KR930000058B1 - 변형된 탄수화물 잔기를 갖는 항종양성 당단백질의 제조방법 - Google Patents

변형된 탄수화물 잔기를 갖는 항종양성 당단백질의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR930000058B1
KR930000058B1 KR1019850004354A KR850004354A KR930000058B1 KR 930000058 B1 KR930000058 B1 KR 930000058B1 KR 1019850004354 A KR1019850004354 A KR 1019850004354A KR 850004354 A KR850004354 A KR 850004354A KR 930000058 B1 KR930000058 B1 KR 930000058B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chain
lysine
glycoprotein
hours
oxidized
Prior art date
Application number
KR1019850004354A
Other languages
English (en)
Other versions
KR860000315A (ko
Inventor
잔센 프란쯔
그로 삐에르
Original Assignee
소시에떼 아노님 사노피
미쉘 드 아스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR8409703A external-priority patent/FR2566271B1/fr
Priority claimed from FR8502067A external-priority patent/FR2577137B1/fr
Application filed by 소시에떼 아노님 사노피, 미쉘 드 아스 filed Critical 소시에떼 아노님 사노피
Publication of KR860000315A publication Critical patent/KR860000315A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR930000058B1 publication Critical patent/KR930000058B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A61K47/6827—Ricin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

변형된 탄수화물 잔기를 갖는 항종양성 당단백질의 제조방법
제1도는 리신(ricin)의 A 사슬(A chain) 및 산화시킨 A 사슬의 혈장 제거곡선을 나타낸다.
제2도는 과요오드산 나트륨 처리후 시간에 따른 A 사슬의 혈장농도 변화를 나타낸다.
제3도는 과요오드산 나트륨 처리시간에 따른 A 사슬 및 메틸화된 A 사슬의 혈장 농도 변화를 나타낸 것이다.
제4도는 겔로닌 및 산화된 겔로닌의 혈장 제거 곡선을 나타낸다.
제5도는 GPIR MOM 및 산화된 GPIR MOM의 혈장 제거곡선을 나타낸다.
제6도는 GPIR 다이안틴 30 및 산화된 GPIR 다이안틴 30의 혈장 제거곡선을 나타낸다.
제7도는 IT 101 및 IT(A-La) T 101의 혈장 제거율을 나타낸다.
제8도는 단백질 합성의 억제에 의해 측정된 CEM 세포에 대한 IT(A-La) T 1 01 및 (A-La)의 세포 독성 활성을 나타낸다.
제9도는 클로로게닉 시험에 의해 측정된 CEM 세포에 대한 IT(A-La) T 101 및 IT T 101의 세포 독성을 나타낸다.
본 발명은 과요오드산 이온을 사용한 산화에 의해 변형된 탄수화물 잔기를 갖는 신규 항종양성 당단백질의 제조에 관한 것이다.
보다 상세히는 본 발명은 리보솜을 비활성화시키고, 지속작용(prolonged actio n)을 갖는 당당백질의 신규 제조방법에 관한 것이나, 상기 사항에만 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상세한 설명 및 특허청구의 범위에서 사용하는 “리보솜을 비활성화시키는 당단백질”이란 용어는 리보솜을 비활성화시켜 결과적으로 전핵 세포에서의 단백질 합성을 억제하는 거대분자 부류에 속하는 사카라이드 잔기를 갖는 물질 및 동일한 비활성화 작용을 갖는 상기 물질의 단편을 정의하는데, 리보솜을 비활성화시키는 상기 당단백질은 상기 목적을 위해 유전자형을 변형시킨 세포로 부터 유도된 천연 또는 생합성된 것일 수 있고, 또한 리보솜을 비활성화시키는 상기 당단백질은 항체와 용이하게 결합할 수 있도록 자체 아미노산의 작용기를 변형시킨 것일 수도 있다.
본 설명에서 “리보솜을 비활성화시키는 당단백질”의 표현을 GPIR 기호로 약칭한다.
본 설명에서 “과요오드산염”이란 용어는 IO4-이온을 정의하며, “메타 과요오드산염”이라고도 기재한다.
리보솜을 비활성화시키는 당단백질(GPIR)은 항체와 결합하여 면역 독소 제조의 중간물질로 특히 유용하다.
미합중국 특허 4340535 및 프랑스공화국 특허 출원 제 81/07596호 및 제 81/21836호에는 접합체(conjugates)라 명명한 항암성 제품의 제조방법이 기재되어 있는데, 상기 제품은 세포파괴를 위해 주입된 항원에 대항하여 생성된 항체들 또는 항체 단편들과 리신(ricin)의 A 사슬을 공유 결합시킴으로서 수득된다. 상기 유형의 생성물이 면역독소의 속명하에 사용되어 왔고, 본 출원에서도 사용한다.
또한 리신의 A 사슬을 함유하는 상술한 면역독소와 유사한 접합체들이 항암성 약제로 유용하다는 것이 공지되어 있고, 특히 겔로늄 멀티플로룸으로 부터 추출한 겔로닌(유럽 생화학 저어널, 1981년. 116권, 447∼454페이지 ; 암연구, 1984년, 44권, 129∼133페이지) 또는 모모르디카 차란티아(MOM)로 부터 추출한 억제물질(미합중국 특허 4368149)과 같은 리보솜을 비활성화시키는 다른 당단백질과 항체 또는 항체 단편들을 공유결합에 의해 결합시킴으로써 생성된다.
리보솜을 비활성화시키는 상기 당단백질(GPIR)들은 리신의 A 사슬과 유사한 특성들을 가지며, 분자량이 20,000 및 30,000 정도인 물질들이다(암조사, 1982년, 1권, 489∼520페이지).
상기 면역 독소의 세포 독소 활성은 모넨신 및 나이제리신과 같은 특정 카르복실 이오노포르를, 각종 아민류 또는 암모늄염과 같은 각종 보조 물질에 의해 강화될 수 있다.
그러나 면역독소의 치료효과는 활성화되는 것에 관계없이 면역독소가 항체 부위를 통하여 생체내의 파괴되는 표적 세포에 활성형으로 위치할 때에만 완전히 나타날 수 있다(면역 독소 활성의 발현 조건과 관계없음). 면역독소가 표적 세포위에 위치할 수 있는 능력은 표적 세포에 도달할 수 있을정도의 충분한 시간동안 및 대응하는 항원 부위에 강하게 결합할 수 있을 정도의 충분히 큰 농도로 면역 독소가 활성형으로 혈류 및 세포의 유액에 존재함에 의해 최우선적으로 좌우된다.
각종 연구들이 각기 다른 동물 모델들에게 면역 독소를 정맥내 주사한 후의 면역 독소의 혈장 제거 동역학을 관찰 및 보고하였다. 주사후 생물학적 활성 면역 독소의 혈장 레벨이 급격히 및 실제적으로 감소된다는 것이 명백하다. 따라서 토끼를 사용한 대표적인 예에서 디설파이드 결합을 갖는 부위를 이용하여 리신의 A 사슬과 인체 T 임파세포의 항원 T 65에 대항하여 생성된 모노클로날 항체(항체 T 101)를 결합시켜 합성한 면역 독소를 사용한 모델에서, 주사후 0시에는 97%의 면역 독소가 혈류에 존재하고 30분내에 소실되며 17시간내에 99.9%가 사라진다고 나타난다.
상기한 면역 독소의 급격한 제거로 인해, 면역 독소가 장기간 동안 파괴시킬 세포로 운반된 많은 표적 항원을 공격하는 것이 억제되므로, 완전한 세포 독성 능력의 발현이 명백하게 손상된다. 또한 면역 독소의 혈장 제거 동역학을 상응하는 비접합 항체의 혈장 제거 동역학과 비교하면, 공지된 바와 같이 항체가 혈장내에 높은 레벨로 비교적 오랜 기간동안 잔류한다. 극히 고도로 정제된 면역 독소 제제에 있어서도, 일정한 잔류 레벨의 비접합 항체가 항상 존재한다. 면역 독소 및 항체의 차등 제거 속도로 인해, 초기에 극히 미량 존재하던 비접합 항체가 2, 3시간후 점차 다량이 되고, 이어서 이들 항체는 경쟁적으로 면역독소와 표적물의 결합을 강력하게 억제한다.
표적 항원과의 결합도 및 결합기간을 증가시키기 위하여 또한 결과적으로 면역 독소의 치료효과를 개선하기 위하여 활성형 면역 독소의 혈장 존재를 증가시킬 필요성이 명백하다.
방사성 표지한후 특이적 표적물을 갖지 않는 동물에 주사하여 리신의 A 사슬을 함유하는 면역 독소의 생체내 위치 측정(localization) 실험에서 주사후 초기 2, 3분후에 접합체는 우선적으로 간에 위치한다. 리신의 A 사슬을 비결합 형태로 주사할 경우에도 같은 양상이 나타난다. 이로부터 면역 독소가 자체내에 함유하는 세포독성 서브-유니트(sub-unit)로 간에 고정된다는 것이 강력하게 주장된다. 리신의 A 사슬은 특히 일부 만노스 잔기가 말단에 위치한, 만노스 잔기 및 N-아세틸글루코스 아민잔기를 함유하는 다당류기를 갖는 당단백질임이 공지되어 있다(농업 생물화학, 1978년, 42권, 501페이지), 상기 말단 만노스 잔기를 갖는 당단백질을 인지할 수 있는 수용기 (rece ptor)가 간에 존재한다는 것이 알려져 있다. 또한, 상기 수용기에 의해 인지되는 당단백질이-수용기는 본질적으로 쿠퍼 세포에 존재하는데-상기 세포에 고정됨으로써 혈류로 부터 급격히 제거되고 부착된 당단백질은 세포를 분해한다. 상기 사항은 베타-글루쿠로니다제의 실험 및 또한 리보누클레아제 B의 실험에 특히 잘 기재되어 있다(Arch, Biochem, Biophys, 1978년, 188권, 418페이지 ; 효소학의 진보, 마이스터 편집, 뉴욕, 1974 ; Pediat. Res., 1977, 11권, 816페이지).
따라서 상기 데이타들로 부터 리신의 A 사슬을 함유하는 면역 독소의 급격한 제거는 리신의 A 사슬의 만노스 잔기가 간세포 특히 쿠퍼 세포에 의해 인지됨에 기인하는 것을 알 수 있다.
겔로닌 또는 MOM과 같은 다른 GPIR들에 대해서 혈장 제거 동역학을 측정한 결과, 리신의 A 사슬의 경우와 마찬가지로 동물에 정맥 주사한후 GPIR의 혈장 레벨이 매우 급격히 및 실제적으로 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 토끼를 사용한 대표적인 실험에서, 생물화학 저어널(1980년, 255권, 6947∼6953페이지)에 기재된 방법으로 정제한 겔로닌을 주사할 경우, 주사후 0시에는 93%의 겔로닌이 혈류에 존재하고 1시간내에 소실되며 24시간내에 99.99%가 사라지는 것으로 나타났다.
당단백질에 함유된 탄수화물(osidic) 구조를 포함해서, 탄수화물 구조를 과요오드산 이온으로 산화시키면, 일차 또는 이차 수산기를 갖는 2개의 인접한 탄소원자의 탄소사슬이 절단된다. GPIR에 존재하는 고리형 당류에서와 같이 2차 수산기 2개가 인접할 경우에 산화시키면 절단되는 2탄소에 2개의 알데히드기가 생성된다.
항종양성 당단백질의 탄수화물 잔기를 과요오드산 이온을 사용한 산화에 의해 변형시켜도 상기 당단백질의 생물학적 작용은 실제적으로 변화하지 않는다고 알려진다.
또한, 리보솜을 비활성화시키는 당단백질의 탄수화물 잔기를 과요오드산 이온을 이용한 산화에 의해 변형시키면 리보솜을 비활성화시키는 새로운 당단백질이 생성되며, 상기한 새로운 당단백질은 자신의 생물학적 활성을 유지하며 생체내의 혈류로 부터 매우 느리게 제거되는 2중 특성을 갖는다는 것이 예기치 않게 발견되었다.
산화된 및 천연 GPIR들에 대한 깊이 있는 생화학적 연구 결과, 과요오드산 염에 의한 GPIR의 산화는 GPIR의 탄수화물 부위에만 제한되고 펩티드 부위를 구성하는 아미노산의 서열에는 영향을 미치지 않는다는 것이 증명되었다.
리보솜을 비활성화시키며 지속작용을 갖는 상기의 새로운 당단백질을 하기에서는 GPIR-La 기호로 기재한다.
마지막으로 리보솜을 비활성시키고 지속작용을 갖는 상기의 새로운 당단백질을 항체와 결합시키면, 수득된 접합체는 면역 독소로서 공지된 생물학적 특성을 보유하며 또한 느린 혈장 제거 동역학을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 과요오드산 이온을 사용한 산화에 의해 탄수화물 단위를 변형시킨, 즉 변형된 구조를 가지며 항종양성인 새로운 당당백질 생성물에 관한 것이다.
보다 상세히는 본 발명은 리보솜을 비활성화시키고 지속작용을 갖는 당단백질에 관한 것으로서, 리보솜을 비활성화시키는 당단백질을 자체의 티올기를 임의로 보호하면서 알칼리 금속 과요오드산염 수용액으로 빛의 차단하의 0∼15
Figure kpo00001
C 온도에서 0.2∼24시간 동안 처리하고, 티올기를 탈보호시킨후, 공지의 방법으로 최종 생성물을 분리하여 수득한다.
항종양성 당단백질은 공지의 방법에 따라 과요오드산 이온을 사용한 반응을 수행하여 탄수화물 단위를 변형시킬 수 있다.
본 발명에 따라서 과요오드산 이온을 사용한 산화 반응에 바람직한 출발물질로 사용되며, 리보솜을 비활성화시키는 당단백질은 리신의 A 사슬과 같이, 그 자체로는 세포에 정착할 수 없기 때문에 매우 약한 세포 독성을 가지나, 특정 세포를 인지하는 항체와 결합한후, 항체가 그의 표적물로 인지한 상기 세포에 대하여 고도의 세포독성을 갖는 모든 GPIR이다.
대표적인 출발 화합물로는 리신의 A 사슬, 겔로닌 및 모모르디카 차란티아 (MOM)로 부터 추출하여 얻은 물질등이 있다.
과요오드산 이온을 사용한 산화밤응에서 출발물질로 유용한 다른 GPIR을 하기에 기재한다.
다이안틴 30 카네이션으로 부터 추출
다이안틴 32 카네이션으로 부터 추출
아그로스틴 A 아그로스템마 기타고로 부터 추출
아그로스틴 B 아그로스템마 기타고로 부터 추출
아그로스틴 C 아그로스템마 기타고로 부터 추출
HCI 후라 크레피탄스로 부터 추출
아스파라거스 오피시날리스- 아스파라거스 오피시날리스로 부터 추출
억제 인자
상기한 목적을 위해 유전형을 변형시킨 세포에 의해 생합성적으로 제조되는 동일한 물질들도 또한 알맞은 화합물이다.
상기한 GPIP들의 단편들은 그들의 근원 GPIR의 특성인 리보솜을 비활성화시키는 전체 또는 일부 특성을 보유하며, 또한 출발물질로 사용될 수 있다.
최소한 1개의 보호된 티올기를 갖는 천연 리신의 A 사슬이 출발물질로 바람직하다.
최근의 연구에서 리신의 A 사슬은 A1 및 A2로 정의되는 2가지 성분으로 구성되며, 상기 물질들은 그들의 폴리사카라이드 단위가 특히 다르다는 것이 밝혀졌다. A 사슬의 2가지 성분에 대해 실시한 실험에서, 과요오드산염 산화반응은 A1 및 A2 사슬에서 유사한 방법으로 수행되며 상기한 2가지 성분이 약리학을 개선시키는 동일한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 리신의 순수한 A 사슬의 제조방법이 미합중국 특허 제4340535에 기재되어 있다. 겔로닌 및 MOM도 또한 종래의 연구에 기재되어 있다.
출발 GPIR의 티올기의 보호는 상기한 티올기가 항체와 결합하기 위해 사용될 경우에 바람직하다.
예를들어 티로신의 페놀 수산기 또는 GPIR의 아미노기 또는 카르복실기와 같은 다른 기능기가 결합에 사용될 경우 보호반응을 수행할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
SH기를 환원 또는 티올/디설파이드 교환에 의해 뒤이어 제거될 수 있는 잔기로 치환할 수 있는 제제, 예를들어 2, 2′-디니트로-5, 5′-디티오디벤조산(DTNB) 또는 3-(피리딘-2-일-디설파닐)프로피온산 또는 선택적으로 디피리딜-2, 2′-디설파이드 또는 디피리딜-4, 4′-디설파이드를 사용하여 보호반응을 수행한다. 상기한 보호 처리를 하지 않을 경우에 산화반응 도중에 유리 티올이 소실되며 완전히 재생되지 않는다. 과량의 보호물질은 투석 또는 다른 적당한 처리에 의해 제거된다.
과요오드산염 산화반응은 3∼7의 산성 pH, 바람직하게는 5∼6.5의 pH에서 수행한다.
과요오드산염은 과량을 사용하고 ; 보다 상세히는 알카리금속 과요오드산염의 농도는 산화시킬 인접한 디올의 농도보다 크고 ; 세포독성 서브-유니트 1∼10mg/ml의 농도에 대해 과요오드산 나트륨은 10∼50mM의 농도가 적당하다. 상기 반응은 0∼15
Figure kpo00002
C, 바람직하게는 1~5℃의 온도에서 빛의 차단하에 0.2∼24 시간동안 수행한다.
상기 반응은 과량의 에틸렌글리콜과 같은 잔류 과요오드산염을 소비하는 시약을 첨가함으로서 중단되고, 부산물들은 투석 또는 다른 적당한 처리에 의해 제거된다. 반응 말기에 수득되는 생성물을 종래의 방법으로 분리한다.
출발물질의 티올기가 보호되었을 경우에는 공지의 방법. 예를 들어 2-메르캅토에탄올과 같은 보호 처리한 티올기를 유리시킬 수 있는 환원제를 사용한 반응에 의해 탈보호하여, 리보솜을 비활성화 시키고 지속작용을 갖는 새로운 당잔백질을 제조한 다음 항체와 결합시켜 면역 독소를 제조할 수 있다.
리신의 A 사슬에서 생성되는 새로운 분자(A-La 기호로 기재함)는 하기의 주요 특성들을 갖는다 :
-분자량이 천연 A 사슬과 크게 다르지 않다.
폴리아크릴아미드 경사 전기영동으로 관찰할 수 있고, 이때 변형 과정에서 단지 단백질 중합체가 소량 제조되고 생성물의 분해는 일어나지 않는다.
-유리 티올기의 비율이 1몰당 0.7이상이다.
-리신의 A사슬을 억제하는 토끼 항체에 대한 면역 반응성이 천연 A 사슬의 면역 반응성과 구별되지 않는다.
-무세포성 모델에서의 단백질 합성에 대한 억제작용이 동량의 천연 A 사슬에 의한 단백질 합성 억제작용의 50% 이상이다.
-마지막으로, 토끼에게 약 0.4mg/kg 체중의 투여량으로 1회 정맥내 주사할 경우, 주사후 23시간때에 지속작용 A 사슬(A-La)의 혈장 레벨은 주사후 0시의 레벨의 10%이상(이때 천연 A 사슬은 0.015%이다)으로, 즉 혈장 레벨의 증가는 500 보다 훨씬 큰 증가 계수를 갖는다.
겔로닌에 있어서도 과요오드산염 산화반응에 의해 수득된 분자는 하기 주요 특성들을 갖는다.
-분자량이 천연 겔로닌과 크게 다르지 않다.
-항 -겔로닌 토끼 항체에 대한 면역 반응성이 천연 겔로닌의 그것과 구별되지 않는다.
-마지막으로, 토끼에게 약 0.3mg/kg 체중의 투여량을 1회 정맥내 주사할 경우, 주사후 24시간때의 변형된 겔로닌의 혈장 레벨은 주사후 0시간때의 혈장 레벨의 3%이상(이때의 천연 겔로닌은 0.01%이다)으로, 200이상의 증가 계수에 의해 혈장 레벨이 증가한다.
리보솜을 비활성화시키고 지속작용을 갖는 당단백질로 부터 접합체 또는 면역 독소의 제조는 미합중국 특허 4340535에 기재된 방법의 범위에서 알맞은 방법을 선택하여 수행한다. 선택된 세포 독성 서브-유니트가 결합하기 알맞은 티올기를 최소한 1개라도 함유할 경우, 상기 물질은 활성화된 디설파이드기를 갖는 항체 또는 단편과의 반응에 바람직하게 사용될 수 있다. 선택된 세포 독성 서브-유니트가 본래 결합하기 알맞은 티올기를 갖지 않을 경우, 유리 티올기를 갖는 최소한 1개의 기능기를 공지의 방법으로 상기한 서브-유니트에 인공적으로 도입하고, 상술한 대로 결합을 수행시킨다. 상술한 기능기의 도입은 과요오드산 이온을 사용한 산화반응전, 이때 산화 반응 동안에 티올잔기를 보호하고 산화반응후에 탈보호한다. 또는 산화반응후에 수행한다.
상기한 과정에 의해 새로운 약리학적 특성을 갖는 변형된 면역 독소가 제조된다. 보다 상세히는 세포독성 서브-유니트를 알맞게 변형시킴으로서 면역 독소의 고유한 세포 독소 특성을 방해하지 않으면서 고유한 특성과 같은 새로운 특성 즉 느린 혈장 제거 동역학을 나타내는 능력을 부여하는 것이 가능하다.
하기의 실시예들은 본 발명을 명확하게 이해하도록 하나 제한하지는 않는다.
[실시예 1]
SH기를 N-에틸말레이미드로 보호한 메틸화된 A 사슬의 산화.
Ⅰ. 정확히 기능화되는 리신 A 사슬의 제조
1) A 사슬의 6 메틸화
메틸화 반응은 민스 및 휘니의 방법 (생화학 7권, 2192페이지, 1968년)을 이용하여 pH 10의 0.2M 붕산염 완충액에서 교반하며 0
Figure kpo00003
C에서 수행한다. 35ml의 A 사슬(3mg/ml)에 20mg의 삼중수소보란(9.5mCi/mmol)을 가하고, 이어서 6% 포름알데히드 350㎕(70㎕씩 30분에 걸쳐 5번 가한다)를 가한다.
과량의 시약은 pH 7의 125mM 인산염 완충액(40ℓ, 300ml/h)을 사용한 계속적인 투석에 의해 제거한다. 투석후 단백질 용액을 원심분리한다. 2.6mg/ml를 함유한 6메틸화 A 사슬 36.5ml가 수거된다.
2) N-에틸말레이미드를 사용한 보호
6메틸화 A 사슬의 고유한 SH기를 효소학의 방법(11권, 541페이지, 1967년)에 기재된 방법을 사용하여 보호한다. 상기 방법을 수행하기 위해, 전단계에서 수거된 리신의 A 사슬을 A 사슬 1몰당 20당량의 N-에틸말레이미드의 존재하에 30
Figure kpo00004
C에서 2시간 동안 보온한다. 과량의 시약을 pH 7의 125mM 인산염 완충액을 사용하여 계속적으로 투석하여 제거하고 이때 500ml/h의 속도로 20시간 마다 완충액을 갈아주어 엘만 시약에 의해 검출될 수 있는 티올기를 갖지 않고, 7mg/ml 함유된 리신의 A 사슬용액 13ml가 수득된다. 상기에서 수득된 생성물을 6메틸화 A 사슬(NEM)이라 기재한다.
3) 과요오드산염 산화
상기 단계에서 수득된 6메틸화 A 사슬(NEM)용액을 6ml를 빛의 차단하의 0
Figure kpo00005
C 및 pH 4.5에서 NaIO4(12.8mg)와 40분 동안 반응시킨다. 600㎕의 에틸렌 글리콜을 가하여 반응을 종결시키고, pH 10의 0.1M 탄산염 완충액(500ml/h로 20시간)을 사용하여 반응매질을 투석한다.
Ⅱ. 무세포성 모델(acellular model)에서 측정한 지속작용 A 사슬의 효소활성.
리신의 A 사슬의 주요 생물학적 특성은 리보솜의 서브-유니트 60S를 분해함으로서 세포내의 단백질 합성을 억제하는 것이다.
시험관내의 실험에서는 인공적인 mRNA(폴리우리딜산)의 존재하에14C-페닐알라닌과 배합할 수 있는 쥐간의 알맞게 제조된 서브셀룰라 분획을 사용하여 수행한다. 서브셀룰라 분획의 제조 및14C-페닐알라닌과의 배합 측정은 문헌(Biochemica Biophysica Acta 1973년, 312권, 608∼615페이지)에 기재된 방법에 따라 쥐의 간세포의 마이크로섬 분획 및 시토졸 분획 둘다를 사용하여 수행한다. A 사슬을 함유하는 시료를 0.2%의 2-메르캅토에탄올 및 15㎍/ml의 소혈청 알부민을 함유하는 pH 7.6의 50mM 트리스-HCI 완충액으로 알맞게 희석시킨다.
억제자가 존재하지 않는 대조용 매질과 비교하여, 리신의 A 사슬을 함유하는 각각의 반응 매질에서 단백질과14C-페닐알라닌과의 배합 억제 백분율을 계산 데이타를 사용하여 측정한다.
억제 활성은 하기와 같이 측정되었다. 산화된 A 사슬에 대해 2.7×10-10mol/ℓ의 IC50이 관찰된다. 상기 실험에서 대조용 A 사슬이 IC50은 1.03×10-10mol/ℓ이다. 따라서 변형에 의해 A 사슬의 활성이 손실되지 않는다.
[실시예 2]
본 실시예는 과요오드산 나트륨으로 변형시킨 리신의 A 사슬을 동물에게 정맥내 주사할 경우, 주사후 느리게 제거됨을 증명한다.
Ⅰ. 과요오드산나트륨을 사용한 리신의 A 사슬의 변형
1) DTNB를 사용한 고유 SH의 보호
리신의 A 사슬을 미합중국 특허 4340535에 기재된 방법에 따라 제조 및 정제한다. 5.6mg/ml를 함유하는 리신의 A 사슬(A 사슬 1당 티올기는 0.84)을 PBS 완충액(20mM) 인산염 및 150mM NaCl 완충액, pH 7)에 용해시킨 용액 10ml에 20당량의 2, 2′-디니트로-5, 5′-디티오-디벤조산(DTNB), 즉 pH 7의 125mM 인산염 완충액(수산화나트륨을 사용하여 pH 7로 조절)에 용해시킨 0.1M DTNB 용액 385㎕를 가한다. 20
Figure kpo00006
C에서 20분동안 보온한다. 이어서 상기 용액을 PBS 완충액을 사용하여 4
Figure kpo00007
C에서 투석시켜 티올기가 보호된 A 사슬 53mg을 5mg/ml를 함유하는 용액 상태로 수득한다.
2) 보호된 A 사슬의 과요오드산염 산화.
5mg/ml의 보호된 A 사슬을 함유하는 용액 6ml에 물에 용해시킨 0.5M 과요오드산나트륨 용액 120㎕를 가하고, 1M 아세트산을 사용하여 pH 6으로 조절한다. 빛의 차단하의 4
Figure kpo00008
C에서 16시간 동안 보온시킨다. 1M 에틸렌 글리콜 수용액 620㎕를 가하여 산화 반응을 정지시킨다. 20
Figure kpo00009
C에서 15분 동안 보온한 후, PBS 완충액에 대해 4
Figure kpo00010
C에서 반응 매질을 투석한다. 과요오드산염 산화에 의해 소량의 단백질 침전이 생성되는데, 10,000×g에서 30분동안 원심분리하여 제거한다. 따라서 3.4mg/ml 농도의 산화 보호된 A 사슬 24mg이 수득된다.
3) 티올기의 탈보호.
3.4mg/ml의 산화 보호된 A 사슬을 PBS 완충액에 용해시킨 용액 6ml에 환원제로서 2-메르캅토 에탄올을 최종 농도가 1%이도록 가한다. 20
Figure kpo00011
C에서 1시간 동안 보온한다. 이어서 상기 용액을 PBS 완충액에 대해 4
Figure kpo00012
C에서 투석한다. 따라서 2.8mg / ml 농도의 산화된 A 사슬 19mg이 수득된다.
DTNB 방법(효소학의 방법, 1972년, 25권, 457페이지, 아카데킥 출판사)을 이용하여 수득된 변형시킨 A 사슬이 1몰당 0.70 유리 티올기를 갖는다고 측정된다. 소듐 도데실 설페이트의 존재하에 폴리아크릴아미드 경사전기 영동에 의해 측정한 변형시킨 A 사슬의 분자량은 30,000 ± 3,000이다.
폴리사카라이드 단위를 산화시킨 미리 수득한 A 사슬 제제에 대하여 단백질 합성 억제에 대한 효소활성 및 약리적 특성들을 측정한다.
Ⅱ. 무세포성 모델에서 측정한 지속작용 A 사슬의 효소활성.
억제활성은 실시예 1에서 기재된 방법에 따라 측정한다. 산화된 A 사슬에 대해 3×10-10mol/ℓ의 IC50이 관찰된다. 상기 실험에서 대조용 A 사슬의 IC50은 1.2×10-10mol/ℓ이다. 따라서 변형으로 인해 A 사슬의 활성은 소실되지 않는다.
Ⅲ. 지속작용 A 사슬 (A-La)의 약리 동역학적 특성.
A 사슬을 토끼의 귀정맥에 1회 주사형 투여한다. 주사하는 A 사슬의 양은 0.415mg/kg이다. 때때로 헤파린 처리를 하여 혈액 시료를 채취한다. RIM-1으로 하기에 약칭된 방사선 면역 측정 시험으로 혈장을 분석한다.
상기 방법은 A 사슬을 변형시키지 않고 측정할 수 있는 이점을 갖는다. 상기 측정은 미세적정 플레이트(예 : “NUNC-TSP 스크린계” Poy Labo Block, 프랑스공화국)에서 밑부분에 공동을 파는 과흡착성 스파이크를 이용하여 수행된다. 상기 스파이크는 고체상들을 형성한다. 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된 리신의 A 사슬을 억제하는 암양항체(이하에서는 Ac 1으로 약칭함)가 고체상들에 흡착된다. 상기 측정을 위해, 10㎍/ml의 Ac 1을 PBS 완충액에 용해시킨 용액 200㎕를 공동에 분할하여 가한다. 스파이크를 먼저 Ac 1 용액과 4
Figure kpo00013
C에서 24시간 동안 접촉시킨 다음, 태내 송아지 혈청과 20
Figure kpo00014
C에서 3시간 동안 접촉시켜 모든 고정 부위를 포화시킨다. 이어서 포화된 면역 흡착제를 각기 다르게 희석시킨 혈장 시료들 또는 농도를 알고 있는 A 사슬 용액과 20
Figure kpo00015
C에서 3시간 동안 접촉시켜 검정곡선을 유도한다. PBS 완충액으로 세척한 후 면역 흡착제를 리신의 A 사슬을 억제하는 암양 항체와 20
Figure kpo00016
C에서 2시간 동안 접촉시키고, 이때 암양 항체는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되고 방사성 표지된 것(이하에서는 Ac 2로 약칭함)이다. Ac 2의 방사능 표지는 그린우드 및 헌터의 방법(생화학 저어널, 1963년, 89권, 114페이지)에 따라 클로르아민 T의 존재하에 요오드-125를 사용한다 ; 방사능 표지된 Ac 2항체의 고유활성도는 5∼10 마이크로퀴리/㎍이다. 106cpm의 방사능 표지된 Ac 2항체 200㎕를 0.1%의 소혈청 알부민을 함유하는 PBS 완충액에 도입한다. PBS 완충액에서 세척한후 스파이크를 분리하고 결합된 Ac 2의 양을 방사성을 계산하여 측정한다. 측정할 시료내의 A 사슬의 농도는 각기 다른 알고 있는 농도의 A 사슬을 도입하여 유도한 검정곡선을 참고하여 측정한다. 지속작용 A 사슬을 동물에 주사하면, 상기의 동일한 지속작용 A 사슬이 상응하는 검정곡선을 유도하도록 이용된다.
상기한 방법에 의해 측정된 혈장내의 A 사슬의 농도값은 신뢰성 및 재현 가능성을 갖는다. 검출 한계치는 1ng/ml이다. 실험들 도중 또는 사이에서의 재현 가능성을 측정하면, 농도값에 대하여 1∼200ng/ml의 범위에서 10%이하의 변이계수를 제공한다.
상기 실험의 결과를 곡선 형태로 나타내는데, 1시간을 단위로하여 횡좌표에 시간을 나타내고, 0시 때의 이론적인 혈장 농도의 백분율로 측정된 생성물의 혈장 농도를 종 좌표위에 로그 눈금으로 나타내어 도면을 그린다. 상기 값을 “상대 혈장 농도 ” (RPC)라 명명하고, 하기식을 사용하여 계산한다.
Figure kpo00017
혈정 부피는 36ml/kg 동물 몸무게로 계산한다.
도면 1은 정맥내 주사한 천연 리신의 A 사슬에 대한 시간에 따를 혈장제거 곡선을 나타낸다. 상기 곡선(제1곡선)은 2가지 위상을 갖는데, 첫번째 위상에서 생성물은 혈류로 부터 급속히 제거되어 주사후 3시간에는 투여량의 0.1%만이 혈장내에 남아 있다. 두번째 위상에서는 느리게 감소한다.
A 사슬의 폴리사카라이드 단위를 산화시킬 경우, 제거 프로필은 크게 변화된다 : 첫번째 제거 위상-생성물 대다수의 제거가 나타남-은 실제적으로 억제되어 A 사슬의 혈장 레벨이 크게 증가된다. 주사후 20시간 때에 산화된 A 사슬의 농도는 변형되지 않은 A 사슬보다 600배 더 크다(제2곡선).
[실시예 3]
본 실시예는 NEM을 사용하여 보호시킨 A 사슬의 약리 동역학적 특성에 대하여 과요오드산염 산화가 미치는 영향을 나타낸다.
1) -리신의 A 사슬의 변형
a) N-에틸말레이미드를 사용한 고유 SH의 보호.
8mg/ml를 함유하는 리신의 A 사슬 수용액 40ml(즉 4.1 마이크로몰의 A 사슬)을 2-메르캅토 에탄올 수용액으로 처리하여 최종 농도가 1%가 되도록 한다.
상기 용액을 1시간 동안 방치하고, pH 7의 125mM 인산염 완총액에 대해 계속적으로 투석시키고, 300ml/h의 속도로 40시간 마다 새로 갈아준다.
엘만의 방법을 이용하여 리신의 A 사슬 1몰당 0.9당량의 SH가 측정된다.
효소학의 방법(11권, 541페이지, 1967년)에 기재된 방법에 따라 상기 SH기를 N-에틸말레이드로 보호한다. 상기 실험을 수행하기 위해, 전단계에서 수득한 리신의 A 사슬을 A 사슬 1몰당 20당량의 N-메틸말레이미드의 존재하에 30
Figure kpo00018
C에서 2시간 동안 반응시킨다. pH 7의 125mM 인산염 완충액에 대해 계속적으로 투석하여 과량의 시약을 제거하고, 500ml/h의 속도로 20시간 마다 완충액을 새로 갈아준다. 엘만 시약에 의해 검출될 수 있는 SH기가 존재하지 않는 7mg/ml를 함유하는 리신의 A 사슬 용액 35ml가 수득된다. 수득된 생성물을 A 사슬(NEM)이라 명명한다.
b) A 사슬(NEM)의 과요오드산염 산화.
A 사슬(NEM)의 과요오드산염 산화는 실시예 2에 기재된 방법에 따라 수행한다.
2) 산화된 A 사슬(NEM)의 특성.
a) 산화된 A 사슬(NEM)의 효소 활성.
실시예 1에 기재된 방법에 따라 단백질 합성에 대한 억제 활성을 측정한다. 산화된 A 사슬(NEM)에 있어서, 효소활성은 4.3×10-10몰/ℓ의 IC50으로 유지된다고 밝혀진다.
b) 산화된 A 사슬(NEM)의 약리 동역학적 특성.
산화된 또는 비산화된 A 사슬(NEM)을 토끼의 귀정맥에 1회 주사하여 투여한다. A 사슬의 주사량은 0.100mg/kg이다. 23시간후에 혈장 시료를 수거하여 실시예 2에 기재된 면역 측정 시험 RIM-1을 이용하여 분석한다. 결과는 하기표에 기재한다.
Figure kpo00019
주사후 23시간후에 산화된 A 사슬(NEM)의 농도는 비 변형된A 사슬(NEM)에서 보다 800배 크다.
[실시예 4]
본 실시에는 산화된 A 사슬의 약리 동역학적 특성에 대한 산화처리 시간의 중요성을 설명한다.
과요오드산 나트륨 처리시간을 제외하고, 실시예 2에 기재된 방법에 따라 산화된 A 사슬 제제 6개를 제조한다. 처리시간을 각각 0(에틸렌 글리콜을 사용하여 반응을 즉시 정지시킨다). 20분, 40분, 2.5시간, 4시간 및 18시간이도록 한다.
상기의 각종 제제를 토끼에게 주사하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 23시간후에 A 사슬의 상대 혈장 농도를 측정한다.
결과는 제2도에 나타낸다. 상기 결과로 부터 1) 반응을 즉시 정지시켰을때의 A 사슬의 혈장 농도가 천연 A 사슬에서의 혈장 농도와 같으므로, A 사슬의 혈장 레벨의 증가는 실제로 과요오드산염 산화에 기인된다. 및 2) 최적 효과를 얻기 위해서는 상대적으로 오랜 시간동안 반응시킬 필요가 있다는 것을 알 수 있다.
[실시예 5]
본 실시예는 NEM으로 보호시킨 메틸화 A 사슬의 약리 동역학적 특성에 대한 산화처리 시간의 중요성을 설명한다.
1) 리신의 기능화된 A 사슬의 제조
a) N-에틸말레이미드를 사용한 A 사슬의 천연 SH기의 보호.
실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로, N-에틸말레이미드를 사용하여 A 사슬의 고유한 SH를 보호한다.
b) A 사슬의 메틸화.
민스 및 휘니의 방법(생화학 7권, 2192페이지, 1968년)에 따라 메틸화 반응을 pH 10의 0.2M붕산염 완충액내에서 교반하며 0
Figure kpo00020
C에서 수행한다.
65.5ml의 A 사슬(NEM) (3mg/ml)에 38mg의 삼증수소보란(47mCi/밀리몰 함유)을 가하고, 이어서 1ml의 6% 포름알데히드를 200㎕씩 30분 동안에 걸쳐 5번 가한다.
pH 7의 125mM 인산염 완충액(40ml)에 대해서 불연속 투석하여 과량의 시약을 제거한다. 투석후 단백질 용액을 원심분리한다. 따라서 3mg/ml의 메틸화된 A 사슬 63ml가 수득된다.
c) 과요오드산염 산화.
과요오드산 나트륨 처리 시간을 제외하고 실시예 1에 기재된 방법에 따라 메틸화된 A 사슬(NEM) 제제 6개를 산화시킨다. 각각 0(에틸렌 글리콜을 사용하여 반응을 즉시 정지시킨다), 10분, 40분, 2.5시간, 4시간 및 18시간 동안 반응을 수행시킨다.
상기한 각종 제제를 토끼에게 주사하고, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 주사후 23시간때의 A 사슬의 상대 혈장 농도를 측정한다.
결과는 제3도의 제2곡선에 나타낸다. 상기 결과는 A 사슬(제1곡선)에 있어서 하기 사항들을 나타낸다 : 1) 반응을 즉시 정지시켰을때의 메틸화된 A 사슬(NEM)의 혈장농도가 A 사슬에서의 혈장 농도와 같으므로 메틸화된 A 사슬(NEM)의 혈장 레벨의 증가는 실제로 과요오드산염 산화에 기인한다, 및 2) 최적 효과를 얻기 위해서는 상대적으로 오랜 시간 동안 반응시킬 필요가 있다.
[실시예 6]
본 실시예는 A 사슬의 2가지 성분 분자 변종(A1 사슬 및 A2 사슬)에 대해서 각각 산화반응을 수행할 경우에 리신의 A 사슬에 대해 실시예 2에 기재한 것과 유사한 결과들이 각각의 2가지 이성질체에서 나타남을 설명한다.
1) A1 및 A2 사슬의 분리
pH 7.0의 125mM 인산염 완충액에 용해시킨 10.9mg/ml의 A 사슬 28 ml (30 9mg)은 동일한 완충액으로 평형시킨 콘카나발린 A/세파로스(112ml) 컬럼에 석출된다. 동일한 완충액으로 세척하여 첫번째 피크에서 A1 사슬이 수거되고 ; 0.5M NaCl 및 0.1M
Figure kpo00021
-메틸 만노시드를 함유하는 pH 6.0의 0.1M 붕산염 완충액으로 A2 사슬이 용출된다.
따라서 184mg의 A1 사슬 및 103mg의 A2 사슬이 수득된다.
질소 압력하에서 한외여과하여 A1 및 A2 사슬을 농축하고 ; pH 7.0의 125mM 인산염 완충액에 대해서 A2 사슬을 투석한다.
SDS를 사용한 아크릴아미드 겔 경사 전기영동에 의해 A 사슬을 분석하면 30 ,000 및 33,000의 분자량에 상응하는 다른 강도의 2가지 밴드가 나타난다. A1 사슬은 분자량 30,000이며 보다 강한 강도의 밴드에 해당되고, A2 사슬은 분자량 33,000이며 약한 강도를 갖는 밴드에 해당된다.
2) 과요오드산 나트륨을 사용한 리신의 A1 및 A2 사슬의 변형
실시예 2에 기재된 방법으로 수행한다. 폴리사카라이드 단위가 산화된 A 사슬의 제제에 대해서, 단백질 합성 억제에 대한 효소활성 및 약리 등 역학적 특성을 측정한다.
3) 무세포성 모델에서 측정한 지속작용 A1 및 A2 사슬의 효소활성
실시예 1에 기재된 방법에 따라 억제활성을 측정한다. 산화된 A1 및 A2 사슬에 대해 각각 2.1×10-10몰/l및 2.1×10-10몰/l 의 IC50이 측정된다. 본 실시예에서 대조용으로 사용되는 천연 A1 및 A2 사슬의 IC50값은 각각 1.9×10-10몰/l 및 1×10-10몰/l이다. 따라서 A 사슬의 분리 변종을 변형시켜도 효소활성은 손실되지 않는다.
4) 지속작용 A1 및 A2 사슬(A1-La, A2-La)의 약리 동역학적 특성
A1 또는 A1-La 사슬 또는 A2 또는 A2-La 사슬을 토끼의 귀정맥에 일회 주사하여 투여(415㎍ A 사슬/kg)한다. 20시간후에 혈장시료를 수거하고, 면역 측정 시험 RIM-1(실시예 2참조)을 사용하여 분석한다. 결과는 하기표에 나타낸다. A 및 A-La 사슬의 값은 대조용으로 나타낸다.
Figure kpo00022
주사후 20시간때의 A1-La의 농도는 A1 및 A2보다 각각 500 및 350배 더 크다.
[실시예 7]
본 실시예는 A 사슬 및 그의 변종인 A1 사슬 및 A2 사슬의, 천연형 및 산화형의 생화학적 특성을 설명한다. 상기 연구에 사용되는 A 사슬은 실시예 2 및 6에 기재된 것처럼 제조된다.
I-탄수화물 조성
상기 단백질의 탄수화물 조성을 클램프의 방법[당단백질 내의 : 조성, 구조 및 기능(A, 고트샬크 편집). 5A권, 300∼321페이지, 엘스비에르 출판사, 암스테르담, 런던, 뉴욕]을 이용한 기체 크로마토그래피 분석에 의해 측정한다.
수득된 결과를 하기 2가지 표에 기재 및 대조시킨다.
Figure kpo00023
몰 조성
(분자량 30,625를 기준으로 하여 하기 결과는 1분자당-또는 -0.5 잔기의 평균 정확성으로 나타낸다.)
Figure kpo00024
상기 결과는 과요오드산염 산화에 의해 A 사슬의 당의 일부가 파괴됨을 나타낸다. A 사슬 1분자당 각각의 A, A1 및 A2 사슬에서 만노스 잔기는 3.17, 2.11 및 2.94의 평균 감소가 일어나고, 푸코스 잔기는 완전히 소실되며, 크실로스 잔기는 1.24, 1 및 1.05의 평균 감소가 일어난다. N-아세틸글루코스아민 잔기는 단지 약간 분해된다.
Ⅱ-N-말단 서열
A 사슬 및 그의 A1 및 A2 변종의 천연형 및 산화형에 대한 N-말단아미노산 서열을 종래의 공지된 방법으로 단백질 시퀀서(sequencer)를 사용하여 측정한다. 결과는 하기표에 대조시킨다.
Figure kpo00025
천연 및 산화된 A, A1 및 A2 사슬의 9N-말단아미노산 서열이 서로 완전히 동일하다고 밝혀지고, 따라서 산화처리는 단백질 사슬을 손상시키지 않음이 증명된다. 또한, A 사슬의 9N-말단 아미노산의 서열은 후나쓰의 리신의 A 사슬(농업 생물 학적., 43권, 2221 페이지, 1979년)에서 먼저 기재된 것과 완전히 동일하다는 것이 발견된다.
Ⅲ-큰카나발린 A/세파로스에 대한 친화도
A 사슬, DTNB로 보호시킨 A 사슬[A(DTNB)] 및 A(DTNB)-La, A1 (DTNB), A1(DTNB)-La, A2(DTNB) 및 A2(DTNB)-La 사슬에 대하여 콘카나발린 A/세파로서와 결합하는 능력을 측정한다. 약 1mg/ml의 A 사슬 용액 1ml를 1ml의 콘카나발리 A컬럼에 넣는다. 크로마토그래피를 수행하여 280nm에서의 흡광도를 측정한다. 콘카나발린 A와 결합하지 않는 첫번째 피크가 기준선으로 돌아올때까지 pH 7.0의 125mM 인산염 완충액으로 세척한후, 0.5M NaCl 및 0.1M
Figure kpo00026
-메틸만노시드를 함유하는 pH 6.0의 0.1M 붕산염 완충액으로 컬럼을 세척한다. 280nm에서의 흡광도 백분율로 나타낸 결과를 하기표에 요약한다.
Figure kpo00027
콘카나발린 A는 당단백질의 말단 만노스에 대해 친화성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 상기 잔기를 함유하는 A 사슬이 con A와 결합하는 것이 발견된다. 특히, 만노스에 의해 보다 충분히 치환된 이성질체인 A2 사슬에서 뚜렷하게 나타난다. 또한 산화처리에 의해 상기 친화성이 파괴되는데, 이는 산화처리에 의하여 슈가 잔지가 파괴되기 때문이다.
Ⅳ-E 1%의 측정
280nm에서의 흡광계수(E 1%)는 1mg/ml 용액의 280nm에서의 흡광도이고, 소혈청 알부민의 표준 범위를 이용한 폴린 시험에 의해 단백질 농도를 측정한다.
결과는 하기표에 요약한다.
Figure kpo00028
사슬의 티올기를 DTNB로 보호하면 니트로벤조일기의 도입으로 인해 280nm에서의 흡광도가 크게 증가한다.
산화후, 280nm에서의 흡광도가 크게 변화하지 않는데, 이는 산화로 인해 280nm에서의 흡광에 관여하는 아미노산이 영향을 받지 않는다는 것을 증명한다.
Ⅴ-동전 초점
동전 초점에 의한 A 사슬의 분석으로 부터 A, A1 및 A2 사슬이 모두 같은 7.5∼8.0의 등전점(pI)을 갖는 일련의 밴드들로 나타난다.
DTNB를 사용하여 A 사슬의 시스테인을 보호하면 밴드가 산부분으로 확장되고 ; 메르캅토 에탄올로 시스테인을 유리시키면 천연 A 사슬 위치로 다시 돌아온다.
천연형 및 산화형 A, A1 및 A2 사슬의 동전점을 비교하면, 보호제가 없을때 A 사슬을 나타내는 모든 밴드들이 산 pH 값으로 0.5pH 단위 만큼 이동하는 것이 나타난다. 상기 이동은 천연형 및 산화형 A 사슬의 pH 부분이 겹쳐지지 않게 일어나는데, 이는 즉 모든 A 사슬 분자들이 산화에 의해 영향 받는다는 것을 나타낸다고 추측된다.
[실시예 8]
본 실시예는 동물에 정맥내 주사한후, 1)천연 겔로닌의 빠른 제거, 및 2)과요오드산 나트륨으로 변형시킨 겔로닌의 느린 제거을 설명한다.
I-과요오드산 나트륨을 사용한 겔로닌의 변형
문헌(생물 화학 저어널, 1980년, 255권, 6947∼6953 페이지)에 기재된 방법에 따라 겔로늄 멀티플로룸으로 부터 겔로닌을 제조 및 정제한다. 티올기를 DTNB로 보호하는 단계를 생략하는 것을 제외하고, 실시예 2의 리신의 A사슬의 산화반응과 동일한 조건하에서 산화반응을 수행한다.
실제로 겔로닌의 고유 티올기를 이용한 겔로닌과 항체와의 결합은 일반적으로 일어나지 않으므로, 산화 단계후에 암연구(1984년, 44권, 129∼133 페이지)에 기재된 방법에 따라 티올기를 인공적으로 도입한다. PBS 완충액에 용해시킨 3mg/ml의 겔로닌 용액 1ml에 물에 용해시킨 0.5M 과요오드산 나트륨 용액 21㎕를 가하고, 1M 아세트산을 사용하여 pH6으로 조절한다. 어두운곳에서, 4
Figure kpo00029
C에서 16시간 동안 보온한다. 1M 에틸렌 글린콜 수용액 105㎕를 가하여 반응을 정지시킨다. 20
Figure kpo00030
C에서 15분 동안 보온한후, 반응 매질을 4
Figure kpo00031
C에서 PBS 완충액에 대히 투석한다. 10,000×g에서 30분 동안 원심분리한후, 2.5mg/ml의 농도를 갖는 산화된 겔로닌 2.9mg이 수득된다.
리신의 A사슬과 마찬가지로 겔로닌의 주요 특성은 리보솜의 서브-유니트 60S를 분해하여 진핵 세포에서의 단백질 합성을 억제하는 것이다(생화학 저어널, 1982년, 207권, 505∼509 페이지). 또한 겔로닌도 과요오드산염 산화에 의한 변형으로 인해 활성이 손실되지 않는다.
Ⅱ-지속작용 겔로닌의 약리 동역학적 특성
천연 겔로닌 또는 상술한 방법으로 변형시킨 겔로닌을 토끼의 귀정맥에 1회 주사하여 투여한다. 겔로닌의 주사량은 0.3∼0.4mg/kg이다. 이따금 헤파린 처리를 하면서 혈장 시료를 체취한다. 하기에서 RIM-2로 약칭한 방사능 면역 측정 시험을 이용하여 혈장을 분석한다.
Ac1 용액이 친화도 크로마토그래피로 정제한 항-겔로닌 토끼 항체 용액이고 Ac2 항체는 방사능 표시된 동일한 항체인 것을 제외하고, RIM-1 시험과 동일한 방법으로 수행한다. 방사능표지 방법은 RIM-1에 기재한 것과 동일하다. 시료시된 동일한 항체인 것을 제외하고, RIM-1 시험과 동일한 방법으로 수행한다. 방사능표지 방법은 RIM-1에 기재한 것과 동일하다. 시료내의 천연 겔로닌 또는 변형된 겔로닌의 농 시험에 기재된 것과 동일한 신뢰성 및 재현 가능성을 갖는다. 상기 실험의 결과를 실시예 2의 리신의 A 사슬에서와 같은 방법으로 나타낸다.
제4도는 정맥 주사한 천연 겔로닌 및 신화된 겔로닌의 시간에 따른 혈장 제거 곡선을 나타낸다. 천연 겔로닌은 천연 리신의 A 사슬과 같이, 매우 급속히 혈류로 부터 제거되어 24시간후에는 혈류 존재 겔로닌의 99.99%가 소실된다(제1곡선). 겔로닌의 폴리사카라이드 단위를 산화시키면, 제거 양상이 크게 변형되어 : 주사후 24시간때의 산화된 겔로닌의 농도는 천연 겔로닌보다 300배 더 크다(제2곡선).
즉, 리신의 A사슬에서와같이, 과요오드산염 산화는 겔로닌의 제거에 관여하는 인지 과정에서 이용되는 슈가를 변형시킴으로서 상기한 인지를 방해한다.
[실시예 9]
본 실시예는 동물에게 정맥 주사하였을때
1. 모모르디카 차란티아로 부터 추출한 GPIR MOM의 급속한 제거, 및
2. 과요오드산 나트륨을 사용하여 변형시킨 GPIR MOM의 느린 제거를 증명한다.
1)-과요오드산 나트륨을 사용한 GPIR MOM의 변형
문헌(생화학 저어널, 1980년, 186권, 443∼452 페이지) 에 기재된 방법에 따라 모모르디카 차란티아 종자의 씨 젖배유로 부터 GPIR MOM 을 제조 및 정제한다. 천연 또는 변형된 MOM 의 약리 동역학적 특성을 방사성 GPIR MOM 을 사용하여 측정한다. 클로르아민 T의 좆재하에 방서성 요오드-125 로 MOM의 티로신에 방사성 표지한다. PBS 완충액에 용해시킨 1mg/ml의 MOM 용액 100㎕에 100μCi/ml의 방사성 요오드-125용액 10㎕ 및 물에 용해시킨 2.5mg/ml의 클로로아민 T용액 30㎕을 가한다. 반응은 주위온도에서 1분동안 수행한다. 0.5mg/ml의 메타증 아황산 나트륨 용액 400㎕를 가하여 반응을 정지시킨다. 0.1%의 젤로틴을 함유하는 PBS 완충액을 사용하여 반응 매질을 세파덱스 G25 컬럼에서 겔 여과에 의한 크로마토 그래피를 수행하여, 반응하지 않은 요오드로 부터 방사능 표지된 단백질을 분리한다. 10,000×g에서 30분동안 원심분리한후 0.04mg/ml의 농도를 갖는 방사능 표지된 MOM 80㎍이 수거된다.
DTNB를 사용하여 티올기를 보호하는 과정을 생략하고 단백질 농도를 125배 작게(40㎍/ml)하여, 실시예 2의 리신의 A사슬에 기재된 것과 동일한 조건하에서 산화반응을 수행한다. 0.04mg/ml 방사능 표지된 MOM 용액 1ml에 물에 용해시킨 0.5M 과요오드산 나트륨 용액 20㎕를 가하고, 1M 아세트산을 사용하여 pH 6으로 조절한다. 어두운 곳에서 4
Figure kpo00032
C에서 16시간 동안 보온하다. 1M에틸렌 글리콜 수용액 100㎕를 가하여 반응을 정지시킨다. 20
Figure kpo00033
C에서 15분 동안 보온한후 4
Figure kpo00034
C에서 PBS 완충액에 대해 반응매질을 투석한다. 10,000×g에서 30분동안 원심분리한후 0.02mg/ml 농도의 산화된 MOM 32㎍이 수거된다.
수거된 새로운 분자의 분자량은 천연 MOM과 크게 다르지 않다. 코마시 블루 또는 방사성 자동 사진법으로 전개시킨후 폴리아크릴아미드 경사 전기영동에 의해 관찰한 결과, 변형 과정은 단지 단백질 중합체를 소량 생산하고 다른 분해 생성물은 생성하지 않는다.
2) 지속작용 MOM의 약리 동역학적 특성
상술한 방법에 의해 산화 또는 비산화된 방사는 표지된 MOM을 토끼의 귀정맥에 1회 주사하여 투여한다. MOM 주사량은 3.50∼3.55㎍/kg이다. 이따금 헤파린 처리를 하면서 혈액 시료를 채취한다. 트리클로로아세트산(TCA, 25% 농도 200㎕)과 함께 혈장(200㎕)을 4
Figure kpo00035
C에서 30분 동안 보온한다. 원심분리후 산에 의해 침전된 침전물에 함유된 방사성을 측정한다.
상기 분석 방법으로 완전한 MOM 분자의 혈장 레벨을 측정할 수 있고, TCA에 의해 침전되지 않는 저-분자 분해 생성물을 고려하지 않는다.
상기 실험의 결과는 시간에 따른 혈류에 잔류하는 초기 방사성의 백분율로 나타낸다. 상기 값을 “초기 혈장 방사성의 백분율”(% IPR)로 명명하고, 하기식으로 계산한다.
Figure kpo00036
상기식중 ; r은 0.2ml의 혈장내에서 t시에 측정한 방사성을 나타낸고,
R은 방사성의 전체 주사량을 나타내며, PV는 혈장 부피(36ml/kg동물 몸무게)를 나타낸다.
정맥 주사후 산화된 또는 비산화된 MOM의 시간에 다른 혈장 제거 곡선을 제5도에 나타낸다. 천연 리신의 A사슬과 같이. MOM은 혈류로 부터 급속히 소실되어 주사후 8시간까지 99.9%의 MOM이 혈류로 부터 소실된다(제1곡선). MOM의 슈가 잔기를 산화시킬 경우 제거속도는 감소되어 (제2곡선), 주사후 8시간때의 산화된 MOM 레벨은 비산화된 MOM 보다 60배 더 크다. 상기 결과로 부터 과요도도산염 산화는 MOM의 급속한 제거에 관여하는 인지 과정을 수행하는 슈가를 변형시킨다는 것이 증명된다.
[실시예 10]
본 실시에의 동물에 정맥 주사할 경우
1. 카네이션으로 부터 추출한 GPIR 다이안틴의 급속한 제거, 및
2. 과요오드산 나트륨을 사용하여 변형시킨 GPIR 다이안틴의 느린 제거를 증명한다.
1)과요오드산 나트륨을 사용한 다이안틴 30의 변형
문헌(생화학 저어널, 1981년, 195권, 339∼405 페이지)에 기재된 방법에 따라 카네이션으로 부터 다이안틴 30을 제조 및 정제한다. 방사성 다이안틴을 이용하여 산화된 또는 비산화된 다이안틴 30의 약리학적 특성을 측정한다. 실시예 9의 MOM에서와 동일한 조건하에 요오드화 및 산화 반응을 수행한다. 새로이 생성된 산화된 다이안틴 분자의 분자량은 천연 다이안틴 30과 크게 다르지 않다.
2) 지속작용 다이안틴 30의 약리동역학적 특성
산화된 도는 비산화된 방사성 표지된 다이안틴을 토끼의 귀정맥에 1회 주사하여 투여한다. 실시예 9의 MOM에 대해 기재된 것과 동일한 방법으로 다이안탄의 혈장 레벨을 측정한다. 제6도는 산화된 다이안틴(제2곡선) 또는 비산화된 다이안틴(제1곡선)의 시간에 따른 혈장 제거 곡선을 나타낸다. MOM과 같이 다이안틴 30은 혈류로 부터 급속히 소실되어 주사후 2시간내에 초기량의 99.9%가 소실된다. 한편 다이안틴 30의 탄수화물 잔기를 산화시키면 제거 역학이 크게 감소되어 주사후 2시간때의 다이안틴 레벨은 비산화된 다이안틴 보다 80배 더 크다. 산화된 다이안틴의 레벨은 25시간후에도 높게 유지된다(24시간때 초기값의 3%).
또 다시 과요오드산염 산화에 의해 다이안틴의 급속한 제거에 관여하는 인지과정을 수행하는 슈가가 변형되다는 것이 증명된다.
[실시예 11]
인체 T 세포를 억제하는 항체(항원 T65에 대항한 항체)를 활성화 디설파이드기로 치환하여 산화된 리신의 A 사슬과 반응시킴으로서 수득된 접합체.
a) 인체 T 세포 역제 항체(또는 항체 T101)
면역학 저어널(1980년, 125(2)권, 725∼735 페이지)에 기재된 방법에 따라 상기 항체가 수득된다.
b) 산화된 리신의 A사슬 : 실시예 2의 기재한 방법에 따라 리신의 A 사슬이 제조된다.
Ⅱ. 인체 T 세포를 억제하는 활성화 항체
200mg/ml의 3-(피리딘 -2-일디설파닐)프로피온산을 t-부탄올에 용해시킨 용액 100㎕에 60.3mg/ml의 1-에틸-3-디메틸아미노프로필-3-카르보디이미드 용액 20㎕를 가하고, 이 혼합물을 주위 온도에서 3분 동안 방치한다. 수득된 용액 68㎕를 PBS 완충액에 용해시킨 89mg/ml의 항체 용액 2ml에 가한다. 상기 혼합물을 30
Figure kpo00037
C에서 15분동안 교반하고 이어서 4
Figure kpo00038
C에서 PBS 완충액에 대해 투석한다. 투석후 단백질 용액을 원심분리하여 7.9mg/ml농도의 활성 항체 15mg이 수득된다. 2-메르캅토 에탄올로 교환하여 유리된 피리딘-2-티온에 대해 343nm에서 분광광도 측정 분석하면 수득된 항체가 항체 1몰당 3.8활성화 혼성 디설파이드기를 갖는것으로 밝혀진다.
Ⅲ) 지속작용 리신의 A사슬을 함유하는 면역 독소의 제조
2.87mg/ml의 변형된 A사슬 2.46ml를 상기에서 수득한 활성 항체 용액 1.5ml(농도 : 7.9mg/ml, 즉 11.8mg의 활성항체)에 가하고 이 혼합물을 20
Figure kpo00039
C에서 20시간 동안 보온한다. 상기 용액을 원심분리하고 이어서 세파덱스 G100컬럼에 여과하여 정제시킨 다음, 280nm에서 용출액의 흡광도를 측정하나. 항체 및 A 사슬을 함유하는 분획들을 혼합하여 0.7mg/ml의 면역독소 용액 15ml, 즉 10.5mg의 면역 독소가 수득된다. 상기 용액은 1ml 당 항체와 결합한 산화된 A 사슬 0.14mg을 함유한다.
따라서 상기 제조에서 평균 결합도는 항체 1 몰당 산화된 A 사슬 1.2몰이다.
상기에서 수득한 리신의 산화된 A 사슬을 함유하는 면역 독소, IT(A-La)T10 1에 대해 약리 동역학적 특성 및 표적 세포에 대한 특이한 세포독소 특성을 조사한다.
[실시예 12]
본 실시예는 리신의 지속작용 A 사슬을 함유하는 면역 독소[IT(A-La)T101로 약칭함]가 느린 혈장 제거 특성을 갖는 것을 증명한다.
Ⅰ-방법
실시예 11에 기재된 방법으로 제조한 접합체를 토끼의 귀정맥에 1회 주사하여 투여한다. A 사슬에서와 같이 주사량은 0.415mg/kg이다. 이따금 헤파린 처리를 하며 혈장 시료를 채취한다. 방사능 면역 측정 시험(하기에는 RIM-3으로 약칭함)으로 혈장을 분석한다. Ac2용액이 생쥐 IgG를 억제하는 염소 항체를 친화도 크로마토 그래피로 정제하고 RIM-1 방법으로 방사능 표지시킨 용액이라는 점을 제외하고, 상기 시험은 RIM-1 시험에 사용된 것과 동일한 방법으로 수행한다. 변형시킨 면역독소를 각기 다른 알고있는 농도를 도입하여 얻은 검정곡선을 참고하여 시료내의 변형된 면역 독소의 농도를 측정한다. RIM-3 시험은 RIM-1 방법에 기재된 것과같은 신뢰성 및 재현 가능성을 갖는다.
대조하기 위해, 활성화 디설파이드기로 치환된 동일한 항체 T101을 천연 리신의 A 사슬과 반응시켜 수득한 접합체 IT T101을 사용하여 동일한 조건하에서 대조실험을 수행하다. 상기 접합체의 제조 및 세포 독소 특성은 프랑스공화국 특허 출원 제25 16794호에 기재되어 있다. 상기 실험의 결과는 실시예 2의 비결합된 리신의 A사슬과 동일하게 나타난다.
Ⅱ-결과
제7도는 IT T101 및 IT(A-La)T101의 정맥 주사후 시간에 따른 혈장 제거곡선을 나타낸다. 주사후 24시간때에 IT(A-La)T101 활성 면역독소의 농도는 IT T101보다 140배 더 크다. 상기 결과로 부터 산화시킨 A 사슬의 새로운 약리 동역학적 특성은 항체와 결합한 후에도 유지된다는 것이 증명된다.
[실시예 13]
본 실시예는 표적 세포에 대한 IT(A-La) T101의 천연 세포 독소 특성이 유지된다는 것을 증명한다.
리신의 A 사슬의 주요 생물학적 특성은 리보솜의 서브-유니트 60S를 분해함으로서 단백질 합성을 억제하는 것이다.14C-류신과 배양중인 암발생 세포와의 배합에 의한 물질의 효과를 연구할 수 있는 세포 모델을 사용하여 본 방업을 수행한다.
사용하는 세포는 항원 T65 를 운반하는 인체 T 백혈병으로 부터 유도한 CEM 세포 계통에 속한다. 연구할 물질의 존재하에 시포를 배양하고, 배양이 끝난 다음 상기 처리한 세포와14C-류신의 배합도를 측정한다.
상기 측정은14C-류신 추적자를 사용하여 단백질 합성도를 측정하는 방법(생물화학 저어널, 1974년, 249(11)권, 3557∼3562 페이지)에 따라 수행한다. 배합된 방사성은 여과하여 분리한 전체 세포에서 측정된다.
상기 측정은 기준으로 하여 횡좌표에 실험한 물질에서의 A 사슬의 물농도를 나타내고, 종좌표에 단백질 합성에 영향을 미치는 다른 물질의 부재하에 대조용 세포에 의한 배합 백분율로서14C-류신의 배합을 나타내어 투여량/효과 곡선을 그린다.
따라서 실험하는 각각의 물질에 대하여,14C-류신의 배합을 50% 억제하는 농도, 즉 “50% 억제농도”(IC50)을 측정할 수 있다.
제8도는 배양 배지에서 10mM 염화암모늄 존재하에 비결합된 산화시킨 A 사슬과 IT(A-La) T101과의 동일한 실험으로 부터 얻어진 곡선을 나타낸다. 상기 도면에서 IT(A-La) T101은 매우 강력한 세포 독소 활성(IC50=5.5×10-12M)을 가지며, 동일한 조건하에 측정하였을때 비결합된 산화시킨 A사슬보다 약 80.000배 더 크다는 것을 알수 있다.
[실시예 14]
본 실시예는 클로노게닉 시험에서 측정된, CEM 표적 세포에 대한 IT(A-La) T101 ALC IT T101의 비교 세포 독성 효율을 증명한다.
모든 단일 표적 세포의 박멸을 위해 면역독소를 사용한다. 상기 실험은 고도로 섬세한 기술에 의해서만 측정되는데, 군체 형성 억제시험에서는 단일 생존 세포라도 수백만개의 사멸 세포중에서 나타날 수 있기 때문이다. 따라서 CEM 인체 임파양 세포를 가한 겔화 배지에서 최적 배약 조건하에 수행한다.
Ⅰ-군체 형성 억제에 의한 세포독성 측정방법
1 밀리몰/ℓ의 소듐
Figure kpo00040
-케토글루타레이트, 1밀리몰/ℓ의 소듐 옥살로아세테이트, 5%의 비활성화 태내 송아지 혈청 및 10%의 비활성화 말혈청을 가한 RPMI 1640 배지를 클로닝 배지로 사용한다. 상기 배지에서 첫번째 0.3% 한천 용액(아가로우즈형 Ⅶ, 시그마 실험실)을 제조하여 작은 페트리 접시에 얇은 층을 이루도록 가한후, 4
Figure kpo00041
C에서 고형화시킨다. 37
Figure kpo00042
C로 유지시킨 두번째 0.275% 한천 용액과 세포를 혼합하고, 이 혼합물을 상기 첫번째층에 가하고 고형화 시킨다. 클로닝효율, 군체의 크기 및 배지의 일정성을 동시에 최적화시키기 위해 예비 실험후 한천의 상기 농도를 선택한다. 배양기에서 15일 동안 배양한후 자동 군체 계산기(“ARTEK”, 미합중국 DYNATECH)를 사용하여 군체를 계산한다. 클로닝 효율 및 그에 따른 면역 독소 처리에서 잔존하는 세포의 정확한 수를 측정하기 위해, 형성된 군체의 수에 따른 접종한 세포의 수를 나타내는 검정곡선을 얻어야 한다. 상기 검정곡선에 나타낸 클로닝 효율은 세포를 면역 독소로 처리할때 자연적으로 생성되는 높은 비율의 사멸 세포에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다는 것이 증명된다.
면역 독소 처리는 10%의 비활성화 태내 송아지 혈청 및 10 밀리몰/ℓ의 염화암모늄을 함유하는 RPMI 1640 배지의 총 부피 1ml에서 지수형 성장상태이고 106/ml의 농도를 갖는 세포와 다른 농도의 면역독소 IT(A-La) T101 또는 IT T101을 배양함으로써 수행한다. 5% 이산화탄소를 함유한 대기하에 37
Figure kpo00043
C에서 시험관을 수평 진탕(“GIRATORY G-2” 진탕기 사용, 2500rpm, NEW-BRUNSWICK)하여 배양한다. 이어서 세포를 세척하고, 한천 용액과 혼합하기 전에 각기 다른 희석액을 제조하여 생존하는 세포의 수를 검정 곡선에 주어진 최대 민감도 지역에서 측정한다. 결과는 하기식을 이용하여 클로닝 효율로 부터 외삽법으로 측정한 생존 세포의 절대수로 나타낸다.
생존세포의 절대수 :
Figure kpo00044
상기식중, C는 1페트리 접시당 클로온의 수를 나타내고, d는 실험한 세포 제제의 희석계수를 나타내며, E는 검정곡선의 기울기로 부터 얻은 클로닝 효율을 나타낸다. 각각의 점은 3실험의 평균이다.
Ⅱ-결과
제9도는 10mM 염화암모늄의 존재하에 면역 독소 농도(A 사슬의 물 농도)에 따른 면역 독소 IT(A-LA) T101 및 IT T101의 CEM 세포에 대한 세포독소 활성을 나타낸 곡선이다. 상기한 2가지 생성물의 효율이 같은 크기 변화를 갖는 것으로 타나난다. 두 경우에서 모두 세포의 수가 결과적으로 극히 대량 감소되어, 10-11M 이하의 농도에 대해 생존하는 잔류 세포의 비율을 초기값의 0.001%이다. 상기 농도에서 비결합된 A 사슬 또는 비-고유성 면역 독소는 상기 세포에 영향을 미치지 않으므로 상기 효과는 매우 특이하다.
본 실시예는 IT(A-La) T101이 종래의 IT T 101과 실질적으로 동일한 교유 면역 독소 특성을 갖는다는 것을 증명한다.
[실시예 15]
활성화 디설파이드기로 치환된 인체 T 세포 억제 항체(항원 T65에 대항하는 항체)와 산화된 및 기능화된 리신의 A 사슬(NEM)을, 활성화 디설파이드기와 A 사슬의 기능화된 슈가 잔기를 결합시킴으로써, 반응시켜 수득한 접합체.
1)-면역독소의 제조
a) 기능화된 A 사슬의 제조.
A 사슬의 SH 기를 N-에틸말레이미드로 보호하고, 실시예 3에 기재된 방법에 따라 18시간 동안 산화시킨다.
시스타민과의 결합(coupling)
pH 9.5의 탄산염 완충액에 대해 투석한후, 4.65mg/ml의 단백질 용액 5.2ml를 18mg의 시스타민 히드로크로라이드와 25
Figure kpo00045
C에서 2시간 동안 보온한다. 이어서 소듐 보로히드라이드(A 사슬 1A로당 200당량, 즉 0.1N NaOH 1ml 에 17.6mg을 함유하는 용액 156㎕)를 가하여 환원시킨다.
pH7의 125mM인산염 완충액에 대해 계속 투석하여 과량의 시약을 제거한다. 결합한 시스타민의 디설파이드 결합을 5%의 최종농도를 이루도록 2-메르캅토 에탄올을 사용하여 30
Figure kpo00046
C에서 1시간 동안 황원시키고, 이어서 pH 7의 12mM 인산염 완충액에 대해 다시 투석을 계속한다(300ml/h로 20ℓ).
투석 및 원심분리후 A 사슬 1몰당 0.25SH가 엘만 방법에 의해 측정된다.
b) 항체의 제조(실시예 11참고)
c) 결합(coupling) 반응
상기에서 수득한 활성화 항체 용액 211㎕(즉 0.006 마이크로 몰)에 변형시킨 리신의 A 사슬 용액 1.5ml(즉 0.058 마이크로몰)를 가한다, 상기 혼합물을 30
Figure kpo00047
C에서 18시간 동안 반응시킨다. 이어서 반응 매질을 PBS 완충액(1CmM 인산염, 140mM 염화나트륨, pH 7.4)에 대해 투석한다. 원심분리하고 폴리아크릴아미드 경사 전기영동하여 수득된 면역 독소가 항체 1몰당 상기 제제에 대하여 0.8A 사슬 (NEM)의 평균 결합도를 갖는다고 밝혀진다.
2) 면역독소 IT(A(NEM)-La-시스테아민) T101의 특성
a) 고유 세포독소 활성
상술한 방법에 의해 제조된 상기 면역독소는 CEM 표적 세포에 대해 매우 강력한 세포 독소 활성을 갖는다는 것이 밝혀진다(실시예 13에 기재된 방법으로 측정하여 IC50=1.2×10-11M)
b) 혈장제거
면역 독소를 토끼의 귀정맥에 1회 주사(50㎍ A 사슬/kg)하여 투여한다. 22시간후에 혈장 시료를 수거하여 면역 분석법 RIM-3(실시예 12)을 사용하여 분석한다. 결과는 하기표에 기재한다. 대조용으로 IT T101의 값을 나타낸다
Figure kpo00048
주사한후 22시간때에 변형된 A 사슬을 함유하는 IT 농도는 IT T101보다 30배 더 크다.
[실시예 16]
활성화된 디설파이드기로 치환한 인체 T 세포 억제 항체(항원 T65에 대항하는 항체)와 산화된 및 기능화된 리신의 A 사슬(NEM)의 활성화 디설파이드기와 A 사슬의 변형된 슈가 잔기를 결합시키는 반응으로부터 수득한 접합체.
1)-면역독소의 제조
a) 기능화된 A 사슬의 제조
A 사슬의 SH 기를 N-에틸말레이드로 보호하고 이어서 실시예 5에 기재된 방법에 따라 18시간 동안 에틸화 및 산화시킨다.
시스타민과 결합(coupling)
pH 9.5의 0.1M 탄산염 완충액에 대해 투석한후 2.5mg/ml의 단백질 용액 18.5ml를 35.6mg의 시스타민 히드로클로라이드와 25
Figure kpo00049
C에서 2시간 동안 반응시킨다. 상기 반응후 소듐 보로히드라이드(A 사슬 1몰당 200당량, 즉 0.1N NaOH 1ml에 17.6mg을 함유하는 용액 395㎕)로 25
Figure kpo00050
C에서 2시간동안 환원시킨다.
pH 7의 125mM 인산염 완충액에 대해 계속 투석하여 과량의 시약을 제거한다. 이어서 결합된 시스타민의 디설파이드 결합을 최종농도 5%를 이루도록 2-메르캅토 에탄올을 사용하여 30
Figure kpo00051
C에서 1시간 동안 환원시키고, 이어서 pH 7의 125mM 인산염 완충액에 대해 다시 계속하여 투석(300ml/h 20ℓ)한다. 투석 및 원심분리후 A 사슬 1몰당 0.32SH 가 엘만 방법으로 측정된다.
b) 변형된 항체의 제조
4.4mg/ml의 항체 T101용액 23.5ml( 즉 0.68 마이크로몰)에 에틸 알콜에 용해시킨 2.12mg의 N-숙신이미딜-3-피리딘-2-일디티오프로피오네이트 용액을 가한다. 상기 혼합물을 25
Figure kpo00052
C에서 30분 동안 교반하고, pH 7의 125mM 인산염 완충액에 대해 투석한다. 투석후 단백질 용액을 원심분리하여 4.2mg/ml의 변형된 항체를 함유하는 용액 23.5ml가 수득된다. 2-메르캅토 에탄올로 교환하여 유리된 피리딘-2-티온을 343nm에서 분광광도 측정 분석하여 수득된 항체가 1몰당 3.2활성화 혼성 디설파이드기를 갖는다는 것이 밝혀진다.
c) 결합(coupling)반응
상기에서 수득된 활성화 항체 용액 781㎕(즉, 0.22마이크로몰)에 변형된 리신의 A 사슬 용액 7.3ml(즉 0.275마이크로몰)를 가한다. 상기 혼합물을 30
Figure kpo00053
C에서 18시간 동안 반응시킨다. PSB 완충액(10mM 탄산염, 120mM 염화나트륨, pH 7.4)에 대해 반응 매질을 투석한다.
원심분리 및 폴리아크릴아미드 경사 전기영동후, 수득된 면역독소가 상기 제제에 대해 항체 1몰당 0.8산화 및 메틸화된 A 사슬(NEM)의 평균 결합도를 갖는다는 것이 밝혀진다. 상기에서 수득한 산화 및 메틸화된 리신의 A 사슬(NEM)을 함유하는 면역 독소의 표적 세포에 대한 고유 세포독소 활성 및 약리학적 특성을 측정한다.
2) 면역독소 IT(메틸화된 A(NEM)-La-시스테아민) T101의 특성
a) 고유 세포 독소 활성
상술한 방법에 의해 수득된 상기 면역독소가 CEM 표적 세포에 대해 매우 강력한 세포 독소 활성을 갖는다고 밝혀진다(실시예 13에 기재된 방법에 의해 측정함 IC50=7×10-2M).
b) 혈장제거
면역 독소를 토끼의 귀정맥에 1회 주사(81㎍ A 사슬/kg)하여 투여한다. 24시간후에 혈장 시료를 수거하고 면역 분석법 RIA-3(실시예 12)을 사용하여 분석한다. 결과는 하기표에 기재한다. IT T101의 값을 대조용으로 나타낸다.
Figure kpo00054
주사후 22시간때에 변형된 A 사슬을 함유하는 IT의 농도는 IT T101 보다 17.5배 더 크다.
[실시예 17]
생쥐에 주사한 지속작용 A 사슬의 독성
모든 동물에 대한 산화된 A 사슬의 전반적인 독물학적 영향을 검토하는 것이 중요하다(면역독소의 독성은 동일한 몰 투여량에서 A 사슬과 동일하게 크기 변화한다). 이 실험은 샤를즈 리버 프랑스 CDI 생쥐(Charles River France CDI mice)에게 산화된 A 사슬을 정맥주사로 투여하고 천연 A 사슬과 비교하여 50% 치사 투여량을 측정한다.
측정된 값을 하기표에 나타낸다.
Figure kpo00055
상기 결과는 산화된 A 사슬의 독성이 천연 A 사슬보다 낮음을 나타낸다. 천연 A 사슬을 산화에 의해 변형시키면 A 사슬의 혈장 레벨이 크게 증가하나, 생성물의 독성은 증가하지 않고 또한 정반대로 실제적으로 감소되다.
따라서, 변형된 세포독성 서브-유니트를 함유하는 면역 독소는 인체치료 의약제로 사용할 수 있다. 면역 독소 제조에 사용되는 항체에 의해 표적 세포가 인지되는 암 또는 비-암 질병의 치료를 위해 상기 변형시킨 면역 독소를 사용할 수 있다. 최적 투여 조건 및 치료 시가는 환자, 치료할 질병의 특성에 따라 결정한다.
보다 일반적인 용어로, 과요오드산 이온을 이용한 산화에 의해 탄수화물 잔기를 변형시키고 또한 변형시키지 않은 것보다 더 긴 반감기를 갖는 항종양성 당단백질이 의약제로 유용하다.
따라서, 본 발명의 다음 과제는 과요오드산 이온을 사용한 산화에 의해 탄수화물 잔기를 변형시킨 항종양성 당단백질을 주사투여, 바람직하게는 정맥 투여하기 알맞은 형태로 제조한 항종양성 의약제에 관한 것이다.

Claims (9)

  1. 변형시키지 않은 항종양성 당단백질을 과요오드산 이온을 사용하여 산화시킴을 특징으로 하는, 리보솜을 비활성화시키고 탄수화물 잔기가 변형되고 완전 리신(whole ricin)과는 다른 항종양성 당단백질의 제조방법.
  2. 리보솜을 비활성화시키고 티올기를 임의로 보호한 당단백질 수용액을 빛의 차단하의 0∼15
    Figure kpo00056
    C의 온도에서 0.2∼24 시간 동안 알칼리금속 과요오드산염 수용액과 반응시키고, 티올기를 탈보호한 후, 공지의 방법으로 최종 생성물을 분리함을 특징으로 하는, 리보솜을 비활성시키고 지속작용을 갖고 완전 리신과는 다른 당단백질 의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 출발 당단백질로 리신의 A 사슬, 겔로닌, GPIR MOM 또는 GPIR 다이안틴 30을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 출발 당단백질로 다이안틴 32, 아그로스틴 A, 아그로스틴 B, 아그로스틴 C, HCI 또는 아스파라거스 오피시날리스 억제자 중의 하나가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항중의 어느 한 항에 있어서, 사용하는 출발물질이 천연 리신의 A 사슬인 리신의 A 사슬 또는 천연 리신의 A 사슬의 단편, 또는 유전자형을 알맞게 변형시킨 세로포부터 생합성적으로 제조한 리신의 A 사슬 또는 그의 단편인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 출발물질이 기능화된 리신의 A 사슬인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 리신의 A 사슬이 메틸화 반응에 의해 기능화되는 방법.
  8. 제2항 또는 제3항에 있어서, 하나 이상의 티올기가 2, 2′-디니트로-5, 5′-디티오디벤조에이트와의 반응에 의해 보호된 리신 A 사슬 수용액을 빛의 차단하의 4
    Figure kpo00057
    C의 온도에서 0.2∼24 시간 동안 과요오드산나트륨 수용액으로 처리하고, 이 혼합물을 2-머캅토에탄올로 처리한 후 공지의 방법으로 최종 생성물을 분리함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2항 또는 제3항에 있어서, 겔로닌 수용액을 빛의 차단하의 4
    Figure kpo00058
    C의 온도에서 0.2∼24시간 동안 과요오드산염 수용액으로 처리하고, 공지의 방법에 의해 최종 생성물을 분리함을 특징으로 하는 방법.
KR1019850004354A 1984-06-20 1985-06-19 변형된 탄수화물 잔기를 갖는 항종양성 당단백질의 제조방법 KR930000058B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR84-09703 1984-06-20
FR8409703A FR2566271B1 (fr) 1984-06-20 1984-06-20 Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention
FR8502067A FR2577137B1 (fr) 1985-02-13 1985-02-13 Glycoproteines antitumorales, modifiees sur leurs motifs glucidiques
FR85-02067 1985-02-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR860000315A KR860000315A (ko) 1986-01-28
KR930000058B1 true KR930000058B1 (ko) 1993-01-06

Family

ID=26224020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019850004354A KR930000058B1 (ko) 1984-06-20 1985-06-19 변형된 탄수화물 잔기를 갖는 항종양성 당단백질의 제조방법

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0172045B1 (ko)
JP (1) JPS6112628A (ko)
KR (1) KR930000058B1 (ko)
AT (1) ATE40700T1 (ko)
AU (1) AU593211B2 (ko)
CA (1) CA1248874A (ko)
DE (1) DE3568167D1 (ko)
DK (1) DK166626B1 (ko)
ES (1) ES8605681A1 (ko)
GR (1) GR851497B (ko)
IE (1) IE58514B1 (ko)
IL (1) IL75484A0 (ko)
NZ (1) NZ212439A (ko)
PT (1) PT80662B (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2577135B1 (fr) * 1985-02-13 1989-12-15 Sanofi Sa Immunotoxines a longue duree d'action comportant un constituant glycopeptidique inactivant les ribosomes modifie sur ses motifs polysaccharidiques
IL80973A (en) * 1985-12-20 1992-08-18 Sanofi Sa Modified ribosome-inactivating glycoproteins,their preparation,immunotoxins containing them and pharmaceutical compositions containing such immunotoxins
FR2602682B1 (fr) * 1986-08-12 1988-12-02 Sanofi Sa Immunotoxines a longue duree d'action in vivo comportant une glycoproteine inhibant les ribosomes, modifiee par oxydation des motifs osidiques et formation d'une base de schiff
FR2601679B1 (fr) * 1986-07-15 1990-05-25 Sanofi Sa Immunotoxines, procede de preparation et compositions pharmaceutiques en contenant
DE4106389A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Behringwerke Ag Fusionsproteine zur prodrug-aktivierung, ihre herstellung und verwendung
US6610299B1 (en) 1989-10-19 2003-08-26 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates
US7241595B2 (en) 1989-10-20 2007-07-10 Sanofi-Aventis Pharma Deutschland Gmbh Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates
US6475486B1 (en) 1990-10-18 2002-11-05 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates
US5250532A (en) * 1991-04-11 1993-10-05 Dowelanco 3,4,N-trisubstituted-4,5-dihydro-1H-pyrazole-1-carboxamides and their use as insecticides
GB9808485D0 (en) * 1998-04-21 1998-06-17 Univ Cambridge Tech Improvements relating to immunotherapy

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL47372A (en) * 1975-05-27 1979-10-31 Yeda Res & Dev Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same
FR2437213A1 (fr) * 1978-09-28 1980-04-25 Cm Ind Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation
JPS5616418A (en) * 1979-07-20 1981-02-17 Teijin Ltd Antitumor protein complex and its preparation
JPS5843926A (ja) * 1981-09-08 1983-03-14 Suntory Ltd 選択性制癌剤

Also Published As

Publication number Publication date
IE58514B1 (en) 1993-10-06
DK277985D0 (da) 1985-06-19
KR860000315A (ko) 1986-01-28
EP0172045A1 (fr) 1986-02-19
PT80662B (en) 1986-12-09
AU593211B2 (en) 1990-02-08
ATE40700T1 (de) 1989-02-15
EP0172045B1 (fr) 1989-02-08
JPS6112628A (ja) 1986-01-21
IL75484A0 (en) 1985-10-31
GR851497B (ko) 1985-11-25
ES8605681A1 (es) 1986-04-01
JPH0582400B2 (ko) 1993-11-18
AU4364685A (en) 1986-01-02
NZ212439A (en) 1989-01-27
DE3568167D1 (en) 1989-03-16
PT80662A (en) 1985-07-01
ES544337A0 (es) 1986-04-01
CA1248874A (en) 1989-01-17
DK277985A (da) 1985-12-21
DK166626B1 (da) 1993-06-21
IE851511L (en) 1985-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Leamon et al. Cytotoxicity of folate-Pseudomonas exotoxin conjugates toward tumor cells. Contribution of translocation domain.
US6670322B2 (en) Method of targeting pharmaceuticals to motor neurons
EP0044167A2 (en) Antibody targeted cytotoxic agent
US5024834A (en) Thioether linked immunotoxin conjugates
KR930000058B1 (ko) 변형된 탄수화물 잔기를 갖는 항종양성 당단백질의 제조방법
Greenfield et al. Thiol-containing crosslinking agent with enhanced steric hindrance
EP0332174A2 (en) Cell specific cytotoxic agents
PT85317B (pt) Processo para a obtencao de imunotoxinas por acoplamento dum anticorpo com uma proteina tricosantina ou tricoquirina
KR930003333B1 (ko) 탄수화물 단위가 변형된 리보솜을 비활성화시키는 당단백질 성분을 함유하는 지속-작용성 면역독소의 제조방법
US5104976A (en) Ribosome-inactivating glycoproteins, modified by oxidation of their osidic units and formation of a schiff's base and in-vivo prolonged action immunotoxins containing such a glycoprotein
US4582703A (en) Cytotoxic medicament formed from the association of at least one immunotoxin and chloroquin
US4919928A (en) Conjugates in which a monovalent carboxylic ionophore is associated by means of a covalent bond with a macromolecule, their use as immunotoxin potentiators and the intermediate activated ionophores
KR950007216B1 (ko) 오시딕단위를 산화시키고, 환원시킴에 의해 리보솜을 비활성화시키는 당단백질을 변형시키는 방법
US4520011A (en) Inactivating protein synthesis by incubating anti-Thy 1.1-ricin a chain monoclonal antibody hybrids with target protein cells
Moroney et al. Modification of the binding site (s) of lectins by an affinity column carrying an activated galactose-terminated ligand
US4397843A (en) Mannose-6-phosphate-low density protein reagent effective against hypercholesterolemia
US5185434A (en) Prolonged-action immunotoxins containing a glycopeptide constituent which inactivates ribosomes, modified on its polysaccharide units
EP0261225B1 (en) Lectin complex and method and probe for making same
Gilliland et al. Chimeric toxins containing fragment A from diphtheria toxin

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee