CN103517921B - IL‑1‑α和‑β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 - Google Patents

IL‑1‑α和‑β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及工程改造的多价和多特异性结合蛋白，制备方法，和具体而言涉及其预防、诊断和/或治疗疾病中的用途。

Description

IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
交叉引用相关申请
本申请要求2010年12月21日申请的美国临时申请序列号61/425,671的优先权，其内容并入本文。
发明领域
本发明涉及多价和多特异性结合蛋白，制备方法，且特别是其在急性和慢性炎性疾病、癌症和其他疾病的诊断、预防和/或治疗中的用途。
发明背景
工程改造的蛋白，诸如结合2种或更多种抗原的多特异性抗体是本领域已知的。此种多特异性结合蛋白可以使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术来产生。
基于2种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，已使用四源杂交瘤(quadroma)技术(参见Milstein和Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40)产生了双特异性抗体，所述杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体(mAbs)。因为2种不同免疫球蛋白(Ig)重和轻链在所得到的杂合-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内随机配对，所以产生最高达10种不同Ig种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。错配对副产物的存在和显著减少的生产产量意味着需要复杂的纯化程序。
双特异性抗体也可以通过2种不同mAbs的化学缀合来产生(参见Staerz等人(1985)Nature 314(6012):628-31)。这种方法不产生均质制剂。其他方法已使用2种不同mAbs或较小抗体片段的化学缀合(参见Brennan等人(1985) Science 229(4708):81-3)。
用于产生双特异性抗体的另一种方法是用异双功能交联剂偶联2种亲本抗体，但所得到的双特异性抗体经受显著的分子异质性，因为交联剂与亲本抗体的反应不是定点的。为了获得更均质的双特异性抗体制剂，2种不同Fab片段已以定点方式在其铰链半胱氨酸残基上进行化学交联(参见Glennie等人(1987) J. Immunol. 139(7):2367-75)。但这种方法产生Fab’2片段，而不是全IgG分子。
已开发了广泛多样的其他重组双特异性抗体形式(参见Kriangkum等人(2001)Biomol. Eng. 18(2):31-40)。在它们当中，串联单链Fv分子和双抗体(diabody)、及其各种衍生物是最广泛使用的。常规地，这些分子的构建从识别不同抗原的2个单链Fv(scFv)片段开始(参见Economides等人(2003) Nat. Med. 9(1):47-52)。串联scFv分子(taFv)代表用另外的肽接头简单连接2个scFv分子的直接形式。这些串联scFv分子中存在的2个scFv片段形成分开的折叠实体。各种接头可以用于连接2个scFv片段且接头具有最多达63个残基的长度(参见Nakanishi等人(2001) Ann. Rev. Immunol. 19:423-74)。尽管亲本scFv片段可以以可溶形式在细菌中正常表达，然而，常常观察到串联scFv分子在细菌中形成不溶性聚集体。因此，重折叠方案或哺乳动物表达系统的使用常规应用于产生可溶性串联scFv分子。在近期研究中，报道了通过转基因兔和牛体内表达针对CD28的串联scFv和黑素瘤相关蛋白聚糖(参见Gracie等人(1999) J. Clin. Invest. 104(10):1393-401)。在这个构建体中，2个scFv分子通过CH1接头进行连接，且得到最高达100 mg/L的双特异性抗体血清浓度。使用各种策略包括结构域顺序变化或使用具有不同长度或柔性的中间接头，以允许在细菌中可溶性表达。几项研究现在已报道了使用非常短的Ala3接头或长的富含甘氨酸/丝氨酸接头，在细菌中表达可溶性串联scFv分子(参见Leung等人(2000) J. Immunol. 164(12):6495-502；Ito等人(2003) J. Immunol. 170(9):4802-9；Karni等人(2002) J. Neuroimmunol.125(1-2):134-40)。在近期研究中，包含长度为3或6个残基的随机化中间接头的串联scFv所有组成成分(repertoire)的噬菌体展示，用于富集以可溶和活性形式在细菌中产生的那些分子。这种方法导致分离具有6个氨基酸残基接头的串联scFv分子(参见Arndt和Krauss(2003) Methods Mol. Biol. 207:305-21)。这种接头序列是否代表串联scFv分子可溶性表达的一般解决方案仍不清楚。然而，这项研究证明串联scFv分子的噬菌体展示与定向诱变组合是富集这些分子的有力工具，所述分子可以以活性形式在细菌中表达。
双特异性双抗体(Db)利用双抗体形式用于进行表达。通过使连接VH和VL结构域的接头长度减少至约5个残基，由scFv片段产生双抗体(参见Peipp和Valerius (2002)Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-11)。接头大小的这种减少通过使VH和VL结构域交叉配对促进2条多肽链的二聚化。双特异性双抗体通过在相同细胞内表达2条多肽链来产生，所述2条多肽链具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)、或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)。在过去已产生了品种繁多的不同双特异性双抗体，且它们中的大多数以可溶形式在细菌中表达。然而，近期的比较研究证明可变结构域的方向可以影响活性结合位点的表达和形成(参见Mack等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15):7021-5)。然而，在细菌中的可溶性表达代表超过串联scFv分子的重要优点。然而，因为2条不同多肽链在单一细胞内表达，所以可以产生无活性同源二聚体连同活性异源二聚体。这使另外纯化步骤的进行成为必需，以获得双特异性双抗体的均质制剂。促使双特异性双抗体产生的一种方法是把手进孔(knob-into-hole)双抗体的产生(参见Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90(14):6444-8.18)。这对于针对HER2和CD3的双特异性双抗体进行了证明。通过用Phe交换Val37和用Trp交换Leu45将大把手引入VH结构域内，且在抗HER2或抗CD3可变结构域中，通过使Phe98突变为Met和使Tyr87突变为Ala在VL结构域中产生互补孔。通过使用这种方法，双特异性双抗体的产生可以从通过亲本双抗体的72％增至通过把手进孔双抗体的超过90％。重要的是，作为这些突变的结果的生产产量只有轻微减少。然而，对于几种构建体观察到抗原结合活性的减少。因此，这种相当精细的方法需要分析各种构建体，以鉴定产生具有不变结合活性的异源二聚分子的那些突变。此外，此种方法需要免疫球蛋白序列在恒定区的突变修饰，因此生成非天然和非自然形式的抗体序列，这可以导致免疫原性增加、体内稳定性差、以及不希望的药物代谢动力学。
单链双抗体(scDb)代表改善双特异性双抗体样分子形成的可替代策略(参见Holliger和Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4):128-30；Wu等人(1996) Immunotechnology 2(1):21-36)。双特异性单链双抗体通过用另外的中间接头连接2条双抗体形成多肽链来产生，所述另外的中间接头长度为约15个氨基酸残基。因此，分子量对应于单体单链双抗体(50－60 kDa)的所有分子都是双特异性的。几项研究已证明双特异性单链双抗体在细菌中以可溶和活性形式表达，其中大多数纯化的分子呈现为单体(参见Holliger和Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4):128-30；Wu等人(1996) Immunotechnol.2(1):21-36；Pluckthun和Pack (1997) Immunotechnol.3(2):83-105；Ridgway等人(1996) Protein Engin.9(7):617-21)。因此，单链双抗体组合了串联scFvs(所有单体都是双特异性的)和双抗体(在细菌中可溶性表达)的优点。
更近地，双抗体已与Fc融合以产生更Ig样的分子，称为双-双抗体(di-diabodies)(参见Lu等人(2004) J. Biol. Chem. 279(4):2856-65)。此外，已描述了在IgG重链中包含2个Fab重复且结合4个抗原分子的多价抗体构建体(参见PCT公开号 WO 0177342, 和Miller等人(2003) J. Immunol. 170(9):4854-61)。
本领域需要结合2种或更多种抗原的改善的多价结合蛋白。美国专利号7,612,181提供了以高亲和力结合2种或更多种抗原的结合蛋白新家族，且其被称为双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)。本发明提供了进一步新的结合两种或更多种抗原的结合蛋白。
发明概述
本发明涉及结合两种或更多种抗原的多价结合蛋白。本发明提供了以高亲和力结合两种或更多种抗原的结合蛋白的新家族。
在一个实施方案中，本发明提供了包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc区且n是0或1。在一个实施方案中，结合蛋白中的VD1和VD2是重链可变结构域。在另一个实施方案中，重链可变结构域选自鼠重链可变结构域、人重链可变结构域、CDR嫁接的重链可变结构域、和人源化重链可变结构域。在又另一个实施方案中，VD1和VD2结合相同抗原。在另一个实施方案中，VD1和VD2结合不同抗原。在又另一个实施方案中，C是重链恒定结构域。例如，X1是接头，条件是X1不是CH1。例如，X1是选自下列的接头：
。
在一个实施方案中，X2是Fc区。在另一个实施方案中，X2是变体Fc区。
在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区。
在一个实施方案中，结合蛋白中的VD1和VD2是轻链可变结构域。在一个实施方案中，轻链可变结构域选自鼠轻链可变结构域、人轻链可变结构域、CDR嫁接的轻链可变结构域、和人源化轻链可变结构域。在一个实施方案中，VD1和VD2结合相同抗原。在另一个实施方案中，VD1和VD2结合不同抗原。在一个实施方案中，C是轻链恒定结构域。在另一个实施方案中，X1是接头，条件是X1不是CL1。在一个实施方案中，X1是选自下列的接头：
。
在一个实施方案中，结合蛋白不包含X2。
在一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含相同接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链包含不同接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含短(约6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，可变重链和可变轻链均包含长(多于6个氨基酸)接头。在另一个实施方案中，可变重链包含短接头且可变轻链包含长接头。在另一个实施方案中，可变重链包含长接头且可变轻链包含短接头。
在一个实施方案中，本文公开的结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含2条多肽链的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区；且所述第二多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。在特定实施方案中，双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含4条多肽链，其中首先两条多肽链分别包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2是Fc区；且其次两条多肽链分别包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，且X2不包含Fc区。此种双重可变结构域(DVD)结合蛋白具有4个抗原结合位点。
在另一个实施方案中，本文公开的结合蛋白结合一种或多种靶。在一个实施方案中，靶选自细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体。在另一个实施方案中，结合蛋白调节一种或多种靶的生物学功能。在另一个实施方案中，结合蛋白中和一种或多种靶。本发明的结合蛋白结合细胞因子，所述细胞因子选自淋巴因子、单核因子、多肽激素、受体或肿瘤标记。例如，本发明的DVD-Igs能够结合下述的两种或更多种：白介素-1 α(IL-1α)和白介素-2 β(IL-1β)。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq.3)和IL-1β (seq.1)的结合蛋白包含SEQ IDNO. 52的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 53的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq.2)和IL-1β (seq.1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO. 54和SEQ ID NO. 56的DVD-Ig重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO. 55和SEQID NO. 57的DVD-Ig轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 2)和IL-1β(seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID NO. 54的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 55的DVD-Ig轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 2)和IL-1β (seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID NO. 56的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 57的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 1)和IL-1β(seq. 1)的结合蛋白包含选自SEQ ID NO. 58和SEQ ID NO. 60的DVD-Ig重链氨基酸序列；和选自SEQ ID NO. 59和SEQID NO. 61的DVD-Ig轻链氨基酸序列。在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 1)和IL-1β(seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID NO. 58的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 59的DVD-Ig轻链氨基酸序列。在另一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 1)和IL-1β(seq. 1)的结合蛋白包含SEQ ID NO. 60的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 61的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 3)和IL-1β(seq. 2)的结合蛋白包含SEQID NO. 62的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 63的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 4)和IL-1β(seq. 2)的结合蛋白包含SEQID NO. 64的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 65的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 4)和IL-1β(seq. 3)的结合蛋白包含SEQID NO. 66的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 67的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 4)和IL-1β(seq. 4)的结合蛋白包含SEQID NO. 68的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 69的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合IL-1α (seq. 4)和IL-1β(seq. 5)的结合蛋白包含SEQID NO. 70的DVD-Ig重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 71的DVD-Ig轻链氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。在一个实施方案中，Fc区不存在于结合蛋白中。
在另一个实施方案中，本发明提供包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。在一个实施方案中，(X2)n不存在于结合蛋白中。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白包含第一和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。在另一个实施方案中，结合蛋白包含两条第一多肽链和两条第二多肽链。在又另一个实施方案中，(X2)n不存在于第二个多肽中。在又另一个实施方案中，Fc区，如果存在于第一多肽中，选自天然的序列Fc区和变体序列Fc区。在又另一个实施方案中，Fc区选自来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD的Fc区。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白是结合两种抗原且包含四条多肽链的DVD-Ig，其中所述第一和第三多肽链的每一条包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；且其中所述第二和第四多肽链的每一条包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在。
本发明提供通过预选择亲本抗体制备DVD-Ig结合蛋白的方法。在一个实施方案中，制备结合两种抗原的双重可变结构域免疫球蛋白的方法，包括步骤a)获得结合第一种抗原的第一亲本抗体或其抗原结合部分；b)获得结合第二种抗原的第二亲本抗体或其抗原结合部分；c)构建第一和第三多肽链，其中每一条包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从所述第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从所述第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；d)构建第二和第四多肽链，其中每一条包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从所述第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从所述第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；和e)表达所述第一、第二、第三和第四多肽链；从而生成结合所述第一种和所述第二种抗原的DVD-Ig分子。
在又另一个实施方案中，本发明提供生成具有所需特性的结合两种抗原的DVD-Ig分子的方法，包括步骤a) 获得第一亲本抗体或其抗原结合部分，其结合第一种抗原且具有至少一种由DVD-Ig分子表现的所需特性；b)获得第二亲本抗体或其抗原结合部分，其结合第二种抗原且具有至少一种由DVD-Ig分子表现的所需特性；c) 构建包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的第一和第三多肽链，其中VD1是从所述第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个重链可变结构域；VD2是从所述第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n是Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；d) 构建包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的第二和第四多肽链，其中VD1是从所述第一亲本抗体或其抗原结合部分获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从所述第二亲本抗体或其抗原结合部分获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体或其抗原结合部分可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，条件是它不是CH1，其中所述(X1)n存在或不存在；且(X2)n不包含Fc区，其中所述(X2)n存在或不存在；e)表达所述第一、第二、第三和第四多肽链；从而生成具有所需特性的结合所述第一种和所述第二种抗原的双重可变结构域免疫球蛋白。
在一个实施方案中，本文公开的第一和第二多肽链的VDI是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，本文公开的第一和第二多肽链的VDI是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，本文公开的第一和第二多肽链的VD2是从相同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。在另一个实施方案中，本文公开的第一和第二多肽链的VD2是从不同亲本抗体或其抗原结合部分获得的。
在一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分与第二亲本抗体或其抗原结合部分是相同抗体。在另一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分与第二亲本抗体或其抗原结合部分是不同抗体。
在一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一种抗原，且第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二种抗原。在特定实施方案中，第一种和第二种抗原是相同抗原。在另一个实施方案中，亲本抗体结合相同抗原上的不同表位。在另一个实施方案中，第一种和第二种抗原是不同抗原。在另一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一种抗原，其效价不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二种抗原的效价。在又另一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分结合第一种抗原，其亲和力不同于第二亲本抗体或其抗原结合部分结合第二种抗原的亲和力。
在另一个实施方案中，第一亲本抗体或其抗原结合部分，和第二亲本抗体或其抗原结合部分，选自人抗体、CDR嫁接的抗体、和人源化抗体。在一个实施方案中，抗原结合部分选自Fab片段，F(ab')2片段，包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，dAb片段，分离的互补性决定区(CDR)，单链抗体，和双抗体。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有至少一种由第一亲本抗体或其抗原结合部分、或第二亲本抗体或其抗原结合部分表现的所需特性。可替代地，第一亲本抗体或其抗原结合部分和第二亲本抗体或其抗原结合部分具有至少一种由双重可变结构域免疫球蛋白表现的所需特性。在一个实施方案中，所需特性选自一种或多种抗体参数。在另一个实施方案中，抗体参数选自抗原特异性、对抗原的亲和力、效价、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用度、组织交叉反应性、和直向同源抗原结合。在一个实施方案中，结合蛋白是多价的。在另一个实施方案中，结合蛋白是多特异性的。本文所述的多价和或多特异性结合蛋白具有特别从治疗观点来看需要的特性。例如，多价和或多特异性结合蛋白可以(1)通过表达抗体与之结合的抗原的细胞比二价抗体更快速内在化(和/或发生分解代谢)；(2)是激动剂抗体；和/或(3)诱导表达多价抗体与之结合的抗原的细胞的细胞死亡和/或细胞凋亡。提供多价和或多特异性结合蛋白的至少一种抗原结合特异性的“亲本抗体”可以是，通过表达抗体与之结合的抗原的细胞内在化(和/或发生分解代谢)的抗体；和/或可以是激动剂、细胞死亡诱导、和/或细胞凋亡诱导性抗体，且如本文所述的多价和或多特异性结合蛋白可以展示这些特性中的一种或多种中的改善。此外，亲本抗体可以缺乏这些特性中的任何一种或多种，但如本文所述构建为多价结合蛋白时可以赋予这些特性。
在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白对于一种或多种靶具有选自如下的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；和至少约106M-1s-1。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白对于一种或多种靶具有如下结合速率常数(Kon)：约102M- 1s-1 和约103M-1s-1之间；约103M-1s-1和约104M-1s-1之间；约104M-1s-1和约105M-1s-1之间；或约105M-1s-1 和约106M-1s-1之间。
在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，结合蛋白对于一种或多种靶具有选自如下的解离速率(off rate)常数(Koff)：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；和至多约10-6s-1。在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白对于一种或多种靶具有如下解离速率常数(Koff)：约10-3s-1－约10-4s-1；约10-4s-1－约10-5s-1；或约10-5s-1－约10-6s-1。
在另一个实施方案中，结合蛋白对于一种或多种靶具有选自如下的解离常数(KD)：至多约10-7 M；至多约10-8 M；至多约10-9 M；至多约10-10 M；至多约10-11 M；至多约10-12 M；和至多约10-13 M。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白对于其靶具有如下解离常数(KD)：约10-7 M－约10-8 M；约10-8 M－约10-9 M；约10-9 M－约10-10 M；约10-10－约10-11 M；约10-11 M－约10-12 M；或约10-12M－约10-13 M。
在另一个实施方案中，本文所述的结合蛋白是进一步包含试剂的缀合物，所述试剂选自免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个实施方案中，显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。在另一个实施方案中，显像剂是选自下列的放射性标记：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。在又另一个实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，本文所述的结合蛋白结合细胞蛋白和试剂，所述细胞蛋白和试剂选自免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。在一个实施方案中，显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。在另一个实施方案中，显像剂是选自下列的放射性标记：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和sureSm。在又另一个实施方案中，治疗剂或细胞毒性剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，本文所述的结合蛋白是结晶结合蛋白且作为晶体存在。在一个实施方案中，晶体是无载体的药学控释晶体。在又另一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性对应物更长的体内半衰期。在又另一个实施方案中，结晶结合蛋白保留生物学活性。
在另一个实施方案中，本文所述的结合蛋白是糖基化的。例如，糖基化是人糖基化模式。
本发明的一个方面涉及分离的核酸，所述分离的核酸编码本文公开的任一种结合蛋白。进一步的实施方案提供了包含本文公开的分离的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT(Durocher等人(2002) Nucl. Acids Res.30:2；pTT3 (具有额外的多克隆位点的pTT；pEFBOS (Mizushima和Nagata, (1990) Nucl. Acids Res. 18:17)；pBV；pJV；pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO和pBJ。在一个实施方案中，该载体是在美国专利公开号20090239259中公开的载体。
在另一个方面，宿主细胞用本文公开的载体转化。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E. coli)。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。在又另一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，CHO、COS；NS0、SP2、PER.C6或真菌细胞诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆虫细胞诸如Sf9。
在一个实施方案中，在单一重组宿主细胞中产生例如具有不同特异性的两种或更多种DVD-Igs。例如，已将抗体混合物的表达称为OligoclonicsTM Merus B.V., TheNetherlands；美国专利号7,262,028和7,429,486。
本发明的另一个方面提供了产生本文公开的结合蛋白的方法，所述方法包括在足以产生结合蛋白的条件下，在培养基中培养同样在本文公开的任一种宿主细胞。在一个实施方案中，通过这种方法产生的50%-75% 的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在特定实施方案中，通过这种方法产生的75%-90%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。在特定实施方案中，产生的90%-95%的结合蛋白是双重特异性四价结合蛋白。
一个实施方案提供了用于释放结合蛋白的组合物，其中所述组合物包含制剂，所述制剂依次包含如本文公开的结晶结合蛋白和成分，以及至少一种聚合载体。例如，聚合载体包含选自下列的一种或多种聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。例如，成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方案提供了用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的本文公开的组合物的步骤。
本发明还提供了包含如本文公开的结合蛋白和药学可接受载体的药物组合物。在进一步的实施方案中，药物组合物包含用于治疗病症的至少一种另外的治疗剂。例如，另外的试剂选自：治疗剂、显像剂、细胞毒性剂、血管生成抑制剂(包括但不限于抗VEGF抗体或VEGF-trap)、激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)、共刺激分子阻断剂(包括但不限于抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗CD20)、粘附分子阻断剂(包括但不限于抗LFA-1抗体、抗E/L选择蛋白抗体、小分子抑制剂)、抗细胞因子抗体或其功能片段(包括但不限于抗IL-18、抗TNF、和抗IL-6/细胞因子受体抗体)、氨甲蝶呤、环孢菌素、雷帕霉素、FK506、可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉弛缓剂、麻醉药、非类固醇消炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、刺激剂、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子、和细胞因子拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗患有病症的人受试者的方法，在所述病症中能够由本文公开的结合蛋白结合的一种或多种靶是有害的，所述方法包括给人受试者施用本文公开的结合蛋白，从而使得人受试者中的一种或多种靶的活性被抑制，并且多种症状之一减轻或达到治疗。例如，病症选自关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合症、慢性疲乏综合症、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合症、脓毒病综合症、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合症、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、 Schmidt氏综合症、成人(急性)呼吸窘迫综合症、秃头、斑秃(alopecia areata)、血清反应阴性关节病(arthopathy)、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病(spondyloarthopathy)、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷综合症、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、卵巢早衰、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjögren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(典型自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎(vasulitis)、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合症、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjörgren氏综合症、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(choleosatatis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症诸如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症(Abetalipoprotemia)、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(aerial)异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞(horn cell)变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合症、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤(aneuryisms)、主动脉夹层、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合症、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆(Dementia pugilistica)、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症(diabetes)、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性(ateriosclerotic)疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合症、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性(hematophagocytic)淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(甲型)、希氏束心律失常(arrythmias)、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流行性感冒、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿(lymphederma)、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性疾病、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合症、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎(epidydimitis)、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合症/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化(atherlosclerotic)疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合症(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合症)、灌注后综合症、泵后综合症、MI心切开术后综合症、先兆子痫、进行性核上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合症、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常(arrythmias)、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应(anaphalaxis)、全身炎症反应综合症、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞(hemaphagocytic)综合症、Wernicke-Korsakoff综合症、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合症、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合症、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合症(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合症、乳糜泻、颈椎关节强直(Cervical Spondylosis)、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合症(clinically isolated syndrome)( CIS)、结膜炎、幼年起病的精神病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出(diskherniation)、椎间盘脱垂(disk prolaps)、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合症(GBS)、枯草热、Hughes综合症、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、包含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾疾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎(keratojuntivitissicca)、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉氏(Langerhan’s)细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、morbus bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合症、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合症、多肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵后综合症(post-pump syndrome)、原发性帕金森综合症、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、sneddon-wilkinson皮肤病、强直性脊柱炎(spondilitis ankylosans)、Stevens-Johnson综合症(SJS)、全身性炎症反应综合症、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体，I型变态反应，II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合症(VKH综合症)、湿黄斑变性、伤口愈合、耶尔森氏菌(yersinia)和沙门氏菌(salmonella)相关的关节病。
在一个实施方案中，可以用本发明的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜的肿瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)，从造血恶性肿瘤诸如白血病产生的实体瘤，和淋巴瘤(何杰金与非何杰金淋巴瘤)。
在一个实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合部分在单独地或与放射治疗和/或其他化疗剂组合地使用时，用于治疗癌症或预防或抑制来自本文所述的肿瘤的转移。
在另一个方面，本发明提供了治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括在如本文讨论的第二种试剂施用之前、同时或之后，施用本文公开的任一种结合蛋白的步骤。在特定实施方案中，第二种试剂选自布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β mAbs，抗IL-6或IL-6受体mAbs，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体或激动剂，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞信号传递抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ。
在特定实施方案中，本文公开的药物组合物通过至少一种选自下列的方式给患者施用：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intrarticular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、大剂量(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。
本发明的一个方面提供了至少一种本发明的至少一种结合蛋白的抗独特型抗体。抗独特型抗体包括包含分子的任何蛋白或肽，所述分子包含至少部分免疫球蛋白分子，诸如但不限于，重或轻链的至少一个互补性决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，构架区，或其可以并入本发明的结合蛋白内的任何部分。
附图简述
图1A是双重可变结构域(DVD)-Ig构建体的示意图示，且显示了从2种亲本抗体产生DVD-Ig的策略；
图1B是构建体DVD1-Ig、DVD2-Ig，以及来自杂交瘤克隆2D13.E3(抗-IL-1α)和13F5.G5(抗-IL-1β)的2种嵌合单特异性抗体的示意图示。
发明详述
本发明涉及结合两种或更多种抗原的多价和/或多特异性结合蛋白。特别地，本发明涉及双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)，和其药物组合物，以及用于制备这种DVD-Igs的核酸、重组表达载体和宿主细胞。本发明还包括在体外或体内使用本发明的DVD-Igs来检测特定抗原的方法。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式，诸如“包括”和“包括”的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语诸如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者治疗。
为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。除非另外与上下文矛盾，术语“多肽”包含多肽和其片段及变体(包括变体的片段)。对于抗原多肽，多肽片段任选含有至少一个连续或非线性多肽表位。可以使用本领域普通方法确定至少一个表位片段的精确边界。该片段包含至少约5个邻接氨基酸，诸如至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、或至少约20个邻接氨基酸。多肽变体如本文所述。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。
术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类诸如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。
术语“生物学活性”指分子的任一项或多项固有生物学特性(无论是如体内发现的那样天然存在的，还是通过重组方法提供或使成为可能的)。生物学特性包括但不限于结合受体；诱导细胞增殖，抑制细胞生长，诱导其他细胞因子，诱导细胞凋亡，和酶促活性。生物学活性也包括Ig分子的活性。
关于抗体、蛋白、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白结构结合而不是一般地与蛋白结合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
术语“抗体”广泛地指由4条多肽链－2条重(H)链和2条轻(L)链组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生物。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域－CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，通过分别与FcγRs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。在又另一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。免疫球蛋白的2条相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化来介导，且通过铰链区内的二硫键来稳定(Huber等人 (1976) Nature 264:415-20；Thies等人(1999) J. Mol. Biol. 293:67-79.)。铰链区内的半胱氨酸残基突变以阻止重链-重链二硫键将使CH3结构域的二聚化不稳定。负责CH3二聚化的残基已得到鉴定 (Dall’Acqua (1998) Biochem. 37:9266-73.)。因此，可能产生单价半-Ig。有趣的是，已在自然界中发现关于IgG和IgA亚类的这些单价半Ig分子(Seligman (1978) Ann. Immunol. 129:855-70；Biewenga等人(1983) Clin. Exp.Immunol. 51:395-400)。FcRn：Ig Fc区的化学计量已测定为2：1(West等人(2000)Biochem. 39:9698-708)，且半Fc足以介导FcRn结合(Kim等人(1994) Eur. J. Immunol.24:542-548.)。破坏CH3结构域二聚化的突变可能对其FcRn结合没有更大的不利作用，因为对于CH3二聚化重要的残基位于CH3 b折叠结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。然而，由于其比常规抗体的那种更小的大小，半Ig分子可以在组织穿透中具有某些优点。在一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fc区中进行替换，从而使得重链的二聚化被破坏，从而产生半DVD Ig分子。IgG的抗炎症活性完全取决于IgG Fc片段N-连接的聚糖的唾液酸化作用。已经确定了对抗炎症活性准确的聚糖要求，从而使得可以生成合适的IgG1 Fc片段，从而生成具有大大增强的效价的完全重组的唾液酸化IgG1 Fc (Anthony等人(2008) Science 320:373-376)。
术语抗体的“抗原结合部分”指保留与抗原特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来进行。此种抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性、或多特异性形式；与2种或更多不同抗原特异性结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')2片段，包含在铰链区由二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人 (1989) Nature 341:544-546, PCT公开WO 90/05144)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白链制备，在所述单条蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子 (称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988) Science 242:423-426；和Huston等人(1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此种单链抗体也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体诸如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合位点(参见例如，Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。此种抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel编辑，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 第790页(ISBN 3-540-41354-5)。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域(Zapata等人(1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
术语“多价结合蛋白”在本说明书自始至终用于指包含2个或更多抗原结合位点的结合蛋白。在一个实施方案中，多价结合蛋白经工程改造为具有3个或更多抗原结合位点，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指结合2种或更多相关或无关靶的结合蛋白。本发明的双重可变结构域(DVD)结合蛋白包含2个或更多抗原结合位点，且是四价或多价结合蛋白。DVDs可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多种抗原。包含2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白被称为DVD-Ig。每一半DVD-Ig包含重链DVD多肽，和轻链DVD多肽，和2个抗原结合位点。每个结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合位点总共6个参与抗原结合的CDR。
术语“双特异性抗体”指通过下述产生的全长抗体，四源杂交瘤技术(参见Milstein和Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40)，2种不同单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz等人(1985) Nature 314(6012):628-31), 或把手进孔或在Fc区中引入突变的类似方法(参见Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14):6444-8.18)，从而导致其中只有一种是功能性双特异性抗体的多种不同免疫球蛋白种类。通过分子功能，双特异性抗体在其2个结合臂之一(一对HC/LC)上结合一种抗原(或表位)，且在其第二个臂(不同对的HC/LC)上结合不同抗原(或表位)。通过这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，且对于其结合的每种抗原是单价的。
术语“双重特异性抗体”指可以在其2个结合臂的每一个中(一对HC/LC)结合2种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开号 WO 02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有2个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其结合的每种抗原是二价的。
结合蛋白的“功能性抗原结合位点”是结合靶抗原的结合位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必与抗原结合位点由其衍生的亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评估与抗原结合的抗体的多种方法中的任何一种测量的。此外，本文的多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力无需在量上相同。
术语“细胞因子”是由一种细胞群体释放的蛋白的一般术语，所述蛋白作为细胞间介质作用于另一种细胞群体。此种细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。在细胞因子中包括的是生长激素诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素诸如促卵胞激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)，和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β；米勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子诸如NGF-α；血小板生长因子；胎盘生长因子，转化生长因子(TGFs)诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-1和-11；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ集落刺激因子(CSFs)诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(ILs)诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、和IL-33；肿瘤坏死因子诸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物学活性等价物。
术语“接头”用于指包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基的多肽，且用于连接一个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的(参见例如， Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994) Structure2:1121-1123)。示例性接头包括但不限于，
。
免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的。
术语“单克隆抗体”或“mAb”指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对照，每种mAb针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何具体方法产生抗体。
术语“人抗体”包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”不预期包括其中来源于另一种哺乳动物物种诸如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(在下文部分II C中进一步描述)，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom (1997) TIB Tech. 15:62-70；Azzazy和Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35:425-445；Gavilondo和Larrick (2002)BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom和Chames (2000) Immunol. Today 21:371-378)，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见，Taylor等人 (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295；Kellermann和Green (2002) CurrentOpin. Biotechnol. 13:593-597；Little等人(2000) Immunol. Today 21:364-370)，或通过包括使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的人抗体种系所有组成成分内非天然存在的序列。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDRs中具有一种或多种改变的抗体，与没有那些改变的亲本抗体相比较，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。示例性的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序来产生。Marks等人(1992) Bio/Technology 10:779-783描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由下述描述：Barbas等人(1994)Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813；Schier等人(1995) Gene 169:147- 155；Yelton等人(1995) J. Immunol. 155:1994-2004；Jackson等人(1995) J. Immunol. 154(7):3310-9；Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896以及如美国专利号6,914,128中所述的具有活性增强氨基酸残基在选择性诱变位置、接触或高变位置的选择性突变。
术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，诸如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。
术语“CDR嫁接的抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域的序列用另一个物种的CDR序列替换，诸如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDRs(例如，CDR3)已用人CDR序列替换。
术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重和轻链可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变成更“人样”，即更类似于人种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接的抗体，其中将非人CDR序列引入人VH和VL序列以替换相应的人CDR序列。“人源化抗体”也是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区、和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补性决定区(CDR)。在CDR上下文中的术语“基本上”指具有的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％等同于非人抗体CDR的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含基本上所有至少一个、且一般为2个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’) 2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方案中，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3、和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。在特定的实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”本文可互换使用。本领域众所周知的这些术语指氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人 (1971) Ann. NY Acad. Sci.190:382-391和Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH PublicationNo. 91-3242)。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31－35，对于CDR2为氨基酸位置50－65，且对于CDR3为氨基酸位置95－102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24－34，对于CDR2为氨基酸位置50－56，且对于CDR3为氨基酸位置89－97。
术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”指在结合抗原的单个可变区中出现的3个CDRs的组。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat (Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol.196:901-917以及Chothia等人(1989) Nature 342:877-883)发现Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139和MacCallum (1996) J.Mol. Biol. 262(5):732-45)描述。再其他的CDR边界定义可能不严格地遵循本文所述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种限定的CDRs，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDRs。
术语“构架”或“构架序列”指减去CDRs的可变区的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同系统来决定，所以对构架序列的含义进行相应不同的解释。6个CDRs(轻链的CDR-L1、-L2和-L3，以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)也将轻链和重链上的构架区分成在每条链上的4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，且CDR3位于FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人提及的，构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FR's。FR代表4个亚区之一，且FRs代表构成构架区的4个亚区中的2个或更多。
术语“种系抗体基因”或“基因片段”指由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞尚未经历成熟过程，所述成熟过程导致用于表达特定免疫球蛋白的遗传重排和突变 (参见例如，Shapiro等人(2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200；Marchalonis等人(2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30)。由各种本发明的实施方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体特有的基本氨基酸序列结构，因此当在那个物种中治疗上使用时，更不可能被识别为来自外来来源。
术语“中和”指当结合蛋白特异性结合抗原时，抵消抗原的生物学活性。在一个实施方案中，中和结合蛋白结合细胞因子且使其生物学活性减少至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。
术语“活性”包括活性诸如DVD-Ig对于2种或更多种抗原的结合特异性和亲和力。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面定组(grouping)，且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。因此，表位由已知结合于特异性结合伴侣上的互补位点的抗原(或其片段)区域的氨基酸残基组成。抗原片段可以包含多于一个表位。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子复杂混合物中识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。如果抗体交叉竞争(一个阻止另一个的结合或调谐作用)，则将抗体称为“结合相同表位”。另外，表位的结构性定义(重叠、类似、同一)是提供信息的，但是功能性定义往往更加相关，因为它们包含了结构性(结合)和功能性(调谐、竞争)参数。
术语“表面等离振子共振”指通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度改变，例如使用BIAcore®系统(BIAcore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala,Sweden和Piscataway, NJ)，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步的描述，参见Jönsson等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jönsson等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson等人(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；和Johnnson,等人 (1991) Anal. Biochem. 198:268-277。
如本领域已知的，术语“Kon”指结合蛋白(例如抗体)与抗原结合以形成例如抗体/抗原复合物的结合速率常数。也将“Kon”称为术语“结合速率常数”或“ka”，如本文中可互换使用的。该值指示抗体与其靶抗原的结合速率、或抗体与抗原之间的复合物形成速率，其也由下列方程表示：
抗体(“Ab”) + 抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本领域已知的，术语“Koff”指结合蛋白(例如抗体)从例如抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数或“解离速率常数”。也将“Koff”称为术语“解离速率常数”或“kd”，如本文中可互换使用的。该值指示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间过去分离为游离抗体和抗原的解离速率，其由下列方程表示：
Ab + Ag←Ab-Ag。
术语“KD”指“平衡解离常数”或“KD”，如本文中可互换使用的，指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)所获得的值。使用结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数表示抗体对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域众所周知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。可以使用其他实验途径和仪器诸如BIAcore®(生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcore International AB，a GE Healthcare company，Uppsala，瑞典获得的仪器)。另外，也可以使用可以从Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)获得的KinExA®(动态排阻测定(Kinetic Exclusion Assay))测定。
“标记”和“可检测标记”指附着在特异性结合伴侣诸如抗体或分析物的部分，以例如使特异性结合对的成员诸如抗体和分析物之间的反应可以检测，而将这样标记的特异性结合伴侣诸如抗体或分析物称为“可检测地标记的”。因而，术语“标记的结合蛋白”指具有标记并入的蛋白，所述标记提供了结合蛋白的鉴定。在一个实施方案中，标记是可检测标记，其可以产生能通过目视或仪器工具检测的信号，例如，并入放射性标记的氨基酸或使生物素化(biotinyl)部分与多肽附着，所述生物素化部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)进行检测。关于多肽的标记实例包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm)；色原，荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素化基团；由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于二抗的结合位点、金属结合结构域、和表位标签)；和磁性试剂，诸如钆螯合物。免疫测定一般采用的代表性标记实例包括产生光的部分，例如吖啶鎓(acridinium)化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。其他标记如本文所述。在这点上，部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。使用“可检测地标记的”意指包含后一种类型的可检测标记。
术语“缀合物”指与第二化学部分，诸如治疗或细胞毒性剂化学连接的结合蛋白诸如抗体。术语“试剂”表示化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。在一个实施方案中，治疗或细胞毒性剂包括但不限于，百日咳毒素、紫素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。在免疫测定上下文中采用时，缀合抗体可以是用作检测抗体的可检测地标记的抗体。
术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的结合蛋白(例如抗体)或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，它不同于其他形式诸如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子(例如，蛋白诸如抗体)、或分子装配体(assembly)(例如，抗原/抗体复合物)组成。这些三维排列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。符合给定、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有3个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giege和Ducruix (1999) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach, 第二版，第20 1-16页, Oxford University Press, New York,New York。
术语“多核苷酸”意指2个或更多核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA。
术语“分离的多核苷酸”应意指下述多核苷酸(例如，基因组的、cDNA、或合成来源的，或其一些组合)，由于其来源，“分离的多核苷酸”不与在自然界中发现“分离的多核苷酸”与之结合的全部或部分多核苷酸结合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸可操作地连接；或在自然界中不作为较大序列的部分存在。
术语“载体”意指能够运输它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意在包括这种其他形式的表达载体，诸如提供等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，和反式或在远处起作用以控制目的基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和需要时，增强蛋白分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，此种控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在是表达和加工必需的组分，且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合伴侣序列。
“转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞含有两个或更多(例如多个)编码抗体的核酸，诸如，例如在美国专利号7,262,028中所述的宿主细胞。此种术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在随后世代中出现某些修饰，所以此种后代实际上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生物界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的来进行。前述技术和程序一般可以根据本领域众所周知以及如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。参见例如，Sambrook等人(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。
如本领域已知的，“转基因生物”指具有包含转基因的细胞的生物，其中引入生物(或生物祖先)内的转基因表达在该生物中非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，所述DNA构建体稳定且可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，从而指导编码的基因产物在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中表达。
术语“调节”和“调谐”指目的分子活性(例如，细胞因子的生物学活性)中的变化或改变。调谐可以是目的分子的某一活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于，结合特征、酶促活性、细胞受体激活、和信号转导。
相应地，术语“调节剂”是能够变化或改变目的分子活性或功能(例如，细胞因子的生物学活性)的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可以引起分子某一活性或功能量级中的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是减少分子至少一种活性或功能量级的抑制剂。示例性抑制剂包括但不限于，蛋白、肽、抗体、肽体(peptibodies)、碳水化合物或小有机分子。肽体在例如PCT公开号 WO01/83525中描述。
术语“激动剂”指当与目的分子接触时，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的增加的调节剂。具体目的激动剂可以包括但不限于，多肽、核酸、碳水化合物、或与抗原结合的任何其他分子。
术语“拮抗剂”或“抑制剂”指当与目的分子接触时，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的减少的调节剂。具体目的拮抗剂包括阻断或调节抗原生物学或免疫活性的那些。抗原拮抗剂和抑制剂可以包括但不限于，蛋白、核酸、碳水化合物、或与抗原结合的任何其他分子。
术语“有效量”指疗法的量，其足以减少或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，抑制或预防病症进展，引起病症消退，抑制或预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展，检测病症，或增强或改善另一种疗法(例如，预防或治疗剂)的预防或治疗作用。
本文术语“患者”和“受试者”可以互换使用，以指动物，诸如哺乳动物，包括灵长类动物(例如人、猴和黑猩猩)、非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼(llama)、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、和鲸)、鸟(例如鸭或鹅)和鲨鱼。优选地，患者或受试者为人，诸如对疾病、病症或状况进行治疗或评估的人，处于疾病、病症或状况危险中的人，患有疾病、病症或状况的人，和/或对疾病、病症或状况进行治疗的人。
术语“样品”以其最广泛的含义使用。“生物学样品”包括但不限于，来自生物(living thing)或从前生物的任何量的物质。此种生物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物。此种物质包括但不限于，血液(例如全血)、血浆、血清、尿、羊膜液、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
“组分”、“多种组分”和“至少一种组分”一般指捕获抗体、检测或缀合抗体、对照、校准物(calibrator)、一系列校准物、灵敏度实验对象组(sensitivity panel)、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如作为溶液)、终止液等，根据本文所述方法和其他本领域已知方法，其可以包括于用于测试样品(诸如患者尿、血清或血浆样品)测定的试剂盒中。因此，在本公开内容上下文中，“至少一种组分”、“组分”和“多种组分”可以包括如上的多肽或其他分析物，诸如包含分析物诸如多肽的组合物，其任选地固定在固体支持物上，诸如通过与抗分析物(例如，抗多肽)抗体结合。一些组分可以在溶液中或者被冻干以重构用于测定。
“对照”指已知不含有分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。本文可以互换使用“对照”、“阳性对照”和“校准物”，以指包含已知浓度分析物的组合物。“阳性对照”可用于确立测定性能特性，并且是试剂(例如分析物)完整性的有用指示物。
“预定截止(cutoff)”和“预定水平”一般指测定截止值，其用于通过将测定的结果与预定截止/水平比较，来评估诊断/预后/治疗效力结果，其中预定截止/水平已经与各种临床参数(例如疾病严重程度、进展/非进展/改进等)联系或相关。虽然本公开内容可以提供示例性预定水平，但众所周知，截止值可能依赖于免疫测定的特性(例如采用的抗体等)而变化。另外，完全在本领域技术人员的一般能力内的是，基于此公开内容将本文的公开内容对其他免疫测定进行适应以获得关于那些其他免疫测定的免疫测定特异性截止值。尽管测定之间预定截止/水平的精确值可能不同，但本文所述的相关性(如果存在)应当是普遍适用的。
如在本文所述的诊断测定中所用的，“预处理试剂”，例如裂解、沉淀和/或增溶试剂，是将存在于测试样品中的任何细胞裂解和/或任何分析物增溶的试剂。如本文进一步所述，不是所有样品都需要预处理。除了其他的之外，增溶分析物(例如目的多肽)可能引起该分析物从存在于样品中的任何内源结合蛋白释放。预处理试剂可以是均质的(不要求分离步骤)或异质的(要求分离步骤)。使用异质性预处理试剂时，在进行到测定的下一个步骤前，从测试样品将任何沉淀的分析物结合蛋白取出。
在本文所述免疫测定和试剂盒上下文中，“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照、和灵敏度实验对象组。为了确立校准(标准)曲线以内推(interpolation)分析物(诸如抗体或分析物)的浓度，一般使用“校准物”或“标准”(例如，一种或多种，诸如多种)。可替代地，可以使用接近预定阳性/阴性截止的单个校准物。可以共同使用多个校准物(即，多于一个校准物或不同量的校准物)，从而构成“灵敏度实验对象组”。
“风险”指特定事件目前或将来某时刻发生的可能性或概率。“风险分层”指已知临床风险因子的排列，它使得医师将患者划分为发展特定疾病、病症或状况的低、中、高或最高风险。
在特异性结合对(例如抗原(或其片段)和抗体(或其抗原反应片段))成员之间相互作用的上下文中，“特异的”和“特异性”指相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似短语指抗体(或其抗原反应片段)特异性结合分析物(或其片段)而不与其他实体特异性结合的能力。
“特异性结合伴侣”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同的分子，它们通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除了普通免疫测定的抗原和抗体特异性结合对，其他特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应物与受体分子、辅因子和酶、酶抑制物和酶等。另外，特异性结合对可以包括作为最初特异性结合成员类似物的成员，例如分析物类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体及其复合物、片段和变体(包括变体的片段)，无论是分离的还是重组产生的。
“变体”指这样的多肽，该多肽通过氨基酸的添加(例如插入)、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同于给定多肽(例如IL-18、BNP、NGAL或HIV多肽或抗多肽抗体)，但保持该给定多肽生物学活性(例如变体IL-18可以与抗IL-18抗体竞争结合IL-18)。氨基酸保守取代，即，将氨基酸用具有相似特性(例如，亲水性和带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换，被本领域认可为一般涉及小改变。如本领域所理解的，可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴定这些小改变(参见例如，Kyte等人(1982) J. Mol. Biol. 157:105-132)。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，可以取代具有相似亲水指数的氨基酸，而仍然保持蛋白功能。一方面，取代具有亲水指数±2的氨基酸。也可以使用氨基酸亲水性来揭示将引起保持生物学功能的蛋白的取代。在肽的上下文中，考虑氨基酸的亲水性允许对该肽的最大局部平均亲水性的计算，这是据报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用的量度(参见例如，美国专利号4,554,101)。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保持生物学活性的肽，所述生物学活性例如免疫原性。一方面，用彼此具有±2以内的亲水性值的氨基酸来实施取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的具体侧链影响。与那个观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸取代理解为取决于氨基酸、尤其是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。“变体”也可用于描述已经经过不同加工(诸如蛋白酶解、磷酸化或其他翻译后修饰)而仍然保持其生物学活性或抗原反应性(例如结合IL-18的能力)的多肽或其片段。除非另外与上下文相矛盾，术语“变体”包含变体的片段。
I. DVD结合蛋白的产生
本发明涉及结合一种或多种靶的双重可变结构域结合蛋白和制备其的方法。在一个实施方案中，结合蛋白包含多肽链，其中所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，X1代表氨基酸或多肽，X2代表Fc区，且n是0或1。可以使用各种技术生成本发明的结合蛋白。本发明提供了生成结合蛋白的表达载体、宿主细胞和方法。
A. 亲本单克隆抗体的产生
DVD结合蛋白的可变结构域可以从亲本抗体获得，包括结合目的抗原的多克隆和mAbs。这些抗体可以是天然存在的或可以通过重组技术产生。
mAbs可以使用本领域已知的广泛多样的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组体、和噬菌体展示技术，或其组合。例如，mAbs可以使用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知和下列教导的那些：例如Harlow 等人 (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, 第2版)；Hammerling等人(1981)于: MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, NY)。术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来源于单一克隆，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆的抗体，而不是指产生其的方法。如下文实施例1中讨论的，杂交瘤进行选择、克隆和进一步筛选所需特征，包括强杂交瘤生长、高抗体产生和所需抗体特征。杂交瘤可以在同系动物体内、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠、或在体外细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。在特定的实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种，诸如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达结合特定抗原的抗体的人细胞融合。
重组mAbs也使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的程序从单一、分离的淋巴细胞中产生，所述SLAM如美国专利号5,627,052；PCT公开号 WO 92/02551；和Babcock等人(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848中所述。在这种方法中，鉴定分泌目的抗体的单一细胞，例如来源于免疫的动物的淋巴细胞，且通过逆转录酶PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNAs，随后可以在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞诸如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对目的抗原的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以进行体外处理，诸如通过体外亲和力成熟法，诸如PCT公开号 WO 97/29131和WO00/56772中描述的那些。
单克隆抗体也通过用目的抗原免疫非人动物来产生，所述非人动物包含一些或全部人免疫球蛋白基因座。在一个实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包含人免疫球蛋白基因座大片段且在小鼠抗体产生方面有缺陷的工程改造的小鼠品系。参见例如Green等人(1994) Nature Genet. 7:13-21和美国专利号5,916,771；5,939,598；5,985,615；5,998,209；6,075,181；6,091,001；6,114,598和6,130,364。还参见PCT公开号WO 91/10741；WO 94/02602；WO 96/34096；WO 96/33735；WO 98/16654；WO 98/24893；WO 98/50433；WO 99/45031；WO 99/53049；WO 00 09560；和WO 00/037504。XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成体样人所有组成成分，且产生抗原特异性人单克隆抗体。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和κ(kappa)轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠包含约80％人抗体所有组成成分。参见Mendez 等人(1997) Nature Genet. 15:146-156；Green和Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495。
体外方法也可以用于制备亲本抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。关于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域众所周知的，且包括在下述参考文献中描述的方法：例如，美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；WO 91/17271；WO92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO 97/29131；Fuchs等人(1991) Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人(1992) Hum. Antibod. Hybridomas3:81-85；Huse等人(1989) Science 246:1275-1281；McCafferty等人 (1990) Nature348:552-554；Griffiths等人(1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins等人(1992) J. Mol.Biol. 226:889-896；Clackson等人(1991) Nature 352:624-628；Gram等人(1992) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrad等人(1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom 等人(1991) Nucl. Acid Res. 19:4133-4137；和Barbas等人(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；以及美国公开号20030186374。
本发明的亲本抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。具体地，此种噬菌体可以用于展示由所有组成成分或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠粒结合或捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。可以用于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括下述参考文献中公开的那些：Brinkman 等人(1995) J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames等人(1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough等人(1994) Eur. J.Immunol. 24:952-958；Persic等人(1997) Gene 187 9-18；Burton等人(1994) AdvancesImmunol. 57:191-280；PCT公开号WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；和WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。
噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区可以进行分离并用于产生完整抗体，且在任何所需宿主中表达，所述完整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，也可以采用重组产生Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，其中使用本领域已知的方法，诸如下述参考文献中公开的那些：PCT公开号 WO 92/22324；Mullinax等人，(1992) BioTechniques12(6):864-869；和Sawai等人(1995) AJRI 34:26-34；和Better等人(1988) Science 240:1041-1043。可以用于产生单链Fvs和抗体的技术实例包括下述参考文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人(1991) Methods Enzymol. 203:46-88；Shu等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999；以及Skerra等人(1988)Science 240:1038-1040。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于筛选大组合文库的其他方法可以应用于亲本抗体的鉴定。如Szostak和Roberts的PCT公开号WO 98/31700，以及Roberts和Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达的表达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素－肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，诸如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过如本文所述的重组方法(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过如本文所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。
在另一种方法中，亲本抗体也可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们展示在酵母表面上。具体地，此种酵母可以用于展示由所有组成成分或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可用于制备亲本抗体的酵母展示方法的实例包括美国专利号6,699,658中公开的那些。
本文所述抗体可以进一步进行修饰以产生CDR嫁接的和人源化的亲本抗体。CDR嫁接的亲本抗体包含来自人抗体的重和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区替换为结合目的抗原的鼠抗体的CDR序列。来自任何人抗体的构架序列可以充当用于CDR嫁接的模板。然而，在此种构架上的直接链替换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人抗体与最初鼠抗体越同源，使鼠CDRs与人构架组合将在CDRs中引入可减小亲和力的变形的可能性越小。因此，在一个实施方案中，选择替换除CDRs外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65％的序列同一性。在一个实施方案中，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少70％的序列同一性。在特定的实施方案中，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少75％的序列同一性。在另一个实施方案中，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少80％的序列同一性。用于产生此种抗体的方法是本领域已知的(参见欧洲专利号EP 239,400；PCT公开号 WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089), 镶面(veneering)或表面重建(resurfacing)(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan (1991) Mol.Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等人(1994) Protein Engin. 7(6):805-814；Roguska等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973)，和链改组(美国专利号5,565,352)；以及抗独特型抗体。
人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有来自非人物种的一个或多个互补性决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知的人Ig序列在下述中公开，例如，
。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health(1983)。如本领域已知的，此种输入的序列可以用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期、或任何其他合适的特征。
人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，例如改善抗原结合。这些构架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。(参见例如，美国专利号5,585,089；Riechmann等人(1988) Nature 332:323。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域技术人员熟悉的。举例说明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从共有和输入序列选择且组合FR残基，从而使得达到所需抗体特征，诸如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最重要地参与影响抗原结合。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化，诸如但不限于下述参考文献中描述的那些：Jones等人(1986) Nature 321:522；Verhoeyen等人(1988)Science 239:1534；Sims等人(1993) J. Immunol. 151:2296；Chothia和Lesk (1987) J.Mol. Biol. 196:901；Carter等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:4285；Presta等人(1993) J. Immunol. 151:2623；Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498；Studnicka等人(1994) Prot. Engin. 7(6):805-814；Roguska等人(1994) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973；PCT公开号 WO 91/09967, 国际申请号PCT/US98/16280；US96/18978；US91/09630；US91/05939；US94/01234；GB89/01334；GB91/01134；GB92/01755；PCT公开号 WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；欧洲专利号EP 229,246；EP 592,106；EP 519,596；EP 239,400；美国专利号5,565,332；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；和4,816,567。
B. 用于选择亲本单克隆抗体的标准
本发明的实施方案涉及用DVD-Ig分子中期望的至少一种或多种特性选择亲本抗体。在一个实施方案中，所需特性选自一种或多种抗体参数。在另一个实施方案中，抗体参数选自抗原特异性、对抗原的亲和力、效价、生物学功能、表位识别、稳定性、可溶性、生产效率、免疫原性、药物代谢动力学、生物利用度、组织交叉反应性、和直向同源抗原结合。
B1. 对抗原的亲和力
治疗性mAb的所需亲和力可以取决于抗原的特性以及所需的治疗终点。在一个实施方案中，在阻断细胞因子－细胞因子受体相互作用时，单克隆抗体具有较高的亲和力(Kd= 0.01 – 0.50 pM)，因为此种相互作用通常是高亲和力相互作用(例如<pM–<nM 范围)。在此种情况下，mAb对其靶的亲和力应当等于或好于细胞因子(配体)对其受体的亲和力。另一方面，具有较低亲和力(>nM范围)的mAb可能例如在清除循环的潜在致病性蛋白中具有治疗性效果，例如结合、隔绝和清除A-β淀粉状蛋白的循环种类的单克隆抗体。在其他情况下，通过位点定向诱变降低现有高亲和力mAb的亲和力、或使用对其靶具有较低亲和力的mAb可用于避免可能的副作用，例如，高亲和力mAb可能隔绝/中和所有其预期的靶，从而完全耗尽/消除靶向的蛋白的功能。在这种情境中，低亲和力mAb可以隔绝/中和负责疾病症状的部分靶(病理或超量产生的水平)，从而允许部分靶继续实施其一种或多种正常生理功能。因此，可能降低Kd来调整剂量和/或减少副作用。亲本mAb的亲和力可能在适当地靶向细胞表面分子来实现所需治疗结果中起到作用。例如，如果靶在癌细胞上以高密度表达、而在正常细胞上以低密度表达，那么较低亲和力mAb将在肿瘤细胞上结合比正常细胞上更多的靶，从而导致肿瘤细胞通过ADCC或CDC消除，且从而可以具有所需的治疗效果。因此，选择具有所需亲和力的mAb可以和可溶性和表面靶都有关。
受体与其配体相互作用后通过受体的信号传递可以取决于受体－配体相互作用的亲和力。类似地，可以想到mAb对表面受体的亲和力可以决定细胞内信号传递的特性以及该mAb是否递送了激动剂或拮抗剂信号。mAb介导的信号传递的基于亲和力的特性可能对其副作用概况具有影响。因此，需要通过体外和体内实验谨慎确定治疗性单克隆抗体的所需亲和力和所需功能。
可以依赖于所需治疗结果实验性确定结合蛋白(例如抗体)的所需Kd。在一个实施方案中，选择对特定抗原的亲和力(Kd)等于或好于DVD-Ig对相同抗原的所需亲和力的亲本抗体。对于给定DVD-Ig分子的亲本抗体可以是相同的抗体或不同的抗体。通过Biacore或其他类似技术评价抗原结合亲和力和动力学。在一个实施方案中，每种亲本抗体对于其抗原具有选自下列的解离常数(Kd)：最多约10-7 M；最多约10-8 M；最多约10-9 M；最多约10-10 M；最多约10-11 M；最多约10-12 M；和最多10-13 M。获得VD1的第一亲本抗体和获得VD2的第二亲本抗体可以对各自抗原具有相似或不同的亲和力(KD)。每种亲本抗体对于所述抗原具有选自下列的结合速率常数(Kon)：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；和至少约106M-1s-1, 如通过表面等离振子共振测定的。获得VD1的第一亲本抗体和获得VD2的第二亲本抗体可以对各自抗原具有相似或不同的结合速率常数(Kon)。在一个实施方案中，每种亲本抗体对于所述抗原具有选自下列的解离速率常数(Koff)：最多约10- 3s-1；最多约10-4s-1；最多约10-5s-1；和最多约10-6s-1, 如通过表面等离振子共振测定的。获得VD1的第一亲本抗体和获得VD2的第二亲本抗体可以对各自抗原具有相似或不同的解离速率常数(Koff)。
B2. 效价
亲本单克隆抗体的所需亲和力/效价将取决于所需的治疗结果。例如，对于受体－配体(R-L)相互作用，亲和力(kd)等于或好于R-L kd (pM范围)。对于致病性循环蛋白的简单清除，kd可以在低nM范围，例如清除循环A-β肽的各种种类。另外，kd也将取决于靶是否表达相同表位的多拷贝，例如靶向Aβ寡聚体中的构象表位的mAb。
当VD1和VD2结合相同抗原但是不同表位时，DVD-Ig将含有对相同抗原的4个结合位点，从而增加抗体亲抗原性以及由此的DVD-Ig的表观kd。在一个实施方案中，选择具有等于或低于DVD-Ig中所需kd的kd的亲本抗体。亲本mAb的亲和力考虑也取决于DVD-Ig是否含有四个或更多相同抗原结合位点(即，来自单一mAb的DVD-Ig)。在此情况下，表观kd将由于抗体亲抗原性而高于mAb。此种DVD-Ig可以用于交联表面受体、增加中和效价、增强病理蛋白的清除等。
在一个实施方案中，选择对特定抗原的中和效价等于或好于DVD-Ig对相同抗原的所需中和潜力的亲本抗体。可以通过靶依赖性生物测定评价中和效价，在所述靶依赖性生物测定中，适当类型的细胞对靶刺激应答产生可测量的信号(即，增殖或细胞因子产生)，且通过mAb的靶中和可以以剂量依赖的方式降低信号。
B3. 生物学功能
单克隆抗体可以潜在地实施几种功能。这些功能中的一些列于表1中。这些功能可以通过体外测定(例如基于细胞的和生物化学测定)和体内动物模型来评价。
表1：治疗性抗体的一些潜在应用
可以选择具有本文在表1中的实例中所述的不同功能的mAb，来实现所需治疗结果。两个或更多选择的亲本单克隆抗体然后可以以DVD-Ig形式使用以实现在单一DVD-Ig分子中的两种不同功能。例如，可以通过选择中和特定细胞因子功能的亲本mAb、并选择增强病理蛋白的清除的亲本mAb，来产生DVD-Ig。类似地，可以选择识别两种不同细胞表面受体的两种亲本单克隆抗体，一种mAb具有对一种受体的激动剂功能，而另一种mAb具有对不同受体的拮抗剂功能。各自具有不同功能的这两种所选单克隆抗体可以用于构建单一DVD-Ig分子，该DVD-Ig分子将在单一分子中具有所选单克隆抗体的两种不同功能(激动剂和拮抗剂)。类似地，可以将各阻断各自的受体配体(例如EGF和IGF)结合的两种针对细胞表面受体的拮抗性单克隆抗体以DVD-Ig形式使用。相反地，可以选择拮抗性抗受体mAb(例如抗EGFR)和中和抗可溶性介质(例如抗-IGF1/2)mAb来制备DVD-Ig。
B4. 表位识别
蛋白的不同区域可能实施不同功能。例如，细胞因子的特定区域与细胞因子受体相互作用，以致使受体活化，而可能需要该蛋白的其他区域来稳定细胞因子。在这个情况下，人们可以选择与细胞因子上的一个或多个受体相互作用区特异性结合的mAb，并由此阻断细胞因子-受体相互作用。在一些情况下，例如某些结合多个配体的趋化因子受体，可以选择结合与仅一个配体相互作用的表位(趋化因子受体上的区域)的mAb。在其他情况下，单克隆抗体可以与靶上的表位结合，该表位不直接负责该蛋白的生理功能，但是mAb与这些区域的结合可以干扰该蛋白的生理功能(位阻)或改变其构象，从而使得该蛋白不能起作用(针对具有多个配体的受体的mAb，其改变受体构象，从而使得没有一个配体可以结合)。不阻断细胞因子与其受体结合、但是阻断信号转导的抗细胞因子单克隆抗体也已经得到鉴定(例如125-2H、抗IL-18 mAb)。
表位和mAb功能的实例包括但不限于阻断受体－配体(R-L)相互作用(结合R相互作用位点的中和mAb)；引起R结合减少或无R结合的位阻。Ab可以在除受体结合位点之外的位点结合靶，但是仍然通过引起构象改变和消除功能(例如Xolair)、与R结合但阻断信号传递(125-2H)而干扰受体结合及靶的功能。
在一个实施方案中，亲本mAb需要靶向合适的表位以发挥最大效力。此种表位在DVD-Ig中应该是保守的。可以通过几种方法确定mAb的结合表位，包括共结晶、mAb－抗原复合物的有限蛋白酶解加上质谱肽作图(Legros等人 (2000) Protein Sci. 9:1002-10)、噬菌体展示的肽文库(O’Connor等人(2005) J. Immunol. Methods 299:21-35)、以及诱变(Wu等人(2003) J. Immunol. 170:5571-7)。
B5. 物理化学和药学特性
使用抗体的治疗性处理经常要求施用高剂量，经常为几mg/kg(由于一般大分子量所致在质量基础上的低效价)。为了调整患者顺应性并充分解决慢性病治疗和门诊病人治疗，需要皮下(s.c.)或肌内(i.m.)施用治疗性mAbs。例如，皮下施用的最大所需体积是～1.0 mL，且因此，需要>100 mg/mL的浓度来限制每剂量的注射数。在一个实施方案中，以一剂量施用治疗性抗体。然而，通过蛋白－蛋白相互作用(例如有可能增加免疫原性风险的聚集)和通过在加工和递送过程中的限制(例如粘度)限制了此种制剂的开发。因此，临床效力所要求的大量以及相关的开发约束，限制了对抗体制剂的潜力的充分开发以及以高剂量方案皮下施用。显而易见的是，蛋白分子和蛋白溶液的物理化学和药学特性是极为重要的，例如稳定性、可溶性和粘度特征。
B5.1. 稳定性：
“稳定的”抗体制剂是其中抗体在贮存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。可以在选择的温度测量稳定性达选择的时间段。在一个实施方案中，制剂中的抗体在室温(约30℃)或在40 ℃稳定至少一个月，和/或在约2-8℃稳定至少1年至少2年。另外，在一个实施方案中，在冷冻(至例如-70 ℃)和融化制剂(此后称为“冻/融循环”)后，该制剂是稳定的。在另一个实例中，“稳定的”制剂可以是这样的制剂，其中少于约10％和少于约5％的蛋白作为聚集体存在于该制剂中。
需要在各种温度下体外稳定达延长的时间段的DVD-Ig。人们可以通过快速筛选在升高的温度体外稳定(例如，在40 ℃稳定2-4周)的亲本mAbs来实现这一点，然后评价稳定性。在2-8℃贮存期间，蛋白显示出至少12个月例如至少24个月的稳定性。可以使用各种技术诸如阳离子交换层析、大小排阻层析、SDS-PAGE、以及生物活性测试来评价稳定性(单体、完整分子的％)。关于可以采用以分析共价和构象修饰的分析技术的更全面列表，参见Jones (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulationsand delivery systems. 于: Cleland, J. L.；Langer, R., 编者；Formulation anddelivery of peptides and proteins,第一版, Washington, ACS, 第22-45页；以及Pearlman和Nguyen (1990) Analysis of protein drugs. 于: Lee, V. H., 编者；Peptide and protein drug delivery, 第一版, New York, Marcel Dekker, Inc., 第247-301页。
异质性和聚集体形成：抗体的稳定性可以是这样的，从而使得制剂在GMP抗体材料中可以显示出少于约10％、以及在一个实施方案中少于约5％、在另一个实施方案中少于约2％、或在一个实施方案中在0.5％至1.5％范围内或更低作为聚集体存在。大小排阻层析是检测蛋白聚集体的灵敏、可重复并且非常强有力的方法。
除了低聚集体水平外，在一个实施方案中，抗体必须是化学稳定的。可以通过离子交换层析(例如阳离子或阴离子交换层析)、疏水相互作用层析、或其他方法诸如等电聚焦或毛细管电泳确定化学稳定性。例如，抗体的化学稳定性可以是这样的，从而使得在2-8℃贮存至少12个月后，与贮存测试前的抗体溶液相比，在阳离子交换层析中代表未修饰的抗体的峰可增加不超过20％、在一个实施方案中不超过10％、或在另一个实施方案中不超过5％。
在一个实施方案中，亲本抗体显示结构的完整性；正确的二硫键形成，以及正确折叠：由于抗体二级或三级结构改变的化学不稳定性可以影响抗体活性。例如，通过抗体活性指示的稳定性可以是这样的，从而使得在2-8℃贮存至少12个月后，与贮存测试前的抗体溶液相比，抗体活性可降低不超过50％、在一个实施方案中不超过30％或甚至不超过10％、或在一个实施方案中不超过5％或1％。可以采用适合的抗原结合测定来确定抗体活性。
B5.2. 可溶性
mAb的“可溶性”与产生正确折叠的单体IgG相关。可以因此通过HPLC评价IgG的可溶性。例如，可溶的(单体的)IgG将引起HPLC层析上的单一峰，而不溶性(例如多体的和聚集的)将产生多个峰。本领域技术人员将因此能够使用常规HPLC技术检测IgG可溶性的升高或降低。对于可采用来分析可溶性的分析技术的更全面列表，(参见Jones (1993) Dep.Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK. 编者: Shamlou, P. Ayazi.Process. Solid-Liq. Suspensions, 93-117。出版商: Butterworth-Heinemann,Oxford, UK和Pearlman和Nguyen (1990) Advances Parenteral Sci. 4:247-301)。治疗性mAbs的可溶性对于配制到通常为足够给药所要求的高浓度是关键的。如本文所概括的，可能要求>100 mg/mL的可溶性来适应有效的抗体给药。例如，在研究早期，抗体可溶性可能不小于约5 mg/mL，在一个实施方案中，在高级加工科学阶段不小于约25 mg/mL，或者在一个实施方案中，不小于约100 mg/mL，或者在一个实施方案中，不小于约150 mg/mL。对本领域技术人员显而易见的是，蛋白分子的固有特性对于该蛋白溶液的物理化学特性，例如稳定性、可溶性、粘度，是重要的。然而，本领域技术人员将认识到，存在众多种可用作添加剂以有益地影响最终蛋白制剂特征的赋形剂。这些赋形剂可以包括：(i)液体溶剂、助溶剂(例如醇，诸如乙醇)；(ii)缓冲剂(例如磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、氨基酸缓冲剂)；(iii)糖或糖醇(例如蔗糖、海藻糖、果糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨糖醇、葡聚糖)；(iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20、40、60、80、泊洛沙姆(poloxamers))；(v)等渗性改性剂(例如，盐，诸如NaCl，糖，糖醇)；以及(vi)其他(例如，防腐剂、螯合剂、抗氧化剂、螯合物质(例如EDTA)、可生物降解的聚合物、载体分子(例如HAS、PEGs)。
粘度是就抗体制造和抗体加工(例如渗滤/超滤)、罐装/封装(fill-finish)加工(泵送方面、过滤方面)和递送方面(可注射性、复杂的设备递送)而言高度重要的参数。低粘度使得抗体的液体溶液能够具有较高浓度。这使得相同剂量能够以较小的体积施用。小注射体积具有在注射感觉上较低疼痛的优点，而且该溶液没有必要是等渗的以降低患者在注射时的疼痛。抗体溶液的粘度可以是这样的，从而使得在剪切速率100(1/s)，抗体溶液粘度低于200 mPa s，在一个实施方案中低于125 mPa s，在另一个实施方案中低于70 mPa s，且在另一个实施方案中低于25 mPa s或甚至低于10 mPa s。
B5.3. 产生效率
产生在哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中有效表达的DVD-Ig，在一个实施方案中将需要两种本身在哺乳动物细胞中有效表达的亲本单克隆抗体。稳定哺乳动物系(即CHO)的生产产量应该高于约0.5g/L，在一个实施方案中高于约1g/L，且在另一个实施方案中在约2至约5g/L范围内或更多(Kipriyanov和Little (1999) Mol. Biotechnol.12:173-201；Carroll和Al-Rubeai (2004) Expert Opin. Biol Ther. 4:1821-9)。
抗体和Ig融合蛋白在哺乳动物细胞中的产生受几个因素影响。通过整合强启动子、增强子和选择标记对表达载体的工程改造，可以最大化目的基因从整合的载体拷贝的转录。鉴定允许高水平基因转录的载体整合位点可以增加蛋白从载体的表达(Wurm等人(2004) Nature Biotech. 22(11):1393-1398)。另外，产生水平受抗体重和轻链的比例以及蛋白装配和分泌过程中各个步骤影响(Jiang等人(2006) Biotechnol. Progr. 22(1):313-8)。
B6. 免疫原性
施用治疗性mAb可导致免疫应答的一定发生率(即，针对治疗性mAb的内源性抗体的形成)。应当在选择亲本单克隆抗体期间分析可能引起免疫原性的潜在元件，并且可以采取降低这种风险的步骤，以在DVD-Ig构建之前最优化亲本单克隆抗体。已经发现小鼠来源的抗体在患者中具有高免疫原性。由小鼠可变区和人恒定区构成的嵌合抗体的生成提供了降低治疗性抗体免疫原性的合理的下一步(Morrison和Schlom (1990) Import. Adv.Oncol. 3–18)。可替代地，可以通过将鼠CDR序列转移入人抗体构架(重构/CDR嫁接/人源化)而降低免疫原性，如Riechmann等人(1988) Nature 332:32327关于治疗性抗体所述。另一个方法称为“表面重建(resurfacing)”或“镶面(veneering)”，该方法从啮齿类动物可变轻和重结构域开始，仅仅将表面可及的构架氨基酸改变为人氨基酸，而CDR和隐蔽的氨基酸则保持来自亲本啮齿类动物抗体(Roguska等人(1996) Protein Engineer. 9:895-904)。在另一类人源化中，代替嫁接整个CDR，一种技术仅嫁接“特异性决定区”(SDRs)，将所述“特异性决定区”定义为参与抗体与其靶结合的CDR残基的亚群(Kashmiri等人(2005) Methods36(1):25-34。这使通过可利用的抗体－靶复合物三维结构的分析或抗体CDR残基的突变分析来确定哪些残基与靶相互作用而鉴定SDR成为必要。可替代地，与鼠、嵌合或人源化抗体相比，完全人抗体可能具有降低的免疫原性。
降低治疗性抗体免疫原性的另一种方法是消除预测有免疫原性的某些特定序列。在一种方法中，在第一代生物制剂已经在人中得到测试并发现具有不可接受的免疫原性后，可以对B细胞表位作图且然后改变来避免免疫检测。另一种方法使用预测并去除可能的T细胞表位的方法。已经开发了计算方法来扫描并鉴定具有与MHC蛋白结合的潜力的生物学治疗剂肽序列(Desmet等人(2005) Proteins 58:53-69。可替代地，可以使用基于人树突细胞的方法来鉴定潜在的蛋白变应原中的CD4+ T细胞表位(Stickler等人(2000) J.Immunother. 23: 654-60；Morrison和Schlom (1990) Important Adv. Oncol. 3–18；Riechmann等人(1988) Nature 332:323-327；Roguska等人(1996) Protein Engineer. 9:895-904；Kashmiri等人(2005) Methods (San Diego Calif.) 36(1):25-34；Desmet-Johan等人2005) Proteins 58:53-69；Stickler等人(2000) J. Immunother. 23:654-60)。
B7. 体内效力
为了生成具有所需体内效力的DVD-Ig分子，当以组合给予时，生成并选择具有相似的所需体内效力的mAbs是重要的。然而，在一些情况下，DVD-Ig可能表现出两种单独mAbs的组合所不能实现的体内效力。例如，DVD-Ig可以使两个靶临近，从而引起两种单独mAbs的组合所不能实现的活性。本文在B3节中描述了额外的所需生物学功能。可以基于诸如药物代谢动力学t ½；组织分布；可溶的相比于细胞表面靶；以及靶浓度-可溶性/密度-表面的因素，选择具有DVD-Ig分子中所需特征的亲本抗体。
B8. 体内组织分布
为了生成具有所需体内组织分布的DVD-Ig分子，在一个实施方案中，必须选择具有类似的所需体内组织分布概况的亲本mAbs。可替代地，基于双重特异性靶向策略的机制，在其他时候，当以组合给予时，可能不要求选择具有类似的所需体内组织分布的亲本mAbs。例如，在DVD-Ig的情况中，其中，一种结合组分将DVD-Ig靶向至特定位点，从而将第二种结合组分带到相同靶位点。例如，DVD-Ig的一种结合特异性可以靶向胰(胰岛细胞)，而另一种特异性可以将GLP1带到胰来诱导胰岛素。
B9. 同种型
为了生成具有所需特性的DVD-Ig分子，所需特性包括但不限于同种型、效应子功能和循环半衰期，在一个实施方案中，依赖于治疗效用和所需治疗终点选择具有适当的Fc-效应子功能的亲本mAbs。有5种主要的重链种类或同种型，其中一些具有几个亚型，且这些决定了抗体分子的效应子功能。这些效应子功能存在于抗体分子的铰链区、CH2和CH3结构域。然而，抗体分子其他部分中的残基可能也对效应子功能具有作用。铰链区Fc-效应子功能包括：(i)抗体依赖性细胞毒性，(ii)补体(C1q)结合、活化和补体依赖性细胞毒性(CDC)，(iii)抗原－抗体复合物的吞噬作用/清除，以及(iv)在一些情况下的细胞因子释放。抗体分子的这些Fc-效应子功能是通过Fc区与一组种类特异性细胞表面受体的相互作用介导的。IgG1同种型的抗体是最活跃的，而IgG2和IgG4具有最小或没有效应子功能。IgG抗体的效应子功能是通过与三种结构上同源的细胞Fc受体型(及亚型)(FcgR1、FcgRII和FcgRIII)相互作用而介导的。可以通过在较低铰链区突变FcgR和C1q结合所需的特定氨基酸残基(例如L234A、L235A)来消除IgG1的这些效应子功能。Fc区、特别是CH2-CH3结构域中的氨基酸残基也决定了抗体分子的循环半衰期。该Fc功能通过Fc区与新生Fc受体(FcRn)的结合而介导，所述新生Fc受体负责抗体分子从酸性溶酶体再循环回到全身循环。
mAb是否应该具有活性或失活同种型将取决于抗体所需的治疗终点。同种型的使用以及所需治疗结果的一些实例罗列如下：
a) 如果所需终点是功能性中和可溶性细胞因子，则可以使用失活同种型；
b) 如果所需结果是清除病理蛋白，则可以使用活性同种型；
c) 如果所需结果是清除蛋白聚集体，则可以使用活性同种型；
d) 如果所需结果是拮抗表面受体，则使用失活同种型(Tysabri，IgG4；OKT3，突变的IgG1)；
e) 如果所需结果是清除靶细胞，则使用活性同种型(Herceptin，IgG1(且具有增强的效应子功能)；以及
f) 如果所需结果是不进入CNS而将蛋白从循环清除，则可以使用IgM同种型(例如，清除循环Ab肽种类)。
可以通过各种本领域众所周知的体外方法确定亲本mAb的Fc效应子功能。
如所讨论的，对同种型以及由此效应子功能的选择将取决于所需的治疗终点。在需要简单中和循环靶的情况下，例如，阻断受体－配体相互作用，则可能不要求效应子功能。在此种情况下，需要消除效应子功能的抗体Fc区内的同种型或突变。在其他以消除靶细胞为治疗终点的情况下，例如消除肿瘤细胞，需要增强效应子功能的Fc-区内的同种型或突变或去岩藻糖基化(Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656；Satoh等人(2006) Expert Opin. Biol. Ther. 6:1161-1173)。类似地，取决于治疗效用，可以通过通过在Fc区引入特定突变而调节抗体－FcRn相互作用，来降低/延长抗体分子循环半衰期(Dall’Acqua等人(2006) J. Biol. Chem. 281:23514-23524；Petkova等人(2006)Internat. Immunol. 18:1759-1769；Vaccaro等人(2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA103:18709-18714)。
可能需要对于DVD-Ig证实影响正常治疗性mAb的不同效应子功能的各种残基的公开信息。在DVD-Ig形式中，有可能除了鉴定为调节单克隆抗体效应子功能的那些之外的额外的(不同的)Fc-区残基是重要的。
总体而言，关于何种Fc-效应子功能(同种型)在最终DVD-Ig形式中是关键的决定将取决于疾病指征、治疗靶、所需治疗终点和安全性考虑。示例性的合适的重链和轻链恒定区罗列如下，包括但不限于：
○ IgG1 –同种异型：G1mz
○ IgG1突变体– A234, A235
○ IgG2 –同种异型：G2m(n-)
○ κ– Km3
○ λ。
Fc受体和C1q研究：可以通过(例如L234A、L235A)铰链区突变来取消抗体与细胞膜上任何过表达的靶复合造成的不需要的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的可能性。由于认为FcgR结合发生在IgG1铰链区上的重叠位点中，所以预期存在于mAb的IgG1铰链区中的这些取代的氨基酸导致mAb与人Fc受体(但非FcRn)的结合减少。mAb的这个特征可以导致比含有野生型IgG的抗体改善的安全性概况。可以通过流式细胞术实验使用表达FcgRIIb(或其他FcgRs)的细胞系(例如THP-1、K562)和工程改造的CHO细胞系确定mAb与人Fc受体的结合。与IgG1对照单克隆抗体相比，mAb显示与FcgRI和FcgRIIa结合降低，而与FcgRIIb的结合未受影响。由抗原/IgG免疫复合物的C1q结合和活化触发具有随后的炎症和/或免疫调节应答的经典补体级联。IgGs上的C1q结合位点被定位在IgG铰链区内的残基。通过C1q ELISA评价C1q与渐增浓度的mAb的结合。结果证明，如当与野生型对照IgG1的结合相比时所预期的，mAb不能与C1q结合。总体而言，L234A、L235A铰链区突变消除mAb与FcgRI、FcgRIIa和C1q的结合，但是不影响mAb与FcgRIIb的相互作用。这些数据提示，具有突变Fc的mAb将在体内与抑制性FcgRIIb正常相互作用，但可能将不能与活化FcgRI和FcgRIIa受体或C1q相互作用。
人FcRn结合：新生受体(FcRn)负责IgG穿过胎盘的转运并控制IgG分子的分解代谢半衰期。可能需要增加抗体的终末半衰期来改善效力、降低施用的剂量或频率、或改善对靶的定位。可替代地，相反的作法可能是有利的，即，降低抗体的终末半衰期以降低全身暴露或改善靶对非靶结合比例。设计IgG与其补救受体(salvage receptor)FcRn之间的相互作用提供了增加或降低IgG终末半衰期的途径。循环中的蛋白(包括IgG)由某些细胞诸如血管内皮细胞通过微胞饮作用在流体相中摄取。IgG可以在内体(endosome)中在微酸性条件下(pH 6.0-6.5)结合FcRn，并且可以再循环到细胞表面，在那里它在几乎中性条件下(pH7.0-7.4)释放。FcRn80、16、17上Fc区结合位点的作图显示，在物种间保守的两个组氨酸残基His310和His435是造成这种相互作用的pH依赖性的原因。使用噬菌体展示技术，鉴定了增加与FcRn的结合并延长小鼠IgG半衰期的小鼠Fc区突变(参见Victor等人(1997) NatureBiotechnol. 15(7):637-640)。在pH 6.0但不在pH7.4增加人IgG对FcRn的结合亲和力的Fc区突变也已得到鉴定 (参见Dall’Acqua等人(2002) J. Immunol. 169(9):5171-80)。此外，在一种情况下，对于猕猴FcRn也观察到类似的pH依赖的结合增加(最高达27倍)，且与亲本IgG相比，这导致猕猴中血清半衰期的2倍增加(参见Hinton等人(2004) J. Biol. Chem.279(8):6213-6216)。这些发现说明，通过设计Fc区与FcRn相互作用而延长抗体治疗剂的血浆半衰期是可行的。相反地，减弱与FcRn相互作用的Fc区突变可以缩短抗体半衰期。
B.10 药物代谢动力学(PK)
为了生成具有所需药物代谢动力学概况的DVD-Ig分子，在一个实施方案中，选择具有相似的所需药物代谢动力学概况的亲本mAbs。一个考虑是对单克隆抗体的免疫原性应答(即HAHA，人抗人抗体应答；HACA，人抗嵌合抗体应答)进一步使得这些治疗剂的药物代谢动力学变复杂。在一个实施方案中，使用具有最小免疫原性或没有免疫原性的单克隆抗体来构建DVD-Ig分子，从而使得获得的DVD-Igs也将具有最小免疫原性或没有免疫原性。决定mAb的PK的一些因素包括但不限于mAb的内在特性(VH氨基酸序列)；免疫原性；FcRn结合和Fc功能。
由于啮齿类动物中的PK概况与食蟹猴(cynomolgus monkey)和人中的单克隆抗体的PK概况良好相关(或接近地预测后者)，所以可以容易地在啮齿类动物中确定所选亲本单克隆抗体的PK概况。如实施例部分1.2.2.3.A中所述确定PK概况。
选择具有所需PK特征(和如本文讨论的其他所需功能特性)的亲本单克隆抗体后，构建DVD-Ig。由于DVD-Ig分子含有来自两种亲本单克隆抗体的两个抗原结合结构域，所以也评价DVD-Ig的PK概况。因此，在确定DVD-Ig的PK概况的同时，可以采用PK测定，所述PK测定基于源自两种亲本单克隆抗体的两个抗原-结合结构域的功能性确定PK概况。可以如实施例1.2.2.3.A中所述确定DVD-Ig的PK概况。可以影响DVD-Ig 的PK概况的其他因素包括抗原结合结构域(CDR)方向、接头大小、以及Fc/FcRn相互作用。可以通过评估下列参数而评价亲本抗体的PK特征：吸收、分布、代谢和排泄。
吸收：至今，治疗性单克隆抗体的施用是通过肠胃外途径(例如静脉内[IV]、皮下[SC]或肌内[IM])。mAb在SC或IM施用后从胞间隙吸收到系统循环中主要是通过淋巴途径。血管外施用后，可饱和的系统前(presystemic)蛋白酶解降解可能导致可变的绝对生物利用度。通常，由于在较高剂量饱和的蛋白酶解能力，可以观察到伴随单克隆抗体剂量渐增的绝对生物利用度的增加。由于淋巴液缓慢引流到血管系统中，mAb的吸收过程通常是相当缓慢的，而且吸收的持续时间可以发生数小时至几天。单克隆抗体SC施用后的绝对生物利用度一般在50％至100％范围内。就在DVD-Ig构建体靶向的血脑屏障处的转运介导结构而言，由于血脑屏障(BBB)处向CNS区室中增强的跨细胞转运，血浆中的循环次数可能降低，在所述CNS区室处DVD-Ig得到释放以使得能够通过其第二抗原识别位点进行相互作用。
分布：IV施用后，单克隆抗体通常遵循双相血清(或血浆)浓度－时间概况，以快速分布相开始，随后为缓慢消除相。一般，双指数(biexponential)药物代谢动力学模型最好地描述这类药物代谢动力学概况。mAb在中央室(central compartment)中的分布体积(Vc)通常等于或略大于血浆体积(2-3升)。因为血清(血浆)浓度－时间曲线的分布相受长吸收部分掩盖，所以血清(血浆)浓度对时间概况中的独特双相模式对于其他肠胃外施用途径诸如IM或SC可能不明显。许多因素，包括物理化学特性、位点特异性和靶定向的受体介导的摄取、组织结合能力以及mAb剂量，可以影响mAb的生物分布。这些因素中的一些可以促成mAb生物分布中的非线性。
代谢和排泄：由于分子大小，完整的单克隆抗体不通过肾排泄到尿中。它们主要通过代谢(例如分解代谢)失活。对于基于IgG的治疗性单克隆抗体，半衰期一般在数小时或1-2天到20天以上的范围内。mAb的消除可以受许多因素影响，包括但不限于对FcRn受体的亲和力、mAb的免疫原性、mAb的糖基化程度、mAb对蛋白酶解的敏感性、以及受体介导的消除。
B.11 人和tox物种(tox species)的组织交叉反应性模式：
相同的染色模式提示，可以在tox物种中评价潜在的人毒性。tox物种是研究不相关的毒性的那些动物。
选择符合两个标准的个别抗体。(1)适于抗体靶已知表达的组织染色；和(2)来自相同器官的人和tox物种组织之间的类似的染色模式。
标准1：免疫和/或抗体选择一般采用重组或合成的抗原(蛋白、碳水化合物或其他分子)。与天然对应物的结合以及针对无关抗原的反筛选(counterscreen)通常是治疗性抗体筛选漏斗的部分。然而，针对众多抗原进行筛选经常是不实用的。因此，使用来自所有主要器官的人组织的组织交叉反应性研究用以排除抗体与任何无关抗原的不需要的结合。
标准2：使用人和tox物种组织的比较组织交叉反应性研究(食蟹猴、狗、可能的啮齿类动物及其他，测试与人研究中相同的36或37种组织)帮助验证tox物种的选择。在冷冻组织切片上的典型组织交叉反应性研究中，治疗性抗体可显示对已知抗原的预期结合，和/或基于低水平相互作用的对组织的较低程度的结合(非特异性结合、对相似抗原的低水平结合、基于低水平电荷的相互作用等)。在任何情况下，最相关的毒理学动物物种是与人和动物组织结合的一致性程度最高的动物物种。
组织交叉反应性研究遵循适当的规章指南，包括EC CPMP指南III/5271/94“Production and quality control of mAbs”以及1997 US FDA/CBER “Points toConsider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products forHuman Use”。将从尸体解剖或活组织检查获得的人组织冷冻切片(5 μm)在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白－生物素系统，实施组织切片的过氧化物酶染色。FDA的指南“Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”。
组织交叉反应性研究经常以两个阶段进行，第一阶段包括来自一个人供体的32个组织(一般为：肾上腺、胃肠道、前列腺、膀胱、心脏、骨骼肌、血细胞、肾、皮肤、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾、小脑、淋巴结、睾丸、大脑皮质、卵巢、胸腺、结肠、胰、甲状腺、内皮、甲状旁腺、输尿管、眼、垂体、子宫、输卵管和胎盘)的冷冻切片。在第二阶段，用来自三个不相关成体的最多达38个组织(包括肾上腺、血液、血管、骨髓、小脑、大脑、子宫颈、食道、眼、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、乳房乳腺、卵巢、输卵管、胰、甲状旁腺、外周神经、垂体、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、横纹肌、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫)实施完整交叉反应性研究。一般在最低两个剂量水平上进行研究。
可以将治疗性抗体(即测试物品)和同种型匹配的对照抗体生物素化用于抗生物素蛋白－生物素复合物(ABC)检测；其他检测方法可以包括对FITC(或以其他方式)标记的测试物品的第三抗体检测，或对未标记的测试物品用标记的抗人IgG进行预复合(precomplexing)。
简而言之，将从尸体解剖或活组织检查获得的人组织的冷冻切片(约5 μm)在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白－生物素系统，实施组织切片的过氧化物酶染色。首先(在预复合检测系统的情况下)，将测试物品与生物素化的第二抗人IgG孵育并使其发展为免疫复合物。将在2和10 μg/mL的测试物品终浓度的免疫复合物添加到在物镜上的组织切片上，然后用抗生物素蛋白－生物素－过氧化物酶试剂盒使组织切片反应30分钟。随后，应用过氧化物酶反应底物DAB(3,3'-二氨基联苯胺)4分钟进行组织染色。使用抗原－琼脂糖珠粒作为阳性对照组织切片。
基于正被讨论的靶抗原的已知表达，将任何特异性染色判断为预期的(例如，与抗原表达一致)或意外的反应性。将任何判断为特异性的染色关于强度和频率进行评分。抗原或血清竞争或阻断研究可以帮助进一步确定观察到的染色是特异性的还是非特异性的。
如果发现两种所选抗体符合选择标准–适当的组织染色，人和毒理学动物特定组织之间的匹配染色–则可以选择它们用于DVD-Ig生成。
必须用最终DVD-Ig构建体重复组织交叉反应性研究，但是尽管这些研究遵循如本文概括的相同方案，对它们进行评价是更复杂的，这是因为任何结合可以来自两种亲本抗体中的任何一种，而任何不清楚的结合需要用复杂的抗原竞争研究来确认。
显而易见的是，如果对于(1)缺乏意外的组织交叉反应性发现以及(2)对相应人和毒理学动物物种组织之间的组织交叉反应性发现的适当相似性选择两种亲本抗体，那么使用多特异性分子如DVD-Ig的组织交叉反应性研究的复杂进行将得到大大简化。
B.12 特异性和选择性：
为了生成具有所需特异性和选择性的DVD-Ig分子，人们需要生成并选择具有类似的所需特异性和选择性概况的亲本mAbs。
利用DVD-Ig的特异性和选择性的结合研究可以由于四个或更多结合位点(对于每种抗原各两个)而复杂化。简而言之，利用DVD-Ig使用ELISA、BIAcore、KinExA或其他相互作用研究的结合研究，需要监测一种、两种或更多种抗原对DVD-Ig分子的结合。虽然BIAcore技术可以分析多种抗原的顺序、独立结合，但更传统的方法包括ELISA或更现代的技术如KinExA不可以。因此每种亲本抗体的仔细表征是关键的。在每种个别抗体已对特异性进行表征后，对DVD-Ig分子中个别结合位点的特异性保持的确认就大大简化了。
显而易见的是，如果两种亲本抗体在组合为DVD-Ig之前就对于特异性进行选择，那么确定DVD-Ig特异性的复杂进行就得到大大简化。
抗原-抗体相互作用研究可以采取许多形式，包括许多经典的蛋白蛋白相互作用研究，包括ELISA(酶联免疫吸附测定)、质谱分析法、化学交联、具有光散射的SEC、平衡透析、凝胶渗透、超滤、凝胶层析、大区分析型SEC、微量制备型超速离心(沉降平衡)、光谱学方法、滴定微量热、(在分析型超速离心机中)沉降平衡、(在分析型离心机中)沉降速度、表面等离振子共振(包括BIAcore)。相关参考文献包括“Current Protocols in ProteinScience”, Coligan等人(编) 第3卷,第19和20章, John Wiley & Sons Inc.出版，及其中包括的参考文献，以及“Current Protocols in Immunology”, Coligan等人(编) JohnWiley & Sons Inc出版，及其中包括的参考文献。
在全血中的细胞因子释放：可以通过细胞因子释放测定研究mAb与人血细胞的相互作用(Wing (1995) Therapeut. Immunol. 2(4):183-190；“Current Protocols inPharmacology”, 等人(编) John Wiley & Sons Inc出版；Madhusudan (2004) Clin.Canc. Res.10(19):6528-6534；Cox (2006) J. Methods 38(4):274-282；Choi (2001)Eur. J. Immunol. 31(1):94-106)。简而言之，将各种浓度的mAb与人全血孵育24小时。测试的浓度应当包括广泛的范围，包括模拟患者典型血液水平的终浓度(包括但不限于100ng/ml–100 µg/ml)。孵育后，对上清液和细胞裂解物分析IL-1Rα、TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-8的存在。将对mAb生成的细胞因子浓度概况与阴性人IgG对照和阳性LPS或PHA对照产生的概况进行比较。来自细胞上清液和细胞裂解物的由mAb展示的细胞因子概况与对照人IgG是相当的。在一个实施方案中，单克隆抗体不和人血细胞相互作用以自发释放炎性细胞因子。
对DVD-Ig的细胞因子释放研究是复杂的，这是由于存在四个或更多结合位点，对于每种抗原各两个。简而言之，如本文所述的细胞因子释放研究测量完整DVD-Ig分子对全血或其他细胞系统的作用，但是可以分析是该分子的哪部分引起细胞因子释放。一旦细胞因子释放已得到检测，就必须确定DVD-Ig制剂的纯度，这是因为一些共纯化细胞组分可以自身引起细胞因子释放。如果纯度不是问题，那么可能需要采用DVD-Ig片段化(包括但不限于去除Fc部分、分离结合位点等)、结合位点诱变或其他方法来去卷积(deconvolute)任何观察。显而易见的是，如果在组合为DVD-Ig之前对于细胞因子释放的缺乏选择两种亲本抗体，那么这种复杂的进行就大大简化。
B.13 与用于毒理学研究的其他物种的交叉反应性:
在一个实施方案中，选择的个别抗体对合适的tox物种(例如食蟹猴)具有足够交叉反应性。亲本抗体需要结合直向同源物种靶(即食蟹猴)并引发适当的应答(调节、中和、活化)。在一个实施方案中，对直向同源物种靶的交叉反应性(亲和力/效价)应当在人靶的10倍之内。在实践中，对多个物种包括小鼠、大鼠、狗、猴(和其他非人灵长类动物)以及疾病模型物种(即用于哮喘模型的绵羊)评价亲本抗体。亲本单克隆抗体对tox物种的可接受的交叉反应性允许在相同物种中的将来的DVD-Ig-Ig毒理学研究。出于该原因，两种亲本单克隆抗体应当对共同的tox物种具有可接受的交叉反应性，从而允许在相同物种中的DVD-Ig毒理学研究。
亲本mAbs可以选自结合特定靶且本领域众所周知的各种mAbs。这些包括但不限于，抗-TNF抗体(美国专利号6,258,562)、抗-IL-12和/或抗-IL-12p40抗体(美国专利号6,914,128)；抗-IL-18抗体(美国专利申请号20050147610)、抗-C5、抗-CBL、抗-CD147、抗-gp120、抗-VLA-4、抗-CD11a、抗-CD18、抗-VEGF、抗-CD40L、抗 CD-40 (例如，参见PCT公开号WO2007124299) 抗-Id、抗-ICAM-1、抗-CXCL13、抗-CD2、抗-EGFR、抗-TGF-β2、抗-HGF、抗-cMet、抗DLL-4、抗-NPR1、抗-PLGF、抗-ErbB3、抗-E-选择蛋白、抗-Fact VII、抗-Her2/neu、抗-F gp、抗-CD11/18、抗-CD14、抗-ICAM-3、抗-RON、抗 CD-19、抗-CD80 (例如，参见PCT公开号 WO2003039486、抗-CD4、抗-CD3、抗-CD23、抗-β2-整联蛋白、抗-α4β7、抗-CD52、抗-HLADR、抗-CD22 (例如，参见美国专利号5,789,554)、抗-CD20、抗-MIF、抗-CD64 (FcR)、抗-TCRα β、抗-CD2、抗-Hep B、抗-CA 125、抗-EpCAM、抗-gp120、抗-CMV、抗-gpIIbIIIa、抗-IgE、抗-CD25、抗-CD33、抗-HLA、抗-IGF1,2、抗 IGFR、抗-VNR整联蛋白、抗-IL-1α、抗-IL-1β、抗-IL-1受体、抗-IL-2受体、抗-IL-4、抗-IL-4受体、抗-IL5、抗-IL-5 受体、抗-IL-6、抗- IL-6R、RANKL、NGF、DKK、αVβ3、IL-17A、抗-IL-8、抗-IL-9、抗-IL-13、抗-IL-13受体、抗-IL-17、和抗-IL-23；IL-23p19；(参见Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731-6 和http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html)。
亲本mAbs还可以选自批准用于在临床试验，或临床用途开发中使用的各种治疗性抗体。此种治疗性抗体包括但不限于，利妥希单抗(Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche)(参见例如美国专利号5,736,137), 批准治疗非何杰金氏淋巴瘤的嵌合抗-CD20抗体；HuMax-CD20, 目前由Genmab开发中的抗-CD20，在美国专利号5,500,362中描述的抗-C20抗体，AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM(Intracel), 和PRO70769 (PCT申请号PCT/US2003/040426), 曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin®, Genentech) (参见例如美国专利号5,677,171), 批准治疗乳腺癌的人源化抗-Her2/neu抗体；帕妥珠单抗(pertuzumab)(rhuMab-2C4, Omnitarg®)，目前由Genentech开发中；在美国专利号4,753,894中描述的抗-Her2抗体；西妥昔单抗(cetuximab)(Erbitux®, Imclone) (美国专利号4,943,533；PCT公开号WO 96/40210),在用于多种癌症的临床试验中的嵌合抗-EGFR抗体；ABX-EGF (美国专利号6,235,883), 目前由Abgenix-Immunex-Amgen开发中；HuMax- EGFr (美国专利号7,247,301), 目前由Genmab开发中；425, EMD55900, EMD62000, 和EMD72000 (Merck KGaA) (美国专利号5,558,864；Murthy等人(1987) Arch. Biochem. Biophys. 252(2):549-60；Rodeck等人(1987) J. Cell. Biochem. 35(4):315-20；Kettleborough等人(1991) Protein Eng. 4(7):773-83)；ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT公开号 WO 95/20045；Modjtahedi等人(1993) J. Cell Biophys. 22(1-3):129-46；Modjtahedi等人(1993) Br.J. Cancer 67(2):247-53；Modjtahedi等人(1996) Br. J. Cancer 73(2):228-35；Modjtahedi等人(2003) Int. J. Cancer 105(2):273-80)；TheraCIM hR3 (YMBiosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba (美国专利号5,891,996；美国专利号6,506,883；Mateo等人(1997) Immunotechnol. 3(1):71-81)；mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth等人(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(2):639-44)；KSB-102 (KSBiomedix)；MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT公开号 WO 0162931)；和SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138)；阿来组单抗(alemtuzumab)(Campath®,Millenium), 目前批准用于治疗B-细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化mAbs；莫罗莫那(muromonab)-CD3 (Orthoclone OKT3®),由Ortho Biotech/Johnson & Johnson开发的抗-CD3抗体，替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin®), 由IDEC/Schering AG开发的抗-CD20抗体，吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg®), 由Celltech/Wyeth开发的抗-CD33(p67蛋白)抗体，阿来塞普(alefacept)(Amevive®), 由Biogen开发的抗-LFA-3 Fc融合物)，阿昔单抗(ReoPro®), 由Centocor/Lilly开发，巴利昔单抗(basiliximab)(Simulect®), 由Novartis开发，帕利珠单抗(palivizumab)(Synagis®),由Medimmune开发，英夫单抗(Remicade®), 由Centocor开发的抗-TNFα抗体，阿达木单抗(adalimumab)(Humira®), 由Abbott开发的抗-TNFα抗体，Humicade®, 由Celltech开发的抗TNFα抗体，戈利木单抗(golimumab) (CNTO-148), 由Centocor开发的完全人TNF抗体，依那西普(etanercept)(Enbrel®), 由Immunex/Amgen开发的p75 TNF受体Fc融合物，来那西普(lenercept)，早先由Roche开发的p55 TNF受体Fc融合物，ABX-CBL，由Abgenix开发中的抗-CD147抗体，ABX-IL8, 由Abgenix开发中的抗-IL8抗体，ABX-MA1, 由Abgenix开发中的抗-MUC18抗体, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1), 由Antisoma开发的抗-MUC1，Therex (R1550),由Antisoma开发中的抗-MUC1抗体，AngioMab (AS1405), 由Antisoma开发中，HuBC-1, 由Antisoma开发中，由Antisoma开发中的Thioplatin(AS1407)，Antegren® (那他珠单抗(natalizumab)), 由Biogen开发中的抗-α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体, VLA-1 mAb, 由Biogen开发中的抗-VLA-1整联蛋白抗体，LTBRmAb,由Biogen开发中的抗-淋巴毒素β受体(LTBR)抗体 ，CAT-152, 由Cambridge AntibodyTechnology开发中的抗-TGF-β2抗体，ABT 874 (J695), 由Abbott开发中的抗-IL-12 p40抗体，CAT-192, 由Cambridge Antibody Technology和Genzyme开发中的抗-TGFβ1抗体，CAT-213, 由Cambridge Antibody Technology开发中的抗-嗜伊红粒细胞趋化蛋白1抗体，LymphoStat-B®由Cambridge Antibody Technology和Human Genome Sciences Inc.开发中的抗-Blys抗体，TRAIL-R1mAb, 由Cambridge Antibody Technology和Human GenomeSciences, Inc.开发中的抗-TRAIL-R1抗体，Avastin® 贝伐单抗(bevacizumab),rhuMAb-VEGF), 由Genentech开发中的抗-VEGF抗体，由Genentech开发中的抗-HER受体家族抗体，抗组织因子(ATF)，由Genentech开发中的抗-组织因子抗体，Xolair® (奥马佐单抗(omalizumab)), 由Genentech开发中的抗-IgE抗体，Raptiva® (依法利珠单抗(Efalizumab)), 由Genentech和Xoma开发中的抗-CD11a抗体，MLN-02抗体(以前为LDP-02), 由Genentech和Millenium Pharmaceuticals开发中，HuMax CD4, 由Genmab开发中的抗-CD4抗体，HuMax-IL15, 由Genmab和Amgen开发中的抗-IL15抗体，HuMax-Inflam, 由Genmab和Medarex开发中，HuMax-Cancer, 由Genmab和Medarex和Oxford GcoSciences开发中的抗-类肝素酶(heparanase)I抗体，HuMax-Lymphoma, 由Genmab 和Amgen开发中,HuMax-TAC,由Genmab开发中, IDEC-131, 由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗-CD40L抗体，IDEC-151 (Clenoliximab), 由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗-CD4抗体，IDEC-114, 由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗-CD80抗体，IDEC-152,由IDECPharmaceuticals开发中的抗-CD23抗体，由IDEC Pharmaceuticals开发中的抗-巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体，BEC2,由Imclone开发中的抗-独特型抗体，IMC-1C11,由Imclone开发中的抗-KDR抗体，DC101, 由Imclone开发中的抗-flk-1抗体，由Imclone开发中的抗-VE钙粘蛋白抗体，CEA-Cide® (拉贝珠单抗(labetuzumab)), 由Immunomedics开发中的抗-癌胚抗原(CEA)抗体，LymphoCide® (依帕珠单抗(Epratuzumab)), 由Immunomedics开发中的抗-CD22抗体，AFP-Cide, 由Immunomedics开发中，MyelomaCide, 由Immunomedics开发中，LkoCide, 由Immunomedics开发中，ProstaCide, 由Immunomedics开发中，MDX-010, 由Medarex开发中的抗-CTLA4抗体，MDX-060, 由Medarex开发中的抗-CD30抗体，由Medarex开发中的MDX-070，由Medarex开发中的MDX-018，Osidem® (IDM-1), 以及由Medarex和Immuno-Designed Molecules开发中的抗-Her2抗体，HuMax®-CD4, 由Medarex和Genmab开发中的抗-CD4抗体，HuMax-IL15,由Medarex和Genmab开发中的抗-IL15抗体，CNTO 148,由Medarex和Centocor/J&J开发中的抗-TNFα抗体，CNTO 1275, 由Centocor/J&J开发中的抗-细胞因子抗体，MOR101和MOR102,由MorphoSys开发中的抗-细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体，MOR201, 由MorphoSys开发中的抗-成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体，Nuvion® (维西珠单抗(visilizumab)), 由Protein Design Labs开发中的抗-CD3抗体，HuZAF®, 由Protein Design Labs开发中的抗-γ干扰素抗体，抗-α 5β1整联蛋白, 由Protein Design Labs开发中，抗-IL-12, 由Protein Design Labs开发中，ING-1, 由Xoma开发中的抗-Ep-CAM抗体，Xolair® (奥马佐单抗(Omalizumab)) 由Genentech和Novartis开发的人源化抗-IgE抗体，和MLN01,由Xoma开发中的抗-β2整联蛋白抗体。在另一个实施方案中，治疗剂包括KRN330 (Kirin)；huA33抗体(A33, Ludwig Institute for CancerResearch)；CNTO 95 (α V 整联蛋白, Centocor)；MEDI-522 (α Vβ3整联蛋白,Medimmune)；volociximab (α Vβ1整联蛋白, Biogen/PDL)；人mAb 216 (B细胞糖基化表位, NCI)；BiTE MT103 (双特异性CD19 x CD3, Medimmune)；4G7xH22 (双特异性B细胞xFcγR1, Medarex/Merck KGa)；rM28 (双特异性CD28 x MAPG, 欧洲专利号EP1444268)；MDX447 (EMD 82633) (双特异性CD64 x EGFR, Medarex)；Catumaxomab (removab) (双特异性EpCAM x 抗-CD3, Trion/Fres)；Ertumaxomab (双特异性HER2/CD3, FreseniusBiotech)；oregovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx)；Rencarex® (WX G250) (碳酸酐酶IX, Wilex)；CNTO 888 (CCL2, Centocor)；TRC105 (CD105 (内皮糖蛋白), Tracon)；BMS-663513 (CD137激动剂, Brystol Myers Squibb)；MDX-1342 (CD19, Medarex)；希普利珠单抗(Siplizumab)(MEDI-507) (CD2, Medimmune)；Ofatumumab (Humax-CD20) (CD20,Genmab)；利妥希单抗(Rituxan) (CD20, Genentech)；veltuzumab ( hA20) (CD20,Immunomedics)；依帕珠单抗(CD22, Amgen)；鲁昔单抗(lumiliximab)(IDEC 152) (CD23,Biogen)；莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3) (CD3, Ortho)；HuM291 (CD3 fc受体, PDLBiopharma)；HeFi-1, CD30, NCI)；MDX-060 (CD30, Medarex)；MDX-1401 (CD30,Medarex)；SGN-30 (CD30, Seattle Genentics)；SGN-33 (林妥珠单抗(Lintuzumab))(CD33, Seattle Genentics)；扎木单抗(Zanolimumab)(HuMax-CD4) (CD4, Genmab)；HCD122 (CD40, Novartis)；SGN-40 (CD40, Seattle Genentics)；Campath1h (阿来组单抗(Alemtuzumab)) (CD52, Genzyme)；MDX-1411 (CD70, Medarex)；hLL1 (EPB-1)(CD74.38, Immunomedics)；加利昔单抗(Galiximab)(IDEC-144) (CD80, Biogen)；MT293(TRC093/D93) (切割的胶原, Tracon)；HuLuc63 (CS1, PDL Pharma)；ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb)；Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2)(CTLA4, Pfizer)；HGS-ETR1 (Mapatumumab) (DR4 TRAIL-R1激动剂, Human GenomeScience /Glaxo Smith Kline)；AMG-655 (DR5, Amgen)；Apomab (DR5, Genentech)；CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo)；HGS-ETR2 (来沙木单抗(lexatumumab)) (DR5 TRAIL-R2激动剂, HGS)；西妥昔单抗(Erbitux)(EGFR, Imclone)；IMC-11F8, (EGFR, Imclone)；尼妥珠单抗(Nimotuzumab)(EGFR, YM Bio)；帕尼单抗(Panitumumab)(Vectabix) (EGFR,Amgen)；扎鲁木单抗(Zalutumumab)(HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab)；CDX-110 (EGFRvIII,AVANT Immunotherapeutics)；阿德木单抗(adecatumumab)(MT201) (Epcam, Merck)；依决洛单抗(edrecolomab)(Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor)；MORAb-003 (叶酸受体a, Morphotech)；KW-2871 (神经节苷脂 GD3, Kyowa)；MORAb-009 (GP-9,Morphotech)；CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex)；曲妥珠单抗(Herceptin) (HER2,Celldex)；帕妥珠单抗(rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech)；阿泊珠单抗(apolizumab)(HLA-DR β链, PDL Pharma)；AMG-479 (IGF-1R, Amgen)；抗-IGF-1R R1507 (IGF1-R,Roche)；CP 751871 (IGF1-R, Pfizer)；IMC-A12 (IGF1-R, Imclone)；BIIB022 (IGF-1R,Biogen)；Mik-β-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche)；CNTO 328 (IL6, Centocor)；抗-KIR (1-7F9) (杀伤细胞Ig-样受体(KIR), Novo)；Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth,Ludwig Institute of Cancer Research)；hCBE-11 (LTßR, Biogen)；HuHMFG1 (MUC1,Antisoma/NCI)；RAV12 (N-连接的糖表位, Raven)；CAL (甲状旁腺激素相关蛋白(PTH-rP), University of California)；CT-011 (PD1, CureTech)；MDX-1106 (ono-4538)(PD1, Medarex/Ono)；MAb CT-011 (PD1, Curetech)；IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone)；巴维昔单抗(bavituximab)(磷脂酰丝氨酸，Peregrine)；huJ591 (PSMA, Cornell ResearchFoundation)；muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation)；GC1008 (TGFb (pan)抑制剂(IgG4), Genzyme)；英夫单抗(Remicade) (TNFa, Centocor)；A27.15 (转铁蛋白受体,Salk Institute, INSERN WO 2005/111082)；E2.3 (转铁蛋白受体, Salk Institute)；贝伐单抗(Avastin) (VEGF, Genentech)；HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab) PCT公开号WO/2000/034337, University of Texas)；IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone)；IMC-1121(VEGFR2, Imclone)。
B. DVD分子的构建:
双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子进行这样设计，从而使得来自2种不同亲本单克隆抗体的2个不同轻链可变结构域(VL)通过重组DNA技术直接或通过短接头串联连接，随后为轻链恒定结构域和任选地，Fc区。类似地，重链包含串联连接的2个不同重链可变结构域(VH)，随后为恒定结构域CH1和Fc区(图1A)。
可变结构域可以使用重组DNA技术从亲本抗体获得，所述亲本抗体通过本文所述方法中的任何一种生成。在一个实施方案中，可变结构域是鼠重或轻链可变结构域。在另一个实施方案中，可变结构域是CDR嫁接的或人源化的可变重或轻链结构域。在一个实施方案中，可变结构域是人重或轻链可变结构域。
在一个实施方案中，第一个和第二个可变结构域使用重组DNA技术直接互相连接。在另一个实施方案中，可变结构域通过接头序列进行连接。在一个实施方案中，连接2个可变结构域。3个或更多可变结构域也可以直接或通过接头序列进行连接。可变结构域可以结合相同抗原或可以结合不同抗原。本发明的DVD分子可以包括1个免疫球蛋白可变结构域和1个非免疫球蛋白可变结构域，诸如受体的配体结合结构域，酶活性结构域。DVD分子也可以包含2个或更多非-Ig结构域。
接头序列可以是单一氨基酸或多肽序列。在一个实施方案中，接头序列选自
。
接头序列的选择基于几种Fab分子的晶体结构分析。在Fab或抗体分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性键。这种天然键包含约10-12个氨基酸残基，由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末端的4-6个残基促成。本发明的DVD Igs使用CL或CH1的N末端5-6个氨基酸残基，或11-12个氨基酸残基分别作为DVD-Ig的轻链和重链中的接头来生成。CL或CH1结构域的N末端残基，特别是前5-6个氨基酸残基，采取环构象而无强二级结构，因此可以充当2个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是Ig序列的部分，因此使可能由接头和接点引起的任何免疫原性很大程度地降到最低。
其他接头序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不是CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基；轻链接头可以来自Cκ或Cλ；且重链接头可以来源于任何同种型的CH1，包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε、和Cμ。接头序列还可以来源于其他蛋白诸如Ig-样蛋白，(例如，TCR、FcR、KIR)；基于G/S的序列(例如，G4S重复SEQ ID NO: 29)；铰链区衍生的序列；和来自其他蛋白的其他天然序列。
在一个实施方案中，使用重组DNA技术使恒定结构域与2个连接的可变结构域连接。在一个实施方案中，包含连接的重链可变结构域的序列与重链恒定结构域连接，且包含连接的轻链可变结构域的序列与轻链恒定结构域连接。在一个实施方案中，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。在一个实施方案中，DVD重链与Fc区进一步连接。Fc区可以是天然序列Fc区，或变体Fc区。在另一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在另一个实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc区。
在另一个实施方案中，将2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽组合，以形成DVD-Ig分子。表2列出了用于治疗疾病(例如治疗癌症)的靶的示例性抗体的VH和VL区氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了以任何方向包含至少两个表2所列VH和/或VL区的DVD。
表2：用于生成DVD-Igs的抗体VH和VL区氨基酸序列表
结合特定靶的特异性DVD-Ig分子的详细描述及其制备方法，在下文实施例部分中提供。
C. DVD蛋白的产生
本发明的结合蛋白可以通过本领域已知的许多技术中的任何一种来产生。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码DVD重和DVD轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的DVD蛋白，在真核细胞例如哺乳动物宿主细胞中表达DVD蛋白，因为此种真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫学活性的DVD蛋白。
用于表达本发明的重组抗体的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220中描述, 与DHFR选择标记一起使用的dhfr- CHO细胞，例如，如Kaufman和Sharp (1982) Mol.Biol. 159:601-621中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、SP2和PER.C6 细胞。当编码DVD蛋白的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养足够时间期间以允许DVD蛋白在宿主细胞中表达，或DVD蛋白分泌到其中宿主细胞生长的培养基内而产生DVD蛋白。DVD蛋白可以使用标准蛋白纯化法从培养基中回收。
在用于重组表达本发明的DVD蛋白的示例性系统中，编码DVD重链和DVD轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，DVD重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达DVD重和轻链，且从培养基中回收完整的DVD蛋白。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收DVD蛋白。又进一步本发明提供了合成本发明的DVD蛋白的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成本发明的DVD蛋白。该方法可以进一步包含从培养基中分离DVD蛋白。
DVD-Ig的重要特征是它可以以与常规抗体相似的方式产生和纯化。DVD-Ig的产生导致具有所需双重特异性活性的均质、单一的主要产物，而无恒定区的任何序列修饰或任何种类的化学修饰。生成“双特异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的其他先前描述的方法不导致单一的主要产物，而是导致装配的无活性、单特异性、多特异性、多价、全长结合蛋白，和具有不同结合位点组合的多价全长结合蛋白的混合物的细胞内或分泌的产生。作为实例，基于由PCT公开WO2001/077342描述的设计，存在重和轻链的16种可能组合。因此只有6.25％的蛋白可能处于所需活性形式，而非与其他15种可能组合相比作为单一主要产物或单一原始产物。使用标准层析技术使所需完全活性形式的蛋白与无活性和部分活性形式的蛋白分离仍有待证实，所述标准层析技术一般在大规模制备中使用。
令人惊讶的是，本发明的“双重-特异性多价全长结合蛋白”的设计导致双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，所述轻链和重链主要装配成所需“双重特异性多价全长结合蛋白”。
至少50％、至少75％且至少90％装配且表达的双重可变结构域免疫球蛋白分子是所需双重特异性四价蛋白。本发明的这个方面特别增强了本发明的商业效用。因此，本发明包括在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一主要产物的方法。
本发明提供了在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的“主要产物”的方法，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的50％，其包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
本发明提供了在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产物”的方法，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的75％，其包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
本发明提供了在单一细胞中表达双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链从而导致“双重特异性四价全长结合蛋白”的单一“主要产物”的方法，其中“主要产物”超过所有装配的蛋白的90％，其包含双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链。
II. 衍生化的DVD结合蛋白
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的结合蛋白用另一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白)衍生化或连接。例如，本发明的标记的结合蛋白可以通过使本发明的结合蛋白与一种或多种其他分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)来衍生，所述其他分子实体诸如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒性剂、药学试剂、和/或可以介导结合蛋白与另一种分子(诸如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白或肽。
本发明的结合蛋白可以与之衍生化的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。结合蛋白也可以用可检测酶衍生化，诸如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当结合蛋白用可检测酶衍生化时，它通过添加酶用于产生可检测反应产物的另外的试剂进行检测。例如，当可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物。结合蛋白也可以用生物素衍生化，且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。
本发明的另一个实施方案提供了结晶结合蛋白以及包含此种晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性对应物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶化后保留生物学活性。
本发明的结晶结合蛋白可以根据本领域已知的和如PCT公开号 WO 02072636中公开的方法来产生。
本发明的另一个实施方案提供了糖基化的结合蛋白，其中抗体或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白产生可以经历称为翻译后修饰的进一步加工。特别地，糖(糖基)残基可以酶促添加，这个过程称为糖基化。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期有最低的作用(Jefferis (2005) Biotechnol.Prog. 21:11–16)。相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有作用。可变结构域中的糖基化可能对抗体结合亲和力具有负面作用，可能是由于空间位阻(Co等人(1993) Mol. Immunol. 30:1361-1367), 或导致对抗原的亲和力增加(Wallick等人(1988) Exp. Med. 168:1099-1109；Wright等人(1991) EMBO J. 10:2717-2723)。
本发明的一个方面涉及生成糖基化位点突变体，其中结合蛋白的O-或N-连接的糖基化位点已进行突变。本领域技术人员可以使用标准的众所周知的技术来生成此种突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体是本发明的另一个目标。
在又另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合部分的糖基化得到修饰。例如，可以制备无糖基化(aglycoslated)抗体(即该抗体缺乏糖基化)。糖基化可以进行改变，以例如增加抗体对抗原的亲和力。此种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以制备导致一个或多个可变区糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，以从而消除该位点的糖基化。此种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此种方法在PCT公开号 WO2003016466和美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
此外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的本发明的修饰的结合蛋白，诸如具有减少量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足(hypofucosylated)抗体(参见Kanda等人 (2007) J. Biotechnol. 130(3):300-310.)或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此种改变的糖基化模式已显示增加抗体的ADCC能力。此种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域得到描述，且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，以从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields等人(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana等人(1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 以及欧洲专利号EP 1,176,195；和PCT公开号WO 03/035835和WO 99/5434280。
蛋白糖基化取决于目的蛋白的氨基酸序列，以及在其中表达蛋白的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，且具有不同的可用底物(核苷酸糖)。由于这些因素，蛋白糖基化模式和糖基残基组成可以依赖于在其中表达特定蛋白的宿主系统而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。在一个实施方案中，糖基化的结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。
不同的蛋白糖基化可以导致不同的蛋白特征，这是本领域技术人员已知的。例如，与哺乳动物细胞诸如CHO细胞系中表达的相同蛋白的效力相比较，在微生物宿主诸如酵母中产生和利用酵母内源性途径糖基化的治疗蛋白的效力可能是减少的。此种糖蛋白在人中也可以是免疫原性的，且在施用后显示减少的体内半衰期。人和其他动物中的特定受体可以识别特定糖基残基且促进蛋白从血流中快速清除。其他不利效应可以包括蛋白折叠、可溶性、对蛋白酶的敏感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白或因子识别、抗原性、或变应原性中的变化。因此，从业者可能选择具有特定糖基化组成和模式(例如等同于或至少类似于在人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中产生的糖基化组成和模式的糖基化组成和模式)的治疗蛋白。
表达不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来完成。使用本领域已知的技术，从业者可以生成显示人蛋白糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)显示等同于动物细胞特别是人细胞的蛋白糖基化的蛋白糖基化(美国专利号7,449,308和7,029,872 以及PCT公开号/ WO2005/100584)。
除了结合蛋白，本发明还涉及对于本发明的这种结合蛋白特异的抗-独特型(抗-Id)抗体。抗-Id抗体是识别独特决定簇的抗体，所述独特决定簇一般与另一种抗体的抗原结合区相关。抗-Id可以通过用结合蛋白或其含CDR区免疫动物来制备。免疫的动物将识别，且对免疫抗体的独特型决定簇应答且产生抗-Id抗体。显而易见的是，可能更容易生成针对整合为DVD-Ig分子的两种或更多亲本抗体的抗-独特型抗体；而且通过本领域众所周知的方法(例如BIAcore、ELISA)确认结合研究，以验证对各种亲本抗体的独特型特异的抗独特型抗体也识别DVD-Ig背景中的独特型(例如抗原结合位点)。对DVD-Ig的两个或更多个抗原结合位点中的每一个特异的抗独特型抗体为测量患者血清中人DVD-Ig的DVD-Ig浓度提供了理想试剂；可以使用“夹心测定ELISA形式”确立DVD-Ig浓度测定，其中，针对第一个抗原结合区域的抗体包被于固相(例如BIAcore芯片、ELISA板等)上，以冲洗缓冲液冲洗，与血清样品孵育，再次冲洗以及最后与针对另一个抗原结合位点的另一个抗独特型抗体孵育，其自身被酶标记以用于定量结合反应。在一个实施方案中，对于具有多于两个不同的结合位点的DVD-Ig，针对两个最外部结合位点(距恒定区最远和最近)的抗独特型抗体将不仅有助于确定人血清中的DVD-Ig浓度，而且也证明分子在体内的完整性。每个抗-Id抗体也可以用作“免疫原”以在另外一种动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗-抗-Id抗体。
此外，本领域技术人员将理解，目的蛋白可以使用宿主细胞文库来表达，所述宿主细胞进行基因工程改造以表达各种糖基化酶，从而使得文库的成员宿主细胞产生具有变体糖基化模式的目的蛋白。从业者随后可以选择并分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白。在一个实施方案中，具有特定选择的新糖基化模式的蛋白显示改善或改变的生物学性质。
III. DVD-Ig的用途
鉴于其与2种或更多种抗原结合的能力，本发明的结合蛋白可以用于检测抗原(例如，在生物样品诸如血清或血浆中)，其中使用常规免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。DVD-Ig用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基(prostheticgroup)、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；且合适放射性材料的实例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、或153Sm。
在一个实施方案中，本发明的结合蛋白在体外和体内中和抗原活性。因此，此种DVD-Igs可以例如，在包含抗原的细胞培养物中、在人受试者中或在具有本发明的结合蛋白与其交叉反应的抗原的其他哺乳动物受试者中用于抑制抗原活性。在另一个实施方案中，本发明提供了用于减少受试者中的抗原活性的方法，所述受试者患有其中抗原活性是有害的疾病或病症。本发明的结合蛋白可以施用于人受试者用于治疗目的。
术语“其中抗原活性是有害的病症”包括疾病或其他病症，其中患有该病症的受试者中抗原的存在已显示或怀疑负责该病症的病理生理学或是促进该病症恶化的因素。因此，其中抗原活性是有害的病症是其中抗原活性减少预期减轻该病症症状和/或进展的病症。此种病症可以例如由患有病症的受试者生物学流体中抗原浓度的增加(例如受试者血清、血浆、滑液等中抗原浓度的增加)来证实。可以用本发明的结合蛋白治疗的病症的非限制性实例包括下文以及涉及包含本发明的抗体的药物组合物部分中讨论的那些病症。
本发明的DVD-Igs可以结合一种抗原或多种抗原。此种抗原包括但不限于，下述数据库中列出的靶，所述数据库通过引用并入本文。这些靶数据库包括下述列表：
治疗靶(http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；
细胞因子和细胞因子受体(http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi, 和
http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)；
趋化因子(http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；
趋化因子受体和GPCRs (http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/)；
嗅觉受体(http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；
受体(http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；
癌症靶(http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；
作为可能的抗体靶的分泌的蛋白(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)；
蛋白激酶(http://spd.cbi.pku.edu.cn/), 和
人CD标记(http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf)和(Zola (2005) Blood 106:3123-6)。
DVD-Igs作为治疗剂以同时阻断2种不同靶以增强效力/安全性和/或增加患者覆盖度是有用的。此种靶可包括可溶性靶(例如，TNF)和细胞表面受体靶(例如，VEGFR和EGFR)。它还可以用于诱导肿瘤细胞和T细胞(例如，Her2和CD3)之间改变方向的(redirected)细胞毒性用于癌症治疗，或自体反应细胞或效应细胞之间改变方向的细胞毒性用于自身免疫病或移植，或任何靶细胞和效应细胞之间改变方向的细胞毒性以消除任何给定疾病中的致病细胞。
此外，当DVD-Ig设计成靶向相同受体上的2个不同表位时，它可以用于触发受体成簇和活化。这在制备激动性和拮抗性抗-GPCR治疗剂中可能具有益处。在这种情况下，DVD-Ig可以用于靶向一种细胞上的2个不同表位(包括在环区以及细胞外结构域上的表位)用于成簇/信号传递(2种细胞表面分子)或信号传递(对于一种分子)。类似地，DVD-Ig分子可以设计成通过靶向CTLA-4细胞外结构域的2个不同表位(或相同表位的2个拷贝)，触发CTLA-4连接和负信号，从而导致免疫应答下调。CTLA-4是用于治疗性处理许多免疫学病症的临床上确认的靶。CTLA-4/B7相互作用通过减弱细胞周期进展、IL-2产生、和活化后的T细胞增殖而负调节T细胞活化，且CTLA-4(CD152)衔接(engagement)可以下调T细胞活化且促进免疫耐受性的诱导。然而，通过激动性抗体衔接CTLA-4减弱T细胞活化的策略仍是不成功的，这是因为CTLA-4活化需要连接。如通过晶体结构分析证实的(Stamper (2001) Nature 410:608)，CTLA-4/B7的分子相互作用为“歪斜拉链(skewed zipper)”排列。然而，目前可用的CTLA-4结合试剂没有一种具有连接性质，包括抗-CTLA-4 mAbs。已存在解决这个问题的几种尝试。在一种情况下，细胞膜结合的单链抗体被生成，且显著抑制小鼠中的同种异体排斥(Hwang (2002) J. Immunol. 169:633)。在分开的情况下，针对CTLA-4的人工APC表面连接的单链抗体被生成且显示减弱T细胞应答(Griffin (2000) J. Immunol. 164:4433)。在2种情况下，CTLA-4连接通过在人工系统中紧密定位的膜结合的抗体来完成。尽管这些实验提供了通过触发CTLA-4负信号传递用于免疫下调的概念验证(proof-of-concept)，但这些报道中使用的试剂不适合于治疗用途。为此，CTLA-4连接可以通过使用DVD-Ig分子来达到，所述DVD-Ig分子靶向CTLA-4细胞外结构域的2个不同表位(或相同表位的2个拷贝)。基本原理是跨越IgG 2个结合位点的距离为约150-170Å，太大而不能有效连接CTLA-4(2个CTLA-4同源二聚体之间30-50 Å)。然而，DVD-Ig上2个结合位点(1个臂)之间的距离短得多，也在30-50 Å范围中，从而允许CTLA-4的正确连接。
类似地，DVD-Ig可以靶向细胞表面受体复合物的2个不同成员(例如IL-12Rα和β)。此外，DVD-Ig可以靶向CR1和可溶蛋白/病原体
，以驱动靶可溶蛋白/病原体的快速清除。
另外，本发明的DVD-Igs可以用于组织特异性递送(靶向组织标记和疾病介质用于增强局部PK，从而达到较高的效力和/或较低的毒性)，包括细胞内递送(靶向内在化受体和细胞内分子)，和递送至脑内(例如，靶向转铁蛋白受体和CNS疾病介质用于穿过血脑屏障)。DVD-Ig也可以充当载体蛋白，以通过与那种抗原的非中和表位结合将抗原递送至特定位置，并且也增加抗原的半衰期。此外，DVD-Ig可以设计成与植入患者内的医学设备物理连接，或靶向这些医学设备(参见Burke等人(2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58(3):37-446；Surface coatings for biological activation and functionalization of medicaldevices (参见Hildebrand等人(2006) Surface Coatings Technol. 200(22-23):6318-6324；Drug/ device combinations for local drug therapies and infectionprophylaxis (参见Wu等人(2006) Biomaterials 27(11):2450-2467)；Mediation of thecytokine network in the implantation of orthopedic devices (参见Marques等人Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (2005),第377-397页)。简而言之，将合适的细胞类型导向至医学植入物部位可以促进愈合和恢复正常组织功能。可替代地，也提供了通过与设备偶联或靶向至设备的DVD对设备植入后释放的介质(包括但不限于细胞因子)的抑制。例如，支架多年来已在介入性心脏病学中使用，以清除闭塞动脉且改善至心肌的血流。然而，常规裸金属支架已知在一些患者中引起再狭窄(治疗区域中动脉的再变窄)，且可以导致血凝块。近来，抗-CD34抗体包被的支架已得到描述，它通过捕获在血液中各处循环的内皮祖细胞(EPC)来减少再狭窄且阻止血凝块发生。内皮细胞是血管衬里(line blood vessels)的细胞，允许血液平稳流动。EPCs附着至支架硬表面，形成平滑层，所述平滑层不仅促进愈合而且还阻止再狭窄和血凝块，所述再狭窄和血块是以前与支架使用相关的并发症(Aoji等人(2005) J. Am. Coll. Cardiol. 45(10):1574-9)。除了改善需要支架的患者的结果外，还存在需要心血管旁路手术的患者的牵涉。例如，用抗-EPC抗体包被的假体血管管道(人工动脉)将消除使用来自患者腿或臂的动脉用于旁路手术移植的需要。这将减少外科手术和麻醉时间，这依次将减少冠状动脉外科手术死亡。DVD-Ig以这样的方式设计，从而使得它与细胞表面标记(诸如CD34)以及蛋白(或任何种类的表位，包括但不限于蛋白、脂质和多糖)结合，所述细胞表面标记以及蛋白已包被在植入的设备上以促进细胞募集。一般而言此种方法也可以应用于其他医学植入物。可替代地，DVD-Igs可以包被在医学设备上，并且在植入且从设备中释放所有DVDs后(或可能需要另外的新鲜DVD-Ig的任何其他需要，包括已装载的DVD-Ig的老化和变性)，设备可以通过给患者全身施用新鲜DVD-Ig进行再装载，其中DVD-Ig被设计成用一组结合位点与目的靶(细胞因子、细胞表面标记(诸如CD34)等)结合，且用另一组结合位点与包被在设备上的靶(包括蛋白，任何种类的表位，包括但不限于脂质、多糖和聚合物)结合。这种技术具有扩展包被的植入物有用性的优点。
A. DVD-Igs在各种疾病中的用途
本发明的DVD-Ig分子也可用作治疗分子以治疗各种疾病。此种DVD分子可以结合参与特定疾病的一种或多种靶。各种疾病中的此种靶的实例在下文描述。
1. 人自身免疫和炎症应答
许多蛋白已牵涉进一般自身免疫和炎症应答，包括C5、CCL1 (I-309)、CCL11 (嗜伊红粒细胞趋化蛋白)、CCL13 (mcp-4)、CCL15 (MIP-1d)、CCL16 (HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18 (PARC)、CCL19、CCL2 (mcp-1)、CCL20 (MIP-3a)、CCL21 (MIP-2)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2 /嗜伊红粒细胞趋化蛋白-2)、CCL25 (TECK)、CCL26、CCL3 (MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (mcp-3)、CCL8 (mcp-2)、CXCL1、CXCL10 (IP-10)、CXCL11(I-TAC / IP-9)、CXCL12 (SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5 (ENA-78 / LIX)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13 (mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1 (CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1 (内皮单核细胞活化细胞因子)、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10 (IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2、和RNF110 (ZNF144)。在一个方面，提供了结合本文列出的一种或多种靶的DVD-Igs。
预期结合下列靶对的DVD Igs以治疗炎性疾病：IL-1α(seq. 3)和IL-1β(seq. 1)；IL-1α(seq. 2)和IL-1β(seq. 1)；IL-1α(seq. 1)和IL-1β(seq. 1)；IL-1α(seq. 3)和IL-1β(seq. 2)；IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 2)；IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 3)；IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 4)；IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 5) (参见实施例2.1至2.8)。
2. 哮喘
变应性哮喘的特征在于存在嗜伊红细胞增多、杯状细胞化生、上皮细胞改变、气道高反应性(AHR)、和Th2和Th1细胞因子表达、以及血清IgE水平升高。目前已普遍接受气道炎症是成为哮喘发病机理基础的关键因素，涉及炎症细胞及其分泌的介质包括细胞因子和趋化因子的复杂相互影响，所述炎症细胞诸如T细胞、B细胞、嗜伊红细胞、肥大细胞和巨噬细胞。皮质类固醇是目前用于哮喘的最重要抗炎治疗，然而，它们的作用机理是非特异性的，且存在安全性担忧，尤其是在青少年患者群体中。因此证明开发更特异性和靶向的治疗是有正当理由的。越来越多的证据表明小鼠中的IL-13模拟许多哮喘特征，包括AHR、粘液分泌过多和气道纤维化，不取决于嗜伊红性炎症(Finotto等人 (2005) Int. Immunol. 17(8):993-1007；Padilla等人(2005) J. Immunol. 174(12):8097-8105)。
已提示IL-13在引起与哮喘有关的病理应答中具有关键作用。开发抗-IL-13 mAb治疗以减少IL-13在肺中的作用是激动人心的新方法，它提供作为哮喘新治疗的相当大的希望。然而，差别免疫途径的其他介质也参与哮喘发病机理，且阻断这些介质，除IL-13外，可能提供另外的治疗利益。此种靶对包括但不限于，IL-13和促炎细胞因子，诸如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。TNF-α可以放大哮喘中的炎症应答且可能与疾病严重性关联(McDonnell等人(2001) Progr. Respir. Res. 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD):247-250.)。这提示阻断IL-13和TNF-α可能具有有益作用，特别是在严重气道疾病中。在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合靶IL-13和TNFα且用于治疗哮喘。
其中炎症和AHR两者可以进行评估的动物模型诸如OVA-诱导的哮喘小鼠模型，是本领域已知的且可以用于确定各种DVD-Ig分子治疗哮喘的能力。用于研究哮喘的动物模型在下述参考文献中公开：Coffman等人(2005) J. Exp. Med. 201(12):1875-1879；Lloyd等人(2001) Adv. Immunol. 77:263-295；Boyce等人(2005) J. Exp. Med. 201(12):1869-1873；和Snibson等人(2005) J. Brit. Soc. Allergy Clin. Immunol. 35(2):146-52。除了这些靶对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人(2004) Toxicol. 92(1-3):229-43；Descotes等人(1992) Dev. Biol. Standardiz. 77:99-102；Hart等人(2001) J. Allergyand Clin. Immunol. 108(2):250-257)。
基于本文公开的基本原理以及使用关于效力和安全性的相同评估模型，可以确定DVD-Ig分子可以结合且用于治疗哮喘的其他靶对。在一个实施方案中，此种靶包括但不限于，IL-13和IL-1β, 因为IL-1β也牵涉于哮喘中的炎症应答中；IL-13和参与炎症的细胞因子和趋化因子， 诸如IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激动剂；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；以及IL-13和ADAM8。本发明还提供了结合参与哮喘的一种或多种靶的DVD-Ig，所述一种或多种靶选自：CSF1 (MCSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、组胺和组胺受体、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNF、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR、和壳多糖酶。
3. 类风湿性关节炎
全身性疾病类风湿性关节炎(RA)的特征在于关节滑膜中的慢性炎症反应，且与软骨变性和近关节骨侵蚀相关。包括TNF、趋化因子和生长因子的许多促炎细胞因子在患病关节中表达。给RA小鼠模型全身施用抗TNF抗体或sTNFR融合蛋白显示是抗炎和关节保护的。其中用静脉内施用的英夫单抗(嵌合型抗TNF mAb)(Harriman等人(1999) Ann. Rheum.Dis. 58 增刊1:161-4)阻断RA患者的TNF活性的临床研究，已提供了下述证据：TNF调节IL-6、IL-8、MCP-1和VEGF产生，免疫和炎症细胞募集到关节内，血管生成，和基质金属蛋白酶1和3的血液水平减少。类风湿性关节炎中炎症途径的更好理解已导致参与类风湿性关节炎的其他治疗靶的鉴定。有希望的治疗诸如白介素-6拮抗剂(IL-6受体抗体MRA，由Chugai,Roche开发(参见Nishimoto等人(2004) Arthritis Rheum. 50(6):1761-1769)、CTLA4Ig(abatacept, Genovese等人(2005) N. Engl. J. Med. 353:1114-23.)、以及抗-B细胞治疗(利妥希单抗，Okamoto (2004) N. Engl. J. Med. 351:1909)，在过去的一年中已在随机对照试验中进行测试。其他细胞因子已进行鉴定且已显示在动物模型中是有利的，包括白介素-15(治疗性抗体HuMax-IL_15, AMG 714参见Baslund等人(2005) Arthrit. Rheum.52(9):2686-2692)、白介素-17和白介素-18，并且这些试剂的临床试验目前在进行中。组合抗TNF和另一种介质的双重特异性抗体疗法在增强临床效力和/或患者覆盖度方面具有很大的潜能。例如，阻断TNF和VEGF两者可以潜在地根除炎症和血管生成，所述炎症和血管生成都参与RA的病理生理学。也预期了用特异性DVD Igs阻断参与RA的其他靶对，包括但不限于，TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-23；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-17；以及TNF和IL-15。除了这些靶对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster等人(2004) Toxicol. 92(1-3):229-43；Descotes等人(1992) Dev. Biol. Standard. 77:99-102；Hart等人(2001) J.Allergy Clin. Immunol. 108(2):250-257)。DVD Ig分子是否将用于治疗类风湿性关节炎可以使用临床前动物RA模型，诸如胶原诱导的关节炎小鼠模型进行评估。其他有用的模型也是本领域众所周知的(参见Brand (2005) Comp. Med. 55(2):114-22)。基于亲本抗体对人和小鼠直向同源物的交叉反应性(例如，对人和小鼠TNF、人和小鼠IL-15等的反应性)，可以用“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig分子进行在小鼠CIA模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上，将基于两种(或更多)小鼠靶特异性抗体的DVD-Ig与用于人DVD-Ig构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和效价、相似的半衰期等)。
4. SLE
SLE的免疫病理学标志是多克隆B细胞活化，这导致血球蛋白过多症、自身抗体产生和免疫复合物形成。基本异常似乎是由于广泛性T细胞调节异常导致的T细胞不能抑制禁忌B细胞克隆(forbidden B cell clones)。此外，B和T细胞的相互作用通过几种细胞因子诸如IL-10，以及共刺激分子诸如CD40和CD40L、B7和CD28和CTLA-4得到促进，这起始第二信号。这些相互作用连同免疫复合物和细胞凋亡物质的受损吞噬清除，使免疫应答与所产生的组织损害永存。下述靶可能参与SLE且可以潜在地用于DVD-Ig方法用于治疗干预：B细胞靶向的治疗：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA、和NT5E.；共刺激信号：CTLA4或B7.1/B7.2；B细胞存活抑制：BlyS、BAFF；补体失活：C5；细胞因子调节：关键原理是任何组织中的净生物学应答是促炎或抗炎细胞因子局部水平之间平衡的结果(参见Sfikakis 等人(2005) Curr. Opin. Rheumatol. 17:550-7)。SLE被视为具有文献记载的血清IL-4、IL-6、IL-10升高的Th-2驱动的疾病。也预期了结合一种或多种靶的DVDIgs，所述一种或多种靶选自IL-4、IL-6、IL-10、IFN-α和TNF-α。本文讨论的靶组合将增强关于SLE的治疗效力，所述治疗效力可以在许多狼疮临床前模型中进行测试(参见Peng(2004) Methods Mol. Med. 102:227-72)。基于亲本抗体对人和小鼠直向同源物的交叉反应性(例如对人和小鼠CD20、人和小鼠干扰素α等的反应性)，可以用“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig分子进行在小鼠狼疮模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上，将基于两种(或更多)小鼠靶特异性抗体的DVD-Ig与用于人DVD-Ig构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和效价、相似的半衰期等)。
5. 多发性硬化
多发性硬化(MS)是具有主要未知病因的复杂人自身免疫型疾病。遍及神经系统的髓鞘碱性蛋白(MBP)的免疫学破坏是多发性硬化的主要病理学。MS是具有复杂病理学的疾病，所述病理学涉及通过CD4+和CD8+ T细胞的浸润和中枢神经系统内的应答。细胞因子、反应性氮种类和共刺激分子在CNS中的表达都已在MS中得到描述。主要考虑是促成自身免疫发展的免疫学机制。具体地，抗原表达、细胞因子和白细胞相互作用、以及帮助平衡/调节其他T细胞诸如Th1和Th2细胞的调节性T细胞，是关于治疗靶鉴定的重要范围。
IL-12是由APC产生且促进Th1效应细胞分化的促炎细胞因子。IL-12在患有MS的患者的发展病变中以及受EAE影响的动物中产生。先前显示干扰IL-12途径有效阻止啮齿类动物中的EAE，且使用抗IL-12 mAb体内中和IL-12p40在普通狨猴中在髓鞘诱导的EAE模型中具有有利作用。
TWEAK是TNF家族成员，在中枢神经系统(CNS)中组成型表达，取决于细胞类型具有促炎、增殖或细胞凋亡作用。它的受体Fn14由内皮细胞、反应性星形胶质细胞和神经元在CNS中表达。TWEAK和Fn14 mRNA表达在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)期间在脊髓中增加。当小鼠在引发期(priming phase)后进行处理时，在C57BL/6小鼠中髓鞘寡树突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的EAE中的抗TWEAK抗体处理导致疾病严重性和白细胞浸润减少。
本发明的一个方面涉及结合一种或多种(例如两种)靶的DVD-Ig分子，所述靶选自IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、FGF、C5、CD52、和CCR2。一个实施方案包括双重特异性抗-IL-12/TWEAK DVD Ig作为对MS治疗有利的治疗剂。
用于评估DVD分子治疗MS有用性的几种动物模型是本领域已知的(参见Steinman等人(2005) Trends Immunol. 26(11):565-71；Lublin等人(1985) Springer SeminImmunopathol. 8(3):197-208；Genain等人(1997) J. Mol. Med. 75(3):187-97；Tuohy等人(1999) J. Exp. Med. 189(7):1033-42；Owens等人(1995) Neurol. Clin. 13(1):51-73；和Hart等人(2005) J. Immunol. 175(7):4761-8。基于亲本抗体对人和动物物种直向同源物的交叉反应性(例如对人和小鼠IL-12、人和小鼠TWEAK等的反应性)，可以用“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig分子进行在小鼠EAE模型中的验证研究；简而言之，可以在可能的程度上，将基于两种(或更多)小鼠靶特异性抗体的DVD-Ig与用于人DVD-Ig构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(相似的亲和力、相似的中和效价、相似的半衰期等)。将同样的概念应用于其他非啮齿类动物物种中的动物模型，其中可以选择“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig用于预期的药理学和可能的安全性研究。除了这些靶对的常规安全性评估外，关于免疫抑制程度的特异性测试在最佳靶对的选择中可以是有正当理由的和有帮助的(参见Luster 等人(1994) Toxicol. 92(1-3):229-43；Descotes等人(1992) Devel. Biol.Standardiz. 77:99-102；Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6)。
6. 脓毒病
脓毒病的病理生理学由革兰氏阴性生物(脂多糖[LPS]、脂质A、内毒素)和革兰氏阳性生物(脂磷壁酸、肽聚糖)的外膜组分起始。这些外膜组分能够与单核细胞表面上的CD14受体结合。由于近期描述的toll样受体，信号随后传递给细胞，从而导致促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)的最终产生。压倒性的炎症和免疫应答是脓毒性休克的基本特征，且在由脓毒病诱导的组织损伤、多器官衰竭和死亡发病机理中起重要作用。细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子(TNF)和白介素(IL-1)，已显示是脓毒性休克的关键介质。这些细胞因子对组织具有直接的毒性作用；它们还激活磷脂酶A2。这些及其他作用导致血小板活化因子浓度增加，促进氧化氮合酶活性，促进通过嗜中性粒细胞的组织浸润，和促进嗜中性粒细胞的活性。
脓毒病和脓毒性休克治疗仍是临床难题，且使用针对炎症应答的生物学反应调节剂(即抗TNF和抗MIF)的近期预期试验仅显示适度的临床利益。近期，兴趣已转向针对逆转伴随的免疫抑制时间段的治疗。实验动物和危急患病患者中的研究已证实淋巴器官和一些实质组织细胞凋亡增加促成这种免疫抑制、无反应性、和器官系统功能障碍。在脓毒病综合症期间，淋巴细胞的细胞凋亡可以由IL-2的不存在或由糖皮质激素、颗粒酶或所谓的‘死亡’细胞因子：肿瘤坏死因子α或Fas配体的释放来触发。细胞凋亡通过胞质和/或线粒体半胱天冬酶的自体活化而进展，所述自体活化可以受Bcl-2家族的促和抗细胞凋亡成员的影响。在实验动物中，使用细胞凋亡抑制剂的处理不仅可以阻止淋巴样细胞的细胞凋亡；它还改善结果。尽管在很大部分上由于与其施用和组织靶向相关的技术困难，使用抗细胞凋亡剂的临床试验仍然遥远，但淋巴细胞的细胞凋亡抑制代表关于脓毒性患者的吸引人的治疗靶。同样地，靶向炎症介质和细胞凋亡介质两者的双重特异性试剂可能具有附加利益。本发明的一个方面涉及结合参与脓毒病的一种或多种靶的DVD-Igs，在一个实施方案中为两种靶，所述靶选自TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、LPS、Toll-样受体、TLR-4、组织因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL-10、IL-1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、CCR3、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期因子、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1、和TREM1。此种DVD Igs对于脓毒病的效力可以在本领域已知的临床前动物模型中进行评估(参见Buras等人(2005) Nat. Rev. Drug Discov. 4(10):854-65和Calandra等人(2000) Nat. Med. 6(2):164-70)。
7. 神经病症
7.1. 神经变性疾病
神经变性疾病是慢性的，在这种情况中其通常依赖年龄，或急性的(例如中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤等)。其特征在于神经元功能的渐进性丧失(神经元细胞死亡、脱髓鞘)，活动性丧失和记忆丧失。成为慢性神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)基础的机制的新出现的知识显示了复杂的病因学，且多种因素已被识别为促进其发展和进展，例如年龄，血糖(glycemic)状态，淀粉状蛋白产生和多聚化，与其受体RAGE(AGE的受体)结合的高级糖化终极产物(AGE)积聚，脑氧化应激增加，脑血流量减少，神经炎症包括炎症细胞因子和趋化因子释放，神经元功能障碍和小胶质细胞活化。因此这些慢性神经变性疾病代表多种细胞类型和介质之间的复杂相互作用。关于此种疾病的治疗策略是有限的，且主要构成用非特异性抗炎剂(例如皮质类固醇、COX抑制剂)阻断炎症性过程或试剂以阻止神经元丧失和/或突触功能。这些治疗不能阻止疾病进展。近期研究提示更加靶向的治疗，诸如针对可溶性A-b肽(包括A-b寡聚形式)的抗体，不仅可以帮助阻止疾病进展而且还帮助维持记忆。这些初步观察提示靶向超过一种疾病介质(例如A-b和促炎细胞因子诸如TNF)的特异性疗法，可以提供比使用靶向单一疾病机制(例如单独的可溶性A-b)观察到的甚至更好的对慢性神经变性疾病的治疗效力。一些用于评估DVD-Ig分子治疗MS的有用性的动物模型是本领域已知的(参见Steinman等人(2005) Trends Immunol. 26(11):565-71；Lublin等人(1985) Springer Semin. Immunopathol. 8(3):197-208；Genain等人(1997) J. Mol.Med. 75(3):187-97；Tuohy等人(1999) J. Exp. Med. 189(7):1033-42；Owens等人(1995)Neurol. Clin. 13(1):51-73；和Hart等人(2005) J. Immunol. 175(7):4761-8。基于对于人和动物物种直向同源物的亲本抗体的交叉反应性(例如，对人和小鼠IL-12、人和小鼠TWEAK等的反应性)，可以用“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig分子进行小鼠EAE模型中的验证研究。简而言之，可以将基于两种(或更多种)小鼠靶特异性抗体的DVD-Ig在可能的程度上与用于人DVD-Ig构建的亲本人或人源化抗体的特征进行匹配(例如相似的亲和力、相似的中和效价、相似的半衰期等)。相同的概念适用于其他非啮齿动物物种中的动物模型，其中“匹配的替代抗体”衍生的DVD-Ig将选择用于预期的药理学和可能的安全性研究。除了这些靶对的常规安全性评估，对免疫抑制程度的特异性测试在选择最佳靶对中可能是必要的和有帮助的(参见Luster等人(1994) Toxicol. 92(1-3):229-43；Descotes等人(1992)Devel. Biol. Stand. 77:99-102；Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6)。
本发明的DVD-Ig分子可以结合参与慢性神经变性疾病诸如阿尔茨海默氏病的一种或多种靶。此种靶包括但不限于，牵涉于AD发病机理中的任何介质，可溶性或细胞表面的，例如AGE(S100 A，两性蛋白(amphoterin))、促炎细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MCP 1)、抑制神经再生的分子(例如Nogo，RGM A)、增强神经突生长的分子(神经营养蛋白)以及能够介导在血脑屏障处转运的分子(例如转铁蛋白受体、胰岛素受体或RAGE)。DVD-Ig分子的效力可以在临床前动物模型中进行验证，诸如过表达淀粉状前体蛋白或RAGE且发展阿尔茨海默氏病样症状的转基因小鼠。此外，可以构建DVD-Ig分子并在动物模型中测试效力，并且可以选择最佳的治疗性DVD-Ig用于在人患者中测试。DVD-Ig分子也可以用于治疗其他神经变性疾病诸如帕金森氏病。α-突触核蛋白(Synuclein)参与帕金森氏病理学。能够靶向α-突触核蛋白和炎症介质诸如TNF、IL-1、MCP-1的DVD-Ig可以证明是在本发明中对于帕金森氏病的有效治疗，也是预期的。
7.2 神经元再生和脊髓损伤
尽管病理学机制的知识增加，但脊髓损伤(SCI)仍是破坏性状况且代表特征在于高医学需要的医学适应症。大多数脊髓损伤是挫伤或压迫损伤，并且原发性损伤通常随后为继发性损伤机制(炎症介质例如细胞因子和趋化因子)，所述继发性损伤机制使最初损伤恶化且导致损害区域显著放大，有时超过10倍。SCI中的这些原发性和继发性机制非常类似于由其他方式例如中风引起的脑损伤中的那些。没有令人满意的治疗，且高剂量大体积注射甲基强的松龙(MP)是损伤后8小时窄时间窗内唯一使用的治疗。然而，这种治疗只预期阻止继发性损伤而不产生任何显著的功能恢复。它因为缺乏明确效力和严重的不利作用而受到猛烈批评，所述不利作用如具有后续感染的免疫抑制和严重组织病理学肌肉改变。没有批准刺激内源性再生潜能的其他药物、生物制剂或小分子，但近年来有希望的治疗原理和药物候选物已在SCI动物模型中显示效力。人SCI中的功能恢复缺乏在很大程度上由在损害部位处、在瘢痕组织中、在髓鞘质中以及损伤相关细胞上抑制神经突生长的因子引起。此种因子是髓鞘相关蛋白NogoA、OMgp和MAG、RGM A、瘢痕相关CSPG(硫酸软骨素蛋白聚糖)和在反应性星形胶质细胞上的抑制因子(有时为脑信号蛋白和肝配蛋白)。然而，在损害部位处，不仅发现了生长抑制分子，而且还发现了神经突生长刺激因子，如神经营养蛋白、层粘连蛋白、L1等。神经突生长抑制和生长促进分子的这种总效果可能解释了，阻断单一因子如NogoA或RGM A在啮齿类动物SCI模型中导致显著的功能恢复，因为抑制影响的减少可以使平衡从生长抑制转移到生长促进。然而，对于阻断单一神经突长出抑制分子观察到的恢复并不完全。为了达到更快速和更显著的恢复，可能需要阻断2种神经突长出抑制分子例如Nogo和RGM A，或阻断神经突长出抑制分子并增强神经突长出增强分子例如Nogo和神经营养蛋白的功能，或阻断神经突长出抑制分子例如Nogo和促炎分子例如TNF(参见McGee等人(2003) Trends Neurosci. 26:193；Domeniconi等人(2005) J. Neurol. Sci. 233:43；Makwana1等人(2005) FEBS J. 272:2628；Dickson (2002) Science 298:1959；Teng，等人(2005) J. Neurosci. Res. 79:273；Karnezis等人(2004) Nature Neurosci. 7:736；Xu等人(2004) J. Neurochem. 91:1018)。
在一个方面，提供了结合下述靶对的DVD-Igs，所述靶对诸如NgR和RGM A；NogoA和RGM A；MAG和RGM A；OMGp和RGM A；RGM A和RGM B；CSPGs和RGM A；聚集蛋白聚糖、中期因子、神经蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)、Te38和TNF-α；与促进树突和轴突萌发的抗体组合的Aß球聚体(globulomer)-特异性抗体。树突病理是AD的非常早期的迹象，已知，NOGO A限制树突生长。人们可以将此种ab类型与任何SCI候选(髓磷脂-蛋白)Ab组合。其他DVD-Ig靶可以包括NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66 (Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG或Omgp的任何组合。此外，靶还可以包括牵涉于神经突抑制的任何介质，可溶性或细胞表面的，例如Nogo、Ompg、MAG、RGM A、脑信号蛋白、肝配蛋白、可溶性A-b、促炎细胞因子(例如IL-1)、趋化因子(例如MIP 1a)、抑制神经再生的分子。抗-nogo/抗-RGMA或类似DVD-Ig分子的效力可以在脊髓损伤的临床前动物模型中进行验证。此外，可以构建这些DVD-Ig分子并在动物模型中测试效力，并且可以选择最佳的治疗性DVD-Ig用于在人患者中测试。此外，可以构建靶向单一受体上的2个不同配体结合位点的DVD-Ig分子，所述受体例如结合3种配体Nogo、Ompg和MAG的Nogo受体，以及结合A-b和S100 A的RAGE。此外，神经突长出抑制剂例如nogo和nogo受体，也在免疫学疾病如多发性硬化中阻止神经再生方面起作用。nogo-nogo受体相互作用的抑制已显示增强多发性硬化动物模型中的恢复。因此，可以阻断一种免疫介质例如细胞因子如IL-12和神经突长出抑制剂分子例如nogo或RGM功能的DVD-Ig分子，可以提供比阻断单独的免疫或神经突长出抑制剂分子更快和更大的效力。
一般而言，抗体无法以有效和相关方式穿过血脑屏障(BBB)。然而，在某些神经疾病(例如中风、外伤性脑损伤、多发性硬化等)中，BBB可能受损，并允许DVD-Igs和抗体向脑内的渗透增加。在其他不发生BBB渗漏的神经状况中，人们可以采用内源性转运系统的靶向，包括在BBB血管内皮上的载体介导的转运蛋白诸如葡萄糖和氨基酸载体、以及受体介导的胞转作用介导细胞结构/受体，从而使得能够进行DVD-Ig的跨BBB转运。在BBB处使得能够进行此种转运的结构包括但不限于胰岛素受体、转铁蛋白受体、LRP和RAGE。另外，策略也使得能够将DVD-Igs用作将可能的药物转运到CNS中的穿梭物(shuttles)，包括低分子量药物、纳米颗粒(nanoparticles)和核酸(Coloma等人 (2000) Pharm Res. 17(3):266-74；Boado等人(2007) Bioconjug. Chem. 18(2):447-55)。
8. 肿瘤学病症
单克隆抗体治疗已显现为关于癌症的重要治疗方式(von Mehren等人(2003)Annu. Rev. Med. 54:343-69)。抗体可以通过下述发挥抗肿瘤作用：诱导细胞凋亡、改变方向的细胞毒性、干扰配体-受体相互作用、或阻止对瘤表型关键的蛋白表达。此外，抗体可以靶向肿瘤微环境组分，干扰重要结构诸如肿瘤相关脉管系统的形成。抗体还可以靶向其配体是生长因子的受体，诸如表皮生长因子受体。抗体因此抑制刺激细胞生长的天然配体与靶向的肿瘤细胞结合。可替代地，抗体可以诱导抗独特型网络、补体介导的细胞毒性、或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。与单特异性治疗相比较，靶向2种分开的肿瘤介质的双重特异性抗体的使用将可能产生额外利益。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合VEGF和磷脂酰丝氨酸；VEGF和ErbB3；VEGF和PLGF；VEGF和ROBO4；VEGF和BSG2；VEGF和CDCP1；VEGF和ANPEP；VEGF和c-MET；HER-2和ERB3；HER-2和BSG2；HER-2和CDCP1；HER-2和ANPEP；EGFR和CD64；EGFR和BSG2；EGFR和CDCP1；EGFR和ANPEP；IGF1R和PDGFR；IGF1R和VEGF；IGF1R和CD20；CD20和CD74；CD20和CD30；CD20和DR4；CD20和VEGFR2；CD20和CD52；CD20和CD4；HGF和c-MET；HGF和NRP1；HGF和磷脂酰丝氨酸；ErbB3和IGF1R；ErbB3和IGF1,2；c-Met和Her-2；c-Met和NRP1；c-Met和IGF1R；IGF1,2和PDGFR；IGF1,2和CD20；IGF1,2和IGF1R；IGF2和EGFR；IGF2和HER2；IGF2和CD20；IGF2和VEGF；IGF2和IGF1R；IGF1和IGF2；PDGFRa和VEGFR2；PDGFRa和PLGF；PDGFRa和VEGF；PDGFRa和c-Met；PDGFRa和EGFR；PDGFRb和VEGFR2；PDGFRb和c-Met；PDGFRb和EGFR；RON和c-Met；RON和MTSP1；RON和MSP；RON和CDCP1；VGFR1和PLGF；VGFR1和RON；VGFR1和EGFR；VEGFR2和PLGF；VEGFR2和NRP1；VEGFR2和RON；VEGFR2和DLL4；VEGFR2和EGFR；VEGFR2和ROBO4；VEGFR2和CD55；LPA和S1P；EPHB2和RON；CTLA4和VEGF；CD3和EPCAM；CD40和IL6；CD40和IGF；CD40和CD56；CD40和CD70；CD40和VEGFR1；CD40和DR5；CD40和DR4；CD40和APRIL；CD40和BCMA；CD40和RANKL；CD28和MAPG；CD80和CD40；CD80和CD30；CD80和CD33；CD80和CD74；CD80和CD2；CD80和CD3；CD80和CD19；CD80和CD4；CD80和CD52；CD80和VEGF；CD80和DR5；CD80和VEGFR2；CD22和CD20；CD22和CD80；CD22和CD40；CD22和CD23；CD22和CD33；CD22和CD74；CD22和CD19；CD22和DR5；CD22和DR4；CD22和VEGF；CD22和CD52；CD30和CD20；CD30和CD22；CD30和CD23；CD30和CD40；CD30和VEGF；CD30和CD74；CD30和CD19；CD30和DR5；CD30和DR4；CD30和VEGFR2；CD30和CD52；CD30和CD4；CD138和RANKL；CD33和FTL3；CD33和VEGF；CD33和VEGFR2；CD33和CD44；CD33和DR4；CD33和DR5；DR4和CD137；DR4和IGF1,2；DR4和IGF1R；DR4和DR5；DR5和CD40；DR5和CD137；DR5和CD20；DR5和EGFR；DR5和IGF1,2；DR5和IGFR，DR5和HER-2，以及EGFR和DLL4。其他靶组合包括EGF/erb-2/erb-3家族的一个或多个成员。参与肿瘤学疾病的DVD Igs可以结合的其他靶(一种或多种)包括但不限于选自：CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1R、IL2、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1 (E-钙粘蛋白)、CDKN1B (p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1 (b-连环蛋白)、CTSB (组织蛋白酶B)、ERBB2 (Her-2)、ESR1、ESR2、F3 (TF)、FOSL1 (FRA-1)、GATA3、GSN (凝溶胶蛋白)、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST((糖蛋白130)、ITGA6 (a6整联蛋白)、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7 (c-Jun)、MKI67 (Ki-67)、NGFB (NGF)、NGFR、NME1 (NM23A)、PGR、PLAU (uPA)、PTEN、SERPINB5 (乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1 (PAI-1)、TGFA、THBS1 (血小板反应蛋白-1)、TIE (Tie-1)、TNFRSF6 (Fas)、TNFSF6 (FasL)、TOP2A (拓扑异构酶Iia)、TP53、AZGP1 (锌-a-糖蛋白)、BPAG1 (网蛋白)、CDKN1A (p21Wap1/Cip1)、CLDN7 (密蛋白-7)、CLU (簇蛋白)、ERBB2 (Her-2)、FGF1、FLRT1(纤连蛋白)、GABRP (GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6 (a6整联蛋白)、ITGB4 (b 4整联蛋白)、KLF5 (GC Box BP)、KRT19 (角蛋白19)、KRTHB6 (毛发特异性II型角蛋白)、MACMARCKS、MT3(金属硫蛋白-III)、MUC1 (粘蛋白)、PTGS2 (COX-2)、RAC2 (p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1 (乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2 (乳腺珠蛋白1)、SPRR1B (Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4、和TNFAIP2 (B94)、RON、c-Met、CD64、DLL4、PLGF、CTLA4、磷脂酰丝氨酸、ROBO4、CD80、CD22、CD40、CD23、CD28、CD80、CD55、CD38、CD70、CD74、CD30、CD138、CD56、CD33、CD2、CD137、DR4、DR5、RANKL、VEGFR2、PDGFR、VEGFR1、MTSP1、MSP、EPHB2、EPHA1、EPHA2、EpCAM、PGE2、NKG2D、LPA、SIP、APRIL、BCMA、MAPG、FLT3、PDGFR α、PDGFR β、ROR1、PSMA、PSCA、SCD1、和CD59。
IV. 药物组合物
本发明还提供了包含本发明的结合蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。包含本发明的结合蛋白的药物组合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面，病症的诊断、检测或监测，病症或其一种或多种症状的预防(例如，抑制或延缓疾病、病症或其他状况的发病)、治疗、管理或改善和/或研究。在特定的实施方案中，组合物包含一种或多种本发明的结合蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种本发明的结合蛋白，以及除本发明的结合蛋白外用于治疗病症的一种或多种预防或治疗剂。在一个实施方案中，预防或治疗剂在病症或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善中有用，或已在其中使用或目前正在其中使用。根据这些实施方案，组合物可以进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的结合蛋白可以并入适合于给受试者施用的药物组合物内。一般地，药物组合物包含本发明的结合蛋白和药学可接受的载体。术语“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的实例包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在一些实施方案中，在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，所述辅助物质增强抗体或抗体部分的保存期限或效力。
各种递送系统是已知的，且可以用于施用一种或多种本发明的抗体或一种或多种本发明的抗体与预防剂或治疗剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、受体介导的胞吞(参见例如，Wu和Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、构建作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)，硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)。此外，可以使用肺施用，例如利用吸入器或喷雾器，和含气溶胶化剂(aerosolizing agent)的制剂。参见例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白、组合疗法、或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes,Inc., Cambridge, Mass.)来施用。在特定的实施方案中，本发明的预防或治疗剂通过肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。预防或治疗剂可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或大剂量注射，通过通过上皮或粘膜皮肤保护层(lining)(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
在一个实施方案中，可以将抗体偶联的碳纳米管(carbon nanotubes)(CNT)与肿瘤细胞在体外的特异性结合、随后为用近红外(NIR)光对其高特异性切除用于靶向肿瘤细胞。例如，可以将生物素化极性脂质用于制备稳定的、生物相容的、非细胞毒性的CNT分散体，然后将所述CNT分散体附着在一个或两个不同的中性抗生物素蛋白衍生的DVD-Igs，所述DVD-Igs针对一种或多种肿瘤抗原(例如CD22)(Chakravarty等人 (2008) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 105:8697-8702。
在特定的实施方案中，可能需要将本发明的预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，诸如硅橡胶(sialastic)膜、聚合物、纤维基质(例如，Tissuel®)、或胶原基质。在一个实施方案中，有效量的一种或多种本发明的抗体拮抗剂局部施用于受试者的受影响区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，有效量的一种或多种本发明的抗体，与有效量的除本发明的结合蛋白外的一种或多种治疗剂(例如，一种或多种预防或治疗剂)组合，局部施用于受试者的受影响区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其一种或多种症状。
在另一个实施方案中，预防或治疗剂可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵以实现控释或持续释放(参见Langer, 同上；Sefton (1987) CRCCrit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald等人 (1980) Surgery 88:507；Saudek等人(1989) N. Engl. J. Med. 321:574)。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发明的治疗剂的控释或持续释放(参见例如，Medical Applications of ControlledRelease, Langer和Wise (编), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；ControlledDrug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen和Ball (编),Wiley, New York (1984)；Ranger和Peppas (1983) J., Macromol. Sci. Rev.Macromol. Chem. 23:61；Levy等人(1985) Science 228:190；During等人(1989) Ann.Neurol. 25:351；Howard等人(1989) J. Neurosurg. 71:105)；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；5,128,326；PCT公开号 WO 99/15154和WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、和聚原酸酯。在一个实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可滤出杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在又另一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接近预防或治疗靶放置，从而只需要全身剂量的部分(参见例如，Goodson (1984) inMedical Applications of Controlled Release, 同上, 2:115-138)。
控释系统在Langer (1990) Science 249:1527-1533)的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于产生包含本发明的一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见例如，美国专利号4,526,938, PCT公开号WO 91/05548和WO 96/20698, Ning等人(1996)Radiother. Oncol. 39:179-189, Song等人(1995) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50:372-397；Cleek等人(1997) Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854；和Lam 等人(1997) Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760。
在特定的实施方案中，当本发明的组合物是编码预防或治疗剂的核酸时，核酸可以体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且施用它，从而使得其成为细胞内的，例如通过利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知进入核的同源异型框样肽连接施用它(参见例如，Joliot等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)。可替代地，核酸可以细胞内引入且通过同源重组并入宿主细胞DNA内用于表达。
本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于，肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、跨粘膜、和直肠施用。在特定的实施方案中，组合物根据常规程序配制为药物组合物，所述药物组合物适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利诺卡因(lignocamne)，以减轻注射部位处的疼痛。
如果本发明的组合物将局部施用，那么组合物可以配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂样物(shampoo)、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences and Introductionto Pharmaceutical Dosage Forms, 第19版, Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)。在一个实施方案中，对于不可喷雾的局部剂型，使用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，且具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，必要时其进行除菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合用于影响各种性质，诸如，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，在一个实施方案中，与固体或液体惰性载体组合，包装在与加压挥发物(例如，气体推进剂，诸如氟利昂)的混合物中或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂(moisturizer)或湿润剂也可以加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的实例是本领域众所周知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，根据本发明使用的预防或治疗剂可以以从加压包装或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式方便地递送，使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可以配制包含化合物和合适粉末基诸如乳糖或淀粉的粉末混合物的胶囊和药液筒(cartridges)(由例如明胶组成)，用于在吸入器或吹入器中使用。
如果本发明的方法包括经口施用，那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁囊剂、软胶囊(gelcaps)、溶液、悬浮液等经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂诸如粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的媒介物构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。
本发明的方法可以包括用气溶胶化剂(aerosolizing agent)配制的组合物的肺施用，例如利用吸入器或喷雾器。参见例如美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；以及PCT公开号WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903。在特定的实施方案中，本发明的结合蛋白、组合疗法、和/或本发明的组合物使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)来施用。
本发明的方法可以包括配制用于通过注射(例如通过大剂量注射或连续输注)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型(例如，在安瓿或多剂量容器中)呈递。组合物可以采取此种形式，如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂，且可以包含配制试剂诸如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，活性成分可以为粉末形式用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无致热原水)构建。
本发明的方法可以另外包括配制为积存(depot)制剂的组合物的施用。此种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，诸如来源于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在指示活性剂的量的密封容器中的干冷冻干燥粉末或无水浓缩物，所述密封容器诸如安瓿或囊剂。当施用方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是通过注射时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混合。
特别地，本发明还提供了一种或多种预防或治疗剂或本发明的药物组合物，其包装在指示试剂的量的密封容器中，所述密封容器诸如安瓿或囊剂。在一个实施方案中，一种或多种预防或治疗剂或本发明的药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末或无水浓缩物提供，且可以重构(例如，用水或盐水)至合适浓度以用于给受试者施用。在一个实施方案中，一种或多种预防或治疗剂或本发明的药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末提供，其单位剂量为至少5 mg、至少10 mg、至少15 mg、至少25 mg、至少35mg、至少45 mg、至少50 mg、至少75 mg、或至少100 mg。冷冻干燥的预防或治疗剂或本发明的药物组合物应在其原容器中贮存于2℃-8℃，并且预防或治疗剂或本发明的药物组合物应在重构后1周内施用，例如重构后5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内施用。在可替代的实施方案中，一种或多种预防或治疗剂或本发明的药物组合物，以液体形式在指示试剂的量和浓度的密封容器中提供。在一个实施方案中，液体形式的施用的组合物在密封容器中提供，其量为至少0.25 mg/ml，至少0.5mg/ml、至少1 mg/ml、至少2.5 mg/ml、至少5 mg/ml、至少8 mg/ml、至少10 mg/ml、至少15mg/kg、至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml或至少100 mg/ml。液体形式应在其原容器中贮存于2℃-8℃。
本发明的结合蛋白可以并入适用于肠胃外施用的药物组合物内。在一个实施方案中，抗体或抗体部分将制备为包含0.1-250 mg/ml结合蛋白的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冷冻干燥剂型组成。缓冲剂可以是L-组氨酸(1-50 mM)，最佳5-10 mM，pH 5.0-7.0(最佳pH 6.0)。其他合适的缓冲剂包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠在浓度0-300 mM(对于液体剂型最佳150 mM)可以用于改变溶液的毒性。对于冷冻干燥剂型可以包括冷冻保护剂，主要为0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可以包括膨胀剂，主要为1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。稳定剂可以在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为1-50 mM L-甲硫氨酸(最佳5-10 mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸和精氨酸，其中之一可以以0-0.05％的浓度包括，和聚山梨醇酯-80(最佳以0.005-0.01％的浓度包括)。制备为可注射溶液用于肠胃外施用、包含本发明的结合蛋白的药物组合物可以进一步包含用作佐剂的试剂，诸如用于增加治疗蛋白(例如，抗体)吸收、或分散的那些。特别有用的佐剂是透明质酸酶，诸如Hylenex®(重组人透明质酸酶)。在可注射溶液中添加透明质酸酶改善肠胃外施用，特别是皮下施用后的人生物利用度。它还允许具有较少疼痛和不适的更大注射部位体积(即大于1 ml)，和最低的注射部位反应发生率。(参见PCT公开号WO2004078140和美国专利申请号 2006104968)。
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。选择的形式取决于预期施用方式和治疗应用。一般的组合物为可注射或可输注溶液形式，诸如类似于由其他抗体被动免疫人使用的那些的组合物。所选施用方式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在另一个实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。
治疗组合物一般在制备和贮存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述制备：将需要量的活性化合物(即，抗体或抗体部分)与本文列举的一种成分或成分组合一起并入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤除菌。一般地，分散体通过将活性化合物并入无菌媒介物内来制备，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自本文列举那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冷冻干燥粉末的情况下，制备方法是真空干燥和喷雾干燥，所述方法由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末。溶液的正确流动性可以通过下述来维持，例如通过利用包衣诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需颗粒大小和通过利用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来引起，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。
本发明的结合蛋白可以通过本领域已知的多种方法来施用，尽管对于许多治疗应用，在一个实施方案中，施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。在某些实施方案中，活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，诸如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems, J.R. Robinson, 编, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
在某些实施方案中，本发明的结合蛋白可以例如，与惰性稀释剂或可吸收食用载体一起经口施用。化合物(和若需要，其他成分)也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接并入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能有必要用材料包被化合物、或将化合物与材料共施用，以防止其失活。
补充性活性化合物也可以并入组合物内。在某些实施方案中，本发明的结合蛋白与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述治疗剂可用于与本发明的结合蛋白一起治疗病症。例如，本发明的结合蛋白可以与结合其他靶的一种或多种另外的抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共施用。此外，本发明的一种或多种抗体可以与2种或更多前述治疗剂组合使用。此种组合疗法可以有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在某些实施方案中，结合蛋白与本领域已知的半衰期延长媒介物连接。此种媒介物包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此种媒介物在例如美国专利号6,660,843和PCT公开号 WO 99/25044中描述。
在特定的实施方案中，通过基因疗法施用编码本发明的结合蛋白或另一种本发明的预防或治疗剂的核酸序列，以治疗、预防、管理、或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者施用表达的或可表达核酸来进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的抗体或介导预防或治疗作用的本发明的预防或治疗剂。
根据本发明，可以使用任何在本领域中可获得的用于基因治疗的方法。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等人(1993) Clin. Pharm. 12:488-505；Wu和Wu(1991) Biother. 3:87-95；Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan (1993) Science 260:926- 932；以及Morgan和Anderson (1993) Ann.Rev. Biochem. 62:191-217；May (1993) TIBTECH 11(5):155-215。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(编), Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley &Sons, NY (1993)；和Kriegler, Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)。各种基因治疗方法的详细描述在US20090297514中公开。
本发明的结合蛋白可用于治疗其中由结合蛋白识别的靶是有害的各种疾病。此种疾病包括但不限于，类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、全身性红斑狼疮、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、Kawasaki氏病、Grave氏病、肾病综合症、慢性疲乏综合症、韦格纳氏肉芽肿病、过敏性紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合症、脓毒病综合症、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合症、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗死、Addison氏病、散发性多腺性I型缺乏和多腺性II型缺乏、Schmidt氏综合症、成人(急性)呼吸窘迫综合症、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷综合症、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、卵巢早衰、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、全身性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、Sjögren氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、传染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素耐受性、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合症、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、Sjörgren氏综合症、Takayasu氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(Hashimoto氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(choleosatatis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应和哮喘、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、以及癌症诸如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗cd3治疗、抗磷脂综合症、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉夹层、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合症、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学疗法相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、Creutzfeldt-Jakob病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子疗法相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合症、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性嗜血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallerrorden-Spatz病、hashimoto氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(A)、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性Addison氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流行性感冒、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性/特发性、偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合症、心肌梗死、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性I肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发烧、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转操作、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合症/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合症(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、和皮肤变化综合症)、灌注后综合症、泵后综合症、MI心切开术后综合症、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象和疾病、Raynoud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合症、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合症、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合症、Wernicke-Korsakoff综合症、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥。(参见PCT公开号WO2002097048, WO9524918和WO00/56772A1)。
本发明的DVD-Igs也可以治疗一种或多种下列疾病：急性冠状动脉综合症、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合症、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合症(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性血小板减少症(AITP)、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合症、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合症(CIS)、结膜炎、儿童期发病性精神病症、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、糖尿病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、Guillain-Barré综合症(GBS)、枯草热、Hughes综合症、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、传染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、恶性肿瘤、显微镜下多脉管炎、Morbus Bechterev、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合症、心肌炎、神经根病症、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌病、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合症、多肌炎、风湿性多肌病(PMR)、泵后综合症、原发性帕金森综合症、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、硬皮病、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、硅树脂相关的结缔组织病、Sneddon-Wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合症(SJS)、全身性炎症应答综合症、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体、I型变态反应、II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合症(VKH综合症)、湿黄斑变性和伤口愈合。
本发明的结合蛋白可以用于治疗患有自身免疫性疾病的人，所述自身免疫性疾病特别是与炎症相关的那些，包括类风湿性关节炎、脊椎炎、变态反应、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎。在一个实施方案中，本发明的结合蛋白或其抗原结合部分用于治疗类风湿性关节炎、Crohn氏病、多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和牛皮癣。
在一个实施方案中，可以用本发明的组合物和方法治疗或诊断的疾病包括但不限于：原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜的肿瘤(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)，从造血恶性肿瘤诸如白血病产生的实体瘤，和淋巴瘤(何杰金与非何杰金淋巴瘤)。
在一个实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合部分在单独地或与放射治疗和/或其他化疗剂组合地使用时，用于治疗癌症或预防或抑制本文所述肿瘤的转移。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合预防或治疗剂和细胞蛋白，从而提供对特定靶器官、组织或细胞，或组织或细胞种类的局部药物递送。在一个实施方案中，DVD-Ig结合细胞表面抗原和预防或治疗剂。所述预防剂或治疗剂可用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如脂质体颗粒、微粒、微胶囊、能够表达抗体或抗体片段的重组细胞、干细胞、受体介导的胞吞(参见例如，Wu和Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、肽、核酸(例如反义DND或RNA或其他基因治疗)、肽核酸(PNA)、纳米颗粒、放疗剂、逆转录病毒或其他载体、抗细菌、抗病毒、抗寄生虫或抗真菌剂、抗肿瘤剂、化疗剂，诸如DNA烷化剂、顺铂、碳铂、抗微管蛋白剂、紫杉醇、多西他赛、紫素、阿霉素、吉西他滨、gemzar、蒽环霉素(anthracyclines)、亚得里亚霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、依立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))、激酶抑制剂和siRNAs、细胞因子抑制性抗炎药(CSAIDs)。
在一个实施方案中，本发明的DVD-Igs结合氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤 柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪 氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇、β2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNF-α或IL-1的信号传递的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1b转化酶抑制剂、TNFá转化酶(TACE)抑制剂、T细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或p75 TNF受体和衍生物p75TNFRIgG (EnbrelTM和p55TNFRIgG(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、生长因子、细胞因子、细胞毒性蛋白(例如TNF)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、抗体或其衍生物或缀合物(例如英夫单抗或利妥希玛)、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希玛、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗-IL-18、抗-IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、和美苏帕玛(Mesopram)。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合非类固醇抗炎药(NSAIDs)；细胞因子抑制性抗炎药(CSAIDs)；抗体或其衍生物或缀合物[例如CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗-TNFa 抗体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫单抗(嵌合抗- TNFa抗体；Centocor)；75 kdTNFR-IgG/依那西普(75 kD TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex)；55 kdTNF-IgG(55 kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB 210396(非耗尽性灵长类动物源化(primatized)抗-CD4抗体；IDEC/SmithKline；DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2 (IL-2融合蛋白；Seragen)；抗-Tac(人源化抗-IL-2Ra；Protein Design Labs/Roche)]；IL-4(抗炎细胞因子DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重组IL-10，抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4 激动剂(例如，激动性抗体)；IL-1RA(IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen)；阿那白滞素(Kineret®/Amgen)；TNF-bp/s-TNF(可溶性TNF结合蛋白)；R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂)；MK-966(COX-2抑制剂)；伊落前列素；氨甲蝶呤；沙立度胺和沙立度胺相关药物(例如，Celgen)；来氟洛米(抗炎和细胞因子抑制剂)；氨甲环酸(纤溶酶原活化抑制剂)；T-614(细胞因子抑制剂)；前列腺素E1)；替尼达普(非类固醇抗炎药)；萘普生(非类固醇抗炎药)；美洛昔康(非类固醇抗炎药)；布洛芬(非类固醇抗炎药)；吡罗昔康(非类固醇抗炎药)；扶他林(非类固醇抗炎药)；吲哚美辛(非类固醇抗炎药)；柳氮磺吡啶；硫唑嘌呤)；ICE抑制剂(白介素-1b换酶抑制剂)；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管发生抑制剂)；皮质类固醇抗炎药(例如，SB203580)；TNF-转变酶抑制剂；抗-IL-12或抗-IL-18抗体或其衍生物或缀合物；白介素-11；白介素-13；白介素-17 抑制剂；金；青霉胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羟氯喹；环孢菌素；环磷酰胺；全淋巴照射；抗-胸腺细胞球蛋白；或抗-CD4 抗体或其衍生物或缀合物；CD5-毒素；经口施用的肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRAs)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；强的松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素；抗-IL2R 抗体或其衍生物或缀合物；海生和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如，DeLuca等人(1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777)；金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；弃白通；阿托立平；霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；氨甲蝶呤；bcl-2抑制剂(参见Bruncko等人(2007) J. Med. Chem. 50(4):641-662)；抗病毒剂和免疫调节剂。
在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合以下用于治疗类风湿性关节炎的试剂之一，所述试剂例如，KDR的小分子抑制剂，Tie-2的小分子抑制剂；氨甲蝶呤；强的松；塞来昔布；叶酸；硫酸羟氯喹；洛芬昔布；依那西普或英夫单抗或其衍生物或缀合物；来氟洛米；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲基强的松龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基强的松龙；硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安缩松；萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛；叶酸盐；萘普酮；扶他林；吡罗昔康；依托度酸；双氯酚酸钠；奥沙普嗪；盐酸羟可酮；重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛；双氯酚酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素，人重组体；盐酸曲马多；双水杨酸酯；舒林酸；氰钴胺素/fa/吡哆醇；扑热息痛；阿仑膦酸钠；强的松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟可酮/扑热息痛；盐酸奥洛帕定；米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥希玛或其衍生物或缀合物；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-Ig或其衍生物或缀合物；IL-18 BP；IL-12/23；抗-IL 18或其衍生物或缀合物；抗-IL 15或其衍生物或缀合物；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；和美苏帕玛。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合炎性肠病的治疗剂，例如，布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β mAbs或其衍生物或缀合物；抗-IL-6 mAbs或其衍生物或缀合物；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂或其衍生物或缀合物，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。
在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合细胞表面分子，诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69，如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNFa或IL-1的信号传递的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1b转化酶抑制剂、TNFa转化酶抑制剂、T细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFb)以及bcl-2抑制剂。
在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合Crohn氏病的治疗剂，例如，TNF拮抗剂，例如抗-TNF抗体，阿达木单抗(Adalimumab)(PCT公开号 WO 97/29131；Humira)，CA2(Remicade)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG (Enbrel)和p55TNFRIgG(Lenercept)) 抑制剂或其衍生物或缀合物和PDE4抑制剂。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合皮质类固醇，例如布地奈德和地塞米松。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪，以及干扰促炎细胞因子诸如IL-1合成或作用的试剂，例如IL-1b转化酶抑制剂和IL-1ra。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合T细胞信号传递抑制剂，例如，酪氨酸激酶抑制剂 6-巯基嘌呤。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合IL-11。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合美沙拉秦、强的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英夫单抗或其衍生物或缀合物、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、氨甲蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异噁唑/甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑(colesevelam hcl)、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗或其衍生物或缀合物，以及干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ。
在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合多发性硬化的治疗剂，例如，皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-b1a(AVONEX；Biogen)；干扰素-b1b(BETASERON；Chiron/Berlex)；干扰素a-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)，干扰素-a(Alfa Wassermann/J&J)，干扰素b1A-IF(Serono/Inhale Therapeutics)，聚乙二醇化干扰素(Peginterferon)a2b(Enzon/Schering-Plough)，共聚物1(Cop-1；COPAXONE；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；针对其他人细胞因子或生长因子及其受体，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF的抗体或拮抗剂或其衍生物或缀合物。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合细胞表面分子或其配体，所述细胞表面分子诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNFα或IL-1的信号传递的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转化酶抑制剂、TACE抑制剂、T细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)和bcl-2抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合多发性硬化的治疗剂，例如，干扰素-b，例如IFNb1a和IFNb1b；考帕松，皮质类固醇，胱天蛋白酶抑制剂，例如胱天蛋白酶-1抑制剂，IL-1 抑制剂，TNF抑制剂，以及针对CD40和CD80的抗体及其衍生物或缀合物。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合以下试剂或其衍生物或缀合物：阿来组单抗、屈大麻酚、尤迈(Unimed)、达克珠单抗(daclizumab)、米托蒽醌、盐酸扎利罗登(xaliproden hydrochloride)、4-氨基吡啶、乙酸格拉太咪尔、那他珠单抗、辛纳必醇(sinnabidol)、a-免疫因子(a-immunokine) NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、卡拉古林(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂质体包封的米托蒽醌)、THC.CBD(大麻素激动剂)、MBP-8298、美苏帕玛(PDE4抑制剂)、MNA-715、抗-IL-6受体抗体、神经素(neurovax)、哌非尼酮allotrap 1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他仑帕奈(talampanel)、特立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4 拮抗剂(例如，TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干扰素γ拮抗剂、IL-4激动剂。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合心绞痛的治疗剂，例如硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、琥珀酸美托洛尔、阿替洛尔、酒石酸美托洛尔、阿罗地平磺酸盐、盐酸地尔硫、硝酸异山梨酯、重硫酸氯吡格雷、硝苯地平、阿托伐他汀钙、氯化钾、呋塞米、斯伐他汀、盐酸维拉帕米、地高辛、盐酸普萘洛尔、卡维地洛、赖诺普利、螺内酯、氢氯噻嗪、马来酸依那普利、纳多洛尔、雷米普利、依诺肝素钠、肝素钠、缬沙坦、盐酸索他洛尔、非诺贝特、依泽替米贝(ezetimibe)、布美他尼、氯沙坦钾、赖诺普利/氢氯噻嗪、非洛地平、卡托普利、富马酸比索洛尔。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合强直性脊柱炎的治疗剂，例如布洛芬、扶他林和米索前列醇、萘普生、美洛昔康、吲哚美辛、扶他林、塞来昔布、洛芬昔布、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、米诺环素、强的松、依那西普、英夫单抗及其衍生物或缀合物。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合哮喘的治疗剂，例如沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松、孟鲁司特钠、丙酸氟替卡松、布地奈德、强的松、沙美特罗羟萘甲酸盐(sameterol xinafoate)、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、强的松龙磷酸钠、曲安缩松、倍氯美松双丙酸酯、异丙托溴铵、阿奇霉素、醋酸吡布特罗、强的松龙、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、克拉霉素、扎鲁司特、富马酸福莫特罗、流感病毒疫苗、甲基强的松龙、阿莫西林三水合物、氟尼缩松、变态反应注射、色甘酸钠、盐酸非索那丁、氟尼缩松/薄荷醇、阿莫西林/克拉维酸钾、左氟沙星、吸入器辅助装置、愈创木酚甘油醚、地塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星、盐酸多西环素、愈创木酚甘油醚/d-甲吗喃、p-麻黄素/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙星、盐酸西替立嗪、糠酸莫米他松、沙美特罗羟萘甲酸盐、苯佐那酯、头孢氨苄、pe/二氢可待因酮/氯苯那敏、盐酸西替立嗪/伪麻黄碱(pseudoephed)、苯福林/cod/异丙嗪、可待因/异丙嗪、头孢罗齐、地塞米松、愈创木酚甘油醚/伪麻黄碱、氯苯那敏/二氢可待因酮、奈多罗米钠、硫酸特布他林、肾上腺素、甲基强的松龙、硫酸间羟异丙肾上腺素。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合COPD的治疗剂，例如硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、异丙托溴铵、沙美特罗/氟替卡松、沙丁胺醇、沙美特罗羟萘甲酸盐、丙酸氟替卡松、强的松、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、孟鲁司特钠、布地奈德、富马酸福莫特罗、曲安缩松、左氟沙星、愈创木酚甘油醚、阿奇霉素、倍氯美松双丙酸酯、盐酸左旋沙丁胺醇、氟尼缩松、头孢曲松钠、阿莫西林三水合物、加替沙星、扎鲁司特、阿莫西林/克拉维酸钾、氟尼缩松/薄荷醇、氯苯那敏/二氢可待因酮、硫酸间羟异丙肾上腺素、甲基强的松龙、糠酸莫米他松、p-麻黄素/cod/氯苯那敏、醋酸吡布特罗、p-麻黄素/氯雷他定、硫酸特布他林、噻托溴铵(tiotropium bromide)、(R,R)-福莫特罗、TgAAT、西洛司特(Cilomilast)、罗氟司特。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合HCV的治疗剂，例如干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-α con1、干扰素-α-n1、聚乙二醇化干扰素-α-2a、聚乙二醇化干扰素-α-2b、三氮唑核苷、聚乙二醇化干扰素α-2b+三氮唑核苷、熊脱氧胆酸、甘草酸、胸腺法新、马克胺(Maxamine)、VX-497以及通过干扰下述靶用于治疗HCV的任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解旋酶、HCV IRES(内部核糖体进入位点)。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合特发性肺纤维化的治疗剂，例如强的松、硫唑嘌呤、沙丁胺醇、秋水仙碱、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干扰素、甲基强的松龙琥珀酸钠(sod succ)、劳拉西泮、呋塞米、赖诺普利、硝酸甘油、螺内酯、环磷酰胺、异丙托溴铵、放线菌素d、阿替普酶、丙酸氟替卡松、左氟沙星、硫酸间羟异丙肾上腺素、硫酸吗啡、盐酸羟可酮、氯化钾、曲安缩松、无水他克莫司、钙、干扰素-α、氨甲蝶呤、霉酚酸酯、干扰素-γ-1â。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合心肌梗死的治疗剂，例如阿司匹林、硝酸甘油、酒石酸美托洛尔、依诺肝素钠、肝素钠、重硫酸氯吡格雷、卡维地洛、阿替洛尔、硫酸吗啡、琥珀酸美托洛尔、华法林钠、赖诺普利、单硝酸异山梨酯、地高辛、呋塞米、斯伐他汀、雷米普利、替尼普酶、马来酸依那普利、托拉塞米(torsemide)、瑞替普酶、氯沙坦钾、盐酸喹那普利/mag carb、布美他尼、阿替普酶、依那普利拉、盐酸胺碘酮、盐酸替罗非班一水合物、盐酸地尔硫、卡托普利、依贝沙坦、缬沙坦、盐酸普萘洛尔、福辛普利钠、盐酸利多卡因、表非替得、头孢唑啉钠、硫酸阿托品、氨基已酸、螺内酯、干扰素、盐酸索他洛尔、氯化钾、多库酯钠、盐酸多巴酚丁胺、阿普唑仑、普伐他丁钠、阿托伐他汀钙、盐酸咪达唑、盐酸哌替啶、硝酸异山梨酯、肾上腺素、盐酸多巴胺、比伐卢定、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、依泽替米贝/斯伐他汀、阿伐麦布(avasimibe)、卡立泊来德(cariporide)、心脏干细胞和生长因子。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合牛皮癣的治疗剂，例如，KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂、卡泊三醇(calcipotriene)、丙酸氯倍他索、曲安缩松、丙酸卤倍他索、他佐罗汀、氨甲蝶呤、氟轻松、增强型二丙酸倍他米松、醋酸氟轻松、阿昔曲丁、焦油(tar)洗发剂、戊酸倍他米松、糠酸莫米他松、酮康唑、丙吗卡因/氟轻松、戊酸氢化可的松、氟羟可舒松、尿素、倍他米松、丙酸氯倍他索/润滑药(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇霉素、氢化可的松、湿润配方、叶酸、丙缩羟强龙、吡美莫司(pimecrolimus)、煤焦油、双醋二氟松、叶酸依那西普、乳酸、8-甲氧基补骨质素、hc/次五倍子酸铋(bismuth subgal)/znox/resor、乙酸甲基强的松龙、强的松、遮光剂、氯氟舒松、水杨酸、蒽地酚、氯可托龙、煤提取物、煤焦油/水杨酸、煤焦油/水杨酸/硫、去羟米松、地西泮、润滑药、氟轻松/润滑药、矿物油/蓖麻油/na lact、矿物油/花生油、石油/肉豆蔻酸异丙酯、补骨脂素、水杨酸、皂/三溴沙仑、硫柳汞/硼酸、塞来昔布、英夫单抗、环孢菌素、阿来塞普、依法利珠单抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB、柳氮磺吡啶。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合牛皮癣关节炎的治疗剂，例如，氨甲蝶呤、依那西普、洛芬昔布、塞来昔布、叶酸、柳氮磺吡啶、萘普生、来氟洛米、乙酸甲基强的松龙、吲哚美辛、硫酸羟氯喹、强的松、舒林酸、增强型二丙酸倍他米松、英夫单抗、氨甲蝶呤、叶酸盐、曲安缩松、扶他林、二甲基亚砜、吡罗昔康、双氯酚酸钠、酮基布洛芬、美洛昔康、甲基强的松龙、萘普酮、托美汀钠、卡泊三醇、环孢菌素、双氯酚酸钠/米索前列醇、氟轻松、硫酸葡糖胺、硫代苹果酸金钠、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、布洛芬、利塞膦酸钠、磺胺嘧啶、硫鸟嘌呤、伐地考昔、阿来塞普、依法利珠单抗和bcl-2抑制剂，或其衍生物或缀合物。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合再狭窄的治疗剂，例如，西罗莫司、紫杉醇、依维莫司(everolimus)、他克莫司、Zotarolimus、扑热息痛。
在另一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合坐骨神经痛的治疗剂，例如，重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、洛芬昔布、盐酸环苯扎林、甲基强的松龙、萘普生、布洛芬、盐酸羟可酮/扑热息痛、塞来昔布、伐地考昔、乙酸甲基强的松龙、强的松、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸曲马多/扑热息痛、美他沙酮、美洛昔康、美索巴莫、盐酸利多卡因、双氯酚酸钠、加巴喷丁、地塞米松、卡立普多、酮咯酸氨基丁三酸醇盐、吲哚美辛、扑热息痛、地西泮、萘普酮、盐酸羟可酮、盐酸替扎尼定、双氯酚酸钠/米索前列醇、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、asa/oxycod/羟可酮ter、布洛芬/二氢可待因酮bit、盐酸曲马多、依托度酸、盐酸丙氧芬、盐酸阿米替林、卡立普多/磷酸可待因/asa、硫酸吗啡、多种维生素、甲氧萘丙酸钠、柠檬酸奥芬那君、替马西泮。
在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合SLE(狼疮)的试剂，例如，NSAIDS，例如，扶他林、萘普生、布洛芬、吡罗昔康、吲哚美辛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布、洛芬昔布、伐地考昔；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松、强的松龙、布地奈德、地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤、环磷酰胺、霉酚酸酯、氨甲蝶呤；PDE4抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例如Cellcept。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉嗪、依木兰，以及干扰促炎细胞因子诸如IL-1合成、产生或作用的试剂，例如胱天蛋白酶抑制剂，如IL-1b转化酶抑制剂和IL-1ra。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合T细胞信号传递抑制剂，例如酪氨酸激酶抑制剂；或靶向T细胞活化分子的分子，例如CTLA-4-Ig或B7家族抗体，或PD-1家族。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合IL-11或抗细胞因子抗体，例如芬突利珠单抗(fonotolizumab)(抗-IFNg抗体)，或抗受体受体抗体，例如抗-IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体。在一个实施方案中，本发明的DVD-Ig结合LJP 394(阿贝莫司(abetimus))，耗尽或失活B细胞的试剂，例如抗-CD20抗体和BlyS，TNF和bcl-2抑制剂，因为已证实bcl-2在转基因小鼠中的超表达导致狼疮样表型(参见Marquina等人(2004) J.Immunol. 172(11):7177-7185)，因此预期抑制具有治疗性作用。
本发明的抗体或其抗原结合部分可以与这样的试剂组合，所述试剂包括但不限于抗瘤剂、放射治疗、化学疗法诸如DNA烷化剂、顺铂、碳铂、抗微管蛋白剂、紫杉醇、多西他赛、紫素、阿霉素、吉西他滨、gemzar、蒽环霉素(anthracyclines)、亚得里亚霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、依立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib))、激酶抑制剂和siRNAs。
本发明的结合蛋白也可以与各种疾病治疗中有用的一种或多种另外治疗剂一起施用。
本发明的结合蛋白可以单独或组合使用以治疗此种疾病。应当理解的是，结合蛋白可以单独或与另外的试剂例如治疗剂组合使用，所述另外的试剂由技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外的试剂可以是领域公认为治疗由本发明的抗体治疗的疾病或状况有用的治疗剂。另外的试剂也可以是赋予治疗组合物有利属性的试剂，例如，影响组合物粘度的试剂。
应进一步理解的是，包括在本发明中的组合是对其预期目的有用的那些组合。下文所述试剂是举例说明的且不希望是限制性的。组合，其是本发明的一部分，可以是本发明的抗体和选自下列的至少一种另外的试剂。组合还可以包括超过一种另外的试剂，例如，2种或3种另外的试剂，如果组合是这样的，从而使得形成的组合物可以行使其预期功能。
治疗自身免疫和炎性疾病的组合是非类固醇消炎药，也称为NSAIDS，它包括药物如布洛芬。其他组合是皮质类固醇，包括强的松龙；当与本发明的DVD Igs组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。可以与本发明的抗体或抗体部分组合的用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性实例包括如下：一种或多种细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、IL-23、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体包括CD154 (gp39或CD40L)的抗体组合，所述细胞表面分子诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80 (B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA。
治疗剂的组合可以在自身免疫和后续炎症级联中的不同点上进行干扰；实例包括TNF拮抗剂，如嵌合、人源化或人TNF抗体，阿达木单抗(Adalimumab)、(PCT公开号 WO 97/29131)、CA2(RemicadeTM)、CDP 571、和可溶性p55或p75 TNF受体，其衍生物(p75TNFR1gG(EnbrelTM)或p55TNFR1gG(Lenercept)，以及还有TNFα转换酶(TACE)抑制剂；类似地由于相同原因IL-1抑制剂(白介素-1-转换酶抑制剂，IL-1RA等)可以是有效的。其他组合包括白介素11。又另一种组合包括自身免疫应答的关键参与物(player)，所述关键参与物与IL-12功能平行作用，依赖于IL-12功能或与IL-12功能一致；特别是IL-18拮抗剂，包括IL-18抗体或可溶性IL-18受体，或IL-18结合蛋白。已显示IL-12和IL-18具有重叠但不同的功能，且针对二者的拮抗剂组合可能是最有效的。又另一种组合是非耗尽性抗-CD4抑制剂。又另一种组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)拮抗剂，包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体。
本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂诸如氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪 氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNF-α或IL-1的信号传递的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶(TACE)抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或p75 TNF受体和衍生物p75TNFRIgG (EnbrelTM和p55TNFRIgG (Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、依那西普、英夫单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、盐酸曲马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸吗啡、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosamine sulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希单抗、IL-1 TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18 BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801、和美苏帕玛(Mesopram)。组合包括氨甲蝶呤或来氟洛米，且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。
也可以与结合蛋白组合使用以治疗类风湿性关节炎的非限制性的另外试剂包括但不限于，下述：一种或多种非类固醇消炎药(NSAIDs)；一种或多种细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；CDP-571/BAY-10-3356 (人源化抗- TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2/英夫单抗(嵌合抗- TNFα抗体；Centocor)；75 kdTNFR-IgG/依那西普(75 kD TNF 受体-IgG融合蛋白；Immunex；(1994) Arthritis & Rheumatism 37:S295；(1996) J. Invest. Med. 44:235A)；55 kdTNF-IgG (55 kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；IDEC-CE9.1/SB210396 (非耗尽性灵长类动物源化(primatized)抗-CD4抗体；IDEC/SmithKline；(1995)Arthrit. Rheum. 38:S185)；DAB 486-IL-2 和/或DAB 389-IL-2 (IL-2融合蛋白；Seragen；(1993) Arthrit. Rheum. 36:1223)；抗-Tac (人源化抗-IL-2Rα；ProteinDesign Labs/Roche)；IL-4 (抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-10 (SCH 52000；重组IL-10, 抗炎细胞因子；DNAX/Schering)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂(例如，激动剂抗体)；IL-1RA (IL-1受体拮抗剂；Synergen/Amgen)；阿那白滞素(Kineret®/Amgen)；TNF-bp/s-TNF (可溶性TNF结合蛋白；(1996)Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S284；(1995) Amer. J.Physiol. - Heart and Circulatory Physiology 268:37-42)；R973401 (磷酸二酯酶IV型抑制剂；(1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S282)；MK-966 (COX-2抑制剂；(1996)Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S81)；伊落前列素((1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S82)；氨甲蝶呤；沙立度胺((1996) Arthrit. Rheum.39(9；增刊):S282)和沙立度胺相关药物(例如， Celgen)；来氟洛米(抗炎和细胞因子抑制剂；(1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S131；(1996) Inflammation Research 45:103-107)；氨甲环酸(纤溶酶原活化抑制剂；(1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S284)；T-614 (细胞因子抑制剂；(1996)Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S282)；前列腺素E1 ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S282)；替尼达普(非类固醇消炎药；(1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S280)；萘普生(非类固醇消炎药；(1996) Neuro Report 7:1209-1213)；美洛昔康(非类固醇消炎药)；布洛芬(非类固醇消炎药)；吡罗昔康(非类固醇消炎药)；扶他林(非类固醇消炎药)；吲哚美辛(非类固醇消炎药)；柳氮磺吡啶((1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S281)；硫唑嘌呤((1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S281)；ICE抑制剂(白介素-1β转换酶抑制剂)；zap-70 和/或 lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂(血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；血管生成抑制剂)；皮质类固醇消炎药(例如，SB203580)；TNF-转换酶抑制剂；抗-IL-12 抗体；抗-IL-18 抗体；白介素-11 ((1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S296)；白介素-13 ((1996) Arthrit.Rheum. 39(9；增刊):S308)；白介素-17抑制剂(参见例如，(1996) Arthrit. Rheum. 39(9；增刊):S120)；金；青霉胺；氯喹；苯丁酸氮芥；羟氯喹；环孢菌素；环磷酰胺；全淋巴照射；抗-胸腺细胞球蛋白；抗-CD4抗体；CD5-毒素；经口施用的肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRAs) HP228和HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals, Inc.)；可溶性补体受体1 (TP10；TCell Sciences, Inc.)；强的松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素；抗-IL2R抗体；海生和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；DeLuca等人(1995) Rheum. Dis. Clin. North Am.21:759-777)；金诺芬；保泰松；甲氯灭酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；弃白通；阿托立平；霉酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(amiprilose)(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；氨甲蝶呤；bcl-2 抑制剂(Bruncko等人(2007)J. Med. Chem. 50(4):641-662)；抗病毒剂和免疫调谐剂。
在一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合部分与下述试剂之一组合施用用于治疗类风湿性关节炎：KDR的小分子抑制剂，Tie-2的小分子抑制剂；氨甲蝶呤；强的松；塞来昔布；叶酸；硫酸羟氯喹；洛芬昔布；依那西普；英夫单抗；来氟洛米；萘普生；伐地考昔；柳氮磺吡啶；甲基强的松龙；布洛芬；美洛昔康；乙酸甲基强的松龙；硫代苹果酸金钠；阿司匹林；硫唑嘌呤；曲安缩松；萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛；叶酸盐；萘普酮；扶他林；吡罗昔康；依托度酸；双氯酚酸钠；奥沙普嗪；盐酸羟可酮；重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛；双氯酚酸钠/米索前列醇；芬太尼；阿那白滞素，人重组体；盐酸曲马多；双水杨酸酯；舒林酸；氰钴胺素/fa/吡哆醇；扑热息痛；阿仑膦酸钠；强的松龙；硫酸吗啡；盐酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/软骨素；环孢菌素；盐酸阿米替林；磺胺嘧啶；盐酸羟可酮/扑热息痛；盐酸奥洛帕定；米索前列醇；甲氧萘丙酸钠；奥美拉唑；霉酚酸酯；环磷酰胺；利妥希单抗；IL-1 TRAP；MRA；CTLA4-IG；IL-18 BP；IL-12/23；抗-IL 18；抗-IL 15；BIRB-796；SCIO-469；VX-702；AMG-548；VX-740；罗氟司特；IC-485；CDC-801；和美苏帕玛。
可以与本发明的结合蛋白组合用于炎性肠病的治疗剂的非限制性实例包括下述：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β mAbs；抗-IL-6 mAbs；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与试剂组合，所述试剂诸如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNFα或IL-1的信号传递的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)以及bcl-2抑制剂。
其中结合蛋白可以组合用于Crohn氏病的治疗剂的实例包括下述：TNF拮抗剂，例如抗-TNF抗体，阿达木单抗(Adalimumab)(PCT公开号 WO 97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，p75TNFRIgG (ENBREL)和p55TNFRIgG(LENERCEPT))抑制剂和PDE4抑制剂。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与皮质类固醇组合，例如布地奈德和地塞米松。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分还可以与试剂组合，所述试剂诸如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪，以及干扰促炎细胞因子诸如IL-1合成或作用的试剂，例如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与T细胞信号传递抑制剂一起使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂 6-巯基嘌呤。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与IL-11组合。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与下述试剂组合：美沙拉秦、强的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英夫单抗、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、氨甲蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异噁唑/甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑(colesevelam hcl)、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗和干扰素γ。
可以与本发明的结合蛋白组合用于多发性硬化的治疗剂的非限制性实例包括下述：皮质类固醇；强的松龙；甲基强的松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；氨甲蝶呤；4-氨基吡啶；替扎尼定；干扰素-β1a(AVONEX；Biogen)；干扰素-β1b (BETASERON；Chiron/Berlex)；干扰素α-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto)，干扰素-α (Alfa Wassermann/J&J)，干扰素β1A-IF (Serono/Inhale Therapeutics)，聚乙二醇化干扰素(Peginterferon)α 2b (Enzon/Schering-Plough)，共聚物1 (Cop-1；COPAXONE；TevaPharmaceutical Industries, Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨(clabribine)；针对其他人细胞因子或生长因子及其受体的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和 PDGF。本发明的结合蛋白可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90。本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂诸如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇诸如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰通过促炎细胞因子诸如TNFα或IL-1的信号传递的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TACE抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂诸如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体，sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)和bcl-2抑制剂。
其中本发明的结合蛋白可以组合用于多发性硬化的治疗剂的实例包括干扰素-β，例如IFNβ1a和IFNβ1b；考帕松，皮质类固醇，半胱天冬酶抑制剂，例如半胱天冬酶-1抑制剂，IL-1 抑制剂，TNF抑制剂，以及针对CD40配体和CD80的抗体。
本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂诸如阿来组单抗、屈大麻酚、尤迈(Unimed)、达克珠单抗(daclizumab)、米托蒽醌、盐酸扎利罗登(xaliprodenhydrochloride)、4-氨基吡啶(fampridine)、乙酸格拉太咪尔(glatiramer acetate)、那他珠单抗、辛纳必醇(sinnabidol)、a-免疫因子(a-immunokine) NNSO3、ABR-215062、AnergiX.MS、趋化因子受体拮抗剂、BBR-2778、卡拉古林(calagualine)、CPI-1189、LEM(脂质体囊化的米托蒽醌)、THC.CBD (大麻素激动剂)MBP-8298、美苏帕玛(PDE4抑制剂)、MNA-715、抗-IL-6 受体抗体、神经素(neurovax)、哌非尼酮allotrap 1258(RDP-1258)、sTNF-R1、他仑帕奈(talampanel)、特立氟胺(teriflunomide)、TGF-β2、替利莫肽(tiplimotide)、VLA-4 拮抗剂(例如，TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干扰素γ拮抗剂、和IL-4激动剂。
可以与本发明的结合蛋白组合用于心绞痛的治疗剂的非限制性实例包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、琥珀酸美托洛尔、阿替洛尔、酒石酸美托洛尔、阿罗地平磺酸盐、盐酸地尔硫、硝酸异山梨酯、重硫酸氯吡格雷、硝苯地平、阿托伐他汀钙、氯化钾、呋塞米、斯伐他汀、盐酸维拉帕米、地高辛、盐酸普萘洛尔、卡维地洛、赖诺普利、螺内酯、氢氯噻嗪、马来酸依那普利、纳多洛尔、雷米普利、依诺肝素钠、肝素钠、缬沙坦、盐酸索他洛尔、非诺贝特、依泽替米贝(ezetimibe)、布美他尼、氯沙坦钾、赖诺普利/氢氯噻嗪、非洛地平、卡托普利、和富马酸比索洛尔。
可以与本发明的结合蛋白组合用于强直性脊柱炎的治疗剂的非限制性实例包括下述：布洛芬、扶他林和米索前列醇、萘普生、美洛昔康、吲哚美辛、扶他林、塞来昔布、洛芬昔布、柳氮磺吡啶、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、米诺环素、强的松、依那西普、和英夫单抗。
可以与本发明的结合蛋白组合用于哮喘的治疗剂的非限制性实例包括下述：沙丁胺醇、沙美特罗/氟替卡松、孟鲁司特钠、丙酸氟替卡松、布地奈德、强的松、沙美特罗羟萘甲酸盐(sameterol xinafoate)、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、强的松龙磷酸钠、曲安缩松、倍氯美松双丙酸酯、异丙托溴铵、阿奇霉素、醋酸吡布特罗、强的松龙、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、克拉霉素、扎鲁司特、富马酸福莫特罗、流感病毒疫苗、甲基强的松龙、阿莫西林三水合物、氟尼缩松、变态反应注射、色甘酸钠、盐酸非索那丁、氟尼缩松/薄荷醇、阿莫西林/克拉维酸钾、左氟沙星、吸入器辅助装置、愈创木酚甘油醚、地塞米松磷酸钠、盐酸莫西沙星、盐酸多西环素、愈创木酚甘油醚/d-甲吗喃、p-麻黄素/cod/氯苯那敏(chlorphenir)、加替沙星、盐酸西替立嗪、糠酸莫米他松、沙美特罗羟萘甲酸盐、苯佐那酯、头孢氨苄、pe/二氢可待因酮/氯苯那敏、盐酸西替立嗪/伪麻黄碱(pseudoephed)、苯福林/cod/异丙嗪、可待因/异丙嗪、头孢罗齐、地塞米松、愈创木酚甘油醚/伪麻黄碱、氯苯那敏/二氢可待因酮、奈多罗米钠、硫酸特布他林、肾上腺素、甲基强的松龙、硫酸间羟异丙肾上腺素。
可以与本发明的结合蛋白组合用于COPD的治疗剂的非限制性实例包括下述：硫酸沙丁胺醇/异丙托铵、异丙托溴铵、沙美特罗/氟替卡松、沙丁胺醇、沙美特罗羟萘甲酸盐、丙酸氟替卡松、强的松、无水茶碱、甲基强的松龙琥珀酸钠、孟鲁司特钠、布地奈德、富马酸福莫特罗、曲安缩松、左氟沙星、愈创木酚甘油醚、阿奇霉素、倍氯美松双丙酸酯、盐酸左旋沙丁胺醇、氟尼缩松、头孢曲松钠、阿莫西林三水合物、加替沙星、扎鲁司特、阿莫西林/克拉维酸钾、氟尼缩松/薄荷醇、氯苯那敏/二氢可待因酮、硫酸间羟异丙肾上腺素、甲基强的松龙、糠酸莫米他松、p-麻黄素/cod/氯苯那敏、醋酸吡布特罗、p-麻黄素/氯雷他定、硫酸特布他林、噻托溴铵(tiotropium bromide)、(R,R)-福莫特罗、TgAAT、西洛司特(Cilomilast)、和罗氟司特。
可以与本发明的结合蛋白组合用于HCV的治疗剂的非限制性实例包括下述：干扰素-α-2a、干扰素-α-2b、干扰素-α con1、干扰素-α-n1、聚乙二醇化干扰素-α-2a、聚乙二醇化干扰素-α-2b、三氮唑核苷、聚乙二醇干扰素α-2b+三氮唑核苷、熊脱氧胆酸、甘草酸、胸腺法新、马克胺(Maxamine)、VX-497以及通过干扰下述靶用于治疗HCV的任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解旋酶、HCV IRES(内部核糖体进入位点)。
可以与本发明的结合蛋白组合用于特发性肺纤维化的治疗剂的非限制性实例包括下述：强的松、硫唑嘌呤、沙丁胺醇、秋水仙碱、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干扰素、甲基强的松龙琥珀酸钠(sod succ)、劳拉西泮、呋塞米、赖诺普利、硝酸甘油、螺内酯、环磷酰胺、异丙托溴铵、放线菌素d、阿替普酶、丙酸氟替卡松、左氟沙星、硫酸间羟异丙肾上腺素、硫酸吗啡、盐酸羟可酮、氯化钾、曲安缩松、无水他克莫司、钙、干扰素-α、氨甲蝶呤、霉酚酸酯、干扰素-γ-1β。
可以与本发明的结合蛋白组合用于心肌梗死的治疗剂的非限制性实例包括下述：阿司匹林、硝酸甘油、酒石酸美托洛尔、依诺肝素钠、肝素钠、重硫酸氯吡格雷、卡维地洛、阿替洛尔、硫酸吗啡、琥珀酸美托洛尔、华法林钠、赖诺普利、单硝酸异山梨酯、地高辛、呋塞米、斯伐他汀、雷米普利、替尼普酶、马来酸依那普利、托拉塞米(torsemide)、瑞替普酶、氯沙坦钾、盐酸喹那普利/mag carb、布美他尼、阿替普酶、依那普利拉、盐酸胺碘酮、盐酸替罗非班一水合物、盐酸地尔硫、卡托普利、依贝沙坦、缬沙坦、盐酸普萘洛尔、福辛普利钠、盐酸利多卡因、表非替得、头孢唑啉钠、硫酸阿托品、氨基已酸、螺内酯、干扰素、盐酸索他洛尔、氯化钾、多库酯钠、盐酸多巴酚丁胺、阿普唑仑、普伐他丁钠、阿托伐他汀钙、盐酸咪达唑、盐酸哌替啶、硝酸异山梨酯、肾上腺素、盐酸多巴胺、比伐卢定、罗苏伐他汀(rosuvastatin)、依泽替米贝/斯伐他汀、阿伐麦布(avasimibe)、和卡立泊来德(cariporide)。
可以与本发明的结合蛋白组合用于牛皮癣的治疗剂的非限制性实例包括下述：KDR的小分子抑制剂、Tie-2的小分子抑制剂、卡泊三醇(calcipotriene)、丙酸氯倍他索、曲安缩松、丙酸卤倍他索、他佐罗汀、氨甲蝶呤、氟轻松、增强型二丙酸倍他米松、醋酸氟轻松、阿昔曲丁、焦油(tar)洗发剂、戊酸倍他米松、糠酸莫米他松、酮康唑、丙吗卡因/氟轻松、戊酸氢化可的松、氟羟可舒松、尿素、倍他米松、丙酸氯倍他索/润滑药(emoll)、丙酸氟替卡松、阿奇霉素、氢化可的松、湿润配方、叶酸、丙缩羟强龙、吡美莫司(pimecrolimus)、煤焦油、双醋二氟松、叶酸依那西普、乳酸、8-甲氧基补骨质素、hc/次五倍子酸铋(bismuthsubgal)/znox/resor、乙酸甲基强的松龙、强的松、遮光剂、氯氟舒松、水杨酸、蒽地酚、氯可托龙、煤提取物、煤焦油/水杨酸、煤焦油/水杨酸/硫、去羟米松、地西泮、润滑药、氟轻松/润滑药、矿物油/蓖麻油/na lact、矿物油/花生油、石油/肉豆蔻酸异丙酯、补骨脂素、水杨酸、皂/三溴沙仑、硫柳汞/硼酸、塞来昔布、英夫单抗、环孢菌素、阿来塞普、依法利珠单抗、他克莫司、吡美莫司、PUVA、UVB、和柳氮磺吡啶。
可以与本发明的结合蛋白组合用于牛皮癣性关节炎的治疗剂的非限制性实例包括下述：氨甲蝶呤、依那西普、洛芬昔布、塞来昔布、叶酸、柳氮磺吡啶、萘普生、来氟洛米、乙酸甲基强的松龙、吲哚美辛、硫酸羟氯喹、强的松、舒林酸、增强型二丙酸倍他米松、英夫单抗、氨甲蝶呤、叶酸盐、曲安缩松、扶他林、二甲基亚砜、吡罗昔康、双氯酚酸钠、酮基布洛芬、美洛昔康、甲基强的松龙、萘普酮、托美汀钠、卡泊三醇、环孢菌素、双氯酚酸钠/米索前列醇、氟轻松、硫酸葡糖胺、硫代苹果酸金钠、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、布洛芬、利塞膦酸钠、磺胺嘧啶、硫鸟嘌呤、伐地考昔、阿来塞普、依法利珠单抗和和bcl-2抑制剂。
可以与本发明的结合蛋白组合用于再狭窄的治疗剂的非限制性实例包括下述：西罗莫司、紫杉醇、依维莫司(everolimus)、他克莫司、Zotarolimus、扑热息痛。
可以与本发明的结合蛋白组合用于坐骨神经痛的治疗剂的非限制性实例包括下述：重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、洛芬昔布、盐酸环苯扎林、甲基强的松龙、萘普生、布洛芬、盐酸羟可酮/扑热息痛、塞来昔布、伐地考昔、乙酸甲基强的松龙、强的松、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸曲马多/扑热息痛、美他沙酮、美洛昔康、美索巴莫、盐酸利多卡因、双氯酚酸钠、加巴喷丁、地塞米松、卡立普多、酮咯酸氨基丁三酸醇盐、吲哚美辛、扑热息痛、地西泮、萘普酮、盐酸羟可酮、盐酸替扎尼定、双氯酚酸钠/米索前列醇、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、asa/oxycod/羟可酮ter、布洛芬/二氢可待因酮bit、盐酸曲马多、依托度酸、盐酸丙氧芬、盐酸阿米替林、卡立普多/磷酸可待因/asa、硫酸吗啡、多种维生素、甲氧萘丙酸钠、柠檬酸奥芬那君、和羟基安定。
其中本发明的结合蛋白可以组合用于SLE(狼疮)的治疗剂的实例包括下述：NSAIDS，例如，扶他林、萘普生、布洛芬、吡罗昔康、吲哚美辛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布、洛芬昔布、伐地考昔；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松、强的松龙、布地奈德、地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤、环磷酰胺、霉酚酸酯、氨甲蝶呤；PDE4抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例如Cellcept。本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂诸如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、奥沙拉嗪、依木兰，以及干扰促炎细胞因子诸如IL-1合成、产生或作用的试剂，例如半胱天冬酶抑制剂，如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本发明的结合蛋白还可以与T细胞信号传递抑制剂一起使用，例如酪氨酸激酶抑制剂；或靶向T细胞活化分子的分子，例如CTLA-4-IgG或抗-B7家族抗体，抗-PD-1家族抗体。本发明的结合蛋白可以与IL-11或抗细胞因子抗体组合，例如芬突利珠单抗(fonotolizumab)(抗-IFNg抗体)，或抗受体受体抗体，例如抗IL-6受体抗体和针对B细胞表面分子的抗体。本发明的抗体或其抗原结合部分还可以与下述试剂一起使用：LJP 394(阿贝莫司(abetimus))，耗尽或失活B细胞的试剂，例如利妥希单抗(抗-CD20抗体)，淋弗斯特(lymphostat)-B(抗-BlyS抗体)，TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体，阿达木单抗(PCT公开号 WO 97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig 构建体(p75TNFRIgG (ENBREL) 和p55TNFRIgG (Lenercept))和bcl-2抑制剂，因为已证实bcl-2在转基因小鼠中的过表达导致狼疮样表型(参见Marquina等人(2004) J.Immunol. 172(11):7177-7185)，因此预期抑制具有治疗性作用。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的结合蛋白。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。结合蛋白的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可以根据下述因素而变化，诸如个体疾病状态、年龄、性别、和重量，以及结合蛋白在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以施用单一大剂量，几个分份剂量可以随着时间而施用，或剂量可以如治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增加。为了易于施用和剂量一致，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。术语“单位剂型”指适合作为单位剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体相关的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明的单位剂型的详细说明由下述指示且直接取决于下述：(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用，和(b)复合这种用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域固有的局限性。
关于本发明的结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20mg/kg，例如1-10 mg/kg。应当指出的是，剂量值可以随着待减轻的状况类型和严重性而变化。应进一步理解的是，对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，具体剂量方案应当随着时间进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，且不希望限制要求保护的组合物的范围或实践。
对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本发明的方法的其他合适修改和调整是显而易见的，且在不背离本发明的范围或本文公开的实施方案的情况下可以使用合适的等同方案进行。尽管本发明目前已得到详细描述，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括仅用于举例说明性目的且不希望是本发明的限制。
V. 诊断
本文公开内容也提供诊断应用。这进一步阐明如下。
I. 测定方法
本公开内容也提供了使用如本文所述的至少一种DVD-Ig确定测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度的方法。可以将本领域已知的任何合适的测定用于该方法。实例包括但不限于免疫测定，诸如夹心免疫测定(例如，单克隆、多克隆和/或DVD-Ig夹心免疫测定或其任何变化(例如单克隆/ DVD-Ig、DVD-Ig /多克隆等)，包括放射性同位素检测(放射免疫测定(RIA))和酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如Quantikine ELISA测定，R&D Systems, Minneapolis, MN)))、竞争性抑制免疫测定(例如正向和反向)、荧光偏振免疫测定(FPIA)、酶多重免疫测定技术(EMIT)、生物发光共振能量转移(BRET)和均质化学发光测定等。在基于SELDI的免疫测定中，将特异性结合目的分析物(或其片段)的捕获试剂附着于质谱分析法探针的表面，诸如预活化的蛋白芯片阵列。然后将分析物(或其片段)特异性捕获在生物芯片上，并通过质谱分析法检测捕获的分析物(或其片段)。可替代地，可以将分析物(或其片段)从捕获试剂洗脱并通过传统MALDI(基质辅助激光解吸/电离)或通过SELDI检测。化学发光微粒免疫测定，特别是采用ARCHITECT®自动化分析仪(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)的免疫测定，是优选免疫测定的实例。
在本公开内容的实践中，使用本领域众所周知的用于采集、处理和加工尿、血液、血清和血浆以及其他体液的方法，例如，当采用如本文所述的DVD-Ig作为免疫诊断试剂和/或用于分析物免疫测定试剂盒中时。测试样品可以除目的分析物之外包含另外的部分，诸如抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶、受体、蛋白、肽、多肽、寡核苷酸和/或多核苷酸。例如，样品可以是从受试者获得的全血样品。将测试样品特别是全血在如本文所述的免疫测定之前进行处理(例如，用预处理试剂)可能是必需的或需要的。即使在预处理不是必需的(例如大多数尿样品)的情况中，也任选可以进行预处理(例如，作为商业平台上方案的部分)。
预处理试剂可以是适用于本发明的免疫测定和试剂盒的任何试剂。预处理任选包含：(a)一种或多种溶剂(例如甲醇和乙二醇)，和任选的盐，(b)一种或多种溶剂和盐，以及任选的去污剂，(c)去污剂，或(d)去污剂和盐。预处理试剂是本领域已知的，且可以采用此种预处理，例如，用于在Abbott TDx、AxSYM®、和ARCHITECT®分析仪(AbbottLaboratories, Abbott Park, IL)上测定的预处理，如文献所述(Yatscoff等人(1990)Clin. Chem. 36:1969-1973, 和Wallemacq等人(1999) Clin. Chem. 45:432-435)，和/或可通过商业途径获得的。另外，可以如美国专利号5,135,875；欧洲专利申请号EU0471293；美国专利号6,660,843；和美国专利申请号 20080020401中所述完成预处理。预处理试剂可以是异质试剂或均质试剂。
使用异质预处理试剂时，预处理试剂沉淀样品中存在的分析物结合蛋白(例如，可以结合分析物或其片段的蛋白)。此种预处理步骤包括通过向样品添加预处理试剂将形成的混合物上清液从沉淀的分析物结合蛋白分离，来取出任何分析物结合蛋白。在此种测定中，将不存在任何结合蛋白的混合物上清液用于测定中，直接进行到抗体捕获步骤。
使用均质预处理试剂时，没有此种分离步骤。将测试样品和预处理试剂的全部混合物与标记的对于分析物(或其片段)特异性的结合伴侣诸如标记的抗分析物抗体(或其抗原反应性片段)接触。在由第一种特异性结合伴侣捕获之前或期间，这种测定中采用的预处理试剂一般在预处理的测试样品混合物中得到稀释。尽管有此种稀释，但一定量的预处理试剂在捕获期间依然存在(或保留)于测试样品混合物中。根据本发明，标记的特异性结合伴侣可以是DVD-Ig (或其片段、变体或变体的片段)。
在异质形式中，从受试者获得样品后，制备第一种混合物。该混合物含有在分析物(或其片段)方面进行评估的测试样品和第一种特异性结合伴侣，其中第一种特异性结合伴侣和测试样品中含有的任何分析物形成第一种特异性结合伴侣－分析物复合物。优选地，第一种特异性结合伴侣是抗分析物抗体或其片段。第一种特异性结合伴侣可以是如本文所述的DVD-Ig (或其片段、变体、或变体的片段)。添加测试样品和第一种特异性结合伴侣以形成混合物的顺序并不关键。优选地，将第一种特异性结合伴侣固定化在固相上。在免疫测定中使用(用于第一种特异性结合伴侣，以及任选第二种特异性结合伴侣)的固相可以是本领域已知的任何固相，诸如但不限于磁性颗粒、珠粒、试管、微量滴定板、杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘(disk)和芯片。
形成含有第一种特异性结合伴侣－分析物复合物的混合物后，使用本领域已知的任何技术将任何未结合的分析物从复合物去除。例如，可以通过洗涤将未结合的分析物去除。然而，理想地，第一种特异性结合伴侣以多于测试样品中存在的任何分析物的量存在，从而使得存在于测试样品中的所有分析物由第一种特异性结合伴侣结合。
去除任何未结合的分析物后，将第二种特异性结合伴侣加入混合物以形成第一种特异性结合伴侣－分析物－第二种特异性结合伴侣复合物。第二种特异性结合伴侣优选是与分析物上表位结合的抗分析物抗体，所述表位不同于第一种特异性结合伴侣结合的分析物上的表位。此外，也是优选地，第二种特异性结合伴侣用如上所述的可检测标记进行标记或含有如上所述的可检测标记。第二种特异性结合伴侣可以是如本文所述的DVD-Ig (或其片段、变体、或变体的片段)。
可以使用本领域已知的任何合适的可检测标记。例如，可检测标记可以是放射性标记(诸如3H、125I、35S、14C、32P、和33P)、酶促标记(诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(诸如吖啶鎓酯(acridinium esters)、硫酯、或磺胺；鲁米诺、异氨基苯二酰肼、菲啶鎓酯(phenanthridinium esters)等)、荧光标记(诸如荧光素(例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3’6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如硫化锌加帽的(capped)硒化镉)、温度测量标记、或免疫-聚合酶链反应标记。标记、标记程序和标记的检测的介绍见于Polak和Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 第二版, Springer Verlag, N.Y. (1997), 以及Haugland, Handbook of FluorescentProbes and Research Chemicals (1996), 其是由Molecular Probes, Inc., Eugene,Oregon出版的组合手册和目录。荧光标记可用于FPIA (美国专利号5,593,896；5,573,904；5,496,925；5,359,093；和5,352,803)。吖啶鎓化合物可以在均质或异质化学发光测定中用作可检测标记(Adamczyk等人(2006) Bioorg. Med. Chem. Lett. 16:1324-1328；Adamczyk等人(2004) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:2313-2317；Adamczyk等人(2004)Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921；以及Adamczyk等人(2003) Org. Lett. 5:3779-3782)。
优选的吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酰胺。在Mattingly (1991) J. Biolumin.Chemilumin. 6:107-114；Adamczyk等人(1998) J. Org. Chem. 63:5636-5639；Adamczyk等人(1999) Tetrahedron 55:10899-10914；Adamczyk等人(1999) Org. Lett. 1:779-781；Adamczyk等人 (2000) Bioconjug. Chem. 11:714-724；Mattingly等人，于Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications；Dyke, 编(2002) CRCPress: Boca Raton, 第77–105页；Adamczyk等人(2003) Org. Lett. 5: 3779-3782；以及美国专利号5,468,646；5,543,524和5,783,699中描述了制备吖啶鎓-9-甲酰胺的方法。另一种优选吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酸芳基酯。吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的一个实例是10-甲基-9-(苯氧基羰基)吖啶鎓氟磺酸酯(可获自Cayman Chemical, Ann Arbor, MI)。在McCapra等人(1965) Photochem. Photobiol. 4:1111-21；Razavi等人(2000)Luminescence 15:245-249；Razavi等人(2000) Luminescence 15:239-244；以及美国专利号5,241,070中描述了制备吖啶鎓-9-甲酸芳基酯的方法。在美国专利公开号20080248493中描述了关于吖啶鎓-9-甲酸芳基酯及其用途的其他细节。
可以根据Adamczyk等人(2006) Anal. Chim. Acta 579(1):61-67中所述的方法实施化学发光测定(例如，使用如上所述的吖啶鎓或其他化学发光剂)。虽然可以使用任何合适的测定形式，但微量培养板化学发光分析仪(Mithras LB-940, BertholdTechnologies USA, LLC, Oak Ridge, TN)使小体积的多样品快速测定成为可能。
添加测试样品和一种或多种特异性结合伴侣以形成化学发光测定的混合物的顺序并不关键。如果第一种特异性结合伴侣用化学发光剂诸如吖啶鎓化合物进行可检测地标记，则形成可检测地标记的第一种特异性结合伴侣-分析物复合物。可替代地，如果使用第二种特异性结合伴侣，而且第二种特异性结合伴侣用化学发光剂诸如吖啶鎓化合物进行可检测地标记，则形成可检测地标记的第一种特异性结合伴侣-分析物-第二种特异性结合伴侣复合物。无论是否标记，任何未结合特异性结合伴侣都可以使用本领域已知的任何技术诸如洗涤从混合物去除。
可以在添加上述吖啶鎓化合物之前、同时或之后，在混合物中原位生成过氧化氢、或为混合物提供或补充过氧化氢(例如，过氧化氢的来源为已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲液或其他溶液)。可以以许多方法原位生成过氧化氢，诸如对于本领域技术人员显而易见的方法。
在同时或随后将至少一种碱性溶液添加到样品之后，生成了指示分析物存在的可检测信号，即化学发光信号。碱性溶液含有至少一种碱，并且具有大于或等于10、优选大于或等于12的pH。碱性溶液的实例包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙、和碳酸氢钙。加入样品的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。根据使用的碱性溶液的浓度，本领域技术人员可以容易地确定加入样品的碱性溶液的量。
可以使用本领域技术人员已知的常规技术检测生成的化学发光信号。基于生成的信号强度，可以定量样品中分析物的量。具体而言，样品中分析物的量与生成的信号强度成比例。可以通过将生成的光的量与关于分析物的标准曲线进行比较或通过与参考标准品进行比较定量存在的分析物的量。可以使用连续稀释或已知浓度的分析物溶液，通过质谱分析法、重量分析方法和其他本领域已知技术生成标准曲线。尽管上文重点描述了使用吖啶鎓化合物作为化学发光剂，但本领域普通技术人员可以容易使该描述适应于其他化学发光剂的使用。
通常可以使用本领域已知的任何形式进行分析物免疫测定，诸如，但不限于夹心形式。具体而言，在一种免疫测定形式中，采用至少两种抗体来分离和定量样品中的分析物诸如人分析物，或其片段。更具体而言，至少两种抗体结合分析物(或其片段)上的不同表位，形成免疫复合物，将其称为“夹心”。通常，在免疫测定中，可以将一种或多种抗体用于捕获测试样品中的分析物(或其片段)(通常将这些抗体称为一种“捕获”抗体或多种“捕获”抗体)，并且可以将一种或多种抗体用于将可检测的(即可定量的)标记结合到夹心(常常将这些抗体称为“一种检测抗体”、“多种检测抗体”、“一种缀合物”或“多种缀合物”)。因此，在夹心免疫测定形式的背景中，如本文所述的结合蛋白或DVD-Ig (或其片段、变体、或变体的片段)可用作捕获抗体、检测抗体或二者。例如，一种具有可以结合分析物(或其片段)上第一个表位的结构域的结合蛋白或DVD-Ig可用作捕获抗体，和/或另一种具有可以结合分析物(或其片段)上第二个表位的结构域的结合蛋白或DVD-Ig可用作检测抗体。在这点上，具有可以结合分析物(或其片段)上第一个表位的第一个结构域以及可以结合分析物(或其片段)上第二个表位的第二个结构域的结合蛋白或DVD-Ig可用作捕获抗体和/或检测抗体。可替代地，一种具有可以结合第一个分析物(或其片段)上表位的第一个结构域以及可以结合第二个分析物(或其片段)上表位的第二个结构域的结合蛋白或DVD-Ig可用作捕获抗体和/或检测抗体，以检测并任选定量两种或更多种分析物。在分析物可以以多于一种形式(诸如单体形式和二聚体/多聚体形式，其可以为同聚体的或异聚体的)存在于样品中的情况下，一种具有可以结合仅暴露于单体形式上的表位的结构域的结合蛋白或DVD-Ig、以及另一种具有可以结合二聚体/多聚体形式不同部分上的表位的结构域的结合蛋白或DVD-Ig，可用作捕获抗体和/或检测抗体，从而使对给定分析物的不同形式的检测和任选的定量成为可能。另外，采用在单一结合蛋白或DVD-Ig内和/或在结合蛋白或DVD-Igs之间具有差异亲和力的DVD-Igs可以提供抗体亲抗原性优势。在如本文所述的免疫测定的背景中，在结合蛋白或DVD-Ig的结构中并入一个或多个接头一般可能是有帮助的或需要的。当存在时，最佳的是，接头应该具有足够的长度和结构柔性，以使得能够通过内部结构域结合表位以及通过外部结构域结合另一个表位。在这点上，如果结合蛋白或DVD-Ig可以结合两种不同的分析物，且一种分析物大于另一种，则理想的是由外部结构域结合更大的分析物。
一般而言，可以将对于(例如怀疑含有)分析物(或其片段)进行测试的样品与至少一种捕获抗体(或多种抗体)和至少一种检测抗体(其可以是第二种检测抗体或第三种检测抗体或甚至连续编号的抗体，例如在捕获和/或检测抗体包含多种抗体时)同时或相继且以任何顺序接触。例如，可以将测试样品首先与至少一种捕获抗体、且然后(相继)与至少一种检测抗体接触。可替代地，将测试样品首先与至少一种检测抗体、且然后(相继)与至少一种捕获抗体接触。在又另一个替代形式中，可以将测试样品同时与捕获抗体和检测抗体接触。
在夹心测定形式中，首先使怀疑含有分析物(或其片段)的样品在允许形成第一种抗体/分析物复合物的条件下与至少一种第一种捕获抗体接触。如果使用多于一种捕获抗体，则形成包含两种或更多种捕获抗体的第一种捕获抗体/分析物复合物。在夹心测定中，以测试样品中预期的分析物(或其片段)的最大量的摩尔过量的量使用抗体，即，优选至少一种捕获抗体。例如，可以使用约5 µg到约1 mg抗体/mL缓冲液(例如，微粒包被缓冲液)。
竞争性抑制免疫测定包含相继和经典形式，所述竞争性抑制免疫测定常用于测量小分析物，这是因为要求仅由一种抗体结合。在相继竞争性抑制免疫测定中，将针对目的分析物的捕获抗体包被在微量滴定板的孔或其他固体支持物上。当将含有目的分析物的样品添加到孔中时，目的分析物与捕获抗体结合。洗涤后，将已知量的标记的(例如，生物素或辣根过氧化物酶(HRP))分析物添加到孔中。酶促标记的底物是生成信号所必需的。合适的HRP底物的实例是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。洗涤后，测量由标记的分析物生成的信号，并且其与样品中的分析物量成反比。在经典竞争性抑制免疫测定中，将针对目的分析物的抗体包被在固体支持物(例如微量滴定板的孔)上。然而，与相继竞争性抑制免疫测定不同，将样品和标记的分析物同时添加到孔中。样品中的任何分析物与标记的分析物竞争结合捕获抗体。洗涤后，测量由标记的分析物生成的信号，并且其与样品中的分析物量成反比。
任选地，在测试样品与至少一种捕获抗体(例如，第一种捕获抗体)接触之前，可以将所述至少一种捕获抗体结合在固体支持物上，这促进第一抗体/分析物(或其片段)复合物从测试样品的分离。捕获抗体结合的基质可以是促进捕获抗体－分析物复合物从样品分离的任何合适的固体支持物或固相。
实例包括板(诸如微量滴定板)的孔、试管、多孔凝胶(例如，硅胶、琼脂糖、葡聚糖或明胶)、聚合物膜(例如，聚丙烯酰胺)、珠粒(例如，聚苯乙烯珠粒或磁珠粒)、滤膜/膜(例如硝化纤维素或尼龙)的条、微粒(例如胶乳粒子、可磁化微粒(例如具有氧化铁或三氧化二铬核以及均聚或杂聚涂层且半径约1-10微米的微粒)。基质可以包含合适的多孔材料，所述多孔材料具有合适的表面亲和力以结合抗原以及足够的孔隙率以允许检测抗体接近。尽管可以使用水合状态下的胶状材料，但一般优选微孔性材料。厚度约0.01至约0.5 mm、优选约0.1 mm的片形式的此种多孔基质是优选的。尽管孔径可以有相当大的变化，但优选孔径为约0.025至约15微米、更优选约0.15至约15微米。可以通过引起抗体与基质的共价键合的化学方法活化此种基质的表面。一般通过疏水性力吸附，产生抗原或抗体与基质的不可逆结合；可替代地，可以使用化学偶联剂或其他方法将抗体与基质共价结合，条件是此种结合不干扰抗体结合分析物的能力。可替代地，可以将抗体与微粒结合，其中微粒已经预先用链霉抗生物素蛋白(例如DYNAL® Magnetic Beads, Invitrogen, Carlsbad, CA)或生物素(例如，使用Power-BindTM-SA-MP链霉抗生物素蛋白包被的微粒(Seradyn, Indianapolis,IN))或抗物种特异性单克隆抗体包被。如果需要，则可以将基质衍生化以允许与抗体上的各种官能团的反应性。此种衍生化要求使用某些偶联剂，其实例包括但不限于马来酐、N-羟基琥珀酰亚胺、以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺。如果需要，则可以将一种或多种捕获试剂(诸如各自对一种或多种分析物特异的抗体(或其片段))附着在固相上不同的物理或可访问的位置(例如，诸如生物芯片构型中(参见例如，美国专利号6,225,047；6,329,209；和5,242,828；以及PCT公开号 WO 99/51773和WO 00/56934)。如果将捕获试剂附着在作为固体支持物的质谱分析法探针上，则可以通过激光解吸电离质谱分析法检测与探针结合的分析物的量。可替代地，单一柱可以填充不同的珠粒，其用一种或多种捕获试剂衍生化，从而在单一位置捕获分析物(参见，抗体衍生的、基于珠粒的技术，例如Luminex的xMAP技术(Austin，TX))。
使对于分析物(或其片段)进行测定的测试样品与至少一种捕获抗体(例如第一种捕获抗体)接触后，孵育混合物以允许第一种抗体(或多种抗体)－分析物(或其片段)复合物的形成。孵育可以在约4.5至约10.0的pH、约2℃ 至约45℃ 温度下实施至少约一(1)分钟至约十八(18)小时的时间段，优选约1至约24分钟，最优选约4至约18分钟。可以在一个步骤(指将测试样品、至少一种捕获抗体和至少一种检测抗体都相继或同时加入反应容器)或多于一个步骤(诸如两个步骤、三个步骤等)中进行本文所述的免疫测定。
形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物(或其片段)复合物后，然后在允许形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物(或其片段)/第二种检测抗体复合物的条件下，将该复合物与至少一种检测抗体接触。尽管为了清楚起见说明为“第二种”抗体(例如第二种检测抗体)，但事实上，在将多种抗体用于捕获和/或检测时，所述至少一种检测抗体可以是第二种、第三种、第四种等用于该免疫测定的抗体。如果将捕获抗体/分析物(或其片段)复合物与多于一种检测抗体接触，则形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物(或其片段)/(多种)检测抗体复合物。与捕获抗体(例如第一种捕获抗体)一样，当使至少一种(例如第二种或任何后来的)检测抗体与捕获抗体/分析物(或其片段)复合物接触时，要求在与上述条件类似的条件下孵育一段时间，以形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物(或其片段)/(第二种或多种)检测抗体复合物。优选地，至少一种检测抗体含有可检测标记。可检测标记可以在形成(第一种或多种)捕获抗体/分析物(或其片段)/(第二种或多种)检测抗体复合物之前、同时、或之后与至少一种检测抗体(例如第二种检测抗体)结合。可以使用本领域已知的任何可检测标记(参见上述讨论，包括Polak和Van Noorden (1997)以及Haugland (1996)参考文献)。
可以将可检测标记直接或通过偶联剂与抗体结合。可以使用的偶联剂的实例是EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，盐酸盐)，其可以通过商业途径从Sigma-Aldrich, St. Louis, MO获得。本领域已知其他可以使用的偶联剂。本领域已知将可检测标记与抗体结合的方法。另外，可以采购或合成许多可检测标记，其已经含有促进可检测标记与抗体偶联的末端基团，诸如CPSP-吖啶鎓酯(即，9-[N-甲苯磺酰基-N-(3-羧丙基)]-10-(3-磺丙基)吖啶鎓甲酰胺)或SPSP-吖啶鎓酯(即，N10-(3-磺丙基)-N-(3-磺丙基)-吖啶鎓-9-甲酰胺)。
(第一种或多种)捕获抗体/分析物/(第二种或多种)检测抗体复合物可以但不必须在对标记定量之前从测试样品的剩余物中分离。例如，如果至少一种捕获抗体(例如第一种捕获抗体)与固体支持物(诸如孔或珠粒)结合，则可以通过去除(测试样品的)流体与固体支持物的接触而实现分离。可替代地，如果至少第一种捕获抗体与固体支持物结合，则其可以同时与含有分析物的样品和至少一种第二种检测抗体接触，以形成第一种(多种)抗体/分析物/第二种(多种)抗体复合物，随后去除流体(测试样品)与固体支持物的接触。如果至少一种第一种捕获抗体没有与固体支持物结合，则不必须为了定量标记的量而将(第一种或多种)捕获抗体/分析物/(第二种或多种)检测抗体复合物从测试样品去除。
形成标记的捕获抗体/分析物/检测抗体复合物(例如第一种捕获抗体/分析物/第二种检测抗体复合物)后，使用本领域已知技术对复合物中标记的量进行定量。例如，如果使用酶促标记，则标记的复合物与对于标记的底物反应，这给出可定量的反应，诸如显色。如果标记是放射性标记，则使用适当的工具诸如闪烁计数器定量标记。如果标记是荧光标记，则通过用一种颜色的光(称为“激发波长”)刺激标记，并检测由对刺激响应的标记发射的另一种颜色(称为“发射波长”)，来定量标记。如果标记是化学发光标记，则通过目视或通过使用发光计、X光胶片、高速照相胶片、CCD照相机等检测发射的光而定量标记。一旦已对复合物中的标记的量进行了定量，就可以通过适当的方法确定测试样品中分析物或其片段的浓度，诸如通过使用标准曲线，所述标准曲线是利用已知浓度的分析物或其片段的连续稀释生成的。除了使用分析物或其片段的连续稀释物，可以通过质量分析法、质谱分析法或其他本领域已知技术生成标准曲线。
在采用ARCHITECT®分析仪的化学发光微粒测定中，缀合物稀释剂pH应为约6.0+/- 0.2，微粒包被缓冲液应维持于约室温(即，从约17至约27ðC)，微粒包被缓冲液pH应为约6.5 +/- 0.2，且微粒稀释剂pH应为约7.8 +/- 0.2。固体优选为少于约0.2%，诸如少于约0.15%、少于约0.14%、少于约0.13%、少于约0.12%，或少于约0.11%，诸如约0.10%。
FPIAs基于竞争性结合免疫测定原理。当由线性偏振光激发时，荧光标记的化合物将发射具有一定偏振程度的荧光，该程度与其旋转速度成反比。当通过线性偏振光激发荧光标记的示踪物－抗体复合物时，发射的光保持高度偏振化，这是因为荧光团受光吸收时间和光发射时间之间旋转的限制。当“游离”示踪化合物(即，没有与抗体结合的化合物)由线性偏振光激发时，其旋转远快于在竞争性结合免疫测定中产生的相应的示踪物-抗体缀合物(或示踪物结合蛋白和/或示踪物DVD-Ig)。FPIAs比RIAs有优势，这是因为没有要求特殊处理和处置的放射性物质。另外，FPIAs是可容易地且快速进行的均质测定。
考虑到上述情况，提供了确定测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度的方法。该方法包括通过如下测定对测试样品测定分析物(或其片段)，所述测定(i)采用(i’)至少一种抗体、可结合分析物的抗体的片段、可结合分析物的抗体的变体、可结合分析物的抗体变体的片段(或示踪物结合蛋白和/或示踪物DVD-Ig)、以及可结合分析物的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，以及(ii’)至少一种可检测标记，以及(ii)包含将由可检测标记生成的、作为测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与生成的、作为对照或校准物中分析物(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物的部分，其中每种校准物与其他校准物的不同在于分析物浓度。
该方法可包括(i)将测试样品与对于分析物(或其片段)的至少一种第一种特异性结合伴侣接触，所述至少一种第一种特异性结合伴侣选自抗体、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、和可结合分析物的DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，从而形成第一种特异性结合伴侣/分析物(或其片段)复合物，(ii)将第一种特异性结合伴侣/分析物(或其片段)复合物与对于分析物(或其片段)的至少一种第二种特异性结合伴侣接触，所述至少一种第二种特异性结合伴侣选自可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体片段、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体变体、可结合分析物的可检测地标记的抗分析物抗体变体的片段、和可检测地标记的DVD-Ig (或其片段、变体、或变体的片段)，从而形成第一种特异性结合伴侣/分析物(或其片段)/第二种特异性结合伴侣复合物，以及(iii)通过检测或测量(ii)中形成的第一种特异性结合伴侣/分析物(或其片段)/第二种特异性结合伴侣复合物中由可检测标记生成的信号，确定测试样品中分析物的存在、量或浓度。这样的方法可以是优选的，在该方法中，对于分析物(或其片段)的至少一种第一种特异性结合伴侣和/或对于分析物(或其片段)的至少一种第二种特异性结合伴侣是如本文所述的DVD-Ig (或其片段、变体、或变体的片段)。
可替代地，该方法可包括将测试样品与对于分析物(或其片段)的至少一种第一种特异性结合伴侣接触，所述至少一种第一种特异性结合伴侣选自抗体、可结合分析物的抗体片段、可结合分析物的抗体变体、可结合分析物的抗体变体的片段、和DVD-Ig (或其片段、变体、或变体的片段)，并同时或以任何顺序相继将测试样品与至少一种第二种特异性结合伴侣接触，所述至少一种第二种特异性结合伴侣可以与分析物(或其片段)竞争结合至少一种第一种特异性结合伴侣，并且其选自可检测地标记的分析物、可结合第一种特异性结合伴侣的可检测地标记的分析物片段、可结合第一种特异性结合伴侣的可检测地标记的分析物变体、和可结合第一种特异性结合伴侣的可检测地标记的分析物变体的片段。存在于测试样品中的任何分析物(或其片段)以及至少一种第二种特异性结合伴侣彼此竞争，以分别形成第一种特异性结合伴侣/分析物(或其片段)复合物和第一种特异性结合伴侣/第二种特异性结合伴侣复合物。该方法另外包括通过检测或测量(ii)中形成的第一种特异性结合伴侣/第二种特异性结合伴侣复合物中由可检测标记生成的信号，确定测试样品中分析物的存在、量或浓度，其中第一种特异性结合伴侣/第二种特异性结合伴侣复合物中由可检测标记生成的信号与测试样品中分析物的量或浓度成反比。
上面的方法可以另外包括对从其获得测试样品的患者诊断、预测、或评估治疗性/预防性处理的效力。如果方法进一步包括对从其获得测试样品的患者评估治疗性/预防性处理的效力，则方法任选另外包括根据需要调整患者的治疗性/预防性处理以改善效力。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统中。
更具体地，提供了确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度的方法。该方法包括通过免疫测定来测定测试样品中的抗原(或其片段)。该免疫测定(i)采用至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记，以及(ii)包含将测试样品中由可检测标记生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与对照或校准物中生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物的部分，其中每种校准物与该系列中的其他校准物的不同在于抗原(或其片段)浓度。所述至少一种结合蛋白之一(i’)包含多肽链，所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii’)能够结合抗原对。该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，(ii)将所述捕获试剂/抗原(或其片段)复合物与至少一种检测试剂接触，所述检测试剂包含可检测标记并且结合抗原(或其片段)上不被所述捕获试剂结合的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物，和(iii)基于(ii)中形成的捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中至少一种捕获试剂和/或至少一种检测试剂是所述至少一种结合蛋白。可替代地，该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，并且同时或以任何顺序相继将测试样品与可检测地标记的抗原(或其片段)接触，所述可检测地标记的抗原(或其片段)可以与测试样品中的任何抗原(或其片段)竞争结合所述至少一种捕获试剂，其中测试样品中存在的任何抗原(或其片段)与所述可检测地标记的抗原彼此竞争，以分别形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物和捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物，和(ii)基于(ii)中形成的捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中所述至少一种捕获试剂是所述至少一种结合蛋白，并且其中所述捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号与测试样品中抗原(或其片段)的量或浓度成反比。测试样品可以来自患者，在此情况下该方法可以进一步包括诊断、预后、或评估患者的治疗性/预防性处理的效力。如果该方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，该方法任选进一步包括根据需要调整患者的治疗性/预防性处理以改善效力。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统中。
提供了确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度的另一种方法。该方法包括通过免疫测定来测定测试样品中的抗原(或其片段)。该免疫测定(i)采用至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记，以及(ii)包含将测试样品中由可检测标记生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与对照或校准物中生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物的部分，其中每种校准物与该系列中的其他校准物的不同在于抗原(或其片段)浓度。所述至少一种结合蛋白之一(i’)包含多肽链，所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii’)能够结合抗原对。该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，(ii)将所述捕获试剂/抗原(或其片段)复合物与至少一种检测试剂接触，所述检测试剂包含可检测标记并且结合抗原(或其片段)上不被所述捕获试剂结合的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物，和(iii)基于(ii)中形成的捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中至少一种捕获试剂和/或至少一种检测试剂是所述至少一种结合蛋白。可替代地，该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，并且同时或以任何顺序相继将测试样品与可检测地标记的抗原(或其片段)接触，所述可检测地标记的抗原(或其片段)可以与测试样品中的任何抗原(或其片段)竞争结合所述至少一种捕获试剂，其中测试样品中存在的任何抗原(或其片段)与所述可检测地标记的抗原彼此竞争，以分别形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物和捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物，和(ii)基于(ii)中形成的捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中所述至少一种捕获试剂是所述至少一种结合蛋白，并且其中所述捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号与测试样品中抗原(或其片段)的量或浓度成反比。如果测试样品来自患者，该方法可以进一步包括诊断、预后、或评估患者的治疗性/预防性处理的效力。如果该方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，该方法任选进一步包括根据需要调整患者的治疗性/预防性处理以改善效力。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统中。
提供了确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度的又另一种方法。该方法包括通过免疫测定来测定测试样品中的抗原(或其片段)。该免疫测定(i)采用至少一种结合蛋白和至少一种可检测标记，以及(ii)包含将测试样品中由可检测标记生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与对照或校准物中生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物的部分，其中每种校准物与该系列中的其他校准物的不同在于抗原(或其片段)浓度。所述至少一种结合蛋白之一(i’)包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且其中所述第二多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且 (X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii’)能够结合抗原对。该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，(ii)将所述捕获试剂/抗原(或其片段)复合物与至少一种检测试剂接触，所述检测试剂包含可检测标记并且结合抗原(或其片段)上不被所述捕获试剂结合的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物，和(iii)基于(ii)中形成的捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中至少一种捕获试剂和/或至少一种检测试剂是所述至少一种结合蛋白。可替代地，该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，并且同时或以任何顺序相继将测试样品与可检测地标记的抗原(或其片段)接触，所述可检测地标记的抗原(或其片段)可以与测试样品中的任何抗原(或其片段)竞争结合所述至少一种捕获试剂，其中测试样品中存在的任何抗原(或其片段)与所述可检测地标记的抗原彼此竞争，以分别形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物和捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物，和(ii)基于(ii)中形成的捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中所述至少一种捕获试剂是所述至少一种结合蛋白，并且其中所述捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号与测试样品中抗原(或其片段)的量或浓度成反比。如果测试样品来自患者，该方法可以进一步包括诊断、预后、或评估患者的治疗性/预防性处理的效力。如果该方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，该方法任选进一步包括根据需要调整患者的治疗性/预防性处理以改善效力。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统中。
提供了确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度的又另一种方法。该方法包括通过免疫测定来测定测试样品中的抗原(或其片段)。该免疫测定(i)采用至少一种能够结合两种抗原的DVD-Ig和至少一种可检测标记，以及(ii)包含将测试样品中由可检测标记生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号，与对照或校准物中生成的、作为抗原(或其片段)的存在、量或浓度的直接或间接指示的信号进行比较。校准物任选是一系列校准物的部分，其中每种校准物与该系列中的其他校准物的不同在于抗原(或其片段)浓度。所述至少一种DVD-Ig之一(i’)包含4条多肽链，其中第一和第三多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且其中第二和第四多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个轻链可变结构域，VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii’)能够结合两种抗原(或其片段)。该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，(ii)将所述捕获试剂/抗原(或其片段)复合物与至少一种检测试剂接触，所述检测试剂包含可检测标记并且结合抗原(或其片段)上不被所述捕获试剂结合的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物，和(iii)基于(ii)中形成的捕获试剂/抗原(或其片段)/检测试剂复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中至少一种捕获试剂和/或至少一种检测试剂是所述至少一种DVD-Ig。可替代地，该方法可以包括(i)将测试样品与至少一种捕获试剂接触，所述捕获试剂结合抗原(或其片段)上的表位，以形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物，并且同时或以任何顺序相继将测试样品与可检测地标记的抗原(或其片段)接触，所述可检测地标记的抗原(或其片段)可以与测试样品中的任何抗原(或其片段)竞争结合所述至少一种捕获试剂，其中测试样品中存在的任何抗原(或其片段)与所述可检测地标记的抗原彼此竞争，以分别形成捕获试剂/抗原(或其片段)复合物和捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物，和(ii)基于(ii)中形成的捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号，确定测试样品中抗原(或其片段)的存在、量或浓度，其中所述至少一种捕获试剂是所述至少一种DVD-Ig，并且其中所述捕获试剂/可检测地标记的抗原(或其片段)复合物中的可检测标记生成的信号与测试样品中抗原(或其片段)的量或浓度成反比。如果测试样品来自患者，该方法可以进一步包括诊断、预后、或评估患者的治疗性/预防性处理的效力。如果该方法进一步包括评估患者的治疗性/预防性处理的效力，该方法任选进一步包括根据需要调整患者的治疗性/预防性处理以改善效力。可以调整该方法以用于自动化系统或半自动化系统中。
关于测定方法(及其试剂盒)，可能采用可通过商业途径获得的抗分析物抗体或如文献所述制备抗分析物的方法。各种抗体的商业供应包括但不限于Santa CruzBiotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA), 和R&D Systems (RDS；Minneapolis, MN)。
通常，可以采用预定水平作为基准，针对所述基准对测定测试样品的分析物或其片段后所获结果进行评估，例如，用于检测疾病或疾病风险。通常，在进行这种比较中，通过将具体测定运行足够次数且在适当的条件下获得预定水平，从而获得分析物的存在、量或浓度与疾病、病症或状况的特定阶段或终点、或与具体临床标记之间的联系或关联。一般，使用参考受试者(或受试者群体)的测定获得预定水平。测量的分析物可以包括其片段、其降解产物、和/或其酶切产物。
具体而言，关于用于监测疾病进展和/或治疗的预定水平，分析物或其片段的量或浓度可以是“无变化的”、“有利的”(或“有利改变的”)、或“不利的”(或“不利改变的”)。“升高的”或“增加的”指测试样品中的量或浓度高于一般或正常水平或范围(例如预定水平)、或高于另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)。术语“降低的”或“减少的”指测试样品中的量或浓度低于一般或正常水平或范围(例如预定水平)、或低于另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)。术语“改变的”指样品中的量或浓度相比于一般或正常水平或范围(例如预定水平)、或相比于另一个参考水平或范围(例如较早或基线样品)发生改变(增加或减少)。
根据标准实践定义关于分析物的一般或正常水平或范围。因为分析物水平在一些情况下将会非常低，所以当与一般或正常水平或范围、或参考水平或范围相比，存在不能由实验误差或样品差异解释的任何净变化时，可以考虑已经出现了所谓的变化水平或变化。因此，在特定样品中测量的水平将与来自所谓的正常受试者的类似样品中确定的水平或水平范围进行比较。在此背景中，分别地，“正常受试者”是例如没有可检测的疾病的个体，而“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是例如没有表现可检测疾病的那些患者或群体。另外，鉴于不会在大多数人群中常规发现高水平分析物，可以将“正常受试者”认为是分析物的量或浓度无相当大的可检测的增加或升高的个体，而“正常”(有时称为“对照”)患者或群体是表现出分析物的量或浓度无相当大的可检测的增加或升高的那些患者或群体。“表观正常受试者”是其中的分析物尚未进行评估或当前正在进行评估的受试者。当分析物正常不可检测(例如，正常水平是零，或在正常群体的约25至约75百分位范围内)，但是在测试样品中可检测时，以及当分析物以高于正常水平存在于测试样品中时，称该分析物水平是“升高的”。因此，本公开内容尤其提供了筛选患有特定疾病、病症或状况或处于患有特定疾病、病症或状况的风险中的受试者的方法。测定方法也涉及其他标记的测定等。
因此，本文所述方法也可用于确定受试者是否患有给定疾病、病症或状况或处于发展给定疾病、病症或状况的风险中。具体地，此种方法可以包括步骤 (a) 确定来自受试者的测试样品中分析物(或其片段)的浓度或量(例如使用本文所述方法或本领域已知方法)；并且(b) 将步骤(a)中确定的分析物(或其片段)的浓度或量与预定水平比较，其中，如果步骤(a)中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是有利的，那么将该受试者确定为未患有给定疾病、病症或状况或没有发展给定疾病、病症或状况的风险。然而，如果步骤(a)中确定的分析物的浓度或量相对于预定水平是不利的，那么将该受试者确定为患有给定疾病、病症或状况或具有发展给定疾病、病症或状况的风险。
另外，本文提供了监测受试者中疾病进展的方法。最佳地，该方法包括步骤(a) 确定来自受试者的测试样品中分析物的浓度或量；(b) 确定来自受试者的较晚测试样品中分析物的浓度或量；并且(c) 将步骤(b)中确定的分析物的浓度或量与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较，其中，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(b)中确定的浓度或量是无变化的或是不利的，那么确定受试者中的疾病已经继续、进展或恶化。比较而言，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(b)中确定的分析物的浓度或量是有利的，那么确定受试者中的疾病已经停止、消退或改善。
任选地，该方法另外包括将步骤(b)中确定的分析物的浓度或量例如与预定水平进行比较。另外，如果比较显示，步骤(b)中确定的分析物的浓度或量例如相对于预定水平不利地改变，则方法任选包括用一种或多种药物组合物对受试者治疗一段时间。
另外，该方法可用于在接受用一种或多种药物组合物治疗的受试者中监测治疗。具体而言，此种方法涉及提供对受试者施用一种或多种药物组合物之前来自受试者的第一份测试样品。接下来，确定来自受试者的第一份测试样品中分析物的浓度或量(例如，使用本文所述或本领域已知的方法)。确定分析物的浓度或量后，任选然后将分析物的浓度或量与预定水平进行比较。如果在第一份测试样品中确定的分析物的浓度或量低于预定水平，那么不对该受试者用一种或多种药物组合物治疗。然而，如果在第一份测试样品中确定的分析物的浓度或量高于预定水平，那么用一种或多种药物组合物对该受试者治疗一段时间。本领域技术人员可以确定用一种或多种药物组合物对该受试者治疗的时间段(例如该时间段可以从约七(7)天到约两年，优选从约十四(14)天到约一(1)年)。
在用一种或多种药物组合物治疗过程期间，然后从受试者获得第二份和后续的测试样品。从受试者获得所述测试样品的测试样品数目和时间并不关键。例如，第二份测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后七(7)天获得，第三份测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后两(2)周获得，第四份测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后三(3)周获得，第五份测试样品可以在首次对受试者施用一种或多种药物组合物后四(4)周获得，等。
从受试者获得每个第二份或后续测试样品后，确定第二份或后续测试样品中分析物的浓度或量(例如，使用本文所述或本领域已知的方法)。然后将第二份和后续测试样品每一份中确定的分析物的浓度或量与第一份测试样品(例如，最初任选与预定水平进行比较的测试样品)中确定的分析物的浓度或量进行比较。如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(c)中确定的分析物的浓度或量是有利的，那么确定受试者中的疾病已经停止、消退或改善，且应当对受试者继续施用步骤(b)的一种或多种药物组合物。然而，如果当与步骤(a)中确定的分析物的浓度或量比较时，步骤(c)中确定的浓度或量无变化或是不利的，那么确定受试者中的疾病已经继续、进展或恶化，且应当用更高浓度的步骤(b)中对受试者施用的一种或多种药物组合物治疗受试者，或者应当用不同于步骤(b)中对受试者施用的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者。具体而言，可以用不同于受试者以前已经接受的一种或多种药物组合物的一种或多种药物组合物治疗受试者以减少或降低所述受试者的分析物水平。
通常，对于可能进行重复测试的测定(例如，监测疾病进展和/或对治疗的应答)，在已从受试者获得第一份测试样品后在一段时间及时获得第二份或后续的测试样品。具体而言，可以在已从受试者获得第一份测试样品后的数分钟、数小时、数天、数周或数年获得来自受试者的第二份测试样品。例如，可以在从受试者获得第一份测试样品后的如下时间段从受试者获得第二份测试样品：约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18 小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年。
当用于监测疾病进展时，上述测定可用于在患有急性状况的受试者中监测疾病进展。急性状况，也称为病危护理状况，指涉及例如心血管系统或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学状况。一般，病危护理状况指需要在基于医院的机构(hospital-based setting)(包括但不限于急诊室、重症监护病房、创伤中心、或其他急救护理机构)中的急性医学干预或通过随行医务人员或其他现场医学人员(field-based medicalpersonnel)管理的那些状况。对于病危护理状况，通常在较短的时间范围内进行重复监测，所述较短的时间范围即数分钟、数小时或数天(例如，约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天)，且最初的测定同样一般在较短的时间范围内完成，例如疾病或状况开始约数分钟、数小时或数天。
测定也可用于在患有慢性或非急性状况的受试者中监测疾病进展。非病危护理或非急性状况指除了涉及例如心血管系统和/或排泄系统的急性、威胁生命的疾病或其他危急医学状况之外的状况。一般，非急性状况包括具有长期或慢性持续时间的那些状况。对于非急性状况，通常在较长的时间范围内进行重复监测，例如数小时、数天、数周、数月或数年(例如，约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年), 且初始测定同样通常在较长时间范围内完成，例如疾病或状况发作的约数小时、数天、数月或数年。
另外，可以使用从受试者获得的第一份测试样品实施上述测定，其中第一份测试样品获得自一个来源，诸如尿、血清或血浆。任选地，然后可以使用从受试者获得的第二份测试样品重复上述测定，其中所述第二份测试样品获得自另一个来源。例如，如果从尿获得第一份测试样品，则可以从血清或血浆获得第二份测试样品。可以比较从使用第一份测试样品和第二份测试样品的测定获得的结果。可以将该比较用于评估受试者中的疾病或状况状态。
此外，本公开内容也涉及确定倾向于或患有给定疾病、病症或状况的受试者是否会从治疗受益的方法。具体而言，公开内容涉及分析物配对物(analyte companion)诊断方法和产品。因此，如本文所述的“监测受试者中疾病治疗”的方法另外也可以最佳地包含选择或鉴定用于治疗的候选。
因此，在特定的实施方案中，公开内容也提供了确定患有给定疾病、病症或状况或处于发展给定疾病、病症或状况的风险中的受试者是否是用于治疗的候选的方法。通常，受试者是经历过给定疾病、病症或状况的一些症状的受试者，或是实际上已诊断为患有给定疾病、病症或状况或处于发展给定疾病、病症或状况的风险中的受试者，和/或显示如本文所述分析物或其片段的不利浓度或量的受试者。
该方法任选包括如本文所述的测定，其中在用一种或多种药物组合物(例如，特别是用与涉及分析物的作用机制相关的药物)、用免疫抑制治疗、或通过免疫吸收治疗对受试者进行治疗之前和之后评估分析物，或其中在此种治疗后评估分析物，并将分析物的浓度或量与预定水平进行比较。治疗后观察到的不利的分析物浓度或量，证实受试者将不会受益于接受进一步或继续治疗，而治疗后观察到的有利的分析物浓度或量，证实受试者将会受益于接受进一步或继续治疗。这种证实帮助管理临床研究和提供改进的患者护理。
不言而喻，尽管本文的某些实施方案在用于评估如本文所讨论的给定疾病、病症或状况时是有益的，但测定和试剂盒可用于评估其他疾病、病症和状况中的分析物。该测定方法也可涉及其他标记的测定等。
该测定方法也可用于鉴定改善给定疾病、病症或状况的化合物。例如，可以将表达分析物的细胞与候选化合物接触。可以使用本文所述的测定方法将与化合物接触的细胞中的分析物表达水平与对照细胞中的分析物表达水平进行比较。
II. 试剂盒
也提供了对于测试样品中分析物(或其片段)的存在、量或浓度测定测试样品的试剂盒。试剂盒包含至少一种测定测试样品的分析物(或其片段)的组分、以及测定测试样品的分析物(或其片段)的说明书。至少一种测定测试样品的分析物(或其片段)的组分可以包括含有任选固定化在固相上的抗分析物DVD-Ig (或其片段、变体、或变体的片段)的组合物。
试剂盒可以包含至少一种通过免疫测定(例如化学发光微粒免疫测定)测定测试样品的分析物的组分、以及通过免疫测定(例如化学发光微粒免疫测定)测定测试样品的分析物的说明书。例如，试剂盒可以包含至少一种对于分析物的特异性结合伴侣，诸如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其可以结合分析物的片段、其可以结合分析物的变体、或可以结合分析物的变体的片段)或抗分析物DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，其中任一个可以是可检测地标记的。可替代地或另外地，试剂盒可以包含可检测地标记的分析物(或其可以结合抗分析物、单克隆/多克隆抗体或抗分析物DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)的片段)，其可以与测试样品中的任何分析物竞争结合抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其可以结合分析物的片段、其可以结合分析物的变体、或可以结合分析物的变体的片段)或抗分析物DVD-Ig(或其片段、变体、或变体的片段)，其中任一个可以固定化在固体支持物上。试剂盒可以包含校准物或对照，例如分离的或纯化的分析物。试剂盒可以包含至少一个用于实施测定的容器(例如已经用第一种特异性结合伴侣包被的管、微量滴定板或条)，和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一个可作为浓缩溶液、可检测标记(例如酶促标记)的底物溶液、或终止液提供。优选地，试剂盒包含实施该测定所必需的所有组分，即，试剂、标准品、缓冲液、稀释剂等。说明书可以是纸形式或计算机可读形式，诸如光盘、CD、DVD等。
更具体地，提供了用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的试剂盒。该试剂盒包含至少一种用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的组分和用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的说明书，其中所述至少一种组分包括至少一种包含结合蛋白的组合物，所述结合蛋白(i’)包含多肽链，所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii’)能够结合抗原对，其中所述结合蛋白是任选可检测地标记的。
进一步提供了用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的另一种试剂盒。该试剂盒包含至少一种用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的组分和用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的说明书，其中所述至少一种组分包括至少一种包含结合蛋白的组合物，所述结合蛋白(i’)包含多肽链，所述多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii)能够结合抗原对，其中所述结合蛋白是任选可检测地标记的。
还进一步提供了用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的另一种试剂盒。该试剂盒包含至少一种用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的组分和用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的说明书，其中所述至少一种组分包括至少一种包含结合蛋白的组合物，所述结合蛋白(i’)包含第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且其中所述第二多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii’)能够结合抗原对，其中所述结合蛋白是任选可检测地标记的。
甚至还进一步提供了用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的另一种试剂盒。该试剂盒包含至少一种用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的组分和用于测定测试样品中的抗原(或其片段)的说明书，其中所述至少一种组分包括至少一种包含DVD-Ig的组合物，所述DVD-Ig(i’)包含4条多肽链，其中第一和第三多肽链包含第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个重链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个重链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是重链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且(X2)n是Fc区，其任选存在，并且其中所述第二和第四多肽链包含第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是从第一亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第一个轻链可变结构域；VD2是从第二亲本抗体(或其抗原结合部分)获得的第二个轻链可变结构域，所述第二亲本抗体(或其抗原结合部分)可以与第一亲本抗体相同或不同；C是轻链恒定结构域；(X1)n是接头，其任选存在，并且当存在时，不是CH1，且 (X2)n是Fc区，其任选存在，并且(ii’)能够结合两种抗原(或其片段)，其中所述DVD-Ig是任选可检测地标记的。
任何抗体(诸如抗分析物抗体或抗分析物DVD-Ig，或示踪物可以并入可检测标记，诸如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记、发色团、化学发光标记等，或试剂盒可以包括进行可检测标记的试剂。可以将抗体、校准物和/或对照在分开的容器中提供，或预先分配到合适的测定形式中，例如到微量滴定板中。
任选地，试剂盒包括质量控制组分(例如，灵敏度实验对象组(sensitivitypanels)、校准物和阳性对照)。质量控制试剂的制备为本领域众所周知，并在关于多种免疫诊断产品的插页中得到描述。灵敏度实验对象组成员任选用于确立测定性能特征，并另外任选地是免疫测定试剂盒试剂完整性以及测定标准化的有用指示。
试剂盒也可以任选包括进行诊断性测定或促进质量控制评价所需的其他试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、酶底物、检测试剂等。其他组分，诸如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液(例如预处理试剂)也可包含在试剂盒中。试剂盒可以额外包括一个或多个其他对照。可以将试剂盒的一种或多种组分冻干，在那种情况下，试剂盒可以另外包含适于重构冻干的组分的试剂。
任选将试剂盒的各种组分根据需要提供在合适的容器(例如微量滴定板)中。试剂盒可以另外包括容纳或贮存样品的容器(例如尿样品的容器或药液筒)。适当时，试剂盒任选也可以含有反应容器、混合容器和促进制备试剂或测试样品的其他组分。试剂盒也可以包括帮助获得测试样品的一种或多种仪器，诸如注射器、移液管、镊、量勺(measuredspoon)等。
如果可检测标记是至少一种吖啶鎓化合物，则试剂盒可以包含至少一种吖啶鎓-9-甲酰胺、至少一种吖啶鎓-9-甲酸芳基酯或其任何组合。如果可检测标记是至少一种吖啶鎓化合物，则试剂盒也可以包含过氧化氢的来源，诸如缓冲液、溶液、和/或至少一种碱性溶液。如果需要，则试剂盒可以含有固相，诸如磁性颗粒、珠粒、试管、微量滴定板、杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘或芯片。
C. 试剂盒及方法的调整
通过测定(诸如免疫测定)确定测试样品中分析物的存在、量或浓度的试剂盒(或其组分)及方法，可以进行调整以用于多种自动化和半自动化系统中(包括其中固相包含微粒的那些)，如例如美国专利号5,089,424和5,006,309中所述、以及例如由AbbottLaboratories (Abbott Park, IL)作为ARCHITECT®商业销售的。
自动化或半自动化系统与非自动化系统(例如ELISA)相比，之间的一些差异包括附着第一种特异性结合伴侣(例如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD-Ig (或其片段、其变体、或其变体的片段)的基质；任一方式，夹心形成和分析物反应性可以受到影响)、捕获、检测和/或任何任选的洗涤步骤的长度和时间控制。尽管非自动化形式(诸如ELISA)可能要求与样品和捕获试剂相对较长的孵育时间(例如，约2小时)，但自动化或半自动化形式(例如ARCHITECT®, Abbott Laboratories)可能具有相对较短的孵育时间(例如对ARCHITECT®约18分钟)。类似地，尽管非自动化形式(诸如ELISA)可以孵育检测抗体(诸如缀合试剂)相对较长的孵育时间(例如，约2小时)，但自动化或半自动化形式(例如ARCHITECT®)可能具有相对较短的孵育时间(例如对ARCHITECT®约4分钟)。
可从Abbott Laboratories获得的其他平台包括但不限于AxSYM®、IMx® (美国专利号5,294,404)、PRISM®、EIA(珠粒)、和QuantumTM II，以及其他平台。另外，可以用其他形式例如在电化学或其他手提式或现场即时(point-of-care)测定系统中采用该测定、试剂盒和试剂盒组分。本公开内容例如适用于实施夹心免疫测定的商业Abbott Point ofCare (i-STAT®, Abbott Laboratories)电化学免疫测定系统。在例如美国专利号5,063,081；7,419,821；和7,682,833；以及美国专利申请号20040018577 和20060160164中描述了在一次性使用测试设备中的免疫传感器及其制造和操作方法。
具体而言，关于分析物测定对I-STAT®系统的调整，优选下述配置。用一对金电流分析工作电极和一个银－氯化银参考电极制造微制作硅芯片。在一个工作电极上，将具有固定化的抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD-Ig (或其片段、其变体、或其变体的片段)的聚苯乙烯珠粒(0.2 mm直径)，与电极上模式化的聚乙烯醇聚合物涂层粘附。将该芯片以适于免疫测定的流体学形式装配到I-STAT®药液筒中。在药液筒样品保持室壁的部分上，有含有对于分析物的特异性结合伴侣的层，对于分析物的特异性结合伴侣是诸如抗分析物、单克隆/多克隆抗体(或可以结合分析物的其片段、其变体、或其变体的片段)或抗分析物DVD-Ig (或可以结合分析物的其片段、其变体、或其变体的片段)，其中任一个可以是可检测地标记的。在药液筒流体袋内是包括对氨基苯酚磷酸酯的含水试剂。
在操作中，将怀疑含有分析物的样品添加到测试药液筒的保持室，并将药液筒插入I-STAT®阅读器。在对于分析物的特异性结合伴侣溶解到样品中后，药液筒中的泵元件迫使样品进入含有芯片的管道。在此将其振荡以促进形成夹心。在测定的倒数第二个步骤，将流体挤出袋并进入管道，以将样品从芯片洗掉且进入废物室中。在测定的最终步骤，碱性磷酸酶标记与对氨基苯酚磷酸酯反应，以切割磷酸基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极被电化学氧化。根据测量的电流，阅读器能够通过嵌入式算法和工厂确定的校准曲线计算样品中分析物的量。
本文所述方法和试剂盒必须包括实施免疫测定的其他试剂和方法。例如，包括各种缓冲液，诸如本领域已知的和/或易于制备或被优化以应用的，例如用于洗涤，作为缀合物稀释剂、微粒稀释剂、和/或作为校准物稀释剂。示例性缀合物稀释剂是用于某些试剂盒(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中并含有2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、盐、蛋白封闭剂、抗微生物剂、和去污剂的ARCHITECT®缀合物稀释剂。示例性校准物稀释剂是用于某些试剂盒(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中并包含含有MES、其他盐、蛋白封闭剂、和抗微生物剂的缓冲液的ARCHITECT®人校准物稀释剂。另外，如2008年12月31日提交的美国专利申请号 61/142,048中所述，例如在I-Stat药液筒形式中，使用与信号抗体连接的核酸序列作为信号放大器，可以获得改善的信号生成。
实施例
实施例1：DVD-IgTM分子的设计、构建和分析
实施例1.1: 用于鉴定和表征亲本抗体和DVD-Ig分子的测定
除非另外指出，下列测定用于实施例始终以鉴定和表征亲本抗体和DVD-Ig分子。
实施例1.1.1: 用于确定亲本抗体和DVD-Ig分子对其一种或多种靶抗原的结合及 亲和力的测定
实施例1.1.1A: 直接结合ELISA(Direct Bind ELISA)
如下实施酶联免疫吸附测定以筛选结合所需靶抗原的抗体。将High bind ELISA板(Corning Costar # 3369, Acton, MA)用100µL/孔的在磷酸盐缓冲盐水(10X PBS,Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073, Worcester, MA)中的10 µg/ml的所需靶抗原(R&D Systems, Minneapolis, MN)或所需靶抗原细胞外结构域/FC融合蛋白(R&D Systems, Minneapolis, MN)或单克隆小鼠抗-多组氨酸抗体(R&D Systems #MAB050, Minneapolis, MN)于4℃包被过夜。将板用含有0.02% Tween 20的PBS洗涤四次。通过添加300 μL/孔封闭溶液(脱脂干奶粉，各个零售供应商，在PBS中稀释到2％)将板在室温封闭1/2小时。封闭后将板用含有0.02% Tween 20的PBS洗涤四次。
可替代地，将一百微升每孔的10 µg/ml的组氨酸(His)标签的所需靶抗原(R&DSystems, Minneapolis, MN)添加到如上所述用单克隆小鼠抗-多组氨酸抗体包被的ELISA板，并于室温孵育1小时。用含有0.02% Tween 20的PBS将孔洗涤四次。
将如上所述在封闭溶液中稀释的一百微升抗体或DVD-Ig制剂添加到如上所述制备的所需靶抗原板或所需靶抗原/FC融合物板或抗-多组氨酸抗体/组氨酸标签的所需靶抗原板，并于室温孵育1小时。用含有0.02% Tween 20的PBS将孔洗涤四次。
将一百微升10 ng/mL的山羊抗人IgG-FC特异性HRP缀合的抗体(SouthernBiotech # 2040-05, Birmingham, AL)添加到所需靶抗原板或抗-多组氨酸抗体/组氨酸标签的所需靶抗原板的各个孔。可替代地，将一百微升10 ng/mL的山羊抗人IgG-κ轻链特异性HRP缀合的抗体(Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL)添加到所需靶抗原/FC融合物板的各个孔，并于室温孵育1小时。用含有0.02% Tween 20的PBS将板洗涤四次。
将一百微升增强的TMB溶液(Neogen Corp. #308177, K Blue, Lexington, KY)添加到各个孔，并于室温孵育10分钟。通过添加50µL 1N硫酸终止反应。将板在450 nm波长分光光度地读数。
在直接结合ELISA中，有时没有观察到结合，可能是因为当包被到塑性表面时靶抗原上的抗体结合位点被“掩蔽”，或抗原“变形”。DVD-Ig分子不能结合其靶可能也是因为直接结合ELISA形式施加于DVD-Ig分子上的空间限制。在直接结合ELISA形式中没有结合的亲本抗体和DVD-Ig分子可以在其他ELISA形式(诸如FACS、Biacore或生物测定)中结合靶抗原。也可以通过调整DVD-Ig分子两个可变结构域之间的接头长度来恢复DVD-Ig分子的不结合，如前文所示。
实施例1.1.1.B: 捕获ELISA
为了通过捕获ELISA确定亲本和DVD-Ig蛋白与IL-1α或IL-1β的结合，将ELISA板(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)与抗人Fc抗体(Pierce Coat缓冲液中2 µg/ml稀释，Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)在4℃孵育过夜。将板在洗涤缓冲液(含有0.05% Tween 20的PBS)中洗涤五次，并用200 µl每孔超封闭封闭缓冲液(Thermoscientific, #37515)在25℃封闭1小时。除去缓冲液，且将在含10%超封闭、0.5% Tween-20的PBS中的2 µg/ml各抗体或DVD-Ig分子添加到孔直至100 µl/每孔，并在25℃孵育1小时。孔在1XPBST 中洗涤5次，且将1 µg/ml 生物素化的抗原以1:6系列稀释滴定(对于含10%超封闭、0.05% Tween-20的PBS中的µg至pg范围)。然后将抗原的每种稀释物添加到板并于25℃孵育1小时。将孔在1XPBST中洗涤五次，然后与聚HRP链霉抗生物素蛋白 (KPL #474-3000, Gaithersburg, MD)在25℃孵育1小时。将孔在1XPBST中洗涤五次，每孔添加100 µlULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL)。显色后用1N HCL终止反应，并测量450nM的吸光度。表3显示了对于靶向IL-1α和IL-1β的DVD-Ig 构建体的捕获ELISA数据，且数值表明人抗IL-1α、抗IL-1β抗体或抗IL-1α/β DVD-Ig蛋白与人IL-1α和/或IL-1β的结合。
表3: 亲本抗体和IL-1α和IL-1β DVD-Ig构建体的捕获ELISA
实施例1.1.1.C: 使用BIACORE技术的亲和力确定
表4: 用于Biacore分析中的试剂
抗原 供应商名称 供应商 目录号
IL-1α 重组人IL-1α R&D systems 200-LA/CF
IL-1β 重组人IL-1β R&D systems 201-LB
BIACORE方法：
BIACORE测定(Biacore, Inc, Piscataway, NJ)用结合速率和解离速率常数的动力学测量来确定抗体或DVD-Ig分子的亲和力。抗体或DVD-Ig分子与靶抗原(例如，纯化的重组靶抗原)的结合通过基于表面等离振子共振的测量，用Biacore® 1000或3000仪器(Biacore® AB，Uppsala，瑞典)使用流动HBS-EP(10 mM HEPES [pH 7.4]，150 mM NaCl，3mM EDTA，和0.005％表面活性剂P20)于25℃进行测定。所有化学品都得自Biacore® AB(Uppsala，瑞典)或否则来自如文中所述的不同来源。例如，使用标准胺偶联试剂盒根据制造商的说明书和程序在25 µg/ml时，将在10 mM 乙酸钠(pH 4.5)中稀释的约5000 RU山羊抗小鼠IgG，(Fcγ)，片段特异性多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)直接固定化在CM5研究级生物传感器芯片上。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。在流动室2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。在流动室1和3中不含山羊抗小鼠IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。对于动力学分析，使用Bioevaluation4.0.1软件，使来源于1：1 Langmuir结合模型的速率方程式同时对所有8次注射(使用总体拟合分析)的结合和解离相拟合。纯化的抗体或DVD-Ig分子在HEPES缓冲盐水中进行稀释，以用于在山羊抗小鼠IgG 特异性反应表面上捕获。将作为配体捕获的抗体或DVD-Ig分子(25 µg/ml)以5 µl/分钟的流速注射在反应基质上。结合和解离速率常数，kon(M-1s-1)和koff(s-1)在25 µl /分钟的连续流速下进行测定。通过在10-200 nM的不同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后通过下式由动力学速率常数来计算抗体或DVD-Ig分子和靶抗原之间反应的平衡解离常数(M)：KD = koff/kon。将结合记录为时间的函数且计算动力学速率常数。在该测定中，可以测量和106 M-1s-1一样快的结合速率以及和10-6 s-1一样慢的解离速率。
表5: 亲本抗体和DVD-Ig构建体的BIACORE分析
通过Biacore技术表征的所有DVD-Ig构建体的结合得到保持，并与亲本抗体的结合相当。N末端可变结构域以与亲本抗体类似的高亲和力结合。
表6: 亲本抗体和DVD-Ig 构建体在食蟹猴IL-1α和IL-1β上的BIACORE分析
通过Biacore技术表征的所有DVD-Ig构建体的结合得到保持，并与亲本抗体的结合相当。N末端可变结构域以与亲本抗体类似的高亲和力结合。
实施例1.1.2: 用于确定亲本抗体和DVD-Ig分子功能活性的测定
实施例1.1.2.A: 细胞因子生物测定
通过确定抗体或DVD-Ig分子的抑制潜力分析抗细胞因子或抗生长因子亲本抗体或含有抗细胞因子或抗生长因子序列的DVD-Ig 分子抑制或中和靶细胞因子或生长因子生物活性的能力。例如，可以使用抗-IL-4抗体抑制IL-4介导的IgE产生的能力。例如，分别通过菲科帕克(Ficoll-paque)密度离心，随后通过磁性分离、然后使用抗-FITC MACS珠粒从外周血血沉棕黄层分离人幼稚B细胞，所述磁性分离使用对人sIgD FITC标记的山羊F(ab)2抗体特异的MACS 珠粒(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 德国)。将磁性分选的幼稚B细胞在XV15中调整到每毫升3 x 105个细胞，并以6 x 6阵列在板中央以100 μl每孔置于(plate out)96孔板中，在37℃于5％ CO2存在下培养10天期间，由填充PBS的孔包围。每个待测抗体制备一个板，由未诱导和诱导的对照以及抗体滴定的五倍重复各三孔组成，所述抗体滴定从7 μg/ml开始并3倍稀释低至29 ng/ml终浓度，添加进50μl四倍浓缩的预稀释物(pre-dilution)中。为了诱导IgE产生，将50 μl 中终浓度各为20 ng/ml的rhIL-4加上0.5 μg/ml的抗-CD40单克隆抗体(Novartis, Basel, 瑞士)添加到各孔，并在培养时间段结束时通过标准夹心ELISA方法确定IgE浓度。
实施例1.1.2.B: 细胞因子释放测定
亲本抗体或DVD-Ig分子引起细胞因子释放的能力得到分析。通过静脉穿刺术从三个健康供体取外周血到肝素化真空(vacutainer)管中。用RPMI-1640培养基将全血1:5稀释，并将其以0.5 mL每孔置于24孔组织培养板中。将抗细胞因子抗体(例如抗-IL-4)稀释到RPMI-1640中，并以0.5 mL/孔置于板中，以得到终浓度200、100、50、10和1 μg/mL。全血在培养板中的最终稀释度为1:10。将LPS和PHA以2µg/mL和5µg/mL的终浓度添加到单独孔中，作为细胞因子释放的阳性对照。使用多克隆人IgG作为阴性对照抗体。一式两份进行实验。将板于37℃在5% CO2下孵育。24小时后，将孔内容物转移到试管中，并于1200 rpm旋转5分钟。收集无细胞上清液并冷冻用于细胞因子测定。用0.5 mL裂解溶液裂解留在板上和管中的细胞，置于–20℃并解冻。添加0.5 mL培养基(以使体积与无细胞上清液样品水平相同)，且收集细胞制备物并冷冻用于细胞因子测定。通过ELISA测定无细胞上清液和细胞裂解液的细胞因子水平，例如IL-8、IL-6、IL-1β、IL-1RA、或TNF-α的水平。
实施例1.1.2.C: 细胞因子交叉反应性研究
针对一种或多种目的细胞因子的抗细胞因子亲本抗体或DVD-Ig分子与其他细胞因子交叉反应的能力得到分析。将亲本抗体或DVD-Ig分子固定化在Biacore生物传感器基质上。通过首先用100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和400mM N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化基质上的羧基，通过游离胺基将抗人Fc mAb共价连接到葡聚糖基质上。将约50μL稀释在乙酸钠(pH4.5)中、浓度为25μg/mL的各抗体或DVD-Ig制剂穿过活化的生物传感器进行注射，且蛋白上的游离胺直接与活化的羧基结合。一般，固定5000共振单位(Resonance Units)((RU’s)。通过注射1 M乙醇胺来失活未反应的基质EDC酯。使用标准胺偶联试剂盒通过固定化人IgG1/K制备第二个流动室(flow cell)作为参考标准。使用CM生物传感器芯片实施SPR测量。将所有将在生物传感器表面上分析的抗原稀释在含有0.01% P20的HBS-EP运行缓冲液中。
为了检查细胞因子结合特异性，将过量的目的细胞因子(100nM，例如可溶性人重组体)穿过抗细胞因子亲本抗体或DVD-Ig分子固定化的生物传感器表面进行注射(5分钟接触时间)。在注射目的细胞因子之前以及紧随其后，HBS-EP缓冲液单独流过每个流动室。用基线和对应于完成细胞因子注射后约30秒的点之间的信号净差异代表最终结合值。再次，测量以共振单位计的应答。在观察到结合事件的情况下，在注射下一个样品之前，使用10mMHCl将生物传感器基质再生，否则将运行缓冲液注射在基质上。同时也将人细胞因子(例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-22、IL-23、IL-27、TNF-α、TNF-β、和IFN-γ)注射在固定化的小鼠IgG1/K参考表面上，以记录任何非特异性结合背景。通过制备参考和反应表面，Biacore可以自动从反应表面数据减去参考表面数据，以消除大部分折射率改变和注射噪声。因此，可能确定归因于抗细胞因子抗体或DVD-Ig分子结合反应的真实结合应答。
当将目的细胞因子穿过固定化的抗细胞因子抗体进行注射时，观察到显著结合。10mM HCl再生完全去除所有非共价结合的蛋白。传感图(sensorgram)检查说明，固定化的抗细胞因子抗体或DVD-Ig分子与可溶性细胞因子的结合是强烈且强有力的。确认用目的细胞因子的预期结果后，对单独各个抗体或DVD-Ig分子测试剩余重组人细胞因子实验对象组。记录各注射循环的抗细胞因子抗体或DVD-Ig分子结合的或未结合的细胞因子的量。使用来自三个独立实验的结果来确定各抗体或DVD-Ig分子的特异性概况。选择对目的细胞因子具有预期的结合、且不结合任何其他细胞因子的抗体或DVD-Ig分子。
实施例1.1.2.D: 组织交叉反应性
以三个阶段完成组织交叉反应性研究，第一阶段包括32个组织的冷冻切片，第二阶段包括最多达38个组织，且第三阶段包括如下所述来自三个不相关成体的额外组织。一般在两个剂量水平完成研究。
第1阶段：将人组织冷冻切片(约5 μm)(来自在尸体解剖或活组织检查获得的一个人供体的32个组织(一般为：肾上腺、胃肠道、前列腺、膀胱、心脏、骨骼肌、血细胞、肾、皮肤、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾、小脑、淋巴结、睾丸、大脑皮质、卵巢、胸腺、结肠、胰、甲状腺、内皮、甲状旁腺、输尿管、眼、垂体、子宫、输卵管和胎盘))在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白－生物素系统实施组织切片的过氧化物酶染色。
第2阶段：将人组织冷冻切片(约5 μm)(来自在尸体解剖或活组织检查获得的3个不相关成体的38个组织(包括肾上腺、血液、血管、骨髓、小脑、大脑、子宫颈、食道、眼、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、乳房乳腺、卵巢、输卵管、胰、甲状旁腺、外周神经、垂体、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、横纹肌、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫))在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白－生物素系统实施组织切片的过氧化物酶染色。
第3阶段：将食蟹猴组织冷冻切片(约5 μm)(来自在尸体解剖或活组织检查获得的3个不相关成体猴的38个组织(包括肾上腺、血液、血管、骨髓、小脑、大脑、子宫颈、食道、眼、心脏、肾、大肠、肝、肺、淋巴结、乳房乳腺、卵巢、输卵管、胰、甲状旁腺、外周神经、垂体、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、横纹肌、睾丸、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫))在物镜上固定并干燥。使用抗生物素蛋白－生物素系统实施组织切片的过氧化物酶染色。
将抗体或DVD-Ig分子与第二生物素化的抗人IgG孵育，并发展为免疫复合物。将终浓度为2和10 μg/mL抗体或DVD-Ig分子的免疫复合物添加至物镜上的组织切片上，然后使组织切片与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶试剂盒反应30分钟。随后，应用过氧化物酶反应底物DAB(3,3'-二氨基联苯胺)4分钟用于组织染色。使用抗原－琼脂糖珠粒作为阳性对照组织切片。靶抗原和人血清封闭研究作为额外对照。将终浓度为2和10 μg/mL 抗体或DVD-Ig分子的免疫复合物与靶抗原(终浓度100 µg/ml)或人血清(终浓度10％)预孵育30分钟，然后添加至物镜上的组织切片上，然后使组织切片与抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶试剂盒反应30分钟。随后，应用过氧化物酶反应底物DAB(3,3'-二氨基联苯胺)4分钟用于组织染色。
基于正被讨论的靶抗原的已知表达，将任何特异性染色判断为预期的(例如，与抗原表达一致)或非预期的反应性。对任何判断为特异性的染色关于强度和频率评分。将第2阶段(人组织)和第3阶段(食蟹猴组织)之间的组织染色判断为类似或不同的。
实施例1.1.2.E: IL-1α/β生物测定和中和测定
实施例1.1.2.E.1: 对于单克隆抗体的人IL-1α和IL-1β生物测定
为了检查本发明的抗人IL-1α和抗人IL-1β抗体的功能活性，在MRC-5生物测定中筛选抗体。MRC-5细胞系是人肺成纤维细胞系，其以剂量依赖的方式响应于人IL-1α或β产生人IL-8。MRC-5细胞系还与食蟹猴IL-1α和IL-1β交叉反应。抗体效价基于抗体抑制IL-1α或β诱导的人IL-8细胞因子的能力。MRC-5细胞(最初从ATCC获得)在37°C、5% CO2培养箱中在含有10％FBS的完全MEM中生长和培养。在测定前一天，将MRC5细胞以1 x 104铺板在96孔平底板(Costar# 3599)的100 μL体积中，然后在37℃、5% CO2培养过夜。测定当天，在完全MEM培养基中制备4x工作抗体和人IL-1α或人IL-1β或食蟹猴IL-1α或食蟹猴IL-1β抗原原液。在完全MEM中在阻断测定板中进行8点系列抗体稀释(10-0.0001 nM范围)。65 μL稀释抗体一式四份转移到96孔V型底板(Costar# 3894)中，然后将65 μL适当抗原的4x 原液(200 pg/mL)添加到含有抗体孔中。将65 μL抗原(200 pg/mL)和65 μL MEM培养基置于抗原对照孔中。培养基对照孔接受130 μL MEM培养基。1小时孵育后，将100 μL Ab/Ag混合物添加到MRC-5细胞中。孔体积等于200 μL/孔且所有试剂都是1X最终浓度。孵育过夜(16-24小时)后，将150μL上清液转移到96孔圆底板(Costar# 3799)中，且将板置于-20℃冰箱中。使用hIL-8ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)或MSD hIL-8(化学发光试剂盒)测试上清液的人IL-8水平。通过相对于单独抗原对照值计算百分比抑制而确定抗体中和效价。
实施例1.1.2.E.2: 抗IL-1α/β DVD-Ig蛋白的IL-1α/β生物测定
为了检查本发明的抗人IL-1α和β DVD-Ig蛋白的功能活性，在MRC-5生物测定中筛选DVD-Ig蛋白。MRC-5细胞系是人肺成纤维细胞系，其以剂量依赖的方式响应于人IL-1α和β和食蟹猴IL-1α产生人IL-8。DVD-Ig分子效价基于DVD-Ig分子抑制IL-1诱导的hIL-8细胞因子的能力。MRC-5细胞(最初从ATCC获得)在37°C、5% CO2培养箱中在含有10％FBS的完全MEM中生长和培养。在测定前一天，将MRC5细胞以1 x 104铺板在96孔平底板(Costar# 3599)的100 μL体积中，然后在37℃、5% CO2培养过夜。测定当天，在完全MEM培养基中制备DVD-Ig分子的4x工作抗体、hIL-1α和hIL-1β或食蟹猴IL-1α和食蟹猴IL-1β抗原原液。测定当天，在完全MEM中在阻断测定板中进行8点DVD-Ig分子系列稀释(100-0.0001 nM范围)。65 μL稀释DVD-Ig分子一式四份转移到96孔v型底板(Costar# 3894)中，然后将65 μL IL-1α或IL-1β的4x 原液(200 pg/mL)添加到含有DVD-Ig分子孔中。将65 μL IL-1α(200 pg/mL)或65 μLIL-1β (200 pg/mL)置于具有65 μL MEM培养基的抗原对照孔中。培养基对照孔接受130 μLMEM培养基。1小时孵育后，将100 μL DVD-Ig/Ag混合物添加到MRC-5细胞中。孔体积等于200μL/孔且所有试剂都是1X最终浓度。孵育过夜(16-24小时)后，将150 μL上清液转移到96孔圆底板(Costar# 3799)中，且将板置于-20℃冰箱中。通过使用人IL-8 ELISA试剂盒(R&DSystems, Minneapolis, MN)或MSD hIL-8(化学发光试剂盒)测试上清液的hIL-8水平。通过相对于单独IL-1α或IL-1β对照值计算百分比抑制而确定DVD-Ig分子中和效价。表7表明IL-1α亲本抗体和IL-1α和IL-1β DVD-Ig蛋白对人IL-1α的中和。表8表明IL-1β亲本抗体和IL-1α和IL-1β DVD-Ig蛋白对人IL-1β的中和。表9表明IL-1α亲本抗体和IL-1α和IL-1βDVD-Ig蛋白对食蟹猴IL-1α的中和。表10表明IL-1β亲本抗体和IL-1α和IL-1β DVD-Ig蛋白对食蟹猴IL-1β的中和。
表7: 使用IL-1α亲本抗体和DVD-Ig构建体的人IL-1α的中和测定
NA:不适用。
所有DVD-Ig分子在MRC5 IL-1α/β中和测定中显示中和。
表8: 使用IL-1β亲本抗体和DVD-Ig构建体的人IL-1β中和测定
NA: 不适用。
所有DVD-Ig分子在MRC5 IL-1α/β中和测定中显示中和。
表9: 使用IL-1α亲本抗体和DVD-Ig构建体的食蟹猴IL-1α中和测定
NA:不适用。
所有DVD-Ig分子在MRC5 IL-1α/β中和测定中显示中和。
表10: 使用IL-1β亲本抗体和DVD-Ig构建体的食蟹猴IL-1β的中和测定
NA: 不适用。
所有DVD-Ig分子在MRC5 IL-1α/β中和测定中显示中和。
实施例1.1.2.F: 肿瘤受体单克隆抗体或DVD-Ig分子在体外的生长抑制作用
将20µL稀释在D-PBS-BSA(含有0.1% BSA的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)中的肿瘤受体单克隆抗体或DVD-Ig分子以180 µL 中0.01 µg/mL-100 µg/mL的终浓度添加到人肿瘤细胞中。将板于37℃在湿润的5% CO2气氛中孵育3天。根据制造商说明书使用MTS试剂(Promega, Madison, WI)定量各孔中活细胞的数目，以确定肿瘤生长抑制百分比。将没有抗体处理的孔用作0％抑制对照，而将没有细胞的孔视为显示100％抑制。
实施例1.1.2.G: 亲本抗体或DVD-Ig分子在体外的杀肿瘤作用
可以对结合肿瘤细胞上靶抗原的亲本抗体或DVD-Ig分子分析杀肿瘤活性。简而言之，将亲本抗体或DVD-Ig分子稀释在D-PBS-BSA(含0.1％BSA的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)中，且以200μL 中0.01 μg/mL-100 μg/mL的终浓度添加到人肿瘤细胞中。将板在湿润的5％ CO2气氛中于37℃孵育三天。根据制造商的说明书(Promega, Madison, WI)使用MTS试剂定量各孔中的活细胞数目以确定肿瘤生长抑制百分比。使用未经抗体处理的孔作为0％抑制的对照，而将没有细胞的孔视为显示100％抑制。
为了评估凋亡，通过下列方案确定半胱天冬酶-3活化：将96孔板中经抗体处理的细胞于室温在120 μl 1x裂解缓冲液(1.67mM Hepes, pH 7.4, 7mM KCl, 0.83mM MgCl2,0.11mM EDTA, 0.11mM EGTA, 0.57% CHAPS, 1mM DTT,1x蛋白酶抑制剂混合物片剂；无EDTA；Roche Pharmaceuticals，Nutley，NJ)中伴随振荡裂解20分钟。细胞裂解后，添加80 μl半胱天冬酶-3反应缓冲液(48mM Hepes, pH 7.5, 252mM蔗糖，0.1% CHAPS，4mM DTT，和20μM Ac-DEVD-AMC底物；Biomol Research Labs, Inc., Plymouth Meeting, PA)，并将板在37℃孵育2小时。使用下列设置在1420 VICTOR Multilabel Counter (Perkin Elmer LifeSciences, Downers Grove, IL)上阅读板：激发＝360/40，发射＝460/40。来自抗体处理的细胞相对于同种型抗体对照处理的细胞的荧光单位的增加指示凋亡。
实施例1.1.2.H: 亲本抗体和DVD-Ig构建体对细胞增殖的抑制
将U87-MG人神经胶质瘤细胞在补加5％胎牛血清的RPMI培养基中以2,000个细胞/孔、100 μl铺板于96孔皿中，并于37℃、5% CO2孵育过夜。次日用抗体或DVD-Ig分子的连续稀释液(0.013 nM至133 nM剂量范围)处理细胞，并在湿润的5% CO2气氛中于37℃孵育5天。通过根据制造商说明书使用ATPlite试剂盒(Perkin Elmer, Waltham, MA)评估ATP水平，间接测量细胞存活/增殖。
实施例1.1.2.I: 亲本抗体或DVD-Ig构建体在体外对受体磷酸化的抑制
将人癌细胞以40,000细胞/孔在180 µl无血清培养基(DMEM+ 0.1% BSA)中铺板到96孔板，并于37℃、5% CO2孵育过夜。将Costar EIA板(Lowell, MA)用100 µl/孔的受体捕获Ab(4 µg/ml终浓度)包被并于室温振荡孵育过夜。次日，洗涤受体抗体包被的ELISA板(用PBST = 在PBS中的0.05% Tween 20，pH 7.2 - 7.4，三次)，且添加200 µl封闭溶液(1%BSA, 0.05% NaN3，在PBS中，pH 7.2 - 7.4)以在振荡器上于室温封闭2小时。将人肿瘤细胞与抗体或DVD-Ig分子和配体共孵育。将稀释在D-PBS-BSA(含0.1% BSA的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)中的单克隆抗体或DVD-Ig分子以0.01 µg/mL-100 µg/mL的终浓度添加到人癌细胞。同时将生长因子以1-100ng/mL(200 µL)的浓度添加到细胞，并将细胞在湿润的5% CO2气氛中于37℃孵育1小时。将细胞在120 µl/孔的冷细胞提取缓冲液(10 mM Tris, pH 7.4,100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM原钒酸钠，1% Triton X-100，10%甘油，0.1% SDS和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解，并于4℃伴随振荡孵育20分钟。将细胞裂解物(100 µl)添加至ELISA板，并于4℃伴随温和振荡孵育过夜。次日，将ELISA板洗涤，并添加100 µl/孔的pTyr-HRP检测Ab(p-IGF1R ELISA试剂盒，R&D System # DYC1770,Minneapolis, MN)，且将板在25℃于暗处孵育2小时。根据制造商说明书将板显色以确定磷酸化。
实施例1.1.2.J: DVD-Ig分子对人癌皮下侧腹异种移植物(Human Carcinoma Subcutaneous Flank Xenografts)生长的效力
使A-431人表皮样癌细胞在组织培养瓶中体外生长至99%生存力、85％汇合。在研究第0日将1 x 106个人肿瘤细胞(1:1基质胶)皮下注射到19-25克SCID雌性小鼠(CharlesRivers Labs, Wilmington, MA)右侧腹。将小鼠按大小匹配到平均肿瘤体积约200至320mm3的小鼠组后，开始施用人IgG对照或DVD-Ig分子(IP，QD，3x/周)。从肿瘤细胞注射后约10天开始，每周测量肿瘤两次。
实施例1.2: 针对目的人抗原的亲本单克隆抗体的生成
如下所述获得结合和中和目的人抗原的亲本小鼠mAbs及其变体：
实施例1.2.A: 用目的人抗原免疫小鼠
在第1天时，将与完全弗氏佐剂或Immunoeasy 佐剂(Qiagen, Valencia, CA)混合的20微克重组纯化的人抗原(例如IL-1α或IL-1β)皮下注射到5只6-8周龄的Balb/C、5只C57B/6小鼠和5只AJ小鼠中。在第24、38和49天时，将与不完全弗氏佐剂或Immunoeasy 佐剂混合的20微克重组纯化的人抗原变体皮下注射到相同小鼠中。在第84天或第112天或第144天时，用1 μg重组纯化的目的人抗原静脉内注射小鼠。
实施例1.2.B: 杂交瘤的生成
根据Kohler, G. 和Milstein (1975) Nature, 256:495所述确立的方法将从实施例1.2.A所述免疫的小鼠获得的脾细胞与SP2/O-Ag-14细胞以5:1的比例融合以生成杂交瘤。将融合产物以2.5x106个脾细胞/孔的密度铺板在96孔板中含有重氮丝氨酸和次黄嘌呤的选择培养基中。融合后7-10天，观察到肉眼可见的杂交瘤集落。通过ELISA就针对目的抗原的抗体的存在测试来自含有杂交瘤集落的每个孔的上清液(例如，如实施例1.1.1.A中所述)。然后就活性测试展示抗原特异性活性的上清液(例如，如实施例1.1.2的测定中所述)，例如，在生物测定中中和目的抗原的能力，例如，诸如在实施例1.1.2.E中所述的那种)。
实施例1.2.C: 针对目的人靶抗原的亲本单克隆抗体的鉴定和表征
实施例1.2.C.1: 分析亲本单克隆抗体中和活性
就结合目的抗原的亲本抗体的存在测定杂交瘤上清液，根据实施例1.2.A和1.2.B生成，且也能够结合目的抗原的变体(“抗原变体”)。然后测试在两个测定中抗体阳性的上清液的抗原中和效价，例如在实施例1.1.2.E的细胞因子生物测定中。通过有限稀释按比例增加和克隆产生抗体的杂交瘤，所述抗体在生物测定中的IC50值小于1000pM，在一个实施方案中，小于100pM。将杂交瘤细胞扩增到含有10%低IgG胎牛血清(Hyclone #SH30151,Logan, UT)的培养基中。平均起来，如Harlow和Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual所述，收获、浓缩和通过A蛋白亲和层析纯化250 mL每种杂交瘤上清液(衍生自克隆群体)。例如，使用如实施例1.1.2.E所述的细胞因子生物测定，测定纯化的mAbs抑制其靶抗原的活性的能力。
实施例1.2.C.2: 分析亲本单克隆抗体与目的食蟹猴靶抗原的交叉反应性
为了测定本文描述的选择的mAbs是否识别目的食蟹猴抗原，如本文所述(实施例1.1.1.C)使用重组食蟹猴靶抗原进行BIACORE分析。此外，也可以在细胞因子生物测定中测量mAbs针对重组目的食蟹猴抗原的中和效价(实施例1.1.2.E)。选择具有良好食蟹猴交叉反应性(在一个实施方案中，在关于人抗原的5-倍反应性内)的mAbs用于进一步的表征。
实施例1.2.D: 确定每个鼠抗-人单克隆抗体的可变区的氨基酸序列
如下所述进行重组抗-人小鼠mAbs的cDNAs分离、表达和表征。对于每个氨基酸序列确定，根据生产商的说明书通过离心分离约1 x 106个杂交瘤细胞，且进行处理以用Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.)分离总RNA。根据生产商的说明书，使用SuperScript第一链合成系统(First-Strand Synthesis System)(Invitrogen,Carlsbad, CA)使总RNA进行第一链DNA合成。将寡脱氧胸苷酸(Oligo(dT))用于引发第一链合成以选择聚腺苷酸+RNA(poly(A)+RNA)。然后用设计用于扩增鼠免疫球蛋白可变区的引物(Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, WI)通过PCR扩增第一链cDNA产物。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物、切割、纯化且然后用TOPO克隆试剂盒亚克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，并转化到TOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen,Carlsbad, CA)中。在转化体上进行集落PCR以鉴定含有插入片段的克隆。使用QIAprep小量制备试剂盒(Miniprep kit)(Qiagen, Valencia, CA)从含有插入片段的克隆分离质粒DNA。使用M13正向和M13反向引物(Fermentas Life Sciences, Hanover MD)在两条链上对质粒中的插入片段进行测序，以确定可变重链和可变轻链DNA序列。鉴定mAbs的可变重链和可变轻链序列。在一个实施方案中，关于用于下一步开发(人源化)的最重要(lead)mAbs实验对象组的选择标准包括下述：
■ 除CH2中的标准N-连接的糖基化位点(NXS)外，抗体不含任何N-连接的糖基化位点
■ 除了每个抗体中的正常半胱氨酸外，抗体不含任何额外的半胱氨酸
■ 将抗体序列与关于VH和VL的最接近的人种系序列进行比对，且应检查任何稀有氨基酸在其他天然人抗体中的出现
■ 如果不影响抗体的活性，将N末端谷氨酰胺(Q)改变为谷氨酸(E)。这将减少由于Q环化造成的异质性
■ 通过质谱分光光度法证实有效信号序列切割。这可以用COS细胞或293细胞材料进行
■ 检查蛋白序列的Asn脱酰胺风险，这将导致活性的丧失
■ 抗体具有低聚集水平
■ 抗体具有>5-10 mg/ml(在研究阶段)；>25 mg/ml的溶解度
■ 抗体具有通过动态光散射(DLS)确定的正常大小(5-6 nm)
■ 抗体具有低电荷异质性
■ 抗体缺乏细胞因子释放(参见实施例1.1.2.B)
■ 抗体对预期的细胞因子具有特异性(参见实施例1.1.2.C)
■ 抗体缺乏预料不到的组织交叉反应性(参见实施例1.1.2.D)
■ 抗体在人和食蟹猴组织交叉反应性之间具有相似性(参见实施例1.1.2.D)。
实施例1.2.2: 重组人源化亲本抗体
实施例1.2.2.1: 重组嵌合抗人亲本抗体的构建和表达
通过在细菌中的同源重组，将编码鼠抗-人亲本mAbs的重链恒定区的DNA用编码含有2个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段替换。这些突变是在位置234(EU编号)的亮氨酸至丙氨酸的改变和在位置235的亮氨酸至丙氨酸的改变(Lund等人(1991) J.Immunol. 147:2657)。每个这些抗体的轻链恒定区被人κ恒定区替换。通过连接到pBOS表达质粒中的嵌合重链和轻链cDNAs的共转染在COS细胞中瞬时表达全长嵌合抗体(Mizushima和Nagata (1990) Nucl. Acids Res. 18: 5322)。通过蛋白A琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。将抗体中和且透析到PBS中。
将编码嵌合mAb的重链cDNA与其嵌合轻链cDNA(两者都连接到pBOS载体中)共转染到COS细胞中。通过蛋白A琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。将抗体中和且透析到PBS中。
然后测试纯化的嵌合抗-人亲本mAbs的结合能力(通过Biacore)和功能活性，例如，如实施例1.1.1.C和1.1.2.B所述。选择维持亲本杂交瘤mAbs的活性的嵌合mAbs用于进一步开发。
实施例1.2.2.2: 人源化抗人亲本抗体的构建和表达
实施例1.2.2.2.A: 人抗体构架的选择
使用Vector NTI软件，将每个鼠可变重链和可变轻链基因序列分别与44个人免疫球蛋白种系可变重链或46个种系可变轻链序列(来源于在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.的NCBI Ig Blast网站)进行比对。
人源化基于氨基酸序列同源性、CDR簇分析、表达的人抗体中的使用频率和关于人抗体晶体结构的可用信息。考虑对抗体结合、VH-VL配对和其他因素的可能作用，在鼠和人构架残基不同的地方将鼠残基突变为人残基，有少许例外。基于人种系抗体序列或其亚组的分析设计另外的人源化策略，所述人种系抗体序列或其亚组与鼠抗体可变区的实际氨基酸序列具有高度同源性，即，序列相似性。
将同源性建模用于鉴定对于鼠抗体序列独特的残基，预测所述残基对于抗体结合位点CDRs的结构是至关重要的。同源性建模是计算方法，由此生成蛋白的近似三维坐标。初始坐标的来源和其进一步改善的指导是第二种蛋白，即参考蛋白，所述参考蛋白的三维坐标是已知的，且其序列与第一种蛋白的序列相关。两个蛋白序列间的关系用于生成参考蛋白和需要其坐标的蛋白，即靶蛋白之间的对应性。参考和靶蛋白的一级序列进行比对，其中两种蛋白相同部分的坐标直接从参考蛋白转移到靶蛋白。两种蛋白的错配部分，例如来自残基突变、插入或缺失的坐标从通用结构模板构建，且能量进行改善以确保与已经转移的模型坐标的一致性。这种计算的蛋白结构可进一步改善或直接用于建模研究中。模型结构的质量由参考和靶蛋白相关的观点的正确性和构建序列比对的精确性确定。
对于鼠mAbs，使用BLAST搜索和目视检查的组合来鉴定适当的参考结构。参考和靶氨基酸序列之间25％的序列同一性被认为是尝试同源性建模实施所必需的最低条件。手工构建序列比对，且使用程序Jackal生成模型坐标(参见Petrey 等人(2003) Proteins 53(增刊6):430–435)。
选择的抗体的鼠和人构架区的一级序列共享相当大同一性。不同的残基位置是用于在人源化序列中包括鼠残基以保留鼠抗体观察到的结合效价的候选物。手工构建在人和鼠序列之间不同的构架残基列表。表11显示了选择用于该研究的构架序列。
表11: 人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列
给定构架残基将影响抗体的结合性质的可能性依赖于其与CDR残基的接近度。因此，使用模型结构，在鼠和人序列之间不同的残基根据其离CDRs中任何原子的距离进行排序。落在任何CDR原子的4.5 Å内的那些残基被鉴定为最重要的，且被推荐为用于在人源化抗体中保持鼠残基(即，回复突变)的候选物。
使用寡核苷酸构建在计算机芯片上构建的人源化抗体。对于每个可变区cDNA，设计各60-80个核苷酸的6个寡核苷酸以在每个寡核苷酸的5’和/或3’末端相互重叠20个核苷酸。在退火反应中，组合所有6个寡核苷酸，煮沸，且在dNTPs的存在下退火。添加DNA聚合酶I，大(克列诺(Klenow))片段(New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.)以补平重叠寡核苷酸之间的约40bp缺口。使用两个最外面的引物进行PCR以扩增整个可变区基因，所述两个最外面的引物含有与修饰的pBOS载体中的多克隆位点互补的突出端序列(Mizushima和Nagata (1990) Nucl. Acids Res. 18: 17)。在琼脂糖凝胶上分离源自每个cDNA装配的PCR产物，且切割和纯化对应于预测的可变区cDNA大小的条带。通过在细菌中的同源重组将重可变区符合读框地插入编码含有2个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段上。这些突变是在位置234(EU编号)的亮氨酸至丙氨酸的改变和在位置235的亮氨酸至丙氨酸的改变(Lund等人(1991) J. Immunol. 147:2657)。通过同源重组将轻链可变区与人κ恒定区一起符合读框地插入。分离细菌集落且提取质粒DNA。对cDNA插入片段进行整体测序。将对应于每种抗体的正确人源化重链和轻链共转染到COS细胞中以瞬时产生全长人源化抗-人抗体。通过蛋白A琼脂糖层析纯化含有重组嵌合抗体的细胞上清液，且通过添加酸缓冲液洗脱结合的抗体。中和抗体并将其透析到PBS中。
实施例1.2.2.3: 人源化抗体的表征
例如，使用如实施例1.1.2.A中所述的细胞因子生物测定测定纯化的人源化抗体抑制功能活性的能力。使用如实施例1.1.1.B中所述的表面等离振子共振(Biacore®)测量测定人源化抗体与重组人抗原的结合亲和力。对人源化抗体的来自生物测定的IC50值和亲和力进行排序。选择完全维持亲本杂交瘤mAbs的活性的人源化mAbs作为用于进一步开发的候选物。对顶部的2-3个最有利的人源化mAbs进行进一步表征。
实施例1.2.2.3.A: 人源化抗体的药物代谢动力学分析
在Sprague-Dawley大鼠和食蟹猴中进行药物代谢动力学研究。用单剂量4 mg/kgmAb对雄性和雌性大鼠和食蟹猴进行静脉内或皮下给药，且使用抗原捕获ELISA分析样品，并且通过非区室分析测定药物代谢动力学参数。简而言之，用山羊抗生物素抗体(5 mg/ml，4℃，过夜)包被ELISA板，用Superblock(Pierce)封闭，且在室温与在10% Superblock TTBS中50 ng/ml的生物素化的人抗原孵育2小时。连续稀释血清样品(0.5%血清，10%Superblock，在TTBS中)，且于室温在板上孵育30分钟。使用HRP-标记的山羊抗人抗体进行检测，且使用4参数逻辑拟合借助标准曲线测定浓度。使用WinNonlin软件(PharsightCorporation, Mountain View, CA)通过非区室模型测定关于药物代谢动力学参数的值。选择具有良好药物代谢动力学概况的人源化mAbs(T1/2为8-13天或更好，具有低清除率和优异的生物利用度50-100%)。
实施例1.2.2.3.B: 人源化单克隆抗体的物理化学和体外稳定性分析
大小排阻层析
用水将抗体稀释到2.5 mg/mL，且使用TSK gel G3000 SWXL柱(TosohBioscience, 目录号 k5539-05k)在Shimadzu HPLC系统上对20 mL进行分析。用211 mM硫酸钠，92 mM磷酸钠，pH 7.0，以0.3 mL/分钟的流速从柱洗脱样品。HPLC系统操作条件如下：
流动相: 211 mM Na2SO4, 92 mM Na2HPO4*7H2O, pH 7.0
梯度: 等度
流速: 0.3 mL/分钟
检测器波长: 280 nm
自动进样器冷却器温度: 4℃
柱温箱温度: 环境
运行时间: 50 分钟。
表12含有如通过上述方案测定的表示为百分比单体(预期分子量的非聚集蛋白)的亲本抗体和DVD-Ig构建体的纯度数据。
表12: 如通过大小排阻层析测定的亲本抗体和DVD-Ig构建体的纯度
DVD-Ig分子显示优异的SEC概况，其中大多数DVD-Ig分子显示>94%的单体。这种DVD-Ig概况类似于关于亲本抗体观察到的概况。
SDS-PAGE
通过在还原和非还原条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析抗体。将阿达木单抗批次AFP04C用作对照。对于还原条件，将样品与具有100 mM DTT的2X tris甘氨酸SDS-PAGE 样品缓冲液(Invitrogen, 目录号 LC2676, 批号 1323208)1:1混合，并于60℃加热30分钟。对于非还原条件，将样品与样品缓冲液1:1混合，并于100℃加热5分钟。将还原的样品(10 mg/泳道)加样到12%预制tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen, 目录号 EC6005box, 批号 6111021)上，且将非还原样品(10 mg/泳道)加样到8%-16%预制tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen, 目录号 EC6045box, 批号 6111021)上。SeeBlue Plus 2(Invitrogen, 目录号LC5925, 批号 1351542)用作分子量标记。凝胶在XCell SureLockmini cell凝胶盒(Invitrogen, 目录号 EI0001)中运行，且通过首先应用75的电压以将样品堆积在凝胶中，随后应用125的恒定电压直至染料前沿到达凝胶的底部来分离蛋白。使用的运行缓冲液为1X tris甘氨酸SDS缓冲液，其从10X tris甘氨酸SDS缓冲液(ABC, MPS-79-080106))制备。凝胶用胶态蓝染料(Invitrogen 目录号 46-7015, 46-7016)染色过夜，且用Milli-Q水脱染，直至背景是清楚的。然后使用Epson Expression扫描仪(型号1680，S/NDASX003641)扫描染色的凝胶。
沉降速度分析
将抗体加样到3个标准二区碳环氧类树脂中心杯(two-sector carbon eponcenterpieces)的每一个的样品室中。这些中心杯具有1.2 cm光程长度，且制造具有蓝宝石窗口。使用PBS作为参考缓冲液，且各室含有140 µL。使用4孔(AN-60Ti)转子在BeckmanProteomeLab XL-I分析型超速离心机(系列号 PL106C01)中同时检查所有样品。
运行条件是编程的，且使用ProteomeLab(v5.6)进行离心控制。分析前允许样品和转子热平衡一小时(20.0 ± 0.1℃)。在3000 rpm实施正确的细胞加样的确认，并对各室记录单一扫描。沉降速度条件如下：
样品室体积: 420 mL
参考室体积: 420 mL
温度: 20℃
转子速度: 35,000 rpm
时间: 8:00小时
UV波长: 280 nm
径向步长(Radial Step Size): 0.003 cm
数据收集: 每步一个数据点，信号不取平均值。
扫描总数: 100。
完整抗体的LC-MS分子量测量
通过LC-MS分析完整抗体的分子量。用水将各抗体稀释到约1 mg/mL。使用具有蛋白microtrap (Michrom Bioresources, Inc,目录号 004/25109/03)的1100 HPLC(Agilent)系统脱盐，并将5 mg样品导入API Qstar pulsar i质谱仪(AppliedBiosystems)。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A(在HPLC水中的0.08% FA，0.02% TFA)和流动相B(在乙腈中的0.08% FA和0.02% TFA)以50 mL/分钟流速运行梯度。在4.5千伏喷射电压以2000至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
抗体轻和重链的LC-MS分子量测量
通过LC-MS分析抗体轻链(LC)、重链(HC)和去糖基化HC的分子量测量。用水将抗体稀释到1 mg/mL，并用终浓度10 mM的DTT在37℃将样品还原为LC和HC，进行30分钟。为了将抗体去糖基化，将100 mg抗体与2 mL的PNGase F、5 mL的10% N-辛基葡糖苷以总体积100mL在37℃孵育过夜。去糖基化后，用终浓度10 mM的DTT将样品在37℃还原30分钟。使用具有C4柱(Vydac, 目录号214TP5115, S/N 060206537204069)的Agilent 1100 HPLC系统脱盐并将样品(5 mg)导入API Qstar pulsar i质谱仪(Applied Biosystems)。使用短梯度来洗脱样品。用流动相A(在HPLC水中的0.08% FA，0.02% TFA)和流动相B(在乙腈中的0.08% FA和0.02% TFA)以50 mL/分钟流速运行梯度。在4.5千伏喷射电压以800至3500质荷比的扫描范围操作质谱仪。
肽作图
用75 mM碳酸氢铵中的6 M盐酸胍的终浓度在室温将抗体变性15分钟。变性的样品用终浓度10 mM的DTT于37℃还原60分钟，随后用50 mM碘乙酸(IAA)在黑暗中于37℃烷化30分钟。烷化后，将样品于4℃针对4升10 mM碳酸氢铵透析过夜。将透析的样品用10 mM碳酸氢铵，pH 7.8稀释到1 mg/mL，且100 mg抗体用胰蛋白酶(Promega, 目录号 V5111)或Lys-C(Roche, 目录号 11 047 825 001)以1:20(w/w)胰蛋白酶/Lys-C:抗体比例于37℃消化4小时。用1 mL的1 N HCl猝灭消化。对于利用质谱仪检测的肽作图，利用Agilent 1100 HPLC系统在C18柱(Vydac, 目录号 218TP51, S/N NE9606 10.3.5)上通过反相高效液相层析(RPHPLC)分离40 mL消化物。利用使用流动相A(在HPLC等级水中的0.02% TFA和0.08% FA)和流动相B(在乙腈中的0.02% TFA和0.08% FA)的梯度以50 mL/分钟的流速运行肽分离。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。
二硫键作图
为了使抗体变性，将100 mL抗体与300 mL 100 mM碳酸氢铵中的8 M盐酸胍混合。检查pH以确保它在7和8之间，且在终浓度6 M的盐酸胍中于室温使样品变性15分钟。用Milli-Q 水将一部分变性的样品(100 mL)稀释到600 mL，以给出1 M的最终盐酸胍浓度。将样品(220 mg)用胰蛋白酶(Promega, 目录号V5111, 批号 22265901)或Lys-C(Roche, 目录号 11047825001, 批号 12808000)以1:50胰蛋白酶或1:50 Lys-C:抗体(w/w)比例(4.4mg酶:220 mg样品)于37℃消化约16小时。将另外5 mg胰蛋白酶或Lys-C添加到样品，且允许于37℃进行消化另外2小时。通过向每一种样品添加1 mL TFA终止消化。使用在AgilentHPLC系统上的C18柱(Vydac, 目录号218TP51 S/N NE020630-4-1A)通过RPHPLC分离消化的样品。以50 mL/分钟的流速利用与用于肽作图的相同的梯度运行分离，其中使用流动相A(在HPLC等级水中的0.02% TFA和0.08% FA)和流动相B(在乙腈中的0.02% TFA和0.08%FA)。HPLC操作条件与对于肽作图使用的那些相同。API QSTAR Pulsar i质谱仪以正模式在4.5千伏喷射电压和800-2500质荷比的扫描范围操作。通过匹配肽的观察到的MWs与通过二硫键连接的胰蛋白酶消化或Lys-C肽的预测MWs来指定二硫键。
游离巯基的确定
用于定量抗体中游离半胱氨酸的方法基于Ellman氏试剂，5,5’-二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)与巯基(SH)的反应，其产生特征性的生色产物5-硫代-(2-硝基苯甲酸)(TNB)。该反应以下式阐明：
DTNB + RSH ® RS-TNB + TNB- + H+。
使用Cary 50分光光度计在412 nm测量TNB-的吸光度。使用2巯基乙醇(b-ME)稀释物作为游离SH标准绘制吸光度曲线，且从样品在412 nm的吸光度确定蛋白中的游离巯基浓度。
通过用HPLC等级水将14.2 M b-ME连续稀释到终浓度0.142 mM而制备b-ME标准原液。然后制备各浓度的一式三份的标准品。使用amicon ultra 10,000 MWCO离心滤器(Millipore, 目录号 UFC801096, 批号 L3KN5251)将抗体浓缩到10 mg/mL，且将缓冲液改为用于阿达木单抗的制剂缓冲液(5.57 mM磷酸二氢钠，8.69 mM磷酸氢二钠，106.69 mMNaCl，1.07 mM柠檬酸钠，6.45 mM柠檬酸，66.68 mM甘露糖醇，pH 5.2，0.1%(w/v)Tween)。将样品于室温在摇床上混合20分钟。然后将180 mL的100 mM Tris缓冲液，pH 8.1添加到各样品和标准品，随后添加300 mL在10 mM磷酸缓冲液，pH 8.1中的2 mM DTNB。彻底混合后，在Cary 50分光光度计上测量样品和标准品于412 nm的吸收。通过绘制游离SH量和b-ME标准品的OD412 nm获得标准曲线。减去空白值后，基于该曲线计算样品的游离SH含量。
弱阳离子交换层析
用10 mM磷酸钠，pH 6.0将抗体稀释到1 mg/mL。使用具有WCX-10 ProPac分析型柱(Dionex，目录号054993，S/N 02722)的Shimadzu HPLC系统分析电荷异质性。在80%流动相A(10 mM磷酸钠，pH 6.0)和20%流动相B(10 mM磷酸钠，500 mM NaCl，pH 6.0)中将样品加样在柱上，并以1.0 mL/分钟的流速洗脱。
寡糖概况分析
用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记试剂衍生化PNGase F处理抗体后释放的寡糖。通过正相高效液相层析(NPHPLC)分离荧光标记的寡糖，并基于与已知标准品的保留时间比较对寡糖的不同形式进行表征。
首先用PNGaseF消化抗体，以从重链Fc部分切割N-连接的寡糖。将抗体(200 mg)与2 mL PNGase F和3 mL 10% N-辛基葡糖苷一起置于500 mL Eppendorf管中。加入磷酸盐缓冲盐水，以使终体积达到60 mL。将样品在设定为700 RPM的Eppendorf恒温混合器中于37℃孵育过夜。阿达木单抗批次AFP04C也以PNGase F消化作为对照。
PNGase F处理后，将样品在设定为750 RPM的Eppendorf恒温混合器中于95℃孵育5分钟，以沉淀出蛋白，然后将样品置于在10,000 RPM的Eppendorf离心机中2分钟以离心沉淀的蛋白。将含有寡糖的上清液转移到500 mL Eppendorf管中并在加速真空(speed-vac)中于65℃干燥。
使用从Prozyme(目录号GKK-404, 批号 132026)采购的2AB标记试剂盒将寡糖用2AB标记。根据制造商说明书制备标记试剂。将乙酸(150 mL，试剂盒中提供)添加到DMSO小瓶(试剂盒中提供)，并通过上下移液溶液几次而混合。将乙酸/DMSO混合物(100 mL)转移到2-AB染料小瓶中(临使用前)，并混合直至染料完全溶解。然后将染料溶液添加到还原剂小瓶(试剂盒中提供)中，并充分混合(标记试剂)。将标记试剂(5 mL)添加到各个干燥的寡糖样品小瓶，并充分混合。将反应小瓶置于设定为65℃和700-800 RPM的Eppendorf恒温混合器中反应2小时。
标记反应后，使用来自Prozyme的GlycoClean S Cartridges(目录号GKI-4726)去除过量的荧光染料。添加样品前，用1 mL milli-Q水洗涤药液筒，随后为5 ishes 1 mL 30%乙酸溶液。临添加样品前，将1 mL的乙腈(Burdick and Jackson，目录号AH015-4)添加到药液筒。
所有乙腈通过药液筒后，将样品点样在新鲜洗涤的盘中央，并允许其吸附到盘上10分钟。用1 mL乙腈洗涤盘，随后为1 mL的96%乙腈的5次ishes。将药液筒置于1.5 mLEppendorf管上，并用3 ishes (每ish 400 mL) milli Q水洗脱2-AB标记的寡糖。
使用与Shimadzu HPLC系统连接的Glycosep N HPLC(目录号GKI-4728)柱分离寡糖。Shimadzu HPLC系统由系统控制器、脱气装置、二元泵、带有样品冷却器的自动进样器、以及荧光检测器组成。
在升高的温度的稳定性
抗体缓冲液是5.57 mM磷酸二氢钠、8.69 mM磷酸氢二钠、106.69 mM NaCl、1.07mM柠檬酸钠、6.45 mM柠檬酸、66.68 mM甘露糖醇、0.1%(w/v)Tween，pH 5.2；或10 mM组氨酸、10 mM甲硫氨酸、4%甘露糖醇，pH 5.9。用合适的缓冲液将抗体终浓度调整为2 mg/mL,使用Amicon超速离心滤器。然后将抗体溶液过滤除菌，并在无菌条件下制备0.25 mL等分试样。将等分试样在-80℃、5℃、25℃、或40℃放置1、2或3周。孵育时间段结束时，通过大小排阻层析和SDS-PAGE分析样品。
在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE分析稳定性样品。使用的程序与本文所述相同。用胶态蓝染料(Invitrogen目录号46-7015, 46-7016)将凝胶染色过夜，并用Milli-Q水脱染，直至背景是清楚的。然后使用Epson Expression扫描仪(型号1680, S/NDASX003641)将染色的凝胶扫描。为了获得更高灵敏度，使用银染色试剂盒(OwlScientific)将相同凝胶银染色，且使用制造商提供的推荐程序。
实施例1.2.2.3.C: 人源化单克隆抗体自身或与化学疗法组合对人癌异种移植物 的生长的效力
使人癌细胞在组织培养瓶中体外生长至99%生存力、85％汇合。将19－25克SCID雌性或雄性小鼠(Charles Rivers Labs)做耳标记并剃毛。在研究第0日将0.2 ml的2 x 106个人肿瘤细胞(1:1基质胶)皮下接种到小鼠右侧腹。将小鼠按大小匹配到单独的平均肿瘤体积约150至200 mm3的小鼠笼中后，开始施用(IP，Q3D/周)媒介物(PBS)、人源化抗体、和/或化学疗法。在接种后约第10天开始每周两次通过一对卡尺测量肿瘤，并根据式V= L ×W2/2(V：体积，mm3；L：长度，mm；W：宽度，mm)计算肿瘤体积。相对于仅接受媒介物或同种型对照mAb的动物中的肿瘤，在以mAb单独或与化学疗法组合处理的动物中，观察到肿瘤体积的减小。
实施例1.2.2.3.D: 基于FACS的改变方向的细胞毒性(rCTL)测定
通过负选择富集柱(R&D Systems, Minneapolis, MN；目录号HTCC-525)从预先冷冻的分离的外周血单核细胞(PBMC)中分离人CD3+ T细胞。将T细胞在瓶(通气口盖，Corning, Acton, MA)中刺激4天，所述瓶用在D-PBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)中的10µg/mL抗-CD3(OKT-3, eBioscience, Inc., San Diego, CA)和2μg/mL抗-CD28(CD28.2,eBioscience, Inc., San Diego, CA)包被，并在具有L-谷氨酰胺、55mM β-ME、青霉素/链霉素、10% FBS的完全RPMI 1640培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中在30U/mL IL-2(Roche)中培养。然后在用于测定前，将T细胞在30U/mL IL-2中静止过夜。根据制造商说明书用PKH26(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)标记DoHH2或Raji靶细胞。在rCTL测定全过程中使用含有L-谷氨酰胺和10% FBS(Hyclone, Logan, UT)的RPMI 1640培养基(无苯酚，Invitrogen, Carlsbad, CA)。(参见Dreier等人，(2002)Int J Cancer 100:690)。
将效应T细胞(E)和靶(T)分别以105和104个细胞/孔的细胞终浓度铺板到96孔板(Costar #3799, Acton, MA)，以产生10:1的E:T比。将DVD-Ig分子稀释，以获得浓度依赖的滴定曲线。过夜孵育后，将细胞沉淀，用D-PBS洗涤一次，然后重悬浮到含有在D-PBS中的0.1% BSA(Invitrogen, Carlsbad, CA)、0.1% 叠氮化钠和0.5 μg/mL 碘化丙锭(BD)的FACS缓冲液中。在FACS Canto II机器(Becton Dickinson, San Jose, CA)上收集FACS数据，并在Flowjo(Treestar)中分析。计算DVD-Ig分子处理的样品中百分比活靶除以百分比总靶(对照，无处理)，以确定百分比比裂解。在Prism(Graphpad)中计算IC50。
实施例1.4: DVD-Ig分子的生成
能够结合两种抗原的DVD-Ig分子使用如本文所述选择的两种亲本单克隆抗体进行构建，所述两种亲本单克隆抗体的一种针对人抗原A，而另一种针对人抗原B。
实施例1.4.1: 具有两种接头长度的DVD-Ig分子的生成
使用含有µ1 Fc的恒定区，其具有在234和235的突变以消除ADCC/CDC效应子功能。生成了4种不同的抗-A/B DVD-Ig构建体：2种具有短接头，且2种具有长接头，各处于两种不同的结构域方向：VA-VB-C和VB-VA-C(参见表13)。衍生自人Cl/Ck或CH1结构域的N末端序列的接头序列如下：
对于DVDAB构建体：
轻链(如果抗-A具有λ):短接头: QPKAAP (SEQ ID NO: 15)；长接头:QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16)
轻链(如果抗-A具有κ):短接头: TVAAP (SEQ ID NO: 13)；长接头:TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14)
重链 (γ1): 短接头: ASTKGP (SEQ ID NO: 21)；长接头: ASTKGPSVFPLAP (SEQID NO: 22)
对于DVDAB构建体：
轻链(如果抗-B具有λ):短接头: QPKAAP (SEQ ID NO: 15)；长接头:QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 16)
轻链(如果抗-B具有k):短接头: TVAAP (SEQ ID NO: 13)；长接头:TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14)
重链(γ1): 短接头: ASTKGP (SEQ ID NO: 21)；长接头: ASTKGPSVFPLAP (SEQID NO: 22)。
将重链和轻链构建体亚克隆到pBOS表达载体中，并在COS细胞中表达，随后通过蛋白A层析进行纯化。将纯化的材料进行SDS-PAGE和SEC分析。
表13描述了用于表达各抗-A/B DVD-Ig蛋白的重链和轻链构建体。
表13: 抗-A/B DVD-Ig构建体
实施例1.4.2: 关于DVDABSL和DVDABLL的DNA构建体的分子克隆
为了生成重链构建体DVDABHC-LL和DVDABHC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将A抗体的VH结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将B抗体的VH结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两种PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到Srf I和SalI双重消化的pBOS-hCγ1,z non-a哺乳动物表达载体(Abbott)中。
为了生成轻链构建体DVDABLC-LL和DVDABLC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将A抗体的VL结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将B抗体的VL结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两种PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到Srf I和Not I双重消化的pBOS-hCk哺乳动物表达载体(Abbott)中。类似的方法已用于生成如下文所述的DVDBASL和DVDBALL：
实施例1.4.3: 关于DVDBASL和DVDBALL的DNA构建体的分子克隆
为了生成重链构建体DVDBAHC-LL和DVDBAHC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体B的VH结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体A的VH结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两种PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到Srf I和Sal I双重消化的pBOS-hCγ1,z non-a哺乳动物表达载体(Abbott)中。
为了生成轻链构建体DVDBALC-LL和DVDBALC-SL，使用特异性引物(3’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体B的VL结构域进行PCR扩增；同时使用特异性引物(5’引物分别含有用于SL/LL构建体的短/长接头序列)将抗体A的VL结构域进行扩增。两个PCR反应均根据标准PCR技术和程序进行。将两种PCR产物凝胶纯化，且一起用作随后的使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。通过使用标准同源重组方法将重叠PCR产物亚克隆到Srf I和Not I双重消化的pBOS-hCk哺乳动物表达载体(Abbott)中。
实施例1.4.4: 另外的DVD-Ig分子的构建和表达
实施例1.4.4.1: DVD-Ig载体构建体的制备
关于用于整合入DVD-Ig分子中的识别特定抗原或其表位的特定抗体的亲本抗体氨基酸序列可以通过如上文所述制备杂交瘤获得，或者可以通过对已知的抗体蛋白或核酸进行测序获得。此外，可以从文献中获得已知的序列。序列可以用于使用标准DNA合成或扩增技术以及使用标准重组DNA技术将所需抗体片段装配到表达载体中而合成核酸，以用于在细胞中表达。
例如，从氨基酸序列确定核酸密码子，且通过Blue Heron Biotechnology, Inc.(www.blueheronbio.com) Bothell, WA USA合成寡核苷酸DNA。将寡核苷酸装配成300-2,000碱基对的双链DNA片段，克隆进质粒载体，且进行序列验证。使用酶促过程装配克隆的片段以得到完整基因，且亚克隆到表达载体中。(参见
。
将一组pHybE载体(美国专利申请序列号61/021,282)用于亲本抗体和DVD-Ig分子克隆。衍生自pJP183；pHybE-hCg1,z,non-a V2的V1用于克隆具有野生型恒定区的抗体和DVD重链。衍生自pJP191；pHybE-hCk V2的V2用于克隆具有κ恒定区的抗体和DVD轻链。衍生自pJP192；pHybE-hCl V2的V3用于克隆具有λ恒定区的抗体和DVDs轻链。由λ信号肽和κ恒定区构建的V4用于克隆具有λ-κ杂合V结构域的DVD轻链。由κ信号肽和λ恒定区构建的V5用于克隆具有κ-λ杂合V结构域的DVD轻链。衍生自pJP183；pHybE-hCg1,z,non-a V2的V7用于克隆具有(234,235 AA)突变恒定区的抗体和DVD重链。
参考表14，许多载体用于克隆亲本抗体和DVD-Ig 分子VH和VL链。
表14: 用于克隆亲本抗体和DVD-Ig分子的载体
实施例1.4.4.2: 在293细胞中的转染和表达
通过用含有相应的轻链(LC)和重链(HC)核酸的质粒瞬时共转染HEK293(EBNA)细胞而实现参考抗体和DVD-Ig分子的表达。在瓶(2L Corning 目录号 431198)中以0.5L-规模在Freestyle 293培养基(Invitrogen, Carlsbad CA)中繁殖HEK293(EBNA)细胞，所述瓶于CO2培养箱(8% CO2，125 RPM，37℃)中摇动。当培养物达到1x106个细胞/ml的密度时，用转染复合物转染细胞。通过首先将150µg LC-质粒和100µg HC-质粒一起在25ml的Freestyle培养基中混合，随后添加500 μl PEI原液[原液：1 mg/ml(pH 7.0)线性25kDa PEI，Polysciences目录号23966] 来制备转染复合物。通过倒置来混合转染复合物，并在添加到细胞培养物之前允许其于室温孵育10分钟。转染后，继续使培养物在CO2培养箱(8% CO2，125RPM，37℃)中生长。转染后24小时，用25ml的10% 胰蛋白胨N1溶液(Organo Technie, LaCourneuve France目录号19553)补充培养物。转染后9天，通过离心(16,000 g，10分钟)将细胞从培养物中取出，将保留的上清液除菌过滤(Millipore HV Durapore Stericup，0.45um)，并置于4℃直至纯化步骤开始。
使用含有MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare)的一次性1ml填充柱(由OrochemTechnologies填充)将各抗体或DVD-Ig分子单独纯化。将柱在PBS中预先平衡，然后用收获的0.55L样品以1 ml/分钟加样过夜(15小时)，将流通物(flow-through)再循环回进料容器中。加样步骤后，将柱用20ml PBS洗涤，并通过以4 ml/分钟进料洗脱缓冲液(50mM柠檬酸，pH 3.5)以及将级分(1 ml)收集在已经含有0.2ml的1.5M Tris pH 8.2 (使得最终pH为约6.0)的管中，来洗脱蛋白。基于层析谱将含有抗体的级分合并，并透析到最终储存缓冲液(10mM柠檬酸，10mM Na2HPO4，pH 6.0)中。透析后，将样品通过0.22 μm Steriflip(Millipore)过滤，并通过吸光度确定蛋白浓度[Hewlett Packard 8453二极管阵列分光光度计(diode array spectrophotometer)]。对分析样品(还原的和非还原的)实施SDS-PAGE分析以评估最终纯度、证实合适大小的重和轻链条带的存在、并确认(在非还原样品中)不存在显著量的游离(例如非复合的)轻链。
表15含有在293细胞中表示为毫克/升的亲本抗体或DVD-Ig构建体的产量数据。
表15: 293细胞中亲本抗体和DVD-Ig构建体的产量的瞬时表达
所有DVDs都在293细胞中表达良好。DVDs可在蛋白A柱上容易地纯化。在大多数情况下，可以容易地从293细胞上清液获得>5 mg/L纯化的DVD-Ig分子。
实施例1.4.5: A/B DVD-Ig分子的表征和最重要选择
在Biacore上针对蛋白A和蛋白B分析抗-A/B DVD-Ig分子的结合亲和力。通过在Biacore上的多重结合研究检查DVD-Ig分子的四价性质。同时，分别通过如本文所述的生物测定评估DVD-Ig分子对于蛋白A和蛋白B的中和效价。将最佳地保留初始亲本mAbs的亲和力和效价的DVD-Ig分子选择用于对于每一个mAb的如本文所述的深入物理化学和生物分析(大鼠PK)表征。基于分析的收集，将最终的最重要DVD-Ig分子推进到CHO稳定细胞系开发中，且将CHO-衍生的材料应用于在食蟹猴中的稳定性、药物代谢动力学和效力研究以及配制前活动中。
实施例2: 双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子的生成和表征
通过根据实施例1.4.4.1合成编码DVD-Ig可变重链和DVD-Ig可变轻链序列的多核苷酸片段并将片段克隆到pHybC-D2载体中，来生成使用具有已知氨基酸序列的亲本抗体的双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子。如实施例1,4.4.2所述，将DVD-Ig构建体克隆进293细胞中并在其中表达。根据标准方法纯化DVD-Ig蛋白。根据所示的实施例1.1.1和1.1.2中所述的方法测定功能特征。下面提供了本发明的DVD-Ig分子的DVD-Ig VH和VL链。
实施例2.1: 具有接头组1的IL-1α(seq. 3)和IL-1β(seq. 1) DVD-Ig 分子的生 成
表16
实施例2.2: 具有接头组1和2的IL-1α(seq. 2)和IL-1β(seq. 1) DVD-Ig 分子的 生成
表17
实施例2.3: 具有接头组1和2的IL-1α(seq. 1)和IL-1β(seq. 1) DVD-Ig 分子的 生成
表18
实施例2.4: 具有接头组1的IL-1α(seq. 3)和IL-1β(seq. 2) DVD-Ig 分子的生 成
表19
实施例2.5: 具有接头组1的IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 2) DVD-Ig 分子的生 成
表20
实施例2.6: 具有接头组1的IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 3) DVD-Ig 分子的生 成
表21
实施例2.7:具有接头组1的IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 4) DVD-Ig 分子的生成
表22
实施例2.8:具有接头组1的IL-1α(seq. 4)和IL-1β(seq. 5) DVD-Ig 分子的生成
表23
实施例2.9: 用于克隆亲本抗体和DVD-Ig序列的克隆载体序列
表24
本发明将分子生物学和药物递送领域中众所周知的技术完整地通过引用并入。这些技术包括，但不限于，在下述出版物中描述的技术：
Ausubel等人(编), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993)；
Ausubel, F.M.等人编，Short Protocols In Molecular Biology (第4版.1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X).
Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball (编), Wiley, New York (1984)；
Giege, R. 和Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., 第20 1-16页, Oxford UniversityPress, New York, New York, (1999)；
Goodson, 于Medical Applications of Controlled Release, 第2卷, 第115-138页 (1984)；
Hammerling, 等人，于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981；
Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring HarborLaboratory Press, 第2版 1988)；
Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md. (1987)和(1991)；
Kabat, E.A.,等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest ,Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIHPublication No. 91-3242；
Kontermann和Dubel编， Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. NewYork. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, StocktonPress, NY (1990)；
Lu和Weiner编，Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X).
Medical Applications of Controlled Release, Langer和Wise (编), CRCPres., Boca Raton, Fla. (1974)；
Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (第3版. 1985) Blackwell ScientificPublications, Boston.Studies in Microbiology；V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook, J.等人编，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2卷.1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. 第1-3卷. (ISBN 0-87969-309-6).
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, 编，Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology(1987) VCH Publishers, NY (Horst Ibelgaufts翻译). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4)。
通过引用并入
可能在本申请自始至终引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网站)的内容都在此为了任何目的明确地整体通过引用并入本文，其中引用的参考文献也是如此。除非另外指出，本发明的实践将采用本领域众所周知的免疫学、分子生物学和细胞生物学常规技术。
等同方案
本发明在不背离其精神或基本特征的情况下可以体现在其他具体形式中。前述实施方案因此在所有方面被视为是示例性的而非限制本文所述的本发明。本发明的范围因而由所附的权利要求而不是由前述说明书指出，且在权利要求的等价含义和范围内的所有改变因而预期包含在其中。
序列表
<110> ABBOTT LABORATORIES
<120> IL-1-α和-β双特异性双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
<130> 10718WO01
<140> PCT/US2011/066130
<141> 2011-12-20
<150> 61/425,671
<151> 2010-12-21
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 34
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<400> 35
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<400> 36
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<220>
<221> 来源
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<400> 37
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Val Asp
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Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<210> 38
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asp Tyr
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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Leu Ile Trp Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Ser Pro Leu Lys
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Lys Gln Arg Thr Leu Trp Gly Tyr Asp Leu Tyr Gly Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 39
Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Val Asp
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 40
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asn Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 41
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 42
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 55
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 56
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<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<211> 247
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 59
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 61
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Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
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Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Arg Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ile Pro Tyr
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Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 66
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 67
Asp Thr Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Val Asp
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Ser Gln Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
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Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 68
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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<211> 221
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 69
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asp Tyr
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210> 71
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多肽"
<400> 71
Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Val Asp
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Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gln Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
115 120 125
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn
130 135 140
Met Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
145 150 155 160
Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Lys Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
180 185 190
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Ala Pro
195 200 205
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
210 215 220
<210> 72
<211> 7185
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多核苷酸"
<400> 72
gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagcggccg ctcgaggccg gcaaggccgg 1020
atcccccgac ctcgacctct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt 1080
ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttggtcgaga 1140
tccctcggag atctctagct agaggatcga tccccgcccc ggacgaacta aacctgacta 1200
cgacatctct gccccttctt cgcggggcag tgcatgtaat cccttcagtt ggttggtaca 1260
acttgccaac tgggccctgt tccacatgtg acacgggggg ggaccaaaca caaaggggtt 1320
ctctgactgt agttgacatc cttataaatg gatgtgcaca tttgccaaca ctgagtggct 1380
ttcatcctgg agcagacttt gcagtctgtg gactgcaaca caacattgcc tttatgtgta 1440
actcttggct gaagctctta caccaatgct gggggacatg tacctcccag gggcccagga 1500
agactacggg aggctacacc aacgtcaatc agaggggcct gtgtagctac cgataagcgg 1560
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agcatatgct tcccgggtag tagtatatac tatccagact aaccctaatt caatagcata 1680
tgttacccaa cgggaagcat atgctatcga attagggtta gtaaaagggt cctaaggaac 1740
agcgatatct cccaccccat gagctgtcac ggttttattt acatggggtc aggattccac 1800
gagggtagtg aaccatttta gtcacaaggg cagtggctga agatcaagga gcgggcagtg 1860
aactctcctg aatcttcgcc tgcttcttca ttctccttcg tttagctaat agaataactg 1920
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cccagaataa aatttggacg gggggttcag tggtggcatt gtgctatgac accaatataa 2040
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<210> 73
<211> 6521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多核苷酸"
<400> 73
acggtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
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<210> 74
<211> 6513
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多核苷酸"
<400> 74
caacccaagg ctgccccctc ggtcactctg ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc 60
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<210> 75
<211> 6515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多核苷酸"
<400> 75
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<220>
<221> 来源
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<400> 76
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taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg 3120
tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 3180
tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 3240
cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 3300
gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 3360
cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa 3420
actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 3480
ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 3540
tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 3600
tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 3660
acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 3720
ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 3780
ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 3840
ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 3900
gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 3960
ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 4020
aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 4080
gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 4140
gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 4200
aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 4260
cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 4320
tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 4380
ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 4440
atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 4500
cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt 4560
ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 4620
gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 4680
cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 4740
cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 4800
ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 4860
aaacagctat gaccatgatt acgccaagct ctagctagag gtcgagtccc tccccagcag 4920
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 4980
cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 5040
ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt 5100
gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct ttgcaaagat ggataaagtt 5160
ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat 5220
tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 5280
gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 5340
tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 5400
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc 5460
cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat 5520
tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg 5580
ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 5640
gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc 5700
tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 5760
gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 5820
cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 5880
agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc 5940
tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc 6000
agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 6060
gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 6120
gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 6180
ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 6240
ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 6300
attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac 6360
agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga ggaattctct agagatccct 6420
cgacctcgag atccattgtg cccgggcgcc accatggaca tgcgcgtgcc cgcccagctg 6480
ctgggcctgc tgctgctgtg gttccccggc tcgcgatgc 6519
<210> 77
<211> 7185
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成多核苷酸"
<400> 77
gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagcggccg ctcgaggccg gcaaggccgg 1020
atcccccgac ctcgacctct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt 1080
ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttggtcgaga 1140
tccctcggag atctctagct agaggatcga tccccgcccc ggacgaacta aacctgacta 1200
cgacatctct gccccttctt cgcggggcag tgcatgtaat cccttcagtt ggttggtaca 1260
acttgccaac tgggccctgt tccacatgtg acacgggggg ggaccaaaca caaaggggtt 1320
ctctgactgt agttgacatc cttataaatg gatgtgcaca tttgccaaca ctgagtggct 1380
ttcatcctgg agcagacttt gcagtctgtg gactgcaaca caacattgcc tttatgtgta 1440
actcttggct gaagctctta caccaatgct gggggacatg tacctcccag gggcccagga 1500
agactacggg aggctacacc aacgtcaatc agaggggcct gtgtagctac cgataagcgg 1560
accctcaaga gggcattagc aatagtgttt ataaggcccc cttgttaacc ctaaacgggt 1620
agcatatgct tcccgggtag tagtatatac tatccagact aaccctaatt caatagcata 1680
tgttacccaa cgggaagcat atgctatcga attagggtta gtaaaagggt cctaaggaac 1740
agcgatatct cccaccccat gagctgtcac ggttttattt acatggggtc aggattccac 1800
gagggtagtg aaccatttta gtcacaaggg cagtggctga agatcaagga gcgggcagtg 1860
aactctcctg aatcttcgcc tgcttcttca ttctccttcg tttagctaat agaataactg 1920
ctgagttgtg aacagtaagg tgtatgtgag gtgctcgaaa acaaggtttc aggtgacgcc 1980
cccagaataa aatttggacg gggggttcag tggtggcatt gtgctatgac accaatataa 2040
ccctcacaaa ccccttgggc aataaatact agtgtaggaa tgaaacattc tgaatatctt 2100
taacaataga aatccatggg gtggggacaa gccgtaaaga ctggatgtcc atctcacacg 2160
aatttatggc tatgggcaac acataatcct agtgcaatat gatactgggg ttattaagat 2220
gtgtcccagg cagggaccaa gacaggtgaa ccatgttgtt acactctatt tgtaacaagg 2280
ggaaagagag tggacgccga cagcagcgga ctccactggt tgtctctaac acccccgaaa 2340
attaaacggg gctccacgcc aatggggccc ataaacaaag acaagtggcc actctttttt 2400
ttgaaattgt ggagtggggg cacgcgtcag cccccacacg ccgccctgcg gttttggact 2460
gtaaaataag ggtgtaataa cttggctgat tgtaaccccg ctaaccactg cggtcaaacc 2520
acttgcccac aaaaccacta atggcacccc ggggaatacc tgcataagta ggtgggcggg 2580
ccaagatagg ggcgcgattg ctgcgatctg gaggacaaat tacacacact tgcgcctgag 2640
cgccaagcac agggttgttg gtcctcatat tcacgaggtc gctgagagca cggtgggcta 2700
atgttgccat gggtagcata tactacccaa atatctggat agcatatgct atcctaatct 2760
atatctgggt agcataggct atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct 2820
atatctgggt agtatatgct atcctaattt atatctgggt agcataggct atcctaatct 2880
atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct 2940
gtatccgggt agcatatgct atcctaatag agattagggt agtatatgct atcctaattt 3000
atatctgggt agcatatact acccaaatat ctggatagca tatgctatcc taatctatat 3060
ctgggtagca tatgctatcc taatctatat ctgggtagca taggctatcc taatctatat 3120
ctgggtagca tatgctatcc taatctatat ctgggtagta tatgctatcc taatttatat 3180
ctgggtagca taggctatcc taatctatat ctgggtagca tatgctatcc taatctatat 3240
ctgggtagta tatgctatcc taatctgtat ccgggtagca tatgctatcc tcatgataag 3300
ctgtcaaaca tgagaatttt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata 3360
ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 3420
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 3480
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca 3540
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc 3600
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat 3660
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc 3720
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg 3780
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc 3840
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat 3900
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga 3960
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc 4020
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc 4080
aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt 4140
aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc 4200
tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc 4260
agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca 4320
ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca 4380
ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt 4440
ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta 4500
acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg 4560
agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc 4620
ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 4680
cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 4740
gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 4800
cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc 4860
gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 4920
caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 4980
aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 5040
tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 5100
gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 5160
ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 5220
atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 5280
cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 5340
caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 5400
cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 5460
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 5520
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctctagc tagaggtcga 5580
gtccctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 5640
tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 5700
cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc 5760
tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctttgca 5820
aagatggata aagttttaaa cagagaggaa tctttgcagc taatggacct tctaggtctt 5880
gaaaggagtg ggaattggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 5940
ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg 6000
ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 6060
accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 6120
aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc 6180
ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg 6240
ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc 6300
ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg 6360
cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc 6420
gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat 6480
ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc 6540
gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg 6600
gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct 6660
ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg 6720
gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag 6780
gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc 6840
gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga 6900
ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc 6960
ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat 7020
tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaggaat 7080
tctctagaga tccctcgacc tcgagatcca ttgtgcccgg gcgccaccat ggagtttggg 7140
ctgagctggc tttttcttgt cgcgatttta aaaggtgtcc agtgc 7185
<210> 78
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列的说明：合成肽"
<400> 78
Asp Glu Val Asp
1

Claims (29)

1.结合蛋白，包含第一和第二多肽链，其中所述第一多肽链由第一个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中
VD1是第一个重链可变结构域；
VD2是第二个重链可变结构域；
C是重链恒定结构域；
X1是接头，条件是X1不是CH1；
X2是Fc区；
n是0或1，且
其中所述第二多肽链由第二个VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中
VD1是第一个轻链可变结构域；
VD2是第二个轻链可变结构域；
C是轻链恒定结构域；
X1是接头；
X2不包含Fc区；
n是0或1，且
其中所述结合蛋白能够结合选自IL-1α和IL-1β的抗原对，
其中所述VD1重和轻链可变结构域或VD2重和轻链可变结构域中的任一形成结合IL-1β抗原的抗原结合结构域，且由SEQ ID NO: 30和31或SEQ ID NO: 32和33的氨基酸序列组成，且
其中所述VD1或VD2重和轻链可变结构域中的另一形成结合IL-1α抗原的抗原结合结构域。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合IL-1α抗原的抗原结合结构域的重链可变结构域由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQ ID NOs: 40、42、44、和46，且其中所述结合IL-1α抗原的抗原结合结构域的轻链可变结构域由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自SEQ ID NOs: 41、43、45、和47。
3.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中X1由选自SEQ ID NOs 1-29的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含两个第一多肽链和两个第二多肽链。
5.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述Fc区是变体序列Fc区。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述Fc区是具有L234A和L235A铰链区突变的变体IgG1 Fc区。
7.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链中的C-(X2)n由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成；且所述第二多肽链中的C-(X2)n由SEQ ID NO: 50的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述VD1重和轻链可变结构域由SEQ ID NOs:30和31的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求7所述的结合蛋白，其中所述VD1重和轻链可变结构域由SEQ ID NOs:30和31的氨基酸序列组成。
10.结合蛋白，能够结合两种抗原且包含四条多肽链，其中两条多肽链由VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中
VD1是第一个重链可变结构域；
VD2是第二个重链可变结构域；
C是重链恒定结构域；
X1是接头；
X2是Fc区；
n是0或1，且
其中另两条多肽链由VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中
VD1是第一个轻链可变结构域；
VD2是第二个轻链可变结构域；
C是轻链恒定结构域；
X1是接头；
X2不包含Fc区；
n是0或1；且
其中所述VD1重和轻链可变结构域形成结合IL-1β抗原的抗原结合结构域，且由SEQ IDNOs: 30和31或SEQ ID NOs: 32和33的氨基酸序列组成，且
其中所述VD2重和轻链可变结构域形成结合IL-1α抗原的抗原结合结构域。
11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述Fc区是变体序列Fc区。
12.根据权利要求11所述的结合蛋白，其中所述Fc区是具有L234A和L235A铰链区突变的变体IgG1 Fc区。
13.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述第一多肽链中的C-(X2)n由SEQ ID NO:49的氨基酸序列组成；且所述第二多肽链中的C-(X2)n由SEQ ID NO: 50的氨基酸序列组成。
14.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述VD1重和轻链可变结构域由SEQ IDNOs: 30和31的氨基酸序列组成。
15.根据权利要求13所述的结合蛋白，其中所述VD1重和轻链可变结构域由SEQ IDNOs: 30和31的氨基酸序列组成。
16.结合蛋白，能够结合两种抗原且包含四条多肽链，其中两条多肽链由VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中
VD1是第一个重链可变结构域；
VD2是第二个重链可变结构域；
C是重链恒定结构域；
X1是接头；
X2是Fc区；
n是0或1；且
其中另两条多肽链由VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n组成，其中
VD1是第一个轻链可变结构域；
VD2是第二个轻链可变结构域；
C是轻链恒定结构域；
X1是接头；
X2不包含Fc区；
n是0或1；且
其中所述VD2重和轻链可变结构域形成结合IL-1β抗原的抗原结合结构域，且由SEQ IDNOs: 30和31或SEQ ID NOs: 32和33的氨基酸序列组成，且
其中所述VD1重和轻链可变结构域形成结合IL-1α抗原的抗原结合结构域。
17.权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白，其中如通过表面等离振子共振测量的，所述结合蛋白对IL-1β抗原具有至少102M-1s-1的结合速率常数(Kon)。
18.权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白，其中如通过表面等离振子共振测量的，所述结合蛋白对IL-1β抗原具有至多10-6s-1的解离速率常数(Koff)。
19.权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白，其中如通过表面等离振子共振测量的，所述结合蛋白对IL-1β抗原具有至多10-7 M的解离常数(KD)。
20.分离的核酸，其编码权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白氨基酸序列。
21.载体，其包含权利要求20所述的分离的核酸。
22.宿主细胞，其包含权利要求21所述的载体。
23.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
24.产生结合蛋白的方法，包括在足以产生所述结合蛋白的条件下，在培养基中培养权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞。
25.根据权利要求24所述的方法产生的蛋白。
26.药物组合物，包含权利要求中1-16中任一项所述的结合蛋白、以及药学可接受的载体。
27.权利要求26的药物组合物，进一步包含至少一种另外的治疗剂。
28.权利要求1-16中任一项所述的结合蛋白在制备用于治疗受试者的疾病或病症的药物中的用途，在所述疾病或病症中IL-1α和IL-1β的活性是有害的，其中所述治疗涉及给所述受试者施用所述药物，从而实现治疗。
29.权利要求28的用途，其中所述疾病或病症选自：类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎和反应性关节炎。
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WO (1) WO2012121775A2 (zh)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012002605A (es) 2009-08-29 2012-04-02 Abbott Lab Proteinas terapeutico de union a dll4.
RU2605928C2 (ru) 2010-03-02 2016-12-27 Эббви Инк. Терапевтические dll4-связывающие белки
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20130133247A (ko) 2010-12-21 2013-12-06 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ-1-알파 및 -베타 이특이적 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
HUE053720T2 (hu) 2011-01-14 2021-07-28 Univ California ROR-1 fehérje elleni terápiás antitestek és eljárások alkalmazásukra
TW201402608A (zh) 2012-07-12 2014-01-16 Abbvie Inc Ｉｌ－１結合蛋白質
UY35110A (es) 2012-11-01 2014-05-30 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas
RU2020139283A (ru) * 2012-11-01 2020-12-10 Эббви Инк. Стабильная композиция белка иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами
US20140213771A1 (en) * 2012-12-28 2014-07-31 Abbvie, Inc. Multi-specific binding proteins
WO2014106001A2 (en) * 2012-12-28 2014-07-03 Abbvie, Inc. Dual specific binding proteins having a receptor sequence
CN104341501B (zh) * 2013-07-29 2019-08-30 上海睿智化学研究有限公司 抗IL-1β人源化单克隆抗体及其制备方法和应用
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
CN106535889A (zh) 2014-02-10 2017-03-22 帕塔拉制药有限责任公司 用于治疗肺疾病的肥大细胞稳定剂
AU2015213678C1 (en) 2014-02-10 2019-03-21 Respivant Sciences Gmbh Mast cell stabilizers treatment for systemic disorders
US20150328317A1 (en) * 2014-05-13 2015-11-19 Eagle Pharmaceuticals, Inc. Aqueous buffer-free bivalirudin compositions
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
EP3218399A1 (en) 2014-11-10 2017-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies and methods of use in ophthalmology
EP3218402A1 (en) * 2014-11-10 2017-09-20 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-il-1beta antibodies and methods of use
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
CN105148270A (zh) * 2015-06-03 2015-12-16 广西医科大学 单链抗体及其相关成套抗肿瘤试剂与应用
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3331522A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Patara Pharma LLC Methods for the treatment of mast cell related disorders with mast cell stabilizers
WO2017027402A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Patara Pharma, LLC Methods for the treatment of systemic disorders treatable with mast cell stabilizers, including mast cell related disorders
JP7014724B2 (ja) 2016-02-06 2022-02-01 エピムアブ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド タンデム型Ｆａｂ免疫グロブリンおよびその使用
BR112018067379A2 (pt) 2016-03-02 2019-01-15 Eisai R&D Man Co Ltd conjugado anticorpo-droga, composição, método para tratamento de um paciente que tem ou corre o risco de ter um câncer, para produzir o conjugado anticorpo-droga ou a composição, para determinar se um paciente será responsivo a um tratamento com o conjugado anticorpo-droga ou a composição, e, uso de um conjugado anticorpo-droga ou de uma composição.
US20190177439A1 (en) * 2016-08-16 2019-06-13 Epimab Biotherapeutics, Inc. Monovalent Asymmetric Tandem Fab Bispecific Antibodies
CA3035528A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Respivant Sciences Gmbh Cromolyn compositions for treatment of chronic cough due to idiopathic pulmonary fibrosis
AU2017339366A1 (en) 2016-10-07 2019-04-11 Respivant Sciences Gmbh Cromolyn compositions for treatment of pulmonary fibrosis
CN108070651A (zh) * 2016-11-07 2018-05-25 苏州安康盟医疗科技有限公司 一种评估crc复发风险的诊断分析/预后分析方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
BR112020022371A2 (pt) 2018-05-03 2021-02-02 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co., Ltd. anticorpos de alta afinidade para pd-1 e lag-3 e proteínas de ligação biespecífica produzidas a partir dos mesmos
LT3883606T (lt) * 2018-09-24 2023-09-11 Janssen Biotech, Inc. Saugus ir veiksmingas opinio kolito gydymo būdas anti-il12/il23 antikūnu
CN111378045B (zh) * 2018-12-28 2022-08-02 长春金赛药业有限责任公司 二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101370525A (zh) * 2005-08-19 2009-02-18 艾博特公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2009149189A2 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

Family Cites Families (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2128208A (en) 1937-02-27 1938-08-23 Du Pont Alkoxy derivatives of methacrylic acid esters and method of producing them
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
NL8103517A (nl) 1981-07-24 1983-02-16 Badger Bv Werkwijze voor het scheiden van carbonzuren van mengsels met niet-zuren door een absorptie-stripbehandeling.
EP0092918B1 (en) 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4753894A (en) 1984-02-08 1988-06-28 Cetus Corporation Monoclonal anti-human breast cancer antibodies
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
DE3590766T (zh) 1985-03-30 1987-04-23
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0273115B1 (en) 1986-10-22 1994-09-07 Abbott Laboratories Chemiluminescent acridinium and phenanthridinium salts
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5006309A (en) 1988-04-22 1991-04-09 Abbott Laboratories Immunoassay device with liquid transfer between wells by washing
US5089424A (en) 1988-06-14 1992-02-18 Abbott Laboratories Method and apparatus for heterogeneous chemiluminescence assay
WO1990002809A1 (en) 1988-09-02 1990-03-22 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5241070A (en) 1988-09-26 1993-08-31 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleophilic polysubstituted aryl acridinium esters and uses thereof
SE462454B (sv) 1988-11-10 1990-06-25 Pharmacia Ab Maetyta foer anvaendning i biosensorer
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5063081A (en) 1988-11-14 1991-11-05 I-Stat Corporation Method of manufacturing a plurality of uniform microfabricated sensing devices having an immobilized ligand receptor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5135875A (en) 1990-08-15 1992-08-04 Abbott Laboratories Protein precipitation reagent
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
AU1545692A (en) 1991-03-01 1992-10-06 Protein Engineering Corporation Process for the development of binding mini-proteins
CZ282603B6 (cs) 1991-03-06 1997-08-13 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschränkter Haftun G Humanizované a chimerické monoklonální protilátky
DE69233367T2 (de) 1991-04-10 2005-05-25 The Scripps Research Institute, La Jolla Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
CA2069530A1 (en) 1991-06-03 1992-12-04 Cass J. Grandone Reagent pack for immunoassays
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5352803A (en) 1992-03-30 1994-10-04 Abbott Laboratories 5(6)-methyl substituted fluorescein derivatives
DE69328622T2 (de) 1992-03-30 2001-02-08 Abbott Laboratories, Abbott Park Reagenzien und verfahren zum nachweis und zur quantifizierung von thyroxin in flüssigen proben
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5565352A (en) 1993-11-24 1996-10-15 Arch Development Corporation Deubiquitinating enzyme: compositions and methods
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
GB9401182D0 (en) 1994-01-21 1994-03-16 Inst Of Cancer The Research Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect
DK1231268T3 (da) 1994-01-31 2005-11-21 Univ Boston Polyklonale antistofbiblioteker
ZA95960B (en) 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
EP0771208B1 (en) 1994-08-12 2005-10-19 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
CA2207961A1 (en) 1995-01-05 1996-07-11 Robert J. Levy Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
JPH11503914A (ja) 1995-04-21 1999-04-06 セル ジェネシス，インコーポレイテッド 大ゲノムｄｎａ欠失の生成
KR100654645B1 (ko) 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
JP2000507912A (ja) 1995-08-31 2000-06-27 アルカームズ コントロールド セラピューティックス，インコーポレイテッド 作用剤の徐放性組成物
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
HU230515B1 (hu) 1996-02-09 2016-10-28 Abbvie Biotechnology Ltd Humán TNFalfa-kötő antitestek alkalmazásai
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
DE69732306T2 (de) 1997-01-16 2006-01-12 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
EP0971946B1 (en) 1997-01-21 2006-07-05 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
US6537749B2 (en) 1998-04-03 2003-03-25 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
PT2180007E (pt) 1998-04-20 2013-11-25 Roche Glycart Ag Engenharia de glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
WO2000009560A2 (en) 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000034337A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
ID29991A (id) 1998-12-23 2001-10-25 Pfizer Inc Cs Antibodi monoklonal manusia pada ctla-4
WO2000056934A1 (en) 1999-03-24 2000-09-28 Packard Bioscience Company Continuous porous matrix arrays
BR0009323A (pt) 1999-03-25 2002-01-08 Knoll Gmbh Anticorpos humanos que ligam a il-12 humana e métodos para a produção
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
NZ520622A (en) 2000-02-25 2004-08-27 Us Gov Health & Human Serv Anti-EGFRvIII scFvs with improved cytotoxicity and yield, immunotoxins based thereon, and methods of use thereof
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
AU2001259432B2 (en) 2000-05-03 2005-04-21 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an FC domain, as therapeutic agents
CN1239701C (zh) 2000-05-19 2006-02-01 梨树化学株式会社 抗表皮生长因子受体的人源化抗体
DE60114830T2 (de) 2000-06-28 2006-08-03 Glycofi, Inc. Verfahren zur herstellung modifizierter glycoproteine
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
KR20080074231A (ko) 2000-06-29 2008-08-12 아보트 러보러터리즈 이중 특이성 항체 및 이의 제조 및 사용 방법
MXPA00009407A (es) 2000-09-26 2004-12-08 Mexicano Inst Petrol Procedimiento para la preparacion de un catalizador monometalico de tipo zeolitico para la obtencion de gasolinas de alto octando mediante reformacion de naftas.
KR20100031769A (ko) 2000-12-28 2010-03-24 알투스 파마슈티컬스 인코포레이티드 전항체 및 이의 단편의 결정과 이의 제조 및 사용 방법
WO2002097048A2 (en) 2001-05-30 2002-12-05 Centocor, Inc. ANTI-p40 IMMUNOGLOBULIN DERIVED PROTEINS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
IL159225A0 (en) 2001-06-13 2004-06-01 Genmab As Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (egfr)
EP1432444A4 (en) 2001-08-17 2005-11-02 Lilly Co Eli ANTI-BETA ANTIBODIES
EP1438400B1 (en) 2001-10-01 2009-06-17 Dyax Corp. Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof
JP2005532253A (ja) 2001-10-25 2005-10-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 糖タンパク質組成物
WO2003039486A2 (en) 2001-11-09 2003-05-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies
DE10156482A1 (de) 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
US7419821B2 (en) 2002-03-05 2008-09-02 I-Stat Corporation Apparatus and methods for analyte measurement and immunoassay
NZ537277A (en) 2002-07-18 2008-04-30 Crucell Holland Bv Recombinant production of mixtures of antibodies
US20040018577A1 (en) 2002-07-29 2004-01-29 Emerson Campbell John Lewis Multiple hybrid immunoassay
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
NZ542873A (en) 2003-03-05 2008-07-31 Halozyme Inc Soluble, neutral-active hyaluronidase activity glycoprotein (sHASEGP) that is produced with high yield in a mammalian expression system by introducing nucleic acids that lack a narrow region encoding amino acids in the carboxy terminus of the human PH20 cDNA
CA2537055A1 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US7723099B2 (en) 2003-09-10 2010-05-25 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with immuno-reference electrode
US7682833B2 (en) 2003-09-10 2010-03-23 Abbott Point Of Care Inc. Immunoassay device with improved sample closure
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
EP1737969B2 (en) 2004-04-15 2018-09-12 GlycoFi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
ATE537189T1 (de) 2004-04-30 2011-12-15 Inst Nat Sante Rech Med Anti-tfr-antikörper
US20090215992A1 (en) 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
KR101518064B1 (ko) * 2005-10-26 2015-05-06 노파르티스 아게 Ｉｌ-1베타 화합물의 신규 용도
MX2008013508A (es) 2006-04-21 2008-10-31 Novartis Ag Composiciones farmaceuticas de anticuerpos antagonistas anti-cd40.
US7883855B2 (en) 2006-07-21 2011-02-08 Abbott Laboratories Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays
MY183804A (en) 2006-11-02 2021-03-16 Genentech Inc Humanized anti-factor d antibodies
US7906293B2 (en) 2007-04-09 2011-03-15 Abbott Laboratories Acridinium phenyl esters useful in the analysis of biological
ES2579231T3 (es) 2008-01-15 2016-08-08 Abbvie Inc Vectores de expresión de mamíferos mejorados y usos de los mismos
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
AU2010208637A1 (en) 2009-01-29 2011-08-04 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
US20110016506A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Yung-Yu Lu Set-Top Box
KR20120104542A (ko) 2009-10-15 2012-09-21 아보트 러보러터리즈 Ｉｌ?１ 결합 단백질
DK2571532T3 (en) 2010-05-14 2017-08-28 Abbvie Inc IL-1 BINDING PROTEINS
CA2807014A1 (en) * 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012088094A2 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
KR20130133247A (ko) 2010-12-21 2013-12-06 애브비 인코포레이티드 Ｉｌ-1-알파 및 -베타 이특이적 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101370525A (zh) * 2005-08-19 2009-02-18 艾博特公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2009149189A2 (en) * 2008-06-03 2009-12-10 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular construction and optimization of anti-human IL-1[alpha]/[beta] dual variable domain immunoglobulin (DVD-IgTM) molecules;Wu C.等;《mAbs》;20090831;第1卷(第4期);第339-347页 *

Also Published As

Publication number Publication date
SG191312A1 (en) 2013-07-31
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