JPS6156198A - イオノフオアと高分子とをカツプリングさせた包合体およびその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ この発明は、一価カルボキシルイオノフォアが共有結合
で高分子と結合している新規な包合体に関し、また、抗
毒素増強剤として前記包含５一 体を適用することにも関する。

さらにこの発明は、前記包合体合成時の中間体としての
活性型イオノフオアにも関する。

〔従来技術とその問題点〕

フランス特許第８２１０２０９１号として提出された以
前の特許出願において、出願人は抗毒素を増強させるカ
ルボキシルイオノフオアの効力について開示している。

「抗毒素」とは、細胞傷害性タンパク（例えば、リシン
のＡ鎖）と、傷害をうける細胞に存在する抗原に対する
抗体または抗体フラグメントとを共有結合させて得られ
る抗腫瘍物質を意味する言葉である。

そのような抗毒素は、特にフランス特許第７８／２７８
３８号並びにその追加特許第７９／２４６５５号および
第８１１０７５９６号さらに第８１／２１８３６号に開
示されている。あ・る種の状況下ではイオノフオアの増
強作用を効果的に利用することができた。特にこのイオ
ノフオアは次のような場合に良好な結果をもたらす。抗
毒素が、選択的細胞傷害剤として標的細胞を崩壊させる
ために生体内で使用される場合。さらにその抗毒素が、
細胞傷害剤として白血病患者の骨髄の治療に用いられ、
その患者にこの方法で処理した骨髄を再び移植する場合
。宿主に対する骨髄の同種移植の反応と関連した疾病を
防ぐ目的で、その抗毒素がその移植組織中のＴ細胞数を
減少させるために用いられた場合もある。

ところが、抗毒素を治療薬としてヒトの体内に投与する
場合、増強効果を期待してのイオノフオアの生体内使用
には、おのずと限界がある。

すなわち、イオノフオア特有の毒性、腹腔内投与に適し
た溶媒に対する低い溶解性、および血中からの急速な消
失である。

〔問題点を解決するための手段〕

この発明に基づくと、前記のカル？キシルイオノフオア
の代りに、一価のカルポキシルイオ？　　　　ノフォア
が高分子と共有結合で結合した包合体を用いることによ
って、上記の欠点をことごとく解決し得ることが見い出
された。上記の高分子の例を挙げると、抗体、抗体のフ
ラグメント、タンノやり、ペプチド、または抗体とタン
パクの共有結合により得られる混成高分子である。

この発明の第１の態様によれば、新規な生成物である包
合体（混成合成分子）が提供される。

この包合体は、一価カル？キシルイオノフオアと高分子
（抗体、タンパク、ペプチドリガント等）との共有結合
により形成される。この明細書において、このような包
合体をイオノフォア包合体と称する。

この発明で用いるイオノフオアは、既知の分子であり、
特にストレプトマイセス属の様々な株から単離された天
然物である。それは、炭化水素を骨格として酸素の入っ
た複素環を営む。

そして必ず分子鎖の一端にカル？キシル基が付いており
、他端には１つ以上のアルコール基が結合している［Ｂ
、Ｃ，プレスマン、生化学年鑑、４５、５　（＋　１．
−５３０　（１９７ｆｉ））。これらの天然物は、それ
らから誘導されるある種の半合成化合物と同様に、イオ
ン透過活性を有している。その活性とは、金属イオンを
親水性の相から親油性の相（両相は混合不可能である）
へ移送させる力価である。

高分子としては、抗体（または抗体のフラグメント）、
タンパク（−２ゾチドホルモンまたはヒト血清アルブミ
ンのようなヒトタンパク）、ペプチドリガント（天然ま
たは合成ポリペプチド、特にポリリシン）を使用し得る
。尚、抗体とタンパクとの共有結合により得られる混成
高分子も使用し得る。抗体を使用する場合には、動物を
従来の方法で免疫するなら、ＪＩＪクローン性の抗体が
得られるであろうし、リンパ球と骨髄腫細胞との融合に
より得られるノ・イブリド細胞のクローンを利用するな
ら、モノクロナール抗体が得られるであろう。

このようが抗体は、特定抗原の認識能を有する完全な免
疫グロブリン分子の形で使用されることもあるが、これ
らの免疫グロブリン分子のいかなるフラグメント（特に
は、Ｆ（ａｂ’）２．ＦａｂおよびＦａｂ’として知ら
れているフラグメント）の形で使用されてもよい。

高分子とイオノフオアとの化学結合は様々な方法を用い
て実施できるが、ここで１つの方法を取上げてみる。そ
の方法では、まず第１に、包合体成分の各生物学的活性
が維持され、次に十分な再現性と高い結合収率が保証さ
れ、尚イ凄Ｉられる包合体中のイオノフオアと高分子の
比率を調節することができ、そしてさらに安定でかつ水
溶性の生成物ができることが条件となる。

これらの条件にかなうあらゆる化学結合法の中から、結
合を形成するために１つ」ン、上のチオール基が関与す
る方法を選ぶこともできる。この場合、結合される化合
物の１つに化学的に導入されたチオール基を利用するこ
とができ、またチオール基と反応し得る１つ以−ヒの原
子団を他の化合物の中に導入することもできる。その際
、反応は−■５ないし９の水性媒質中にて３０℃を越え
ない温度で行なわれ、安定で確実な共有結合が形成され
る。例えば、チオール基を、イオノフオアのアルコール
基の１つをアシル化しく４［るＳ−アセチル−メルカプ
トコノ・り酸無水物との反応により、イオノフオア中へ
化学的に導入し得る。続いて、アセチル保護基を取り除
くために、ヒドロキシルアミンと反応させてチオール基
を露出させることもできる。この方法は「生化学と生物
物理に関する総説」１１９巻、４１−４９頁、１９６７
年に記載されている。

イオノフオアとしては、モネンジン、ナイジェリシン、
グリソニキシンおよびラサロシドが適している。特に好
ましいものとしては次の式で表わされるモネンジンとナ
イジェリシンが挙けられる。

と　　　　　　　　” 上記のイオノフオアを次の式で表わされるＳ−アセチル
メルカプトコハク酸無水物と反応させて、チオール基を
化学的に導入する。

この反応によフ、イオノフオアに付いている水酸基の１
つ（モネンジンおよびナイジェリシンの場合は１級水酸
基）とアセチルコノ・り酸との間にエステル結合が形成
され、次の式の化合物が生じる。

ＣＨ２Ｃ００Ｈ ここで、Ｉｏは水酸基の１つ（モネンジンおよびナイジ
ェリシンの場合は１級水酸基）が除かれたイオノフオア
の残基を表わす。上記化合物についた保護基をはずす。

その結果、次の式の生成物が得られる。

ＣＨ２Ｃ０ＯＨ ここで■０は先に定義したとおりであり、結合反応にそ
のま１使用し得る。前記の活性型イオノフオアは次の一
般式で表わされるが、新規な化合物であり、この発明の
もう１つの構成要素である。

ＣＨ２Ｃ００Ｈ （ここでＷは水素またはアセチル基である。）化合物　
ｌｏ−Ｏ−Ｃｏ−Ｃ）Ｔ ＣＨ２Ｃ０ＯＨは以後Ｉ′で表示し、 結合型イオノフオアを意味する。

高分子とのカップリングは、化合物Ｉおよび■のどちら
かを用いて実施することができるが、そのカップリング
は化合物■を用いた方がより速く進む。そのためそれを
使用する方が望ましい。こうして、高分子とのカップリ
ングを行なう。その高分子には、チオール基と共有結合
し得る１つ以上の原子団が導入されている。この共有結
合は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合であっ
てもよい。

ジスルフィド結合 この場合、包合体の調製は次式で表わし得る。

ＩＳＨ＋Ｐ−Ｒ−８−８−Ｘ　−＋　ｌ−８−８−Ｒ−
Ｐ　＋　ＸＳＨここで、■はカップリングされるイオノ
フオアを、Ｐは修飾される高分子を示し、−５−Ｓ−Ｘ
は活性化された混成ジスルフィド原子団（Ｘは活性基）
を表わす。活性型イオウ原子によって置換される高分子
は、活性型イオウ原子を有する試薬によるその高分子自
体の置換反応により得られる。これは次の式で表わされ
る。

Ｐ　＋　Ｙ−Ｒ−８−８−Ｘ−＋Ｐ−Ｒ−８−８−Ｘこ
こで、Ｐは修飾される高分子であり、Ｙは試薬をタンパ
クに共有結合させる基を、Ｒは置換基であるＹと−５−
Ｓ−Ｘ　　を−緒に運ぶことができる基を表わす。そし
てＸは活性基を示す。

ｔ　　　　　官能基Ｙは、置換を受けるタンパクの構成
アミノ酸の側鎖についているいかなる基とも共有結合し
得る基である。これらの基の中で、タンＡ？り質を構成
しているリシン残基の末端アミノ基が特に好ましい。と
りわけ、Ｙは次のように表わせる。

（イ）　カルがジイミドのようなカップリング試薬およ
び】−エチル−３−ジエチルアミノゾロビル−３−カル
ボジイミドのような特に水に溶けやすい誘導体の存在下
で、タン・ヌクのアミノ基と結合するカルボキシル基。

（ロ）　アミン基をアシル化するために、そのアミン基
と直接反応し得る塙化カルボン酸。

（ハ）オルト−ニトロフェニル着シ〈はノやラーニトロ
フェニルエステルマタはジニトロフェニルエステルのよ
うないわゆる活性型エステル。またはアミノ基をアシル
化するためにそのアミン基と直接反応するＮ−ヒドロキ
シコハク酸イミドエステル。

に）　アミド結合を形成させるためにアミン基と容易に
反応する無水コハク酸のような・ソヵルボン酸の分子内
無水物。

（ホ）　次式で示されるイミドエステル基。

ここでＲ１は、次の式に従がって高分子のアミノ基と反
応するアルキル基。

一一→タンパク→旧−Ｃ−Ｒ２＋０ＨＲ１前記の原子団
−５−Ｓ−Ｘ　は、保護されていないチオール基と反応
し得る活性化された混成ジスルフィドを示す。特に、混
成ジスルフィド中でＸは、１つ以上のアルキル、ハロゲ
ンまたはカルボキシル基によって任意に置換されたピリ
ジン−２−イルまたはピリジン−４−イル基を示すこと
がある。

前記のＲ基は、置換基Ｙおよび−Ｓ−５−Ｘ　を同時に
運び得るいかなる基をも表す。それは、一連の反応中に
使用される反応物質と合成された生成物を分解する可能
性のある基が含まれないように選択されねばならない。

特に、Ｒ基は（ＣＨ２）ｎ基（ｎは工ないし１０）であ
るが、または原子団Ｒ３−δＨ−ｃＨ−Ｒ４であり得る
。ここでＲ４は水素または炭素原子１ないし８のアルキ
ル基うな、連続して用いられる反応物質に対して不活性
な置換基を示す。ここでＲ５は、炭素数１ないし５０厘
鎖または分枝アルキル基、特に第３ブチル基を表わす。

化合物Ｙ−Ｒ−８−８−Ｘと高分子Ｐの反応は均質な液
相、最も一般的には水または緩衝液中で実施される。反
応物質の溶解度に問題があるならば、アルコールや特に
第３ブタノールのような水と混合し得る有機溶媒を体積
比で３０係まで、反応媒質中に加えることができる。反
応は、室温にて数分から２４時間筐での時間を経て進行
する。その後、低分子量の生成物特に過剰の反応物質を
透析により除去することができる。この工程により、高
分子１分子あたり１ないし５０の置換基を導入すること
が可能になる。このような化合物を使用すれば、高分子
とイオノフオア−とのカップリングを、この２つの化合
物を水溶液中へ加えて行ない得る。このときの温度は３
０℃を趙えず、反応時間は数分から１日である。反応の
終わった水溶液は、低分子量の生成物を除去するために
透析にかけられる。

チオエーテル結合 この場合、前もってマレイミド基が導入されたタンノｆ
りＰとｌ−８）Ｉとを反応させることにより、包合体を
調製する。この反応は次式で表わされる。

ここで２は炭素原子１ないし１０を含む脂肪族または芳
香族の介在基を示す。マレイミドで置換されるタン・（
りＰは、マレイミド基を有スる試薬によりタンパク中に
含捷れるアミノ基を置換してタン・ギク自体から得られ
る。反応は次式のとおりである。

ここでＹは次のいずれかである。

（イ）　カルブキシル基。この場合、カルｙｙｙイミド
のようなカップリング試薬および１−エチル−３−ジエ
チルアミノプロビル−３−カル？ジイミドのような特に
水に溶けやすい誘導体の存在下でカルブキシル基を活性
化したのち、反応を進行させる。

（ロ）　オルト−ニトロフェニルｉ　Ｌ　＜　＋！パラ
ーニトロフェニルエステルまたはジニトロフェニルエス
テルのようないわゆる活性型エステル。またはアミノ基
をアシル化するためにそのアミノ基と直接反応するＮ−
ヒドロキシコハク酸イミドエステル。

そのような試薬の調製法は、特にＨｅｌｖｅｔｌｃａＣ
ｈｌｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　５８．５３１−５４１　（
１９７５）に記載されている。同じ部類に属する他の試
薬は、市販品として手に入る。

との反応は均質な液相、最も一般的には水または緩衝液
中で進行する。反応物質の溶解度に問題があるならば、
アルコールや特に第３ブタノは、室温にて数分から２４
時間までの時間間隔で進行する。その後、低分子量の生
成物特に過剰の反応物質を透析により除去することがで
きる。この工程により、高分子１分子あたり工ないし５
０の置換基を導入することが可能になる。

このような化合物を使用すれば、高分子とイオノフオア
〜とのカップリングは、この２つの化合物を水溶液中へ
加えて行なわれる。このときの温度は３０℃を越えず、
反応時間は数分から１日である。反応の終わった水溶液
は、低分子ｔの生成物を除去するため透析にかけられ、
続いて既知の様々な方法によって包合体を精製すること
ができる。

この発明の第２の態様によれば、抗簿素増強剤としての
イオノフオア包合体の使用法が提供される。この発明は
、同様に、少なくとも１つの抗毒素および少なくとも１
つのイオノフオアが関与する医療にも関連性をもつ。

イオノフオア包合体に関してなされた研究によれば欠の
点が明らかにされている。

（イ）　イオノフオアの増強効果は、高分子とカップリ
ングされた後に発現する。イオノフオアを高分子と結合
させると、イオノフオアが水性媒質によく溶けるように
なる。それによって生成物の生体内投与が容易になる。

（ロ）イオノフオアを高分子に結合させると、イオノフ
オアの血中半減期がかなり伸びる。このことは生体内で
増強効果を持続させるために重要である。

（ハ）　包合体の毒性はイオノフオア単独のものより低
い。

さて、臨床面での効果を期待した場合、標的細胞に対す
る少なくとも２つのエフェクターが重要な問題となる。

第１には、細胞傷害性タンノｌり（例えばリシンのＡ鎖
）が挙げられる。これはいわゆる抗毒性包合体に取込ま
れる細胞に傷害を与えるエフェクターである。第２には
イオノフオア−（例えばモネンジン）が挙けられる。こ
れはいわゆるイオノフオア包合体に取込まれる抗毒素を
増強させる成分である。

イオノフオアが、標的細胞の表面にあるレセプターに対
応した高分子と結合された場合（例えば、その高分子が
、傷害をうける細胞集団に特異的な抗原を認識する抗体
または抗体のフラｔ　　　　グメントであって、その抗
原は抗毒素しこより認識されるものとは異なっている場
合）、若しくはイオノフオアが、傷害を受ける細胞表面
上のレセプターに対応した被デチドホルモンと結合され
た場合、問題となっている両方の標的が、非標的細胞の
表面に共に存在する確率は、きわめて低い。そのため抗
毒素が及ぼす細胞傷害の特異性を増加させるための非常
に強力な方法が提供される。

〔実施例１〕 活性型ジスルフィド基により置換されたＴ２９−３３抗
体と、チオール基が導入されたモネン・シンとの反応に
より得られたイオノフォア包合体。

ａ）　Ｔ２９−３３抗体 この抗体は、ヒト白血病のＴ２Ｏ０抗原を標的としたモ
ノクロナール抗体である。この抗体は、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ、　、　１５２．８４２（１９８０）に記載されて
いる。これは、ヘプリテク社（米国カリフォルニア州す
ンジエゴ）から市販品として入手できる。

ｂ）活性型Ｔ２９−３３抗体 前もって第三ブタノールに溶解しておいた３−（１：’
りジン−２−イルジスルフアニル）テロピオン酸３〜お
よび１−エチル−３−ジメチルアミノプロピル−３−カ
ルビジィミド１．８〜を含む溶液を、抗体１０〜層（す
なわち０１３３μｍｏｔ）を含むＴ２９−３３抗体溶液
２＋ｄＫ加えた。

混合物を１５分間３０℃で攪拌し、続いてｐ［（７の１
２５ｍＭリン酸緩衝液に対して連続的（５００ｍｌ！／
時で４０時間）Ｋ透析した。透析後、タンパク溶液を遠
心し、１−当り修飾された抗体６．６ダを含む溶液２．
５−を得た。２−メルカプトエタノールの交換反応によ
り放出されるピリジン−２−チオンを３４３　ｎｍでの
分光測光による分析から、得られた抗体は、抗体１分子
当９７．２個の活性基を有していることが分かった。

Ｃ）活性化モネンジン 甥 市販品のモネンジンを使用した。それを以下のとおりに
修飾した。モネンジン６９３Ｉｎｇをクロロホルムに溶
かし、続いて無線Ｓ−アセチル反応媒質を真空中で蒸発
乾固させ、残渣を酢酸エチルに加え、混合物を水で徹底
的に洗った。

それから有機相を真空中で蒸発させた。生成物に、真空
乾燥後結晶として得られた。それをＮＭＲスペクトルお
よび質量スペクトルにより同定した。このようにして得
られた生成物（Ｓ−アセチル活性型モネンジン）は上述
のｍ式で表わされる。この式中、Ｉｏは一般水酸基が除
かれたモネンジン残基を示し、Ｗはアセチル基を示す。

アセチル基は、終濃度５０ｍＭのヒドロキシルアミンと
の反応によって除去される。こうして得られた生成物は
、上述のｍ式の化合物（式中、■０は一般水酸基が除か
れたモネンジン残基を示し、Ｗは水素を示す。）に相幽
するが、カップリング操作に直接使用され得る。しかし
、次の段階にて、Ｓ−アセチル活性型モネンジンおよび
活性型抗体の存在下においてチオール基の保護をはずし
ておくことが望ましい。

ｄ）イオノフオア包合体の調製 Ｓ−アセチル活性型モネンジン８■（９μｍｏｔ）を第
３ブタノールの最少量に溶解し、その溶液をｐＨ７の１
２５ｍＭＩＪン酸緩衝液中に活性型抗体６６＃／ｄ（す
なわち０．１１　Ａｍｏｌ　）を含む溶液に加えた。さ
らにＩＮヒドロキシルアミン溶液１２５μ！を加えた。

それを２５℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液
（リン酸１０ｍＭ、塩化ナトリウム１４０ｍＭ、ｐＨ７
，４）に対して透析して過剰の反応物質を除去し、反応
媒質を精製した。透析と遠心により、ＩｇＧ　Ｔ２９−
３３を５６ｍｙ／ｍｔ含む溶液２．８−を得た。それに
は、抗体１分子当カ平均７分子のモネン・シンが結合し
ていた。

〔実施例２〕 抗−Ｔ６５抗毒素の増強。

上記の方法で得られたこの発明の包合体のも胞培養液中
に存在する抗−Ｔ６５抗毒素の活性をどの程度増強させ
るかについて調べられた。こ−の標準細胞として、Ｔ６
５およびＴ２Ｏ０抗原を通常布するＯＥＭヒトリンノ４
芽球様細胞系が用いられた。Ｔ６５抗原は、ここで使用
される抗毒素の標的であるが、この標準細胞の第１の標
的抗原である。この抗毒素は、フランス特許第８１／２
１８３６号の明細書中に記載されているものである。Ｔ
２Ｏ０抗原は、イオノフオア包合体の標的であるが、こ
の標準細胞の第２の標的抗原と言えよう。

標的細胞のタンｉ４り合成を阻害することが、抗毒素の
基本的な性質なので、培養腫瘍細胞への１４Ｃ−ロイシ
ンの取込みを調べてその抗毒素の影響を測定する試験が
採用された。この測定は、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ！ｇｔｒｙ、　２４９（１
１）、３５５７−３５６２　（１９７４）に記載されて
いる方法を応用した手法により実施した。すなわちタン
パク合成の程度を測定するためにトレーサー１４Ｃ−ロ
イシンを用いた。ここでは、濾過して得られた全細胞に
取込まれた放射線活性を測定した・このような測定から
、試験物質のＡ鎖のモル濃度を横軸に、１４Ｃ−ロイシ
ンの取込み量を縦軸にプロットして、投与量効果曲線を
作製することができる。１４０−ロイシンの取込み量は
タンパク合成に影響を与えないいかなる物質も存在しな
い対照細胞に取込まれる量のノ４−セントとして表示し
た。この曲線から、各試験物質に対して１４Ｃ−ロイシ
ンの取込みを５０％阻害する濃度すなわち５０係阻害濃
度（工Ｃ３ｏ）を決定することが可能である。

様々な実験を以下の方法に従って実施した。

得られた実験結果を第１図に示す。

ａ）引用文献中で使用されている撫癒薫抗−Ｔ６５を様
々な濃度で加えたＣＥＭ細胞を１８時間インキ−ベート
した。続いてその細胞に放射線活性をもつトレーサーを
取込ませた。工Ｃ５ｏは２．８×１０＝”　Ｍ　（曲線
１）であったが、これは細胞が抗毒素の影響に対して正
常な感受性を有することを示している。

ｂ）様々な濃度の抗毒素と以下の物質それぞれの混合物
の存在下でＣＥＭ細胞を３７℃にて１８時間培養した。

０物質中：５０ｎＭの遊離モネンジン（曲線２）。

０物質（ｉｉ）　：すでに記述したイオノフオアを包合
した抗−２００、濃度は１０　Ｍ（モネンジンに関して
７０ｎＭ）（曲線３）。

モネンジンおよびイオノフオア包合体が、ここでの範囲
の濃度では使用された細胞に傷害をもたらさないことを
実験に先立って調べた。得られた■Ｃ５ｏ値は、それぞ
れ５０ｎＭモネンジンでは２．４Ｘ１０−　　Ｍ、１０
　　Ｍイオノフオア包合体では１．４Ｘ１０−　　Ｍで
あった。

これらの結果から、調べられた一連の物質は著しい抗毒
素増強作用を発揮することが分かった。すなわち係数と
して、濃度５０　ｎＭのモネンジンでは１０００倍、濃
度１０−８Ｍ（モネンジンに関して７０ｎＭ）のイオノ
フオア包合体では２０００倍であった。

〔実施例３〕 活性型ジスルフィド基で置換した３Ｅ１０抗体とチオー
ル基を導入したモネンジンとの反応により得られたイオ
ノフォア包合体。

ａ）　３Ｅ１０抗体 この抗体は、ヒト細胞膜抗原に対するモノクロナール抗
体である。その抗体は、リンｉｊ球と増殖性を抑えたヒ
ト黒色＠　ＳＫ　ＭＥＬ　２８細胞［Ｗｏｏｄｂｕｒｙ
　Ｒ，Ｇ、　ＢＴＡＬ、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｅｉ、。

７７、２１８３−２１８６（１９８０）］との融合細胞
から得うれる。このハイプリドーマをクローン化し、動
物の腹腔内で増殖させた。抗体が腹水中で生産され、そ
れをタンノ卆りＡのセファロースにより精製した。

ｂ）抗−３Ｅ１０活性型抗体 この抗体は、実施例１で述べた手法により得られた。す
なわち抗体１分子当たり８分子の活性基を有する抗体３
Ｅ１０が１９５〜得られた。

Ｃ）活性型モネンジン モネンジンを実施例１で記載した方法により活性化した
。

ｄ）イオノフオア包合体の調製 Ｓ−アセチル活性型モネンジン９１■（１０４Ｃμｍｏ
ｔ）を最少量の第３ブタノールに溶解した。

それを、−７の１２５　ｍＭリン酸緩衝液中に抗体３、
９　ｍｙ／ｍｅ　（１，３μｍａｔ）を溶かした溶液５
０−に加えた。さらにＩＮヒドロキシルアミンｍａ２５
ｍｔを加えた。それを２５℃で２時間インキュベートし
、ＰＢＳ緩衝液（リン酸１０ｍＭ、塩化ナトリウム１４
０ｍＭ。

ｐＨ７，４）に対して透析して過剰の反応物質を除去し
、反応媒質を精製した。透析と遠心によりＩｇＧを３７
〜勺含む溶液２．８　ｍｌを得た。それには、抗体１分
子当り平均８分子のモネンジンが結合していた。

〔実施例４〕 ３Ｅ１０／モネンジン包合体の毒性。

３Ｅ１０／モネンジン包合体の生体内での生物学的特性
を調べた。さらに詳しく、その毒性およびその薬物動態
を遊離モネンジンのそれと比較した。遊離モネンジンの
宿性をマウスで調べた。静注後の５０係致死量は４≠ｇ
であり、１匹のマウス当り８０μＩであった。

包合体の毒性もマウスに単独で静注して調べた。生成物
を次下の投与量で各群のマウスに静注した・包合体量と
しては、３．７　ｍ＋２．１．８５１ｖ。

０．９５２１Ｎｇおよび０４９６■、これをモネンジン
量に換算すれば、それぞれ１６３μ、９，８１．５μ５
１４０．７５μＩおよび２０４μｇである。どの群のマ
ウスも死亡しなかった。

〔実施例５〕 ３Ｅ１０／モネンジンの薬物動態。

雌のヌードマウスを対象として、実施例３に記載したイ
オノフオア包合体の薬物動態を検討した。マウスには次
の物質を注射した。

０３．７■／−のイオノフオア包合体（結合モネンジン
１６３μｙ）を含む溶液１−０ ０遊離モネンジン１６３μＩ（対照群）。

時間をおいて、２匹のマウスの血漿を採取した。

活性型モネンジンは、血漿を希釈することによりその血
漿中に検出された。また、活性型モネンジンは、タンパ
ク合成の阻害を調べる試験において遊離モネンジンに対
する標準曲線（実施例１に記載）と比較すると、その血
漿中に検出された。

測定は、抗−６５抗毒素の存在下でＯＥＭ細胞を対象に
して行なわれた。結果を第２図に示すが、そこでは、時
間を横軸に、μｇ／−で表わしたモネンジン濃度を縦軸
にプロットした。

これらの結果から次のことが分かる。

１）遊離モネンジンは血漿中に検出され得なかった。た
だし、時間Ｏの時には、５Ｘ１０　　Ｍすなわち約０．
５１１ｇ／ｍｌが検出された。これはマウスの全血に投
与された量の０．００７１に相当する。

２）包合体は、少なくとも８時間、１０μｇ／ｍｌのオ
ーダーすなわち約１×】ＯＭの濃度で検出された。２４
時間後でさえも、１．５μ／ｌ／ｍｌのオーダーで検出
された。しかしながらこの濃度は、生体外実験の条件下
で最大の効果を齋すために必要とされる濃度よりも１０
０倍高かった。

〔実施例６〕 活性型ジスルフィド基で置換したヒト血清アルブミン（
Ｈ８Ａ）とチオール基を導入したモネンノンとを反応さ
せて得られたイオノフォア包含体Ｏ ａ）活性型ヒト血清アルブミン 活性型Ｈ８Ａは、前記実施例において抗体に関して記載
された技法と類似の手法により得られた。

ｂ）活性型モネンジン モネンジンを、実施例１に記載の方法で活性化した。

Ｃ）イオノフオア包合体の調製 Ｓ−アセチル活性型モネンジン２２８■（２６８μｍｏ
ｔ）を最少量の第３ブタノールに溶解した。

それを、ｐＨ７の１２５ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液中に活性
型Ｓ　Ａ　９．４　ｒｌＱ／ｍ！　（５２，７μｍｏｌ
）を溶かした溶液どζ ２３−に加えた。さらにＩＮヒドロキシルアミン溶液１
．１５−を加えた。それを２５℃で１時間インキュベー
トし、ＰＢＳ緩衝液（リン酸１０ｍＭ、塩化ナトリウム
１４０ｍＭ５ｐ）１７．４　）に対して透析した。透析
と遠心により、修飾されたＩＳＡを８．７　ｍ９／＋＋
ｄ含む溶液２．８−を得た。それには、アルブミン１分
子当り平均１６分子のモネンジンが結合していた。

ｒ　　　　〔実施例７〕 Ｈ８Ａ／モネンジンの薬物動態。

雄のヌードマウスを対象として、実施例６に記載したイ
オノフオア包合体の薬物動態を検討した。使用した実験
手法は、実施例５に記載したものと同じである。その結
果を第３図に示すが、そこでは、時間を横軸に、μｇ／
−で表わしたモネンジン濃度を縦軸にプロットした。

これらの結果から次の仁とが分かる。

１）実施例５の場合のように、遊離モネンジンを血漿中
に検出することはできなかった。

２）包合体は、少なくとも４時間、３０μｊ９／ｙｄの
オーダーの濃度で検出された。８時間後でさえも、６μ
ｇ／−のオーダーで検出された。しかしながらこの濃度
は、生体外実験の条件下で最大の効果を齋すために必要
とされる濃度よりも４００倍高かった。

〔実施例８〕 活性型ジスルフィド基で置換した抗−Ｔ６５抗体のＦ（
ａｂ’）２フラグメントとチオール基を導入したモネン
ジンとの反応により得られたイオノフォア包合体。

ａ）抗−Ｔ６５抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント抗−
Ｔ６５抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントは、前記の抗
−Ｔ６５抗体をにプシンにより酵素的に加水分解して得
られた。処理に先立って、抗−Ｔ６５抗体をｐ）１３．
７の０．１Ｍギ酸ナトリウム緩衝液に対して透析した。

そして抗体１７６〜を、ペプシン（抗体１ｒｎｇ当りペ
プシン０，０５〜）存在下で３７℃にて２時間インキュ
ベートした。酵素反応は２　Ｍ　）　ＩＪス緩衝液２．
０５１Ｒｔで停止させた。

その溶液を遠心にかけ、続いてＡＣＡ４４カラム上でグ
ル濾過して精製した。溶出液の光学的濃度は２８０　ｎ
ｍで測定した。精製分画を集めたところ、濃度３．３ダ
／−の溶液２６−が得られた。

ｂ）抗−Ｔ６５抗体の活性型Ｆ（ａｂつ２活性型生成物
は上記のＦ（ａｂ’）２から得られたが、実施例１−ｂ
での抗体に関して記載した手法と類似の技法が用いられ
た。その結果、抗体１分子当り活性基３４．３を有する
抗−Ｔ６５抗体のＦ（ａｂ’）２が得られた。

Ｃ）活性型モネンジン モネンジンを、実施例１−ｃで記載した方法により活性
化した。

ｄ）イオノフオア包合体の調製 モネンジン０．４４Ｆｎ９（０，５２μｍｏｌｅ）を最
少量の第３ブタノールに溶解し、それを１Ｍヒドロキシ
ルアミン５４μ！の存在下で、ｐ＋１７０１２５ｍＭリ
ン酸緩衝液に溶かしたＦ（ａｂ’）２０．３３　ｒｎｇ
／ｙｎｔ（０゜ＯＯ３／１ｍｏｌｅ）溶液１．０２艷に
加えた。それを２５℃で１時間インキユペートシ、ＰＢ
Ｓ緩衝液（リン酸１０ｍＭ、塩化ナトリウム１４０ｍＭ
。

ｐＨ７，４）に対して透析して過剰の反応物質を除去し
、反応媒質を精製した。透析および遠心により、抗−Ｔ
６５抗体のＦ（ａｂ’）２０．３３　ｍｌ／ｍｅ溶液１
、１１１Ｌｔを得た。Ｆ（ａｂ’）２１分子当り平均３
４分子のモネンジンが結合していた。

〔実施例９〕 活性型ジスルフィド基で置換したヒト血清アルブミン（
ＩＳＡ）と、チオール基を導入した抗−ＤＮＰ抗体並び
にチオール基を導入したモネンジンとを反応させて得ら
れるイオノフオア包合体。

ここで抗−ＤＮＰ抗体とは、２．４−ジニトロフエニル
基を特異的ハプテンとしてそれに対応する抗体を示す。

ａ）抗−ＤＮＰ抗体の調製 この実施例で使用される抗−ＤＮＰ抗体は、フランス特
許第７８／２７８３８号の実施例４で開示されている方
法に従って得られた。ジメチルホルムアミド罠溶かした
１７ｍｐ／ｄのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水物
溶液４０μ！を、６５ｍｙ７．１　（０，２μｙｙＨＩ
ｅ）の抗−ＤＮＰ　ＩｇＧ溶液３０−に加えた。その反
応混合物を２時間攪拌し、続いて声７の１２５ｍＭ緩衝
液で２４時間（４００ｍ／時）連続透析して過剰の反応
物質を除去して精製した。この結果、生成物濃度６４〜
鷹の溶液４．５−を得た。ヒドロキシルアミンとの反応
によって保護基がはずされたＳＨ基を分光測光法で回折
したところ、ＩｇＧは、１分子当りＳＨ基４．４を有す
ることが分かった。

記載した手法と類似の技法によＪ　ＩＳＡから得られた
。得られた量は３０〜であるが、アルブミン１分子当り
活性基３８個を有していた。

Ｃ）活性化モネンジン 喫 モネンジンを、実施例１−ｃで記載した方法により活性
化した。

ｄ）イオノフオア包合体の調製 修飾した抗−ＤＮＰ抗体溶液３．５　ｍｌ　（０，１４
９μｍｏｌｅ　）を上記で得た活性型Ｈ８Ａ溶液４．１
　ｍｌ（０，４５０μｍｏｌｅ）に加えた。さらに１Ｎ
ヒドロキシルアミン溶液３８０μｋを加え、混合物を３
０℃にて５時間静置した。その後その混合物を、０Ｄ２
８ｏでモニターしながらセファデックスＧ２００のカラ
ムにかけてゲル濾過した。抗体とＩＳＡを両方含む分画
を集めたところ包合体１６−を得た。それをさらにＤＥ
ＡＥ　）リスアクリル（ＩＢＦ　）のカラムに通して過
剰の遊離抗体を除去して精製した。その際０Ｄ２８ｏで
モニターしながら、０．０３５Ｍから０．１　ＭのＮａ
Ｃ１の濃度勾配をかけてｐＨ８，８の（１，０２Ｍ　）
　ＩＪス緩衝液で溶出させた。

抗体とＩＳＡの両方を含む分画を集め、−１７の１２５
ｍＭリン醗緩衝液に対して透析し、さらに超遠心にかけ
て濃縮した。この結果、ＩｇＧ／ＩｓＡ包合体溶液１２
−を得た。電気泳動濃度測定法によれば、得られた調製
物の平均力、プリング度は、抗体１分子に対してＩＳＡ
　１．５分子であり良。

活性型モネンジン４．８６１Ｗ（５，７６μｍｏｌｅ）
を最少量の第３ブタノールに溶解し、上記の溶液に加え
た。続いてＩＮヒドロキシルアミン溶液６００μノを加
え、混合物を２５℃にて１時間静置した。そして反応混
合物をＰＢＳ緩衝液（リン酸塩１０ｍＭ＋塩化ナトリウ
ム１４０ｍＭ　、　ｐＨ７，４）に対して透析した。

透析および遠心により、濃度０．９１５■／ｍｅのＩｇ
Ｇ／）（ＳＡ包合体溶液１３．５−が得られた。ＩｇＧ
１分子あたり平均２６分子のモネンジン（または、ＩＳ
Ａ　１分子あた夛平均１７．４分子のモネンジン）が結
合してい友。

〔実施例１０〕 抗−Ｔ６５抗毒素の増強。

４１一 実施例９の方法により得られたこの発明の包合体が、抗
−Ｔ６５抗毒素の活性をどのように増強させるかを検討
した。その抗毒素は、実施例２で取上げた細胞培養液中
に存在する。まず第１に、（ＪＭ細胞を、イオノフオア
包合体の標的分子であるＴＮＰ　（２，４，６−ドリニ
トロフエニル基）で化学的に標識してもよいし、しなく
てもよい。次に、この細胞を、イオノフオア包合体およ
び抗−Ｔ６５抗寡素またはどちらか一方と共にインキュ
ベートした。その後タンノクク合成の阻害の程度を実施
例２で述べた方法により測定した。

ａ）細胞のＴＮＰによる標識 トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム１０η／−を
含む溶液と等量のＰＢＳ緩衝液１ｄ当力２×１０　個の
０ｇＭ細胞を、４℃でインキュベートシながらＴＮＰを
標識した。１５秒後Ｌしリシンの１０＝Ｍ溶液を過剰に
添加して反応を止めた。そしてその細胞を洗浄した。

ｂ）タンパク合成阻害度の測定 ＴＮＰで標識されたか、または標識されなかった前記の
ＣＥＭ細胞を５×１０　細胞／−の細胞濃度に調製して
、抗体１０　　Ｍを加えたイオノフオア包合体と共に４
℃にて１時間ブレインキュベートした。４℃で洗浄後、
その細胞を、非動化したウシ胎児血清１０チと抗体を含
むＲＰＭＩ−１６４０培地（ｏイシンが入っていない）
中に再び懸濁した。そしてその細胞を、様々な濃度の抗
−Ｔ６５抗毒素を加えて３７℃で２０時間インキュベー
トした。その後その細胞に放射線活性のあるトレ−サー
を取込ませた。

Ｃ）カップリング後のモネンジンの活性未標識ＣＥＭ細
胞を、様々な濃度の抗毒素（ＩＴ）および力、プリング
させた若しくはカップリングさせなかったモネンジンと
共に直接インキュベートとした。そのモネンジンは、一
定濃度５Ｘ１０−８Ｍにして添加した。抗毒素の細胞傷
害に対する増強効果は、両方の場合とも同様であった。

このことは、モネンジンのカップリングがモネンジンの
活性に影響しないことを示唆している。この結果を第４
図に示す。

ｄ）イオノフオア包合体による抗毒素（ＩＴ）の特異的
活性化 第５図を参照としながら説明する。

ＴＮＰで細胞を標識したのち、１０　　Ｍの抗−ＤＮＰ
抗体でブレインキュベートした。その後ＩＴおよび５Ｘ
１０　　Ｍのモネンジンでインキュベートした。ＩＴの
細胞傷害増強作用が強く表われた（曲線１）。

ＴＮＰ標識細胞と抗体を濃度１０””Ｍ（モネンジン濃
度にして２．６Ｘ１０　　Ｍ）で導入したイオノれた工
Ｃ５ｏは遊離モネンジンを使って得られた■Ｃ３ｏ（曲
線１）とは著しく異なっていた。

曲線３は、上記細胞とブレインキュベートした上記の同
一イオノフォア包合体の活性を示す。

ただしその細胞はＴＮＰで標識されていない。曲線２と
曲線３とを比較すると、イオノフオアによる活性化は、
そのイオノフオア包合体の抗体に対応する抗原（この場
合ハプテンであるＴＮＰ　）を有する細胞に対して特異
的であることが分かつ九。活性化係数は１００倍以上で
ある。

曲線４は、ＴＮＰ標識細胞と抗−ＤＮＰ抗体ならびに非
カップリングモネンジンとをブレインキュベートして得
られた結果を示す。この場合、抗毒素が膏す細胞毒性は
非常に低く、ＴＮＰで標識されなかったＯＥＭ細胞を対
象とした（曲線５）または抗−ＤＮＰ抗体とブレインキ
ュベートとしたＴＮＰで標識されたＣＥＭ細胞を対象と
した（曲線６）と同一の実験条件下で得られたものと一
致した。これらの対照実験の結果から、選択的活性が発
現するためには、モネンジンを抗−〇ＮＰ抗体でカップ
リングさせる必要があることが確められた。

これらの結果により示されたことは、細胞傷害作用は崩
壊される細胞を二重に標的として狙うことにより誘起さ
れる。すなわち、抗毒素の毒性をもつ構成単位および抗
毒素の細胞傷害力を高めるため釦用いられる増強剤とい
った２種類の物質が必要である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗毒素が細胞内のタンパク合成に影響を及ぼ
すことを表わすグラフ図。Ｍ２図は、３Ｅ１０／モネン
ジン包合体の血中濃度の経時変化を示すグラフ図。第３
図は、Ｈ８Ａ／モネンジン包合体の血中濃度の経時変化
を示すグラフ図。 第４図は抗毒素共存下でのカップリングまたは非カップ
リングモネンジンの細胞傷害への増強作用を示すグラフ
図。第５図は各種の組合わせた物質が引起こす細胞傷害
の程度を示すグラフ図。 出願人代理人　　弁理士　鈴　江　武　彦４６一

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）一価のカルボキシルイオノフォアを高分子と共有
   結合によりカップリングさせて得られる包合体。
2. （２）前記高分子が、抗体、抗体のフラグメント、タン
   パク、ペプチドリガント、および混合した高分子から選
   ばれる特許請求の範囲第１項記載の包合体。
3. （３）前記高分子がモノクロナール抗体である特許請求
   の範囲第１項または第２項に記載の包合体。
4. （４）前記の共有結合によるカップリングが、ジスルフ
   ィド結合またはチオエーテル結合により達成される特許
   請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の
   包合体。
5. （５）前記イオノフォアが、一級水酸基を有する特許請
   求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の包
   合体。
6. （６）前記高分子が、Ｔ２９−３３抗体、３Ｅ１０抗体
   、抗−ＤＮＰ抗体およびヒト血清アルブミンから選ばれ
   、前記イオノフォアが、モネンジンまたはナイジェリシ
   ンである特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか
   １項に記載の包合体。
7. （７）イ）カップリングすべき化合物の１つにチオール
   基を導入し、ロ）他の化合物に前記チオール基と反応し
   得る１つ以上の基を導入し、およびハ）得られた２つの
   化合物を３０℃以下の温度にてｐＨ５ないし９で反応さ
   せることを特徴とする一価のカルボキシルイオノフォア
   を高分子と共有結合によりカップリングさせて得られる
   包合体の調製法。
8. （８）前記チオール基を有するイオノフォアを、このチ
   オール基と反応し得る基であって式 −Ｓ−Ｓ−Ｘ（式中のＸは活性基を示す）で示されるも
   のを導入した高分子と反応させる特許請求の範囲第７項
   記載の方法。
9. （９）前記チオール基を有するイオノフォアを、このチ
   オール基と反応し得る基であって式▲数式、化学式、表
   等があります▼（式中のＺは炭素原子１ないし１０を含
   む脂肪族または芳香族の介在基を示す）で示されるもの
   を導入した高分子と反応させる特許請求の範囲第７項記
   載の方法。
10. （１０）前記イオノフォアとＳ−アセチルメルカプトコ
    ハク酸無水物とを反応させることによって式▲数式、化
    学式、表等があります▼ （上式中、Ｉ＾Ｏは水酸基の１つが除かれたイオノフォ
    ア残基を示す）で示される化合物を生成し、該化合物を
    ヒドロキシルアミンと反応させて式▲数式、化学式、表
    等があります▼（ここでＩ＾Ｏは上記のとおりである）
    で表わされる化合物を生成することによってチオール基
    を導入する特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）前記Ｉ＾Ｏは、一級水酸基が除かれたモネンジ
    ンまたはナイジェリシンである特許請求の範囲第１０項
    記載の方法。
12. （１２）一価のカルボキシルイオノフォアを高分子と共
    有結合によりカップリングさせて得られる包合体を有効
    成分とする抗毒素増強剤。
13. （１３）一価のカルボキシルイオノフォアを高分子と共
    有結合によりカップリングさせて得られる包合体のうち
    少なくとも１つと少なくとも１つの抗毒素を含む医薬。
14. （１４）イオノフォアにＳ−アセチルメルカプトコハク
    酸無水物を反応させることによって得た活性型カルボキ
    シルイオノフォアであって、アセチル基がヒドロキシル
    アミンによって除去されていることのあるもの。
15. （１５）式▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｉ＾Ｏは水酸基の１つが除去されたイオノフ
    ォア残基を示し、Ｗは水素またはアセチル基を示す）に
    相当する活性型カルボキシルイオノフォア。
16. （１６）式▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｉ＾Ｏは水酸基の１つが除去されたイオノフ
    ォア残基を示し、Ｗは水素またはアセチル基を示す）で
    表わされる特許請求の範囲第１４項記載の化合物。
17. （１７）式▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｉ＾Ｏは一級水酸基が除去されたモネンジン
    またはナイジェリシンである）で表わされる特許請求の
    範囲第１６項記載の化合物。