JPS61200925A - 長期作用型免疫毒素および製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、多糖単位が修飾された糖タン／ダク質（又は
グリコペプチド）から誘導され、かっタンノ４り質の合
成を阻害する？リペプテド型の成分に共有結合した少く
とも一種の抗体を含有する菓効のある新しい分子（関す
る。

米国特許第４，３４０，５３５号並びにフランス国特許
第８１１０７５９６号及び同第８１／２１８３６号は、
包合体と呼ばれる抗ガン生成物の＃ｉ法を開示している
。この生成物は、破壊される細胞についている抗原を標
的とする抗体又は抗体断片と、リシンの入ａｔ共有結合
によりてカップリングすることＫよＣｉられる。この種
の生成物は今まで免疫毒素という包括的な名称によって
称されてき九が、本発明におｉても同様である。ところ
でリシンの＾＠を含有する既に公知の免疫毒素に虜似す
る包合体は知られている。こ九は抗ガン剤として適して
りるが、轡ニグロニウムフルナイフａルム（欧州生化学
ジャーナル−１９８１年、＠１１６号、４４７−４５４
ＦＪ及び”ガン研究’　１９８４年、第４４号、１２９
−１３３頁）から抽出されたグσニン、又はモモルジカ
カランテイス（ＭＯＭ、米国特許第４，３６８，１４９
号）から抽出された阻害剤のよ５なりポソームを不活性
化する他のグリコペプチドと、抗体又は抗体断片を共有
結合（よつてカップリングさせることにより慢らｎる。

上述のリボソーム（ＧＰＩＲという略号を使う。）を不
活性にし、またリシンの＾鎖と同じような性實を有する
糖タンパク′Ｘはｚｏ、ｏｏｏ〜３０．０００の分子ｆ
を有する（“ガン・サーベイ”　１９８２年、第１巻、
４８９−５２０頁）０本明細書で用いる“リボソームを
不活性化する糖タンーダクｊｔ＃は、リボソームを不活
性化し、その結果真核細胞におけるタンパク貿の合成を
阻害する巨大な分子量の糖類単位を有する物質を指す。

その他にも同じ不活性化特性を育するならば、その物質
の何らかの断片でもよい。リーソームを不活性化する前
記糖タンノ９り質は天然のものであるか、又は遺伝子型
がこの目的のために修飾された細胞から生合成によって
誘導して得られる。

これら免疫毒性はアンモニウム塩、種々のアミンのよう
なアジエバント＠買又はモネンシン若しくはナイジェリ
シンのようなある種のカルダキシルイオノフオアーなど
様々な物質によって強化さルる〇 しかしながら免疫毒素の治療効果は、活性化されている
ものであつてもそうでなくても、その免疫毒素がその抗
体部分を通して活性な形態で、破壊される標的細胞上に
生体内局在化することができるという条件（いかなる免
疫毒素活性の発現においても必須の条件）でのみ十分発
揮される。標的細胞上に局在化される免疫毒素の効力は
、まず第一に血流及び細胞外液にある免疫１１＃ｅが活
性な形態で一定の時閣内に標的細胞に十分な濃度で到達
し、目的とする抗原を高い割合で捕捉する能力に依存す
る。

多くの研究によつて免疫毒素が嘩ぐな動物の静脈内に注
射された場合の血漿からの消失キネティックスが確立さ
れた。その結果注射後くけ産物学的（活性な免疫毒素の
血漿中の１１闇は急速に低下することがわがつた〇 ヒトのＴＩＪン／４球の抗原Ｔ６５を標的とするモノク
ロナル抗体とりシンの＾鎖をジスルフィド結合を含む連
鎖でカップリングさせて得られる免疫毒素についてウサ
ギを使ったモデルで調べ九ところ、注射直後に血流中に
存在する免疫毒素は、３０分後にはその９７％が、１７
時間後にはその９９．９％が消失した。この免疫ＩＩ索
の急速な消失によってその細胞障害力は減じられる。と
いうのは、免疫ｍ素と破壊される細胞についｆｃ標的細
胞との恒久的な結合が妨げられるからである。さらに免
疫毒素の血漿からの消失キネティックスを対応する非包
合抗体と比較してみたところ、この抗体ｆｌ！漿中に相
対的に長い時間高いａ度で留まることがわかった０冥際
どんなに高度に免疫８″Ｒを絹製しても、常に一定看の
非包合体は残留する。免疫１１素と非包合抗木の消失速
度の違いから、鰻切はごく少な４割合でしかない非包合
抗体は、徐々にその割合が増え、数時間後には半数を超
える割合になる。そのため抗体は徐々に、免疫ｍ素が°
標的に結合する際の強力なアンタボ−ストになる。

従つて血漿中の免慶ＩＩ素を高い割合で存続させること
は標的である抗原が結合さｎる割合と持続時間を増加さ
せ、その結果免疫褌素の治療効果を増進することｆ：；
を味する。

リシンのＡ鎖を含有する免疫毒素の生体同局在化につい
て、免疫＄１素を放射ｖａ職し、特定の標的をもたない
動物に注射して実験したところ、包合体な注射後数分で
肝臓に時異的に局在化した。同じ実験をカップリングし
ない形態のりシンのＡｆｉについて行ったところ、同様
な結果が得らｎた。これは免疫毒素に包まれる細胞毒性
サブユニットが肝臓と結合することを強（示唆する。

リシンの入偵は七のポリオサン基が、マンノ−ｘｉｉと
Ｎ−アセチルグルフサミン残基からなる糖タン・−り質
である。そしてそのうちのいくつかの７ンノース基は、
末端に位置する（°＾芸生物化学”１９７８年、第４２
巻、５０１頁）。

またこれら末端に位置するマンノース残基金倉む糖タン
・ｆり＊をａ別する受容体は肝臓的にあることが発見さ
れた。これらの受容体（クツパー細胞中に存する。）は
これらを代謝する細胞と結合することによつて血液中か
ら消失する。

これＫｃＡしてはβ−グルクロニダーゼとりボヌクレア
ーゼＢの場＆について詳しい報告がある（°生物化学と
生物物厖”１９７８年、１８８号、４１８頁、°酵素学
の進歩”マイスター編、ニエーヨーク、１９７４年およ
び１小児科学研ｙ？、”１９７７年、Ｍ１１巻、８１６
頁）。

これらを総合すると、リシンの＾鎖を含有する免疫毒素
の急速な消失は、リシンの＾鎖のマンノース残基が肝細
胞特にクツ／＃−細胞によって認知されるためと説明で
きる０ 動物の静脈内に注射した後の他のＧＰ　Ｉ　Ｒ、例えば
ゲロニン又ｉｊ　ＭＯＭ　、についての血漿からの消失
キネティックスの研兜が進められた結果、リシンの＾鎖
についてはＧＰＩＲの血漿中濃度は注射後急速に大部分
消失することがわかった。

り゛サギについて公知（゛生化学ジャーナル”ｌ９８０
年、２５５号、６９４７−６９５３頁）の方法によって
精製し九ゲａニンを注射したところ、注射直後に血流中
に存在したグａニンは、その１４間後には９３％、２４
時間後には９９、９９％が／ｇ失した。

糖タン・１夕に含存されるものを含む炭水化物揖造の、
過ヨード酸イオンによる酸化に、２つの隣接する炭素原
子は第１又は第２ヒドロキシル基を有する場合にな、Ｒ
＃：鍼の分割を生せしめる。

２つの隣接するヒドロ中シル基が′に２ヒドロキシル基
の＃に曾には、ＧＰＩＲに存在する場合のように、酸化
は、その間に分割が生ずる炭ｇｍ子に２つのアルデヒド
基金虫取する。

本明細書にＳいて、「過ヨード酸塩」なる語はＩＯ，−
イオンを示し、この＃は［メタベリオデート」の名で文
献にも見出される。

リボソームを不活性化する糖タンΔりの炭水化物ユニッ
トが過ヨード酸イオンによる酸化によつ天変性されるな
らば、生物活性を保持する特性と生体内で血流から極め
てゆっく〕除去されろ籍性の２つの時性を有する、す〆
ソームを不活性化する看しい循タンパクが辱られること
がわかつ７をｎ ま次、こ１らの新しいａ延作用金有し、リーソームを不
活性化する循タンパクが抗体と結合すると、生じた結・
オ体は抗毒素の公知の生物時性を保付し、遅い血漿除去
運動機能を示すこともわかり九。

従って、本発明は、その自然な形で用いられ又は変性さ
れた抗体又は抗体フラグメントと、遅延作用を有しリボ
ソームを不活性化する糖タンパクとの共１′結廿によっ
て得られた、抗葛４のクラスに属する生成物に関・する
。

明鋪を期するため、社々のタンパク又はそれらのＭ５を
示−Ｊ″記号および種々の記号を示す表現の意味につい
て以下に説明する。

記号Ｐは、任意の抗体又は抗体フラグメント、任意の免
疫グミプリン又は免疫グロブリンフラグメント、又はそ
れらの官能基の変性によシ上紀のものから誘導された分
子からなる群から選択されたタンパクを意味し、このよ
うにして選択されたタン／ダグが、その抗原を有する細
胞特に標的細胞の表面において、与えらｎた抗原を選択
的Ｋｕｉ繊し得る限）において、上記タンノ４りを有す
る炭水化物構造を含む。出発タンパクは、天然のもので
も、そのゼノタイプがこの目的のために変性された測置
から誘導さｎた生物合成されたものでもよい。

記号ＧＰＩＲ−１ａは、遅延作用を育し、リボソームを
不活性化するタンノダクを表わすが、このタンパクは、
そのチオール基が任意に保ａされている、リボソームを
不活性化する糖タン／＃りを、過ヨード酸アルカリ金属
の水溶液（より、光がない状態で０〜１５℃で０．２〜
２４時間処理することにより、また必要ならばそのチオ
ール基の保護を除去することによって得られたものであ
る□また、そのタン／ダグは、本しこのよりにして選ば
れたタンパクが、細胞研究モデルで示し得るように、ユ
ーカリ細胞におけるリボソームタンパクの合成′ｆｒ：
阻止し得る特性を保持するならば、このタン／＃りが有
する官能基の変性により上記糖タンパクから誘導された
分子を含む。抗毒素において蝶、１部のＧＰＩＲ−１１
は細胞毒素性チプユニットとしても示さルている。

記号＾−１１は、遅延作用を有し、すメソー五を不活性
化する糖タンパクを示すが、この物タンノ々りは、その
システィンＺ７Ｚおｚヒｚｓｙのチオール基の少なくと
も１つが任意に保映されているりシンのＡＭ？過ヨード
酸アルカリ金属の水溶液によシ光の不存在下で０〜１５
℃で０．２〜２４時間処理することによシ、また必要に
応じて上記チオール基の説保幽によシ得らｎるｉ 記号Ｐ′は、上記タンパクＰ又はそれを化学的に変性し
た４のから誘導されたラジカルを表わし、そこからそれ
自体の基の１つ又はそれ以上が除去され、また他の官能
基が任意に保護されているものである。

記号ＧＰＩＲ−１ａ’は上記タン−譬りＧＰＩＲ−１１
又はそれを化学的に変性したものから誘導されたものを
表わし、そこからそれ自体の基の１つ以上が除去され、
他の官能基が任意に保護されているものである。

記号＾−１ａ　／は、そのシスティン１１１および２５
７のチオール基の少なくとも１つが除去さｎた、タンノ
ダクＡ−１ａから誘導され次ラジカルを表わす。

記号Ｐ、は、上記タンパクりＧＰＩＲ−１ａおよびＰｏ
ｌつを表わし、それは上記タンパクにｊ［接又はスペー
ス構造を介して結合さｎた遊離チオール基を有する。

記号ｐ、は、タン／４りＧＰＸＲ−１ａおよびＰのうち
の一方であるがＰｌとは異なるものであ〕、遊離チオー
ルと反応し得る１種以上の官能基を有するものである。

記号Ｐ、′はタン・ダクＰＩＫＲする基に結合したタン
パクりＰｌのラジカルを表わし、％Ｋ、（システィンの
）８Ｈ基、（タン／ダグの末端位置又はリシンのイプシ
ａン位置にある）Ｎ）ｉ、基、（チロシンの）ＯＨ基、
又は（アルパルｔ：／＃又はグルタミン酸の）ＣＯＯＨ
基であシ、又はＰ、が抗体又は抗体フラグメントである
場合にのみ、公知の方法により過ヨード酸との反応によ
り炭水化物構造の開始部から発生するタンパクＰ、のラ
ジカルである。

記号２２′は、特徴的官能基（タン）４りの末端位置に
あるか又はリシンのイプンロン位置にある）ＮＨｔ、Ｃ
ｔロジンの）ＯＨ又は（アスパラテン酸およびグルタミ
ン＠）のＣｏ０ＨＫ結合されたタンパクりＰｌのラジカ
ルを表わす０例えば、Ｐ、、−８８は（抗体又は抗体フ
ラグメントＰ又はタンパクＧＰＩＲ−１ａであり得る）
タンパクＰ１を表わすが、このタンパクＰ、は、システ
ィンの５を１１４が遊離しておシ、他の官能基は任意に
保護されているものである。

同様に、Ｐ、、−〇〇−は、その末端力ルメキシル基又
はそのグルタミン酸およびアスノ４うｔン酸のカルボキ
シル基が、ＳＨ基を導入する基と結合されているタンパ
クＰｌをｆｆ？）ス。

Ｐ、、−ＮＨ−は（抗体又は抗体フラグメントＰ又はタ
ンパクａｐｘＲ−１ａでらｐ辱る）タンパクＰ、を表わ
すが、とのタンパクＰｔは、その末端アミ７基又はその
りシンのアミ７基がタンパクＰ、のチオールと連結し優
る基に結合している本のである。

「不活性スペーシング構造」なる峰は、このプロセスに
用いる反応体に対し不活性な２価の有機ラジカルを示し
、例えば１〜１５の炭素原子を有する［０又は側鎖アル
キレン基であり、１つ以上の二重結合を含んでもよく、
また酸素原子によつて中断されていてもよく、あるいは
またメトキシ基、遊離の又はエステル化されたカルボキ
シル基、ジアルキルアミン基又はカルバメート基のよう
な１種以上の不活性官能基によつて置換されているもの
であってもよい。同シＪｅはまた。上でアルキレンＴｓ
Ｖｃついて示り、　タように、ｌ橿以との不活性官能基
−よつて置換され得る６〜１５の炭素原子を有するアリ
レン基をも示す。

ここでＹおよびＹ′に関して用いられている「共有結合
し得る官能基」という表現は、共有結合を形成するため
にタンノダクＰ１およびＰｔに属する基と反応し得るい
かなる基をも意味する。−〇〇−基および−（Ｃ，Ｎ）
Ｉ）−基は、タンパクの遊離アミン、チオールおよびフ
ェノール性水酸基と結合し得る適当な官能基である。同
様に、−Ｎ）１−基もタンパクの遊離カルがキシル基と
ａ盆し得る適当なＮ能基である。−Ｎ−基は過ヨウ素酸
イオンによる酸化のあとにタンパクＰ、およびＰ！ＯＳ
＠の２つの炭素原子と結合し得る適当な官能基である。

ただしそれは、Ｐ宜およびＰｌが抗体または抗体断片で
ある場合に限る・ ここで２及び２′として示されている「蛋白質に属する
基」なる表現は、蛋８質Ｐ１及びＰｌを形成するアミノ
酸の特有な基から作られたラジカルを示す。例示すれば
、チロシンやセリンアミノ酸の水＃ｌｔ基から生ずる＊
ｇ原子、アスパラギン酸やグルタミン酸の末端カルがキ
シルや遊離カルゲキシルから生じたカルボキシル基、蛋
白質の末端アミンから生じた一ＮＨ−５（例えばリジン
）するいはシスティンのチオールかう生じた硫黄原子が
ある。同様（、この表現は、過ヨウ素酸イオンの処理に
よシ、蛋白ｊ［Ｐ　ｒ及びＰｌの訣水化物構造の一つ１
：ａ化し之後得られるジアルデヒド機造から生じた基を
示す。しかしこの場せ、Ｐ、及びＰ、は抗体又は抗体断
片である。

ここでＸで示される「活性ラジカル」なる用ｔｆ！は−
８−８−ブリクジに結合さｎた基を示し、これは遊離チ
オールと反応してＸ−８Ｈを解放した二硫化物を形成す
る。適切な活性ラジカルはピリジン−２−イル及びピリ
ジン−４−イル基で、これらは置換さｎていないもの、
あるいは１又は２以のへａグン又はアルキル基、カルボ
キシル基、アルフキジカルボニル幕によってｒｉｔ換さ
れたものである。フェニル基は置換されていないもの又
は好ましくはｌ又は２以上のへログン基又はニトロ基、
アルコキシル基、カルボキシル基又はアルコキシルカル
がニル基によって置換されたものである。

「アル中ル」及び「アルコキシ」といつ用語は、５炭素
原子以下を含む越を示す。

「アルキレン」なる用ｉｌｆは、炭素原子１０以下を含
むｌ［ｊｆｆｌ又は分枝した飽和脂肪族基を示す。

こｎらは１又は２以上の不活性官能基（例えばアルコキ
シルカル基）によって置換されたものでもよい。

とくにこの発明は、イムノトキシンのクラスに属する生
産物に関する。そしてこ１らは、一方では抗体父な抗体
断片に共有結合して得らｎｌその自然の形又は適切に修
正されて（シンがルＰ）使用され、こｎは所定のターゲ
ットセルによつて運ばｎた抗原を選択的に認識する能力
を待うている。他方、これらは長期活性のグリコプロテ
ィンを有しており、これはり〆ソームを不活性化するも
ので、リケソームを不活性化スるダリコブａティンの処
理（よって得られる。

そのチオール基は、過ヨウ素酸のアルカリ金属化物の水
溶液で選択的に保護される。その期間は、０．２〜２４
時間、温度０〜１５℃、光のない状態である。そしてチ
オール基をブロッキングしないことＫより、（シンボル
ｏｐｒＲ−ｊａ）を用いた場合、２つの蛋白質の結分は
２硫化物の結合又はチオエーテル結合のいずｎかを介し
て有効となる。

抗体Ｐを長期活性グリコプロティン（これはりｌソーム
、ＧＰＩＲ−１を不活性とする）と結合させて形成され
たイムノトキシンは、次の統計的な式で示される。

Ｐ’−Ｗ　−ＧＰＩＲ−１ａ’ ここでＰ′は蛋白質の基を示し、この蛋白質は抗体又は
抗体断片Ｐであり、あるいはこれらを適宜化学的に修正
し次ものである。また他の官能基は必要によりブロック
されておシ、ＧＰＩＲ−１１／はＧＰＩＲ−１ａやこｎ
を適宜化学的に６正した蛋白質のラジカルを示す。他の
官能基は必要によジブロックされ、Ｗはチオエチル基又
は二硫化ｉｔ含む２価の共有Ｓ４ｉで、これらの基では
硫黄原子はＰ及びＧＰＩＲ−Ｊ、のシスティンのそれで
あり、あるいはＰ及び／又はＧＰＩＲ−１ａ　Ｋ　１４
する上記基ＫＭ曾して官能基を待九せた窄関（＄ρｍｃ
ｉｎｇ　）構造によりて、Ｐ及び／又はＧＰＩＲ−Ｊｊ
Ｋ属する基に結合している。

２つの蛋白Ｘ間のチオエーテル納会は、以下のタイプの
結合として理解される。

ここでＺ、Ｙ及びＢは以下に定義さルる。

この発明は、好ましくは下記の統計的な式で示すイムノ
トキシンに関する。

Ｐ’−Ｗ’　−ＧＰ　Ｉ　Ｒ−１１’ ここで　Ｐ／及び０ＰＸＲ−１，’は、先に定義し九通
シである。Ｗ′は以下（１）〜（ｄｉから選ばれた共有
構造である。

（ｃ）　　−Ｚ−Ｙ−ｇ−８−８−（Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’
）　、　−（ｄ）　　−（Ｚ’−Ｙ’−Ｗ’）　ｎ−８
−８−Ｅ−Ｙ−Ｚ、−これらの式で、２及び２′は、蛋
白質ＧＰＩＲ−１１及びＰＫＭする基を示し　ＩＦ−０
７ン残滓（ｒｅｓｉｄｕｅ＠）の一つのヒドロキシルか
ら生じる酸素原子、　ＧＰＩＲ艷ｉ及びＰのアスパラギ
ン酸及び／又はグルタミン酸の末端カルボキシル又は遊
離カルボキシルの１つから生じるカルがキシル基、ＧＰ
ＩＲ−１，及びＰの末端アミンの１つ又はリジン残滓の
１つのニブシロン位置のアミンの１つから生じる一Ｎｌ
（−基から選ばｒＬるものであり、更に上記共有構造（
ｂ）及び（Ｃ１中の２についてのみ、公知の方法でＰの
炭水化物構造の一つを過ヨウ素酸で酸化させた後得らｎ
るジアルデヒド構造から生じる基である。

Ｙ及びＹ′は、蛋白’Ｍ　ＧＰ　ＩＲ−ｔ　ａ及ヒＰ（
７１）Ｚ及び２′基の任意の一つと共有結合可能な官能
基を示す。

Ｂ及びＥ′は不后性交闇構造と示し、ｎは０又は１であ
る。

イムノトキシンは上述の式１及びｎによって藺単に表現
できる。しかし、２価共有ｍａ−ｗ−又は−Ｗ′は少な
くとも１分子のＰ及び少なくとも１分子のＧＰＩＲ−１
ａに結合さｎる。蛋白質Ｐ及びＧＰＩＲ−Ｊａとの結合
数は、結合操作中に含まれる上記蛋白質にある基の数に
よる。

例えば、リシン自体のサブユニフ）Ａを抗体Ｐ（例えば
抗体Ｔｌ０Ｉ　）に結合してイムノトキシン全形底する
際、２硫化基を持つ２価の共有構！１！ヲ経て行なう場
合（ここで２硫化基の一方の硫黄はりシンの長期活性＾
釧のシスティン２５７に属し、他方の硫黄はオキシプロ
ピル基によって抗体Ｐのチロシンのフェノール酸素と結
合している。）、下記統計的な式を有する。

Ｐ’（０−ＣＯ−ＣＩ−１，−ＣＩ（を８−８−人−ｇ
ａ’）ｔここでＩは結合中に含まルる抗体（例えば抗体
Ｔｌ０Ｉ　）中のチロシンの数を示す−得らｎたイムノ
トキシンは、式星の生産物に対応している。この式中、 Ｐ′は上述した通りであるが、とくに結合中に含まれて
いるチロシンのフェノール基を除去し九抗体Ｔ１θ１の
ラジカルである。

入−ｔｓ′はシスティン２５７のチオール基を除去した
りシンの長期活性人鎖のラジカルであるＯ Ｗは下記の（Ｃ）基である。

−Ｚ−Ｙ−Ｅ−８−４−（Ｅ’−Ｙ’−Ｚ’）　ｎ＋こ
こで２は結合中に含まれるフェノールハイドロキシルの
酸素であり、Ｙは−ｃｏ−、ｇＦｉ不活性空間構造−Ｃ
Ｈ２−ＣＨ！−、ｎは０である＾荷に好適なイムノトキ
シンはりシンの長期活性ナプユニット＾と単一抗体Ｐと
を含むｌ又は２以上の構造物によって形式されたもので
、下式で示される。

Ｐ’　（Ｗ’−Ａ−１、’　）　ｍ ここでｐ／　、　ｗ／及び八−１，／は上述した通りで
ある。ｍは結合中に含まれる蛋白質ＰＫＩＥする基の数
を示す。ｍの数は０．３〜１２．好ましくは０．５〜１
０の範囲で変化する。

ｒｍｔｖＦは０．３〜１２、好ましくはＯ，Ｓ　〜１０
の範囲で変化する。」とは、ｍの値は統計的な値である
ということである。なぜなら、抗体分子の中でに結合は
均一には生じないためである。従ってｍは整数ではない
。

ｍの値はとくに使用される抗体により、更には抗体の分
子量による。

従りて断片Ｆｉｂ又はＦａｂ’を！に初の抗体Ｐとして
使用すると、ｍの価は０．３と約２の間で変化する。断
片Ｆ（ａｂ’）ｔを使用すると、ｍは０、５と約４の間
で変化する。ＩｇＧタイプの抗体では、ｍは０．５と約
６との閣で変化する。抗体■ｇＭではｍは１と約１２の
間で変化する。

しかし、好ましくは抗体Ｐの置換の８度は、ｍが０．５
以上であり、１０を越えないのがよい。

一般く、上述の構造式■及び１は、簡略式（記載さｎた
一般式を示す。

同様に以下の式＋Ｖ、Ｖ及び■はｎが１のときはいつも
統計的な式である。なぜなら結合反応体は蛋白質Ｐ１及
びＰ、中から選択され、これら蛋白質は全て抗体Ｐとし
て上述の如く考慮されるものとしてまったく同じ性′Ｘ
を有している。

この場合蛋白’Ｘ　Ｐ　Ｉ及びＰ、は抗体Ｐ又は蛋白質
ＧＰＩＲ−１，自体であることを問わない。

この発明の他の態様としては抗体と、すメソーム不活性
化抛タンパクとの間にジスルフィド又はチオエーテル型
の共有結合を有する長期作用型免ｆ＆福素の製造方法で
あつて、糖タンノＩり（そのチオール基を適宜保超して
）を過ヨウ素酸アルカリ金ｊＩｉ塩の水溶液で０〜１５
℃で、光の不存在下で０．２〜２４時間処理して得るよ
うにしたことを９？！１とする方法を提供する。

本発明の好ましい態様は上記構造■の免疫毒素の製造方
法であつて、タンノダクＰＩ（リボソーム不活性化長期
作用！！７糖タンパク、ＧＰＩＲ−１１又は抗体もしく
は抗体断片であって、遊離チオール基が直接又は介在原
子団を介して結合したもの）′をを水中液中温でタンノ
ぐりＰ。

（’ｉと異なり、リボソーム不活性化長期作用型糖タン
／９り、ＧＰＩＢ　−１ａ又は抗体もしくは抗体断片で
あってタンパクＰ、の遊離チオール基と結合し得る基を
有するもの）と反応させ、チオエーテル又はジスルフィ
ド結合を形成させること七脣徽とする方＠を提供するも
のである。

本発明の物に好ましい態様は上記構造Ｕの免疫毒素の製
造法であって、Ｐ’、Ｗ’およびＧＰＩＲ−１ａ’が上
記定義のものからなるもので、下記一般式のタンパク、
すなわち一般式、Ｐ、　’　−（Ｚ−Ｙ−ｇ）　ｎＳ　
Ｈのタンノヤクを一般式、 Ｐ、’−Ｚ’−Ｙ’−Ｅ’−Ｇ のタンノータと反応させることを特徴とする免疫毒素の
製造方法、 （ただし、式中Ｐ、′およびＰ、′はこｎらタンパクに
属する基に結合されたタンノシクＰ、およびＰ富のラジ
カル、又はＰ、およびＰ、が抗体もしくは抗体断片であ
るときは過ヨウ素酸との反応によｐ糖鎖核の開鎖によシ
生じたタンパクＰ。

およびＰ、０５ジカル、Ｚ、Ｚ’、Ｙ、Ｙ’、ｇ、ｇ’
は前記同様、Ｇは （九だし、Ｘは活性化基）である） を提供するものである。

したがって上記ＰおよびＧＰＩＲ−１ａ　Ｆｉ下記の基
金逼宜含むタンノダクである、 （１）　　結合に関与するチオール基又はその他の晶、
（２）　　上記チオール基と反応しジスルフィド又はチ
オエステル結合を形底し得る１以上の官能基。

本発明によれば上記チオール基および官能基は天然のタ
ンノヤクＰ又はＧＰＩＲ−１ａ、又はこれらを人工的に
導入し之ものである。

リボソームを不活性化し、過ヨウ素酸塩で酸化するため
に出発物質として用いられる糖タンノ臂りはすべてＧＰ
ＩＲ，たとえばリシンＡ鎖であり、こｎらはそｎ目体、
細胞毒性が極めてわずかである。なぜならばこｎらは細
胞に付着することができない。他方、特定の細胞を認識
する抗体と結合したのちは、この抗体が目標ｇｌｌｉ！
２を認臓したときはこれら細胞に対し細胞毒性が極めて
大きいものとなる。

代表的な出発化合物は、リシンの＾頒、グミーニン及び
モモルデイカ　カランテイス（ＭＬ）Ｍ　）からの抽出
操作により得られた抽出物質である。

過ヨウ素酸イオンとの酸化に用いる出発物質として有用
な他の０ＦＩｎ−は、以下の通シでらる０ ・ディアンチン３０　（Ｄｉａｎｔｈｉｎ　３０　）デ
ィアントロス　カリ夏フィルス（ＤｉｎｎｔｈｕｍＣａ
ｒｙｏｐｈｙｌｊｕｍ　）から ―デ４．７　ンｆ　ン３２　（Ｄｉａｒｉｔｈｉｎ　３
２　）ティアントフス　カリｙフィルス（Ｄｉａｎｔｈ
ｕｓＣｓｒｙｏｐｈｙｌｊｕｓ　）から ゆアグクスティンＡ　（Ａｇｒｏｓｔｉｎ　Ａ）アゲロ
ステーマ　シターゴ（Ａｇｒｏｉ　ｌｅｍｍａｇｉｔｈ
ａｇｏ　）から 費アゲＣｒＸテ４７８　（Ａｇｒｏａ（ｉｎ　Ｂ　）７
グロステーマ　ジターゴ（＾ｇｒｏｓｔｅｍｍ＊ｇ自ｂ
ａｇ□　）から ・アｙ　ｏ　ｘテ４　ンＣ（Ａｇｒｏｓｔｉｎ　Ｃ）ア
ゲロステーマ　ジターゴ（＾ｇｒｏｓｌｅｍｍａｇｉ　
ｔｂｍｇｏ　）から −Ｉ（ＣＩ フラ　クレビタンス（Ｈｕｒａ　ｃｒｅｐｉｔａｎｓ）
から１アスパラゲス　オフィテナリス阻害剤アスパラゲ
ス　オフィｆ　ｆ　リス（Ａｓｐａ　ｒｍｇｕｉｏｆｆ
ｊｅｉｎａＮａ　）　カら この目的のために遺伝子ＩＪ：Ｊ１：修飾した細胞で生
合成的に生産された同じ物質も、ま九適当な化合物であ
る。

上記ＧＰＩＲｚのフラグメントは、もしそれらが元のＧ
ＰｆＲｆｔ％徴付ける不活性リゲソームの全部または一
部の性′Ｘｔを保持しているとするならば、同様に出（
ｌ！！初寅として用いることができる０ リシンの天然の＾鎖のうち、チオール基の少なくとも一
つが保護さ九ているものは好ましい出発物質である。

リシンの細枠の入蜆の製造については、米国特許第４３
４０５３５号に記載されている。グローニン及びＭＯＭ
についても記載さｎている。

出発物質におけるチオール基の保禮は、そのチオール基
が抗体との結合に用＾らｎるものである場合にのみ必要
とさｎる。例えばテロシンのフェノール性水酸基のよう
な他の感応基が結合に用いられる場合には、ｎ記の保獲
は行なわれない。

保ｄのためのブロッキングは、”Ｈ九ｔ、引続いて還元
反応ま九はチオール／ジスルフィド変換反応で除去でき
るような官能基で置換することができるような試薬、例
えば２．２−ジニトロ−５，５−ジベンゾジ安息香酸（
ＤＴＮＢ）、或いｒｉ３−（ヒＩｊシンー２−イルージ
スルフ７ニル）ブａピオン酸等との反応によって行なわ
れる。

このような試薬が存在しない条件下では、＾鎖中の遊ｉ
ａｆオール基は酸化反応中に消失してしまい、たとえ２
−メルカプトエタノールのような還元剤との反応によっ
ても全体的に再生することはできない。過剰のブロック
剤は透析により除去する。

リボソームを不活性化する糖蛋白（そのチオール基がブ
ロックさ几たもの）は、次いで過ヨウ素酸イオンとの酸
化を受ける。他方、もし細胞ａチプユニットがチオール
を含まず、或いはチオールまたはｔオール績が結合に用
いられないならば、上記のブロッキングは行なわれない
。

過ヨウ素酸による酸化反応はｐＨ３〜７、好ましくは５
〜６．５の酸性下で実施される。過ヨウ素酸塩は過１１
Ｊ　Ｉｃ用いる。よシ望ましくは、過ヨウ素酸アルカリ
金属塩の１１度が、酸化さるべきビチナルジオールの濃
度よりも高くなるようにする。例えば、繻胞嵩すブユニ
ットａ度１〜１０　ｍｇ／ｍｌ；に対し、過ヨウ＃：酸
ナトリウム濃實はｌＯ〜５０　ｍ　Ｍが適している。処
理は０〜１５℃、好“ましくは１〜５℃の暗所において
、０．２〜２４時間行なう。

残存する過ヨウ＊＃壇金消費する試薬、例えば過剰のエ
チレングリコールの添加によって反応を停止させ、副生
ｇ物を透析により除去する。

反応終了時に得らルた生成物は、通常の手法により単層
する。

もし出発物質のチオール基がプａｙりさルて−れば、公
知の方法でブロッキングを解除する。

例えば２−メルカプトエタノールのよう（、ブロックさ
九る前のチオール基を遊離させ得る還元剤と反応させれ
ばよい。これにより、す〆ソームを不活性化するＩＩ低
蛋白新規な持続作用が与えられ、これは抗体と結合して
免疫毒素を得るために用いることができる。

リシンの＾鎖の場合、この方法で得られる新しい分子（
以下記号＾−１で表わす）は、次の主要な性質を有して
いる。

・分子ｔ１は、天然の人頌の分子量とそｎはど変らない
。ポリアクリルアミドにょるイ気泳動で観察する１り、
この修飾反応は極く少量の蛋白質の宜曾体を生成するだ
けで、分解生成物は何等生じない◇ −ａａ＋オール基の比率は、Ｑ、７．／ｍｏｌヨりも大
きい。

・リシンの＾＠七基準とした兎抗体に対する免疫反応時
性は、天然の＾鎖のそｎと区別できない。

・無細胞系における蛋白曾成の阻害活性は、等社の天然
＾偵で生じるものの５０％より大きい０ ・最後に、兎に約０．４ｍｇ／Ｋｇ体重の投与量で一回
静脈注射した後、静注後２３時間での血流中における長
期作用型へ鎖（＾−１）の血漿レベルは、投与時おける
血漿レベルの１０％よシも大きい（天然へ鎖の場合のこ
の時点での値は０．０１５％であるから、血漿レベルの
上昇因子は５゛００倍よシもかなシ大きい）。

同様く、ｒ口一二ンの場合に過ヨウ素酸酸化により得ら
れる分子は次の主要な性質を有している。

・分子量は、天然のグａ−二ンの分子量七それほど変ら
ない。

・抗グローニン兎抗体に対する免疫反応時性は、天然の
グローエンの反応特性と区別できない。

・最後に、兎に約０．３　ｍ　ｇ　／Ｋｇ体重の投与量
で一回静脈注射した後、静注後２４時間での血流中にお
ける修飾グローニンのｆｆ１Ｌ漿レベルは、投与時にお
ける血漿レベルの３％よりも大きい（天然グローニンの
場合のこの時点での値は０．０１％であるから、血漿レ
ベルの上昇因子は２００倍よりも大きい）。

リボソームを不活性化する長期作用型Ｓ＋＊白から結合
体、即ち免疫ｆｆｉ素を調製するには、米国特許第４３
４０５３５号く記載されている方法のなかから適当に選
択した方法を用いればよい。もし、選択した細胞毒チプ
ユニットが、結合に逼した少なくとも一つのチオール基
を天然に含んでいるならば、この基は活性化さルたジス
ルフィド基をもつた抗体または抗体フラグメントとの反
応に好適に用いられる。もし、選択した細胞毒サブユニ
ットが、結合に適したチオール基を天然には含んでいな
いならば、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の後、遊離チ
オールをもった少なくとも一つの官能基を公知の何等か
の方法で人為的に１紀ナプユニツトに導入し、上記の結
合反応ｆ：ｌｌｅ行する。

前記官能基の導入は、過ヨウ素酸イオンとの酸化処理の
前、ｉ九は酸化処理の後のどの段階で行なってもよい。

但し、酸化処理の旧に行なう場合には、酸化処理の閣は
チオール基をブロックしておき、酸化処理の後に七のブ
ロックを解除する必要がある。

ヒトの癌細胞に対するモノクロ−゛ナル抗体の調製につ
いては、既に科学文献で広く報告されており、また現在
では多数のこ几ら抗体が商業的に入手可能である。

本発明の方法において、ＧＰＩＲ−１−と抗体（または
抗体フラグメント）との化学的な結合は、結合体の二つ
の成分（抗体およびＧＰＮ？−１ａ）の夫々の生物学的
活性を保持し、満足すべき再現性および艮好な収率で結
合体が得らｎ５ま九慢ら几た結合体中におけるＧｊＪＩ
Ｒ−１ａ／抗体の比率制御を可能とすると共に、更には
安定且つ水溶性の生成物に導くような方法で行なうこと
ができる。

こｎらの特徴に対応し恵方法の中で、二つの蛋白の間の
結合形成において、ｌｔたは２以上のチオール基を含む
ものを優先すべきである。

事実、こｎらのチオール基は、ジスルフィド結合または
チオエーテル結合の形成に籍に適し、両者共に上記の一
般的条件を満たす◎同時に免疫１ａ素の調製についても
以下の特徴を有している。

・リシンの＾鎖と抗体との間の共有結合は、ジスルフィ
ド基を含んでいる。

・ジスルフィド結合を形成している硫黄原子の一つは、
常り、リシン＾鎖の２５７位置（での７ステイン残基に
属する硫黄原子である。

・まな、リシンのＡ鎖を抗体く結合するリンクは、抗体
のＮＨ，側基またはペプチド鎖の末端基に結合しており
、抗体とりシン＾鎖とのカップリングによシ形成さｎる
◇これらについては、米国荷許第４３４０５３５号に詳
細に記載されている。

同じ方法が、同様の特徴を有し、且つ抗体または抗体フ
ラグメントとＧＰＩＲ−１ａとの結合で形成さｎる免疫
毒素−のｔＪｓ製にも適用できる。

抗体または抗体フラグメントとＧＰＩＲ−１ａとの結合
、及び異なつた官能基におけるジスルフィドｔｆＦ、は
チオエーテル型の共有結合によシ形成される免疫違素癲
の調製について、以下に詳細に説明する。

一般的に、峙り交叉結合の乱れを排除して蛋白間くうま
く結合反応を行なうため（は、安定屯で且つ明確に定ま
った共有結合が形成されるように、結合さるべき一方の
蛋白（一方のみ）は使用さｎるチオールまたはチオール
基だけを有し、他方の蛋白はｐＨ５〜９．３０℃を越え
ない温度の水性媒質中においてｔオール虜と反応し得る
１または２以上の基のみを有することが重要である。

以下に詳細に説明するように、蛋白Ｐ、およびＰ鵞の特
徴は出発吻實として用いらｎる。Ｂの立体構造は、より
好ましい構造Ｒ〜ＲＢ（これは実施例としてのみ与えら
ルる）に直代えることができる。

１、　タンパクｐ。

このタンノ臂りは、どんなｍ曾も結合に関与する１つか
１つ以上のチオール基を有しているので、生じる状況は
タン・臂りＰｌの性′ＸＫ応じて異なる。

（＾）　天然の状態でタンパクＰ１は、夕ンパクＰ、と
の結合に関与する１つ以上のチオール基を有している。

このことは！に次のような場合に言える。すなわち、タ
ンパクＰ、が、ペプシンの存在下で抗体を限定分解し、
続いて高分子間のジスルフィド結合を還元して通常得ら
れるようなＦ　（ａｂ　）’として知られる抗体断片で
ある場合である。このことは、タン／デクＰＩがリシン
の＾鎖またはＡｉｌの誘導体である場合にもあてはまる
。この場合、天黙りシンの１７１誉目のシスティン残基
および２５７ｆ目のシスティン残基に付いている少なく
とも１つのチオール哉が未結合であって化学結合を庄じ
ゃすい。

これらすべての場合において、天然のチオール基を有す
るタンパクＰ、はこのような状態で結合工程に使用され
る。

（Ｂｌ　　天然の状態でタンパクＰ、は、タンノダクＰ
、との結合に関与するチオール基を有していない。この
ことは峙に次のような場合に言える。

すなわち、タンパクＰＫが天然の免疫グミプリンであつ
て、抗体全体か抗体の断片時に通常Ｆ（−ｂ　）’また
はＦ（ａｂ）と呼ばれる断片の１つである場合。天然の
状態でタン／＃りＰＩが結合に関与する１つのチオール
基を持たない場合のいま１つの例は、このタンパクＰ１
が、２つのシスティン残基それぞれがアルキル化により
探題されているか、または化学修飾を受けないリシンの
＾鎖である場合である。全ての場合において、結合を可
能にする１つ以上のチオール基をそのような分子に導入
することが妥当といえる０３つの型の反応がチオール基
を導入する丸めに好ましく用いられる。

（１）　　最初の型の反応は、Ｓ−アセｔルメルカブト
コへり酸無水物との反応である。この酸無水物は、タン
パクのアミノ基のア七デル化を可能にする。その後当該
チオール基をヒドロキシアミンと反応させることにより
てアセチル保諌基を除くことができる。この方法はすで
にアーテープズ・オプ・バイオケミストリー・アンド拳
バイオフイジクス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｌｏｃ
ｈｅｍｉ　−ａｉｒｙ　ｓｏｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｊｃｍ
　）、１１９　、４１−４９（１９６７）に記載されて
いる。このように保護基が導入されたチオール基を続い
て活性型ジスルフィド基と反応させる場合、ヒドロキシ
アミンによって前もつて保護基をはずさなくて済む１ｌ
ｉＪ脂性がある。事実、この発明の物質を形成する反応
体を使ってジスルフィド結合を形成する反応は、遊離チ
オール基金使つた場合と同様ＫＳ−アセチル基を使つて
も生じる。

文献に記載されている他の方法も、修飾されるタンパク
にチオール基を導入するために使うことができる。

（２）第２の型の反応はタンパクをカルボキシル基を介
して以下に示すジスルフィド構造を有する対称的なジア
ミノ分子と反応させることである。

Ｈ，Ｎ−Ｒ，−８−８−Ｒ１−ＮＨ１ 上式中、Ｒ１は炭素数２から５の脂肪族原子団である。

この反応では、カルボジイミド％に１−エチル−３ジメ
ｔルアミ／プａピル−３−カルメジイミドのような水溶
性の誘導体の如きカップリング剤の存在下でシスタミン
［”Ｒ１−−（ＣＩｔ）を］と反応させ、用いた化学１
論ｔＫ応じて次に示す誘（体の１つか双方の混合物を形
成させることが好ましい。

Ｐｒ　’−ＣＯ−Ｎ　Ｈ−ＲＩ−Ｒ３−Ｓ　−ＲをＮ　
Ｈ＊　　　　（ｌ　ｍ　）Ｐ、’−Ｃｏ−ＮＨ−Ｒ，−
８−８−Ｒ，−Ｎ）（−Ｃｏ−Ｐ、　（ｌりこの夕の反
応生１！１．′ａは次の２つの工程のいずれかに供され
る。

（１）　　式１１ま九は１ｂにおいて、タンパクＰ。

がリシンの＾鎖またはその誘導体の１種ならば、得られ
た反応溶液は分別せずに２−メルカプトエタノールのよ
うな還元剤との反応に供せられる。それによつて次式の
１植函のタンパク誘導体が得られる。

Ｐ、　’−〇〇Ｎ）（−Ｒ，−８）（ こうして得られた生成物は続いて透析かグル濾過によ）
精製される。

（ｂ）　　式１２およびＩｂにおいて、ラジカルＰ、′
が抗体またはその断片の１種から成る、タンパクＰのラ
ジカルならば、得られた反応溶液はそのｔまカップリン
グに用いられ、その場合チオール／ジスルフィド交換法
が用いられる。この交換法は、例えばギリランド（ＧＮ
Ｉ口ａｎｄ　）　トコリエール（Ｃｏ１１ｉｅｒ　）　
Ｋよってキャンナー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５
ｅｒｃｂ　）　、４０．３５６４（ｘ９ｓｏ）Ｋ記載さ
れている。

（３）　　第３の反応は、導入しようとするチオールを
有するラジカルを固定するために糖鎖単位を使うことで
ある。このＩＩ［１位は天然の状態で抗体に＃圧してい
るものである。続いてタンパクは、Ｓ鎖単位にアルデヒ
ド基を生じさせる丸めに過ヨウ素酸で酸化される。過剰
の工ｔレンゲリコールを加えて反応を停止させ、副産物
と過剰の反応体を透析によシ除いた後、得られた成生物
を次の一般式を有対称なジアミノ分子で処理する。

Ｈ，Ｎ−Ｒ，−８−８−Ｒ，−ＮＨ。

上式中Ｒ３は炭素数２ないし５の脂肪！！に量である。

得られた付加生成物は、続いて金属水素化物（轡には、
水素化ホウ素ナトリ９ム）との反応により第２または第
３アミンに還元される。この反応はシスタミンＣＲ＋−
一（ＣＨｙ）を）を用いて実施することが好ましく、用
いた化学を論量に応じて次式のＩｎ体の１方かその両方
の混合物が形成される。

Ｈ Ｈ 得られた反応液を、！ａｔたはｌｂの構造式で表わされ
る生成物であって２１′が抗体または抗体断片であるも
のく関して上記し九とお）の処理を行なってもよい。

チオール基を人工的に導入（対称なジアミノジスルフィ
ド反応体を使うタイプ）するための上に述べた後二者の
反応において、タンパクＰ。

は遊離８　Ｈ基または遊離アミノ基を持たないことが好
ましい。＾鑓とその誘導体の場合には、Ｎ−エチルマレ
イミドまたはヨード酢酸のようなチオール基に対する通
常の試薬との反応により天然のチオール基をアルキル化
し、およびミイーンズ（ＭＥＡＮ８）およびフィーニー
（ＦＦ、ＥＮＥＹ）によってバイオケミストリー（Ｂｉ
　ｏｃｈｅｍｊ　ｓ　ｔ　ｒｙ　）７．２１９２（１９
６８）Ｋ記載された還元的メチル化法に従って天然のＮ
Ｈ，基をメチル化することによシ常に遊離のチオール基
を持たなくさせ得る。このようにして天黙りシンの＾鎖
に１モル当り６個までのメチル基を導入することができ
る。このようにして修飾されたタンパクには、生物学的
な荷性（脣には、真核細胞のリボソームにおけるタンパ
ク合成を阻害する能力）が備わっている。抗体または抗
体断片さらに８ｇ１群のすべての物質の場合には、１記
したようにそれらは天然の遊、１ｉｓＨ基を持たないの
で、還元的メチル化を例えばミーンズおよびフィーニー
の方法により実施するほうがよい。このようにして通常
抗体１モル当）数十のメチル基を導入することができる
。その場合抗体の細胞表面上の抗原を認識する能力を変
化させない。

■　タンパクｐｔ あらゆる場合、このタン／−りは、タン／４りＰ。

のチオール基と反応してジスルフィドまたはチオエーテ
ル結合を形成し得る１つ以上の官能基を有するタン・ぐ
りである。これらの官能基は、常にタンパクＰ！に人工
的に導入されるが、それがジスルフィド結合によシカツ
ブリングされるのかチオエーテル結合によりカップリン
グされるのかに応じて異なっている。具体的には以下に
記載する。

（１）　　ジスルフィド結合 この場合、包合体のＵ！Ａは以下の式で表わされる。

Ｐ、’−（Ｚ−Ｙ−ｇ）ｎ−３Ｈ十Ｆ、’−Ｚ’−Ｙ’
−Ｂ’−８−８−Ｘ→Ｐ、　’−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）ｎ−８
−８−Ｅｊ−Ｙ’−Ｚ’−Ｐｔ’−ｆ−Ｘ−ＳＨ。

活性イオウ原子により置換されるタン／４りＰ！はタン
ノイクＰ！または適切に保護されたタンパクＰ！からそ
れ目体活性イオウ原子を有する試薬による置換により得
られる。これは次の式で示される。

Ｐ　、−）−ｆ、−Ｙ’−Ｒ−８−８−Ｘ−＋Ｐ、　’
−Ｚ’−Ｙ−Ｒ’−８−８−Ｘ上式中、Ｐ、は置換され
るべきタン・ダクを示し、Ｌ−Ｙ’は試薬をタンパクに
共有結合させる基を示す。官能基Ｌ−Ｙ’は、置換され
るべきタンパクの構成アミノ酸の側鎖に付いているいず
れか１つの基と共有結合し得る基である。これらの基の
中で、特に次のものが選び出せる。

（ａｌ　　ヘプｔ）鑓の末端アミ７基またはタンパクに
含まれるリシン残基のアミ７基。この場合、Ｌ−Ｙ’は
時に次のように表わせる。

・カルメジイミド、符に１−エチル−３−ジメチルアミ
／プロピル−３−カルメジイミドの如き水溶性誘導体の
ようなカップリング剤の存在下でタンノダクのアミノ基
と結合し優るカルボキシル基。

・アミ７基とｉ！接反応して、それをアシル化し辱るカ
ルゲン酸塩化物。

豐オルト−または／４ラーニトロフェニルｆりｔｆ−ジ
ニトロフェニルエステル、ｉ　ｆｔ　ｐ’ｉ　Ｎ−ヒト
ミキシコハク酸イミドエステルのようないわゆる「活性
型」エステル。これはアミ７基とＩ［接反応して、それ
をアシル化し得る。

・フハクｔＲ無水物のようなジヵルーン酸の内部無水物
。これはアミ７基と自然に反応して、アミド結合を形成
させる。ま九は ・イミとエステル基 上式中、Ｒ２はアルキル基で、次式のようにタンパク？
ｔのアミン基と反応する。

上式中、Ｒ１は−Ｒ−８−８Ｘ基を示す。

［ｂ）　　タンパクに含まれるチロシン残基のフェノー
ル基。この場合、Ｌ−Ｙ’は峙にイミダゾール−１−イ
ルカルボニル基を示すことがある。

それは次の弐に従ってタンノ櫂りの７エノール基と反応
する。

上式中、Ｌがイミダゾール−１−イルで　ｙ／がＣｏ玉
で、Ｒ４が−Ｒ−８−８−Ｘ基である。

−５−Ｓ−Ｘはａ離チオール基と反応し得る活性型ジス
ルフィドを示す。神に、このジスルフィドにおいて、Ｘ
＃ｉ１つ以上のアルキル、へログンまたはカルボキン基
で置換されていることのあるピリジン−２−イルまたは
ピリジン−４−イル基を指すことがある。Ｘもまた１つ
以上のフェニル基またはカルボキシル基で好ましくは置
換されているフェノール＆を指すことがある。

またはＸはメトキシカルボニル基のようなアルコキシカ
ルボニル基を指すこともある。

Ｒｉは、ｒａｍ？Ｉｓｙ’＊よび５−ｓ−ｘを同時に結
合し得る介在分子（削成中の８のような）を示す。それ
は、後の反応において、使用される反応物質と合成され
る庄成物を妨害するような基を含まないようなものでな
ければならない。をに、Ｒ基ペー（ＣＨｔ）−でもちり
得（ｎは１ないしｉｏ）、−ｔた次の基でもあ）得る。

上式中、Ｒ６は水素または炭素ａｌないし８のアルキル
基を指し、Ｒ１は続いて使われる次式のカルカルバメイ
ト基のような反応体に不活性な置換基を指す。

−ＮＨ−Ｃ−ＯＲ。

上式中、８丁は炭素数１から５の直＠または分枝アルキ
ル基、台に第３ブチル基を示す。化合物Ｌ−Ｙ’−Ｒ−
８−８−Ｘとタン１フ２重との反応は均質な液相、鰻も
一般的には水または緩閏液中で進行する。反応体の溶解
性を高めるには、水に可溶性の有接溶媒を反応溶液に加
えることができる。その最終Ｓ度を、第３ブタノールの
ような第３アルコールの場合には容量比で２０％までに
することができ、ジメチルホルムアミドまたはテトラヒ
ドロ７ランの場合には容量比で１０％までにすることが
できる。

反応を、室温にて数分から数時間の時間をかけて実施す
る。その後、低分子量の生成物および時には過剰の反応
体を透析ｉ九はグル濾過によって除去することができる
。この方法によｐ１タンパク１モルあたプｌないし１５
の遊侠基を導入することが可能となる。そのような化合
物を用いる場合、タンパクＰ、とのカップリングは、Ｐ
Ｈ６から８の溶液中（て３０’Ｃを越えない温度で、１
時間から２４時間かけておこなう。

低分子量の生ｇ物を除くために適宜、得られた水溶液を
透析する。ついで包合体を既知の方法の変法によｐｆｌ
ｆ製できる。

（２）ｆオニ−チル結合 この場合、包合体をＰ、’−（ｚ−ｙ−ｇ）　ａ−３Ｈ
と前もって１つ以上のフレイミド基を導入しておいたタ
ンノ卆りＰ、とを反応させることＫより調製する。１例
として、反応を次の式で示す。

上式中、Ｒ８は炭素ａ１ないし１５の脂肪族ま九は芳香
族介在分子を示す。それは、続いて使用される反応体に
対して不活性である。２は、結合に関与するタンパクＰ
、の官能基の積項に従うて変化し優る基を示す。すなわ
ち、２は、！！Ｘ（テａシン残基（チロシル基）の７エ
ノール基のエステルの場合Ｌ　ＮＨ（タンパクの７ミ／
Ｔ＆と活性型カルボキシル基のカップリングの場合）ま
たはＮ　Ｈ−ＣＨｔ　（タンパクのアミ７基とクロσメ
ｔルケトンの場合）である、マレイミドで置換されたタ
ン／？りＰ、は、それ目体マレイミド基を有する試薬に
よってタンパクの適当な基を置換することによって、タ
ンパクＰ、自体からま之は適当に保護されたタンパクＰ
、から得られる。これらに適した基の５ち、臀に次のも
のが選ばれる。

リ　ペプチド鎖の末端アミン基またはタンノぐりに含ま
れるリシン残基（リシル基）の側蝋アミ７基。この場合
、フレイミド基を有する試薬は次のよりなものがある。

ア）次の一般式の試薬 上式中、Ｌ−Ｃｏ−は次のとおシである。

拳カルゲキシル基。その場合、カルボジイミドのような
カップリング剤および時には！−二チルー３−ジメチル
アミツブａピル−３−カルボジイミドのような水溶性誘
辱体の存在下でカルボキシル基を活性化したのち、反応
が進行する。

・またはオルト−若しくはパラ−ニトロ７エ二ルマタハ
ジニトロフエニルエステルｔたＨＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステル。

これは直接アミノ基と反応し、それをアシル化する。こ
のような試薬の調製は、奇にヘルベテイ力・ケミ力・ア
クタ（）ｌｅｌｖｅ口ＣａＣｈｉｍｆｃａ　Ａｃｔａ　
）　、　５８　、５３１−５４１　（１９７５）に記載
されている。同じようなりラスの他の薬剤は市販品とし
て手に入る。

イ）次の一般式の試薬 Ｃ） り これは次の反応式に従ってタン・１りＰヨのアミノ基と
反応し得る。

リ　タンノーりに含まれるｔロンン残基のフェノール基
。この場合、７レイミド基金有する試薬は次の一般式で
示される。

す これは次の反応式に従ってタン／譬りの７エノール基と
反応する。

マレイミドを有する試薬とタン・ぐりＰｌ　との反応は
均質な液相、鰻も一般的には水または媛淘液中で進行す
る。反応体の溶解性を高めるには、水に可溶性の有機溶
媒と反Ｉ２；溶液に加えることができる。その最終濃度
を、第３ブタ／−ルのような第３アルコールの場合には
容量比で２０％までにすることができ、ジメチルホルム
アミドまたはテトラヒドロフランの場合には容量比で１
０％までにすることができる。反応は室温にて数分から
数時間かけておこなう。

そののち、低分子鼠生底物、轡に過剰の反応物を透析、
又はグル濾過によシ取り除く。

この方法によシ、通常、タンパク１そり当シ１〜１３の
置換基を導入することができるｎこのような化合物を用
いる場合、タンノザク質Ｐとのカップリングは、２つの
タンパク質をｐＨ６〜８の水溶液中に３０℃以下の温度
で１ないし２４５８間かけて溶解すること（よっておこ
なう。鴎られた溶液を、所望に応じて透析して低分子ｍ
生成物を除去し、抱合体を檀々の既知の手法によって精
製する。

ぜ“ （ここで、ＥおよびＧは上記の通＃））で示される化合
物は、式 ％式％ （ここで、ＧおよびＥは上記の通））で示される化合物
を、有機溶媒中１０ないし４０℃の温度で、式 で示されるカルボニルジイミダゾールと反応させること
によって奉られる。

式■の化合物は、タンメゼク質ＧＰＩＲ−１ｇおよびＰ
のチロシンの水酸基とのカップリング用試薬として時に
有用である。

この発明は、また、統計式 ％式％ の残基もしくはその官能基のいずれか１つを修飾するこ
とによってＧＰｒＲ−１ｎからｔ５導された分子でらっ
て、チロシンのフェノール水酸基が１つ以上除去されて
いるものを表し、酸素ＩＱ子は、残基ＧＰＩＲ−１ａ“
から離脱した上記フェノール水酸基に属するものを表し
、および Ｅおよび０は上記の通りである）で示される新規生成物
にも関する。

時に好ましい化合物は、式■で示される化合物であって
Ｅが、基−ｆｃＨｔ”ｒ”’；−へここで、ｐｄ２ない
し７の整数）または基 、−ＣＨ− ＣＪ（、Ｃ００）ｉ であり、かつＧが式−８−８−Ｘ（ここで、Ｘは、１つ
以上のへ口ｒン、アルキル基、カルボニル基、アルコキ
シカルボニル基、１つ以上のへログン、ニトル、アルコ
キシ、カルが中シルモしくはアルコキシ力ル〆ニルで置
換されもしくはに換されていないフェニル基もしくはア
ルコキシカルボニル基でそれぞれ置換されまたは置換さ
れていないピリジン−２−イルおよびピリジン−４−イ
ルよシ表る群の中から選ばれ九活性基であるものである
。

式■の生成物は、式 ＧＰＩＪ（−１ａ　”　−０Ｈ （ココテ、ＧＰＩＲ−１ａ’は上記の通シーおよび水酸
基は残ｉＧＰＩＲ−１ａ“のｔロジンから脱離するフエ
／−ル水酸基である）で示される化合＠を、場合に応じ
て水混和性有機溶媒（例えばジオキチンやテトラヒドロ
７ランのようなエーテル系溶媒）を含有する水系溶媒中
、ＩＯないし４０℃の温度で、式■の化合物と反応させ
ることによって得られる。

ＧＥ’ＬＲ−１ｓがリシンの長期作用型Ａ＠である場合
、４られた免疫褌素ＩＴ（＾−１ａ）の性質は以下の通
りである。

＋１）　　抗体１モル当りの修飾＾頌のモル数で表現さ
れる半均カップリング度は、通常、０，５ないし５であ
り、侍に１ないし３である。

（２１ホｌ）　７　？リルアミドグル嵯気泳動法によっ
てＩ　Ｔ（Ａ−１１）　を分離すると、抗体の分装置と
１ｄ３００００ダルトンづつ連続的に異なる分子址を有
する住ｉＪｉ、物に相当する一連のバンドに分れる。

（３）　　ナイトフルオロメトリーによって、抗体は活
性化およびカップリング反応中にどのような実質的な労
化をも受けていないことおよび抱合体自体の内部におい
てそれが指向された抗原をなお認識し得ることが示され
イ薯る。

（４）修飾され抗体とカップリングし九＾鎖の、タンノ
４り買合成に刈する阻害活性は、２−メルカプトエタノ
ールの存在下くおいて無細胞モデルで測定すると、全体
的に保持されている。

免疫＃Ｓ素ＺＴ（＾−１ａ）の細胞毒性活性は、活性化
剤の存在下において標的抗原を有する細胞につめて細胞
モデル中でのタン／４り合戊賦験で測定したとき、標的
抗原を待たない細胞について同一条件でおこなったとき
よ５もｔｏｏ。

倍以上大きい。例えば、ジスルフィド架橋を含む結きに
よってリシンの修飾＾鯨を、ある種のヒト白血病細胞表
面に存在する抗原Ｔ６５に指向される単一りσ−ン抗体
（抗体Ｔｌ０Ｉで表示）とカップリングして優た免＆ａ
ａＸ（ＩＴ（＾−１ａ）で表示）は、趨性Ｔ６５細胞に
対してよりも約１０５倍陽性Ｔ６５砒胞ＶＣ対して細胞
毒性である。

免疫播ネＩＴ（Ａ−１１）の細胞磁性効率は、クローン
原性（ｃｌｏｎｏｇｅｏｉｃ　）試験で測定したとき、
相応する通常のｒＴＱについて得られたものと同等であ
る。例えば、ｌＱｍＭの塩化アンモニウムの存在下に１
０　　　Ｍもの低い投与量でＩＴ（Ａ−１ａ）は初期値
の９９．９９９％のオーダーの特異的ナイトリダクシＩ
Ｉ　ン（ｅ７１０ｒｅｄＬＩｃＩｉｏｎ　）に至る。こ
の結果は、同じ抗体およびリシンの非修飾＾鎖で形成さ
れたＩＴ　　ＴＩＱｌについて得たものと同一である。

＾鎖として換算してＩＴ（Ａ−１ａ）をウナギに０、４
　ｍｇ／Ｋ　ｇ体重のオーダーで血管円投与した後、投
与から２３時間後の血液流に存在するＩＴ（＾−１ｎ）
の血漿中レベルは、同一条件で測定した通常のＩＴの血
漿中レベルよシも１０ないし２００倍高い。かくして、
ウサギが関与する典型的な例において、投与２３時間後
の血液流中のＩＴ（＾−１ｉ）の血漿中レベルは、時間
０のときに存在するレベルの７％でらシ、同一時間にお
ける通常のＩＴ　　Ｔｌ０Ｉの場合のＯ，ＯＳ％と比べ
て、１４０倍であることがわかる。

これによって、桑理的性買に関して新たな性質が付与さ
れた修飾免疫′ＪＢ六が得られるのである。

さらに詳細には、ｌａ胞毒性サブユニットを逼当に修飾
することによって、免疫毒素の特異的細胞毒性に、これ
を阻害することなく、新たな固有の性質すなわち遅延さ
れた血漿中における消失キネティックスを示す能力を付
与できるのである。

以下、この発明の実施例を記載する。

実施例　１ この実施例は過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したりシン人
鎖ｆ！：＃脈注射した場合の消失の逓砥性を証明するた
めのものである。

１　過ヨフ累酸ナトリウムにょろりシンＡ鎖の修飾 （１）　　１）ＴＮＨｉ用いた天然ＳＨのブａツキング
リシンＡ蟻を米国’Ｆ？ＩｆＮ０．４，３４０，５３５
に記載されている方法で製造、絹製した。２，２′−ジ
ニ）＋１７−５．５’−ジテ第２安息香ｅ１１（ＤＴＮ
Ｂ　）　＋７）＃液２０当鼠、すなわち、ｐＨ７の１２
５ｍＭリン酸塩復閏液に溶かしたＤＴＮＨの０．１Ｍ溶
液、３８５μｔ（この溶液は水酸化ナトリウムでｐｉ（
ニアに調節した）を、ＰＢＳ緩ｔｊ４液に溶かした５、
６ｍｇ／ｍｌの割合で含むリシン＾鎖ｉｏｍｇ溶液に加
えた（りん酸塩については２０　ｍＭ　、　ＮｍＣ７ｊ
については１５０ｍＭのｐ）（：　７の援衛液）。培養
は２０℃で２０分間続けた。この溶液を４℃でＰＢ８援
衛液を用いて透析し、チオール紙をブロッキングしたへ
鎖を５３ｍｇ　ｆ：５　ｒｎｇ／ｍｌの割合で含む溶液
として得た。

（２）　　ブロッキングされた＾鎖の過ヨウ素酸塩によ
る酸化 過ヨウ累酸ナトリウムの０．５Ｍ水溶液１２０μｅを、
１Ｍ酢酸でｐＨ：６に調整したブロッキング済み＾鎖を
５ｍｇ／ｍｌ含む溶液６ｍｇ中に加えた。培養は暗所で
４℃で１６時間おこなった。酸化反応停止は工ｔレンゲ
リコールの１Ｍ水浴液６２０／ｉ６を加えることにより
おこなった。

培養後、２０℃で１５分間、反応媒体を４℃でＰＢＳ緩
爾液で透析した。この過ヨウＸＩ！Ｉｌ！塩による酸化
によシタンパク質のわずかな析出を得た。これを３０分
間、１０，０ＯＯＸＧで遠心分離し除去し、酸化および
ブロッキングされたＡ鎖を３．４ｍｇ／ｍｅの濃度で２
４ｍｇ得た。

（３）　　チオール基のブロッキング解放２−メルカブ
トエタ／−ルを還元剤として般終儂度１％で酸化、ブロ
ッキング化Ａｄ（ＰＢＳＷ　園ｆ’＆　中Ｋ　３．４　
ｍｇ／ｍ６含む）ｆｌｉｍ７！に加えた。

培養を２０℃で１時間おこない、ついでこの溶液を４℃
でＰＢＳｔｌ改液を用いて透析した。七の結果酸化され
た入Ｕ　ｔ”　２．８　ｒｎ　１７ｍ　ｌの濃度で１９
ｍｇ得た。

ＤＴＮＢ法（ｇｎｔｙｍｏｌｏｇｙ　、　ｌ　９７２　
、２５．４５７Ａｃｍｄｃｍｊｃ　Ｐｒｅｓｓ　）を用
い、この修飾されたへ鎖が１モル当り０．７０の遊離チ
オール基を有することが判明した。この修飾ＡＭの分子
鑞はト。

デシルナルフェートの存在下での？リアクリルアミド勾
配峨気泳動により３０，０００±３，０００であること
が判明した。

多糖単位が酸化された＾ＳＡを、タン・臂り質合成の抑
止における酵素活性および薬理学的付性について１ｌｃ
ｌｆ死した。

Ｉ　持続法Ａ鎖の酵素活性の非細胞モデルによる測定 抑止活性を実施例１の方法で測定した。その結果、酸化
＾鎖のＩＣ，、は３Ｘ１０−”モル／ｌであり、対照＾
鎖のｘ　ｃ、、は１．２ｘ１０−ｔｏモル／ｌであった
。し九がって修飾によるＡ鎖の活性損失は認められなか
った。

Ｉ　持続性＾ｇ（Ａ−Ｌａ）の薬理効果このＡＭをラビ
ットに耳を介して静脈投与した。この＾頌投与道は０．
４１５ｍｇ／Ｋｇでちった。

血液サンプルをへ／４’リン上に間隔をおいて採取した
。この血漿を下記にｉ（ＩＭ−１の記号で示したラジオ
イムノアッセイテストで分析したＯこの方法はＡ１１ｉ
を修飾することなしに判定し得る利点を存する。この判
定をマイクロ滴定プレートを用いておこなった。このプ
レートの蓋体には過吸収剤スパイクが設けられていて、
こ１がベース中の穴に浸入するようになっている。

これらのスパイクは固体相からなるものである０リシン
の＾鎖を示し、親和性クロフトグラフイで精製された維
手抗体（以下に＾Ｃ！の記号で示す）をこの固体相上に
吸収させた。この目的のため、ＰＢａｌｌ＃Ｊ液中に１
０　、ａ　ｇ／ｍｅ含む＾ｃｒの溶液を上記穴に分けて
注入した。上記スノタイクを４℃で２４４時間＾ｃｌ溶
液と鰻初に接触させ、ついで２０℃で３時間、胎児ウシ
血清と接触させ、全ての固定部位を飽和させた。この飽
和した免疫吸収剤を２０℃、３時間、種々の濃度の血漿
チンプル、又は既知の濃度のＡ＠浴溶液接触させ、目盛
白線を作成した。ＰＢＪｊ！陶液で洗浄後、この免＆吸
収剤Ｊをリシン人類を示す雌羊抗体（Ｉｔ相クロマトグ
ラフィで侑製し、放射能ラベルを施したもの、以下＾Ｃ
２と記す）と２０℃で２時１１５接触させた。この＾Ｃ
２の放射能ラベルはクロラミンＴの存狂下でヨウ素１２
５を用い、ＧｒｅｅｎｗｏｏｄおよびＨｕｎｔｅｒの方
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１９６３，８９，１１４）
でおこなった。このラベルした＾Ｃ２抗体は５〜ｌＯマ
イクロキ工−リー／μｇを示し九〇このラベル化＾ｃ２
１Ｑｃｐｍを２００μｇとして、０．１％クシ血清アル
ブミンを含むＰＢＳ緩鷺液中に導入し次。ＦＢＩ援衛液
中で洗浄ののち、上スノーイクを取りはずし、結合した
八Ｃ２の量を放射能測定により計量した。サンプル中の
Ａ釧の濃度は、異なる既知の濃度で＾韻を導入すること
によって作られ九目Ｉ＆市線に対して参照することくよ
り測定した。愕続性入鎖を動物に注射し死際、同じ＾頌
を用い相当する目盛白線を作成し九。

この方法で測定された血漿中のＡ＠の濃度は再現性がら
り、信租できるものである。この探知しきい直はＩ　ｎ
ｇ／ｍｌである。各実験間の再現性の検討の結果、変化
関数が１〜２００ｎｇ／ｍｌの１１度について１０％以
下であった。

これらの実験の結果はＩｆＩＩＩＭで示され、時間はｆ
ｔｔｔ軸に、零時の血漿？１度理論値に対する記録され
九生底物の血漿濃度の％をｌｏｇスケールで縦軸に示し
た。この値、すなわち、°相対血ｉｓ度”（ＲＰＣ）は
下肥の式で計算される〇血ｇＲｔは動物の体重のＩ　Ｋ
Ｐ当り３６ｍ／で考えられている。

第１図は天然りシン入鎖を静脈注射し九場合の血漿にお
ける消失曲線を時間の関数として示したものである。こ
の白線（１１は２つの相を示している。第１にこの天黙
りシン＾＠を注射後３時間で血漿中に残る率はわずか０
．１％（投与量に対して）であり、血液から急赦に消失
することを示している。第２の相においてはこの７１％
矢がよりゆるやかである。

しかし、多糖単位が酸化され九へ鎖においては、この消
失性は著るしく改められる。すなわち、入鎖製品の大部
分が消失するもととなる第１の消失相は著るしく抑制さ
れ、その結果、＾鎖の血漿における残留レベルが著るし
く増大する。注射２０時間後では酸化＾鎖の濃度は修飾
されていない＾＠（曲＠２）の場合の６００倍にも々る
。

実施例　２ この実施例は、酸化処理時間が酸化入鎖の薬物動態学的
性質に及ぼす重要性を検討するものである。

過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた以外Ｖｉ
実施例２の手法を用いて６種の酸化Ａ鎖のＩ！！列を消
失した。処理時間は次の通シであった。すなわち、Ｏ（
エチレングリフールを用いて反応を直ちに停止）、２０
分、４０分、２．５時間、４時間、および１８８時間あ
った。

これら６種の製剤をウサギに注射し、２３４閣経過後の
＾鎖の血漿中相刈ｆｉ変を実施例１の手法によりＩｌ！
！Ｉ定した。

結果を：ｓ２図に示す。この結果から、１）＾鑓の血漿
中濃度の増加は、確かに、過ヨウ索酸堰による酸化に基
づくこと（反応を直ちに停止しなときは、＾頌の血漿中
濃度は生の＾鎮についてのものと同一であるからである
）、および２ン晟週の効果を得るためには、反応処理時
開を比較的長くすることが必要であることがわかる。

実施例　３ 本実施例においては生のゲロニンを動物に靜脈注射した
場とのその急消失と過ヨウ素酸ナトリウムによって変性
させ九グσニンを同様に注射した後のそのゆっくりとじ
九消失について説明する。

１）　　過ヨウ素酸ナトリウムによるゲロニンの修飾 ゲロニンをグロニウムムルチ７０−ルム（（Ｊｅｌｏｎ
ｉｕｍｍｕ１口ｆｌｏｒｕｍ　）から生化学ジャーナル
、第２５５巻、６９４７−６９５３頁、１９８０年に述
べである方法で抽出し、絹製した。実施例２でリシン人
類１（ついて述べたのと同じ方法で酸化反応を行また。

しかしチオール基のＤＴＮＢによるマスクは行っていな
い。

実際ゲロニンの天然のチオール基を用いてゲロニンと抗
体をカップリングさせることはあまり行なわれていない
ので、ｔオール哉は、酸化後、ガン研究（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、）　、　＠　４４巻、１２９−１３３頁、１
９８４年において説明された技術と用いて人工的に導入
しな。過ヨウＸｆ！！ｔナトリウム０．５　Ｍ水溶１１
ｉ２１／ＪＪを１　ｍ４当たｐ　ｌ　ｍｇのグσ二ノを
含む溶液ＩＪにリン酸緩衝溶液中で加え、１Ｍ酢酸でｐ
Ｈを６にした。これを暗所で１６時間４℃に保った。反
応は１Ｍエチレングリコール水溶液を１０５μｅ加えて
終結させた。これを２０℃で４分間保温した後、反応物
を４℃でリン酸緩＾液中において透析した。

３０分間ｔｏ、ｏｏｏｘｙで遠心分離にかけると、ココ
かう２ｍＩ　Ｋ　２．５　ｍ　ｇ／ｒｎｌの酸化ゲロニ
ン２゜９ｍｇ２５ｊ得られた。

リシン＾頽と同じように、ゲロニンの基本的時性はり〆
ソームの６０８サブユニツトの分解によって真核細胞に
おけるタンパク員合成を阻害することである（バイオケ
ミカルジャーナル。

第２０７％、５０５〜５０９頁、１９８２手）。ゲロニ
ンの場合にも過ヨウ素酸酸化による修飾は、活性の損失
を生じさせないことがわがつ九。

１　ゲロニンにおける条物動態学的特性の維持生の、或
いは上述の手続で修飾され次グロ二ノをうさぎの耳の血
管から一回注射した。投与したゲロニンの量は０．３な
いし０．４ｍｇ／に２であった。ヘノ４１）ンの存在下
で血液を時々採取した。

血漿は以下ＲＩＭ−４と略称する放射線免疫試験を用い
て分析した。

この試験はＲＩＭ−１試験と同じ技術を用いる。

ただし＾Ｃ１溶液が本例ではアフィニティークロットグ
ラフィーで絹製された抗ｒロ二ノウサギ抗体溶液である
。＾Ｃ２抗体はＲｊＭ−１試験と同じ抗体を放射性同位
体で標識したものである。

同−標本中の生のゲロニンと修飾したゲロニンの濃度を
それぞれ標本とは異つた既知の濃度の検ｆｆｉ線と比較
することによって決定した。放射標識の技術はＲＩＭ−
１で説明したものと同じである。ＲＩＭ−２試験はＲＩ
Ｍ−１試験と同等の信頼性と再現性を示した。本実験の
結果は実施例２でリシンのＡ＠について示したのと同じ
方法で示す。

図３は生の及び修飾したゲロニンを静脈注射した場合の
血漿中濃度ＩＩＩＩＢ縁を時間の関数として表わしてい
る。生のゲロニンは９９．９９％が２４時間で消失し九
ことから、生のりシン入鎖と同じように血中から非常に
急速に消失することがわかる（臼Ｍｌ）。ゲロニンのポ
リサツカリド単位が酸化されている場合は曲線形が大き
く違う。投与２４時間後に酸化し九ゲロニンのＳ度は生
のゲロニンの３００倍ある（曲線２）。

従つてこれらの結果はりシン入鎖と同じようく、過ヨＩ
７素酸酸化はゲロニンの消失を測るのに用いられる糖鵡
を、この機能を妨げる８度にまで修飾することを示して
いる。

実施例　４ リシン人類を活性化されたジスルフィド基で置換し人間
のＴ、ｌｆｉ廁を阻害する抗体と反応させた抱合体を準
備する。

ａ）大関のＴｉ胞を阻害する抗体（ＴＩＯＩ抗体） この抗体は免疫学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＩ
ｍｒｎｕｎｏｌｏｇｙ　）第１２５　（２）巻、７２５
−７３７ｉ、１９８０年において説明された方法によつ
て準備した。

ｂ）　ｅＲ化されたりシンのＡ鎖 リシンの＾鎖は実施例２で説明した方法によって準備し
た。

■）人間のＴ細胞を阻害する活性化抗体ｌ−エチル−３
−ジメｔルアミノプａピルー３−カルボジイミドを１　
ｍｌ当り６０．３ｍｇ含す溶液２０μ６を３−（ピリジ
ニル−２−ジスファニル）プロピオン酸を１　ｍｌ当り
２０　ｍｇ含む溶液１００μＪＫｔｅｒｌ−ブタノール
中で加え、混合物を３分間室温で放置し九。こうして得
られた溶液６８ｐｅ１ｆｃ、　　ｘｒｒｒｉ当り抗体８
．９ｍｇを含む溶液２ｍｅにリン酸ｉｓ液中で加えた。

この混合物を１５分間３０℃で攪拌し、その後４℃下で
リン酸緩衛液において透析した。次いでタン・ククｊ［
浴液を遠心分離し、活性化抗体を７．９ｍ　ｇ　／　ｍ
　Ａ！のｇ［で１５ｍｇ４た。２−メルカ１トエタ／−
ルとの交換反応によって放出され九ピリジンー２−ｆオ
ンの３４３　ｎｍにおける吸収をみると、この抗体は１
ａｏｌ当り３．８個の活性化された混合ジスルフィド基
を有していることがわかっ之。

Ｉ）持続作用のあるリシン人類を含有する免疫ｍ素の準
備 修飾された＾鎖をｌ　ｍｌ当り２．８７ｒｎｚ含む溶液
２．４６ｍ＃と上述の方法によりて得られた活性化抗体
の溶液ｉ、５ｒｎｔを準備しく濃度７．９ｍｇ／ｍ１Ｈ
ＪａＩち活性化抗体を１１．８ｍｓ：含む）、この混合
物’ｉ２０℃で２０ａｆ閣放置した。この溶液を遠心分
離にかけ、セフ１デツクスＧＩ００ｆ用いてｆ過し、ｎ
ｌ製した。溶出物の光学＠度を２８０ｎｍ″Ｃ測定した
。抗体とＡｄの両方と含む分画を合わせると免疫毒素を
ｔｍｇ当シ０．７　ｍｇ含む溶液ｘｓｍＢ即ち免疫毒素
は１０．５ｒｎｇ）が得られ比０この溶液は抗体とカッ
プリングされｆｃＩ！！Ｉ化Ａ＃Ａをｌ　ｍｌ当り０．
１４ｒｎｇ含有する。

従ってこの方法による平均カップリング度は抗体１ａｏ
ｌにつき酸化＾鎖Ｌ２ｍｏｌである。

上記の方法で得た酸化されたりシン＾ｆｉＡを含む免疫
１＠素ＩＴ（Ａ−Ｌａ）ＴＩＯＩにライて、その桑初動
態学的舛性と標的細胞に対する細胞毒性を調べた。

実施例　５ 本実施例においては、持続作用をもつりシン＾＠を含む
免疫毒素（ＩＴ（＾−Ｌｍ）ＴＩＯＩと略す）の血漿中
濃度がゆっくシと減少するという性質を獲得することを
示す。

■方法 実施例４で説明した手続で１１！傭された抱合体をうさ
ぎの耳の血管に一度注射しな。投与された曽はＡ鎖につ
いて体１ｉｃ　Ｉ　Ｋｐ当たシ０．４１５ｆｆ１ｇであ
る。ヘノタリンの存狂下で二液を時々採血した。血漿を
放射線免疫試験（ＲＩＭ−ｊと略す）によって（２箇所
）分析した。

このｐｔ、験はＲＩＭ−１と同じ技術を用いて行われた
。但しｋｃ２溶液は本試験においてはＲＩＭ−１の技術
を用いてアフィニティークロットグラフィーによりて絹
製され、放射機織され九マウスのｒｇＧを阻害するヤギ
の抗体である。このサンプルにおける修飾された免疫毒
素の濃度＃ｉ既知の異った濃度から導いた検量線を用い
て決定した。ＲｌＡ４−：１賦験はＲＩＭ−１と同じ信
頼性及び再現性を有する□ 比較対照のため、生のりシン人類を活性化され九ジスル
フィド基で置換した抗体の反応から得られたＩＴＴｒｏ
！抱合体と同じ条件下で比較例の試験を行った。この抱
合体の準備と細菌毒性はフランス国時許出ＩＸ第２，５
１６，７９４号で説明した方法によりて行った。これら
の実験結果は実施例２でカップリングされていないＡ鎮
について行ったのと同じ方法で示した。

Ｑ結果 図４はｆＩＰ脈注射されたＩＴＴＩＯＩ及びＩＴ（＾−
Ｌｍ）ＴＩＯＺの血漿中′ａ度曲婦を示している、投与
２４時間後にＩＴ（＾−Ｌｍ）ＴＩＯＩ活性細胞毒素は
ＩＴＴＩＯＩの１４０倍になっていた。この事実は酸化
された＾鎖の薬物動態学的符性は抗体とカップリングさ
れた後も保持されていることを示している。

実施例　６ 本実施例においてはＩＴ（Ａ−Ｌｍ）ＴＩＯＩの標的細
胞に対する細胞＃Ａ素時特性保存について述べる。

リシン人類の基本的な生物学的特性は細胞中のタンパク
質合成ｔす〆ンームの６０８チブユニツトの分解によっ
て阻害することである。

この方法は培養中のガン細胞に１４０で標識したロイシ
ン（以下１４Ｃ−ロイシンをいう）を取シ込ませて研究
されている物質の効果を測定する細胞系を用いる。

用いられる細胞は、抗原Ｔ６５を運ぶ人間のＴ白血病か
ら誘導されるＣＥＭＭ胞系に栖する。

この細胞は目的の物質の存在下で保温した後、細胞への
１４０−ロイシンの取り込みの程度を測定した。この測
定には生物化学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏ（Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　　第
　２４９巻１１号、３５５７−３５６２頁で説明された
、タンノ１り質合成量を測定するのに１４０−ロイシン
のトレーサーを用いる方法によりて行５０取シ込まれた
放射能はろ過した細胞の全体について測定し九〇 定置の基準として紐激／効果［ｉｆｌ線を描くことがで
きる。この白線横軸には目的物質中のＡ鎖Ｏモル１度、
縦軸には、タンパク質倉成を阻害する物質の存在しない
比較細胞における１４０−ロイシンの取り込み１に対す
る百分率をプロットして得られる。

こうしてそれぞれの物質について１４Ｃ−ロイシン取シ
込み１１ｋｓｏ％阻゛与する１度または５０％阻’ｉｌ
！Ｆｉｉ１度（ＩＣ’、、）を決定することができる。

図５は恒温媒体中でｌ　Ｑ　ｍＭ塩化アンモニウムの存
在下でＩ　’ｒ　（＾−Ｌａ）ＴＩＯＩとカップリング
されていないＡｆｉてついて行った同じ実験から曲ａｔ
示している。この図をみると工１゛（＾−Ｌｘ）Ｔ１０
１は同一条件で測定されたカップリングも酸化されてい
ないＡｕＫ比べ約８万倍の非常に強い細胞毒性（ＩＣ，
。−５，５ＸＬＯＭ）を有することがわかる。

実施例　７ 本実施例はクローン原性試験において確認されたＯＥＭ
標的細胞に対するＩＴ（Ａ−Ｌａ　）ＴｌｏｌとＩＴＴ
ｚ０ＩＯａ胞徴性的効能の比較を示す。

免疫ｍ素は標的細胞を一つ一つ破壊する作用と担う。こ
の作用は感度の高い技術を用いて測定することができる
。コ０ニー形成阻害試験によれば、−個の住存細胞を数
百万の死んだ細胞から見い出せるためこの可能性がある
。これは人間のＯＥＭ＋ｊンパ系に応じたグル媒体にお
ける最適な培養条件によって可能になる。

■、コσニー形成阻害試験による細廐毒素の測定技術 クローニングに用いられる媒体はケトグルタル酸ナトリ
ウム１ミリｍｏｌ、オキサロ酢酸ナトリウム１ミリｍｏ
ｌ、５％の不活性仔ウシ血清及び１０％の不活性ウマ血
渭が加えられ九ＲＰＭ１１６４０である。最初に０．３
％の寒天溶液（アガロースｖＩ型、シグマ（ＳＩＧＭ＾
）研兜／ｍ艮）ｔベトリ皿のこの媒体中に薄層のようＫ
して用意し、４℃で凝固させた。細胞は３７℃に保温し
た０、２７５％寒天溶液と混ぜ合せ、それから１＆初の
寒天層上に流し込んで凝固させた。これに用いｆｔ、、
寒天の潤度は、クローニングの効率、コロニーの大きさ
及び媒体の均一性の王者を同時に９遍化する目的で行っ
た予＠ｉＩＩ試験の結果から定めた。恒温に保ってから
１５日後に１自動コロニー計数器（“アルチック″、ダ
イナチック社。

米国）を用いてコロニーを計数した。クローニング効率
、即ち免疫毒素処理で生き残った細胞の正確な数を決定
するには、接種された細胞の数を形成されたコロニーの
数の関数として表す検針線をつくることが大切である。

発明者等はこの検１１線から得られるクローニング効率
は、細胞を免疫′ｉＢＸ処理した場合よくみられるよう
（、死んだね胞が高い割合でｂっても＃響されないこと
を鉦明した。

免疫毒素処理は、１０％の不活性仔りシ血ｒ＃と１０ミ
リｒｒ＋ｏｌＬ１）塩化アンモニウムを含むＲＰＭ１１
６４０媒体の全１１１１１１１＃ｉｃ対してそれぞれ異
った１度のＩＴ（Ａ−Ｌａ）ＴＩＯＩ及びＩＴＴＪｉ１
７Ｊの免疫毒素処理用い、指数的に成長している細胞を
保温することによりて行う。保温は５％の二酸化炭素を
含む雰囲気下で試験管を水平方向く振ること（二二−ブ
ルンスウイツク社“シラトリーＧ−２”攪拌器を用いて
２５００ｒｐｍのベース）ｉＣよって３７℃に保うた。

生存細胞の数が検量線によって最大感度範囲で測定でき
るようＩＣ寒天溶液と混合する前に、細胞を洗浄し、そ
れぞれ異り九希釈にして準備した。結果は次の関係式を
用い、りａ−ユング効率から外挿して生存細胞の絶対数
で表した。生存細胞の絶対数Ｘｄ は次式で表わされる。　８　、ここでＣはベトリ皿１皿
当）のりσ−ンの数、ｄは細胞の希釈因子、Ｂは検ｍｓ
の勾配から求められ九りａ　−ユング効率である。それ
ぞれの値は３回の試験結果の平向をとった□ Ｉ結果 図６は塩化アンモニクムＩＯミリｍｏｆの存在下におけ
る１４Ｍ細胞に対するＩＴ（＾−Ｌａ）Ｔ１０１及びＩ
ＴＴＪｉ７Ｚ免疫毒素の細胞毒性曲線を免疫ｌｌ素の濃
度（Ａ鎖のモル濃度）の関数として表している。これら
２つの毒素の効率は同じオーダーの大きさであることは
明らかである。

刊胞数減少の度合は両者とも大きいが、これは１０”’
ｆ）　Ｍ程度の低い濃度においては残σ生存細胞の割合
は初期値に比べてＯ，ＯＯ１％のオーダーになってしま
うからである。この効果は高度に％異的である。何故な
らこれらの濃度においてはカップリングされていないＡ
＠と非轡異的な免疫毒素は、これらの細胞に対して効果
をもっていないことが証明されたからである。

本実施例によってＩＴ（Ａ−Ｌｍ）ＴＩＯＩは従来のｆ
ＴＴＪ１７７と実質的に同一な時＄４細胞毎性を有する
ことがわかる□ 実施例　８ 酸化されたＡｆＡの動物の体全体への毒物学的時性（免
疫＃Ｓ木の毒性は等モル量における＾鎖と同じオーダー
の大きさである）を調べることは重要である。これはｔ
ヤールズリバーフランスＣＤｒフクスに！脈注射された
酸化＾鎖の半数致装置を生のＡ鎖との比較において決定
することによつて行われる。

その結果を下表に示す。

上の結果Ｆｉ酸化された＾鎖の速性は生のＡ＠より低い
ことを示している。これはへ頌が°酸化によって修飾さ
れるとＡ釧の血漿中濃度は著しく増加するけれども、そ
の毒性は増加するどころか、反対にかなり減少すること
を意味しているＯ 従って修飾された細胞速性サブユニットを包む免疫毒素
は入閣の治療楽として使える。これらの修飾された免疫
連索は、標的細胞が免疫連累をｒ＄儂するのに用いられ
る抗体によって猷別されるようなガンまたはガンでない
病気の治療に用いられる。ｉ＆通な投与量と治療時間は
問題の病気にか゛かった患者とその病気の特質に応じて
定められるべきである。

より一般的な言葉でいえば、糖質単位が過ヨウ素イオン
によって修飾され、対応する修飾のない抗腫％糖タンパ
ク質よシも半減期の長い抗腫燭糖タンノ臂り質は薬とし
て有用だということである。

従ってもう一つの特徴によれば、本発明は糖質単位が過
ヨウ素酸イオンの酸化によつて修飾されている抗−場糖
タンノ々り質が注射好ましくはぎす脈注射に適して形態
１ｃなっている抗ｍ＊薬に関する。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第６図は本発明の抛タンノクク貿の時性を
示す線区である。 出願人代理人　　弁理士　鈴　江　武　彦伍りさ千８月
とつ蛇ｎりしζ 田 １４ｃｍロイシシ／）才す０國） 手続補正書は式） ％式％ １、事件の表示 特願昭６０−２７４８４０号 ２、発明の名称 長期作用型免疫毒素および製造方法 ３、補正？する者 事件との関係　特許出願人 名称　チノフイ ４、代理人 明細書、図面 ７、補正の内容　号・ｌトｉ通・１ ｆ１１　　明細書の浄８（内容に変更なし）。 （２）　　図面の浄書（内容に変更なし）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）チオエーテル基又はジスルフィド基を含む２価の
   共有結合構造を介して抗体又は抗体断片がリボソームを
   不活性化する糖タンパクと結合した包合体からなり、そ
   の炭水化物単位が過ヨウ素酸イオンによる酸化により変
   性されていることを特徴とする長期作用型免疫毒素。 （２）チオエーテル基又はジスルフィド基を含む２価の
   共有結合構造を介して抗体又は抗体断片がリボソームを
   不活性化する長期作用型糖タンパクと結合した包合体か
   らなり、該長期作用型糖タンパクがリボソームを不活性
   化する糖タンパク（そのチオール基を適宜保護して）を
   過ヨウ素酸アルカリ金属塩の水溶液で０〜１５℃で、光
   の不存在下で０．２〜２４時間処理して得られたもので
   あることを特徴とする長期作用型免疫毒素。 （３）下記一般式、 Ｐ′−Ｗ−ＧＰＩＲ−１ａ′ （式中、Ｐ′は抗体または抗体断片であるタンパクＰの
   ラジカルで他の官能基が適宜ブロックされ、ＧＰＩＲ−
   １ａ′はリボソームを不活性にする糖タンパクであり、
   その炭水化物単位が過ヨウ素酸イオンで酸化変性された
   タンパクＧＰＩＲ−１ａのラジカルを表わし、Ｗはチオ
   エーテル基またはジスルフィド基を含む２価の共有結合
   構造であってイオウ原子がＰおよびＧＰＩＲ−１ａのシ
   スティンか、又はＰ又はＧＰＩＲ−１ａのいずれかに属
   する官能基を有する介在基を介してＰ又はＧＰＩＲ−１
   ａに属する基に結合していることを特徴とする長期作用
   型免疫毒素。 （４）下記一般式、 Ｐ′−Ｗ−ＧＰＩＲ−１ａ′ （式中、Ｐ′は抗体または抗体断片であるタンパクＰの
   ラジカルで他の官能基が適宜ブロックされ、ＧＰＩＲ−
   １ａ′はリボソームを不活性にする糖タンパクであり、
   そのＧＰＩＲ−１ａ′がリボソームを不活性化する糖タ
   ンパク（そのチオール基を適宜保護して）を過ヨウ素酸
   アルカリ金属塩の水溶液で０〜１５℃で、光の不存在下
   で０．２〜２４時間処理して得られたものであり、Ｗは
   チオエーテル基またはジスルフィド基を含む２価の共有
   結合構造であってイオウ原子がＰおよびＧＰＩＲ−１ａ
   のシスティンか、又はＰ又はＧＰＩＲ−１ａのいずれか
   に属する官能基を有する介在基を介してＰ又は ＧＰＩＲ−１ａに属する基に結合していることを特徴と
   する長期作用型免疫毒素。 （５）下記一般式で表わされる免疫毒素。 Ｐ′−Ｗ′−ＧＰＩＲ−１ａ′ （式中、Ｐ′およびＧＰＩＲ−１ａ′は特許請求の範囲
   第３項の場合と同じ。Ｗ′は下記群から選ばれる共有結
   合構造を示す。 （ａ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｃ）−Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）＿
   ｎ−（ｄ）−（Ｚ′−Ｙ′Ｅ′）＿ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｙ
   −Ｚ−、（上式中、ＺおよびＺ′はＧＰＩＲ−１ａおよ
   びＰに属する原子団を示し、１つのチロシン残基の水酸
   基に由来する酸素原子、ＧＰＩＲ−１ａとＰのグルタミ
   ン酸およびアスパラギン酸またはそのいずれかの末端な
   いし遊離カルボキシル基の１つに由来のカルボニル基、
   Ｐの糖鎖を過ヨウ素酸で酸化したあと得られるジアルデ
   ヒド構造に由来の基、および１つのリシン残基のε位の
   アミンの１つ若しくはＧＰＩＲ−１ａとＰの末端アミン
   の１つに由来の−ＮＨ−基から選ばれる。上記（ｂ）、
   （ｃ）の共有結合構造体のＺはＰの糖鎖構造の一つの酸
   化により得られるジアルデヒド構造から生ずる基。 ＥおよびＥ′は不活性な介在分子を示す。 そして、ｎは０または１である。） （６）下記一般式で表わされる免疫毒素。 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−１ａ′）ｍ （式中、ｍは０．３ないし１２の数値、Ｐ′は抗体また
   は抗体断片であるタンパクＰのラジカルで他の官能基を
   適宜ブロックしたもの、Ａ−１ａ′はシスティン１７１
   および２５７のチオール基の少なくとも一つを保護した
   リシンＡ鎖を過ヨウ素酸アルカリ金属水溶液で０〜１５
   ℃、光不存在下で０．２〜２４時間処理し、チオール基
   の脱保護をおこなうことにより得られるリボソーム非活
   性化糖タンパクのラジカルを示し、Ｗ′は下記群から選
   ばれる共有結合構造を示す。 （２）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｂ）▲数式、化学式、表等があります▼ （ｃ）−Ｚ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｓ−（Ｅ′−Ｙ′−Ｚ′）＿
   ｎ−（ｄ）−（Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′）＿ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｅ−
   Ｙ−Ｚ−（式中、Ｚ、Ｚ′、Ｙ、Ｙ′、Ｅ、Ｅ′および
   ｎは特許請求の範囲第３項と同じ） （７）一般式 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−１ａ′）＿ｍ （式中、Ｗ′およびＡ−１ａ′は特許請求の範囲第６項
   と同様、Ｐ′は抗体断片Ｆａｂ又はＦａｂ′、ｍは０．
   ３〜２である。） で表わされる特許請求の範囲第６項記載の免疫毒素。 （８）一般式 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−１ａ′）＿ｍ （式中、Ｗ′およびＡ−１ａ′は特許請求の範囲第６項
   と同様、Ｐ′は抗体断片Ｆ（ａｂ′）＿２、ｍは０．５
   〜４である。） で表わされる特許請求の範囲第６項記載の免疫毒素。 （９）一般式 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−１ａ′）＿ｍ （ただし、Ｐ′はＩｇＧタイプの抗体、ｍは０．５〜６
   である。） で表わされる特許請求の範囲第６項記載の免疫毒素。 （１０）一般式 Ｐ′（Ｗ′−Ａ−１ａ′）＿ｍ （ただし、Ｐ′はＩｇＭタイプの抗体、ｍは１〜１２で
   ある。） で表わされる特許請求の範囲第６項記載の免疫毒素。 （１１）ジスルフィド又はチオエーテル結合を直接又は
   分圧原子団を介して抗体又は抗体断片と糖タンパクとの
   間に形成させ、その糖鎖単位を過ヨウ素酸イオンで酸化
   修飾させたことを特徴とするチオエーテル基又はジスル
   フィド基を含む２価の共有結合構造を介して抗体又は抗
   体断片がリボソームを不活性化する糖タンパクと結合し
   た包合体からなり、その炭水化物単位が過ヨウ素酸イオ
   ンによる酸化により変性されていることを特徴とする長
   期作用型免疫毒素の製造方法。 （１２）抗体と、リボソーム不活性化糖タンパクとの間
   にジスルフィド又はチオエーテル型の共有結合を有する
   長期作用型免疫毒素の製造方法であって、糖タンパク（
   そのチオール基を適宜保護して）を過ヨウ素酸アルカリ
   金属塩の水溶液で０〜１５℃で、光の不存在下で ０．２〜２４時間処理して得るようにしたことを特徴と
   する方法。 （１３）タンパクＰ＿１（リボソーム不活性化長期作用
   型糖タンパク、ＧＰＩＲ−１ａ又は抗体もしくは抗体断
   片であって、遊離チオール基が直接又は介在原子団を介
   して結合したもの）を水溶液中、室温でタンパクＰ＿２
   （Ｐ＿１と異なり、リボソーム不活性化長期作用型糖タ
   ンパク、ＧＰＩＲ−１ａ又は抗体もしくは抗体断片であ
   ってタンパクＰ＿１の遊離チオール基と結合し得る基を
   有するもの）と反応させ、チオエーテル又はジスルフィ
   ド結合を形成させることを特徴とする特許請求の範囲第
   ４項記載の免疫毒素の製造方法。 （１４）一般式 Ｐ＿１′−（Ｚ−Ｙ−Ｅ）＿ｎＳＨ　（IV）のタンパク
   を一般式 Ｐ＿２′−Ｚ′−Ｙ′−Ｅ′−Ｇ　（Ｖ） のタンパクと反応させることを特徴とする特許請求の範
   囲第５項記載の免疫毒素の製造方法。 （ただし、式中Ｐ＿１′およびＰ＿２′はこれらタンパ
   クに属する基に結合されたタンパクＰ＿１およびＰ＿２
   のラジカル、又はＰ＿１およびＰ＿２が抗体もしくは抗
   体断片であるときは過ヨウ素酸との反応により糖鎖核の
   開鎖により生じたタンパクＰ＿１およびＰ＿２のラジカ
   ル、Ｚ、Ｚ′、Ｙ、Ｙ′、Ｅ、Ｅ′は前記同様、Ｇは ▲数式、化学式、表等があります▼又は−Ｓ−Ｓ−Ｘ （ただし、Ｘは活性化基） である） （１５）一般式 ＧＰＩＲ−１ａ″−Ｏ−ＣＯ−Ｅ−Ｇ　（IX）で表わさ
   れる免疫毒素。 （ただし、ＧＰＩＲ−１ａ″はＧＰＩＲ−１ａ又はチロ
   シンのフェノール水酸基の１以上を除去する官能基の修
   飾によりＧＰＩＲ−１ａから得られる分子であり、酸素
   原子がＰ＿２″ラジカルから除かれたフェノール水酸基
   に属するものであり、Ｅは不活性介在構造であり、Ｇが ▲数式、化学式、表等があります▼ 又は−Ｓ−Ｓ−Ｘ（ただし、Ｘは活性化基である）であ
   る。）