KR20220054710A - 관문 차단 및 미소부수체 불안정성 - Google Patents

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엠. 파르돌 드류
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Abstract

면역 관문, 이를테면 CTLA- 4 및 PD-1의 차단은 암 환자들에게 가능성을 보여준다. 이들 수용체로 지향된 억제성 항체들은 면역 내성을 파괴하고, 항-종양 면역을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 물질은 특정 범주의 종양이 있는 환자에게 특히 잘 작용한다. 이러한 종양은 이들이 만들어내는 다수의 신생항원들 때문에 치료에 특히 영향을 받을 수 있다.

Description

관문 차단 및 미소부수체 불안정성{CHECKPOINT BLOCKADE AND MICROSATELLITE INSTABILITY}
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에서 제공하는 CA43460 및 CA62924에 따라 정부 지원 하에 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 보유한다.
본 발명은 암 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 치료요법에 관한 것이다.
미소부수체 불안정성 (Microsatellite instability: MSI)이란 미소부수체에서 서열화 오류의 축적이다. 이것은 DNA 미스매치(mismatch) 복구에서 결함이 있는 종양에서 발생된다. 린치(Lynch) 증후군에 MSI가 존재하며, 이 증후군은 환자들이 결장, 자궁내막, 위 암, 난소, 소장, 간, 간담즙, 상부 요로, 뇌, 및 전립선 암에 대하여 더 고통받을 수 있게하는 유전된 암 증후군이다. MSI는 산발적 결장직장암, 위암, 전립선암, 폐암, 팽대부(ampullary) 암, 그리고 자궁내막 암의 10-20%에 또한 존재한다. 또한, 췌장암의 0.3% 내지 13%는 MSI인 것으로 보고된다.
신생물 변형의 증식 제어에 있어서 온전한 면역감시의 중요성은 수십년 동안 알려져 왔었다. 누적된 증거들은 암 조직에서 종양-침윤 림프구 (TIL)와 다양한 악성종양에서 우호적인 예후간에 상관성을 보여준다. 구체적으로, CD8+ T-세포들의 존재와 CD8+ 작동체 T-세포들 / FoxP3+ 조절 T-세포들의 비율은 고형 악성종양, 이를테면 난소암, 결장직장암 및 췌장 암, 간세포 암종, 악성 MEL 및 RCC에서 개선된 예후는 장기적 생존과 관련있는 것으로 보인다. TIL는 생체외(ex vivo)에서 확장되고, 그리고 재-주입될 수 있으며, 암, 이를테면 흑색종에서 지속적인 객관적인 종양 반응을 유도할 수 있다.
PD-1 수용체-리간드 상호작용은 면역 관리를 억제하기 위하여 종양이 장악하는 주요 경로다. 건강한 상태하에서 활성화된 T-세포들의 세포 표면 상에 발현되는 PD-1의 정상적인 기능은 자가면역 반응들이 포함된, 원치않는 또는 과도한 면역 반응들을 하향-조절하는 것이다. PD-1의 리간드들 (PD-L1 및 PD-L2)은 다양한 종양에서 구성적으로 발현되고, 또는 유도될 수 있다. PD-1 리간드가 PD-1에 결합되면, T-세포 수용체를 통하여 촉발되는 T-세포 활성화는 억제된다. PD-L1은 다양한 비-조혈성 조직, 가장 뚜렷하게는 맥관 내피에서 낮은 수준으로 발현되지만, 반면 PD-L2 단백질은 림프 조직 또는 만성 염증 환경에서 발견되는 항원-제시 세포들상에서 겨우 검출가능한 수준으로 발현된다. PD-L2는 림프 기관들에서 면역 T-세포 활성화를 조절하는 것으로 간주되지만, 반면 PD-L1은 주변 조직들에서 불필요한 T-세포 기능을 약화시키는 작용을 한다. 비록 건강한 기관들은 PD-L1(만일 있다면)을 거의 발현시키지 않지만, 다양한 암들은 이 T-세포 억제인자를 과잉 수준으로 발현시키는 것으로 입증되었다. 종양 세포들에서 PD-L1의 높은 발현 수준(그리고 PD-L2의 경우 더 낮은 수준)은 신장 세포 암종 (RCC), 췌장 암종, 간세포 암종, 난소 암종 및 비-소 세포 폐 암 (NSCLC)이 포함된 다양한 유형의 암에서 나쁜 예후 및 생존과 관련있는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, PD-1은 악성 MEL을 가진 환자들에서 종양-특이적 T 세포 팽창을 조절하는 것으로 제안되었다. 다수 암에서 PD-L1의 발현과 임상적 예후의 관찰된 상관성에 의해 PD-1/PD-L1 경로는 종양 면역 회피(evasion)에 측정적 역할을 하는 것으로 제시되며, 그리고 치료요법적 중재를 위한 매력적인 표적으로 간주되어야 한다는 것이다.
면역 관문(immune checkpoints), 이를테면 CTLA- 4(cytotoxic T-lymphocyte antigen-4) 및 PD-1(programmed death-1)의 차단은 암 환자들에게 가능성을 보여주고 있다. CTLA-4 및 PD-1은 활성화된 T 세포들에서 상향조절되며, 그리고 활성화를 겪고 있는 T 세포에게 억제성 신호들을 제공한다. 이들 수용체로 지향된 억제성 항체들은 면역 내성을 파괴하고, 항-종양 면역을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. MK-3475는 PD-1에 대항하는 인간화된 단클론성 IgG4 항체이며, 흑색종 및 비-소 세포 폐 암 (NSCLC)이 포함된 다수 유형의 종양에서 활성을 보이고 있다. 이전에, PD-1을 차단시키는 상이한 항체, BMS-936558, 완전하게 인간화된 단클론성 IgG4 항체는 흑색종, NSCLC에서 활성을 또한 보여주었으며, 그리고 결장직장 암이 있는 한 명의 환자에서 완벽한 반응을 보여주었다.
MK-3475 (기존에 SCH 900475로 알려짐)는 PD-1와 이의 리간드들, PD-L1 및 PD-L2간의 상호작용을 직접적으로 차단시키기 위하여 기획된 IgG4/카파 이소형의 강력한 그리고 매우-선택성이 큰 인간화된 mAb이다. MK-3475는 S228P 안정화 돌연변이들을 포함하며, 그리고 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 보체-의존적 세포독성 (CDC, complement-dependent cytotoxicity) 활성을 가지지는 않는다. MK-3475는 건강한 인간 기증자들, 암 환자들, 및 영장동물들로부터 얻은 배양된 혈액 세포들에서 T 림프구 면역 반응들을 강력하게 강화시킨다. 인간 기증자 혈액 세포들을 사용한 T-세포 활성화 검증에 있어서, EC50는 0.1 내지 0.3 nM의 범위 안에 있었다. MK-3475는 인터루킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), 인터페론 감마 (IFNγ), 및 다른 사이토킨들의 수준을 또한 조정한다. 상기 항체는 항원이 존재할 때에만 기존 면역 반응들을 강화시키고, T- 세포들을 비-특이적으로 활성화시키지 않는다.
상기 PD-1 경로는 Th1 세포독성 면역 반응들을 억제시키는 음성 피드백 시스템으로써, 만약 이 조절이 안된다면, 숙주를 손상시킬 것이다1-3. 많은 종양 및 이들의 주변 환경에서 이것은 상향조절된다. PD-1 또는 이의 리간드들에 대한 항체로 이 경로를 차단시키면 흑색종, 비-소 세포 폐 암, 신장 세포 암종, 방광 암 및 호지킨(Hodgkin) 림프종이 포함된 많은 상이한 암 유형의 환자들에서 괄목할만한 임상적 반응으로 이어졌다4-10. 종양 세포들 또는 면역 세포들의 표면 상에서 PD-1에 대한 리간드들(PD-L1 또는 PD-L2)의 발현은 중요하지만, PD-1 차단에 대한 반응의 확정적 예측 바이오마커는 아니다4,6-8,11.
인간 종양들에서 PD-1 차단의 효과 보고에서, 흑색종, 신장 세포 암, 및 폐 종양 환자에서 실질적인 분획이되는 것과 대조적으로, 33명의 결장직장 암 (CRC) 환자들중 오직 한 명만이 이 치료에 반응하였다는 점에 본 발명자들은 흥미를 가졌다10,12. 이 한 명의 환자에서 차이점은 무엇이었을까? 진행된 CRC의 작은 분획에서 MMR-결함이 발생되기 때문에, 이 환자는 MMR-결함을 가지는 것으로 가정하였고13,14, 종양에서 발현되는 체세포 돌연변이들은 이 환자 본인의 면역계에 의해 인지될 수 있고15, MMR-결함성 암들은 MMR-능숙 CRC보다 10- 내지 100-배 더 많은 체세포 돌연변이들을 가질 수 있다16-18. 더욱이, MMR-결함성 암들은 눈에 띄는 림프구 침윤물들을 포함하는데, 이는 면역 반응과 일치된다19-22. 그리고 Topalian 외10에 의한 연구에서 PD-1 차단에 가장 반응적이었던 종양 유형들중 2가지는 담배 연기 (폐 암) 또는 UV 방사선 (흑색종)에 노출된 결과로 많은 수의 체세포 돌연변이들을 가지고 있었다23,24. 본 가설은 정확했다: PD-1 차단에 반응하였던 한 명의 CRC 환자의 종양은 MMR-결함성이었다25. 따라서, MMR-결함성 종양은 MMR-능숙 종양보다 PD-1 차단에 더 반응한다고 가설을 세웠다.
이 가설을 시험하기 위하여, MMR-결함을 가진 또는 가지지 않는 종양을 가진 환자들에 있어서 면역 관문 차단을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 단계 2 임상 시험을 시작하였다. 종양에서 MMR 결함은 2가지 경로를 통하여 발생되기 때문에26-28, 본 발명자들은 유전적 비-폴립증 결장직장 암 (HNPCC, 또한 린치 증후군이라고도 함)을 가진 환자들을 모집하였는데, 이것은 4개의 MMR 유전자들중 하나에서 유전된 생식계열 결함에 이어서 남아있는 야생형 대립유전자에서 제2 비활성화 체세포 변화로 인하여 발생되었다. 또한, 산발적 MMR-결함성종양을 가진 환자들도 모집하였는데, 이는 MMR 유전자의 대립유전자가 모두 체세포 돌연변이에 의해 또는 후성적 침묵에 의해 비활성화된 것이다29. 어느 경우던 간에, 생성된 신생물들은 수백 또는 수천개의 돌연변이들을 품고 있다16,18.
환자들의 수명을 단축시키지 않고, 삶의 질이 떨어지지 않도록 하기 위하여, 당업계에서는 암 치료를 개선시키는 지속적인 요구가 있다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 암 환자를 치료하는 방법이 제시된다. 이 암 환자는 미소부수체 불안정성 암 (MSI)에서 발견되는, 높은 돌연변이성 부하를 가진다. 면역 관문 억제성 항체는 이 암 환자에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 암 환자를 치료하는 방법이 제시된다. 암 환자 유래의 샘플은 BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21, NR-24, Penta C, 및 Penta D로 구성된 집단으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커들에 대하여 시험되며, 그리고 미소부수체 불안정성을 가지는 것으로 측정된다. 상기 암은 결장암, 위암, 자궁내막암, 담관암종, 췌장암, 및 전립선 암으로 구성된 군에서 선택된다. 항-PD-1 항체는 상기 암 환자에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 인간의 종양을 분류하는 방법이 제시된다. 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커들의 안정성을 평가하기 위하여, 인간유래의 샘플을 시험한다. 상기 샘플에서 미소부수체 불안정성이 측정된다. 상기 종양은 면역 관문 억제성 항체를 사용하는 치료에 대해 우수한 후보자로 식별된다.
본 발명의 여전히 또 다른 구현예에 따르면, 인간의 종양을 분류하는 방법이 제시된다. 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커들의 안정성을 평가하기 위하여, 인간유래의 샘플을 시험한다. 상기 샘플에서 미소부수체 안정성이 측정된다. 상기 종양은 면역 관문 억제성 항체를 사용하는 치료에 대해 나쁜 후보자로 식별된다.
본 명세서를 읽는 당업자들에게는 이들 구현예와 다른 구현예들이 미소부수체 불안정성 암들을 치료하는 방법을 제공한다는 사실이 자명할 것이다.
도 1a-1b. 펨브로리주맙(pembrolizumab)에 대한 임상적 반응들. (도 1a) 생화학적 반응들. 혈청 단백질 바이오마커 수준은 각 주기마다 측정되었고, 그 값는 기준선으로부터 변화율로 나타낸다. 만일 기준선 종양 마커 값들이 정상의 상한보다 큰 경우에 이 환자들은 포함되었다. CA-125는 자궁내막 암 환자에게 사용되었고; CA19-9는 한 명의 담관암종과 한 명의 팽대부 암에 사용되었고; 그리고 CEA는 다른 모든 환자들에게 사용되었다. 녹색, 붉은 색 및 검정색은 MMR-결함성 CRC, MMR-능숙 CRC, 그리고 MMR-결함성 비-CRC를 가진 환자들을 차례로 나타낸다. (도 1b) 방사선 반응들. 종양 반응들은 일정 간격을 두고 측정되었으며, 값들은 각 측정가능한 종양의 기준 측정으로부터 최장 직경의 합(SLD)의 최대 분획적 변화(fractional change)를 보여준다.
도 2a-2d. MMR 상태에 따른 펨브로리주맙에 대한 임상적 이익. 결장직장 암 코호트에서 무진행 생존을 나타나며(도 2a), 결장직장 암 코호트에서 종합적 생존을 나타내며(도 2b), 결장직장이외의 MMR-결함성 암들을 가진 환자들의 무진행 생존을 나타내며(도 2c) (중앙값 PFS=5.4 개월; 95% CI, 3% 내지 측정불가), 그리고 결장직장이외의 MMR-결함성 암들을 가진 환자들의 종합적 생존 (도 2d)에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 보여준다. MMR-결함성종양 (CRC 및 비-CRC)을 가진 두 코호트에서, 종합적 생존의 중앙값(median)에 도달되지 못하였다. MMR-능숙 암들을 가진 코호트의 환자들의 중앙값 PFS는 2.2 개월 (95% CI 1.4 내지 2.8%)이었으며, 중앙값 OS는 5.0 개월 (95% CI 3.0 내지 측정불가)이었다.
도 3 (도 S2.) 방사선 반응의 스파이더 플롯(Spider plot). 종양 반응들은 일정 간격을 두고 측정되었으며, 값들은 각 측정가능한 종양의 기준 측정으로부터 최장 직경의 합(SLD)의 변화율을 보여준다. 기준선 및 연구 치료 스캔이 수득가능한 경우에만 환자들이 포함되었다. 녹색 및 적색은 MMR-결함성 및 능숙 CRC를 가진 환자들을 차례로 나타낸다. 청색은 CRC이외의 MMR-결함성 암들을 가진 환자들을 나타낸다.
도 4a-4b (도 S3). MMR-능숙 및 결함성 CRC들은 연구 등록에 앞서 치료 및 전이성 질환 기간에 있어서 비교할만한 시기를 가진다. MMR-결함성 및 능숙 CRC 코호트 간에 이 펨브로리주맙 연구에서 연구 등록 직전 치료요법에 있어서 시간에 대한 카플란-마이어 추정(HR 0.81, 95% CI 0.38 내지 1.752, p=.60) (도 4a) 및 등록 직전 전이성 질환의 기간(HR 1.13, 95% CI 0.49 내지 2.62, p=.78) (도 4b)은 비교가능하였다. 기존 치료요법에서 짧은 기간은 치료 불응성 CRC 집단에서 예상된다.
도 5 (도 S4.) 생화학적 반응의 워터폴 플랏(Waterfall plot). 혈청 단백질 바이오마커 수준은 각 주기마다 측정되었고, 그 값는 기준선으로부터 최고 변화율로 나타낸다. 만일 기준선 종양 마커 값들이 정상의 상한보다 큰 경우에 이 환자들은 포함되었다. CA-125는 자궁내막 암 환자에게 사용되었고; CA19-9는 1 명의 담관암종과 1 명의 팽대부 암에 사용되었고; 그리고 CEA는 모든 다른 환자들에게 사용되었다. 녹색 및 적색은 MMR-결함성 및 능숙 CRC를 가진 환자들을 차례로 나타낸다. 청색은 CRC이외의 MMR-결함성 암들을 가진 환자들을 나타낸다.
도 6a-6b (도 S5.) MMR-결함성 및 능숙 종양들에서 체세포 돌연변이. 종양의 진유전체(exome) 염기서열측정(sequencing) 및 매치된 정상 DNA에 의해 식별된 종양당 전체 체세포 돌연변이 (도 6a) 그리고 객관적인 반응들과의 상관관계 (도 6b) (비-매개변수적 윌콕슨(Wilcoxon) 시험, p= 0.007 그리고 경향에 대한 존키어-테르파스트라(Jonckheere-Terpstra) 시험, p=0.02).
도 7 (도 S6). CD8 및 PD-L1 발현의 면역조직화학. MMR-결함성 CRC (개체 #16, 위) 및 MMR-능숙 CRC (개체 #3, 아래)으로부터 침습성 전방부위(invasive front)(황색 점선). 이 황색 점선은 종양 (T) 조직과 정상 (N) 조직을 구별한다. MMR-결함성종양 (상부 패널) 환자에서 PD-L1 (파란색 화살표)와 CD8 (갈색 점)의 현저한 발현이 있는 한편, MMR-능숙 종양 (아래 패널)에서는 어느 마커이건 간에 거의 발현이 없다. 또 다른 MMR-결함성 CRC (개체 #19, 상부) 및 MMR-능숙 CRC (개체 #3, 하부)에서 CD8에 대한 항체로 면역표지된 (갈색 점들) 종양 침윤 림프구들 (TIL)의 대표적인 영상이다. MMR-결함성종양에서 CD8 세포들의 침윤 참고. 침습성 전방부위의 10x 및 TIL 20x의 원본 확대.
도 8 (도 S7.) MMR-결함성 및 MMR-능숙 종양 미세환경에서 CD8 및 PD-L1 발현. T 세포 밀도 단위는 종양 mm2당 세포들이다. 침습성 전방부위는 종양과 정상 조직의 접합부에서 면역 세포들 (TIL 및 대식세포들)을 말한다. 비쌍체 t-검정(unpaired t-test)을 사용하여 획득된 P-값.
도 9 (도 S8.) CD8 발현 및 펨브로리주맙에 대한 임상적 이익. 종양내 CD8+ T 세포 밀도 (세포들/mm2)와 객관적인 반응 간의 상관관계(경향에 대한 존키어-테르파스트라 시험, p=0.02).
도 10 (표 S1.) 면역-관련된 그리고 RECIST 반응 기준의 비교 (Wolchok 외, Clin Can Res 2009;15:7412-20으로부터 각색됨.)
도 11 (표 S2.) 치료에 대한 면역-관련된 반응
도 12 (표 S4.) 임상적 결과와 함께, 전체 체세포 돌연변이와 돌연변이 연합된 신생항원들 (MANA)간의 상관관계
도 13 (표 S5.) 임상적 결과와 함께 면역 마커들의 상관관계
본 발명자들은 면역 관문 억제인자들이 높은 돌연변이 부하를 가진 종양에서 최상의 작업을 한다는 사실을 발견하였다. 더욱이, 미스매치 복구에서 종양 결함성은 특정 형태의 면역 치료요법에 특히 민감한데, 그 이유는 이러한 표현형으로 인하여 높은 빈도로 돌연변이의 지속적인 축적이 초래되기 때문이다. 본 발명자들은 미소부수체 불안정성 표현형 또는 다른 높은 돌연변이성 부하를 나타내는 암 환자들의 치료를 개발하였다. 상기 치료는 면역 관문에 대한 억제성 항체와 관련된다. 이러한 관문는 PD-1, IDO, CTLA-4, PD-L1, 및 LAG-3을 포함한다. 다른 면역 관문들 역시 사용될 수 있다. 항체들은 정맥내 주입, 경구 투여, 피하 투여, 설하 투여, 안구 투여, 비강 투여, 등을 포함하나, 이에 국한되지 않는 통상적인 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다.
미소부수체 불안정성 (MSI) 종양은 DNA 미스매치 복구에 결함을 가지고 있으며, 이것은 높은 비율의 자발적 돌연변이들과 신생-항원들의 발현 가능성으로 이어진다. 더욱이, 흑색종과 유사하게, MSI 양성 결장 암들에 있어서, 눈에 띄는 림프구 침윤은 흔하다. MSI이거나, 또는 그렇지 않으면 높은 돌연변이성 부하를 갖는 임의의 종양은 본 발명에 따라 치료될 수 있다. 하기 실시예 1에서 설명되는 것이 포함되나, 이에 국한되지 않는 당분야에 공지된 임의의 방법에 따라 MSI의 속성에 대하여 시험될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 MSI 마커들중 임의의 것은 MSI 표현형을 측정하기 위하여 시험될 수 있다. 종양 게놈 당 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 적어도 1400개, 적어도 1500개, 또는 적어도 1600개의 돌연변이를 가지는 종양을 식별해냄으로써, 높은 돌연변이성 부하에 대하여 샘플들을 시험할 수 있다. 높은 돌연변이성 부하(High mutational burden)란 개인의 정상 조직들과 비교하여 종양에서 체세포 돌연변이의 수가 많다는 것을 의미한다. 비-MSI 종양에서 체세포 돌연변이의 평균 수는 약 70개의 체세포 돌연변이이다.
MSI 표현형 또는 높은 돌연변이성 부하를 나타내는 임의 유형의 종양은 본 발명에 따라 시험되거나 및/또는 치료될 수 있다. 이들 암 유형은 결장암, 위암, 자궁내막암, 담관암종, 췌장암 및 전립선 암을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 팽대 종양, 담즙 종양, 신경교아종이 포함된 뇌 종양, 유방 종양, 폐 종양, 피부 종양, 식도 종양, 간 종양, 신장 종양, 난소 종양, 육종 종양, 자궁 종양, 자궁경부 종양, 방광 종양, 고환 종양, 구강 종양, 혀 종양 및 소장과 대상의 종양 또한 시험되거나 및/또는 치료될 수 있다.
MSI의 시험는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 실행될 수 있다. 다음의 마커들중 하나 또는 그 이상이 시험될 수 있다: 5개의 거의 모노뉴클레오티드 반복 마커들 (BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21 및 NR-24) 그리고 2개의 매우 다형태 펜타뉴클레오티드 반복 마커들 (Penta C 및 Penta D). 사용될 수 있는 한 가지 상업적 시스템에 있어서, 형광적으로 표지된 프라이머들 (마커 패널)은 상기 명시된 7개의 모든 마커들과 함께 공동-증폭에 사용된다. 유전자형/표현형의 배정을 위한 증폭 후 단편들이 검출된다.
MSI에 대하여 시험될 수 있는 샘플들은 종양 조직 뿐만 아니라, 종양으로부터 방출된 핵산이 포함된 체액을 포함한다. 이러한 조직들과 체액에서 종양 DNA를 시험하는 것은 공지되어 있다.
사용될 수 있는 유형의 항체들은 면역 관문 억제인자들에 대하여 개발된 임의의 것들을 포함한다. 이들은 단클론성이거나 또는 다클론성일 수 있다. 이들은 효소적 절단 또는 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 것들을 포함하는 전체 항체의 단일 쇄 단편들 또는 다른 단편들이 될 수 있다. 이들은 가령, IgG, IgM, IgE가 포함되나, 이에 국한되지 않은 임의의 이소형이 될 수 있다. 상기 항체들은 인간, 염소, 토끼, 마우스, 소, 침팬지를 포함하는 임의의 종 기원의 것일 수 있다. 상기 항체들은 인간화된 또는 키메라항체일 수 있다. 상기 항체들은 치료요법적 분자 또는 추적 분자가 되는 또 다른 모이어티와 접합되거나 또는 이에 부착되도록 제작될 수 있다. 상기 치료요법적 분자는 예를 들면, 독소일 수 있다.
MMR의 결함이 있는 종양과 이 결함이 없는 종양을 치료하기 위하여 펨브로리주맙의 소규모 단계 2 시험의 데이터는 MMR-결함성 종양이 MMR-능숙 종양 보다 PD-1 차단에 반응성이 더 크다는 가설을 뒷받침한다. MMR-결함은 결장직장, 자궁, 위, 담도, 췌장, 난소, 전립선 및 소장의 암을 포함하는 많은 암에서 발생된다18,34-42. 이런 유형의 MMR-결함성 종양을 가진 환자들은 이들 환자의 종양이 다른 DNA 복구 결함, 이를테면 POLD, POLE, 또는 MYH에서의 돌연변이를 가진 종양을 포함할 수 있기 때문에, 항-PD-1 치료요법으로부터 또한 이익을 얻는다. 18,43,44
MMR-결함성 종양이 면역계를 자극한다는 가설은 새로운 사상은 아니며45, 그리고 MMR-결함성 종양에서 관찰되는 치밀한 면역 침윤 및 Th1-연합된 사이토킨-풍부 환경에 의해 뒷받침된다.19-22,46 MMR-결함성 종양 미세환경은 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3 및 IDO가 포함된 몇 가지 면역 관문 리간드를 강력하게 발현한다는 것을 최근 연구가 보여줌으로써 이들 고유의 관측을 더 개선시켰는데, 이것은 이들의 활성 면역 미세환경이 종양 제거를 저항하는 면역 억제성 신호들에 의해 상쇄된다는 점을 나타낸다47. MMR-결함성암종과 연합된 면역 침윤물이 신생항원들에서 지향된 것은 예전의 발견과 새로운 발견들에서 가장 그럴싸한 설명이었다. 흑색종에서 항-CTLA-441 및 폐암48에서 항-PD-1에 대한 더 높은 돌연변이 부하 및 더 높은 반응율의 상관관계는 MANA 인식이 내생성 항-종양 면역 반응의 주요 요소라는 생각을 더 뒷받침하는 것이다.
현재 연구와 기존 연구 결과를 근거하여, MMR 결함으로부터 돌연변이-연합된 신생항원들(mutation-associated neoantigens)의 수가 상당히 증가(>20-배)된 것은 (도 12 (표 S4); 또한 New England Journal of Medicine에서 온라인 수득가능함; 본 명세서에 참고자료에 편입됨) 이 유전적으로 한정된 암의 하위부류의 강화된 항-PD-1 반응의 근간이다. 종양에서 돌연변이-연합된 신생항원들의 수에 대한 본 발명자들의 추정이 단지 가상 환경(in silico)에서 결합-친화력의 예측에 근거하기는 하지만, 이와 같은 제안은 MMR-능숙 종양이 MMR-결함성 종양보다 림프구들의 침윤이 훨씬 적다는 관찰과 일관된다 (도 7 (S6), 도 8 (S7) 및 도 13 (표 S5); New England Journal of Medicine에서 온라인 수득가능; 본 명세서에 참고자료에 편입됨). 최근 연구들에서49,50 예측된 신생-에피토프의 아주 작은 비율만 MHC를 가진 세포 표면 상에 실질적으로 존재하며, 내생성 T 세포 반응들의 표적임을 보여준다. 예측된 돌연변이-연합된 신생항원들의 수는 실질적 돌연변이-연합된 신생항원들의 수에 비례하지만, 그리고 실질적 돌연변이-연합된 신생항원들의 수가 높은 종양은 이 종양에 대항하여 반응하는 면역계를 더 자극시킬 가능성이 더 많은 것으로 보인다. MMR-결함성 종양과 MMR-능숙 종양 간에 항-PD-1 반응에서의 차이의 근원적 대체 기전 또한 고려되어야 한다. 예를 들면, MMR-결함성 종양과 MMR-능숙 종양에서 활성화된 상이한 신호생성 경로로 인하여 가용성 인자들의 분비에 차이를 초래할 수 있고, 이는 종양 미세환경 안에서 PD-1 경로의 차등적 활성화를 야기할 수 있다26-28. 유전적 차이는 종양-연합된 자가-항원들의 발현을 변경시키는 후성적 차이에 영향을 줄 수 있으며, 이는 결과적으로 이 종양의 항원성을 변경시킬 수 있다. 항원-특이적 면역 반응들의 실험적 분석 뿐만 아니라 면역 미세환경에서의 변화의 실험적 분석은 PD-1 항체들에 대한 MMR-결함성 종양의 현저한 반응에 대한 이들 인자의 상대적 기여를 정의하는데 도움이 되어야 한다.
이 연구 과정 동안 몇 가지 눈에 띄는 관측들이 있었다. 첫째, 혈청 단백질 바이오마커, 가령 CEA에서의 변화는 단일 투여량 치료요법 이후 임상적 이익과 부합되었다. CEA 수준의 감소는 객관적인 방사선 증거보다 몇 개월 선행되었고, 아마도 다른 바이오마커들, 이를테면 순환 종양 DNA (ctDNA)는 초기 반응의 대리(surrogate) 마커로 유익할 수 있다51,52. 둘째, 본 결과는 종양 게놈의 평가가 면역치료요법을 안내하는데 도움을 줄 수 있다는 것을 암시한다. 이들은 변경의 수 및 유형이 MMR-능숙 암에서 조차도 면역 관문 억제인자들의 잠재적 유용성을 판단하는데 유용할 수 있음을 뒷받침한다41,48,53. 가장 중요한 것은, 본 결과는 전적으로 유전적 상태: 즉, 기저 종양 유형과는 무관하게, 유전적 상태에만 근거한 특정 종양의 부류의 치료에 대한 새로운 접근법을 입증한다.
상기 개시내용은 전반적으로 본 발명을 설명한다. 본 명세서에서 공개된 모든 참고자료들은 본 명세서에 참고자료로 명시적으로 편입된다. 오직 본 발명의 설명을 목적으로 본 명세서에 제공된 다음의 특정 실시예를 참고하면 좀더 완전한 이해를 할 수 있을 것이며, 이때 상기 실시예들은 본 발명의 범위를 제한시키고자 하는 의도는 아니다.
실시예 1
MSI 테스팅(Testing)
MSI 테스팅은 이미 표준화되었으며, 검정할 필요없이 CLIA-인증된 실험실에서 실행된다. MSI를 측정하기 위하여 보관된 종양 샘플 또는 새로 획득된 생검이 사용될 것이다. MSI 상태는 CLIA 인증된 면역조직화학 (IHC)에 의해 국소적으로 실행될 수 있거나, 또는 PCR 기반 자격규정에 의해 실행될 것이다. 수득가능한 환자들은 Johns Hopkins에서 Promega로부터 MSI 분석 시스템을 사용하여 식별될 것이다. 이 시험는 5가지 거의 단일형태 모노뉴클레오티드 반복 마커들 (BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21 및 NR-24)에서 반복 단위의 삽입 또는 결손을 통하여, MSI 상태를 측정할 것이다. 코호트 A 및 C에서 평가되려면 적어도 2개의 MSI 좌(loci)가 요구된다. 환자들은 Promega 시험 결과에 근거하여 새로운 코호트에 할당되거나 및/또는 재배치될 수 있다.
실시예 2
방법들
환자들
단계 2 연구를 위하여, 3군데 참여 센터로부터 치료-난치성 진행성 전이 암 환자들이 모집되었다 (표 1). 3가지 코호트가 평가되었다: 코호트 A는 MMR-결함성 결장직장 선암종을 가진 환자들로 구성되었으며; 코호트 B는 MMR-능숙 결장직장 선암종을 가진 환자들로 구성되었으며; 그리고 코호트 C는 결장직장 이외의 유형의 MMR-결함성 암들을 가진 환자들로 구성되었다.
연구 감독
NEJM.org에서 볼 수 있는 프로토콜은 각 지역의 기관 감사 위원회로부터 승인받았으며, 그리고 이 연구는 헬싱키 선언 및 임상시험관리 기준에 대한 통일 지침서에 관한 국제 회의에 따라 실행되었다. 모든 환자들은 연구 참여에 앞서 사전 동의서를 서면으로 제출하였다. 책임 연구자 (D.L.) 및 연구 지원자 (L.A.D.)는 이 연구 감독에 책임이 있다. Merck은 본 연구의 약물을 기증하였으며, 프로토콜의 최종 안과 본 원고의 최종 본을 검토하였다. 본 임상 연구는 주로 자선 단체들의 후원을 통하여 재정 지원되었다.
연구 기획
본 단계 2 시험은 그린-달베르그(Green-Dahlberg) 2-단계 기획을 사용하여 실행되었으며, 상기에서 설명된 3가지 병행 코호트로 구성되었다. 본 연구 물질인, 펨브로리주맙 (Merck)은 매 14일 마다 10 mg/kg으로 정맥내로 투여되었다. 펨브로리주맙은 PD-1과 이의 리간드들, PD-L1 및 PD-L2의 상호작용을 차단하는 IgG4/카파 이소형의 인간화된 단클론성 항-PD-1 항체다.
각 치료에 앞서 안전성 평가가 실행되었다. 혈청 바이오마커들의 측정을 통하여 전체 종양 부하의 평가는 각 주기 시작시점에 실행되었다. 방사선물질에 의한 평가는 12주수(weeks)과 그 이후 8주마다 이루어졌다. 실시예 3에 임상 프로토콜에 관한 더 상세한 내용이 제공된다.
미스매치 복구 상태의 분석
MMR 경로에서 유전적 결함을 가진 종양은 특히, 미소부수체로 알려진 반복 DNA 영역에서 수천개의 체세포 돌연변이를 품고 있는 것으로 알려져 있다. 게놈에서 이들 영역 안에 돌연변이들의 축적은 미소부수체 불안정성 (MSI)으로 명명된다 26-28. 종양에서 Promega의 MSI 분석 시스템을 사용하여 MMR가 제기능을 못하게 될때(compromised) 특별히 복사 오류에 약한 선택된 미소부수체 서열들의 평가를 통하여, MMR-상태가 감정되었다26-28. 추가 상세한 내용은 Supplementary Appendix를 참고한다.
게놈 및 생물정보 분석
주요 종양 샘플 및 매치된 정상 주변-혈액 표본 표본은 진유전체 염기서열측정30 및 HLA 하플로타입측정(haplotyping)에 충분한 종양 조직이 수득가능한, MMR-결함성 암종이 있는 개체와 MMR-능숙 암종이 있는 다른 개체의 하위 집단으로부터 획득되었다. 돌연변이체 펩티드 결합에 대한 가능성을 평가하기 위하여, 개별 환자의 MHC 클라스 I HLA 하플로타입과 복합된 체세포 진유전체 데이타는 에피토프 예측 알고리즘에 적용되었다31,32. 이 알고리즘은 각 종양에서 돌연변이-연합된 신생항원들의 총 수의 추정을 제공하였다. Supplementary Appendix (New England Journal of Medicine에서 온라인 수득가능함; 본 명세서의 참고자료에 편입됨)에서 추가 상세한 내용들이 제공된다.
통계학적 분석
코호트 A 및 B에 대한 일차 종점은 면역-관련된 객관적인 반응율 (irORR) 및 면역-관련된 반응 기준 (irRC)을 사용하여 평가된 20주수(weeks)에서 면역-관련된 무-진행 생존 (irPFS) 비율이다33. 코호트 C의 일차 종점은 20주수(weeks)에서 irPFS 비율이다. 면역-관련된 기준 (즉, 면역-기반 치료요법을 평가하는데 사용된 기준)은 방사선 반응들, 그리고 RECIST 기준과 달리, 질병 진행 후 질환의 억류 수준에 근거하며; 이들 기준은 정의되어 있고, 도 10(표 S1)에서 RECIST v1.1과 비교되어 있다. 20주수(weeks)에서 반응율 및 PFS 비율은 RECIST v1.1 및 irRC을 사용하여 본 연구에서 평가 및 보고되었다 (도 10 (표 S1)). PFS 및 종합적 생존은 카플란-마이어 방법에 의해 요약되었다. 가설, 귀무 가설(null hypothesis)을 거부하는 판단 규정, 그리고 효과 및 무익에 대한 조기-중단 규정에 대한 상세한 내용은 Supplementary Appendix에 제공된다.
실시예 3
보충 방법
환자들
환자가 이 연구에 참여 자격을 가질려면 환자는 적어도 18세 이상이어야 하고, 기존-치료된 진행성 암종에 관한 조직학적으로 식별된 증거를 가지고 있어야 한다. 모든 환자들은 등록에 앞서 MMR 상태 테스팅을 받았다. 모든 환자들은 고형 종양의 반응 평가 기준(RECIST), 버젼 1.1에 의해 특정된 적어도 하나의 측정가능한 병소, Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 수행-상태 점수 0 또는 1, 그리고 적절한 혈액학적 기능, 간 기능 및 신장 기능을 갖는다. CRC를 갖는 등록가능한 환자들은 적어도 2가지 사전 암 치료요법을 받아야 하며, 그리고 다른 유형의 암을 가진 환자들은 적어도 1 가지의 사전 암 치료요법을 받아야 한다. 치료받지 않은 뇌 전이, HIV, B형 간염, C형 간염, 임상적으로 심각한 복수/삼출물, 또는 자가면역 질환의 병력이 있는 환자들은 배제되었다.
연구 감독
원고의 초안은 일부 저자들에 의해 준비되었고, 모든 저자들은 최종 원고에 일조하였다. 모든 저자들은 원고가 공개되도록 제출하는데 있어서 판단하였다. 책임 연구원 및 연구 지원자는 보도된 데이터의 정확성 및 완결성 뿐만 아니라 프로토콜 준수에 대하여 책임진다.
HLA 형 측정(TYPING)
HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 서열 기반된 형측정은 하기에서 설명된 바와 같이 3가지 별개 단계로 세분될 수 있다. 포괄적, A*02 특이적, B 포괄적, B 군 특이적, C 포괄적 그리고 C*07 특이적 PCR 및 염기서열측정 믹스는 JHU 핵심 시절에서 만들어졌다. Celera의 AlleleSEQR HLA-B 서열 기반된 형측정 키트는 B 포괄적 SBT에 사용되었다. HLA-A 형측정 계획은 2가지 PCR 반응들, A 포괄적 그리고 A*02 특이적으로 구성된다. 포괄적 증폭산물은 부분적 엑손 1 - 부분적 엑손 5를 포괄한다. A*02 증폭산물은 부분적 인트론 1 - 부분적 엑손 5를 포괄한다. HLA-B 형측정 계획은 2가지 PCR 반응들, B 포괄적 그리고 B 군 특이적으로 구성된다. B 포괄적 PCR은 엑손 2 - 엑손 3과 엑손 4 - 엑손 7이 포괄된 2개의 PCR 증폭산물이 포함된 멀티플렉스화된 반응이다. B 군 특이적 증폭산물은 부분적 인트론 1 - 부분적 엑손 5을 포괄한다. HLA-C 형측정 계획은 2개의 PCR 반응들, C 포괄적 및 C*07 특이적으로 구성된다. C 포괄적 및 C*07 특이적 증폭산물은 엑손 1 - 7을 포괄한다.
HLA-A 및 B PCR의 특이성은 AmpliTaq Gold DNA 중합효소를 사용한다. GeneAmp 높은 충실성(Fidelity) 효소가 HLA-C 및 C*07 PCR 믹스에 사용된다. 이 효소는 2가지 중합효소의 믹스이다: AmpliTaq DNA 중합효소 (비-프루프리딩 중합효소)와 프루프리딩 중합효소. 이 효소 믹스는 더 큰 전장의 HLA-C 증폭산물의 효과적이고, 탄탄한 증폭을 만드는데 필요하다.
PCR 생성물 정제는 엑소뉴클레아제 I 및 새우 알칼리 포스파타제(Shrimp Alkaline Phosphatase)를 사용하여 실행되었다. 상기 A 포괄적 증폭산물 및 B 포괄적 증폭산물은 엑손 2,3,4에 대하여 양-방향적으로 서열화되었다. C 포괄적 증폭산물은 엑손 2,3에 대하여 양-방향적으로 서열화되었고, 그리고 엑손 1,4,5,6,7에 대해서 단일 방향으로 서열화되었다. A*02 특이적 증폭산물, B 군 특이적 증폭산물 그리고 C*07 특이적 증폭산물은 엑손 2,3에 대하여 단일 방향으로 서열화되었다. 모든 염기서열측정 반응들은 Applied Biosystems의 Big Dye Terminator V1.1로 수행되었으며, ABI Prism 3500XL Genetic Analyzer로 서열화되었다. Conexio Genomic의 "Assign SBT" 대립유전자 배당 소프트웨어가 데이터 파일들을 처리하는데 사용되었다.
미스매치 복구(MISMATCH REPAIR) 상태 테스팅1,2
종양 및 정상 (단순 림프절 또는 절제 가장자리)의 6개 슬라이드가 절단되었고 (각각 5 미크론씩), 탈파라핀화되었고 (크실렌), 그리고 헤마토실린 및 에오신 (H+E)으로 하나 착색되었다. 인증된 면허가 있는 해부 병리학자에 의해 지적된 적어도 20% 신생물 세포들이 포함된 종양 부위는 Pinpoint DNA 단리 시스템 (Zymo Research, Irvine, CA)을 사용하여 육안절개하였으며(macrodissected), 단백분해효소 K에서 8 시간 동안 절단되었으며, 그리고 DNA는 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 단리되었다. 제조업자의 지시에 따라 정상 샘플와 종양 샘플의 실체를 식별하기 위하여, MSI 및 2-펜타뉴클레오티드 반복 좌 (PentaC 및 PentaD)를 검출하는 5가지 허위단일형태 모노뉴클레오티드 반복 (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 및 MONO-27)로 구성된 MSI 분석 시스템 (Promega, Madison, WI)을 사용하여 MSI가 평가되었다. 50-100 ng DNA의 증폭 후, PCR 형광 생성물들은 Applied Biosystems 3130xl 모세관 전기영동 기구(Invitrogen, Calsbad, CA)에 크기가 표시되었다. 모든 경우에서 펜타뉴클레오티드 좌는 실체가 식별되었다. 대조군은 음성 대조로써 물, 그리고 양성 대조로써 20% MSI 암 DNA와 함께 80% 생식계열 DNA의 혼합물을 포함하였다. 각 미소부수체 좌에 대하여 염기 크기가 측정되었으며, 생식계열 DNA와 비교하여 2개 또는 그 이상의 모노뉴클레오티드 좌의 길이가 변화되었다면, 이 종양은 MSI로 지정되었다.
염기서열측정 분석
샘플들
FFPE 블록 또는 냉동된 조직으로 제공되는 샘플들은 병리학적 평가에 의해 종양 세포성(cellularity)이 측정되었다. 정상 조직의 오염을 제거하기 위하여 종양은 육안 절개되었고, 이로써 샘플에는 >20% 신생물 세포들이 포함되게 된다. 대응되는 정상 샘플들은 혈액, 타액 또는 외과술로부터 획득된 정상 조직으로 제공되었다.
샘플 준비 및 차-세대 염기서열측정3
종양 샘플 및 정상 샘플의 샘플 준비, 라이브러리 구축, 진유전체 포집, 차세대 염기서열측정, 및 생물 정보 분석은 Personal Genome Diagnostics, Inc. (Baltimore, Maryland)에서 실행되었다. 간략하게 설명하자면, Qiagen DNA FFPE 조직 키트 또는 Qiagen DNA 혈액 미니 키트 (Qiagen, CA)를 사용하여 대응되는 혈액 또는 타액 샘플들과 함께, 냉동 또는 포르말린-고정된 파라핀 매립된 (FFPE) 조직으로부터 DNA가 추출되었다. 종양 샘플 및 정상 샘플의 게놈 DNA는 단편화되었고, 그리고 이전에 설명된 바와 같이, 제작자의 지침에 따라 Illumina TruSeq 라이브러리 구축 (Illumina, San Diego, CA)에 사용되었다. 간략하게 설명하자면, 100μl의 TE 안에 50 ng - 3μg의 게놈 DNA가 Covaris 소니케이트 (Covaris, Woburn, MA) 안에서 150-450bp의 크기로 단편화되었다. 150bp보다 작은 단편들을 제거하기 위하여, 제작자의 지시에 따라 DNA는 Agencourt AMPure XP 비드 (Beckman Coulter, IN)를 사용하여 비드 대비 1.0 내지 0.9의 PCR 생성물의 비율로 2차례 정제되었고, 70% 에탄올을 사용하여 세척되었다. 정제된, 단편화된 DNA는 36μl의 H2O, 10μl의 말단 복구 반응 버퍼, 5μl의 단부 복구 효소 믹스 (cat# E6050, NEB, Ipswich, MA)와 함께 혼합되었다. 상기 100μl 말단-복구 혼합물은 20℃에서 30 분 동안 배양되었고, 제조업체의 지시에 따라 Agencourt AMPure XP 비드 (Beckman Coulter, IN)를 사용하여 비드 대비 1.0 내지 1.25의 PCR 생성물의 비율로 정제되었고, 70% 에탄올을 사용하여 세척되었다. A-테일(tail)을 만들기 위하여, 42μl의 말단-복구된 DNA는 5μl의 10X dA 테일링(Tailing) 반응 버퍼와 3μl의 Klenow (exo-)(cat# E6053, NEB, Ipswich, MA)와 혼합되었다. 상기 50μl 혼합물은 37℃에서 30 분 동안 배양되었고, 제조업체의 지시에 따라 Agencourt AMPure XP 비드 (Beckman Coulter, IN)를 사용하여 비드 대비 1.0 내지 1.0의 PCR 생성물의 비율로 정제되었고, 70% 에탄올을 사용하여 세척되었다. 어뎁터(adaptor) 결찰(ligation)을 위하여, 25μl의 A-테일화된 DNA는 6.7μl의 H2O, 3.3μl의 PE-어뎁터 (Illumina), 10μl의 5X 결찰 버퍼 및 5μl의 Quick T4 DNA 리제이즈 (cat# E6056, NEB, Ipswich, MA)완 혼합되었다. 상기 결찰 혼합물은 20℃에서 15 분 동안 배양되었고, 제조업체의 지시에 따라 Agencourt AMPure XP 비드 (Beckman Coulter, IN)를 사용하여 비드 대비 1.0 내지 0.95 및 1.0의 PCR 생성물의 비율로 2회 정제되었고, 70% 에탄올을 사용하여 세척되었다. 증폭된 라이브러리를 획득하기 위하여, 각각 25μl씩 12개 PCRs이 준비되었고, 각각에는 15.5μl의 H2O, 5μl의 5 x Phusion HF 버퍼, 10 mM의 각 dNTP가 포함된 0.5μl의 dNTP 믹스, 1.25μl의 DMSO, 0.25μl의 Illumina PE 프라이머 #1, 0.25μl의 Illumina PE 프라이머 #2, 0.25μl의 Hotstart Phusion 중합효소, 그리고 2μl의 DNA가 포함된다. 사용된 PCR 프로그램이 사용되었다: 98℃에서 2 분; 98℃에서 15 초, 65℃에서 30 초, 72℃에서 30 초를 12 주기; 그리고 72℃에서 5 분. DNA는 Agencourt AMPure XP 비드 (Beckman Coulter, IN)를 사용하여 비드 대비 1.0 내지 1.0의 PCR 생성물의 비율로 정제되었고, 제조업체의 지시에 따라 70% 에탄올을 사용하여 세척되었다. 엑손 또는 표적화된 영역들은 제작자(Agilent, Santa Clara, CA)의 지시에 따라 Agilent SureSelect v.4 키트를 사용하여 용액안에 포집되었다. 포집된 라이브러리는 그 다음 Qiagen MinElute 컬럼 정제 키트로 정제되었으며, 17μl의 70℃ EB에서 용리되어, 15μl의 포집된 DNA 라이브러리가 획득되었다. (5) 상기 포집된 DNA 라이브러리는 다음의 방식으로 증폭되었다: 각각 19μl의 H2O, 6μl의 5 x Phusion HF 버퍼, 0.6μl의 10 mM dNTP, 1.5μl의 DMSO, 0.30μl의 Illumina PE 프라이머 #1, 0.30μl의 Illumina PE 프라이머 #2, 0.30μl의 Hotstart Phusion 중합효소, 및 2μl의 포집된 진유전체 라이브러리가 포함된, 8개의 30uL PCR 반응이 설정되었다. 사용된 PCR 프로그램이 사용되었다: 98℃에서 30 초; 98℃에서 10 초, 65℃에서 30 초, 72℃에서 30 초를 14 주기(진유전체 경우) 또는 16 주기(표적화된 경우); 그리고 72℃에서 5분. PCR 생성물들을 정제하기 위하여, 제작자의 지시에 따라 NucleoSpin Extract II 정제 키트 (Macherey-Nagel, PA)가 사용되었다. 쌍을 이룬-단부 염기서열측정은 Illumina HiSeq 2000/2500 및 Illumina MiSeq 기구 (Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 실행되었고, 이로써 진유전체 라이브러리의 경우 단편들의 각 단부로부터 100개 염기, 표적화된 라이브러리의 경우 단편의 각 단부로부터 150개 염기가 된다.
차-세대 염기서열측정 데이터의 일차 프로세싱 및 가상 체세포 돌연변이의 식별3
매치된 종양 샘플와 정상 샘플에서 돌연변이를 식별하기 위하여 VariantDx 커스텀 소프트웨어 (Personal Genome Diagnostics, Baltimore, Maryland)를 사용하여 체세포 돌연변이가 식별되었다. 돌연변이 소명(calling)에 앞서, 종양 샘플 및 정상 샘플 모두에 대한 서열 데이터의 일차 프로세싱은 어뎁터 서열들의 마스킹(masking)을 포함하여, Illumina CASAVA 소프트웨어 (v1.8)를 사용하여 실행되었다. 서열 판독은 ELAND를 사용하여 인간 참조 게놈 (버젼 hg18)에 대응하여 배열되었고, 니들만-운쉬(Needleman-Wunsch) 방법 5를 사용한 선택 영역들의 추가 재배열도 함께 하였다. 그 다음, 전체 진유전체 또는 관심 대상 영역에 걸쳐 VariantDx을 사용하여 점 돌연변이들, 삽입, 및 결손으로 구성된 후보 체세포 돌연변이들이 식별되었다. VariantDx는 매치된 정상 샘플에 대응하여 종양 샘플들의 서열 배열을 검사하는 한편, 배열 및 염기서열측정에 따른 인위물을 배제하기 위하여 필터가 적용된다. 간략하게 설명하자면, 배열 필터는 종양에서 질이 떨어지는 판독(reads), 쌍을 이루지 않은 판독 그리고 빈약하게 매핑된 판독들을 배제하기 위하여 적용되었다. 염기 품질 필터는 종양의 경우 보고된 phred 품질 득점이 > 30이고, 정상의 경우 > 20인 염기의 포함으로 한정시키기 위하여 적용되었다. 종양에서 돌연변이는 (i) 명확하게 쌍을 이룬 판독이 종양에서 돌연변이를 포함하고; (ii) 종양에서 특정 돌연변이가 포함하는 명확하게 쌍을 이룬 판독의 수가 판독 쌍의 적어도 10%이며; (iii) 미스매치된 염기가 매치된 정상 샘플에서 판독의 >1% 로 존재하지 않으며, 뿐만 아니라 dbSNP로부터 유도된 통상 생식계열 변이체의 커스텀 데이터베이스 안에 존재하지 않고; 그리고 (iv) 종양과 정상 모두에서 그 위치가 > 150X에서 감추어진(covered) 경우에만, 후보 체세포 돌연변이로 식별되었다. 참조 게놈 조사에 의해, 유사(paralogous) 서열이 포함된 잘못된 게놈 배열로 인하여 발생된 돌연변이들이 식별되었으며, 그리고 배제되었다.
후보 체세포 돌연변이들은 단백질-코딩 영역들에서 발생되는 돌연변이들을 식별하여 위하여, 유전자 추적(annotation)에 근거하여 더 필터되었다. UCSC (https://genome.ucsc.edu/)으로부터 hg18 상에 수득가능한 최신 전사체 버젼을 사용하여 snpEff 그리고 CCDS, RefSeq 및 Ensembl 추적의 커스텀 데이타베이스를 사용하여 기능적 결과가 예측되었다. 표준(canonical) 시작 및 종료 코돈의 전사체 그리고 수득가능하다면, CCDS 또는 Refseq 전사체를 선택하기 위하여 예측들을 정리하였다. 끝으로, 돌연변이들을 필터하여 인트론 및 침묵 변화를 배제시키고, 한편 미스센스(missense) 돌연변이, 넌센스(nonsense) 돌연변이, 프레임쉬트프(frameshifts), 또는 접목 부위 변경(splice site alterations)을 초래하는 돌연변이들은 남겨두었다. 인위적 변화를 추가로 제거하기 위하여, 수작업의 육안검사(visual inspection) 단계도 사용되었다.
돌연변이체 펩티드 MHC 결합 예측
아미노산 변화를 초래하는 것으로 예측된 체세포 프레임쉬프트, 삽입, 결손, 그리고 미스센스 돌연변이들은 개별 환자의 HLA 하플로타입에 근거하여 잠재적 MHC 클라스 I 결합에 대하여 분석되었다. 본 초기 분석은 HLA-A 및 HLA-B에 집중되었다. 아미노산 돌연변이들은 이들의 상응하는 CCDS 접수 번호에 연계되고, 이것을 사용할 수 없는 경우들에 있어서 Refseq 또는 앙상블 전사체를 사용하여 단백질 서열을 추출하였다. 8mer, 9mer, 및 10mer 에피토프를 식별하기 위하여, 각 돌연변이 주변 아미노산 단편들이 식별되었다. 이들 15, 17, 및 19개 돌연변이체 아미노산 단편들은 에피토프 예측 프로그램 NetMHC 3.4.6 에피토프에 의해 분석되었으며, NetMHC 그룹 6 에서 제안된 바와 같이, 예측된 친화력이 <50nm 인 경우 잠재력이 강력한 결합체(binder)로 간주되었으며, 예측된 친화력이 <500nm인 에피토프는 잠재력이 약한 결합체로 간주되었다.
전체 신생항원 부하를 더 세분하기 위하여, 각 돌연변이체 펩티드에 대한 상보적 야생형 펩티드의 동일한 과정을 반복하였다. 그 다음 본 발명자들은 상보적 야생형 펩티드가 잠재력이 약한 결합체로 예측되었을 때, 잠재력이 강한 결합체인 돌연변이체 펩티드에 대하여 필터하였다. 이들 돌연변이체 펩티드들은 돌연변이-연합된 신생항원들 (MANA)로 지칭된다. 환자가 NetMHC 3.4에 의해 뒷받침되지 않는 단일 MHC 하플로타입을 보유하는 경우(가령, 사례 1, 17 및 21), 이 개별 하플로타입은 본 분석에 포함되지 않았다.
통계학적 방법들
시험 기획7
이 시험은 항-PD-1 치료요법을 위하여 치료 선택 마커로서 MK-3475 및 MSI의 효과를 동시에 평가하기 위하여 병행되는 2-단계를 사용하여 실행되었다. 이 시험은 본 내용에서 설명된 3가지 코호트의 환자들에서 나란히 2-단계 단계 2 연구로 구성되었다. 연구 물질인, MK-3475은 매 14일 마다 10 mg/kg으로 정맥내로 투여되었다.
코호트 A 및 B 각각의 경우, 공동-일차 종점은 20주수(weeks)에서 무-진행-생존 (irPFS)이며, 면역 관련된 기준을 사용하여 평가된 객관적인 반응 (irOR)이다. 단계별 게이트키핑 절차(step-down gatekeeping procedure)를 사용하여 종합적 유형 I 오류를 유지시켰다. 2-단계 그린-달베르그 기획을 사용하여 irPFS를 평가하였는데, 15명의 환자 이후 중간 분석, 그리고 25명의 환자이후 최종 분석되었다. 단계 1에서, 20주수(weeks)에서 15의 무진행중 ≥ 1인 경우 제 2 단계로 진행되어야 하고, 그리고 20주수(weeks)에서 25의 무진행중 ≥ 4인 경우 irOR에 대한 시험 진행이 요구되었으며, 이때 25명의 반응자들(irCR 또는 irPR)중 ≥ 4는 해당 코호트에서 유망한 효과를 나타낸다. 각 코호트는 20주수(weeks)에서 무진행이 ≥ 4 이고, ≥ 4 반응들이 식별되면 바로 효능이 있는 것으로 종료될 수 있고, 또는 20주수(weeks)에서 단계 1에서 15중 무진행이 0이었거나, 또는 ≥ 22의 개체가 20주수(weeks)에 질환 진행을 가지면 바로 무효인 것으로 종료될 수 있다. 이 기획은 20-주 25%의 irPFS 비율을 검출하는데 90% 효력을 달성하며, 그리고 21%의 irOR 비율 (irORR)을 검출하는데 80% 효력을 달성하고, 20-주 5%의 irPFS 비율 및 5%의 irORR의 귀무 가설(null hypothesis)에서 종합적 유형 I 오류는 0.05였다.
코호트 C의 경우, 일차 종점은 20주수(weeks)에서 irPFS이었다. 2-단계 그린-달베르그 2-단계 기획이 사용되었으며, 14명의 환자 이후 중간 분석과 21명의 환자이후 최종 분석이 있었고; 단계 1에서, 20주수(weeks)에서 14명중 무진행이 ≥1인 경우 제 2 단계로 진행이 요구되었으며, 종점 20주수(weeks)에서 21중 무진행이 ≥ 4인 경우 코호트 C에서 적절한 효과를 나타낸다. 이 코호트는 20주수(weeks)에서 무진행이 ≥ 4인 것으로 식별되면 바로 종료될 수 있다. 상기 기획은 20-주 25%의 irPFS 비율을 검출하기 위하여 81% 효력을 가지고, 20주수(weeks)에서 5%의 irPFS의 귀무 가설에서 5% 유형 I의 오류가 있었다.
통계학적 분석
RECIST v1.1 및 Wolchok 등 8로부터 개작된 면역-관련된 반응 기준 (irRC)을 사용하여 반응 및 진행이 평가되었는데, 이것은 2차원적 종양 측정의 산물의 합을 사용하고, 새로운 병소를 이 합에 포함시킨다. 20주수(weeks)에서 무-진행 생존 (PFS) 비율 및 irPFS 비율은 펨브로리주맙의 개시 이후 20주수(weeks)에서 질환 진행이 없고, 생존한 환자들의 비율로 추정되었다. 20주수(weeks) 이전에 질환 진행이 되었거나, 연구 데이터가 수집되는 시점에서 >20 주로 등록된 환자들은 20-주 PFS (irPFS) 비율 예측을 위한 분석에 포함되었다. 독성 또는 질환 악화 및 이로 인하여 20-주 종양 평가를 하지 못한 환자들은 진행성 질환으로 가진 것으로 간주되었다. ORR (irORR)는 CR 또는 PR (irCR 또는 irPR)의 최고 종합적 반응을 획득한 환자들의 비율이다. 종양 반응 평가를 하는데 충분한 기간동안 연구에 가담한 환자들은 반응율을 평가하는 분석에 포함되었다. 반응한(CR 또는 PR) 환자들중, 반응 지속 기간은 처음 RECIST 반응 시기부터 질환 진행 시기까지이며, 그리고 진행되지 않았던 반응자들에 대한 최종 수득가능한 종양 평가에서 검열되었다.
PFS 및 irPFS는 최초 투여 날로부터 질환 진행 일자까지, 또는 처음 발생된 원인이 무엇이건 간에 그 원인에 의한 사망 일자까지의 시간으로 정의되었다. PFS 및 irPFS는 생존하고, 무-진행인 환자들에 대한 진행성 질환의 부재를 기록하는 최종 수득가능한 종양 평가의 날짜에 검열되었다. 종합적 생존 (OS)은 최초 투여 날로부터 임의 원인에 의한 사망 일자까지의 시간으로 정의되었다. 분석 시점에서 여전히 생존한 환자들의 경우 이 환자들이 생존한 것으로 알려진 최종 일자에서 OS 시간이 검열되었다. 생존 시간은 카플란-마이어 방법에 의해 요약되었다. 사후 비교 분석(post hoc analysis)으로써, 로그-순위 검정(log-rank tests)을 사용하여 코호트 A와 B를 비교하였으며, Cox 모델에 근거하여 위험 비율이 평가되었다.
Cox 회귀 모델에 근거한 랜드마크 분석을 사용하여 PFS 또는 OS와 함께 1 주기 이후 CEA 감소 백분율 연관성이 평가되었다. 상관 연구들을 위하여, 비-매개변수적 윌콕슨 검정을 사용하여 MMR-결함성 환자들과 MMR-능숙 환자들 간에 돌연변이 부하가 비교되었다. 반응 및 생존 시간에 있어서 기준선 돌연변이성 부하 및 면역 마커들의 효과는 차례로 로지스틱 회귀와 Cox 회귀를 사용하여 평가되었다.
면역조직화학 및 영상 분석
B7-H1 발현의 막 패턴을 나타내는 악성 세포들의 분획과 침습성 전방부위에서 백분율은 이전에 보고된 바와 같이9,10, 3명의 병리학자 (R.A.A., F.B., 및 J.M.T.)에 의해 정량화되었다. 영상 분석을 사용하여 CD8 디아미노벤지딘 (DAB)-착색된 세포들의 수가 측정되었다. 각 경우에 H&E-착색된 슬라이드를 사용하여, 본 발명자들은 다음의 영역들을 식별하였다: i) 종양, ii) 침습성 전방부위 (악성 조직과 비-악성 조직간의 경계), 그리고 iii) 정상 조직. 상기 CD8-착색된 슬라이드는 Aperio ScanScope AT상에서 20x 등가 확대(픽셀당 0.49 마이크로미터)에서 스캔되었다. 종양, 침습 전방부위 및 정상 조직 (상기, H&E로부터)에 대응하는 영역들은 Aperio ImageScope v12.1.0.5029를 사용하여 별도 층에 주석되었다.
CD8-양성 림프구 밀도는 PIP11에서 이행된 커스텀 알고리즘을 사용하여 상기 영역 각각에서 산출되었다. 결과는 VIPS 라이브러리12를 사용하여 Deepzoom 영상으로 전환되었고, OpenSeadragon 뷰어 (http://openseadragon.github.io)를 사용하여 시각화되었다.
실시예 3에만 해당되는 참고문헌.
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실시예 4
환자들
2013년 9월부터 2015년 1월 사이에 41명의 일련 환자들이 등록되어, 치료받았다. (표 1). 모집에는 임상 시험 선택에 따라 미스매치 복구를 가진 종양을 가지고 있는 것으로 알고 있는, 또는 그 다음 시험된 종양 상태를 모르는 환자들이 포함되어 있었다. MMR-결함성 CRC 코호트에서 한 명의 환자는 등급 3 빌리루빈 수준을 허용하는 IRB 자격 면제자로 등록되었다. 코호트 A 와 B에 총 32명의 CRC 환자들이 등록되었다. 모든 CRC 환자들은 >2의 사전 화학치료요법 레지멘(중앙값=4)을 받았고, 예외적으로 한 명의 MMR-능숙 환자는 한 가지 화학치료요법과 한 가지 (비-PD1-기반) 면역치료요법적 레지멘을 받았다.
CRC가 아닌 MMR-결함성 고형 종양으로 진단을 받은 9명의 개체들은 코호트 C에 등록되었다. 코호트 C의 모든 환자들은 >1의 사전 암 치료 (중앙값=2)를 받았다.
*
*실시예 5
일차 종점 평가
20주수(weeks)에서 코호트 A의 경우 irORR 및 irPFS(도 11 (표 S2)) 는 40% (10명중 4명의 환자들; 95% CI, 12 내지 74%)와 78% (9명중 7명의 환자들; 95% CI, 40 내지 97%)이었으며, 그리고 코호트 C의 경우는 71% (7명중 5명의 환자들; 95% CI, 29 내지 96%)와 67% (6명중 4명의 환자들; 95% CI, 22 내지 96%)이었다. MMR-능숙 CRC를 가진 환자들로 구성된 코호트 B에서 irORR 및 20-주수(weeks) irPFS는 0% (95%CI, 0 내지 20%)와 11% (18명중 2명의 환자들; 95% CI, 1 내지 35%)이었다. MMR-결함성 코호트 A 및 C는 모두 20주수(weeks)에서 4명의 개체들이 무진행 질환이며, 면역-관련된 반응 기준에 근거하여 4가지 객관적 반응들이 관찰될 때 효능에 대한 이들의 사전정의된 조기 중단 규정에 도달하였다 (도 11 (표 S2); New England Journal of Medicine에서 온라인으로 수득가능; 본 명세서의 참고자료에 편입됨; 그리고 상기 보충 방법들).
환자들에 대한 추적 검사의 중앙값 시간은 MMR-결함성 CRC을 가진 환자들(코호트 A)의 경우 32 주수(weeks) (범위, 5-51 주수(weeks))였으며, MMR-능숙 CRC를 가진 환자들(코호트 B)의 경우 12 주수(weeks) (범위, 2-56 주수(weeks))이었으며, 그리고 MMR-결함성 비-CRC 종양을 가진 환자들 (코호트 C)의 경우 12 주수(weeks) (범위, 4-42 주수(weeks))이었다. 20-주수(weeks) irPFS에 대하여 수득가능한 모든 환자들은 적어도 20 주수(weeks)를 따랐다.
실시예 6
방사선 평가
코호트 A에서 10명의 수득가능한 MMR-결함성 CRC 환자들중 4명 (40%; 95% CI, 12-74%)은 RECIST 기준에 따른 객관적인 반응들을 얻었다(표 2, 도 1 및 도 3 (S2)). 환자들이 12-주수(weeks) 스캔을 거치지 않았다면 이들은 평가 불가능한 것으로 간주되었다. 질환 제어율은 환자들의 일부가 객관적인 반응을 얻었거나, 또는 환자의 질환이 안정적인 것으로 정의되었으며, 코호트 A에서는 90%(10명중 9명의 환자들; 95% CI, 55-100%)이었다.
코호트 C에 등록된 CRC가 아닌 MMR-결함성암 유형을 가진 7명의 평가 가능한 환자들중 5명 (71%; 95% CI, 29-96%)은 RECIST 기준에 의한 객관적인 반응들 (표 2, 도 3 (S2) 및 도 1)을 획득하였고, 그리고 질환 제어율은 71% (7명중 5명의 환자들; 95% CI, 29-96%)이었다.
코호트 C에서 환자들은 코호트 A의 환자들보다 더 신속하게 반응하였다(12주 vs. 28 주수(weeks)의 RECIST에 의한 반응까지의 중앙값 시간, p=0.03). 더욱이, 린치 증후군과 연합되지 않은 6명의 모든 MMR-결함성 종양 환자 모두다(100%) 객관적인 반응을 획득한 반면, 린치 증후군과 연합된 11명의 종양 환자중 단지 3명(27%)만 반응하였다 (표 S3; p=0.009; New England Journal of Medicine에서 온라인으로 수득가능; 그리고 본 명세서의 참고자료에 편입됨). 다른 기준 특징들은 객관적인 반응들과 연합된 통계학적으로 유의성을 보이지 않았다.
코호트 B에서 MMR-능숙 CRC를 가진 18명의 환자들에서 RECIST 기준에 의한 객관적인 반응들은 관찰되지 않았고 (표 2, 도 3 (S2) 및 도 1), 이 질환 제어율은 11% (18명중 2명의 환자들; 95%CI, 1 내지 35%)이었다.
RECIST 기준에 의한 반응(도 11 (표 2))을 획득한 모든 환자들은 면역-관련된 반응 기준 (도 11 (표 S2))에 의한 반응들을 또한 획득하였다.
실시예 7
생존
코호트 A, MMR-결함성 CRC를 가진 환자들에서 중앙값 무-진행 생존 (PFS) 및 중앙값 종합적 생존 (OS)은 이르지 못하였다 (도 2). 대조적으로, 코호트 B에서 MMR-능숙 암을 가진 환자들은 단지 2.2 개월의 PFS (95% CI, 1.4-2.8) 와 5.0 개월의 중앙값 OS (95% CI, 3.0 내지 측정불가)를 획득하였다. 코호트 C (MMR-결함성 비-CRC)에서, 중앙값 PFS는 5.4 개월 (95% CI, 3 내지 측정불가)이었고, 중앙값 OS는 이르지 못하였다.
MMR-결함성 및 능숙 CRC 코호트의 사후(도 2) 비교에서 질환 진행에 대한 위험 비율(HR)(HR=0.10; 95% CI, 0.03-0.37; p<0.001)및 종합적 생존 (HR = 0.22; 95% CI, 0.05-1.00; p=0.05)에 대한 위험 비율(HR)을 보여주는데, MMR-결함성 CRC을 가진 환자들에게 유리하다.
생존에서의 차이가 예후 차이로 인한 것일 수도 있는 지를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 전이성 질환을 가진 것으로 진단을 받은 환자들의 지속 시간과 등록 전 이들의 기존 레지멘에서의 임상적 수행을 측정하였다. 전이성 질환의 지속 기간 (p=0.77; Log-순위 검정) 또는 이들의 기존 레지멘에서의 중앙값 PFS (p=0.60, Log-순위 검정)에 있어서 MMR-결함성 환자들 대비 MMR-능숙 CRC 환자들 간의 유의미적인 차이가 없었다는 것을 본 발명자들은 알았다 (도 4 (S3)). 최초 진단 이후 경과된 시간에 대하여 조정된 MMR-결함성 CRC 종양과 MMR-능숙 종양 간에 결과에서 차이를 검사하기 위하여 PFS와 OS의 다변수(multivariate) 분석을 추가로 실시하였다. MMR-결함성 종양과 MMR-능숙 종양 간의 펨브로리주맙의 상이한 효과를 나타내는 PFS (HR 0.04, 95% CI 0.01-0.21, P<0.001)와 OS (HR 0.18, 95% CI 0.03-1.01, P=0.05)에 대한 위험 비율 크기는 이와 같은 잠재적 차이에 대하여 조정된 후에도 유지되었다.
실시예 8
안전성 평가
환자들의 >5%에서 발생된 부작용 사례들은 표 3에 열거되어 있다. 선택 부작용 사례들은 발진/가려움 (24%), 갑상샘염/갑상샘저하증/뇌하수체염 (10%), 그리고 무증상 췌장염(15%)을 포함한다. 갑상선 기능 비정상의 숫자는 적지만, 이는 MMR-결함성 코호트에 제한되었다 (표 3).
실시예 9
종양 마커들
2개의 CRC 코호트에서, 기준선 CEA 수준이 수득가능하였고, 32명의 환자들중 29명은 등록 이전에 정상의 상한선 (3 mg/dl)이상이었다. MMR-결함성 CRC를 가진 10명의 환자들중 7명에서 주요 CEA 감소가 일어났으며, 그리고 CEA가 평가가능하였던 MMR-능숙 CRC를 가진 19명의 환자들중에서는 어느 누구에게도 일어나지 않았다 (도 1 및 도 5 (S4)). 비-CRC MMR-결함성 환자들중 4명의 환자들에서 종양 마커 수준 (CEA, CA19-9 또는 CA-125)은 정상의 상한선 이상으로 상승되었다. 이들 4명중 3명의 환자들에서 CA19-9 또는 CA-125가 > 70%로 감소되었다. 3개 코호트 모두의 종양 마커 역동학은 도 1에 나타낸다. 펨브로리주맙의 1 투여(dose) 후 (14 일 내지 28일 사이) CEA 감소 수준은 무-진행 (p=0.01)과 종합적 생존 결과(p=0.02)를 모두 예측하는 것이었다. CEA 반응은 질환 제어의 방사선 식별 (범위, 10 내지 35 주수(weeks))에 앞서 일어났다. 대조적으로, 진행된 환자들은 치료요법 개시 30일 안에 급속한 바이오마커 상승을 나타내었다. 따라서, CEA 수준에서의 변화는 상당히 선행되었고, 그리고 궁극적인 방사선 변화와 관련있었다.
실시예 10
게놈 분석
전체-진유전체 서열의 분석에서 MMR-능숙 환자들(n=6)의 종양당 73개의 돌연변이와 비교하였을 때, MMR-결함성 환자들 (n = 9)의 종양당 평균 1,782개의 체세포 돌연변이가 나타났다 (비-매개변수적 윌콕슨 검정, p=0.007) (도 6a-6b (S5); 표 S3 또한 참고, 이는 New England Journal of Medicine에서 온라인으로 수득가능; 본 명세서의 참고자료에 편입됨). 이들 돌연변이의 대부분 (63%)은 아미노산을 변경시키는 것으로 예측된다.
그 다음 이들 돌연변이는 각 환자의 개별 MHC 하플로타입 맥락에서 이들의 면역원적 가능성에 대하여 평가되었다. 이에 따라 본 발명자들은 MMR-결함성 환자의 종양과 MMR-능숙 환자들의 종양 각각으로부터 평균 578개 및 21개의 잠재적 돌연변이-연합된 신생항원들을 식별하였다(표 S3; 이는 New England Journal of Medicine에서 온라인으로 수득가능; 본 명세서의 참고자료에 편입됨). 모든 체세포 돌연변이중에 잠재적 돌연변이-연합된 신생항원들의 분획은 두 코호트에서 유사하였다 (MMR-결함성 환자들과 MMR-능숙 환자들에서 차례로 평균 32% 및 29%). 체세포 돌연변이의 높은 수와 잠재적 돌연변이-연합된 신생항원들은 무-진행 생존의 개선과 객관적인 반응에 우호적인 경향과 연합되어 있었다 (도 13 (S5) 및 도 12 (표 S4); 또한 New England Journal of Medicine의 온라인으로 수득가능; 본 명세서의 참고자료에 편입됨).
실시예 11
면역조직화학
CD8 및 PD-L1의 발현은 종양내 그리고 종양 조직이 수득가능하였던 30가지 사례의 침습 전방 부위에서 면역조직화학에 의해 평가되었다 (도 7 (S6); New England Journal of Medicine에서 또한 온라인으로 수득가능; 본 명세서의 참고자료에 편입됨). 코호트 A와 C의 환자들의 종양은 코호트 B 환자들의 종양보다 더 큰 밀도의 CD8-양성 림프 세포들을 포함하고 있었고 (도 8 (S7); p=0.10) 그리고 CD8-표지링은 객관적인 반응과 안정적 질환을 선호하는 경향과 연합되었다 (도 9 (S8) 및 도 13 (표 S5); New England Journal of Medicine에서 온라인으로 또한 수득가능; 본 명세서의 참고자료에 편입됨). 이 CD8-양성 림프 침윤물은 종양의 침습 전방부위에서 특히 두드러였다 (도 8 (S7); p=0.04). 유의적인 막 PD-L1 발현은 오직 MMR-결함성 환자들에서만 발생되었고, 그리고 종양의 침습 전방 부위에 위치한 종양 침윤 림프구들 (TIL)과 종양-연합된 대식세포들에서 현저하였다 (도 8 (S7); p=0.04). CD8 및 PD-L1의 발현은 PFS 또는 OS와 통계학적으로 연합되지 않았다 (도 13 (표 S5)).
환자들의 인구학적 특징 및 기준 특징들
특징 MMR-결함성 CRC MRC-능숙 CRC P 값 1 MMR-결함성 비-CRC
n=11 n=21 n=9
연령
중앙값 46 61 0.02 57
범위 (24-65) (32-79) (34-92)
성별 - 숫자. (%)
여성 5(45) 8(38) 0.72 4(44)
남성 6(55) 13(62) 5(56)
인종 - 숫자. (%)
백인 8(73) 17(81) 0.66 8(89)
흑인 1(9) 3(14) 0(0)
기타 2(18) 1(5) 1(11)
ECOG 수행 상태 - 숫자 (%)2
0 0(0) 6(29) 0.07 2(22)
1 11(100) 15(71) 7(78)
진단 -숫자 (%)
결장 9(82) 18(86) >0.99 0(0)
직장 2(18) 3(14) 0(0)
팽대부/담관암종 0(0) N/A 4(44)
자궁내막 0(0) N/A 2(22)
소장 0(0) N/A 2(22)
위 0(0) N/A 1(11)
조직학 - 숫자 (%)
잘/중간 수준으로 분화된 7(64) 18(86) 0.20 4(44)
분화가 잘 안됨 4(36) 3(14) 3(33)
기타 0(0) 0(0) 2(22)
단계 IV - 숫자 (%) (11)100 21(100) >0.99 9(100)
간 전이 - 숫자. (%) 6(55) 11(52) >0.99 6(67)
첫 진단 이후 기간 - 개월
중앙값 31 58 0.07 23
범위 6-95 27-192 2-105
기존 체계적 치료요법-숫자 (%)
0 0(0) 0(0) 0.89 1(11)
2 3(27) 4(19) 5(56)
3 3(27) 5(24) 1(11)
>4 5(45) 12(57) 2(22)
검출된 생식계열 돌연변이 또는 공지의 린지 - 숫자 (%)
있음 9(82) 0(0) <0.001 4(44)
없음 2(18) 21(100) 4(44)
모름 0(0) 0(0) 1(11)
BRAF 야생형 - 숫자 (%)
있음 8(73) 11(52) 0.64 4(44)
없음 0(0) 1(5) 0(0)
모름 3(27) 9(43) 5(56)
KRAS 야생형 - 숫자 (%)
있음 6(55) 13(62) 0.72 4(44)
없음 5(45) 8(38) 1(11)
모름 0(0) 0(0) 4(44)
MMR, 미스매치 복구; CRC, 결장직장 암1 MMR-결함성 CRC 대(versus) MMR-능숙 CRC2 ECOG, Eastern Cooperative Oncology Group
객관적인 RECIST 반응들
반응 유형 - 숫자 (%) MMR-결함성 CRC MRC-능숙 CRC MMR-결함성 비-CRC
n=10 n=18 n=7
완전한 반응 0(0) 0(0) 1(14)1
부분적 반응 4(40) 0(0) 4(57)2
안정적 질환 (12주수(weeks)) 5(50) 2(11) 0(0)
진행성 질환 1(10) 11(61) 2(29)
측정불가능3 0(0) 5(28) 0(0)
객관적인 반응율 (%) 40 0 71
95% CI 12-74 0-19 29-96
질환 제어율 (%)4 90 11 71
95% CI 55-100 1-35 29-96
반응의 지속기간 - 중앙값 주수(weeks) 도달하지 못함 N/A5 도달하지 못함
반응까지의 시간, 중앙값 주수(weeks) (범위) 28 (13-35) N/A5 11 (10-13)
1 12 주수(weeks)에서 원래 PR이 20 주수(weeks)에서 CR로 전환됨**2 12 주수(weeks)에서 하나의 PR
3 임상적 진행으로 인하여 12-주수(weeks) 스캔을 하지 않은 환자들은 평가불가능한 것으로 간주되었다.
4 질환 제어율은 12 주수(weeks) 또는 그 이상의 기간 동안 완전한 반응, 부분적 반응 또는 안정적 질환을 가진 환자들의 백분율로 정의되었다.
5 MMR-능숙 CRC 환자들에 대하여 기록된 무반응
약물-관련된 부작용 사례들
사례 - 숫자 (%) 1 모든 등급 등급 3 또는 4
N=41 N=41
임의의 40(98) 17(41)
혈액 및 림프
빈혈 8(20) 7(17)
림프구감소증 8(20) 8(20)
심장
동성 빈맥 4(10) 0
피부학
건성 피부 5(12) 0
발진/소양증 10(24) 0
내분비 장애
갑상샘염/갑상샘저하증/뇌하수체염 4(10) 0
위장관
복부 통증 10(24) 0
식욕부진 4(10) 0
변비 8(20) 0
설사 10(24) 2(5)
입안 건조 5(12) 0
욕지기 5(12) 0
장 폐쇄 3(7) 3(7)
간담즙
ALT, 상승됨 3(7) 2(5)
췌장염2 6(15) 0
대사 및 영양
저알부민혈증 4(10) 4(10)
저나트륨혈증 3(7) 3(7)
근골격
관절통 7(17) 0
근(육)통 6(15) 0
신경계통
어지럼 4(10) 0
두통 7(17) 0
정신적
불면증 3(7) 0
호흡기3
알레르기비염 12(29) 0
기침 4(10) 0
호흡곤란 6(15) 0
상부 호흡기 감염 3(7) 0
기타
추위못견딤 6(15) 0
부종 4(10) 0
피로 13(32) 0
열 5(12) 0
통증 14(34) 0
참조 언급된 각 참조의 개시내용은 본 명세서에 명시적으로 편입된다.1.Nishimura H, Okazaki T, Tanaka Y, 외. Autoimmune Dilated Cardiomyopathy in PD-1 Receptor-Deficient Mice. Science 2001;291:319-22.2.Chen L. Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity. Nat Rev Immunol 2004;4:336-47.
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Claims (18)

  1. 면역 관문 억제성 항체(immune checkpoint inhibitory antibody)를 유효성분으로 포함하는, 미소부수체 불안정성 암 (MSI, microsatellite instable cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 미소부수체 불안정성 암은 BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21, NR-24, Penta C, 및 Penta D로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 결장암, 위암, 자궁내막암, 담관암종, 췌장암, 및 전립선 암으로 구성된 군에서 선택되는, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 항-PD-1 항체인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 항-IDO 항체인, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 항-CTLA-4 항체인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 항-PD-L1 항체인, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 항-LAG-3 항체인, 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 인간화된 단클론성 항체인, 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 MK-3475인, 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 IgG4 항체인, 조성물.
  11. 다음 단계를 포함하는 생체외에서 미소부수체 불안정성 암의 치료에 관한 정보를 제공하는 방법:
    (a) BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21, NR-24, Penta C, 및 Penta D로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커들의 안정성을 평가하기 위하여, 인간유래의 샘플을 시험하는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 미소부수체 불안정성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 샘플에서 상기 BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21, NR-24, Penta C, 및 Penta D로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커가 발현되는 경우, 샘플의 암을, 면역 관문 억제성 항체를 사용하는 치료에 대해 우수한 후보자로 식별하는 단계.
  12. 다음 단계를 포함하는 생체외에서 미소부수체 안정성 암의 진단 및 치료에 관한 정보를 제공하는 방법:
    (a) BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21, NR-24, Penta C, 및 Penta D로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커들의 안정성을 평가하기 위하여, 인간 유래의 샘플을 시험하는 단계;
    (b) 상기 샘플에서 미소부수체 안정성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 샘플에서 상기 BAT-25, BAT-26, MON0-27, NR-21, NR-24, Penta C, 및 Penta D로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 미소부수체 마커가 발현되지 않는 경우, 샘플의 암을, 면역 관문 억제성 항체를 사용하는 치료에 대해 부적합 후보자로 식별하는 단계.
  13. 면역 관문 억제성 항체(immune checkpoint inhibitory antibody)를 유효성분으로 포함하는, 미소부수체 불안정성 암 (MSI, microsatellite instable cancer)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 미소부수체 불안정성 암은 종양당 100 체세포 돌연변이의 돌연변이성 부하(mutational burden)를 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 항체는 항-PD-1 항체인, 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 항체는 항-IDO 항체인, 조성물.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 항체는 항-CTLA-4 항체인, 조성물.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 항체는 항-PD-L1 항체인, 조성물.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 항체는 항-LAG-3 항체인, 조성물
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