CN104870423A - 用于蛋白质化学修饰的pictet-spengler连接反应 - Google Patents

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Abstract

用醛和酮官能化的蛋白质是用于开发经过化学修饰的生物治疗药物和基于蛋白质的材料的有前途的新底物。通常是将它们的反应性羰基与α-效应亲核试剂如取代的肼和烷氧基胺缀合，分别生成腙和肟。然而，得到的C＝N键在生理学相关条件下容易受到水解的影响，这限制了它们在生物系统中的应用。在这里，我们引入了Pictet-Spengler连接反应，所述的Pictet-Spengler连接反应是基于醛和色胺亲核试剂的经典的Pictet-Spengler反应。所述的连接反应利用醛和烷氧基胺的生物正交反应形成中间体氧基亚铵离子；这个中间体经历与吲哚亲核试剂的分子内C C键形成，得到水解稳定的氧杂咔啉产物。利用所述反应进行乙二醛官能化的和甲酰甘氨酸官能化的蛋白质的位点特异性的化学修饰，所述的蛋白质包括治疗用单克隆抗体赫赛汀的一种加有醛标签的变体。结合用于将醛位点特异性的地引入到蛋白质中的技术，所述的Pictet-Spengler连接反应提供了一种获得用于医学应用和材料应用的稳定的生物缀合物的新方法。

Description

用于蛋白质化学修饰的PICTET-SPENGLER连接反应
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年11月16日提交的美国临时专利申请61/727,501的优先权，通过引用将所述申请的全部内容并入本文。
关于联邦政府在所赞助的研究或开发获得的发明中的权利的声明
本发明是在美国政府的支持下作出的，由国家卫生研究所资助，授权编号GM59907。美国政府在本发明中具有某些权利。
发明背景
引言
用于蛋白质修饰的反应方法学在数十年来一直是一个活跃的研究领域。早期的策略集中在原始氨基酸的全面修饰，提供了获得各种经修饰的产物的途径(Glazer AN(1970),“Specific ChemicalModification of Proteins”,Annu.Rev.Biochem.39(1):101-130)。然而，各种应用要求蛋白质的位点特异性修饰：生物物理学研究需要知道连接报道分子的位点(Michalet X、Weiss S、&M(2006),“Single-Molecule Fluorescence Studies of Protein Folding andConformational Dynamics”,Chem.Rev.106(5):1785-1813)，制备蛋白质微阵列和功能材料需要在特定取向上的固定(Wong LS、Khan F、&Micklefield J(2009),“Selective Covalent ProteinImmobilization:Strategies andApplications”,Chem.Rev.109(9):4025-4053)，以及蛋白质药物与聚(乙二醇)或细胞毒素分子的缀合，其中化学修饰的位点影响所得到的生物制品的药代动力学和治疗学性能(Shen B-Q.等人(2012),“Conjugation site modulates the in vivo stability andtherapeutic activity of antibody-drugconjugates”,Nat.Biotechnol.30(2):184-189；Cho H等人(2011),“Optimized clinical performance of growth hormone with anexpanded genetic code”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(22):9060-9065)。因此，该领域近年来开发了用以实现蛋白质的位点特异性修饰的方法，通常涉及引入表现出生物正交反应性的非原始官能团(Sletten EM&Bertozzi CR(2009),“BioorthogonalChemistry:Fishing for Selectivity in a Sea ofFunctionality”,Angew.Chem.Int.Ed.48(38):6974-6998；Stephanopoulos N&Francis MB(2011),“Choosing an effectiveprotein bioconjugationstrategy”,Nat.Chem.Biol.7(12):876-884)。
醛类和酮类是用于位点特异性蛋白质修饰化学操作的流行选择。它们作为温和的亲电子试剂的独特反应性使得能够进行与α-效应亲核试剂如取代的肼和烷氧基胺的选择性缀合，分别生成腙和肟-连接的产物(Jencks WP(1964),“Simple Carbonyl GroupReactions”,Prog.Phys.Org.Chem.2:63-128)。已经开发了多种化学方法、酶促方法和遗传学方法将醛和酮类以位点特异性的方式引入蛋白质。这些方法包括N末端丝氨酸或苏氨酸残基的高碘酸盐氧化(Geoghegan KF&Stroh JG(1992),“Site-Directed Conjugation ofNonpeptide Groups to Peptides and Proteins ViaPeriodate-Oxidation of a 2-Amino A1cohol-Application toModification at N-Terminal Serine”,BioconjugateChem.3(2):138-146)；用以得到α-酮酰胺或乙二醛肟酰胺的磷酸吡哆醛-介导的N末端转氨基作用(Gilmore JM、Scheck RA、Esser-Kahn AP、Joshi NS、&Francis MB(2006),“N-Terminal Protein Modificationthrough a Biomimetic TransaminationReaction”,Angew.Chem.Int.Ed.45(32):5307-5311；Scheck RA、DedeoMT、Iavarone AT、&Francis MB(2008),“Optimization of aBiomimetic TransaminationReaction”,J.Am.Chem.Soc.130(35):11762-11770；Witus LS.等人(2010),“Identification of Highly Reactive Sequences ForPLP-Mediated Bioconjugation Using a Combinatorial PeptideLibrary”,J.Am.Chem.Soc.132(47):16812-16817；Witus LS&FrancisM(2009),“Site-Specific Protein Bioconjugation via a Pyridoxa15'-Phosphate-Mediated N-Terminal TransaminationReaction”,Current Protocols in Chemical Biology,(John Wiley&Sons,Inc)；为通过表达蛋白质连接生成的蛋白质C-末端硫酯添加包含酮的小分子(Esser-Kahn AP&Francis MB(2008),“Protein-Cross-Linked Polymeric Materials throughSite-SelectiveBioconjugation”,Angew.Chem.Int.Ed.47(20):3751-3754)；通过琥珀终止密码子抑制进行的包含酮的非天然氨基酸的遗传编码并入(Wang L、Zhang Z、Brock A、&Schultz PG(2003),“Addition ofthe keto functional group to the genetic code of Escherichiacoli”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(1):56-61；Hutchins BM.等人(2011),“Selective Formation of Covalent Protein Heterodimerswith an Unnatural Amino Acid”,Chem.Biol.18(3):299-303；Kim CH等人(2012),“Synthesis of Bispecific Antibodies usingGenetically Encoded Unnatural AminoAcids”,J.Am.Chem.Soc.134(24):9918-9921)；指导带有醛或酮的小分子的酶促连接反应的肽标签的遗传编码(Rashidian M、Song JM、Pricer RE、&Distefano MD(2012),“Chemoenzymatic ReversibleImmobilization and Labeling of Proteins without PriorPurification”,J.Am.Chem.Soc.134(20):8455-8467；Chen I、HowarthM、Lin W、&Ting AY(2005),“Site-specific labeling of cellsurface proteins with biophysical probes using biotinligase”,Nat.Methods 2(2):99-104)；以及用于通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)进行修饰的位点的遗传编码，在我们的实验室开发的“醛标签”方法(Carrico IS、Carlson BL、&Bertozzi CR(2007),“Introducing genetically encoded aldehydes intoproteins”,Nat.Chem.Biol.3(6):321-322；Wu P.等人(2009),“Site-specific chemical modification of recombinant proteinsproduced in mammalian cells by using the genetically encodedaldehyde tag”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:3000-3005；Hudak JE、Yu HH、&Bertozzi CR(2011),“Protein Glycoengineering Enabledby the Versatile Synthesis of Aminooxy Glycans and theGenetically Encoded AldehydeTag”,J.Am.Chem.Soc.133(40):16127-16135)；Hudak JE等人(2012),“Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions UsingCopper-Free Click Chemistry and the AldehydeTag”,Angew.Chem.Int.Ed.51(17):4161-4165；Shi X.等人(2012),“Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-taggedproteins for singlemolecule imaging”,Nat.Methods9(5):499-503；Rabuka D、Rush JS、deHart GW、Wu P、&BertozziCR(2012),“Site-specific chemical protein conjugation usinggenetically encoded aldehydetags”,Nat.Protoc.7(6):1052-1067)。
用于将反应性羰基引入到蛋白质中的方法的多样性与已经广泛用于它们的化学修饰的反应的有限数目形成鲜明对比。大多数的报道使用了上述的形成腙和肟的反应，是因为它们的生物正交性、操作的简单性(即，不需要辅助试剂)、以及在温和的含水条件下的良好收率。然而，得到的C＝N键容易受到水解的影响(Mueller BM、Wrasidlo WA、&Reisfeld RA(1990),“Antibody conjugates withmorpholinodoxorubicin and acid cleavablelinkers”,Bioconjugate Chem.1(5):325-330)，影响了它们在需要长时间稳定性的情况中的应用。例如，认为在Mylotarg(α-CD33与细胞毒素卡奇霉素的一种抗体-药物缀合物)中腙的不稳定性是导致了使所述药物退出美国市场的致命原因之一(Ducry L&Stump B(2009),“Antibody-Drug Conjugates:Linking Cytotoxic Payloads toMonoclonal Antibodies”,Bioconjugate Chem.21(1):5-13)。肟被称为对于水解最稳定的C＝N连接，但是它对于在稀释条件下的水解仍是热力学不稳定的，通过酸催化过程而分解(Kalia J&Raines RT(2008),“Hydrolytic Stability of Hydrazones andOximes”,Angew.Chem.Int.Ed.47(39):7523-7526)。许多研究人员发现，在理想存储条件(低温、高浓度、和中性或高pH)下的肟缀合物是动力学稳定的，并由此适合于短期的实验室研究(Hudak JE、Yu HH、&Bertozzi CR(2011),“Protein Glycoengineering Enabled by theVersatile Synthesis of Aminooxy Glycans and the GeneticallyEncoded Aldehyde Tag”,J.Am.Chem.Soc.133(40):16127-16135)；Shi X.等人(2012),“Quantitative fluorescence labeling ofaldehyde-tagged proteins for single-moleculeimaging”,Nat.Methods 9(5):499-503；Yi L等人(2010),“A HighlyEfficient Strategy for Modification of Proteins at the CTerminus”，Angew.Chem.Int.Ed.49(49):9417-9421)。然而，需要长时间保持所述缀合物在生理学温度和低浓度的生物学应用要求比所述肟显著更稳定的共价键。
理想的生物结合反应会与蛋白质醛和酮形成稳定的C-C键。已经报道了一些这种反应，但是它们受到慢的反应动力学的限制(SasakiT、Kodama K、Suzuki H、Fukuzawa S、&Tachibana K(2008),“N-terminal labeling of proteins by the Pictet-Spenglerreaction,“Bioorg.Med.Chem.Lett.18(16):4550-4553)或者需要有机共溶剂的限制(Alam J、Keller TH、&Loh T-P(2010),“Functionalization of Peptides and Proteins by Mukaiyama AldolReaction,“J.Am.Chem.Soc.132(28):9546-9548；Alam J、Keller TH、&Loh T-P(2011),“Indium mediated allylation in peptide andprotein functionalization”,Chem.Commun.47(32):9066-9068)。能够实现肟生物结合的普遍接受的具有通用性和操作简单性的形成C-C键的转化尚没有被报道。这种技术将代表该领域的重大的进步。令人惊讶地，本发明提供基于这种技术的试剂和方法以及由此形成的生物分子缀合物。
发明概述
在各种实施方案中，本发明提供了能够参与Pictet-Spengler连接反应(一种C-C键形成反应，其在中间步骤中利用了肟形成的生物正交性)的化合物。这种新的反应可用于制备与包括抗体在内的生物分子(例如乙二醛-修饰的蛋白质和甲酰甘氨酸修饰的蛋白质)的水解稳定的缀合物。
所述的Pictet-Spengler连接反应具有最初使得传统的肟-和腙-蛋白质缀合反应流行的选择性、动力学、和操作简单性。然而，其氧杂咔啉(oxacarboline)产物能够允许生物结合物持续存在于其中C＝N连接目前被破坏的导致水解的环境中。我们使用多种醛官能化的蛋白质(包括一种治疗相关的人IgG)证明了所述方法的通用性。模型反应表明，酮也是可能的底物，这是关于生物结合的一个未来的研究方向。在本文中，我们集中于Pictet-Spengler连接反应用于修饰经过纯化的蛋白质的用途，但是其应用延伸到能够用反应性羰基官能化的其它生物分子。用于具有酮基团和醛基团的聚糖的代谢官能化(Mahal LK、Yarema KJ、&Bertozzi CR(1997),“Engineering ChemicalReactivity on Cell Surfaces Through OligosaccharideBiosynthesis”,Science 276(5315):1125-1128；Sadamoto R等人(2004),“Control of Bacteria Adhesion by Cell-WallEngineering”,J.Am.Chem.Soc.126(12):3755-3761；Hang HC&Bertozzi CR(2001),“Ketone Isosteres of 2-N-Acetamidosugarsas Substrates for Metabolic Cell SurfaceEngineering”,J.Am.Chem.Soc.123(6):1242-1243)、酶促官能化(TaiH-C、Khidekel N、Ficarro SB、Peters EC、&Hsieh-Wilson LC(2004),“Parallel Identification of O-GlcNAc-Modified Proteins fromCell Lysates”,J.Am.Chem.Soc.126(34):10500-10501)、和化学官能化(O'Shannessy DJ、Voorstad PJ、&Quarles RH(1987),“Quantitation of glycoproteins on electroblots using thebiotin-streptavidin complex”,Anal.Biochem.163(1):204-209；Zeng Y、Ramya TNC、Dirksen A、Dawson PE、&Paulson JC(2009),“High-efficiency labeling of sialylated glycoproteins onliving cells”,Nat.Methods 6(3):207-209)的方法是成熟的，并且在糖基化蛋白质的蛋白质组学分析中得到应用。Pictet-Spengler连接反应可以提高这些方法的性能，以及增强设法使用生物正交化学检测或操纵羰基的其它方面(Smith CD等人(1991),“Excess brainprotein oxidation and enzyme dysfunction in normal aging andin Alzheimer disease”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(23):10540-10543；Nystrom T(2005),“Role of oxidativecarbonylation in protein quality control and senescence”,EMBOJ24(7):1311-1317)。
在一个示例性实施例中，本发明提供具有下式的化合物：
其中A存在或者不存在，并且，当存在时，是被取代的或未被取代的芳基或被取代的或未被取代的杂芳基部分，并且R1选自以下的成员：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、卤素、CN、CF3、酰基、-SO2NR5R6、-NR5R6、-OR5、-S(O)2R5、-C(O)R5、-COOR5、-CONR5R6、-S(O)2OR5、-OC(O)R5、-C(O)NR5R6、-NR5C(O)R6、-NR5SO2R6和-NO2，其中R1、R2、R3、和R4中的两个或更多个与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的环系统：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
R5和R6是独立地选自以下的成员：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代的或未被取代的杂环烷基，以及R9和R10与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的5-7元环：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
符号Rx、Ry和Rz表示H、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的杂烷基，条件是Rx和Ry中的至少一个具有选自以下的结构：
Ro选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和s选自1和2。选自R1、Rx、Ry和Rz的成员具有下式的结构：
其中L是选自以下的连接基：被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和X选自可检测的标记、交联基团、聚(氧化烯)和亲和标记。
在另一个示例实施例中，本发明提供使用本发明的化合物(例如，式I的化合物)形成生物分子(例如，抗体)的缀合物的方法。
在各种实施方案中，本发明提供通过蛋白质与式I的化合物之间的反应形成的生物分子缀合物。
在一个示例性实施方案中，本发明提供利用蛋白质和式I的化合物之间形成的缀合物进行的生物分子分析法。所述方法包括形成生物分子与本发明化合物之间的缀合物和检测所述缀合物。
本发明的其它示例性目的、优点和方面在随后的发明详述中阐明。
附图说明
图1是Pictet-Spengler连接反应的设计和评价。(A)Pictet-Spengler反应。(B)Pictet-Spengler连接反应。(C)用于本研究的醛-和酮-反应性吲哚的合成。(D)1a与异丁醛在包含100mM氘化乙酸盐(pD≤5.5)或磷酸盐(pD≥6.0)缓冲液的D2O溶液中的二级速率常数。误差线表示至少三个重复实验的标准偏差。使用的缩写：TBS，叔丁基二甲基甲硅烷基；DBU，1,8二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；TBAF，四丁氟化铵；Teoc，2-(三甲代甲硅烷基)乙氧基羰基；ADDP，1,1’-(偶氮二羰基)二哌啶；PFP，五氟苯基；DIPEA，二异丙基乙胺。
图2示出了模型肟和氧杂咔啉的水解稳定性。(A)示出了5a和5b的水解的反应路线。(B)液相色谱数据，示出了1μM 5a和5b在室温下经历两天的水解。
图3.对乙二醛-Mb进行的Pictet-Spengler连接反应的优化。(A)乙二醛-Mb的生物素酰化的一般方案。吲哚1b表现出(B)浓度依赖性的、(C)时间依赖性的和(D)pH依赖性的乙二醛-Mb标记。另外，(E)生物素酰化可以通过用BnONH2的共处理减少。将Mb(醛)或乙二醛-Mb(+醛)用(B)0-200μM1b在pH 4.0处理3小时、(C)用250μM1b在pH 4.0处理0-2小时、(D)用250μM1b在pH 4.0-75处理3小时、或(E)在0-800μMBnONH2的存在下用100μM1b在pH 45处理3小时。所有反应在37℃进行并用10μM苯甲醛淬灭，随后通过SDS-PAGE解析。使用异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的α-生物素抗体评价生物素酰化，使用丽春红S评价总蛋白负载。
图4.通过Pictet-Spengler连接反应进行的FGly-MBP修饰。(A)示出了与FGly-MBP的Pictet-Spengler连接反应并随后进行包含氧杂咔啉的C末端8聚体肽的凝血酶催化的裂解的反应路线。(B)Pictet-Spengler连接反应的ESI-MS分析。将FGly-MBP和MBP C390A与1mM 1a在pH 5.0在37℃保温12小时。(C)FGly-MBP缀合物的凝血酶催化的裂解。在较高[凝血酶]时AF488-MBP缀合物的荧光减少，这与仅在C末端进行标记相一致。(D)AF488-MBP缀合物水解的荧光偏振分析；插图示出了紧随添加凝血酶之后的溶液的偏振。将包含100nMAF488缀合物的溶液在磷酸缓冲盐水(pH 7.2)中于37℃保温一周，随后添加凝血酶。
图5.通过Pictet-Spengler连接反应修饰的FGly-α-HER2的表征。(A)FGly-α-HER2和AF488-α-HER2的还原和非还原SDS-PAGE分析。(B)用人抗体处理的SKOV3和Jurkat细胞群的中值荧光强度。将细胞用AF488-α-HER2、FGly-α-HER2或人同位素对照处理，然后用α-hIgG和α-AF488抗体进行荧光标记。误差线表示三个重复实验的标准偏差。
图6由1a与(A)异丁醛和(B)丙酮的反应获得的粗材料的1HNMR谱。
图7液相色谱(A440)，示出了1μM 5a和5b在室温下在pH 4.50的5μM乙酸钠中的水解。化合物4是单独合成的，且其色谱强度是随意刻度的。样品的分析使用了在含0.1％三氟乙酸的H2O中的从5％到95％乙腈的梯度。
图8在多种条件下通过氧杂咔啉或肟形成进行的乙二醛-Mb的生物素酰化。将Mb或乙二醛-Mb用1b或商购的N-(氨基氧基乙酰基)-N1-(D-生物素酰基)肼处理。条件：(A)0-200μM生物素探针，在pH 4.0进行3小时，(B)250μM生物素探针在pH 4.0进行0-2小时，(C)250μM生物素探针，在pH 4.0-7.5进行3小时，(D)100μM生物素探针，在0-800μM BnONH2的存在下在pH 4.5进行3小时，或者(E)100μM 1b在0-50μM经过缓冲的苯胺的存在下在pH 4.5、5.5或6.5进行4小时。所有反应都是在37℃进行并用10μM苯甲醛淬灭，随后通过SDS-PAGE解析。使用FITC-缀合的α-生物素抗体评价生物素酰化，使用丽春红S评价总蛋白负载。
图9与1a缀合的FGly-MBP的隐蔽消化(cryptic digests)的质谱分析。(A)示出了经过修饰的肽的高分辨率ESI-MS谱。计算的质量：1032.5114；实测值：1032,5220。(B)通过电子-转移解离进行的经过修饰的肽的MS/MS片段化。
图10在PBS中的AF488-MBP缀合物的UV-vis谱。
图11在PBS中的AF488-α-HER2缀合物的UV-vis谱。
图12完整的合成反应路线，示出了(A)吲哚和制备所述吲哚所需的化合物的制备和(B)用于小分子水解实验的荧光素衍生物的制备。
发明详述
I.引言
本发明提供用于优选产生目标蛋白缀合物的新方法。在示例性实施方案中，这些缀合物是蛋白质和可检测的标记或亲和标记之间形成的缀合物。本发明的化合物和方法代表了用于生产和识别标记蛋白质的完整体系。在一个示例性实施方案中，所述蛋白质缀合物优选结合大分子的目标或目标位点。示例性的目标蛋白质包括各种细胞相关的和非细胞相关的分子。
在更具体地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于本文中描述的特定实施方案，因为这种实施方案可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅仅出于描述特定实例的目的，并且所述术语不是限制性的。本发明的范围仅由权利要求来限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同含义。在提供数值的范围的情况中，应该理解为该范围的上限和下限以及该指明范围内的任何其它指明的数值或居间数值之间的每个居间数值(直到所述下限的单位的十分之一，除非上下文清楚地表明情况不是这样)都被包括在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该较小范围内并且也被包括在本发明范围内，服从该指明范围中的任意特定排除的限制。在指明的范围包括所述限制之一或者其二者的情况中，排除所述限制之一或其二者的范围也被包括在本发明之内。某些范围在本文中呈现为被冠以“约”的数值。术语“约”在本文中用于为它后面的精确数值以及接近或邻近该术语后面的数字的数字提供字面上的支持。在确定一个数字是否接近或邻近特定描述的数字时，该接近或邻近的未描述数字可以是一个数字，所述数字在其存在的上下文中提供所述具体描述的数字的基本上等价物。本说明书中引用的所有的出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，如同每个独立的出版物、专利或专利申请被明确地和单独地以引用的方式并入本文。此外，每个引用的出版物、专利、或专利申请通过引用的方式并入本文用以公开和描述与引用该出版物相关的主题内容。对于任何出版物的引用是对于申请日之前的公开，且不应认为是本文中描述的本发明由于在前的发明而不能早于这种公开的认可。此外，所提供的公开可能不同于实际的公开日期，所述实际的公开日期可能需要单独地加以确认。
需要指出的是，权利要求书可以撰写为排除任何非必需的要素。因而，此处的声明意在用作在涉及描述权利要求要素时使用排除术语如“仅”、“只”等或使用“否定”限制的在先基础。对于阅读了本公开的本领域技术人员显而易见的是，本文中描述或者阐明的各个实施方案中的每一个都具有孤立的成分和特征，可以如一地将这些孤立的成分和特征与任何其它几个实施方案的特征分离开或者组合，而不脱离本发明的范围或主旨。可以以描述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序来执行任何所描述的方法。尽管也可以在本发明的实践或测试中使用与本文中描述的方法和材料相似或者等效的任何方法和材料，以下描述代表性的说明性方法和材料。
在描述本发明时，使用了以下术语，这些术语具有以下所述的定义。
II.定义
在取代基团通过它们常规的从左至右书写的化学式指明时，所述结构任选地还包括所述结构从右到左书写形成的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-意在还任选地表示-OCH2-。
除非另有说明，术语“烷基”本身或者作为另一个取代基的一部分表示直链或支链、或者环状的烃基或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和或多不饱和的并且可以包括二价、三价和多价的基团(例如，亚烷基)，具有指定碳原子数目(即C1-C10表示一个到十个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于诸如以下基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级的同系物和异构体。除非另作说明，术语“烷基”还意在任选地包括以下更详细地定义的那些烷基衍生物，如“杂烷基”。局限于烃基的烷基被称为“同烷基(homoalkyl)”。示例性的烷基包括单不饱和的C9-10油酰基链(oleoyl chain)或双不饱和的C9-10,12-13亚麻酰基链(linoeyl chain)。
术语“亚烷基”本身或者作为另一个取代基的一部分是指衍生自烷的二价基，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括如下作为“杂亚烷基”所述的那些基团。通常，烷基(或亚烷基)具有1-24个碳原子，本发明优选具有10个或更少个碳原子的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是短链的烷基或亚烷基，一般具有八个或更少个碳原子。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，是指分别通过氧原子、氨基或硫原子连接到分子的其余部分的那些烷基基团。
术语“芳氧基”和“杂芳氧基”以其常规的含义使用，是指通过氧原子连接到分子的其余部分的那些芳基或杂芳基基团。
除非另有说明，术语“杂烷基”本身或者与另一个术语结合，表示由所述数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成的稳定的直链或支链、或环烃基、或其组合，其中的氮原子和硫原子可以任选地被氧化且所述氮杂原子可以任选地被季铵化。所述的杂原子O、N和S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置或者位于所述烷基连接到分子的其余部分的位置。实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。最多两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”本身或者作为另一个取代基的一部分是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基，杂原子还可以占据链的任一个末端或者同时占据链的两个末端(例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基而言，书写所述连接基的化学式的方向隐含了所述连接基的任意取向。例如，式-CO2R’-既表示-C(O)OR’又表示-OC(O)R’。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或者与其它术语结合分别表示环状的“烷基”和“杂烷基”。另外，对于杂环烷基而言，杂原子可以占据所述杂环连接到所述分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。另外的示例性环烷基包括甾体，例如胆甾醇及其衍生物。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有说明，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一个取代基的一部分是指氟、氯、溴、或碘原子。另外，诸如“卤代烷基”的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意在包括但不限于三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的芳族取代基，其可以是单环或稠合在一起或通过共价连接的多环(优选具有1-4个环)。术语“杂芳基”是指包含1-4个选自N、O、S、Si、Se、P和B的杂原子的芳基(或环)，其中的氮和硫原子任选地被氧化，且所述氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子连接到分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-异唑基、4-异唑基、5-异唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、和6-喹啉基。用于每一个上述芳基和杂芳基环系统的取代基可以选自如下所述的可接受的取代基。
为了简便起见，术语“芳基”在与其它术语(例如，芳氧基、芳硫氧基、芳基烷基)组合使用时同时包括上述定义的芳基环和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意在包括其中芳基连接于烷基的那些基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括烷基中一个碳原子(例如，亚甲基)已经被例如氧原子代替的那些情况(例如，苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。
上述术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中的每一个意在任选地包括所示基团的被取代形式和未被取代的形式。用于各种类型基团的示例性取代基在下面提供。
用于烷基和杂烷基(包括通常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)的取代基统称为“烷基取代基”，且它们可以是选自以下的各种基团中的一个或多个(但不限于此)：H、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的杂环烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，取代基的个数为从零到(2m’+1)，其中m’是这种基团中碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地表示氢、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基如被1-3个卤素取代的芳基、被取代的或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基。在本发明的化合物包括不止一个R基团时，每个R基团独立地选自R’、R”、R’”、和R””，例如在存在有多于一个的这种基团时。当R’和R”连接于同一氮原子时，它们可以与所述氮原子合起来形成5-、6-、或7-元环。例如，-NR’R”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基的讨论，本领域技术人员可以理解，术语“烷基”意在包括这样的基团，即，其包括结合有与除氢以外的基团，例如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。这些术语涵盖了被认为是示例性的“烷基取代基”的基团，这些烷基取代基是示例性的“被取代的烷基”和“被取代的杂烷基”部分的成员。
与对于烷基所述的取代基类似，用于芳基和杂芳基的取代基统称为“芳基取代基”。这些取代基选自例如H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、被取代的或未被取代的杂环烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基、和氟代(C1-C4)烷基，取代基的个数为从零到所述芳环系统上开放价键的总数；且其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。在本发明的化合物包括不止一个R基团时，每个R基团独立地选自R’、R”、R’”、和R””，例如在存在有多于一个的这些基团时。
芳基或杂芳基环上相邻原子的两个取代基可以任选地被下式的取代基所代替：-T-C(O)-(CRR’)q-U-，其中T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR’-或单键，且q是0到3的整数。或者，芳基或杂芳基环上相邻原子的两个取代基可以任选地被下式的取代基所代替-A-(CH2)r-B-，其中A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，且r是1到4的整数。如此形成的新的环的一个单键可以任选地被一个双键所代替。或者，芳基或杂芳基环上相邻原子的两个取代基可以任选地被下式的取代基所代替-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-，其中s和d独立地为0到的整数3，且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、或-S(O)2NR’-。取代基R、R’、R”和R’”优选独立地选自氢或被取代的或未被取代的(C1-C6)烷基。这些术语涵盖了被认为是示例性的“芳基取代基”的基团，这些芳基取代基是示例性的“被取代的芳基”和“被取代的杂芳基”部分的成员。
如本文中使用的，术语“酰基”表示包含羰基残基的取代基，即C(O)R。示例性的R包括H、卤素、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、和被取代的或未被取代的杂环烷基。
如本文中使用的，术语“稠环系统”意味着两个环，其中每个环与另一个环共享至少两个原子。“稠环系统”可以包括芳族环以及非芳族环。“稠环系统”的实例是萘、吲哚、喹啉、苯并吡喃等。
如本文中使用的，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)和硼(B)。
“聚(氧化烯)”是指具有聚醚主链的一类化合物。在本发明中使用的多(氧化烯)类包括例如直链的和支链的。另外，示例性的聚(氧化烯)的末端可以是一个或多个反应性的、可活化的、或惰性的基团。例如，聚(乙二醇)是由重复的氧化乙烯子单元组成的聚(氧化烯)，其可以或可以不在末端包括另外的反应性的、可活化的或惰性的部分。有用的聚(氧化烯)包括在一个末端被惰性基团“封端”的那些，例如，单甲氧基聚(氧化烯)。在所述分子是支链分子时，其可以在所述氧化烯链的多个末端包括多个反应性的、可活化的或惰性的基团且所述反应性基团可以是相同或不同的。具有杂双官能的直链聚(氧化烯)衍生物在本领域中也是已知的。
“蛋白质”是指其中的单体是氨基酸并通过酰胺键结合在一起的一种聚合物，或者称为多肽。另外还包括非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。非核苷酸编码的氨基酸也可以被结合在蛋白质中。此外，在本发明中还可以使用经过修饰而包括活性基团、糖基化位点、聚合物、治疗性部分、生物分子等的氨基酸。氨基酸可以是其d-或l-异构体形式。一般优选l-异构体。如本文中使用的，“蛋白质”是指糖基化的多肽和未糖基化的多肽二者。还包括了通过表达所述蛋白质的系统不完全糖基化的蛋白质。对此的全面评论，参见Spatola,A.F.的CHEMISTRYANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS,PEPTIDESANDPROTEINS,B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)。
如本文中使用的，术语“抗体”是指能够特异性地结合于抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或来源于重组来源的完整的免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人，1999,Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等人，1988,Science 242:423-426)。“抗体”还包括合成抗体。
如本文中使用的，术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，例如，通过本文中描述的噬菌体表达的抗体。该术语还应该理解为表示通过合成编码所述抗体的DNA分子且通过该DNA分子表达抗体蛋白质或确定所述抗体的氨基酸序列所生成的抗体，其中所述的DNA或氨基酸序列使用本领域中可获得的且公知的合成DNA技术或氨基酸序列技术获得。
符号“R”是一个通用的缩写，表示选自以下的取代基团：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、和被取代的或未被取代的杂环烷基。
术语“底物”和“前体”可互换使用且表示能够用包括醛或酮的部分进行化学修饰的生物分子。
本文中公开的化合物还可以包含构成这种化合物的一种或多种原子的非天然比例的原子同位素。例如，所述化合物可以用例如如下的放射性同位素进行放射性标记：氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)。本发明化合物的所有同位素形式，无论是否为放射性的，都被包括在本发明范围内。
“亲和标记”：如本文中使用的，术语亲和标记是指与配对实体(例如，捕获试剂)特异性地相互作用/结合的基团、部分、或实体。亲和标记/捕获试剂对通常被称为“亲和对”。所述亲合对可以是生化试剂对。生化试剂对的非限制性实例包括抗体-抗原、酶-抑制剂、激素类-受体、糖-外源凝集素、生物素-(链霉)亲和素、和互补性核酸组分。
“与...结合”或“与之结合”：在两个实体彼此结合时，如本文中所述的，它们是通过直接或间接的共价或非共价相互作用连接的。优选所述结合是共价的。所希望的非共价相互作用包括氢键、范德华相互作用、疏水性相互作用、磁相互作用、库伦相互作用、亲合力相互作用、或其组合、等等。
“可检测标记”或“可检测部分”是指可以通过光谱学、光化学、生化试剂、免疫化学、化学、或其它物理学手段检测到的组分。例如，适合于本发明的应用的标记包例如放射性标记(例如，32P)、荧光团(例如，荧光素)、电子密度试剂、酶(例如，如通常用于ELISA的酶)、生物素、地高辛配基、或半抗原和蛋白质(所述的半抗原和蛋白质是通过例如将放射性标记结合到所述半抗原或肽中而使得可检测到的那些，或者用于检测与半抗原或肽具有特异性反应性的抗体的那些)。
本发明还通过以下化合物来举例说明，所述化合物与蛋白质结合的羰基部分如醛和酮类进行Pictet-Spengler连接反应。
III.组合物
在一个示例性实施例中，本发明提供下式的化合物：
其中A存在或者不存在，并且，当存在时，表示被取代的或未被取代的芳基或杂芳基部分，以及R1是选自以下的成员：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、卤素、CN、CF3、酰基、-SO2NR5R6、-NR5R6、-OR5、-S(O)2R5、-C(O)R5、-COOR5、-CONR5R6、-S(O)2OR5、-OC(O)R5、-C(O)NR5R6、-NR5C(O)R6、-NR5SO2R6和-NO2，其中R1、R2、R3、和R4中的两个或更多个与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的环系统：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。符号Rx、Ry和Rz表示H、被取代的或未被取代的烷基或被取代的或未被取代的杂烷基，条件是Rx和Ry中的至少一个具有选自以下的结构：
Ro选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和s选自1和2.选自R1、Rx、Ry和Rz的成员具有下式的结构：
其中L是选自以下的连接基：被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和X选自可检测的标记、交联基团、聚(氧化烯)和亲和标记。
在一个示例性实施方案中，L-X组合被结合于所述环状结构的氮，形成下式的化合物：
在多种的实施方案中，本发明的化合物具有选自以下的结构：
在一个示例性实施方案中，本发明的化合物具有选自以下的结构：
在多种的实施方案中，A是被取代的或未被取代的苯基。
在多种的实施方案中，本发明的化合物具有下式的结构：
其中R1、R2、R3、和R4选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、卤素、CN、CF3、酰基、-SO2NR5R6、-NR5R6、-OR5、-S(O)2R5、-C(O)R5、-COOR5、-CONR5R6、-S(O)2OR5、-OC(O)R5、-C(O)NR5R6、-NR5C(O)R6、-NR5SO2R6和-NO2，其中R1、R2、R3、和R4中的两个或更多个与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的环系统：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
R5和R6是独立地选自以下的成员：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代的或未被取代的杂环烷基，以及R9和R10与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的5-7元环：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
如本文中使用的，术语“连接基”是指本发明化合物的一部分，其将X连接到分子的其余部分。间隔基可以是亲水性的(例如，四乙二醇、六乙二醇、聚乙二醇)，或者它们可以是疏水性的(例如，己烷、癸烷等)，或者是同时包括亲水性和疏水性结构的混合结构。
在一个示例性实施方案中，本发明的化合物包括选自以下的连接基：C1-C30烷基或杂烷基、C1-C30被取代的烷基或杂烷基、聚醇、聚醚(例如，聚乙二醇)、聚胺、聚氨基酸、多聚糖、及其组合。在不同的实施方案中，连接基L是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个碳原子的被取代的或未被取代的烷基。
在多种的实施方案中，所述连接基具有下式的结构：
其中R7选自以下的成员：被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和n选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在不同的实施方案中，所述连接基包括含有下式的聚(氧化烯)子单元：
其中m选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在各种的实施方案中，所述连接基包括聚(氧化烯)子单元：
在某些实施方案中，有利的是，本发明化合物的连接基为X和分子的其余部分之间的连接赋予柔性和一定距离。在不同的实施方案中，使用连接基调节X的性能和/或整个化合物的性能。
在示例性实施方案中，间隔基起到在本发明化合物与将与其反应的生物分子之间形成一定距离的作用。具备这种特性的连接基具有若干用途，包括降低X与引入的生物分子之间的空间位阻影响。
在又一个实施方案中，用于本发明化合物的连接基具有可以被裂解掉以便从缀合物释放X(以及任选的部分，例如，结合于亲和标记的分子)、生色团(fluorophore)、聚氧化烯等的基团。有许多可裂解基团本领域中是已知的。参见例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta,761:152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.,265:14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.,124:913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.,155:141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.,261:205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.,143:1859-1867(1989)。另外，可以从不同供应商如Pierce商购得到大量的可裂解的双官能(包括相同或不同的双官能)间隔臂，并且这些中有许多适合于并入到本发明化合物中。
本发明化合物的一个优点在于它们可与各种各样的能量供体和/或受体分子一起使用以构建探针。可与PL连接的大量生色团对于本领域技术人员来说是已知的。参见例如，Cardullo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.ofChemical Physics21:836-850(1953)；Hochstrasser等人，Biophysical Chemistry45:133-141(1992)；Selvin,P.,Methods inEnzymology246:300-334(1995)；Steinberg,I.Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang等人，Tetrahedron Letters31:6493-6496(1990)；Wang等人，Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。
可用于与本发明的猝灭剂连接的示例性生色团的非限制性列表在以下表1中提供。
现有文献有许多实用的指导涉及为特定探针选择合适的生色团，例如以下文献：Pesce等人，Eds.,FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(MarcelDekker,New York,1971)；White等人，FLUORESCENCE ANALYSIS:A PRACTICALAPPROACH(Marcel Dekker,New York,1970)；等等。这种文献还包括提供了荧光分子和生色分子以及它们的相关光学性质的详细列表的那些文献(参见例如，Berlman,HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATICMOLECULES,2nd Edition(Academic Press,New York,1971)；Griffiths,COLOUR和CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press,New York,1976)；Bishop,Ed.,INDICATORS(Pergamon Press,Oxford,1972)；Haugland,HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES和RESEARCH CHEMICALS(MolecularProbes,Eugene,1992)Pringsheim,FLUORESCENCEANDPHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers,New York,1949)；等等。另外，在文献中有详尽的指导涉及将用于通过可以被添加到分子上的可容易得到的活性基团共价连接的报道分子和猝灭剂分子衍生化。
可用于将生色团缀合到其它分子和表面上的化学作用的多样性和实用性由关于制备用生色团衍生化的核酸的详尽文献作为示例。参见例如，Haugland(supra)；Ullman等人，美国专利3,996,345；Khanna等人，美国专利4,351,760。
在另一个示例实施例中，X是螯合剂或螯合物。示例性的螯合剂是氨基羧酸类(即，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等以及它们的膦酸类似物如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等)。
许多有用的螯合基团、冠醚类、穴状配体等在本领域中是已知的并且可以结合到本发明化合物中。参见例如，Pitt等人，“The Designof Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload,“In,INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY和MEDICINE；Martell,Ed.；AmericanChemical Society,Washington,D.C.,1980,pp.279-312；Lindoy,THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES；Cambridge UniversityPress,Cambridge,1989；Dugas,BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag,New York,1989，以及其中包含的参考文献。
另外，用于将螯合剂、冠醚和环糊精连接到其它分子的多种路线对于本领域技术人员来说是已知的。参见例如，Meares等人，“Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins andPolypeptides”，来自MODIFICATION OF PROTEINS:FOOD,NUTRITIONAL,ANDPHARMACOLOGICAL ASPECTS，Feeney等人，Eds.,American ChemicalSociety,Washington,D.C.,1982,pp.370-387；Kasina等人，Bioconjugate Chem.,9:108-117(1998)；Song等人，BioconjugateChem.,8:249-255(1997)。
在其它实施方案中，X是一种荧光敏化剂。示例性的敏化剂包括罗丹明560、575和590荧光素、2-或4-喹诺酮、2或4-香豆素、或其衍生物例如香豆素445、450、490、500和503、4-三氟甲基香豆素(TFC)、7-二乙基-氨基-香豆素-3-甲酰肼(carbohyddzide)等，和特别是2-羟基喹啉124(7-氨基-4-甲基-2-喹诺酮)、香豆素120(7-氨基-4-甲基-2-香豆素)、香豆素124(7-氨基-4-(三氟甲基)-2-香豆素)、氨基甲基三甲基补骨脂素、萘等。
在一个示例性实施方案中，敏化剂是包括萘基的部分。
在另一个实施例中，X是亲合部分。示例性的亲合部分选自：广泛的各种小的生物活性分子(例如，药物、杀虫剂、毒素等)、有机官能团(例如，胺、羰基、羧基等)、生物分子、金属、金属螯合物和有机金属化合物。
提供方法和组合物用于生产低聚的亲和标记分子并优选用于将那些低聚的亲和标记分子共价结合于大分子靶标，其中的靶标是复杂混合物，诸如血浆、血液、脑脊液等的组分，和/或在所述大分子靶标上具有一个位点或者有限数目的多个位点上存在优先键合。本文中描述的方法代表了用于从组合库生产和识别亲和标记分子的完整系统，所述亲和标记分子在体外或体内优先地与大分子靶标或靶标位点结合并且优先地将那些亲和标记结合到感兴趣的大分子上。
可用于本发明的示例性亲和标记分子是低聚的且具有可用的反应性官能团，所述的反应性官能团与连接部分L上的反应性官能团为反应性互补的。示例性的亲和标记分子能够与复杂混合物中的感兴趣的大分子靶标或靶标位点特异性地相互作用。与大分子靶标或靶标位点的特异性相互作用是指，与亲和标记分子和大分子靶标在其中进行结合的环境中的其它组分相比，该亲和标记会表现出对所述大分子靶标的优先结合。所述的优先通常是在不存在所述低聚物的情况下的随机结合的至少约1.5倍、优选至少约2倍。
在示例性实施方案中，所述亲和标记是低聚的亲和标记。所述的低聚的亲和标记可以是寡肽、寡核苷酸、低聚糖、或其组合等等。
通常，每个低聚亲和标记的单体单元数目为4-12个，更通常为4-8个，且优选为5-8个。构成低聚亲和标记的单体单元可以是天然存在的或合成的，一般具有约2-30个碳原子，通常为2-18个碳原子且优选为约2-12个碳原子。
在不同的实施方案中，所述的亲和标记是寡肽，且氨基酸单体可以是天然存在的或是合成的。方便地，使用天然存在的L-a-氨基酸，但是也可以使用D-对映体。
在不同的实施方案中，亲和标记是寡核苷酸。可以容易地采用任何寡核苷酸，无论是天然存在的还是合成的核苷酸单体。
特别地，对于合成的核苷酸而言，磷酸基团或者糖基团可以经过修饰，使得其中的磷酸盐中的氧原子被硫或氮所代替，所述磷酸基团被磺酸根、酰胺等代替，核糖或脱氧核糖可以被具有5-6个碳原子的糖所代替，例如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖等，嘌呤和嘧啶可以通过在氮上被烷基或酰基取代而进行修饰、可以采取不同的环结构、可以用氧代替氮或反之亦然，等等。
在不同的实施方案中，所述亲和标记是低聚糖。示例性的低聚糖一般具有4-6个单体单元，可以是直链或支链的，由具有5-8个碳原子的糖组成。可以采用对已知低聚糖的各种修饰，特别是在考虑与外源凝集素或粘附分子结合的情况中。
在另一个示例实施方案中，X是药物部分。所述药物部分可以是已经被接受用于临床应用的药物，或者它们可以是处于实验应用阶段的药物或其活性或作用机理正在进行研究的药物。所述药物部分可以对于给定疾病状态具有得到证实的作用，或者可以是仅假设对于给定的疾病状态具有期望作用。在另一个示例实施方案中，所述药物部分是经过筛选而能够与选定的被分析物相互作用的化合物。在本发明中可用作X的药物部分包括来自具有多种药理学活性的广泛药物类别的药剂。
在另外的示例性实施方案中，X是生物分子，如蛋白质、核酸、肽或抗体。用于本发明的生物分子可以源于任意来源。所述生物分子可以从天然来源分离得到，或者可以通过合成的方法来生产。蛋白质可以是天然的蛋白质或突变的蛋白质。突变可以通过化学诱变、定点诱变或本领域技术人员已知的其它诱导突变的手段来实现。可用于实践本发明的蛋白质包括例如酶、抗原、抗体和受体。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。肽和核酸可以从天然来源分离得到，或者可以是完全或者部分合成来源的。
在其中X是蛋白质或抗体的那些实施方案中，蛋白质通过所述蛋白质表面上任何可用的反应性肽残基连接于分子的其余部分。在优选的实施方案中，活性基团是胺或羧酸根。在示例性实施方案中，活性基团是赖氨酸残基的ε-胺基。
其它示例性的亲合部分包括但不限于小沟结合物和嵌入试剂。
IV.方法
本发明还提供制备生物分子与本发明化合物之间的缀合物的方法。在一个示例性实施方案中，提供了对用选自醛和酮的成员官能化的生物分子进行修饰的方法，所述方法包括：(a)使所述生物分子在适合于通过所述化合物与醛和酮的反应形成环化的Pictet-Spengler加合物的反应条件下接触前述提出的任一化合物，从而修饰所述生物分子。
在一个示例性实施方案中，本发明提供活化生物分子前体用于与本发明化合物反应的方法。因此，在步骤(a)之前，可以用包括选自所述醛和所述酮的一个成员的反应性部分来修饰前体生物分子，从而形成用选自醛和酮的一个成员官能化的生物分子。
V.缀合物
本发明还提供由本发明化合物与生物分子之间形成的缀合物。本发明的缀合物中的示例性生物分子组分包括蛋白质、聚糖、核酸、代谢物、抑制剂、脂质、和辅助因子。
在一个示例性实施方案中，所述缀合物具有选自以下的结构：
其中R1、R5和R6如上述定义。
在不同的实施方案中，所述缀合物具有选自以下的结构：
以下实施例阐明本发明的实施方案但非意在限制本发明的组合物或使用这些组合物的方法的范围。
实施例
实施例1
材料和方法
A.通用合成方法
所有试剂得自Sigma-Aldrich、Acros、或TCI并且在不经进一步纯化的情况下使用。无水溶剂通过氧化铝和Q-5(1)的柱子进行了干燥和除氧，例外是N,N-二甲基甲酰胺，其在购买时在密封的瓶子中并在加有分子筛的情况下储存。氘化溶剂购自Cambridge IsotopeLaboratories。在配备有Welch 2026自动清洗干式真空泵或EdwardsRV3真空泵的Buchi Rotavapor R-114上去除溶剂。
薄层色谱法在Silicycle硅胶板上进行并通过UV照射或I2染色进行分析。快速色谱法使用Silicycle230-400目硅胶进行。高压液相色谱在具有210和254nm UV吸收检测器的Varian ProStar装置上进行。制备HPLC在C18反相柱(250x21.4mm)上进行，溶剂流速为20mL/min；或者在Varian Microsorb 300-5C4反相柱(250x4.6mm)上进行，溶剂流速为1mL/min。
NMR谱是在Bruker AVQ-400、AVB-400、DRX-500、AV-500、或AV-600光谱仪获取的。1H NMR谱以残余的CHCl3(7.26ppm)、CD2HCN(1.94ppm)、或CD2HOD(3.31ppm)作为参考。13C NMR谱以CDCl3(77.16ppm)、CD3CN(1.32ppm)、或CD3OD(49.00ppm)作为参考。使用MestReNova(Mestrelab Research S.L.)处理NMR谱。小分子的高分辨率ESI质谱在位于UC Berkeley Mass Spectrometery Facility的Thermo LTQ Orbitrap质谱仪上获得。
B.新化合物的合成
2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1H-吲哚(6)：向经过烘干的烧瓶加入吲哚-2-甲醇(1.581g,10.74mmol)、TBSCl(1789g,11.87mmol,1.10equiv)、和咪唑(2.197g,32.27mmol,3.00equiv)，并将混合物悬浮在CH2Cl2(40mL,无水)中。在16小时之后，将反应混合物浓缩为橙色残余物。将粗的混合物吸收在Et2O(50mL)中，用AcOH水溶液(5％v/v,3x50mL)和盐水(25mL)洗。合并的有机层用硫酸钠干燥并浓缩为结晶固体(2.789g,10.67mmol,99％)，其不经进一步纯化直接使用。Rf＝0.5，9:1己烷:EtOAc。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.29(s,1H),7.57(d,J＝7.7Hz,1H),7.37(dd,J＝8.1,0.6Hz,1H),7.19-7.14(m,1H),7.12-7.07(m,1H),6.32(d,J＝1.0Hz,1H),4.89(s,2H),0.95(s,9H),0.12(s,6H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ138.3,136.0,128.6,121.7,120.5,119.8,110.9,99.0,59.4,26.1,18.5,-5.2。HRMS(ESI)计算值C15H24NOSi[M+H]+:262.1627；实测值：262.1625。
3-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)-1H-吲哚-l-基)丙酸甲酯(7)：向6(2.789g,10.67mmol)的乙腈(25mL)溶液中加入丙烯酸甲酯(4.80mL,53.3mmol,5.00equiv)随后加入1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU；800μL,5.35mmol,0.50equiv)，并使得到的混合物回流。在18小时之后，将溶液冷却并浓缩为橙色油状物，将其通过硅胶色谱法纯化(9:1己烷:EtOAc,Rf＝0.4)，得到无色油状物(3.543g,10.19mmol,96％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.58(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(d,J＝8.2Hz,1H),7.23-7.18(m,1H),7.12-7.07(m,1H),6.38(s,1H),4.84(s,2H),4.54-4.49(m,2H),2.89-2.84(m,2H),0.91(s,9H),0.10(s,6H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.0,138.5,137.1,127.7,122.0,121.0,119.8,109.3,101.8,58.2,51.9,39.5,34.6,26.0,18.4,-5.2。HRMS(ESI)计算值C19H30NO3Si[M+H]+:348.1995；实测值：348.1996。
3-(2-(羟甲基)-1H-吲哚-1-基)丙酸甲酯(2):在0℃，向7(1.283g,3.692mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中加入四丁基氟化铵(1.0M，在THF中,3.90mL,3.90mmol,1.06equiv)。在15分钟之后，将反应混合物用乙醚(20mL)稀释，用NaHCO3洗涤(饱和水溶液,3x20mL)，并浓缩为浅绿色油状物。将油状物通过硅胶色谱法(2:1己烷:EtOAc,Rf＝0.25)进行纯化，得到白色结晶固体(822mg,3.524mmol,95％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.60(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(dd,J＝8.2,0.4Hz,1H),7.27-7.23(m,1H),7.16-7.11(m,1H),6.44(s,1H),4.77(s,2H),4.49(t,J＝7.3Hz,2H),3.66(s,3H),2.87(t,J＝7.3Hz,2H),2.64(s,1H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ172.3,138.5,137.0,127.6,122.2,121.1,119.9,109.3,102.3,57.1,52.0,39.1,34.3。HRMS(ESI)计算值C13H15NNaO3[M+Na]+:256.0950；实测值：256.0946。
2-(三甲基甲硅烷基)乙基羟基(甲基)氨基甲酸酯(8):向N-甲基羟胺盐酸盐(249mg,2.98mmol,1.05equiv)中加入KOH(0.1M的MeOH溶液,30.0mL,3.00mmol,1.06equiv)，形成白色沉淀物。在5分钟之后，加入N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基氧基]琥珀酰亚胺(736mg,2.84mmol)。在4小时之后，将溶液浓缩并将残余物悬浮在乙酸乙酯(30mL)中。将有机溶液用碳酸氢钠(饱和水溶液，3x15mL)和盐水(15mL)洗，用Na2SO4干燥，并浓缩为无色油状物，其纯度足以用于进一步的使用(466mg,2.44mmol,86％)。Rf＝0.2，4:1己烷:EtOAc。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.35(br s,1H),4.24-4.19(m,2H),3.20(s,3H),1.04-0.98(m,2H),0.04(s,9H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.6,65.0,38.0,17.9,-1.4.HRMS(ESI)计算值C7H17NNaO3Si[M+Na]+:214.0875；实测值：214.0870。
3-(2-(3,8,8-三甲基-4-氧代-2,5-二氧杂-3-氮杂-8-甲硅烷基)-1H-吲哚-1-基)丙酸甲酯(9)：向烘干的烧瓶添加2(195mg,0.836mmol)、TeocN(Me)OH(201mg,1.05mmol,1.26equiv)、和三丁基膦(251μL,1.05mmol,1.26equiv，加入甲苯(24mL，无水)，随后加入1,1'-(偶氮二羰基)二哌啶(263mg,1.04mmol,1.25equiv)。在随后的一个小时过程中形成浓稠的白色沉淀，之后加入乙醚(40mL)并将溶液过滤通过硅藻土。将残余物浓缩为黄色油状物，然后通过硅胶色谱法(4:1己烷:EtOAc,Rf＝0.3)纯化，得到无色的油状物(299mg,736(mol,88％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.60(d,J＝7.9Hz,1H),7.36(d,J＝8.2Hz,1H),7.28-7.22(m,1H),7.14-7.09(m,1H),6.57(s,1H),5.05(s,2H),4.63(t,J＝7.4Hz,2H),4.25-4.19(m,2H),3.67(s,3H),3.09(s,3H),2.88(t,J＝7.4Hz,2H),1.02-0.96(m,2H),0.05(s,9H)。13C NMR(151MHz,CDCl3)δ171.9,158.0,137.3,133.3,127.5,122.8,121.4,120.0,109.6,105.4,68.0,64.8,51.9,39.3,37.0,34.7,17.9,-1.4。HRMS(ESI)计算值C20H30N2NaO5Si[M+Na]+:429.1822；实测值：429.1816。
3-(2-(3,8,8-三甲基-4-氧代-2,5-二氧杂-3-氮杂-8-甲硅烷基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(3):向9(366mg,900μmol)的二氧杂环己烷(7mL)溶液中加入LiOH(0.5M水溶液,3.60mL,1.80mmol,2.00equiv)。在2小时之后，反应用AcOH(5％v/v水溶液,10mL)淬灭到pH 4，形成白色沉淀物。将溶液用EtOAc萃取(3x10mL)。将有机萃取液浓缩为黄色油状物并通过硅胶色谱法(2:1己烷:EtOAc，含2％AcOH,Rf＝0.4)纯化，得到棕黄色固体(292mg,744μmol,83％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ10.95(br s,1H),7.61(d,J＝7.9Hz,1H),7.38(d,J＝8.3Hz,1H),7.28-7.23(m,1H),7.15-7.10(m,1H),6.58(s,1H),5.04(s,2H),4.67-4.59(m,2H),4.25-4.19(m,2H),3.11(s,3H),2.98-2.90(m,2H),1.04-0.94(m,2H),0.04(s,9H)。13C NMR(151MHz,CDCl3)δ176.4,158.0,137.2,133.1,127.5,122.9,121.5,120.2,109.5,105.5,68.0,65.0,39.1,37.0,34.8,17.9,-1.4。HRMS(ESI)计算值C19H28N2NaO5Si[M+Na]+:415.1665；实测值：415.1666。
3-(2-(((甲基氨基)氧基)甲基)-1H-吲哚-1-基)丙酸(1a):向3(107mg,273μmol)和CsF(241mg,1.59mmol,5.81equiv)的混合物加入N,N-二甲基甲酰胺(5mL,无水)。在20之后，加入H2O(3mL)，引起气体的放出。将溶液浓缩并通过硅胶色谱法纯化(5％AcOH,3％MeOH in CH2Cl2,Rf＝0.45)，得到白色固体(69mg,274μmol,100％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ7.51(d,J＝7.9Hz,1H),7.40(d,J＝8.3Hz,1H),7.19-7.14(m,1H),7.05-7.00(m,1H),6.47(s,1H),4.89(s,2H),4.54-4.50(m,2H),2.83-2.75(m,2H),2.66(s,3H)。13C NMR(151MHz,CD3OD)δ175.1,138.5,136.2,129.0,123.1,121.8,120.6,110.4,104.7,68.0,40.4,38.9,35.6。HRMS(ESI)计算值C13H17N2O3[M+H]+:249.1239；实测值：249.1232。
3-(1-异丙基-2-甲基-1,2-二氢-[1,2]嗪并[5,4-b]吲哚-5(4H)-基)丙酸(10):向1a(6.0mg,24μmol)在1:1的NH4OAc水溶液(20mM,pH 4.50):MeOH的溶液(2mL)中加入异丁醛(6.6μL,72μmol,3equiv)。在1小时之后，将反应混合物浓缩为浅粉色固体(7.0mg,23μmol,96％)。Rf＝0.4，在含5％AcOH和3％MeOH的CH2Cl2中。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.49(d,J＝7.9Hz,1H),7.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.20-7.15(m,1H),7.12-7.07(m,1H),5.00(d,J＝14.8Hz,1H),4.78(d,J＝14.9Hz,1H),4.32-4.18(m,2H),3.55(d,J＝5.7Hz,1H),2.76(t,J＝6.8Hz,2H),2.67(s,3H),2.27-2.18(m,1H),1.08(d,J＝6.8Hz,3H),1.02(d,J＝6.8Hz,3H)。13C NMR(151MHz,CDCl3)δ175.2,136.2,130.4,127.8,121.5,119.6,119.6,109.2,107.0,66.8,58.3,41.6,39.3,34.5,33.2,20.6,20.6。HRMS(ESI)计算值C17H23N2O3[M+H]+:303.1709；实测值：303.1701。
3-(1,1,2-三甲基-1,2-二氢-[1,2]嗪并[5,4-b]吲哚-5(4H)-基)丙酸(11)：向1a(5.8mg,23μmol)在1:1NH4OAc水溶液(20mM,pH4.50):MeOH的溶液(2mL)中加入丙酮(5.1μL,69μmol,3equiv)。在1小时之后，将反应混合物浓缩为无色油状物(6.8mg,24μmol,100％)。Rf＝0.5，在含5％AcOH,3％MeOH的CH2Cl2中。1H NMR(600MHz,CD3CN)δ7.60(d,J＝7.9Hz,1H),7.39(d,J＝8.2Hz,1H),7.15-7.10(m,1H),7.07-7.03(m,1H),4.92(br s,2H),4.22(t,J＝6.7Hz,2H),2.70(t,J＝6.8Hz,2H),2.66(s,3H),1.45(s,6H)。13C NMR(151MHz,CD3CN)δ173.0,137.2,134.1,125.7,121.4,120.0,119.8,116.9,110.6,65.8,60.0,40.0,37.1,34.69,34.66。HRMS(ESI)计算值C16H21N2O3[M+H]+:289.1552；实测值：289.1544。
2-(三甲基甲硅烷基)乙基甲基((1-(3-氧代-3-((3-(3-(2-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)乙酰胺基)丙氧基)丙基)氨基)丙基)-1H-吲哚-2-基)甲氧基)氨基甲酸酯(12)：在0℃向装有含3(6.5mg,17μmol)和二异丙基乙基胺(9.0μL,51μmol,3.0equiv)的CH2Cl2(1mL,无水)的烘干的烧瓶加入三氟乙酸五氟苯基酯(3.0μL,17μmol,1.0equiv)。使溶液在随后的30分钟过程中温热到室温，然后将其过滤通过0.5cm3二氧化硅短柱，用CH2Cl2(2mL)洗。将滤液浓缩并溶解于N,N-二甲基甲酰胺中(3x0.5mL，无水)，然后将其加入到生物素-PEG3-NH2(7.7mg,17μmol,1.0equiv)和二异丙基乙基胺(9.0μl,51μmol,3.0equiv)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL，无水)溶液中。在24小时之后，将溶液浓缩，然后通过硅胶色谱法纯化(8％MeOH in CH2Cl2,Rf＝0.1)，得到白色固体(10.2mg,12.4(mol,75％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.56(d,J＝7.9Hz,1H),7.43(d,J＝8.2Hz,1H),7.24-7.19(m,1H),7.10-7.05(m,1H),6.82(s,1H),6.59-6.54(m,2H),6.00(s,1H),5.19(s,1H),5.03(s,2H),4.60(t,J＝7.3Hz,2H),4.46-4.41(m,1H),4.26-4.22(m,1H),4.20(dd,J＝9.5,7.7Hz,2H),3.58-3.49(m,8H),3.45(m,2H),3.34(t,J＝6.1Hz,2H),3.30(dd,J＝12.1,6.0Hz,2H),3.23(q,J＝6.5Hz,2H),3.13(s,3H),3.12-3.07(m,1H),2.86(dd,J＝12.8,5.0Hz,1H),2.72(t,J＝7.3Hz,2H),2.68(d,J＝12.9Hz,1H),2.16(t,J＝7.4Hz,2H),1.74-1.70(m,2H),1.67-1.60(m,6H),1.45-1.37(m,2H),1.03-0.95(m,2H),0.04(s,9H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ173.1,170.8,163.6,157.8,137.4,133.1,127.3,122.7,121.1,119.9,110.1,105.3,70.52,70.45,70.2,70.1,69.9,69.2,67.7,64.9,61.9,60.2,55.6,40.64,40.57,38.0,37.7,37.3,36.9,36.0,29.8,29.0,28.2,28.2,25.7,17.9,-1.4。HRMS(ESI)计算值C39H64N6NaO9SSi[M+Na]+:843.4122；实测值：843.4125。
3-(2-(((甲基氨基)氧基)甲基)-1H-吲哚-1-基)-N-(3-(3-(2-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)乙酰胺基)丙氧基)丙基)丙酰胺(1b)向装有12(2.2mg,2.7(mol)和CsF(6.5mg,43(mol,16equiv)的烘干的烧瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL，无水)。在2小时之后，加入H2O(1mL)和MeOH(1mL)并将反应混合物浓缩为白色残余物。粗产物通过硅胶色谱法纯化(65:20:20:2.5:2.5EtOAc:MeCN:MeOH:H2O:NH4OH,Rf＝0.25)，得到无色油状物(1.8mg,2.7μmol,99％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.40(d,J＝8.2Hz,1H),7.21-7.17(m,1H),7.10-7.04(m,1H),6.65(br s,1H),6.50(s,1H),6.49(br s,1H),5.71(br s,1H),4.88(s,2H),4.83(br s,1H),4.55(t,J＝7.1Hz,2H),4.42-4.37(m,1H),4.24-4.19(m,1H),3.58-3.48(m,8H),3.47-3.43(m,2H),3.36(t,J＝5.9Hz,2H),3.32-3.28(m,2H),3.26-3.21(m,2H),2.85(dd,J＝12.8,5.0Hz,1H),2.67(t,J＝7.1Hz,2H),2.62(d,J＝12.8Hz,1H),2.15(t,J＝7.3Hz,2H),1.72-1.69(m,2H),1.68-1.59(m,6H),1.44-1.38(m,2H)。13CNMR(126MHz,CDCl3)δ173.0,170.9,163.4,137.3,135.5,127.6,122.2,121.0,119.8,110.0,103.7,70.5,70.4,70.0,69.8,69.4,67.3,61.9,60.1,55.6,40.7,40.3,39.4,38.2,37.5,37.3,36.0,29.9,28.9,28.7,28.2,28.1,25.7。HRMS(ESI)计算值C33H53N6O7S[M+H]+:677.3696；实测值：677.3691。
6-氨基-9-(2-羧基-4-((5-(3-(2-(3,8,8-三甲基-4-氧代-2,5-二氧杂-3-氮杂-8-甲硅烷基)-1H-吲哚-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酰基)苯基)-3-亚氨基-3H-氧杂蒽-4,5-二磺酸单钠盐和6-氨基-9-(2-羧基-5-((5-(3-(2-(3,8,8-三甲基-4-氧代-2,5-二氧杂-3-氮杂-8-甲硅烷基)-1H-吲哚-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酰基)苯基)-3-亚氨基-3H-氧杂蒽-4,5-二磺酸单钠盐(13)：在0℃向装有含3(9.8mg,25μmol)和二异丙基乙基胺(13μL,75μmol,3.0equiv)的CH2Cl2(1mL，无水)的烘干烧瓶中加入三氟乙酸五氟苯基酯(4.5μl,26μmol,1.0equiv)。使溶液在随后的45分钟过程中温热到室温，然后将其过滤通过0.5cm3二氧化硅短柱，用CH2Cl2(2mL)洗。将滤液浓缩并溶解于N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL，无水)中。向200μl的这个溶液加入二异丙基乙基胺(4.5μL,26μmol,17equiv)和AF488尸胺(1.0mg,1.6μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL，无水)溶液。在21小时之后，加入MeOH(1mL)并将反应混合物浓缩为红色残余物，将其通过C18柱上的HPLC进行纯化(时间(min),在H2O中含乙腈％：0,10；5,10；35,100)。分离得到产物，为红色粉末(1.17mg,1.15μmol,74％)。HRMS(ESI)计算值C45H5IN6Na2O14S2Si[M+Na]+:1037.2469；实测值：1037.2488。
6-氨基-9-(2-羧基-4-((5-(3-(2-(((甲基氨基)氧基)甲基)-1H-吲哚-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酰基)苯基)-3-亚氨基-3H-氧杂蒽-4,5-二磺酸单钠盐和6-氨基-9-(2-羧基-5-((5-(3-(2-(((甲基氨基)氧基)甲基)-1H-吲哚-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酰基)苯基)-3-亚氨基-3H-氧杂蒽-4,5-二磺酸单钠盐(1c)：向装有13(1.166mg,1.149μmol)和CsF(31mg,204μmol,178equiv)的烘干烧瓶中加入N,N-二甲基甲酰胺(无水,0.5mL)。在6小时之后，加入H2O(1mL)并将反应混合物浓缩为暗红色残余物，将其通过C4柱上的HPLC进行纯化(时间(min),在H2O中的乙腈％：0,5；5,5；10,10)。将得到的产物溶解于9:1MeCN:H2O(3x0.5mL)中并过滤以去除残余的CsF，得到红色固体(871μg,1.00μmol,87％)。Rf＝0.20，在6:2:2:2的EtOAc:MeOH:MeCN:H2O中。HRMS(ESI)计算值C39H39N6O12S2[M-Na]-:847.2067；实测值：847.2078。
5-((3,3-二乙氧基丙基)氨基甲酰基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸(14)：向5-羧基荧光素(30mg,80μmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(31mg,162μmol,2.0equiv)、和1-羟基苯并三唑水合物(20wt％H2O,55mg,326μmol)的混合物中加入N,N-二甲基甲酰胺(3mL)，随后加入三乙胺(22.2μL,159μmol,2.0equiv)和3-氨基丙醛二乙基缩醛(13μL,80μmol,1.0equiv)。在黑暗中搅拌26小时之后，加入MeOH(1mL)并将溶液浓缩为橙色油状物，将其通过硅胶色谱法(含8％MeOH的CH2C12,Rf＝0.35)以及C18柱上的HPLC(时间(min),在含0.1％TFA的H2O中的MeCN％：(0,45；3,45；15,55)纯化。得到产物，为亮橙色粉末(13mg,26μmol,32％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.41(d,J＝0.9Hz,1H),8.17(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),6.68(d,J＝2.3Hz,2H),6.61(d,J＝8.7Hz,2H),6.53(dd,J＝8.7,2.3Hz,2H),4.65(t,J＝5.5Hz,1H),3.75-3.67(m,2H),3.59-3.53(m,2H),3.51(t,J＝7.1Hz,2H),1.95(dt,J＝8.6,4.3Hz,2H),1.20(t,J＝7.1Hz,6H)。13C NMR(151MHz,CD3OD)δ170.7,168.3,162.4,155.5,154.4,137.9,135.0,130.3,129.5,126.1,125.0,114.2,111.2,103.7,103.0,98.2,63.0,37.3,34.5,15.7。HRMS(ESI)计算值C28H28NO8[M+H]+:506.1815；实测值：506.1823。
2-(6-羟基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)-5-((3-氧代丙基)氨基甲酰基)苯甲酸(Shen B-Q.等人(2012),“Conjugation site modulatesthe in vivo stability和therapeutic activity of antibody-drugconjugates”,Nat.Biotechnol.30(2):184-189)：将化合物14(13mg,26μmol)溶解在12:12:1CH2C12:三氟乙酸:H2O(1mL)中并在密封管中加热到42℃。在18小时之后，将反应用H2O(2mL)淬灭并将溶液浓缩为橙色的油状物。产物通过硅胶色谱法纯化(含10％MeOH的CH2C12,Rf＝0.2)，得到橙色固体(8.8mg,20μmol,79％；97％brsm)。1H NMR(500MHz,CDC13)δ8.46(s,1H),8.20(d,J＝8.0Hz,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),6.81-6.58(m,6H),4.67(t,J＝5.4Hz,1H),3.53(t,J＝7.0Hz,2H),1.93(dt,J＝14.2,7.1Hz,2H)。HRMS(ESI)计算值C24H16NO7[M-H]-:430.0927；实测值：430.0917。
5-((3-((苄基氧基)亚氨基)丙基)氨基甲酰基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸(5a)：将4(3.2mg,7.4μmol)和O-苄基羟胺盐酸盐(1.3mg,8.1μmol,1.1equiv)的混合物溶解于n 1:1的乙酸钠水溶液(100mM,pH 4.50):MeOH(1mL)中。在2.5小时之后，将得到的悬浮液浓缩为橙色固体，并通过C18柱上的HPLC进行纯化(时间(min),在H2O中的MeCN％：0,40；5,40；15,55)，得到橙色固体(3.2mg,6.0μmol,81％)。分离得到产物，为9:11比例的顺:反异构体的混合物。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.40(d,J＝4.0Hz,1H),8.16-8.08(m,1H),7.54(t,J＝5.9Hz,0.6H,反式-C(H)NO),7.32-7.15(m,6H),6.87(t,J＝5.5Hz,0.4H,顺式-C(H)NO),6.69(t,J＝2.2Hz,2H),6.68-6.62(m,2H),6.56(t,J＝2.3Hz,1H),6.54(t,J＝2.4Hz,1H),5.08(s,顺式-CH2O,0.9H),5.01(s,反式-CH2O,1.1H),3.61(t,J＝6.6Hz,2H),2.75(q,J＝6.3Hz,顺式-CH2C(H)N,0.9H),2.53(q,J＝6.4Hz,反式-CH2C(H)N,1.1H)。HRMS(ESI)计算值C31H25N2O7[M+1-1]+:537.1662；实测值：537.1670。
5-((2-(5-(2-羧基乙基)-2-甲基-1,2,4,5-四氢-[1,2]嗪并[5,4-b]吲哚-1-基)乙基)氨基甲酰基)-2-(6-羟基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸(5b)：将4(3.2mg,7.4μmol)和1a(2.0mg,8.1μmol,1.1equiv)的混合物溶解于1:2的乙酸钠水溶液(100mM,pH 4.50):MeOH(1.5mL)中。在2.5小时之后，将反应混合物浓缩为橙色固体，并通过C18柱上的HPLC进行纯化(时间(min),在H2O在的MeCN％：0,40；5,40；15,55)，得到橙色固体(3.7mg,5.6μmol,76％)。1H NMR(500MHz,CD3OD)δ8.07(s,1H),7.85(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(d,J＝8.1Hz,1H),7.17(d,J＝8.0Hz,1H),7.08-7.03(m,1H),7.03-6.98(m,1H),6.68(d,J＝1.9Hz,2H),6.62-6.52(m,4H),5.12(d,J＝14.4Hz,1H),5.05(d,J＝14.5Hz,1H),4.37-4.27(m,2H),4.11(br s,1H),3.59(dt,J＝13.2,6.4Hz,1H),3.50(dt,J＝13.7,6.9Hz,1H),2.88(s,3H),2.75-2.63(m,2H),2.52(m,1H),2.29(m,1H)。HRMS(ESI)计算值C37H32N3O9[M+H]+:662.2138；实测值：662.2154。
C.小分子实验
1HNMR动力学：如下制备氘化乙酸钠缓冲液：通过添加在D2O中的NaOD将乙酸-d4在D2O中的溶液碱化到合适的pD(pD＝pH计读数+0.41)(2)，然后用D2O将其稀释到100mM[乙酸盐-d3]。如下制备氘化磷酸钠缓冲液：将浓度都是100mM的磷酸-d3的D2O溶液和Na3PO4的D2O溶液合并，直到合适的pD。为了测定速率方程中每个反应物的量级，在即将进行NMR采集之前将包含1a(1.5mM或3.0mM)或异丁醛(1.5mM或3.0mM)在氘化缓冲溶液中的储备溶液以1:1比例合并。对于速率常数的测定，在即将进行NMR采集之前将包含1a(1mM)或异丁醛(1mM)在氘化缓冲溶液中的储备溶液以1:1比例合并(在pD 7.0使用包含1.5mM的每种反应物的储备溶液)。所有的动力学数据都是在保持探针温度为295K的情况下在Bruker AV-500或AV-600光谱仪获取。以每30s获取8光谱扫描组，且所有反应跟踪至少一个半衰期。随时间跟踪N-CH2共振的消失并且将产物的甲基共振积分以确定溶液中的物质总量。将数据在MestReNova和Microsoft Excel中进行分析。
小分子水解：水解溶液包含1μM 5a或5b、25μM苯基丙氨酸作为内标、和5mM乙酸钠，处于适当pH。将溶液在室温保温并通过Agilent1200装置上的液相色谱重复地分析50μL的等分样品，使用AgilentPoroshell 120EC-C18反相柱(4.6x50mm)，溶液流速为0.4mL/min。采用如下梯度(时间(min),在含0.1％TFA的H2O中的MeCN％)：0,5；10,95；12,95；14,5；19,5。将每个溶液的第一次进样的时间指定为t＝0。将5a和5b在440nm处的吸收峰的积分相对于每个进样的苯基丙氨酸峰进行归一化。
D.乙二醛-Mb的生物素酰化
乙二醛-Mb的制备：根据结果改进的文献规程(3)进行马心脏肌红蛋白(Sigma-Aldrich)的转氨基作用。制备肌红蛋白(50μM)在磷酸钠缓冲液(25mM,pH 6.50)的储备溶液和吡哆醛5'-磷酸盐(PLP,200mM)在磷酸钠缓冲液(25mM,将pH调节到6.50)中的储备溶液。将肌红蛋白溶液与等体积的PLP储备溶液或媒介物(25mM磷酸钠，pH 6.50)合并并在黑暗中在37℃保温1小时。然后将溶液稀释10倍并使用离心浓缩器(Amicon Ul tra,10kDa MWCO)与磷酸钠缓冲液(25mM,pH 6.50)交换5次，然后相对于磷酸钠缓冲液(10mM,pH 6.50)进行透析以去除残余的磷酸吡哆醛。
时间依赖性标记：在37℃，将乙二醛-Mb或Mb(3μg)和1b或N-(氨基氧基乙酰基)-N’-(D-生物素酰基)肼(氨基氧基-生物素)(250μM)在4μl反应体积的乙酸钠缓冲液(25mM,pH 4.00)中合并0-120分钟，然后用苯甲醛(10mM)淬灭。
浓度依赖性标记：在37℃，将乙二醛-Mb或Mb(3μg)和1b或氨基氧基-生物素(0-200μM)在4μL反应体积的乙酸钠缓冲液(100mM,pH 4.00)中合并3小时，然后用苯甲醛(10mM)淬灭。
ph依赖性标记：在37℃，将乙二醛-Mb或Mb(1.7μg)和1b或氨基氧基-生物素(250μM)在4μL反应体积的乙酸钠缓冲液(100mM,pH 4.00-5.50)或磷酸钠(100mM,pH 6.00-7.50)缓冲液中合并3小时，然后用苯甲醛(10mM)淬灭。
用BnONH2进行的共处理：在37℃，将乙二醛-Mb或Mb(1.7μg)和1b(100uM)、和BnONH3C1(0-800μM)在5μL反应体积的乙酸钠缓冲液(100mM,pH 4.50)中合并3小时，然后用苯甲醛(10mM)淬灭。
用苯胺进行的共处理：在37℃，将乙二醛-Mb或Mb(1.7μg)和1b(100μM)、和乙酸苯铵(0-50μM,pH 4.50或5.50)或磷酸苯铵(0-50mM,pH 6.50)在μL反应体积的乙酸钠缓冲液(50mM,pH 4.50或5.50)或磷酸钠缓冲液(50mM,pH 6.50)中合并4小时，然后用苯甲醛(10mM)淬灭。
进行蛋白质印迹的通用程序：在添加苯甲醛之后，将反应混合物在室温下保温5分钟，然后与含β-巯基乙醇的33％(v/v)4x SDS加样缓冲液合并并在26孔Bio-Rad Criterion XT 4-12％bis-tris凝胶(45min,175V)上在XT MES缓冲液中展开。然后将凝胶的内容物在含20％MeOH的tris-甘氨酸缓冲液中湿法转移到硝化纤维膜上(60min,100V)并使用丽春红S染色(在5％v/v乙酸中的0.1％w/v)使总蛋白负载成像。将印迹在包含牛血清清蛋白(4％w/v)的含0.1％Tween-20的磷酸缓冲盐水中在4℃封闭过夜。将在封闭溶液中的印迹在鼠ɑ-生物素FITC(Jackson ImmunoResearch,1/10000)中在室温下保温1小时，用PBST洗涤(3x10min)并成像。将蛋白质印迹在AmershamTyphoon 9410成像仪上扫描并在ImageJ中进行分析。
E.FGly-MBP缀合物的制备和评价
FGly-MBP和MBP C390A的制备以前已有描述(Shen B-Q.等人(2012),“Conjugation site modulates the in vivo stability和therapeutic activity of antibody-drug conjugates”Nat.Biotechnol.30(2):184-189)。
全长蛋白质缀合物的ESI-MS：如下准备用于质谱分析的MBP与1a的缀合反应：将FGly-MBP或MBP C390A(6.8μg)与1a(1mM)在37℃在8μL反应体积的乙酸钠缓冲液(100mM,pH 5.0)合并12小时。然后通过添加磷酸氢二钠(100mM,92μL)使pH到7.9而将反应淬灭，在4℃储存将近1小时，然后进行ESI-MS分析。
胰蛋白酶消化：将在磷酸钠缓冲液(65mM,pH 7.2)中的FGly-MBP与1a(5.7μg)的缀合物与二硫苏糖醇(DTT,2.54mM,60nmol)在56℃一起保温30分钟，与碘乙酰胺(5.98mM,150nmol)一起在室温下在黑暗中保温1小时，然后在室温下与DTT(2.33mM,60nmol)保温5分钟(虽然在FGly-MBP中没有半胱氨酸残基，加入DTT和碘乙酰胺以证明氧杂咔啉部分与用于蛋白水解消化的标准的还原和烷基化过程是相容的)。将得到的样品在37℃用胰蛋白酶(0.115μg,2wt％)处理18小时。然后用甲酸将溶液酸化到1％的最终浓度并在MilliporeZipTip C18树脂上进行纯化，用含70％MeCN和1％甲酸的H2O洗脱。通过离心蒸发将洗脱液浓缩并将得到的残余物再悬浮在水中，然后在UCBerkeley HHMI Mass Spectrometry Lab通过在Bruker Apex-QeESI-Q-FT-ICR质谱仪(9.4T)上的流动进样进行分析。HRMS(ESI)计算值C45H70N13O15[M+H]+:1032.5114；实测值：1032.5220。
凝血酶裂解：在37℃，将FGly-MBP(44μg)的溶液用在20μL反应体积的乙酸钠缓冲液(100mM,pH 4.5)中的AF488C5-氨基氧基乙酰胺或1c(200μM)进行标记17小时。将溶液稀释10倍，使用离心浓缩机(Amicon Ul tra,30kDa MWCO)交换到PBS中，进行5次。将得到的AF488-MBP缀合物(0.6μg)在PBS中的溶液与凝血酶(0-1.2U)在6μL反应体积中在37℃保温1小时，然后通过添加减少量的SDS加样缓冲液并煮沸5分钟进行淬灭，然后通过SDS-PAGE分离。将凝胶成像，然后用Colloidal blue(Life Technologies)染色。
荧光偏振：如上所述制备肟和氧杂咔啉连接的AF488-MBP缀合物。酰胺连接的AF488-MBP是如下制备的：将FGly-MBP(44μg)在15μL反应体积的碳酸氢钠缓冲液(100mM,pH 8.0)中用AF4885-SDP酯(500μM)在37℃处理45分钟。然后将溶液稀释10倍，使用离心浓缩机(AmiconUl tra,30kDa MWCO)交换到PBS中，进行5次。在通过UV-vis估计缀合效率之后，制备包含100nM AF488的每种缀合物在PBS(100μL)中的溶液一式三份。将溶液在密封的黑96孔板(Costar)中在37℃保温。使用Perkin Elmer Victor3V读板器周期地采集荧光偏振数据。在接近一周之后，将读板器平衡到37℃，向每个孔加入凝血酶(12U)，并以12分钟间隔监测偏振。游离生色团的溶液(100nM)表现出40±1.3mP(AF488C5-氨基氧基乙酰胺)和104±0.3mP(1c)的偏振值，与凝血酶裂解的产物的偏振值相一致，误差可以归因为肽-AF488缀合物和游离生色团混合物的存在，以及由于在37℃一周过程中PBS的蒸发引起的AF488共轭溶液浓度的轻微增加。
F.AF488-α-HER2的制备和评价
FGly-α-HER2如以前所述制备，且Cys到FGly的转化率为97％完全(Cho H等人(2011),“Optimized clinical performance of growthhormone with an expanded genetic code”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(22):9060-9065))。
AF488-α-HER2的制备：将FGly-α-HER2(76μg)与1c(1mM)在乙酸钠缓冲液(100mM,pH 4.50)中以100μL反应体积在37℃保温12小时。然后将溶液稀释10倍，使用离心浓缩机(Amicon Ul tra,30kDa MWCO)交换到PBS中，进行6次。在Thermo NanoDrop 2000分光光度计上测定缀合效率，对于FG1y-α-HER2使用ε280＝210000M-1cm-1，对于AF488使用ε494＝71000M-1cm-1，并采用校正因子(□280＝□494*0.11)来解决AF488在280nm的吸收。
细胞培养：SKOV3和Jurkat T细胞得自ATCC并在补充有谷氨酰胺、10％胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中在湿润的5％CO2气氛中在37℃生长。将细胞密度保持在1x105到2x106细胞/mL之间。
用AF488-α-HER2进行的活细胞标记：收获培养基中的细胞并用FACS缓冲液(含1％胎牛血清的PBS)并以106/mL再悬浮在96孔V形底板(Costar)中的100μL等分样品的FACS缓冲液中，然后冷却到4℃(所有后续操作都在4℃进行)。标记实验以一式三份进行。所有的抗体保温在100μL FACS缓冲液中进行，且所有洗涤步骤涉及在300x g离心和用200μL FACS缓冲液洗涤3次。将细胞与hIgG(10nM)一起保温30分钟，洗涤，与兔α-AF488(Life Technologies,1/2000)或媒介物一起保温30分钟，洗涤，然后与山羊α-hIgG DyLight649(Jackson ImmunoResearch,1/2000)和驴α-rabbit FITC(JacksonImmunoResearch,1/2000)或媒介物一起保温30分钟。然后洗涤细胞，再悬浮在300μL FACS缓冲液中，并通过流式细胞计数法进行分析。在BD FACSCalibur流式细胞计上进行流式细胞计数，在FlowJo(TreeStar)中进行数据分析。基于如图13所示的种群计算中值荧光强度。
结果和讨论
Pictet-Spengler连接反应试剂的设计和合成。对于上个世纪而言，Pictet-Spengler反应在吲哚生物碱天然产物的合成中起到了重要的作用(J,Antonchick AP,Wu F,&Waldmann H(2011),“The Pictet-Spengler Reaction in Nature and in OrganicChemistry”Angew.Chem.Int.Ed.50(37):8538-8564)。我们假设，在色胺和醛或酮之间形成C-C键的转化(图1A)可以经过改造而用于不可逆的生物结合。以前在这种情况下使用典型的Pictet-Spengler反应(Sasaki T,Kodama K,Suzuki H,Fukuzawa S,&Tachibana K(2008),“N-terminal labeling of proteins by the Pictet-Spenglerreaction,“Bioorg.Med.Chem.Lett.18(16):4550-4553)；然而，该反应在适合蛋白质的条件下是缓慢进行的，在pH4-5的二级速率常数为大约10-4M-1s-1(Maresh JJ等人(2007),“Strictosidine Synthase:Mechanism of a Pictet-Spengler Catalyzing Enzyme”，J.Am.Chem.Soc.130(2):710-723)。这些慢的反应动力学要求高浓度(例如，50mM)的衍生化试剂以实现经过修饰的蛋白质的良好收率，这从试剂成本、非目标反应性、所得缀合物的纯化、和(在用于活细胞上的蛋白标记的情况下的)毒性的角度来说是有问题的。
在我们的Pictet-Spengler连接反应的设计(图1B)中，我们通过将氨基氧基取代基移动到吲哚的2位从而允许更加亲核的3位参与亲电取代提高了该反应的速率。已知在2位被脂肪族胺取代的吲哚在有机溶剂中经历“异-Pictet-Spengler”反应(Molina P,Alca'ntara Jn,&Lo'pez-Leonardo C(1996),“Regiospecific preparation ofγ-carbolinesandpyrimido[3,4-a]indole derivatives byintramolecular ring-closure of heterocumulene-substitutedindoles”，Tetrahedron 52(16):5833-5844；Lee Y,Klausen RS,&Jacobsen EN(2011),“Thiourea-Catalyzed EnantioselectiveIso-PictetSpengler Reactions”，Org.Lett.13(20):5564-5567)。最终，我们将氨基氧基官能团甲基化，以提供有利于通过分子内的亲电取代而促进快速C—C键形成的反应性氧基亚铵离子中间体。用于为产物提供环外氨基氧基官能团的N-烷氧基色胺的Pictet-Spengler反应是已知的(Plate R、Van Hout RHM、Behm H、&Ot tenheijm HCJ(1987),“Synthesis of2-hydroxy-3-(ethoxycarbonyl)-1,2,3,4-tetrahydro-β-carbolines from N-hydroxytryptophans.An approach to theeudistomin series”，J.Org.Chem.52(4):555-560)；Hermkens PHH等人(1990),“Syntheses of 1,3-disubstituted N-oxy-β-carbolines by the PictetSpengler reactions ofN-oxy-tryptophanand-tryptamine derivatives”，Tetrahedron46(3):833-846)；Kirkup MP、Shankar BB、McCombie S、Ganguly AK、&McPhail AT(1989),“A concise route to the oxathiazepinecontaining eudistomin skeleton和some carba-analogs”，Tetrahedron Lett.30(49):6809-6812)，但是就我们所知，它们在含水介质中的动力学和行为尚未得到研究。在这些背景情况下，我们预期氨基氧基-官能化的吲哚1参与快速的Pictet-Spengler典型反应(图1B)。
我们通过短的、高收率合成路线制备模型吲哚1a(图1C)。首先，如下制备作为被掩蔽的官能化手柄的酯：用TBSCl保护吲哚-2-甲醇，随后进行DBU催化的对丙烯酸甲酯的氮杂-Michael加成(Yeom C-E、KimMJ、8:Kim BM(2007),
“1,8-Diazabicylo[5.4.0]undec-7-ene(DBU)-promotedefficientandversatile aza-Mchael addition”，Tetrahedron63(4):904-909)。随后将所述羟基基团脱保护得到吲哚2，通过在改进的Mitsunobu条件下与Teoc-保护的N-甲基羟基胺反应装配氨基氧基部分(Ishikawa T等人(2001),Novel[2-3]-SigmatropicRearrangement for Carbon—Nitrogen Bond FormationJ.Am.Chem.Soc.123(31):7734-7735；Tsunoda T、Yamamiya Y、&S(1993),1,1□-(azodicarbonyl)dipiperidine-tributylphosphine,a new reagent system for mitsunobu reaction,TetrahedronLett.34(10):1639-1642)。所得产物的皂化反应产生化合物3，将其用CsF干净地脱保护得到吲哚1a，总共六个步骤，收率66％。
模型吲哚1a的反应性和产物的水解稳定性。为了确认Pictet-Spengler连接反应，我们用pH 4.5的乙酸铵甲醇溶液中的异丁醛或丙酮处理吲哚1a。两个反应都是在不到1小时的时间非常干净利落地进行，得到期望的三氢-β-氧杂-γ-咔啉(以下称为氧杂咔啉(oxacarboline))产物(图6)。对1a与异丁醛在D2O中的反应速率的1H NMR光谱学分析显示在pD 7.0的1a和异丁醛浓度的一级速率定律(表S1)，和作为氨基氧基化合物特征在酸性条件下的pD-速率常数特征(图1D)(Jencks WP(1959)Studies on the Mechanism of Oxime和Semicarbazone FormationJ.Am.Chem.Soc.81(2):475-481)。这些结果表明，我们的速率增强策略是成功的，因为Pictet-Spengler连接反应比在含水介质中的典型Pictet-Spengler反应快4-5个数量级。
接下来，我们对通过Pictet-Spengler连接反应生成的氧杂咔啉的水解稳定性与模型肟的水解稳定性进行对比。我们用苄基烷氧基胺或1a处理醛-衍生化的荧光素(4,图2A)，分别生成5a和5b。将包含1μM 5a或5b的pH 4.5或5.0的缓冲溶液在室温下保温并通过液相色谱进行分析。在两天的过程中，大部分的肟5a水解，但是超过90％的氧杂咔啉5b保持完整无损(图2B)；没有检测到其他产物(图7)。以前的工作已经表明，在过量甲醛的存在下肟的水解以近似的时间进度发生，甲醛用作捕获剂以驱动反应朝向缀合物水解的方向进行(Kalia J&Raines RT(2008),“Hydrolytic Stability of Hydrazones和Oximes”，Angew.Chem.Int.Ed.47(39):7523-7526)。值得注意的是，我们的结果显示，肟的水解可以在水溶液中进行相当的程度，甚至是在没有捕获剂的存在下，这强化了对于不可逆生物结合反应的需求。这些模型实验确定了Pictet-Spengler连接反应在酸性条件下迅速进行，形成水解稳定的产物。
针对模型蛋白质的反应范围。我们接下来对Pictet-Spengler连接反应作为标记带有醛的蛋白质的手段进行了评估。为了便于所标记的蛋白质的检测和操纵，我们通过以下方法制备了生物素酰基化的吲哚1b：将3与氨基-聚乙二醇-官能化的生物素偶联，随后用CsF进行Teoc基团的脱保护。作为与1b反应的蛋白质底物，我们通过磷酸吡哆醛-介导的转氨基作用制备了具有N末端乙二醛部分的马心肌红蛋白(乙二醛-Mb)(图3A)(Gilmore JM,Scheck RA,Esser-Kahn AP,JoshiNS,&Francis MB(2006),“N-Terminal蛋白质Modificationthrough a Biomimetic Transamination Reaction”，Angew.Chem.Int.Ed.45(32):5307-5311)。在乙二醛-Mb标记实验中，通过以下来检测缀合产物：采用SDS-PAGE并在用苯甲醛将过量的标记试剂淬灭之后用FITC-缀合的α-生物素抗体进行蛋白质印迹分析。首先，我们确定标记是以浓度依赖性和时间依赖性的方式进行(分别是图3B和3C)。重要的是，没有进行醛官能化的Mb的对照样品显示出可以忽略的标记。我们接下来研究了所述反应的pH依赖性，在更酸性的pH观察到更大程度的生物素酰化，在吲哚1a的动力学研究中也观察到这一点。最后，我们发现用苄基烷氧基胺作为醛清除剂进行的共处理导致生物素酰化的减少(图3E)。使用商购的氨基氧基-生物素作为标记试剂进行的相似的实验系列表现出相同的标记上的定性趋势(图8)。总体来说，这些结果确定了吲哚1b特异性地标记转氨基化的肌红蛋白中的醛官能团，并且更一般地具有典型的氨基氧基试剂的性质(我们还研究了是否可以通过苯胺催化来加速Pictet-Spengler连接反应(参见Dirksen A、Hackeng TM、&Dawson PE(2006),“NucleophilicCatalysis of Oxime Ligation”，Angew.Chem.Int.Ed.45(45):7581-7584)。苯胺在pH 4.5并不提高Ib与乙二醛-Mb的该反应的速率，而且在较高pH(5.5或6.5)时发现苯胺抑制该反应(图8E)，这与以前的观察结果一致(Hudak JE等人(2012),“Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions UsingCopper-Free Click Chemistryandthe Aldehyde Tag”，Angew.Chem.Int.Ed.51(17):4161-4165；Shi X.等人(2012),“Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-taggedproteins for singlemolecule imaging”，Nat.Methods9(5):499-503))。
我们接下来研究了1a与甲酰甘氨酸官能化的与麦芽糖结合的蛋白质(FGly-MBP)的反应，其中的FGly-MBP是使用遗传编码的醛标签方法制备的(图4A)(Rabuka D,Rush JS,deHart GW,Wu P,&BertozziCR(2012),“Site-specific chemical protein conjugation usinggenetically encoded aldehyde tags”，Nat.Protoc.7(6):1052-1067)。简而言之，在MBP的C末端构造6-残基肽序列LCTPSR,构成重组蛋白质的残基389-394。我们还在醛标签序列的N末端包括了凝血酶切割位点。在大肠杆菌(E.coli)中进行的蛋白质与结核杆菌(M.tuberculosis)FGE的共表达引起Cys390的氧化，得到FGly(Carrico IS,Carlson BL,&Bertozzi CR(2007),“Introducing genetically encoded aldehydes intoproteins”,Nat.Chem.Biol.3(6):321-322)。作为对照，我们还表达了C390A突变体，所述的C390A突变体不是FGE的底物并且不含FGly醛。将FGly-MBP与1mM吲哚1a在37℃保温12小时引起定量转化，得到期望的单修饰的加合物(通过ESI-MS进行判断)，而C390A突变体显示没有反应发生(图4B)。另外，在用胰蛋白酶类消化1a的FGly-MBP缀合物时，我们能够通过高分辨率ESI-MS识别包含期望加合物的C末端8残基胰蛋白酶肽。通过电子转移解离进行的所述胰蛋白酶肽的MS/MS片段化提供了FGly残基修饰的直接证据(图9B)。
为了确认标记仅在FGly残基发生，我们利用在紧邻所述醛标签序列上游构造的凝血酶切割位点。首先，我们通过以下制备吲哚1c：将3与Alexa Fluor 488(AF488)尸胺偶联，随后使用CsF脱保护。接下来，我们通过以下制备了FGly-MBP的氧杂咔啉连接的AF488缀合物或肟连接的AF488缀合物：用1c或AF488羟胺处理，将缀合物与不同量的凝血酶保温1小时，然后通过SDS-PAGE分析产物。在较高凝血酶浓度时来自FGly-MBP谱带的凝胶内荧光的强度降低，这与只在经过裂解的C末端8残基肽内的标记相一致(图4C)。值得注意的是，肟连接的和氧杂咔啉连接的AF488-MBP缀合物表现出定性地相似的行为，表明相对于肟而言，较大的氧杂咔啉部分并不抑制蛋白质作为凝血酶的底物的能力。这些实验确定了Pictet-Spengler连接反应专门标记加有醛标签的蛋白质上的FGly残基。
蛋白质上的氧杂咔啉键的水解稳定性。接下来，我们分析测定了FGly-MBP上的氧杂咔啉键的水解稳定性。荧光偏振是产生关于生色团在溶液中翻滚速度的信息的一种技术：与大分子缀合的生色团翻滚缓慢且表现出高的偏振值，而小分子生色团表现出低的偏振值。因此，荧光偏振理想地适合于监测蛋白质生色团缀合物的裂解(Jameson DM&Ross JA(2010),“Fluorescence Polarization/Anisotropy inDiagnostics和Imaging”，Chem.Rev.110(5):2685-2708)。将FGly-MBP用1c、AF488羟胺、或赖氨酸反应性的AF488-磺基二氯苯酚酯处理，获得氧杂咔啉连接的、肟连接的、或酰胺连接的AF488-MBP缀合物(图10)。然后将样品稀释至100nM的AF488缀合物并在37℃保温。监测荧光偏振一周(图4D)。肟缀合物表现出偏振的稳态下降，指示所述缀合物在7天的过程中接近完全水解。相反，氧杂咔啉和酰胺缀合物仅表现出最低的偏振变化。为了确认氧杂咔啉连接的AF488缀合物在一周之后仍保持完整不变，我们向样品添加凝血酶，引起偏振的立即减少，这是因为包含生色团的C末端肽被从蛋白质的其余部分裂解下来。来自酰胺连接的AF488缀合物的信号保持稳定(在凝血酶切割位点的下游不再有赖氨酸残基)，表明偏振的减少并不是添加凝血酶产生的假象。
Pictet-Spengler连接反应对于单克隆抗体的位点特异性的修饰的应用。为了展示Pictet Spengler连接反应在制备抗体缀合物中的实用性，我们使用α-HER2人IgG，在其两个重链中的每一个的C末端用醛标签序列进行了修饰(缩写为FGly-α-HER2)。母体抗体是临床获得批准的药物赫赛汀的变体(Menard S、Pupa SM、Campiglio M、&Tagliabue E(2003),“Biologicandtherapeutic role of HER2 incancer”，Oncogene 22(42):6570-6578)和T-DM1的变体(T-DM1是目前处于最后一个阶段的临床评价的基于赫赛汀的抗体-药物缀合物)(Krop IE等人(2012),“A Phase II Study of TrastuzumabEmtansine in Patients With Human Epidermal Growth FactorReceptor 2-Positive Metastatic Breast Cancer Who WerePreviously Treated With Trastuzumab,Lapatinib,anAnthracyc1ine,a Taxane,和Capecitabine”，Journal of ClinicalOncology)。FGly-α-HER2如之前的描述制备(Hudak JE等人(2012),“Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions UsingCopper-Free Click Chemistryandthe Aldehyde Tag”，Angew.Chem.Int.Ed.51(17):4161-4165)并且随后在pH 4.5用吲哚1c标记12小时；将得到的缀合物(AF488-α-HER2)在重链(图5A)上干净地用平均1.0±0.13个生色团/hIgG进行修饰(图11)。我们接下来通过流式细胞计数法评价了这种抗体缀合物对卵巢腺癌细胞系SKOV3的结合，所述的卵巢腺癌细胞系SKOV3过表达HER2。将SKOV3细胞用AF488-α-HER2或FGly-α-HER2处理，随后用DyLight 649-缀合的α-hIgG二抗处理以测量总hIgG结合。我们发现在AF488-α-HER2和FGly-α-HER2之间的结合没有差异(图5B)，表明Pictet-Spengler连接反应的反应条件和氧杂咔啉部分的存在都不会消极地影响抗体对于HER2的亲合力。将标记的细胞与兔α-AF488二抗一起保温并随后与FITC-缀合的α-兔三抗一起保温引起用AF488-α-HER2处理的细胞上荧光的增加但不引起用FGly-α-HER2处理的细胞上荧光的增加(图5B)。这个结果证实了成功地通过AF488-α-HER2将AF488提供给细胞表面。正如所料，同种型对照hIgG没有表现出对于SKOV3细胞的显著性结合；此外，AF488-α-HER2缀合物对于不表达HER2的Jurkat T细胞没有亲合力。总体来说，这些实验表明了Pictet-Spengler连接反应可以用于制备位点特异性标记的单克隆抗体而不损害结合活性。
上述对于本发明具体实施方案的描述适用于示例和说明的目的。它们并非意在为穷举的或将本发明限制在所公开的确切形式，在上述教导下显然有许多修饰和变化都是可能的。选择和描述这些实施例以便最好地解释本发明的原理及其实际应用，并由此使得其他本领域的技术人员能够最好地利用本发明以及适合于所构想的特定使用的具有不同修饰的各种实施方案。意在本发明的范围由所附的权利要求及其等同物来限定。
本文中提及的所有的出版物、专利、和专利申请都通过引用以其整体并入本文并用于所有目的。

Claims (15)

1.一种化合物，具有下式的结构：
其中
A存在或不存在并且，当存在时，是被取代的或未被取代的芳基或杂芳基部分，R1是选自以下的成员：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、卤素、CN、CF3、酰基、-SO2NR5R6、-NR5R6、-OR5、-S(O)2R5、-C(O)R5、-COOR5、-CONR5R6、-S(O)2OR5、-OC(O)R5、-C(O)NR5R6、-NR5C(O)R6、-NR5SO2R6和-NO2，其中R1、R2、R3、和R4中的两个或更多个与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的环系统：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基；
Rx和Ry选自H和被取代的或未被取代的烷基，条件是Rx和Ry中的至少一个具有选自以下的结构：
其中
Ro选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和
s选自1和2,
其中
选自R1、Rx和Ry的成员具有下式的结构：
其中
L是选自以下的连接基：被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和
X选自可检测的标记、交联部分、聚乙二醇和亲和标记。
2.权利要求1的化合物，具有下式的结构：
3.前述权利要求中任一项的化合物，具有选自以下的结构：
4.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物具有选自以下的结构：
5.根据前述权利要求任一项的化合物，其中所述化合物具有下式的结构：
其中
R1、R2、R3、和R4选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、卤素、CN、CF3、酰基、-SO2NR5R6、-NR5R6、-OR5、-S(O)2R5、-C(O)R5、-COOR5、-CONR5R6、-S(O)2OR5、-OC(O)R5、-C(O)NR5R6、-NR5C(O)R6、-NR5SO2R6和-NO2，其中R1、R2、R3、和R4中的两个或更多个与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的环系统：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基；和
R5和R6是独立地选自以下的成员：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代的或未被取代的杂环烷基，以及R9和R10与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的5-7元环：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
6.根据前述权利要求任一项的化合物，其中L是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个碳原子的被取代的或未被取代的烷基。
7.根据前述权利要求任一项的化合物，其中X是选自以下的成员：生色团和生物素。
8.根据前述权利要求任一项的化合物，其中LX具有下式的结构：
其中
R7选自被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；和
n选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
9.根据权利要求5的化合物，其中R7包括：
其中
m选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
10.对用选自醛和酮的成员官能化的生物分子进行修饰的方法，所述方法包括：
(a)使所述生物分子与根据前述权利要求任一项的化合物在适合于通过使所述化合物与选自所述醛和所述酮的部分进行反应形成环化的Pictet-Spengler加合物的反应条件进行接触，从而修饰所述生物分子。
11.根据权利要求10的方法，其中所述加合物具有选自以下的结构：
其中
R1选自H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基、卤素、CN、CF3、酰基、-SO2NR5R6、-NR5R6、-OR5、-S(O)2R5、-C(O)R5、-COOR5、-CONR5R6、-S(O)2OR5、-OC(O)R5、-C(O)NR5R6、-NR5C(O)R6、-NR5SO2R6和-NO2，其中R1、R2、R3、和R4中的两个或更多个与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的环系统：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基；和
R5和R6是独立地选自以下的成员：H、被取代的或未被取代的烷基、被取代的或未被取代的杂烷基、被取代的或未被取代的芳基、被取代的或未被取代的杂芳基和被取代的或未被取代的杂环烷基，以及R9和R10与它们所连接的原子一起任选地结合以形成选自以下的成员的5-7元环：被取代的或未被取代的环烷基、被取代的或未被取代的杂环烷基、被取代的或未被取代的芳基和被取代的或未被取代的杂芳基。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述加合物具有选自以下的结构：
13.根据前述权利要求任一项的方法，其中，在步骤(a)之前，用包括选自所述醛和所述酮的成员的反应性部分来修饰前体生物分子，从而形成所述用选自醛和酮的成员官能化的生物分子。
14.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述的生物分子是选自以下的成员：蛋白质、聚糖、核酸、代谢物、抑制剂、脂质、和辅助因子。
15.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述生物分子是抗体。
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