CN110261521B - 羰基化蛋白质的鉴定 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学蛋白质组领域。具体而言,涉及羰基化蛋白质的鉴定。更具体而言,涉及通过苯胺衍生的探针富集、鉴定和/或检测羰基化蛋白质的方法和组合物。更具体地,本发明涉及细胞铁死亡中羰基化蛋白质的富集、鉴定和/或检测,这些羰基化蛋白质可能作为铁死亡相关疾病的标志物或治疗靶标。
Description
技术领域
本发明涉及化学蛋白质组领域。具体而言,涉及羰基化蛋白质的鉴定。更具体而言, 涉及通过苯胺衍生的探针富集、鉴定和/或检测羰基化蛋白质的方法和组合物。
背景技术
铁死亡(ferroptosis)是一种新发现的细胞死亡形式,与急性肾损伤、亨廷顿病、癌症、 脑室周围白质软化症和SECIS结合蛋白2(SBP2)缺陷综合征等疾病相关(Yang,W.S.和 Stockwell,B.R,2016;Xie,Y.等,2016)。铁死亡在形态学、生物化学和遗传学等方面 不同于细胞凋亡、坏死和自噬等其他形式的细胞死亡(Dixon,S.J.等,2012;Yang,W.S. 等,2014;Dixon,S.J.和Stockwell,B.R.2014)。铁死亡的典型特征包括对细胞内铁的依 赖性和磷脂过氧化物的积累(Yang,W.S.和Stockwell,B.R,2016;Dixon,S.J.和Stockwell,B.R.2014;Yang,W.S.等,2016;Kagan,V.E.等,2017)。据报道两种化学小分子通过 已经证实的机制诱导铁死亡。一种是Erastin,其抑制细胞表面胱氨酸-谷氨酸反向转运 蛋白(系统xc -),导致还原型谷胱甘肽耗尽,以及随后的谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)失 活(Dixon,S.J.等,2012)。另一种是RSL3,其可通过共价修饰和抑制GPX4的活性来诱 导铁死亡而不影响GSH水平。由于GPX4在减少磷脂过氧化物方面的独特作用,Erastin 和RSL3都能够激活脂质过氧化过程,最终导致细胞死亡(Dixon,S.J.等,2012;Yang,W. S.等,2016)。众所周知,磷脂氧化过程能够产生脂源性亲电性物质,其能够对蛋白质进 行特异性修饰从而扰乱它们的活性和功能。其中,一种重要的修饰类型通常被称为“蛋 白质羰基化”,其可以通过亲核氨基酸(半胱氨酸、组氨酸或赖氨酸)与在脂质过氧化期间 产生的亲电性α,β-不饱和醛或酮之间的迈克尔加成而产生(Fritz,K.S.和Petersen,D.R., 2011;Galligan,J.J.等,2012;Madian,A.G.等,2011;Aldini,G.等,2007),从而在靶 蛋白上留下反应性“羰基”基团。最近的研究表明,当细胞死于铁死亡时,丙二醛(MDA)(一 种典型的脂源性亲电小分子(LDE)(Ayala,A.等,2014))的浓度增加(Yang,W.S.和 Stockwell,B.R,2016;Xie,Y.等,2016),这可能导致蛋白质羰基化增加。然而,羰基 化蛋白质靶标和特异性位点及其在铁死亡过程中的作用尚未探索。
目前已经开发了几种方法来检测蛋白质羰基化(Chen,Y.等,2016;Liebler,D.C.2008; Vasil'ev,Y.V.等,2014)。Cravatt及其同事报道了一种竞争性的基于活性的蛋白质组分析 (ABPP)策略,用半胱氨酸特异的碘乙酰胺-炔基(IAyne)探针分析细胞裂解物中LDE修饰 的靶标(Wang,C.等,2014)。尽管该方法能够定量蛋白质组中>1000个LDE敏感性半胱 氨酸,但是其只能间接检测半胱氨酸上的修饰而不能检测其他亲核残基的修饰。另一种 方法是合成生物正交的LDE类似物或前体探针(如HNE-炔基),用于标记和富集蛋白质羰基化的靶标(Yang,J.等,2015;Vila,A.等,2008;Kim,H.Y.等,2009;Codreanu,S.G. 等,2014)。然而,这些非天然的替代探针不适合检测细胞内的内源修饰事件。
本领域仍然迫切需要新的用于鉴定和/或检测羰基化蛋白质的方法。
附图说明
图1示出了苯胺探针用于在天然蛋白质组中检测蛋白质羰基化的反应性评估。(A)通过苯胺探针捕获HNE-羰基化蛋白质的总体示意图。(B)o-APA、m-APA、p-APA探针 与由HNE诱导的蛋白质羰基化的反应性的比较。(C)NaBH3CN的还原在m-APA标记 中是关键的。(D)通过m-APA检测蛋白质组中浓度依赖性HNE-羰基化。(E)游离苯胺 可与m-APA的标记有效地竞争。(F)使用m-APA通过荧光共聚焦显微镜对HNE处理的 细胞中的蛋白质羰基化进行成像。(G)通过LC-MS确认m-APA与HNE羰基化谷胱甘 肽的加合物,显示了GSH、GSH-HNE加合物和与m-APA形成的最终产物的提取的离 子色谱图。
图2示出了m-APA标记的优化。(A)优化m-APA标记的pH。(B)优化m-APA标记 的探针浓度。(C)m-APA不与蛋白质亚磺酰化反应。将HT1080细胞裂解物与10mM H2O2一起孵育以诱导全蛋白质组半胱氨酸氧化,其可以通过亚磺酰化反应性双甲酮 (Dyn-2)探针而不是m-APA探针检测到。
图3示出了m-APA与另外两种羰基化靶向探针HZyne和AOyne的标记效率的比 较。(A)通过胶内荧光比较蛋白质组中三种羰基化靶向性探针的标记效率。(B)在不同 探针浓度下相对定量胶内荧光的强度以反映三种探针的标记动力学和强度。
图4示出了通过TOP-ABPP鉴定外源HNE修饰的位点。(A)使用m-APA与 TOP-ABPP鉴定蛋白质组中HNE修饰位点的示意图。(B)由AOyne、m-APA和HZyne 探针并行鉴定的Cys、His和Lys的数目。(C)在使用m-APA探针的TOP-ABPP实验的 三次重复中鉴定的HNE修饰的半胱氨酸的数目的维恩图。
图5示出了在样品制备期间观察到来自AOyne-肽段加成物的不稳定产物。(A)上图: 由AOyne捕获的HNE修饰的肽的预期加合物的结构,其与叠氮基偶氮苯-生物素标签 缀合,被链霉亲和素富集并被连二亚硫酸钠切割。下图:在N-O键断裂的不稳定产物 的精确分子量。(B)上图:使用AOyne探针制备并通过LC-MS/MS分析的标准TOP-ABPP 样品的总离子色谱图。下图:提取的色谱峰,m/z为475.3028,保留时间为20.92分钟, 表明可能有在AOyne加合肽的N-O键断裂的不稳定产物。(C)检索完整和裂解的加成物, 分别鉴定到293和316个位点。在完整加成物和裂解加成物之间共有127个重叠位点。 (D)和(E)根据LC-MS/MS样品制备中使用的条件,由HZyne、AOyne和m-APA标记的 蛋白质组用DTT或连二亚硫酸钠处理或用0.1%甲酸在不同温度下孵育。在0.1%甲酸 中,在60℃下,凝胶内荧光显示出AOyne标记的蛋白质组明显的信号损失。
图6示出了蛋白质组中外源HNE修饰的半胱氨酸的序列分析。(A)根据二级结构倾向分析HNE修饰的半胱氨酸,表明HNE优先靶向无规卷曲中的半胱氨酸。(B)HNE修 饰的半胱氨酸的局部序列偏好。
图7示出了生化验证由TOP-ABPP鉴定的HNE修饰的半胱氨酸。(A)通过定点诱 变、m-APA标记和富集以及免疫印迹,验证HNE对靶半胱氨酸修饰的示意图。(B) MS/MS谱支持在RTN4的C1101和GAPDH的C152上的HNE修饰。(C)确认RTN4C1101和GAPDHC152为HNE修饰的位点,因为当相应的半胱氨酸突变时m-APA标记消失。
图8示出了使用m-APA通过isoTOP-ABPP在蛋白质组中定量分析HNE-敏感位点。(A)通过isoTOP-ABPP在蛋白质组中定量HNE修饰的敏感性的示意图。基于低浓度和 高浓度HNE的处理方式对每个位点的反应程度进行量化,更饱和的标记(比率~1)表示 该位点对HNE修饰具有更高的敏感性。(B)用20μM和100μM HNE处理,在蛋白质组 中~1000个半胱氨酸的isoTOP-ABPP比率的分布。插图显示了一组HNE-高敏感性半 胱氨酸(比率≤2.0,红色方框)的放大视图,其具有标记的代表性位点(ZAK的C22、RTN4 的C1001、HMOX2的C282和VDAC2的C210)。(C)对含有HNE-敏感性半胱氨酸的蛋 白质就其分子功能进行基因本体论(ontology)分析。(D)MS/MS谱支持在HMOX2的 C282和VDAC2的C210上进行HNE修饰。(E)用递增浓度的HNE处理细胞时,在蛋 白质组中VDAC2的C210和HMX2的C282上的m-APA选择性标记的羰基化。
图9示出了在铁死亡中分析内源羰基化蛋白质并对这些靶标进行功能分析。(A)用RSL3诱导以及用Lip-1拯救的铁死亡细胞中的脂质过氧化物水平。使用C11-BODIPY 荧光探针检测并通过FACS分析,RSL3将增加脂质过氧化物的水平,而Lip-1可以降 低细胞铁死亡过程中的脂质过氧化物水平。(B)在铁死亡中RD-ABPP分析内源羰基化蛋 白质的示意图。(C)从生物学过程角度对铁死亡中的羰基化蛋白质进行GO分析。(D)从 分子功能角度对铁死亡中的羰基化蛋白质进行GO分析。
图10示出了使用m-APA用RD-ABPP定量铁死亡中的内源蛋白质羰基化。(A)脂质 过氧化在介导铁死亡中起重要作用,RSL3可以通过抑制GPX4(一种脂质过氧化的关键 解毒酶)诱导铁死亡,而Lip-1可以通过清除脂质过氧化的产物来拯救细胞免于铁死亡。 (B)在用0、50、150nM RSL3诱导后和/或用300nM Lip-1拯救后,在铁死亡的HT 1080 细胞中检测蛋白质羰基化。(C)维恩图显示在铁死亡细胞中相对于对照的细胞或拯救的 细胞中鉴定的羰基化蛋白质的数目。(D)铁死亡中羰基化蛋白质的疾病分析。(E)铁死亡 中羰基化蛋白质的细胞组分分析。(F)用铁死亡中的羰基化定量所选择的蛋白质的原始 色谱峰,红色和蓝色分别是轻和重二甲基化肽的图,蛋白质名称示于图上方和量化比率 示于图下方。
图11示出在铁死亡中内源LDE修饰的鉴定和验证。(D)使用TOP-ABPP策略鉴定 铁死亡中内源LDE修饰的位点的示意图。m-APA标记的蛋白质组与酸可切割叠氮化物 -生物素标签缀合,并且通过与2%甲酸孵育来释放LDE修饰的肽用于LC-MS/MS分析。 (B)铁死亡中内源HNE/ONE修饰的选定残基位点列表。(C)铁死亡过程中验证在VDAC2 的C210上的内源羰基化,m-APA标记在C210突变成丙氨酸时丢失。6xHis标签的野 生型VDAC2及其C210A突变体在m-APA标记和富集前(“输入”)和后(“输出”)的免疫 印迹(上图)和信号量化(下图)。(D)在RSL3诱导的铁死亡过程中,过表达GFP、野生型 VDAC2及其C210A突变体的三种HT 1080稳定细胞系的细胞活力测试。
图12示出本发明中使用的部分化合物和探针的化学结构。
图13示出本发明中酸标签的合成途径。
图14示出GSH_HNE_m-APA最终加合物的HRMS。
图15示出用小分子底物N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)验证苯胺探针检测蛋白质羰基化 的反应性。A:NAC_HNE_m-APA的最终加合物的HPLC图。B:NAC_HNE_m-APA 最终加合物(500MHz,CD3OD)的1H NMR谱。C:NAC_HNE_m-APA最终加合物 (126MHz,CD3OD)的13C NMR光谱。D:NAC_HNE_m-APA最终加合物的HRMS。
发明内容
除非另有指示或定义,否则本文所有术语均具有本领域中的通常含义,该含义将为 本领域技术人员所了解。
本发明人令人惊奇地发现,可使用基于苯胺的探针来分析蛋白质羰基化。不期望受 任何理论束缚,认为苯胺可以与蛋白质羰基化修饰形成的醛底物快速地形成质子化的苯 胺希夫碱高反应性中间体,然后苯胺希夫碱中间体可以通过用NaBH3CN还原亚胺键来稳定,形成苯胺修饰的肽底物(图1A)。通过苯胺探针上的炔基,可以进一步缀合荧光 标签或生物素标签,从而可以用SDS-PAGE显示羰基化蛋白质或富集羰基化蛋白质用于 基于MS的蛋白质组分析。
因此,在一方面,本发明提供一种用于富集生物学样品中羰基化的蛋白质的方法,所述方法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有可检测标记物的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;和
c)通过所述苯胺探针上的可检测标记物富集羰基化的蛋白质。
在一些实施方案中,步骤b)在大约pH5至大约pH7下进行,优选在酸性pH下进行,例如pH5至pH6。在一些实施方案中,步骤b)所述苯胺探针的浓度为至少大约0.5mM。
如本发明所用,“从生物学样品提取蛋白质”包括从任何生物学样品获得蛋白质以进行蛋白质组分析的任何过程。可以提取样品中的全部蛋白质或部分蛋白质(如可溶蛋白)。
在一方面,本发明提供一种用于鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质和/或 其羰基化氨基酸残基的方法,所述方法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有可检测标记物的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;和
c)通过所述可检测标记物检测羰基化的蛋白质,或通过所述可检测标记物富集羰基化的蛋白质用于基于质谱的测定。
在一些实施方案中,步骤b)在大约pH5至大约pH7下进行,优选在酸性pH下进行,例如pH5至pH6。在一些实施方案中,步骤b)所述苯胺探针的浓度为至少大约0.5mM。
在一些实施方案中,通过LC-MS/MS进行所述基于质谱的测定。
在一方面,本发明提供一种用于富集生物学样品中羰基化的蛋白质的方法,所述方 法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有端炔的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;
c)在允许发生叠氮-炔环加成反应的条件下,使步骤b)的产物与可检测标记物的叠 氮化物接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述可检测标记物标记;和
d)通过所述可检测标记物富集羰基化的蛋白质。
在一些实施方案中,步骤b)在大约pH5至大约pH7下进行,优选在酸性pH下进行,例如pH5至pH6。在一些实施方案中,步骤b)所述苯胺探针的浓度为至少大约0.5mM。
在一些实施方案中,所述富集的蛋白质用于进行定量化学蛋白质组分析。例如,通过RD-ABPP定量化学蛋白质组平台,比较不同样品的蛋白质羰基化水平。
在一些实施方案中,所述带有端炔的苯胺探针选自邻-氨基苯乙炔(o-APA)、间-氨基 苯乙炔(m-APA)和对-氨基苯乙炔(p-APA)。o-APA、m-APA和p-APA的结构分别如下所示:
叠氮-炔环加成反应是本领域最常用的一种点击化学反应,其中通过Cu(I)催化,使 得末端炔基与叠氮基发生环加成反应(CuAAC),生成结构选择性的1,2,3-三氮唑。通常而 言,可以在Tris(苄基三唑基甲基)胺(TBTA),CuSO4和TCEP存在下实现所述叠氮-炔环加成反应。
在一方面,本发明提供一种用于鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质和/或 其羰基化氨基酸残基的方法,所述方法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有端炔的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;
c)在允许发生叠氮-炔环加成反应的条件下,使步骤b)的产物与可检测标记物的叠 氮化物接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述可检测标记物标记;和
d)通过所述可检测标记物检测羰基化的蛋白质,或通过所述可检测标记物富集羰基化的蛋白质用于基于质谱的测定。
在一些实施方案中,所述带有端炔的苯胺探针选自邻-氨基苯乙炔(o-APA)、间-氨基 苯乙炔(m-APA)和对-氨基苯乙炔(p-APA)。
在一些实施方案中,步骤b)在大约pH5至大约pH7下进行,优选在酸性pH下进行,例如pH5至pH6。在一些实施方案中,步骤b)所述苯胺探针的浓度为至少大约0.5mM。
在一些实施方案中,通过LC-MS/MS进行所述基于质谱的测定。
在本发明上述各方面的一些实施方案中,所富集的蛋白质用于进行定量化学蛋白质 组分析。例如,通过RD-ABPP定量化学蛋白质组平台,比较不同样品的蛋白质羰基化水平。
RD-ABPP的实验设计是本领域技术人员已知的。例如,来自靶样品和对照样品的经本发明的方法富集的蛋白质在用蛋白酶(如胰蛋白酶)消化后,分别通过重甲醛和轻甲醛进行还原性二甲基化标记,然后通过质谱方法定量和比较样品之间的蛋白质羰基化差异,鉴定潜在的羰基化蛋白质或位点。
在本发明上述各方面中,所述羰基化的氨基酸残基包括羰基化的半胱氨酸、羰基化 的组氨酸或羰基化的赖氨酸。
在本发明上述各方面中,所述可检测标记物可以包括但不限于,放射性标记(例如3H、125I、35S、14C、32P和33P)、酶标记(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖 6-磷酸脱氢酶等);化学发光标记(例如吖啶酯、硫酯或磺酰胺;鲁米诺、异鲁米诺、菲 啶酯等);荧光标记(例如荧光素(例如,5-荧光素、6-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四 氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(例如硫化锌 封端的硒化镉)、多肽标签(亲和标签如6xHis标签)、生物素/链霉亲和素标记系统等。
在一些实施方案中,所述可检测标记物可以直接偶联至苯胺的邻位、间位或对位,从而形成苯胺探针的一部分。在另一些实施方案中,所述可检测标记物通过点击化学(如叠氮-炔环加成反应)与已经标记于靶上的苯胺探针(带有端炔)连接。用于点击化学的许多可检测标记物的叠氮化物可商购获得,例如生物素-PEG4-叠氮化物(ChemPep Inc.,产品编号271606),PC-生物素-叠氮化物(Click chemistry tools,产品编号1119),罗丹明-叠 氮化物等。
本发明可检测标记物可用于直接或间接检测被标记的物质。或者所述可检测标记物 可以用于富集被标记的物质,从而用于进一步的测定,例如基于质谱的测定。本领域技术人员可以根据具体需要选择合适的可检测标记物。在一些具体实施方案中,所述可检 测标记物是罗丹明。在另一些具体实施方案中,所述可检测标记是生物素,其可以通过 与经另外标记的链霉亲和素特异性结合而被检测,或者可通过与固定化的链霉亲和素特 异性结合而被富集。
在一些实施方案中,所述可检测标记物是可裂解的生物素标签,使得可以在富集步 骤之后,通过裂解处理去除所述生物素。
在一些具体实施方式中,可裂解的生物素标签(叠氮化物)是下式所示的偶氮苯生物 素标签(Azo tag):
在通过点击化学标记后,可以通过用连二亚硫酸钠处理切割偶氮苯位点而去除生物 素(释放标记的蛋白质/肽)。
在一些优选具体实施方式中,可裂解的生物素标签(叠氮化物)是下式所示的酸裂解 生物素标签(Acid tag):
在通过点击化学标记后,可以通过用酸(例如2%甲酸)处理切割而去除生物素(释放 标记的蛋白质/肽)。
在一些实施方案中,所述可裂解的生物素标签还可以被同位素标记,从而可以应用 于基于质谱的定量蛋白质组分析,例如应用于同位素TOP-ABPP策略(iso-TOP-ABPP)。iso-TOP-ABPP的实验设计是本领域技术人员已知的。
在本发明各个方面的一些实施方案中,生物学样品可以是直接获得自生物来源的样 品,或者是经加工的样品。所述生物学样品包括但不限于,体液如全血、血浆、血清、 脑脊液、滑液、尿,来自不同组织或器官的样品,包括来自患者的活组织检查样品。生 物学样品还涵盖分离的细胞系如HT1080细胞或H1299细胞。所述生物学样品还可以是 疾病相关的样品,例如来自急性肾损伤、亨廷顿病、癌症、脑室周围白质软化症和SECIS 结合蛋白2(SBP2)缺陷综合征、神经变性和炎症患者的样品,从而可以鉴别所述疾病相 关的羰基化蛋白质靶。
在一些实施方案中,所述生物学样品是铁死亡的细胞,例如是RSL3诱导的铁死亡细胞。在一些实施方案中,所述生物学样品是RSL3诱导后经Lip-1处理的经拯救的铁死 亡细胞。在一些实施方案中,所述生物学样品是未经RSL3诱导的对照细胞。通过质谱 定量比较铁死亡细胞和对照细胞(或拯救的细胞)的蛋白质羰基化水平,可以鉴定铁死亡 中内源羰基化修饰的蛋白质靶。
在一些实施方案中,所述生物学样品是脂源性亲电小分子(LDE)例如HNE处理的细胞。在一些实施方案中,所述生物学样品是未经脂质衍生的亲电体(LDE)例如HNE 处理对照细胞。通过质谱定量比较LDE处理细胞和对照细胞的蛋白质羰基化水平,可以 鉴定外源羰基化修饰的蛋白质靶,即不同生物学过程中潜在的羰基化靶点。
在另一方面,本发明还提供苯胺探针在富集、鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质中的用途,所述探针选自邻-氨基苯乙炔(o-APA)、间-氨基苯乙炔(m-APA)和对-氨基苯乙炔(p-APA),优选m-APA。
在另一方面,本发明还提供通过本发明的方法鉴定的羰基化蛋白质作为疾病标志物 或细胞铁死亡标志物的用途。
在另一方面,本发明提供一种用于富集、鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质的试剂盒,所述试剂盒至少包括本文所述的苯胺探针、NaBH3CN和/或可检测标记 物(标签)。所述探针和所述可检测标记物如上文所定义。
本发明的方法和试剂盒特别适合于鉴别与铁死亡相关疾病的蛋白质靶点。
实施例
下面将通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所描述的 实施例范围中。
一般方法
试剂
o-APA、m-APA、p-APA探针购自Sigma-Aldrich(产品号:597651、498289和481122)。除非单独说明,其他试剂均购自Sigma-Aldrich。
细胞培养
将H1299、HT1080和HEK293T细胞在37℃、5%CO2下在补充有10%FBS和1% PS的DMEM培养基中培养。当达到80%密度时,通过胰蛋白酶消化将细胞传代培养。
质粒
从hORFeome数据库获得RTN4、VDAC2、HMOX2、GAPDH的全长cDNA并亚 克隆到经修改的pCLNCX逆转录病毒载体中。通过基于PCR的定点诱变,使用 FastPFU DNA聚合酶(Beijing TransGen Biotech Co.,Ltd.)和以下引物产生 RTN4C1101A、GAPDHC152A、VDAC2C210A和HOMX2C282A的质粒:
RTN4(BC1101A)(正向:5'-GGTCATGTGAACGCTACGATAAAGGAACTCAG-3'和反向: 5'-AGCGTTCACATGACCAAGAGCAGAATTACTG-3')。
VDAC2C210A(正向:5'-GCTGAAGATCTTGACACTTCAGTAAACCTTGCTTG-3'和反向: 5'-GTCAAGATCTTCAGCAACTTTCTGATAAATTG-3')。
HOMX2C282A(正向:5'-GCTCCCTTCCGAACAGCTATGGCTGTGCTGAGG-3'和反义: 5'-GTTCGGAAGGGAGCGCTGCTGCCCTCCAGG-3')。
GAPDHC152A(正向:5'-CAATGCCTCCGCTACCACCAACTGCTTAGC-3'和反向: 5'-AGCGGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGGCTG-3')。
瞬时转染
RTN4WT、RTN4C1101A、HOMX2WT和HOMX2C282A在转染前确认为具有正确的序列。 在6孔板中将HEK-293T细胞培养至约70%密度,并使用Lipo2000(Thermo Fisher)用 3μg质粒转染HEK-293T细胞。12小时后更换新鲜的DMEM培养基。48小时后,过表 达RTN4WT和RTN4C1101A的细胞与100μM HNE一起孵育1小时,而过表达HOMX2WT和HOMX2C282A的细胞与0、2、5、10和20μMHNE孵育。
稳定的过表达
通过逆转录病毒转染构建具有稳定过表达VDAC2、GAPDH及其相应半胱氨酸突 变体的HEK-293T或HT1080细胞系。蛋白质与C端FLAG标签和6xHis标签融合。
通过使用Lipo2000系统将3μg AMPHOR质粒和3μg靶向修饰的pCLNCX质粒转 染到靶细胞中来产生逆转录病毒。24小时后更换新鲜培养基,48小时后收集。收集含 有病毒的培养基并通过0.22μm膜过滤。用3倍DMEM培养基稀释病毒并与8μg/ml聚 凝胺混合。将混合物加入到靶细胞的平板中(约70%密度)并在24小时后更换新鲜培养 基。将细胞传代并在200μg/ml潮霉素处理下培养,直到所有未转染的细胞被杀死。通 过使用抗FLAG或抗6x His抗体的蛋白质印迹验证pCLHCY质粒的转染效率。
验证单个HNE靶向的蛋白质
将过表达RTN4WT、RTN4C1101A、GAPDHWT和GAPDHC152A的细胞在0.1% TritonX-100/PBS中裂解,以100000g离心30分钟以除去细胞碎片,并通过BCA蛋白 质测定法测定蛋白质浓度。将蛋白质组标准化至2mg/mL,与100μM HNE在室温孵育 1小时,并在pH5.0用0.5mM m-APA标记1小时。蛋白质组通过甲醇/氯仿沉淀并重悬 于0.4%SDS/PBS中。蛋白质组与1mMCuSO4、100μM TBTA配体、100μM生物素 -(PEG)2-N3和1mM TCEP在室温反应1小时。在再次沉淀后,蛋白质组用链霉亲和素珠 富集3小时。珠用PBS洗涤3次,用上样缓冲剂在95℃洗脱20分钟。样品在SDS-PAGE 凝胶上分离并用抗6xHis或抗FLAG抗体进行免疫印迹。
为了检查HNE对HMOX2和VDAC2的浓度依赖性标记,将细胞在无血清培养基 中用0、2、5、10和20μM HNE处理,并在含有0.5%TritonX-100的冰冷PBS中超声 处理裂解。
为了验证铁死亡中在VDAC2的C210上的羰基化,将稳定过表达VDAC2WT或VDAC2C210A的HT1080细胞与DMSO或300nM RSL3一起孵育,以在无血清培养基中 原位诱导铁死亡3小时。收集细胞并通过在含有0.5%TritonX-100的冰冷的PBS中超声 处理裂解。
用FACS分析铁死亡细胞中脂质过氧化物的水平
将HT1080以8x105个细胞/孔接种在6孔培养皿中生长过夜。在实验当天,将细胞用DMSO、含有/不含300nM Lip-1的150nM RSL3在无血清培养基中处理3小时。然 后将细胞用预热的PBS洗涤3次,并用含有2μM C11-BODIPY的无血清培养基孵育15 分钟。细胞用PBS洗涤3次,收集并使用配备有用于激发的488nm激光器的流式细胞 仪进行分析。每种条件至少分析10,000个细胞。
通过MTT监测细胞活力
将细胞以10,000个/孔接种于96孔培养皿中生长过夜。然后将细胞用DMSO或500nM RSL3在血清培养基中处理24小时。用预热的PBS洗涤细胞并用含有MTS试剂 的无血清培养基孵育2小时。测量490nm处的吸光度,并且报告为测试条件下细胞活 力相对于阴性对照处理的百分比。
蛋白质亚磺酰化的凝胶内荧光扫描
使H1080细胞生长至80%密度,用PBS洗涤3次,并以1000rpm离心3分钟。除 去PBS上清液,并将细胞沉淀在-80℃下储存。在含有0.1%TritonX-100的冰冷PBS中 通过超声处理裂解细胞沉淀,以100,000g离心30分钟以除去细胞碎片,并通过BCA 蛋白质测定法测定蛋白质浓度。蛋白质组在室温与10mM H2O2孵育1小时,并用100μM Dyn-2额外标记1小时。蛋白质组与1mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM荧光团 -N3和1mM TCEP在室温反应1小时。使用样品缓冲剂将蛋白质组在90℃煮沸5分钟, 在10%SDS-PAGE凝胶上解析并通过ChemiDocXRS+(Bio-Rad)成像。然后将凝胶通过 考马斯亮蓝(CBB)染色以证明等量加样。
化学合成
使用本领域普通技术人员已知的方法,化学合成Dyn-2、AOyne、HZyne、最终加 合物GSH-HNE-m-APA以及最终加和物NAC-HNE-m-APA。
在GSH模型中测试m-APA
1mM GSH与Tris-HCl缓冲剂(pH=7.4)中的100μM HNE在室温反应1小时。然后 将反应调节至pH5.0并加入0.5mM m-APA和60mM NaBH3CN反应1小时。在具有肽 BEH C18柱(Waters 300,1.7 2.1 100mm)和四极杆SQ Detector 2质谱仪(Waters Corp.)的 UPLC-ESI-MS上分析样品。使用超纯水和乙腈作为流动相进行7分钟梯度洗脱,分别 在m/z 306、462和563提取GSH-HNE、GSH-HNE和GSH-HNE-m-APA的离子色谱图。
胶内荧光扫描
使H1299细胞生长至80%密度,用PBS洗涤3次并以1000rpm离心3分钟。除去 PBS上清液,并将细胞沉淀在-80℃下储存。通过在含有0.1%TritonX-100的冰冷PBS 中超声处理裂解细胞沉淀,以100,000g离心30分钟以除去细胞碎片,并通过BCA蛋 白质测定法测定蛋白质浓度。将蛋白质组标准化至2mg/mL,在室温用0、10、50、100 或250μM HNE孵育1小时,并且在pH 5.0下用0.5mM m-APA标记1小时。通过加入5倍体积倍数的甲醇/氯仿(v/v=4:1)混合物和3倍体积的水使蛋白质组沉淀,并以10000g 离心10分钟。弃去上清液,用冷甲醇洗涤蛋白质组,并重悬于0.4%(w/v)SDS/PBS中。 将蛋白质组与1mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM荧光团-N3和1mM TCEP在室 温反应1小时。使用样品缓冲剂将蛋白质组在90℃煮5分钟、在10%SDS-PAGE胶内 上分离并通过ChemiDoc XRS+(Bio-Rad)成像。然后将胶内通过考马斯亮蓝(CBB)染色 以证明等量加样。
为了通过胶内荧光检测铁死亡中的蛋白质羰基化,用0、50或150nM RSL3处理HT1080细胞,并用或不用300nM Liproxstatin-1共处理3小时。收集细胞,通过在含有0.5%TritonX-100的冰冷的PBS中超声处理裂解,并以100,000g离心30分钟以除去细 胞碎片。通过BCA蛋白质测定法测定蛋白质浓度,并将其标准化至2mg/mL。如上所 述进行m-APA标记和胶内荧光扫描的过程。
LSM共聚焦显微镜分析
使HT1080细胞生长至70%密度并与20μM HNE一起在无血清培养基孵育1小时。 用预温的PBS洗涤细胞,用含有4%(v/v)甲醛的PBS在37℃固定15分钟,用PBS冲 洗三次并在37℃含有0.2%(v/v)TritonX-100的PBS中透化10分钟。再次用PBS冲洗 细胞三次,并用0.5mM m-APA标记1小时。然后轻轻摇动用PBS洗涤细胞三次,并在 室温用100μM BTTAA-CuSO4复合物、100μM荧光团-N3和2.5mM抗坏血酸钠点击15 分钟。最后,细胞用25μg/mlHoechst 33342染色10分钟以指示细胞核区域。使用装备 有63x/1.4NA油浸物镜的ZeissLSM 700激光扫描共聚焦显微镜获得图像。
鉴定和定量外源HNE修饰的位点
为了鉴定HNE修饰的位点,用100μM HNE处理蛋白质组,并用0.5mM m-APA标 记1小时(HZyne和AOyne的标记条件与m-APA相同,处理AOyne标记的情况不需要 NaBH3CN)。然后将蛋白质组与1mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM生物素 -AZO-N3(轻)标签和1mM TCEP反应1小时。蛋白质组用甲醇/氯仿沉淀,重悬于1.2% SDS/PBS中并稀释至0.2%SDS/PBS。根据发表的TOP-ABPP方案(Weerapana,E.等, 2007)对样品进行链霉亲和素富集和珠上(on-bead)胰蛋白酶消化。通过1400g离心将胰 蛋白酶消化物与珠分离,并分别用300μL PBS和300μL H2O洗涤珠子三次。偶氮苯切 割通过3次在室温用75μL的25mM连二亚硫酸钠孵育珠1小时进行,并缓慢旋转(Qian, Y.等,2013)。收集上清液,加入5%甲酸,-20℃保存待分析。
为了定量HNE修饰的位点,蛋白质组用20μM和100μM HNE分别处理,用m-APA 标记,然后分别用重生物素-AZO-N3和轻生物素-AZO-N3点击。蛋白质组用甲醇/氯仿 沉淀,合并并重悬于1.2%SDS/PBS中。如上所述通过TOP-ABPP方案处理样品。
用于铁死亡中内源糖基化蛋白质鉴定和定量的RD-ABPP
将8×106个HT 1080细胞接种在15cm培养皿中,生长过夜,并在无血清培养基中与DMSO(“对照”)或150nM RSL3(“铁死亡的”)孵育3小时。收集细胞,通过在含有0.5%TritonX-100的冰冷PBS中超声处理裂解并以100,000g离心30分钟以除去细胞碎片。 通过BCA蛋白质测定法测定蛋白质浓度,并将其标准化为1mL体积的2mg/mL。来自 对照或铁死亡细胞的裂解物分别用0.5mM m-APA标记。蛋白质组用甲醇/氯仿沉淀并重 悬于0.4%SDS/PBS中。在样品中加入1mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM生物 素-(PEG)2-N3和1mM TCEP反应1小时。再用甲醇/氯仿沉淀蛋白质组,重悬于1.2% SDS/PBS中,稀释至0.2%SDS/PBS并进行链霉亲和素富集。将富集的蛋白质用100mM TEAB缓冲剂中的串联胰蛋白酶消化,并进行还原性二甲基化标记(Hsu,J.L.等,2003; Boersema,P.J.等,2009)。简而言之,将4%轻或重甲醛分别加入到铁死亡或对照蛋白 质组中,同时加入0.6M氰基硼氢化钠。反应在室温持续1小时,并依次用1%氨和5% 甲酸猝灭。最后,将重和轻标记的肽组合,通过快速真空浓缩,通过Fast-seq方案分离 (Ding,C.等,2013),并通过LC-MS/MS分析。
为了拯救细胞免于铁死亡,HT1080细胞用150nM RSL3和300nM Liproxstatin-1一起处理(“拯救的”)。使来自“铁死亡”和“拯救的”细胞的蛋白质组进行如上所述的 RD-ABPP方案。表1总结了在RD-ABPP结果中与铁死亡有潜在联系的靶标。
表1
Uniprot# | 基因名称 | 比率(RLS/DMSO) | 比率(+Lip-1/-Lip-1) | 与铁死亡的潜在联系 |
P02786 | TFRC | 3.18 | 2.71 | 转铁蛋白受体,在铁死亡敏感细胞中表达增加 |
Q658P3 | STEAP3 | 2.44 | 2.09 | 将Fe<sup>3+</sup>还原成Fe<sup>2+</sup>的功能 |
P45880 | VDAC2 | 12.57 | 10.71 | 铁死亡的正调节子,erastin直接靶标 |
Q9Y277 | VDAC3 | 10.62 | 7.75 | 铁死亡的正调节子,erastin直接靶标 |
O60488 | ACSL4 | 3.12 | 2.9 | 通过细胞脂质组分调节铁死亡敏感性 |
P01116 | KRAS | 11.82 | 7.56 | 致癌RAS突变细胞对erastin诱导的铁死亡敏感 |
鉴定铁死亡中LDE修饰的内源位点
为了鉴定细胞铁死亡中的内源LDE修饰的位点,如上文在RD-ABPP方案中所述, 用DMSO(“对照”)或150nM的RSL3(“铁死亡的”)处理HT 1080细胞。蛋白质组用0.5mM m-APA标记1小时,然后与1mM CuSO4、100μM TBTA配体、100μM生物素-酸-N3标 签和1mM TCEP反应1小时。蛋白质组用甲醇/氯仿沉淀,重悬于1.2%SDS/PBS中并 稀释至0.2%SDS/PBS。将样品进行链霉亲和素富集和珠上胰蛋白酶消化。通过1400g 离心将胰蛋白酶消化物与珠分离,并用分别用300μL PBS和300μL H2O洗涤珠子三次。 通过将珠子在室温的200μL 2%甲酸中孵育1小时,并轻轻转动,来释放LDE修饰的肽。 用400μL含有1%甲酸的50%乙腈/水洗涤珠子2次,合并上清液,通过快速真空浓缩 并通过LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS和数据分析
通过在Q Exactive series Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上的LC-MS/MS 并与easynano-LC联用进行样品分析。在正离子模式下,使用质量分辨率为70000的 Orbitrap质量分析仪在350至1800的m/z范围内采集全扫描质谱。MS/MS碎片以数据 依赖模式进行,其中使用HCD的碰撞模式,选择TOP 20最强的离子进行MS2分析, 分辨率为17500。其他重要参数:分离窗为2.0m/z units;默认电荷为2+;归一化碰撞 能量为28%;最大IT为50毫秒;动态排除为20.0秒。
LC-MS/MS数据通过ProLuCID(Xu,T.等,2015)分析,利用半胱氨酸的静态修饰 (+57.0215Da)和甲硫氨酸的可变氧化(+15.9949Da)。对于RD-ABPP数据,将同位素修饰 (轻和重标记分别为28.0313和34.0631Da)设定为肽和赖氨酸N-端上的可变修饰。对于 TOP-ABPP数据,将576.3788Da设定为半胱氨酸上的可变修饰。对于isoTOP-ABPP数 据,将576.3788和582.3926Da设定为半胱氨酸上的可变修饰。
对于铁死亡中的HNE、ACR、ONE、OHE、2-HD、HHE修饰,将442.3308、342.2420、440.3151、398.2682、524.4455、400.2838Da设定为半胱氨酸上的可变修饰。
分析完整的质谱图,以确保同位素包络的单峰与ProLuCID鉴定的肽的质量匹配,这对于区分相似质量的修饰,例如相差仅2Da的HNE和ONE是至关重要的。对于鉴 定的每个修饰位点,如果肽中存在多个潜在修饰位点(C/H/K),并且将得分标准化以指 定每个位置修饰的可能性,则基于MS/MS谱计算置信度得分(Kong,A.T.等,2017)。对 于RD-ABPP结果,如果有多个肽成功定量,则使用每个蛋白质的一个样品T检验计算 倍数变化和相对p值。如前所述,通过CIMAGE软件对还原性二甲基化和isoTOP-ABPP 的比率进行定量(Weerapana,E.等,2010)。
实施例1:评估苯胺探针检测天然蛋白质组中的蛋白质羰基化的反应性。
测试了用分别在邻位、对位和间位具有炔基的市售氨基苯乙炔(“APA”)化合物(图1A)捕获细胞裂解物中羰基化蛋白质的效率。来自非小细胞肺癌H1299细胞的蛋白质组 用100μM的HNE处理,然后用0.5mM的每种APA探针进行标记。用NaBH3CN还原 后,APA标记的蛋白质通过铜催化的点击化学与荧光团-N3缀合(Kolb,H.C.等,2001), 并通过胶内荧光显现。
在三种APA探针中,m-APA在与HNE修饰的蛋白质组反应中表现出最佳效率(图1B)。这可以解释为当炔基位于间位时,吸电子能力下降,这为苯胺弹头提供了最强的 亲核性。进一步发现,m-APA标记的最佳pH在5和6之间(图2A),这与酸性条件有利 于亚胺形成的事实一致。通过NaBH3CN的还原步骤稳定亚胺键也十分关键(图1C)。标 记在0.5mM的m-APA达到饱和并在1小时内完成(图2B、图3A、图3B)。在这些优化 的条件下,发现m-APA能够检测不同浓度的HNE诱导的蛋白质组中的蛋白质羰基化(图1D),并且游离苯胺可与标记竞争(图1E),且不被其他氧化形式的半胱氨酸修饰(如蛋白 质亚磺酰化)污染(图2C)。
本发明还用HNE原位处理细胞,并证明m-APA可以有效标记固定细胞中的羰基化蛋白质,使得使用共聚焦显微镜可以直接成像(图1F)。此外,使用谷胱甘肽(GSH)作为 模型来验证m-APA与羰基化GSH之间的反应。GSH与100μM HNE反应形成具有游 离醛的迈克尔加合物,并加入0.5mM m-APA继续反应1小时。在用60mM NaBH3CN 还原亚胺键后,通过LC-MS成功检测到GSH-HNE-m-APA产物(m/z=563)(图1G)。通 过HPLC进一步纯化产物,并通过具有正确质量的傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTMS) 表征(图14)。最后,我们使用小分子底物N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)验证了该反应,并 且通过1H NMR,13C NMR以及HRMS(图15)表征最终加合物,所有这些都证实m-APA 能够如预测的那样捕获羰基化的半胱氨酸。
实施例2:使用串联正交蛋白质裂解(TOP)-ABPP策略鉴定羰基化位点。
接下来将m-APA标记和TOP-ABPP策略联用来鉴定HNE修饰位点。在用100μM HNE处理蛋白质组并用m-APA标记之后,带有可切割的偶氮苯位点的偶氮苯-生物素标 签(“azo-生物素”)(Qian,Y.等,2013)与m-APA标记的蛋白质缀合。在链霉亲和素富集和 珠上胰蛋白酶消化之后,通过连二亚硫酸钠进行一轮正交切割以从链霉亲和素珠上释放 HNE修饰的肽,然后通过LC-MS/MS分析以鉴定HNE修饰的位点(图4A)。进行三次 生物学重复,并一共鉴定了>1000个半胱氨酸、25个组氨酸和5个赖氨酸作为HNE修 饰的位点,其与之前半胱氨酸是通过迈克尔加成的HNE修饰的主要位点的研究结果一 致(Yang,J.等,2015;Doorn,J.A.和Petersen,D.R.,2002)(图4C)。
还将m-APA与另外两个之前报道的可点击探针HZyne和AOyne的性能一一进行了比较。HZyne没有在相同的实验条件下鉴定出任何位点,这与其在胶内荧光的最弱标记 相符(图3A、3B)。令人惊讶的是,尽管AOyne的胶内荧光的标记效率看起来更高,但 它仅能通过TOP-ABPP识别293个半胱氨酸、15个组氨酸和4个赖氨酸作为HNE修饰 的位点,远低于m-APA所鉴定的位点(图3A、3B、4B)。进一步的研究表明AOyne修 饰的肽加合物是不稳定的,其中大部分在样品制备期间在N-O键处断裂(图5)。这些数 据表明m-APA是用于标记蛋白质羰基化的优选探针,可以用于LC-MS/MS进行的化学 蛋白质组学分析。
鉴于半胱氨酸被发现是HNE修饰的主要位点,于是进行了这些HNE-加成肽的二 级结构特征分析,显示HNE对于卷曲中的半胱氨酸有明显的偏好性(图6A)。有趣的是, 修饰位点侧翼的局部序列比对显示,在CXXC结构(硫氧还蛋白家族的代表性基序)中, 当在X+2或X-2位置的另一个半胱氨酸不可用时,HNE优选修饰半胱氨酸(图6B)。这 一结果表明,尽管它们的内在反应性升高,但具有硫氧还蛋白样折叠的蛋白质不是HNE 修饰的优选靶标,这与之前使用IAyne探针的发现一致(Wang,C.等,2014)。在所鉴定 的半胱氨酸中有几个是之前报道的HNE修饰位点,包括浆膜蛋白-4(RTN4)的C1101和 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的C152(图7B)。我们在HEK-293T细胞中过表达这三种 蛋白以及它们的半胱氨酸突变体,并且免疫印迹显示在HNE处理后,m-APA探针只能 捕获野生型蛋白,而不捕获任何半胱氨酸突变体(图7C)。这些结果不仅在生化上证实了 这些半胱氨酸是HNE修饰的特定位点,而且还进一步证明了m-APA探针在复杂蛋白质 组中选择性标记蛋白质羰基化的效率。
实施例3:通过同位素TOP-ABPP方法(“isoTOP-ABPP”)对HNE敏感性进行定量排序。
为此对蛋白质组中HNE敏感性半胱氨酸进行定量排序,本发明应用m-APA探针来比较用不同浓度的HNE处理后每个位点的修饰水平。来自H1299细胞的蛋白质组分别 用低浓度(20μM)和高浓度(100μM)的HNE处理,用m-APA探针标记,并分别与同位素 标记的重和轻生物素-azo-N3缀合。在LC-MS/MS分析之前,将蛋白质组合并,富集, 用胰蛋白酶消化并用连二亚硫酸钠切割。每个HNE-加合的肽的定量比率(轻/重)“R”反 映了其对HNE修饰的敏感性,其中较低的比率对应于较高的HNE敏感性(即,在用低 浓度的HNE处理时HNE标记接近饱和)(图8A)。定量了约1000个不同的isoTOP-ABPP 比率的半胱氨酸。最终,使用R≤2作为截止值,能够在蛋白质组中鉴定约100个对HNE 修饰的高敏感性半胱氨酸(图8B)。含有这些HNE-高敏感性半胱氨酸的蛋白质的分析显 示孔蛋白(porin)活性是最显著富集的分子功能,其次是Ran GTPase结合活性和肽/蛋白 质转运蛋白活性(图8C)。将本发明鉴定出的HNE-高敏感性半胱氨酸与之前使用竞争性 ABPP方法获得的半胱氨酸进行比较,发现ABPP列表中的5个HNE-敏感性半胱氨酸 中的4个也通过当本发明方法鉴定出(图8B),包括FN3KRP的C24、ZAK的C22、RTN4 的C1001和EEF2的C41。
此外,本发明还发现了一些新的HNE-高敏感性半胱氨酸,包括电压依赖性阴离子选择通道蛋白2(VDAC2)的C210和血红素加氧酶2(HMOX2)的C282(图8D、图8E)。 在HEK-293T细胞中过表达这两种新鉴定的蛋白质及其半胱氨酸突变体,并且活细胞的 浓度依赖性HNE处理显示高敏感性半胱氨酸可在低至5μM的HNE处检测到。总的来 说,使用HNE作为模型化合物的这些结果表明,对于化学蛋白质组分析,m-APA是用 于在体外和原位捕获蛋白质羰基化位点的强大且高效的探针。
实施例4:铁死亡中蛋白质羰基化的内源事件分析。
铁死亡是新定义的细胞死亡类型,特征在于其依赖于细胞内铁和恶化的脂质过氧化 作用。RSL3是一种有效的GPX4抑制剂,负责将脂质过氧化物还原为相应的醇类,可 以有效地触发HT 1080细胞中的铁死亡(Yang,W.S.和Stockwell,B.R.,2008)。这样的 细胞死亡可以通过liproxstatin-1(Lip-1)(用作催化活性氧清除剂的spiroquinoxalinamine 衍生物)有效地抑制(图10A)(Kagan,V.E.等,2017;Friedmann Angeli,J.P.等,2014;Zilka, O.等,2017)。与这些报道一致,当用RSL3处理HT1080细胞以诱导铁死亡时,观察到 可以通过Lip-1的预处理阻断脂质ROS的增加(图9A)。因此,将m-APA探针应用于铁 死亡条件中,旨在捕获这一过程中的蛋白质羰基化。来自RSL3处理的和/或Lip-1处理 的HT1080细胞的裂解物用m-APA标记并与荧光团-叠氮化物缀合以通过胶内荧光进行 分析。荧光信号随着RSL3浓度的增加而增加,证明了在铁死亡中升高的脂质过氧化和 蛋白质羰基化。当添加Lip-1来拯救细胞免于铁死亡时,还观察到m-APA标记信号伴 随减少(图10B),证实检测到的m-APA信号确实衍生自内源性产生的LDE。
为了定量评估铁死亡中羰基化的靶标,采用了名为“RD-ABPP”的定量化学蛋白质组 学平台,其结合与ABPP联用的还原性二甲基化(“RD”)(Boersema,P.J.等,2009;Niphakis, M.J.等,2014)。设计和进行两个独立的RD-ABPP实验(图10C)。在一个实验中,来自 对照细胞和铁死亡细胞的蛋白质组用m-APA探针标记和富集,并且将所得的经消化的肽样品分别通过重甲醛或轻甲醛进行还原性二甲基化。在另一个实验中,使用m-APA 标记来自具有和不具有铁死亡抑制剂Lip-1的RSL3处理的细胞蛋白质组。定义在至少 两次重复中定量的轻/重比≥2的蛋白质作为潜在的靶标,并且在每种类型的实验中总共 分别鉴定了1075和1031个羰基化蛋白质,其中总共有463个蛋白质相同(图10D)。这 是本领域首个全面的铁死亡中脂质过氧化内源产生的羰基化蛋白质图谱。
实施例5:铁死亡中羰基化靶标的基因本体论(GO)分析。
GO分析显示,羰基化蛋白质主要位于膜区室内,包括内质网(ER)膜、高尔基体以及线粒体膜(图10E),其高度富集多不饱和脂肪酸(PUFA),并容易发生脂质过氧化(Fritz,K.S.和Petersen,D.R.,2013)。有趣的是,ER已被证明是铁死亡中脂质过氧化的主要 部位(Kagan,V.E.等,2017),这与脂质亲电体可能通过邻近效应优先靶向蛋白质也是一 致的。还根据DAVID疾病数据库中记录的注释分析了这些羰基化蛋白质,发现它们在 肺癌、肾衰竭和阿尔茨海默病等疾病中高度富集(图10D)。这些疾病中的大多数早已被 指出与铁死亡有关(Yang,W.S.和Stockwell,B.R.2016;Xie,Y.等,2016;Friedmann Angeli, J.P.等,2014;Skouta,R.等,2014;Linkermann,A.等,2014),并且艾滋病/HIV感染也 在该清单前列,HIV感染可引起谷胱甘肽体内平衡失调(Herzenberg,L.A.等,1997;Cao, J.Y.和Dixon,S.J.,2016)并引起脂质过氧化。
在羰基化蛋白质列表中,发现了几个已知的与铁死亡有潜在联系的靶标(图10F)。例如,ACSL4已被证明影响铁死亡敏感性(Doll,S.等,2017)。KRAS的致癌突变细胞系 可被RSL3选择性诱导铁死亡(Dolma,S.等,2003)。VDAC2/3之前被鉴定为另一种有效 的铁死亡诱导化合物Erastin的直接靶标(Yagoda,N.等,2007)。值得注意的是,数据也 显示参与铁代谢的一些重要蛋白质在铁死亡期间被羰基化,包括转铁蛋白受体TFRC和 铁还原酶STEAP3(Xie,Y.等,2016;Yang,W.S.和Stockwell,B.R.,2008)。通常,Fe3+通过TFRC进入细胞内,然后位于内体内,通过STEAP3将Fe3+还原成Fe2+。因此,TFRC 和STEAP3的羰基化可能会阻碍其功能,以减缓Fe2+的超载并降低其通过Fenton反应 催化铁死亡过程的作用。这可能起到负反馈循环的作用,尽可能地防止细胞过度脂质过 氧化。
实施例6:鉴定和验证铁死亡中内源LDE修饰位点
除了鉴定铁死亡中的羰基化修饰蛋白质,更期望鉴定具有内源LDE修饰的特定位点。从技术上讲,该任务更具有挑战性,因为这种内源修饰通常是亚化学计量的,并且 不像用多个胰蛋白酶肽的蛋白质鉴定,位点特异性作图只能依赖于所加合的一个肽。
在最初尝试使用偶氮苯富集标签鉴定内源修饰位点失败后,改用另一种酸可切割叠 氮化物-生物素标签,其之前在蛋白质糖基化的化学蛋白质组分析中被证明能够更强和更有效地回收探针标记的肽(Szychowski,J.等,2010;Woo,C.M.等,2015;Qin,W.等, 2017)(图11A)。在新的实验设置中,通过与2%甲酸孵育将肽从珠上释放,并通过 LC-MS/MS分析,在所得的LC-MS/MS分析数据中利用常见LDE加合物(HNE、ACR、 ONE、HHE、OHE及MDA)的质量及多重过滤进行检索,最终鉴定出8个内源HNE修 饰的位点、11个ACR修饰的位点及5个ONE修饰的位点(图11B)。目前为止,这是首 个铁死亡中内源LDE修饰的位点的列表,其将对于显示脂质过氧化和铁死亡之间的联 系非常有价值。
在内源LDE修饰的位点列表中,VDAC2值得注意,因为它的C210被鉴定为对内 源HNE修饰的高敏感性位点,且当细胞用铁死亡诱导时蛋白质被m-APA高度富集。更 明显地,二级谱清楚地证明C210在铁死亡过程中被HNE和ONE修饰。为了从生化上 验证并从功能上表征在细胞铁死亡过程中VDAC2的C210的羰基化。我们构建稳定过 表达野生型VDAC2或其C210A突变体的HT1080细胞系。在由RSL3诱导的铁死亡中, m-APA探针只能标记野生型VDAC2而不标记C210A突变体,证实羰基化存在于该特 定位点(图11C)。接下来比较在由RSL3诱导的铁死亡过程中稳定过表达GFP、野生型 VDAC2或其C210A突变体的3个HT1080细胞系活力。发现过表达野生型VDAC2而 不是C210A突变体可以部分地保护细胞免于铁死亡(图11D),可能是在该过程中通过淬 灭LDE信号实现的。这些数据表明在VDAC2的C210上的内源LDE修饰在功能上与 在RSL3诱导的氧化胁迫后针对铁死亡敏化细胞有关。
结论
本发明提供了基于苯胺的探针m-APA在化学选择性捕获蛋白质组中蛋白质羰基化的开发和应用。使用m-APA,在天然蛋白质组中直接鉴定了>1000个由HNE修饰的位 点,并且对它们的反应性进行了定量排序。本发明进一步应用这种化学蛋白质组学策略, 对在铁死亡过程中的蛋白质羰基化进行首次全面的分析,其中鉴定出>400个内源LDE 修饰蛋白质和>20个修饰位点。还在生物化学上验证了在线粒体外膜(OMM)锚定的通 道蛋白VDAC2中的关键半胱氨酸C210是一个内源LDE修饰位点,其在敏化LDE信 号和介导细胞铁死亡中具有重要作用。本发明将有助于进一步探究铁死亡的分子机制, 为铁死亡中生物标志物的发现提供有价值的途径。鉴于m-APA探针的高标记效率和化 学选择性,且这些探针很容易从商业来源获得,成本很低,m-APA有望作为在许多其 他生理和/或病理条件下(主要参与铁死亡、氧化应激和脂质过氧化等,包括神经变性和 炎症)检测和捕获羰基化蛋白质的理想工具。
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Claims (12)
1.一种用于富集生物学样品中羰基化的蛋白质的方法,所述方法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有可检测标记物的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;和
c)通过所述苯胺探针上的可检测标记物富集羰基化的蛋白质,
其中所述苯胺探针是间-氨基苯乙炔(m-APA)。
2.一种用于鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质和/或其羰基化氨基酸残基的方法,所述方法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有可检测标记物的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;和
c)通过所述可检测标记物检测羰基化的蛋白质,或通过所述可检测标记物富集羰基化的蛋白质用于基于质谱的测定,
其中所述苯胺探针是间-氨基苯乙炔(m-APA)。
3.一种用于富集生物学样品中羰基化的蛋白质的方法,所述方法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有端炔的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;
c)在允许发生叠氮-炔环加成反应的条件下,使步骤b)的产物与可检测标记物的叠氮化物接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述可检测标记物标记;和
d)通过所述可检测标记物富集羰基化的蛋白质,
其中所述苯胺探针是间-氨基苯乙炔(m-APA)。
4.一种用于鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质和/或其羰基化氨基酸残基的方法,所述方法包括:
a)从所述生物学样品提取蛋白质;
b)在NaBH3CN存在下,使所提取的蛋白质与带有端炔的苯胺探针接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述苯胺探针标记;
c)在允许发生叠氮-炔环加成反应的条件下,使步骤b)的产物与可检测标记物的叠氮化物接触,使得羰基化的蛋白质中羰基化的氨基酸残基被所述可检测标记物标记;和
d)通过所述可检测标记物检测羰基化的蛋白质,或通过所述可检测标记物富集羰基化的蛋白质用于基于质谱的测定,
其中所述苯胺探针是间-氨基苯乙炔(m-APA)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中步骤b)在pH5至pH7下进行。
6.根据权利要求5所述的方法,其中步骤b)在pH5至pH6下进行。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中步骤b)所述苯胺探针的浓度为至少0.5mM。
8.根据权利要求2或4所述的方法,其中通过LC-MS/MS进行所述基于质谱的测定。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,所述可检测标记物是可裂解的生物素标签。
11.苯胺探针在富集、鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质中的用途,所述苯胺探针是间-氨基苯乙炔(m-APA)。
12.一种用于富集、鉴定和/或检测生物学样品中羰基化的蛋白质的试剂盒,所述试剂盒至少包括苯胺探针,所述苯胺探针是间-氨基苯乙炔(m-APA)。
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CN101846649A (zh) * | 2009-03-26 | 2010-09-29 | 清华大学 | 磷酸化和/或糖基化蛋白质或多肽的一步富集修饰测定方法 |
CN104870423A (zh) * | 2012-11-16 | 2015-08-26 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于蛋白质化学修饰的pictet-spengler连接反应 |
CN107235866A (zh) * | 2017-06-13 | 2017-10-10 | 重庆医科大学 | 一种用于检测次磺酸化蛋白质的荧光探针、制备方法及其应用 |
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2018
- 2018-03-12 CN CN201810200763.9A patent/CN110261521B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101846649A (zh) * | 2009-03-26 | 2010-09-29 | 清华大学 | 磷酸化和/或糖基化蛋白质或多肽的一步富集修饰测定方法 |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN110261521A (zh) | 2019-09-20 |
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