CN115932131A - 一种肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，包括以下步骤：向肌肉组织匀浆液中加入生物素酰肼，得到生物素化蛋白粗提液；向生物素化蛋白粗提液中加入氰基硼氢化钠，静置，然后进行超滤，得到蛋白超滤液；向蛋白超滤液中加入亲和素珠，反应后纯化，然后加入D‑生物素，反应后离心，再用碳酸氢铵溶液洗涤，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白；对完成亲和纯化的羰基化蛋白进行酶解，得到肽段样品；采用LC‑MS/MS对肽段样品进行质谱数据采集，并对采集的质谱数据进行数据库检索分析。本发明能够对羰基化蛋白进行自下而上的蛋白质组学鉴定并获得可靠的鉴定结果。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域，具体涉及一种肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法。
背景技术
在衰老、疾病或应激等条件下，肌肉线粒体中呼吸链复合体的活性下降，进而使呼吸链氧化磷酸化作用减弱并形成“电子漏”。伴随胞内抗氧化系统出现的代偿性变化，过量电子由线粒体溢出后可形成活性氧(O2 ·-、H2O2、HO·、1O2)、活性氮(NO·、N2O3、ONOO-、HNO-)和活性卤素(HOCl、HOBr、HOI)自由基，对蛋白质进行广泛而复杂的翻译后修饰(文献1.Akagawa.Free Radic Res.2021,55(4):307-320.)。蛋白质羰基化修饰是一类将醛、酮或内酰胺引入多肽链的不可逆的非酶促翻译后修饰作用，其主要包含三条途径：1)金属离子催化氧化作用：游离H2O2通过与结合在氨基酸残基上的过渡态金属离子经芬顿反应形成HO·，对该氨基酸位点进行修饰，常见的有赖氨酸氧化为α-氨基己二醛、精氨酸氧化为γ-谷氨酸半醛、脯氨酸氧化为γ-谷氨酸半醛或2-吡咯烷酮、苏氨酸氧化为2-氨基-3-丁酮酸(文献2.Stadtman and Levine.Amino Acids.2003,25(3-4):207-18.)；2)高级脂质氧化物氧化作用：脂质分子中多不饱和脂肪酸可通过与自由基发生链式反应形成脂质过氧化物，后者降解得到大量携带活性醛基的衍生物，其中乙二醛、和丙二醛等二羰基化合物能与赖氨酸形成席夫碱加合物，丙烯醛、4-羟基-2-壬烯醛和4-氧-2-壬烯醛能与赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸形成迈克尔加合物并引入羰基；3)高级糖基化物氧化作用：由还原糖的羰基与蛋白多肽链的氨基通过亲核加成反应形成可逆的席夫碱加合物，后者经Amadori重排、氧化裂变和反醛醇式破碎产生乙二醛、甲基乙二醛和3-脱氧葡萄糖酮等α-二羰基化合物，并可进一步将羰基引入赖氨酸或精氨酸。
鉴于羰基化修饰属于修饰水平较低的亚化学计量修饰类型，修饰氨基酸的相对分子质量变化通常较小并可能产生同分异构体，探索羰基衍生化标记配合高分辨率质谱分析成为该领域主流的羰基化蛋白组学策略。2,4-二硝基苯肼(DNPH)标记法最早由Levine等(文献3.Levine et al.Methods Enzymol.1990,186:464-78.)提出，其能够与羰基反应形成稳定的2,4-二硝基苯腙(DNP)，并在365～375nm处具有特征吸收光谱，可通过分光光度法对羰基进行定量检测。同时，利用商业化DNP抗体可通过氧化印迹法识别和定量羰基化蛋白。二维凝胶电泳被广泛应用于多种生物样品羰基化蛋白的鉴定，但该方法使用蛋白质着色的动态范围相对较小，不能有效检测低丰度蛋白，极易将丰度高而羰基含量低的特定蛋白质归为高羰基化蛋白，忽略丰度低而羰基含量高的特定蛋白质。一些研究者认为DNPH标记会改变蛋白质的等电点和迁移速率，导致在与未标记样本匹配时出现假阳性结果，同时氨基酸结合DNPH所引起的质量变化也极大影响了肽质量指纹谱鉴定的准确性。探针法作为电泳法的替代技术可降低样品蛋白的复杂性，提高质谱识别率。O-(生物素基咔唑甲基)羟胺(文献4.Colombo et al.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2016,1019:178-90.)和N’-氨基羟甲基羰基肼-D-生物素(文献5.Yan and Forster.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2011,879(17-18):1308-15.)等可作为醛反应性探针(ARP)与羰基反应生成比腙更稳定的醛肟衍生物，已被证明可有效富集由脂质过氧化物体外诱导形成的羰基化蛋白，进而通过亲和素亲和层析和LC-MS鉴定。但ARP对于非醛基类衍生羰基识别的灵敏度较差，无法反映生物样品中羰基化蛋白种类全貌。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，能够对羰基化蛋白进行自下而上的蛋白质组学鉴定并获得可靠的鉴定结果。
本发明提供了如下的技术方案：
一种肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，包括以下步骤：
向肌肉组织匀浆液中加入生物素酰肼，得到生物素化蛋白粗提液；
向生物素化蛋白粗提液中加入氰基硼氢化钠，静置，然后进行超滤，得到蛋白超滤液；
向蛋白超滤液中加入亲和素珠，反应后纯化，然后加入D-生物素，反应后离心，再用碳酸氢铵溶液洗涤，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白；
对完成亲和纯化的羰基化蛋白进行酶解，得到肽段样品；
采用LC-MS/MS对肽段样品进行质谱数据采集，并对采集的质谱数据进行数据库检索分析。
进一步的，所述肌肉组织匀浆液的制备方法包括：将肌肉组织称重后，按照1g：4～19mL的比例加入含0.5～1.5％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，得到肌肉组织匀浆液。
进一步的，所述生物素化蛋白粗提液的具体制备方法包括：向肌肉组织匀浆液中加入生物素酰肼至终浓度为2.5～10mM，在冰浴条件下匀浆，悬液在室温下静置2～4h，使蛋白样品生物素化，然后通过2500～4000×g离心10～15min，并以相同条件重复离心上清液2次，得到生物素化蛋白粗提液。
进一步的，所述蛋白超滤液的具体制备方法包括：向生物素化蛋白粗提液加入氰基硼氢化钠至10～20mM，于0℃下静置0.5～2h得到蛋白溶液，将蛋白溶液通过0.45μm滤网过滤后加入PBS缓冲液，在5000～10000×g条件下离心20～40min，重复10～20次完成超滤，充分除去生物素酰肼，得到蛋白超滤液。
进一步的，所述亲和纯化后的羰基化蛋白的具体制备方法包括：
向蛋白超滤液中加入亲和素珠，4℃下反应30～90min，随后转移至离心式蛋白纯化柱，以3000～5000×g离心5～10min，再用PBS以500～2000×g离心1min重复清洗3～5次，弃去离心管中液体；
向离心式蛋白纯化柱加入PBS缓冲液后，加入D-生物素至终浓度为5～10mM，4℃下反应1～2h，再以500～2000×g离心1min，重复3～5次，洗脱链有亲和素的蛋白，获取离心后的下清液；
将离心后的下清液转移到10kD Ultra-0.5超滤管中，用50～100mM碳酸氢铵溶液清洗，每次以12000～14000×g离心10～20min，重复3～5次，充分去除D-生物素，待浓缩至干燥后加入100～150μL碳酸氢铵反复吹打溶解，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白，并于-80℃保存备用。
进一步的，所述蛋白超滤液与亲和素珠的体积比为1：1～2，所述蛋白超滤液与PBS缓冲液的体积比为1：1～2。
进一步的，所述肽段样品的制备方法包括：
取完成亲和纯化的羰基化蛋白100～200μL于10kDa Ultra-0.5超滤管中浓缩干燥，加入150～300μL 8M尿素溶液(尿素溶解于0.1M Tris/HCl，pH＝8.5)，混匀后以12000～14000×g离心10～20min，弃去滤出液，再加入180～270μL 8M尿素溶液和20～30μL 1M二硫苏糖醇，混匀后在40～60℃下孵育1h，随后以12000～14000×g离心10～20min，以此打开二硫键，获取浓缩液；
向浓缩液中加入100～150μL碘乙酰胺，于4℃下避光静置反应30～60min，随后以12000～14000×g离心10～20min，进一步封闭巯基，获取浓缩液；
向浓缩液中加入100～150μL 8M尿素溶液，混匀后以12000～14000×g离心10～20min，重复3～5次，除去二硫苏糖醇和碘乙酰胺，再加入50～100mM碳酸氢铵溶液，混匀后以12000～14000×g离心30～40min，弃去下套管溶液，重复3～5次，充分置换尿素，得到羰基化蛋白；
用碳酸氢铵溶解羰基化蛋白，根据蛋白定量值，在蛋白溶液中以胰酶：蛋白＝1：25～75的质量比加入10×胰酶，然后在37℃水浴中反应12～18h，终止酶解。
进一步的，采用LC-MS/MS对肽段样品进行质谱数据采集的方法包括：将肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至分析柱进行分离，利用流动相A和流动相B建立分析梯度，以DDA模式采集数据，每个扫描循环中包含一个MS全扫描和20个MS/MS扫描。
进一步的，所述分析柱的参数为：75μm×25cm，C18，1.9μm，
所述流动相A为0.1％甲酸，所述流动相B为0.1％甲酸和80％乙腈的混合液，所述流动相A和流动相B的流速设置为300nL/min；所述MS全扫描的参数为：R＝60K，AGC＝300％，max IT＝20ms，scanrange＝350～1500m/z；所述MS/MS扫描的参数为：R＝15K，AGC＝100％，max IT＝auto，cycle time＝2s；HCD碰撞能量设置为30，四级杆的筛选窗口设置为1.6Da，离子重复采集的动态排除时间设置为35s。
进一步的，对采集的质谱数据进行数据库检索的依据是金属离子催化氧化途径(MCO)、过氧化脂质氧化途径(ALEs)和还原糖及其降解产物氧化途径(AGEs)；
所述金属离子催化氧化途径包括：Lys->Allysine(分子量偏移-1Da)、Arg->GluSA(分子量偏移-43Da)、Delta:H(1)C(-1)N(-2)O(-1)(分子量偏移-55Da)、Pro->pyro-Glu(分子量偏移+14Da)、Pro->Pyrrolidinone(分子量偏移-30Da)、Oxidation(分子量偏移+16Da)、Met->AspSA(分子量偏移-32Da)、Trp->Kynurenin(分子量偏移+4Da)、Trp->Hydroxykynurenin(分子量偏移+20Da)、Delta:O(4)(分子量偏移+64Da)、Delta:O(3)(分子量偏移+48Da)、Delta:O(2)(分子量偏移+32Da)；
所述过氧化脂质氧化途径包括：HNE(分子量偏移+156Da)、4-ONE+Delta:H(-2)O(-1)(分子量偏移+136Da)、4-ONE(分子量偏移+154Da)、Delta:H(2)C(3)O(1)(分子量偏移+54Da)、Delta:H(6)C(8)O(2)(分子量偏移+134Da)、Delta:H(6)C(6)O(1)(分子量偏移+94Da)、Delta:H(6)C(3)O(1)(分子量偏移+58Da)、Delta:H(10)C(8)O(1)(分子量偏移+122Da)；
所述还原糖及其降解产物氧化途径包括：Delta:C(2)O(1)(分子量偏移+40Da)、Delta:H(2)C(2)O(2)(分子量偏移+58Da)、Delta:H(2)C(2)O(1)(分子量偏移+42Da)、Delta:H(4)C(3)O(2)(分子量偏移+72Da)、Delta:H(4)C(5)O(1)(分子量偏移+80Da)、Delta:H(6)C(7)O(4)(分子量偏移+154Da)、3-deoxyglucosone(分子量偏移+144Da)、MG-H1(分子量偏移+54Da)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用的生物素酰肼能够与羰基反应形成席夫碱，用于标记肌肉组织蛋白，将氰基硼氢化钠加入生物素酰肼标记过的生物素化蛋白粗提液能够将腙键还原稳定，将席夫碱还原为更稳定的胺，随后进行超滤能够除去生物素酰肼，再采用亲和素珠吸附靶标蛋白，采用D-生物素离心洗脱亲和素富集的蛋白，采用碳酸氢铵洗涤以除去D-生物素，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白；结合LC-MS/MS对羰基化蛋白酶解后的肽段样品进行质谱数据采集，并对采集的质谱数据进行数据库检索分析，从而对羰基化蛋白进行自下而上的蛋白质组学鉴定，获得可靠的鉴定结果。
附图说明
图1为实施例3的处理组间羰基化位点差异图(A)和羰基化蛋白Venn图(B)；
图2为实施例3的差异羰基化蛋白GO分类图；
图3为实施例3的差异羰基化蛋白KEGG注释图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
选取144只28日龄爱拔益加肉鸡，随机分配到3个试验组，每组6重复，每重复8只鸡。其中对照组(NC)昼夜环境温度22℃，自由采食饮水；热应激组(HS)昼夜环境温度32℃，自由采食饮水；采食配对组(PF)昼夜环境温度22℃，并根据热应激组前一日采食量等量饲喂。在肉鸡第42日龄时由每重复选取2只接近平均体重的肉鸡，称重后颈静脉放血处死，采集新鲜的胸大肌组织于冻存管中，-80℃保存。
将胸肌组织称重后，按照1g：19mL的比例加入含0.5％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，加入生物素酰肼至终浓度为2.5mM，在冰浴条件下匀浆，悬液在室温下静置2h，使蛋白样品生物素化，通过2500×g离心10min，并以相同条件重复离心上清液2次，得到生物素化蛋白粗提液。
向生物素化蛋白粗提液加入氰基硼氢化钠至10mM，将混合液于0℃下静置0.5h，将蛋白溶液通过0.45μm滤网过滤后加入PBS缓冲液，在5000×g条件下离心25min，重复10次完成超滤，充分除去生物素酰肼，得到蛋白超滤液。
将100μL超滤液与100μL亲和素珠混合于1.5mL EP管，4℃下反应30min，随后转移至离心式蛋白纯化柱，以3000×g离心5min，再用PBS以500×g离心1min重复清洗3次，弃去离心管中液体。
向离心式蛋白纯化柱加入100μL PBS缓冲液后，加入D-生物素至终浓度为5mM，4℃下反应1h，再以500×g离心1min，重复3次，洗脱链有亲和素的蛋白。
将离心后的下清液转移到10kD Ultra-0.5超滤管中，用50mM碳酸氢铵溶液清洗，每次以12000×g离心10min，重复3次，充分去除D-生物素，待浓缩至干燥后加入100μL碳酸氢铵反复吹打溶解，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白，并于-80℃保存备用。
取完成亲和纯化的羰基化蛋白200μL于10kDa Ultra-0.5超滤管中浓缩干燥，加入150μL 8M尿素溶液(尿素溶解于0.1M Tris/HCl，pH＝8.5)，混匀后12000×g离心10min，弃下套管溶液，再加入180μL 8M尿素和20μL1M二硫苏糖醇，混匀后45℃下孵育1h，随后于12000×g下离心10min，以此打开二硫键，获取浓缩液。
向浓缩液中加入100μL碘乙酰胺，于4℃下避光静置反应30min，随后通过12000×g离心10min，进一步封闭巯基，获取浓缩液。
向浓缩液中通过加入100μL 8M尿素，混匀后12000×g离心10min洗涤蛋白，重复3次，除去二硫苏糖醇和碘乙酰胺，再加入50mM碳酸氢铵溶液，混匀后12000×g离心30min弃去下套管溶液，重复3次充分置换尿素，得到羰基化蛋白。
用碳酸氢铵溶解羰基化蛋白，根据蛋白定量值，在蛋白溶液中以胰酶：蛋白＝1：75的质量比加入10×胰酶，然后37℃水浴中反应12h，终止酶解，得到肽段样品。
使用Orbitrap Exploris 480质谱仪串联EASY-nLC 1200液相的液质联用系统对肽段样品进行采集质谱数据，肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至分析柱(75μm×25cm，C18，1.9μm，
)进行分离。利用两个流动相(流动相A：0.1％甲酸，流动相B：0.1％甲酸和80％乙腈)建立分析梯度。液相的流速设置为300nL/min。
质谱以DDA模式采集数据，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(R＝60K，AGC＝300％，max IT＝20ms，scan range＝350～1500m/z)，以及随后的20个MS/MS扫描(R＝15K，AGC＝100％，max IT＝auto，cycle time＝2s)。HCD碰撞能量设置为30。四级杆的筛选窗口设置为1.6Da。离子重复采集的动态排除时间设置为35s。
质谱下机数据检索依据是金属离子催化氧化途径(MCO)：Lys->Allysine(分子量偏移-1Da)、Arg->GluSA(分子量偏移-43Da)、Delta:H(1)C(-1)N(-2)O(-1)(分子量偏移-55Da)、Pro->pyro-Glu(分子量偏移+14Da)、Pro->Pyrrolidinone(分子量偏移-30Da)、Oxidation(分子量偏移+16Da)、Met->AspSA(分子量偏移-32Da)、Trp->Kynurenin(分子量偏移+4Da)、Trp->Hydroxykynurenin(分子量偏移+20Da)、Delta:O(4)(分子量偏移+64Da)、Delta:O(3)(分子量偏移+48Da)、Delta:O(2)(分子量偏移+32Da)；过氧化脂质氧化途径(ALEs)：HNE(分子量偏移+156Da)、4-ONE+Delta:H(-2)O(-1)(分子量偏移+136Da)、4-ONE(分子量偏移+154Da)、Delta:H(2)C(3)O(1)(分子量偏移+54Da)、Delta:H(6)C(8)O(2)(分子量偏移+134Da)、Delta:H(6)C(6)O(1)(分子量偏移+94Da)、Delta:H(6)C(3)O(1)(分子量偏移+58Da)、Delta:H(10)C(8)O(1)(分子量偏移+122Da)；还原糖及其降解产物氧化途径(AGEs)：Delta:C(2)O(1)(分子量偏移+40Da)、Delta:H(2)C(2)O(2)(分子量偏移+58Da)、Delta:H(2)C(2)O(1)(分子量偏移+42Da)、Delta:H(4)C(3)O(2)(分子量偏移+72Da)、Delta:H(4)C(5)O(1)(分子量偏移+80Da)、Delta:H(6)C(7)O(4)(分子量偏移+154Da)、3-deoxyglucosone(分子量偏移+144Da)、MG-H1(分子量偏移+54Da)。数据使用Maxquant1.6.17.0软件进行28次数据库检索分析。检索参数设置如下表1。
表1Maxquant搜库参数
*注：每次搜库添加一种羰基化修饰类型，最后合并分析。
实施例2
选取144只28日龄爱拔益加肉鸡，随机分配到3个试验组，每组6重复，每重复8只鸡。其中对照组(NC)昼夜环境温度22℃，自由采食饮水；热应激组(HS)昼夜环境温度32℃，自由采食饮水；采食配对组(PF)昼夜环境温度22℃，并根据热应激组前一日采食量等量饲喂。在肉鸡第42日龄时由每重复选取2只接近平均体重的肉鸡，称重后颈静脉放血处死，采集新鲜的胸大肌组织于冻存管中，-80℃保存。
将胸肌组织称重后，按照1g：4mL的比例加入含1.5％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，加入生物素酰肼至终浓度为10mM，在冰浴条件下匀浆，悬液在室温下静置4h，使蛋白样品生物素化，通过4000×g离心15min，并以相同条件重复离心上清液2次，得到生物素化蛋白粗提液。
向生物素化蛋白粗提液加入氰基硼氢化钠至20mM，将混合液于0℃下静置2h，将蛋白溶液通过0.45μm滤网过滤后加入PBS缓冲液，在10000×g条件下离心40min，重复20次完成超滤，充分除去生物素酰肼，得到蛋白超滤液。
将100μL超滤液与200μL亲和素珠混合于1.5mL EP管，4℃下反应90min，随后转移至离心式蛋白纯化柱，以5000×g离心10min，再用PBS以2000×g离心1min重复清洗5次，弃去离心管中液体。
向离心式蛋白纯化柱加入200μL PBS缓冲液后，加入D-生物素至终浓度为10mM，4℃下反应2h，再以2000×g离心1min，重复5次，洗脱链有亲和素的蛋白。
将离心后的下清液转移到10kD Ultra-0.5超滤管中，用100mM碳酸氢铵溶液清洗，每次以14000×g离心15min，重复5次充分去除D-生物素，且待超滤至干燥后加入150μL碳酸氢铵反复吹打溶解，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白，并于-80℃保存备用。
取完成亲和纯化的羰基化蛋白100μL于10kDa Ultra-0.5超滤管中浓缩干燥，加入300μL 8M尿素(溶解于0.1M Tris/HCl，pH＝8.5)，混匀后14000×g离心20min，弃下套管溶液，再加入270μL 8M尿素和30μL 1M二硫苏糖醇，混匀后60℃下孵育1h，随后于14000×g下离心20min，以此打开二硫键，获取浓缩液。
向浓缩液中加入150μL碘乙酰胺，于4℃下避光静置反应60min，随后通过14000×g离心20min，进一步封闭巯基，获取浓缩液。
向浓缩液中通过加入150μL 8M尿素，混匀后14000×g离心20min洗涤蛋白，重复5次，除去二硫苏糖醇和碘乙酰胺，再加入100mM碳酸氢铵溶液，混匀后14000×g离心40min弃去下套管溶液，重复5次充分置换尿素，得到羰基化蛋白。
用碳酸氢铵溶解羰基化蛋白，根据蛋白定量值，在蛋白溶液中以胰酶：蛋白＝1：25的质量比加入10×胰酶，然后37℃水浴中反应18h，终止酶解，得到肽段样品。
采用LC-MS/MS对肽段样品进行质谱数据采集，并对采集的质谱数据进行数据库检索分析，具体方法与实施例1中相同。
实施例3
选取144只28日龄爱拔益加肉鸡，随机分配到3个试验组，每组6重复，每重复8只鸡。其中对照组(NC)昼夜环境温度22℃，自由采食饮水；热应激组(HS)昼夜环境温度32℃，自由采食饮水；采食配对组(PF)昼夜环境温度22℃，并根据热应激组前一日采食量等量饲喂。在肉鸡第42日龄时由每重复选取2只接近平均体重的肉鸡，称重后颈静脉放血处死，采集新鲜的胸大肌组织于冻存管中，-80℃保存。
将胸肌组织称重后，按照1g：9mL的比例加入含1％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，加入生物素酰肼至终浓度为5mM，在冰浴条件下匀浆，悬液在室温下静置3h，使蛋白样品生物素化，通过3500×g离心10min，并以相同条件重复离心上清液2次，得到生物素化蛋白粗提液。
向生物素化蛋白粗提液加入氰基硼氢化钠至15mM，将混合液于0℃下静置1h，将蛋白溶液通过0.45μm滤网过滤后加入PBS缓冲液，在7500×g条件下离心30min，重复15次完成超滤，充分除去生物素酰肼，得到蛋白超滤液。
将100μL超滤液与150μL亲和素珠混合于1.5mL EP管，4℃下反应60min，随后转移至离心式蛋白纯化柱，以4000×g离心5min，再用PBS以1000×g离心1min重复清洗3次，弃去离心管中液体。
向离心式蛋白纯化柱加入150μL PBS缓冲液后，加入D-生物素至终浓度为6mM，4℃下反应1.5h，再以1000×g离心1min，重复3次，洗脱链有亲和素的蛋白。
将离心后的下清液转移到10kD Ultra-0.5超滤管中，用75mM碳酸氢铵溶液清洗，每次以14000×g离心15min，重复3次，充分去除D-生物素，待超滤至干燥后加入100μL碳酸氢铵反复吹打溶解，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白，并于-80℃保存备用。
取完成亲和纯化的羰基化蛋白150μL于10kDa Ultra-0.5超滤管中浓缩干燥，加入200μL 8M尿素(溶解于0.1M Tris/HCl，pH＝8.5)，混匀后14000×g离心15min，弃下套管溶液，再加入225μL 8M尿素和25μL 1M二硫苏糖醇，混匀后50℃下孵育1h，随后于14000×g下离心15min，以此打开二硫键，获取浓缩液。
向浓缩液中加入100μL碘乙酰胺，于4℃下避光静置反应45min，随后通过14000×g离心15min，进一步封闭巯基，获取浓缩液。
向浓缩液中通过加入100μL 8M尿素，混匀后14000×g离心15min洗涤蛋白，重复3次，除去二硫苏糖醇和碘乙酰胺，再加入75mM碳酸氢铵溶液，混匀后14000×g离心30min弃去下套管溶液，重复3次充分置换尿素，得到羰基化蛋白。
用碳酸氢铵溶解羰基化蛋白，根据蛋白定量值，在蛋白溶液中以胰酶：蛋白＝1：50的质量比加入10×胰酶，然后37℃水浴中反应16h，终止酶解，得到肽段样品。
采用LC-MS/MS对肽段样品进行质谱数据采集，并对采集的质谱数据进行数据库检索分析，具体方法与实施例1中相同。
如图1所示，本修饰蛋白组学共鉴定到921个羰基化氨基酸位点及对应的419个羰基化蛋白。相较于NC，热应激处理导致101个氨基酸位点的羰基化水平上调，109个位点下调；相较于NC，采食配对处理导致77个氨基酸位点的羰基化水平上调，83个位点下调；相较于PF，热应激组中有58个位点的羰基化水平上调，另有69个位点下调。此外，NC、HS和PF组共享有257个羰基化修饰蛋白，HS与NC间共有而PF没有的修饰蛋白数为21个，PF与NC共有而HS没有的修饰蛋白有29个，HS与PF共有而NC没有的修饰蛋白有18个，NC、HS和PF特有的修饰蛋白数量则依次为42、27和20个。
如图2所示，由羰基化蛋白GO分类可知，羰基化蛋白主要参与的生物学过程有细胞过程(GO:0009987)、生物调节(GO:0065007)、代谢过程(GO:0008152)、发育过程(GO:0032502)、应激反应(GO:0050896)、定位(GO:0051179)和多细胞生物过程(GO:0032501)等，涉及到细胞组分包括细胞解剖实体(GO:0110165)和蛋白复合物(GO:0032991)，有关分子功能主要包括结合(GO:0005488)、催化活性(GO:0003824)、分子功能调节器(GO:0098772)、结构分子活性(GO:0005198)、转运体活性(GO:0005215)、转录调节活性(GO:0140110)、ATP依赖性活性(GO:0140657)、分子传感器活性(GO:0060089)和细胞骨架运动活性(GO:0003774)等。
如图3所示，由羰基化蛋白KEGG注释可知，羰基化蛋白在代谢方面主要涉及碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢；遗传信息处理主要包括复制与修复、折叠、分类和降解、翻译和转录；环境信息处理相关通路主要包括信号传导和信号分子相互作用；细胞过程主要有细胞生长与死亡、运动与分解代谢、细胞群落和细胞运动性；生物体系统主要包括免疫系统、内分泌系统、消化系统和循环系统等。
综上，本发明采用生物素酰肼标记肌肉组织蛋白，将氰基硼氢化钠加入生物素酰肼标记过的生物素化蛋白粗提液将腙键还原稳定，通过超滤除去生物素酰肼，再采用亲和素珠吸附靶标蛋白，采用D-生物素离心洗脱亲和素富集的蛋白，采用碳酸氢铵洗涤以除去D-生物素，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白；结合LC-MS/MS对羰基化蛋白酶解后的肽段样品进行质谱数据采集，并对采集的质谱数据进行数据库检索分析，从而对羰基化蛋白进行自下而上的蛋白质组学鉴定，获得可靠的鉴定结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
向肌肉组织匀浆液中加入生物素酰肼，得到生物素化蛋白粗提液；
向生物素化蛋白粗提液中加入氰基硼氢化钠，静置，然后进行超滤，得到蛋白超滤液；
向蛋白超滤液中加入亲和素珠，反应后纯化，然后加入D-生物素，反应后离心，再用碳酸氢铵溶液洗涤，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白；
对完成亲和纯化的羰基化蛋白进行酶解，得到肽段样品；
采用LC-MS/MS对肽段样品进行质谱数据采集，并对采集的质谱数据进行数据库检索分析。
2.根据权利要求1所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，所述肌肉组织匀浆液的制备方法包括：将肌肉组织称重后，按照1g：4～19mL的比例加入含0.5～1.5％蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，得到肌肉组织匀浆液。
3.根据权利要求1所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，所述生物素化蛋白粗提液的具体制备方法包括：向肌肉组织匀浆液中加入生物素酰肼至终浓度为2.5～10mM，在冰浴条件下匀浆，悬液在室温下静置2～4h，然后通过2500～4000×g离心10～15min，并以相同条件重复离心上清液2次，得到生物素化蛋白粗提液。
4.根据权利要求1所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，所述蛋白超滤液的具体制备方法包括：向生物素化蛋白粗提液加入氰基硼氢化钠至10～20mM，于0℃下静置0.5～2h得到蛋白溶液，将蛋白溶液通过0.45μm滤网过滤后加入PBS缓冲液，在5000～10000×g条件下离心20～40min，重复10～20次完成超滤，得到蛋白超滤液。
5.根据权利要求1所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，所述亲和纯化后的羰基化蛋白的具体制备方法包括：
向蛋白超滤液中加入亲和素珠，4℃下反应30～90min，随后转移至离心式蛋白纯化柱，以3000～5000×g离心5～10min，再用PBS以500～2000×g离心1min重复清洗3～5次，弃去离心管中液体；
向离心式蛋白纯化柱加入PBS缓冲液后，加入D-生物素至终浓度为5～10mM，4℃下反应1～2h，再以500～2000×g离心1min，重复3～5次，获取离心后的下清液；
将离心后的下清液转移到10kD Ultra-0.5超滤管中，用50～100mM碳酸氢铵溶液清洗，每次以12000～14000×g离心10～20min，重复3～5次，待浓缩至干燥后加入100～150μL碳酸氢铵反复吹打溶解，得到完成亲和纯化的羰基化蛋白，并于-80℃保存备用。
6.根据权利要求5所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，所述蛋白超滤液与亲和素珠的体积比为1：1～2，所述蛋白超滤液与PBS缓冲液的体积比为1：1～2。
7.根据权利要求1所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，所述肽段样品的制备方法包括：
取完成亲和纯化的羰基化蛋白100～200μL于10kDa Ultra-0.5超滤管中浓缩干燥，加入150～300μL 8M尿素溶液，混匀后以12000～14000×g离心10～20min，弃去滤出液，再加入180～270μL 8M尿素溶液和20～30μL 1M二硫苏糖醇，混匀后在40～60℃下孵育1h，随后以12000～14000×g离心10～20min，获取浓缩液；
向浓缩液中加入100～150μL碘乙酰胺，于4℃下避光静置反应30～60min，随后以12000～14000×g离心10～20min，获取浓缩液；
向浓缩液中加入100～150μL 8M尿素溶液，混匀后以12000～14000×g离心10～20min，重复3～5次，再加入50～100mM碳酸氢铵溶液，混匀后以12000～14000×g离心30～40min，弃去下套管溶液，重复3～5次，得到羰基化蛋白；
用碳酸氢铵溶解羰基化蛋白，根据蛋白定量值，在蛋白溶液中以胰酶：蛋白＝1：25～75的质量比加入10×胰酶，然后在37℃水浴中反应12～18h，终止酶解。
8.根据权利要求1所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对肽段样品进行质谱数据采集的方法包括：将肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至分析柱进行分离，利用流动相A和流动相B建立分析梯度，以DDA模式采集数据，每个扫描循环中包含一个MS全扫描和20个MS/MS扫描。
9.根据权利要求8所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，所述分析柱的参数为：75μm×25cm，C18，1.9μm，
所述流动相A为0.1％甲酸，所述流动相B为0.1％甲酸和80％乙腈的混合液，所述流动相A和流动相B的流速设置为300nL/min。
10.根据权利要求1所述的肌肉组织中羰基化蛋白质的富集和鉴定方法，其特征在于，对采集的质谱数据进行数据库检索的依据是金属离子催化氧化途径、过氧化脂质氧化途径和还原糖及其降解产物氧化途径；
所述金属离子催化氧化途径包括：Lys->Allysine、Arg->GluSA、Delta:H(1)C(-1)N(-2)O(-1)、Pro->pyro-Glu、Pro->Pyrrolidinone、Oxidation、Met->AspSA、Trp->Kynurenin、Trp->Hydroxykynurenin、Delta:O(4)、Delta:O(3)、Delta:O(2)；
所述过氧化脂质氧化途径包括：HNE、4-ONE+Delta:H(-2)O(-1)、4-ONE、Delta:H(2)C(3)O(1)、Delta:H(6)C(8)O(2)、Delta:H(6)C(6)O(1)、Delta:H(6)C(3)O(1)、Delta:H(10)C(8)O(1)；
所述还原糖及其降解产物氧化途径包括：Delta:C(2)O(1)、Delta:H(2)C(2)O(2)、Delta:H(2)C(2)O(1)、Delta:H(4)C(3)O(2)、Delta:H(4)C(5)O(1)、Delta:H(6)C(7)O(4)、3-deoxyglucosone、MG-H1。
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