DK166626B1 - Antitumorale glycoproteiner, hvis kulhydratenheder er blevet modificeret, og fremgangsmaade til fremstilling deraf. - Google Patents

Description

i DK 166626 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte antitumorale glycoproteiner, hvis kulhydratenheder er blevet modificeret ved oxidation med periodationen, hvorhos giycoproteinerne er forskellige fra det hele ricin.

5

Narmere betegnet angår den foreliggende opfindelse hidtil ukendte glycoproteiner, der inaktiverer ribosomer og har en forlænget virkning, hvilke glycoproteiner adskiller sig fra det hele ricin.

10

Udtrykket "glycoprotein, der inaktiverer ribosomer", således som det benyttes i den foreliggende beskrivelse og også i kravene, betegner ethvert stof, som bærer saccharidenheder tilhørende klassen af makromolekyler, der inaktiverer ribosomer og 15 følgelig inhiberer proteinsyntese i eucaryote celler, tilligemed ethvert fragment af det nævnte stof, som er i besiddelse af den samme inaktiverende egenskab, idet nævnte glycoprotein, som inaktiverer ribosomer, kan være af naturlig eller biosyntetisk oprindelse, idet det hidrører fra en celle, hvis geno-20 type er blevet modificeret til dette formål, og nævnte glycoprotein, som inaktiverer ribosomer, kan også være modificeret i dets aminosyrers funktionelle grupper, så at det let kan kobles til et antistof.

25 I beskrivelsen vil udtrykket "glycoprotein, der inaktiverer ribosomer", blive betegnet med symbolerne GPIR.

I beskrivelsen betegner udtrykket "periodat" I04_-ionen, der i litteraturen også omtales som "metaperiodat".

30

Glycoproteinerne, som inaktiverer ribosomer (GPIR), er særlig anvendelige som mellemprodukter til fremstilling af immuno-toksiner ved hjælp af kobling med antistoffer.

35 US-patentskrift nr. 4.340.535 og beskrivelsen til de franske patentansøgninger nr. 2.504.010 og nr. 2.516.794 beskriver fremstillingen af anticancerforbindelser, omtalt som konjuga- DK 166626 Bl 2 ter, der opnås ved via en kovalent binding at koble ricins A-kæde med antistoffer eller anti stoffragmenter, som er rettet mod antigener båret af den celle, der skal nedbrydes. Produkterne af denne type er blevet betegnet og betegnes i den fo-5 religgende beskrivelse med det generiske navn immunotoksiner.

Der kendes konjugater, som er analoge med de tidligere beskrevne immunotoksiner indeholdende ricins A-kæde, hvilke konjugater også er egnede som anticancermedikamenter og hidrører 10 fra koblingen via en kovalent binding af antistoffer eller antistoffragmenter med andre glycoproteiner, der inaktiverer ri-bosomer, såsom især geloninet, der ekstraheres fra Gelonium multiflorum (eur. J. Biochem., 1981, 116, 447-454; Cancer

Res., 1984, 44, 129-133), eller den inhibitor, der ekstraheres 15 fra Momordica charantia (MOM) (US-patentskrift nr.

4.368.149).

Disse glycoproteiner, der inaktiverer ribosomer (GPIR), og som har egenskaber svarende til de egenskaber, som ricins A-kæde 20 har, er stoffer med en molekylvægt af størrelsesordenen 20.000 og 30.000 (Cancer Survey, 1982, 1, 489-520).

Det er også kendt, at disse immunotoksiners cytotaksiske virkning kan potentieres ved hjælp af en række forskellige hjælpe- 25 stoffer, såsom ammoniumsalte, forskellige aminer eller visse carboxyl ionophorer, såsom monensin og nigericin.

Uanset om immunotoksiners terapeutiske virkninger aktiveres eller ikke aktiveres, kan de imidlertid kun manifestere sig i 30 fuldt omfang, for så vidt i mmunotoksi net er i stand til via sin antistofdel at blive lokaliseret in vivo i den aktive form på målcellerne, der skal nedbrydes (sine qua non betingelse for at bringe enhver immunotoksinvirking til udtryk). Immuno-toksinets evne til at blive lokaliseret på målet afhænger 35 først og fremmest af immunotoks i nets evne til at forblive i blodstrømmen og de ekstracel1ulare væsker i den aktive form i tilstrækkelig lang tid til at det når frem til dets målceller DK 166626 B1 3 og i tilstrækkelige store koncentrationer, således at optagelsesgraden af de tilsvarende antigeniske steder bliver høj.

Talrige undersøgelser har gjort det muligt.at fastslå immuno-5 toksiners plasmaeliminationskinetik efter intravenøs injektion i forskellige dyremodeller. Det fremgår, at efter injektion falder plasmamængden af biologisk aktivt immunotoksin meget hurtigt og meget betydeligt. I et typisk tilfælde, der involverer kaniner, i en model, som anvender et immunotoksin, der 10 ved hjælp af en arm indeholdende en disulfidbro er syntetiseret ved kobling af ricins-A-kæde med et monoklonalt antistof rettet mod humane T-lymfocyters (antistof T101) antigen T65, viser det sig således, at 97% af det på tidspunktet 0 i blod-strømmen tilstedeværende immunotoksin efter injektion forsvin-15 der i løbet af 30 min., og at 99,0% forsvinder i løbet af 17 timer. Denne hurtige forsvinden af immunotoksi net trækker ganske tydeligt fra med hensyn til, at dets fuldstændige cyto-toksiske kapacitet bringes til udtryk, ved at immunotoksi net hindres i et udstrakt tidsrum at mætte en høj andel af mål-20 antigenerne, der bæres af de celler, som skal nedbrydes. Endvidere viser sammenligning mellem immunotoksinernes plasmaeliminationskinetik og de tilsvarende ikke-konjugerede antistoffers plasmaeliminationskinetik, at antistofferne derimod forbliver i plasmaet i en høj mængde i relativt lange tidsrum, 25 således som det er velkendt. Imidlertid findes der altid en vis tilbageværende mængde af ikke-konjugerede antistoffer, endog i de mest højrensede immunotoksinpræparater. Via virkningen af de forskellige eliminationshastigheder for immunotiksi-ner og antistoffer bliver de ikke-konjugerede antistoffer, som 30 til at begynde med foreligger i meget lille mindretal, gradvist et flertal efter nogle få timer, og disse antistoffer bliver derfor gradvis ved konkurrence kraftige antigonister for fikseringen af immunotoksinerne til deres mål.

35 Fordelen ved at forøge det vedvarende indhold af immunotoksi-ner i den aktive form i plasmaet med henblik på at forøge såvel varigheden som graden af optagelse af mål antigenerne og DK 166626 B1 4 følgelig af at forøge immunotoksinernes terapeutiske virkninger er derfor indlysende.

Endvidere har lokaliseringsforsøg in vivo med immunotoksinet 5 indeholdende ricins A-kæde, hvilket immunotoksin er blevet radiomærket og derpå injiceret i dyr uden et specifikt mål, vist, at i løbet af de første få minutter efter injektion bliver konjugatet fortrinsvis lokaliseret i leveren. Det samme gælder for ricins A-kæde, som følger det samme mønster, når 10 den injiceres i den ikke-koblede form. Dette antyder stærkt, at immunotoksinet fikseres i leveren via den cytotoksiske sub- i enhed, som det indeholder. Det er kendt, at ricins A-kæde er et glycoprotein, hvis polyoside grupper især indbefatter man- l nosegrupper og N-acetylglucosamingrupper, idet nogle mannose-15 grupper foreligger i terminale positioner (Agri. Biol . Chem., 1978, 42, 501). Eksistensen i leveren af receptorer, der er i stand til at genkende glycoproteiner med disse terminale man-nosegrupper, er også blevet fastslået. Endvidere har det vist sig, at de glycoproteiner, der genkendes af disse receptorer -20 idet sidstnævnte i alt væsentligt er til stede på Kupffer-cellerne - hurtigt elimineres fra blodstrømmen ved fiksering til disse celler, som metaboli serer dem. Dette er særlig godt dokumenteret i tilfælde af β-glucuronidsase og også i tilfælde af ribonuclease B (Arch. Biochem. Biophys., 1978, 188, 418; 25 Advances in Enzymology, udgivet af A. Meister, New York, 1974;

Pediat. Res., 1977, u, 816).

Taget som helhed viser disse data, at den hurtige eliminering af immunotoksiner indeholdende ricins A-kæde kan forklares ved 30 levercellernes og især Kupf fer-cel lernes erkendelse af manno-segrupperne i ricins A-kæde.

Undersøgelserne af plasmaeliminationskinetik udført med andre GPIR'er, f.eks. gelonin eyjer MOM, efter intravenøs injektion 35 i dyret, har vist, at ligesom i tilfælde af ricins A-kæde formindskes plasmaets QPiR-mængde meget hurtigt og meget væsentligt efter injekti0n> i et typisk tilfælde, hvor kaniner an- DK 166626 B1 5 vendes, viser det sig efter injektion af gelonin, der er renset ved hjælp af den beskrevne metode (J. Biol. Chem., 1980, 255, 6947-6953), at 93¾ af det i blodstrømmen på tidspunktet 0 efter injektion tilstedeværende gelonin forsvinder i løbet 5 af 1 time, og at 99,99% forsvinder i løbet af 24 timer.

Det er kendt, at oxidation af osidiske strukturer inklusive de 1 glycoproteiner indeholdte med periodationer forårsager overskæring af carbonkæden, når to tilstødende carbonatomer bærer 10 primære eller sekundære hydroxyIgrupper. Hvis de to tilstødende hydroxylgrupper er sekundære, således som det generelt er tilfældet i de i GPIR'er tilstedeværende cykliske oser, frembringer oxidation to aldehydgrupper på de carbonatomer, mellem hvilke overskæringen har fundet sted.

15

Det har nu vist sig, at når kulhydratenhederne i et antitumoralt glycoprotein er modificeret ved hjælp af oxidation med periodationer, forbliver nævnte glycoproteins biologiske virkning i det væsentlige uændret.

20

Det har også vist sig, hvilket er absolut uventet, at hvis kulhydratenhederne i et glycoprotein, som inaktiverer riboso-mer, modificeres ved oxidation med periodationer, opnås et nyt glycoprotein, der inaktiverer ribosomer, idet det nævnte nye 25 glycoprotein har den dobbelte egenskab i form at bevare sine biologiske virkninger og meget langsomt at blive elimineret fra blodstrømmen in vivo.

En dybtgående biokemisk undersøgelse af oxiderede og naturlige 30 GPIR'er har gjort det muligt at vise, at oxidationen af GPIR’er med periodat udelukkende involverer GPIR'ernes osidiske del og ikke har nogen virkning på sekvensen af aminosyrer-ne, der udgør peptiddelen deraf.

35 Disse hidtil ukendte glycoproteiner, som inaktiverer ribosomer og har en forlænget virkning, omtales i det følgende ved hjælp af symbolerne GPIR-LA.

DK 166626 B1 6

Endelig har det vist sig, at når disse hidtil ukendte glycop-roteiner, som inaktiverer ribosomer og har en forlænget virkning, kobles med antistoffer, bevarer de opnåede konjugater de for immutoksiner kendte biologiske egenskaber og har langsom 5 plasmaeliminationskinetik.

Det vil bemærkes, at periodatoxidation har været foreslået som kendt teknik til fremstilling af konjugater bestående af et antistof eller et antistoffragment samt af et antitumoralt 10 stof. I dette tilfælde benyttes de ved hjælp af periodatoxidation af det antitumorale stof opnåede aldehydgrupper til fremstilling af det krævede konjugat. Disse aldehydgrupper indføres derfor midlertidigt for at muliggøre konjugationen af antistof og antitumoralt stof. EP offentliggørelsesskrift nr.

15 74.279 og FR offentliggørelsesskrift nr. 2.312.259 kan nævnes i denne henseende, hvilke offentliggørelsesskrifter ikke omtaler de ifølge den foreliggende opfindelse benyttede glycopro-teiner.

20 Ifølge den foreliggende opfindelse deltager aldehydgrupperne, som er indført på giycoproteinet ved hjælp af periodatoxidation, derimod ikke i dannelsen af de ovenfor definerede immu-notoksi ner.

25 Den foreliggende opfindelse angår derfor, som hidtil ukendte produkter, strukturelt modificerede antitumorale glycoprotei-ner, hvis kulhydratenheder er blevet modificeret ved oxidation med periodationen. Den foreliggende opfindelse angår nærmere betegnet glycoproteiner, der inaktiverer ribosomer, og hvis 30 kulhydratenheder er blevet modificeret ved oxidation med periodationen, og som har den samme virkning som og en længere halveringstid end det umodificerede glycoprotein.

Opfindelsen angår fortrinsvis glycoproteiner, som inaktiverer 35 ribosomer og har en forlænget virkning, og som opnås ved behandling af et glycoprotein, der inaktiverer ribosomer, og hvis thiolgrupper eventuelt er beskyttet, med en vandig opløs- DK 166626 B1 7 m'ng af et alkalimetalperiodat i et tidsrum fra 0,2 til 24 timer ved en tempertur fra 0 til 15°C og i fravær af lys, om ønsket afblokering af thiol grupperne samt isolation af slutproduktet ved hjælp af kendte metoder.

5

Ethvert antitumoralt glycoprotein kan i sine kulhydratenheder modificeres ved omsætning med peri odat ionen ifølge de kendte metoder.

10 Glycoproteinerne, som inaktiverer ribosomer, og som anvendes som foretrukne udgangsmaterialer for oxidation med periodatio-ner ifølge den foreliggende opfi ndel se,er alle GPIR'er, såsom ricins A-kæde, hvilke GPIR'er selv kun er meget svagt cytotok-siske, fordi de ikke kan fikseres til celler, men som på den 15 anden side efter kobling med et antistof, der genkender bestemte celler, bliver meget cytotoksiske over for disse celler, når først antistoffet har genkendt sit mål.

Repræsentative udgangsforbindelser er ricins A-kæde, gelonin 20 og det fra Momordica charantia ekstraherede stof (MOM), således som det opnås ved ekstraktion.

Andre GPIR'er, som kan anvendes som udgangsmaterialer for oxidation med periodationer, er som følger: 25

Dianthin 30 fra Dianthus carryophy11us

Dianthin 32 fra

Agrostin A fra Agrostemma githago

Agrostin B fra " " 30 Agrostin C f ra ‘ '' " HCI fra Hura crepitans

Asparagus officinalis- inhibitor fra Asparagus officinalis 35 De samme stoffer produceret biosyntetisk ved hjælp af celler, hvis genotype er blevet modificeret til dette formål, er også egnede forbindelser.

DK 166626 B1 8

Fragmenter af ovennævnte GPIR'er, forudsat at de bevarer hele eller en del af evnen til at inaktivere ribosomer, hvilken evne karakteriserer den GPIR, hvoraf de er afledt, kan også anvendes som udgangsmaterialer.

5 A-kæden i naturligt ricin, i hvilken mindst en af thiolgrup-perne er beskyttet, er en foretrukken udgangsforbindelse.

Nylige undersøgelser har vist, at ricins A-kæde omfatter 2 be-10 standdele betegnet Al og A2, der især adskiller sig med hensyn til deres polysaccharidenheder. De forsøg, som har været udført med A-kædens 2 bestanddele, har gjort det muligt at vise, at periodatoxidation finder sted på en meget ensartet måde i Al- og A2-kæden og giver disse 2 bestanddele identiske egen-15 skaber med hensyn til forbedring af pharmacokinetikken.

Fremstillingen af ricins rene A-kæde er beskrevet i US-patent-skrift nr. 4.340.535. Gelonin og MOM er også tidligere blevet beskrevet.

20

Beskyttelse af thiolgrupperne i de som udgangsmaterialer benyttede GPIR'er er ønskelig, når nævnte thiolgrupper er de grupper, som skal anvendes til kobling med antistoffet.

25 Hvis andre funktionelle grupper anvendes til koblingen, f.eks. tyrosiners phenoliske hydroxylgruppe eller GPIR's aminogrupper eller carboxylgrupper, kan beskyttelse udføres eller undlades.

Blokering udføres ved omsætning med et middel, der er i stand 30 til at substituere SH-grupperne med en gruppe, der efterfølgende kan fjernes ved reduktion eller thiol/disulfid-udveksling, f.eks. 2,2'-di nitro-5,5'-dithiodibenzoesyre (DTNB) eller 3-(pyridin-2-yl-disulfanylJpropionsyre eller alternativt dipyridyl-2,2'-di sulfid eller dipyridy1-4,4'-disulfid. Ved 35 fravær af en sådan behandling kan de frie thiolgrupper forsvinde under oxidationsreaktionen, i hvilket tilfælde de ikke kan gendannes fuldstændigt. Overskuddet af blokeringsmiddel DK 166626 Bl 9 fjernes ved hjælp af dialyse eller enhver anden passende behandl i ng.

Periodatoxidationsreaktionen udføres ved en sur pH-værdi mel-5 lem 3 og 7, fortrinsvis mellem 5 og 6,5.

Periodatet anvendes i overskud. Nærmere betegnet er koncentrationen af alkalimetalperiodat større end koncentrationen af de vicinale dioler, der er i stand til at blive oxideret. Koncen-trationer på 10 til 50 mM med hensyn til natr i umper i odat til koncentrationer på 1 til 10 mg/ml cytotoksisk sub-enhed er passende. Behandlingen udføres ved en temperatur mellem 0 og 15°C, fortrinsvis mellem 1 og 5*C, og i mørke, og den varer mellem 0,2 og 24 timer.

15

Reaktionen standses ved tilsætning af et middel, der forbruger det tilbageværende periodat, f.eks. et overskud af ethylen- glycol, og biprodukterne fjernes ved dialyse eller ved hjælp af enhver anden passende behandling. Det ved reaktionens afs-20 lutning opnåede produkt isoleres ved hjælp af konventionel tekn i k.

Hvis udgangsmaterialets thiolgrupper er blevet blokeret, gennemføres afblokering ved hjælp af de kendte metoder, f.eks.

25 ved omsætning med et reduktionsmiddel, der kan frigøre den tidligere blokerede thiolgruppe, såsom 2-mercaptoethanol, hvilket fører til det nye glycoprotein, der inaktiverer ribo-somer og har en forlænget virkning og er parat til at blive benyttet til f.eks. kobling med et antistof til opnåelse af et 30 immunotoksin.

I tilfælde af ricins A-kæde har det resulterende nye molekyle (omtalt ved hjælp af symbolerne A-La) følgende hovedegenskaber : - en molekylvægt, der ikke afviger signifikant fra den naturlige A-kædes molekylvægt. Såvidt det er muligt at se ved hjælp 35 DK 166626 B1 10 af polyacrylamidgradientelektrophorese frembringer denne modifikationsproces polymerer af proteinet i en meget ringe mængde og danner ikke nogen nedbrydningsprodukter.

5 - et antal frie thiolgrupper, der er større end 0,7 pr. mol.

- en immunoreaktivitet over for kanin-antistoffer, der inhibe-rer ricins A-kæde, hvilken immunoreaktivitet ikke kan skelnes fra den naturlige A-kædes immunoreaktivitet.

10 - en inhiberende virkning på proteinsyntesen i en acellular model, der er større end 50% af den inhiberende virkning, som forårsages af en lige så stor mængde naturlig A-kæde.

15 - efter en enkelt intravenøs administration til kaniner i en dosis på ca. 0,4 mg/kg legemsvægt er endvidere mængden i plasmaet af A-kæde (A-La) med forlænget virkning 23 timer efter injektion større end 10% af den mængde, der er til stede på tidspunktet nul (i modsætning til 0,015% for den naturlige 20 A-kæde på dette tidspunkt), dvs, en stigning i plasmamængden med en faktor, der er meget større end 500.

Tilsvarende i tilfælde af gelonin har det ved periodatoxida-tion opnåede molekyle følgende hovedegenskaber: 25 - en molekylvægt, der ikke er signifikant anderledes end molekylvægten af naturligt gelonin.

- en immunoreaktivitet over for anti-gelonin kanin-antistof- 30 fer, der ikke kan skelnes fra det naturlige gelonins immuno reakt i vi tet.

- efter en enkelt intravenøs administration til kaniner i en dosis på ca. 0,3 mg/kg legemsvægt er endvidere mængden i plas- 35 maet af det modificerede gelonin 24 timer efter injektion større end 3% af den mængde, der er til stede på tidspunktet nul (i modsætning til 0,01% for det naturlige gelonin på dette DK 166626 B1 11 tidspunkt), dvs. en stigning i plasmamængden med en faktor, der er større end 200.

Fremstillingen af konjugaterne eller immunotoksinerne ud fra 5 de g 1ycoproteiner, der inaktiverer ribosomer og har en forlænget virkning, udføres ved hjælp af en hvilken som helst fremgangsmåde, der hensigtsmæssigt vælges fra intervallet af fremgangsmåder beskrevet i US-patentskrift nr. 4.340.535. Hvis den valgte cytotoksiske sub-enhed naturligt indeholder mindst 10 en thiol, som gør den egnet til kobling, vil denne gruppe fortrinsvis blive benyttet til omsætning med det antistof eller anti stoffragment, der bærer en aktiveret disulfidgruppe. Hvis den valgte cytotoksiske sub-enhed ikke naturligt har en thiol-gruppe, der gør den egnet til kobling, kan i det mindste en 15 funktionel gruppe, der bærer en fri thiol, fortrinsvis blive indført kunstigt i den nævnte sub-enhed ved hjælp af en hvilken som helst kendt fremgangsmåde, og koblingen kan fortsættes som oven for anført. Indføringen af den nævnte funktionelle gruppe kan finde sted enten før oxidationstrinnet med perioda-20 tioner, i hvilket tilfælde det vil være nødvendigt for thiol-gruppen at blive blokeret under oxidationstrinnet og derefter blive afblokeret efter dette trin, eller efter oxidationstrinnet.

25 Dette fører til modificerede immunotoksiner, som har opnået en ny karakter med hensyn til deres pharmacokinetiske egenskaber. Nærmere betegnet har det ved passende modifikation af den cytotoksiske sub-enhed været muligt til immunotoksiners specifikke cytotoksiske egenskaber uden at genere disse at tilføje 30 en ny egenskab, der er lige så naturlig, nemlig evnen til at udvise langsom plasmaeliminationskinetik.

35

Opfindelsen illustreres nærmere i det følgende under henvis ning til tegningen, hvor DK 166626 B1 12 fig. 1 viser plasmaeliminationskurven som funktion af tiden for A-kæden af intravenøst injiceret naturligt ricin, 5 fig. 2 viser tidens indflydelse på plasmakoncentrationen af A-kæde ved behandling med natriumperiodat, fig. 3 viser tidens indflydelse på plasmakoncentrationen af A-kæde og methyleret A-kæde ved behandling med natriumperiodat, fig. 4 viser plasmaeliminationskurverne for intravenøst inji-10 ceret naturligt gelonin og oxideret gelonin som funktion af tiden, fig. 5 viser plasmaeliminationskurveme som funktion af tiden for det oxiderede og det ikke-oxiderede MOM efter intravenøs injektion, 15 fig. 6 viser plasmaeliminationskurverne som funktion af tiden for det oxiderede diantin og det ikke-oxiderede diantin, fig. 7 viser plasmaeliminationskurverne som funktion af tiden for intravenøst injiceret IT T101 og IT (A-la) T101, fig. 8 viser dosis/virkning-kurver, der illustrerer cytotoksi-20 citet af IT (A-la) T101 og (A-la) over for CEM-celler målt ved inhibering af proteinsyntese, og fig. 9 viser kurver, der illustrerer den cytotoksiske virkning af immunotoksinerne IT (A-la) T101 og IT T101 på CEM-celler, målt ved hjælp af den clonogene prøve.

25 De efterfølgende eksempler giver en bedre forståelse af opfin delsen uden at begrænse dens rammer.

DK 166626 B1 13

Eksempel 1;

Oxidation af den methylerede A-kæde, hvori SH-grupperne er blokeret med N-ethylmaleimid.

5 I - Fremstilling af ricins korrekt funktional iserede A-kæde 1) Hexamethylering af A-kæden

10 Methyleringsreaktion udføres ved 0°C under omrøring i 0,2 M

boratpuffer med pH 10 ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Means og Feeney (Biochemistry 7, 2192 (1968)). 20 mg findelt borhy-drid (indeholdende 9,5 mCi/mmol) sættes til 35 ml A-kæde (3 mg/ml), efterfulgt af 350 mikroliter 6% formaldehyd (tilsat i 15 fem 70 mikroliter portioner fordelt over et tidsrum på 30 min.).

Overskuddet af reagens fjernes ved hjælp af kontinuerlig dialyse mod 125 mM phosphatpuffer med pH 7 (40 liter ved 300 20 ml/h). Efter dialyse centrifugeres proteinopløsningen. 36,5 ml hexamethyleret A-kæde indeholdende 2,6 mg/ml opsamles.

2) Blokering med N-ethylmaleimid 25 Den hexamethylerede A-kædes naturlige SH blokeres ved hjælp af metoden beskrevet i Methods in Enzymology 11, 541 (1967). For at gøre det, inkuberes ricins ricins A-kæde, som blev opnået i det foregående trin, i 2 timer ved 30°C i nærværelse af 20 ækvivalenter N-ethylmaleimid pr. mol A-kæde. Overskuddet af 30 reagens fjernes ved kontinuerlig dialyse mod 125 mM phosphat-puffer med pH 7, som i løbet af 20 timer fornys med en hastighed på 500 ml/ti me. Efter i nddampn i ng opnås 13 ml af en opløsning af ricins A-kæde indeholdende 7 mg/ml og ikke længere med thiolgrupper, som kan bestemmes ved hjælp af Ellman's reagens.

35 Det således opnåede produkt kaldes derefter hexamethyleret A-kæde (NEM).

DK 166626 B1 14 3) Periodatoxidation 6 ml af opløsningen af hexamethy1eret A-kæde (NEM), der er opnået som oven for anført, behandles med NaI04 (12,8 mg) i 40 5 min. i mørke ved pH 4,5 og ved 0°C. Omsætningen standses ved tilsætning af 600 mikroliter ethylenglycol, og reaktionsmediet dialyseres kontinuerligt mod 0,1 M carbonatpuffer med pH 10 (20 timer ved 500 ml/h).

10 II - Enzymatisk virkning af A-kæden med forlænget virkning, målt på en acellular model

Den fundamentale biologiske egenskab ved ricins A-kæde består i at inhibere proteinsyntesen i celler ved nedbrydning af den 15 ribosomale sub-enhed 60S.

In vitro forskriften indebærer anvendelse af passende supplerede subcellulare fraktioner af rottelever, der er i stand til at inkorporere l^C-phenylalanin i nærværelse af en kunstig 20 messenger RNA: polyuridylsyre.

Den til fremstilling af de subcellulare fraktioner og måling af inkorporeringen af l4C-phenylalanin benyttede procedure er en tilpasning af metoden beskrevet i Biochemica Biophysica Ac-25 ta 1973, 312, 608-615, under anvendelse af både en mikrosomal-fraktion og en cytosolfraktion af rottehepatocyter. Prøven indeholdende A-kæden indføres i form af en passende fortyndet opløsning i en 50 mM Tris HCl-puffer med pH 7,6 indeholdende 0,2% 2-mercaptoethanol og 15 mikrogram/ml kvægserumalbumin.

30

Optæl!ingsdataene anvendes til i forhold til et kontrolmedium uden inhibitor at beregne den procentiske inhibering af inkorporeringen af l4C-phenylalanin i proteinerne for hvert reaktionsmedium indeholdende ricins A-kæde.

Den inhiberende virkning blev bestemt. En ICsQ-værdi på 2,7 x 10“1° mol/liter iagttages for den oxiderede A-kæde. ICsg-vær- 35 DK 166626 B1 15 dien for den til kontrol benyttede A-kæde i forsøget er 1,03 x 10“1° mol/liter. Modifikationen forårsager derfor ikke et aktivitetstab for A-kæden.

5 Eksempel 2:

Dette eksempel viser den langsomme eliminering af ricins A-kæ-de, der er modificeret med natriumperi odat, efter intravenøs injektion i dyret.

10 I - Modifikation af ricins A-kæde med natriumperiodat

1) Blokering af den naturlige SH-gruppe med DTNB

15 Ricins A-kæde blev fremstillet og renset på den i US-patent-skrift nr. 4.340.535 beskrevne måde. 20 ækvivalenter af en opløsning af 2,2 '-dinitro-5,5'-dithiodibenzoesyre (DTNB), dvs.

385 mikroliter af en 0,1 M opløsning af DTNB i en 125 mM phosphatpuffer med pH 7 (denne opløsning indstilles til pH 7 20 med natriumhydroxid), sættes til 10 ml af en opløsning af ricins A-kæde indeholdende 5,6 mg/ml (med 0,84 thiolgruppe pr. A-kæde) i PBS-puffer (en puffer, der er 20 mM med hensyn til phosphat og 150 mM med hensyn til NaCl, med pH-værdi 7). Inkubation foretages i 20 min. ved 20°C. Derpå dialyseres 25 opløsningen mod PBS puffer ved 4°C til opnåelse af 53 mg A-kæde, der er blokeret på thiol-gruppen, i form af en opløsning indeholdende 5 mg/ml.

2) Periodatoxidation af den blokerede A-kæde 30 120 mikroliter af en 0,5 M opløsning af natriumperiodat i vand sættes til 6 ml af en opløsning indeholdende 5 mg/ml blokeret A-kæde, og pH 6 indstilles med 1 M eddikesyre. Inkubation foretages i 16 timer ved 4°C i mørke. Oxidationsreaktionen 35 standses ved tilsætning af 620 mikroliter af en 1 M vandig opløsning af ethylenglycol. Efter inkubation i 15 min. ved 20°C, dialyseres reaktionsmediet ved 4°C mod PBS-puffer. Pe- DK 166626 B1 16 riodatoxidation frembringer et svagt præcipitat af protein, som fjernes ved centrifugering ved 10.000 x g i 30 min. Dette fører til 24 mg oxideret, blokeret A-kæde i en koncentration på 3,4 mg/ml.

5 3) Afblokering af thi olgrupperne.

2-mercaptoethanol tilsættes som reduktionsmiddel til en slut-koncentration på 1% til 6 ml oxideret, blokeret A-kæde inde-10 holdende 3,4 mg/ml i PBS-puffer. Inkubation foretages i 1 time ved 20°C. Opløsningen dialyseres derpå mod PBS-puffer ved 4°C. Dette fører til 19 mg oxideret A-kæde i en koncentration på 2,8 mg/ml.

15 Ved anvendelse af DTMB-teknikken (Methods in Enzymology, 1972, 25, 457 (Academic Press)), fastslås det, at den opnåede modificerede A-kæde har 0,70 fri thiolgruppe pr. mol. Den modificerede A-kædes molekylvægt er 30.000±3.000, bestemt ved hjælp af polyacrylamidgradientelectrophorese i nærværelse af 20 natriumdodecylsulfat.

Det tidligere opnåede A-kæde-præparat, hvori polysacchariden-hederne er blevet oxideret, blev undersøgt for dets enzymatiske virkninger til inhibering af proteinsyntese og for dets 25 pharmacokinetiske egenskaber.

II - Enzymatisk virkning af A-kæde med forlænget virkning, målt på en acellular model 30 Den inhiberende virkning blev bestemt ved hjælp af den i eksempel 1 beskrevne teknik. En IC5Q“Værdi på 3 x 10“1° mol/liter iagttoges for den oxiderede A-kæde. ICsg-værdien for kontrol A-kæden ved forsøget er 1,2 x 10~1° mol/liter. Modifikationen forårsager derfor ikke et aktivitetstab for A-kæden.

35 DK 166626 B1 17 III - Farmakokinet i ske egenskaber hos A-kæden med forlænget virkning (A-La) A-kæden administreres til kaniner ved hjælp af en enkelt in-5 jektion i en ørevene. Mængden af injiceret A-kæde svarer til 0,415 mg/kg. Blodprøver udtages med mellemrum på heparin. Plasmaerne analyseres ved hjælp af en radioimmunometrisk prøve, der nedenfor betegnes ved forkortelsen RIM-1.

10 Denne teknik udmærker sig ved at bestemme A-kæden uden at modificere den. Bestemmelsen udføres i mikrotitreringsplader (f.eks.: "NUNC-TSP screening system" fra Poly Labo Block

France), hvis lågbærer hyperabsorberende spidser, der rager ned i bundens hulrum. Disse spidser udgør de faste faser.

15 Fåre-antistoffer, der inhiberer ricins A-kæde (betegnet i det følgende ved forkortelsen Acl), renset ved hjælp af affinitetskromatografi, absorberes på de faste faser. Til dette formål fordeles 200 mikroliter af en opløsning af Acl indholdende 10 mikrogram/ml i PBS-puffer i hulrummene. Spidserne 20 bringes først i kontakt med opløsningen af Acl i 24 timer ved 4°C og derpå med kalvefosterserum i 3 timer ved 20°C med henblik på mætning af alle fikseringsstederne. Den mættede immu-noabsorbent bringes derpå i 3 timer ved 20°C i kontakt med plasmaprøverne, som skal bestemmes i forskellige fortyndinger, 25 eller med opløsninger af A-kæde med kendte koncentrationer med henblik på at fastslå kalibreringskurven. Efter vaskning med en PBS-puffer bringes immunoabsorbenten i 2 timer ved 20eC i kontakt med fåre-antistof ferne, der inhiberer ricins A-kæde, som er blevet renset ved hjælp af affinitetskromatografi og 30 radiomærket (nedenfor betegnet ved forkortelsen Ac2). Radiomærkningen af Ac2 foretages med jod-125 i nærværelse af chloramin T ved metoden ifølge Greenwood og Hunter (Biochem J., 1963, 89, 114). Den specifikke aktivitet af de radiomærkede Ac2-antistoffer er 5 til 10 mikrocurie/mikrogram.

35 106 cpm radiomærkede Ac2-antistoffer indføres som 200 mikroli ter i en PBS-puffer indeholdende 0,1% kvægseruma1 bumin. Efter vaskning i PBS-puffer aftages spidserne, og mængden af bundet DK 166626 B1 18

Ac2 roåles ved tælling af radioaktiviteten. Koncentrationen af A-kæde i prøverne, der skal bestemmes, måles ved henvisning til kalibreringskurven, der er frembragt ved indføring af A-kæden i forskellige kendte koncentrationer. Når A-kæden med 5 forlænget virkning injiceres i dyret, anvendes den samme A-kæde med forlænget virkning til at frembringe den tilsvarende kalibreringskurve.

Værdierne for koncentrationen af A-kæde i blodplasmaet, der 10 måles ved hjælp af denne teknik, er reproducerbare og pålidelige. Tærskelpåvisningen er 1 nanogram/ml. En undersøgelse af reproducerbarheden inden for og mellem forsøg fører til variationskoefficienter på mindre end 10% for koncentrationsværdier i intervallet fra 1 til 200 nanogram/ml.

15

Resultaterne af disse forsøg er vist i form af kurver, hvori tiden, udtryk i timer, er afsat efter abscissen, og plasmakoncentrationen af det målte produkt, angivet i procent af den teoretiske plasmakoncentration på tidspunktet 0, er afsat ef-20 ter en logaritmisk skala på ordinaten. Denne værdi, der kaldes den "relative plasmakoncentration" (RPC), beregnes ved anvendelse af følgende udtryk: RPC = koncentration målt ved tidspunktet t x jqq 25 injiceret mængde/plasmavolumen

Plasmavolumenet betragtes som værende lig med 36 ml/kg af dyrets legemsvægt.

30 Fig. 1 viser plasmaeliminationkurven, som funktion af tid, for naturligt ricins A-kæde, der er injiceret intravenøst. Denne kurve (kurve 1) har to faser. I den første fase forsvinder produktet meget hurtigt fra blodstrømmen, eftersom 0,1% af den injicerede dosis forbliver i plasmaet 3 timer efter injektion.

35 I den anden fase er formindskelsen langsommere.

Når A-kæden er blevet oxideret i sine polysaccharidenheder, modificeres eliminationsprofilen dybtgående. Den første elimi- DK 166626 B1 19 nationsfase - som er ansvarlig for størstedelen af produktets forsvinden - undertrykkes praktisk talt, hvilket fører til en betydelig stigning i plasmamængderne af A-kæde. 20 timer efter injektion er koncentrationen af den oxiderede A-kæde 600 gange 5 større end i tilfældet af den umodificerede A-kæde (kurve 2).

Eksempel 3

Dette eksempel viser virkningen af periodatoxidation på den 10 med NEM blokerede A-kædes farmakokinet i ske egenskaber.

1) Modifikation af ricins A-kæde a) blokering af den naturlige SH med N-ethyImaleimid 15 40 ml af en vandig opløsning af ricins A-kæde indeholdende 8 mg/ml (dvs. 4,1 mikromol A-kæde) behandles med en vandig opløsning af 2-mercaptoethanol, så at slutkoncentrationen er 1%.

20

Opløsningen lades henstå i 1 time og dialyseres derpå kontinuerligt mod 125 mM phosphatpuf fer ved pH 7, der fornys i løbet af 40 timer med en hastighed på 300 ml/time. Ved anvendelse af Ellman's metode blev 0,9 ækvivalent SH bestemt pr.

25 mol af ricins A-kæde.

Denne SH-gruppe blokeres med N-ethylmaleimid ved hjælp af metoden beskrevet i Methods in Enzymology, 11, 541 (1967). For at gøre dette inkuberes ricins A-kæde, som blev opnået i det 30 foregående trin, i 2 timer ved 30°C i nærværelse af 20 ækvivalenter N-ethylmaleimid pr. mol A-kæde. Overskudet af reagens fjernes ved hjælp af kontinuerlig dialyse mod 125 mM phosphatpuf fer med pH 7, som fornyes i løbet af 20 timer med en hastighed på 500 ml/time. Dette fører til 35 ml af en opløsning 35 af ricins A-kæde indeholdende 7 mg/ml, og den indeholder ikke længere thiolgrupper, der kan bestemmes ved hjælp af Ellman's reagens. Det således opnåede produkt kaldes i det følgende A-kæde (NEM).

DK 166626 B1 20 b) Periodatoxidation af A-kæden (NEM)

Periodatoxidation af A-kæden (NEM) udføres ved anvendelse af den i eksempel 2 angivne procedure.

5 2) Den oxiderede A-kædes (NEM) egenskaber a) Den oxiderede A-kædes (NEM) enzymatiske aktivitet 10 Den inhiberende virkning på proteinsyntesen blev bestemt ved anvendelse af proceduren beskrevet i eksempel 1. De enzymatiske egenskaber viser sig at blive bevaret med en lC5o~værdi på 4,3 x 10"10 mol/1 for den oxiderede A-kæde (NEM).

15 b) Den oxiderede A-kædes (NEM) farmakokinetiske egenskaber

Den oxiderede eller ikke-oxiderede A-kæde (NEM) administreres til kaniner i en enkelt injektion i ørevenen. Den injicerede mængde A-kæde svarer til 0,100 mg/kg. Plasmaprøverne opsamlet 20 på tidspunktet 23 h analyseres under anvendelse af den i eksempel 2 beskrevne immunometriske prøve RIM-1. Resultaterne er vist i den følgende tabel: 25 Plasmakoncentration 23 timer efter in jektion: A-kæde (NEM) 0,01%

Oxideret A-kæde (NEM) 6% 30 _____ 23 timer efter injektion er koncentrationen af den oxiderede A-kæde (NEM) 800 x større end i tilfælde af den umodificerede A-kæde (NEM).

35 DK 166626 B1 21

Eksempel 4

Dette eksempel viser vigtigheden af varigheden af den oxidative behandling for den oxiderede A-kædes farmakokinetiske egen-5 skaber.

6 præparater af oxideret A-kæde fremstilles under anvendelse af den i eksempel 2 angivne procedure, med undtagelse af varigheden af natriumperiodatbehandlingen. Behandlingstiderne er 10 som følger: nul (reaktion standset øjeblikkeligt med ethylen-glykol), 20 minutter, 40 minutter, 2,5 timer, 4 timer og 18 timer.

Disse forskellige præparater injiceres i kaniner, og de rela-15 tive plasmakoncentrationer af A-kæden måles efter 24 timer ved hjælp af den samme procedure som den i eksempel 1 benyttede.

Resultaterne er vist i fig. 2. Disse resultater viser, at 1) stigningen i plasmamængden af A-kæden i virkeligheden skyldes 20 periodatoxidation, fordi plasmakoncentrationen af A-kæde, når reaktionen standses øjeblikkeligt, er identisk med den for den naturlige A-kæde opnåede, og 2) det er nødvendigt for denne reaktions varighed at være relativ lang med henblik på opnåelse af optimale virkninger.

25

Eksempel 5

Dette eksempel viser vigtigheden af varigheden af den oxidative behandling på den med NEM blokerede methylerede A-kædes 30 farmakokinetiske egenskaber.

1) Fremstilling af ricins funktionaliserede A-kæde a) Blokering af A-kædens naturlige SH med N-ethylmaleimid 35 DK 166626 B1 22 A-kædens naturlige SH blokeres med N-ethylmaleimid ved hjælp af denne samme procedure som den i eksempel 1 beskrevne.

b) Methylering af A-kæden 5

Methyleringsreaktionen udføres ved 0eC under omrøring i 0,2 M boratpuffer ved pH 10 ved hjælp af metoden ifølge Means og Feeney (Biochemistry 7, 2192, 1968). 38 mg findelt borhydrid (indeholdende 47 mCi/mmol) sættes til 65,5 ml A-kæde (NEM) (3 10 mg/ml) efterfulgt af 1 ml 6% formaldehyd, som tilsættes i fem 200 mikroliterportioner fordelt over et tidsrum på 30 minutter.

Overskudet af reagens fjernes ved hjælp af kontinuerlig dialy-15 se mod 125 mM phsophatpuffer med pH 7 (40 ml). Efter dialyse centrifugeres proteinopløsningen. 63 ml methyleret A-kæde indeholdende 3 mg/ml opsamles.

C) Periodatoxidation 20

Seks præparater af methyleret A-kæde (NEM) oxideres under anvendelse af proceduren beskrevet i eksempel 1, med undtagelse af varigheden af natriumperiodatbehandli ngen. Behandlingstiderne er som følger: nul (reaktions standset øjeblikkeligt med 25 ethylenglykol), 10 minutter, 40 minutter, 2,5 time, 4 timer og 18 timer.

Disse forskellig præparater injiceres i kaniner, og de relative plasmakoncentrationer af A-kæden måles efter 23 timer ved 30 hjælp af den samme procedure som den i eksempel 2 anførte.

Resultaterne er vist i fig. 3, kurve 2. Disse resultater viser, at for A-kæden (kurve 1): 35 1. skyldes stigningen i plasmamængden af den methylerede A- kæde (NEM) i virkeligheden periodatoxidation, fordi plasmakoncentrationen af methyleret A-kæde (NEM), når reaktionen standses øjeblikkeligt, er identisk med den for A-kæden opnåede; og DK 166626 B1 23 2. er det nødvendigt, at varigheden af denne reaktion er relativt lang med henblik på opnåelse af optimale virkninger.

Eksempel 6 5

Dette eksempel viser, at når oxidationsreaktionen udføres separat med de to indgående molekylære varianter i A-kæden (Alkæde og A2-kæde) frembringer oxidationsreaktionen virkninger på hver af de to isomerer, der er analoge med virkningerne 10 beskrevet i eksempel 2 for ricins A-kæde.

1) Separation af Al-kæden og A2-kæden 28 ml A-kæde indeholdende 10,9 mg/ml) (309 mg) i 125 ml phosp-15 hatpuffer med pH 7,0 påføres på en søjle af 112 ml konkavalin A/sepharose, der er ækvilibreret i den samme puffer. Al-kæden opnås i den første top ved vaskning med den samme puffer. A2-kæden eluerers med 0,1 M boratpuffer med pH 6,0, som er 0,5 M med hensyn til NaCl og 0,1 M med hensyn til α-methyImanno-2 0 sid.

Dette fører til 184 mg Al-kæde og 103 mg A2-kæde.

Al-kæden og A2-kæden koncentreres ved hjalp af ultrafiltrering 25 under nitrogentryk. A2-kæden dialyseres mod 125 mM phosphat-puffer med pH 7,0.

Analyse af A-kæden ved hjælp af akrylamidgelgradientelektrop-horese med SDS viser tilstedeværelse af 2 bånd med forskellig 30 intensitet svarende til molekylvægte på 30.000 og 33.000. Al-kæden svarer til båndet med kraftigere intensitet og med molekylvægt 30.000, og A2-kæden svarer til båndet med svag intensitet og med molekylvægt 33.000.

35 DK 166626 B1 24 2) Modifikation af ricins A-kæde og A2-kæde med natriumperiodat

Denne modi f i kation foretages som beskrevet i eksempel 2. Præ-5 paraterne af A-kæde, hvori polysaccharidenhederne er blevet oxideret, blev undersøgt for deres enzymatiske aktiviteter til inhibering af proteinsyntese og for deres pharmakokinetiske egenskaber.

10 3) Enzymatiske virkninger af Al- og A2-kæder med forlænget virkning, målt på en acellular model

Den inhiberende aktivitet blev bestemt som beskrevet i eksempel 1. Den iagttagne IC5Q-værdi er lig med 2,1 x 10"10 mol/1 15 og 2,1 x 10"1° mol/1 for henholdsvis den oxiderede Al-kæde og den oxiderede A2-kæde. ICsg-værdierne for de naturlige Al- og A2-kæder, som er kontrolkæderne ved forsøget er henholdsvis 1,9 x 10“1° mol/1 og 1 x 10~1° mol/1. Modifikationen af de separate varianter af A-kæden forårsager derfor ikke et tab af 20 deres enzymatiske aktivitet.

4) Pharmakokinetiske egenskaber hos Al- og A2-kæderne (Al-La, A2-La) med forlænget virkning.

25 Al- eller Al-La- kæden eller A2- eller A2-La-kæden administreres til kaniner ved hjælp en enkelt injektion i en ørevene (415 mikrogram A-kæde/kg). PIasmaoprøverne opsamlet efter 20 timer analyseres ved hjælp af den immunometri ske prøve RIM-1 (se eksempel 2). Resultat er vist i nedenstående tabel. Værdi-30 erne for A- og A-La-kæderne er angivet til sammenligning.

35 DK 166626 B1 25

Relativ plasmakoncentration 20 timer efter injektion A-kæde 0,012% 5

Oxideret A-kæde (A-La) 10%

Al-kæde 0,02%

Oxideret Al-kæde (Al-La) 10% 10 A2-kæde 0,04%

Oksideret A2-kæde (A2-La) 14% 20 timer efter injektion er koncentrationerne af Al-La og A2-La henholdsvis 500 og 350 gange større end i tilfælde af Al 15 og A2.

Eksempel 7;

Dette eksempel beskriver de biokemiske egenskaber hos A-kæden 20 og dens varianter, Al-kæden og A2-kæden, i den naturlige form og i den oxidererede form.

De til disse undersøgelser benyttede A-kæder fremstilles som beskrevet i eksemplerne 2 og 6.

25 I - Kul hydratsammensatn i nger

Disse proteiners kulhydratsammensætninger bestemmes ved hjælp af gaskromatografiske analyser under anvendelse af Clamp's me- 30 tode (in Glycoproteins: their composition, structure and function (udgivet af A. Gottschalk), bind 5A, side 300-321, Elsevier Publishing Co., Amsterdam, London, New York).

De opnåede resultater er samlet i de to nedenstående tabeller.

35 DK 166626 B1 26

Procentetisk sammensætning Kæder Totale kulhydrater, % 5

Naturligt A 5,58 + eller - 0,5

Al 4,54 + eller - 0,5 A2 6,24 + eller - 0,5 2q Oxideret A 2,27+eller-0,5

Al 2,07 + eller - 0,5 A2 3,33 + eller - 0,5 15 Molær sammensætning (På basis af en molekylvægt på 30.625, anføres resultaterne med gennemsnitlig nøjagtighed på + eller - 0.5 gruppe pr. molekyle) 20 kæder

Monosaccharider

Naturlige Oxideret 2 5 A Al A2 A Al A2 N-Acetylglucosamin 1,89 1,48 2,15 1,74 1,50 2,37

Mannose 4,6 3,40 5,2 1,43 1,29 2,26 30 Fucose 1,37. 1,41 1,52 0 0 0

Xylose_11.6 1,481 1,671 0,36 0,48 0.62

Resultaterne dokumenterer, at periodat oxidation har nedbrudt en del af A-kædens sukkerarter. Pr. molekyle A-kæde er der en 3 5 gennemsnitlig formindskelse på 3,17, 2,11 og 2,94 mannose grupper, fucosegrupperne er fuldstændigt forsvundet, og der er en gennemsnitlig formindskelse på 1,24,1 og 1,05 xylosegrup- DK 166626 B1 27 per for henholdsvis A-, Al- og A2-kæderne. N-acetylglucosamin-grupperne er kun svagt nedbrudte.

II - N-Terminal sekvens 5

Sekvensen af de N-terminale aminosyrer i A-k®den og dens Alog A2-varianter i den naturlige form og i den oxiderede form blev konstateret med en protein-sequencer ved hjælp af de procedurer, der kendes af fagmanden på området. De opnåede resul-10 tater er samlet i nedenstående tabel.

Kæder Sekvens af de 9 N-terminale aminosyrer

Naturligt A Ile-Phe-Pro-Lys-Gln-Tyr-Pro-Ile-Ile 15

Al Ile-Phe-Pro-Lys-Gln-Tyr-Pro-Ile-Ile A2 Ile-Phe-Pro-Lys-Gln-Tyr-Pro-Ile-Ile

Oxideret A Ile-Phe-Pro-Lys-Gln-Tyr-Pro-Ile-Ile 20

Al Ile-Phe-Pro-Lys-Gln-Tyr-Pro-Ile-Ile A2 Ile-Phe-Pro-Lys-Gln-Tyr-Pro-Ile-Ile

Det viser sig, at sekvensen af de 9 N-terminale aminoasyrer i 25 de naturlige og oxiderede A-, Al- og A2-kæder er fuldstændig identiske med hinanden, hvilket viser, at den oxidative behandling efterlader proteinkæden intakt. Det viser sig også, at sekvensen af A-kædernes 9 N-terminale aminosyrer er fuldstændig identisk med den tidligere af Funatsu beskrevne sek-30 vens for ricins A-kæde (Agric. Biol. Chem., (1979), 43, 2221).

III - Affinitet på concanavalin A/sepharose A-kæden, den med DTNB blokerede A-kæde [A(DTNB)J og kæderne 35 A(DTNB)-La, Al(DTNB), Al (DTNB)-La ,A2(DTNB) og A2(DTN8)-La afprøves for deres kapacitet til at fiksere til concanavalin A/sepharose. 1 ml af en opløsning af A-kæde indeholdende ca. 1 DK 166626 B1 28 mg/ml påføres på en søjle af 1 ml concanavali η A. Kromatografi efterfølges af måling af den optiske tæthed ved 280 nm. Efter vaskning med 125 mM phosphatbuffer med pH 7,0, indtil den første top, som ikke er tilbageholdt af concanavalin A, er vendt 5 tilbage til grundlinien, vaskes søjlen med 0,1 M boratbuffer med pH 6,0, som er 0,5 M med hensyn til NaCl og 0.1 M med hensyn til alfa-methylmannosid. Resultaterne, udtrykt som en procentdel af den optiske tæthed ved 280 nm, er sammenfattet i nedenstående tabel.

10 kæder % ikke tilbageholdt % elueret ved hjælp af Ialt __af con A__alpha-methvlmannosid__% A 53 27 80 15----

Al(DTNB) 66 11 77

Al(DTNB)-La 78 5 83 A2(DTNB) 80 6 86 A2(DTNB)-La 73 0.4 73.4 20____ A2(DTNB) 25 70 95 A2(DTNB)-La 64 9 73 25 Det er kendt, at concanavalin A har en affinitet til glycop-roteiner med terminale mannoser. Det viser sig, at A-kæden, som indeholder sådanne grupper, kan binde.til con A. Dette er særlig tydeligt i tilfælde A2-kæden, som er den mere rigt med mannose substituerede isomer. Det viser sig også, at den oxi- 30 dative behandling nedbryder denne affinitet, som hænger sammen med nedbrydningen af sukkergrupperne ved en behandling af denne type.

IV - Bestemmelse af E 1 promille.

Absorptionskoefficienten ved 280 nm ((El promille) er den optiske tæthed ved 280 nm af en opløsning indeholdende 1 mg/ml, 35 DK 166626 B1 29 hvori proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af FOLlN-prø-ven med et standardinterval af kvægserumalbumin.

Resultaterne er sammenfattet i følgende tabel: 5 A kæde 0,65 A(DTNB) kæde 1,12 10 A(DTNB)-La kæde 1,04

Al(DTNB) kæde 1,07

Al(DTNB)-La kæde 1,02 15 A2(DTNB) kæde 0,95 A2(DTNB) -La kæde 0,95

Blokering af kædens thiolgruppe med DTNB frembringer en betydelig stigning i absorptionen ved 280 nm, som følge af indfø-20 ringen af nitrobenzoylgruppen.

Efter oxidation iagtages ingen signifikant ændring af absorptionen ved 280 nm, hvilket viser, at oxidation ikke har påvirket aminosyrer, der er ansvarlige for absorptionen ved 280 25 nm* V - Isoelektrisk fokusering

Analyse af A-kæden ved hjælp af isoelektrisk fokusering frem-30 bringer et sæt bånd med isoelektriske punkter (pi), som ligger mellem 7.5 og 8.0 og er identiske for A-, Al- og A2-kæderne.

Blokering af A-kædenå cystein med DTNB forårsager en udvidelse af båndene mod det sure område. Frigørelse af cysteinet med 35 mercaptoethanol fører disse bånd tilbage til den naturlige A-kædes placering.

O

DK 166626 B1 30

En sammenligning mellem de i soelektri ske punkter får de naturlige og oxiderede A-, Al- og Al-kæder viser, at ved fravær af et blokerende middel overføres alle de bånd, der er karakteristiske for A-kæden, med 0,5 pH-enhed mod sure pH-værdier.

5 Denne overførsel finder sted uden overlapning mellem de naturlige og oxiderede A-kæders pH-områder, hvilket synes at angive, at alle A-kædemolekylerne påvirkes af oxidation.

Eksempel 8 10

Dette eksempel viser 1) den hurtige eliminering af naturligt gelonin, og 2) den langsomme eliminering af gelonin, der er modificeret med natriumperi odat, efter intravenøs injektion i dyret.

15 I - Modifikation af gelonin med natriumperi odat

Geloninet blev fremstillet og renset udfra Gelonium multiflo-rum ved hjælp af den metode, som er blevet beskrevet (J. Biol.

20 Chem. (1980) 255, 6947-6953). Oxidationsreaktionen udføres under de samme betingelser som de, der i eksempel 2 er beskrevet for ricins A-kæde, med undtagelse af, at det trin, i hvilket thiolgrupperne blokeres med DTNB, udelades.

25 Eftersom koblingen af gelonin med antistoffet generelt ikke foretages under anvendelse af gel oni nets naturlige thiol grupper, vil thiolgrupperne i virkeligheden blive indført kunstigt efter oxidationstrinnet ved hjælp af den teknik, der er beskrevet i Cancer Res., 1984, 44, 129-133. 21 mikroliter af en 30 o,5 M opløsning af natriumperiodat i vand sættes til 1 ml af en opløsning indeholdende 3 mg/ml gelonin i PBS-puffer, der er indstillet til pH 6 med 1 M eddikesyre. Inkubation foretages i 16 timer ved 4°C i mørke. Reaktionen standses ved tilsætning af 105 mikroliter af en 1M vandig opløsning af ethylenglycol.

35 Efter inkubation i 15 min ved 20°C, dialyseres reaktionsmediet ved 4eC mod PBS-puffer. Efter centrifugering ved 10.000 x g i 30 minutter, fører dette til 2,9 mg oxideret gelonin i en koncentration på 2,5 mg/ml.

DK 166626 B1 31

Ligesom ricins A-kæde består gelonins fundamentale egenskab i at inhibere proteinsyntese i eucaryote celler ved nedbrydning af den ribosomale sub-enhed 60 S (Biochem. J. (1982) 207, 505-509). Også i tilfælde af gelonin forårsager modifikationen 5 som følge af periodatoxidation ikke et aktivitetstab.

II - Farmakokinetiske egenskaber hos gelonin med forlænget virkning 10 Naturligt gelonin eller gelonin, der er modificeret ved hjælp af de ovenfor forklarede procedurer, administreres til kaniner ved hjælp en enkelt injektion i en ørevene. Den injicerede ge-loninmængde er mellem 0,3 og 0,4 mg/kg. Blodprøver udtages med mellemrum på heparin. Plasmaerne analyseres ved hjælp af en 15 radioimmunometri sk prøve, der nedenfor betegnes ved forkortelsen RIM-2.

Denne prøve foretages ved hjælp af den samme teknik som blev benyttet til prøven RIH-1, med den undtagelse, at opløsningen 20 Acl her er en opløsning af anti-gelonin kanin-antistoffer, der er renset ved hjælp af affinitetskromatografi, idet Ac2-anti-stofferne er de samme radiomærkede antistoffer. Radiomærkningsproceduren er identisk med den procedure, der er beskrevet for metoden RIM-1. Koncentrationen af naturligt gelonin eller 25 modificeret gelonin i prøverne, der skal bestemmes, måles ved reference til en kalibreringskurve, der er fastlagt ved at indføre naturligt eller modificeret gelonin i forskellige kendte koncentrationer. Prøven RIM-2 har de samme pålidelig-heds- og reproducerbarhedskarakteristika, som er beskrevet for 30 metoden RIM-1. Resultaterne af disse forsøg er anført på samme måde som for ricins A-kæde i eksempel 2.

Figur 4 viser plasmaeliminationskurverne som funktion af tid for naturligt gelonin og oxideret gelonin, der er i injiceret 35 intravenøst. Det naturlige gelonin forsvinder ligesom naturligt ricins A-kæde meget hurtigt fra blodstrømmen, eftersom 99,99% af det i blodstrømmen tilstedeværende gelonin forsvin- DK 166626 B1 32 der i løbet af 24 timer (kurve 1). Når geloninet er blevet oxideret i sine polysaccharidenheder, modificeres eliminationsprofilen dybtgående. 24 timer efter injektion er koncentrationen af det oxiderede gelonin 300 gange større end koncen-5 trationen af det naturlige gelonin (kurve 2).

Ligesom for ricins A-kæde dokumenterer disse resultater således, at periodatoxidation har modificeret de sukkerarter, der er involveret i den genkendelsesproces, der ansvarlig for eli-1° minationen af gelonin, til punktet for hindring af denne genkendelse .

Eksempel 9: 15 Dette eksempel viser: 1. den hurtige eliminering af GPIR MOM, der erextraheret fra Momordica karantia, og 20 2. den langsomme eliminering af GPIR MOM, der er modificeret med natriumperiodat, efter intravenøs injektion i dyret.

1) - Modifikation af GPIR MOM med natriumperiodat 25 GPIR MOM blev fremstillet og renset udfra Momordica karantia-frøs frøhvide ved hjælp af den metode, som er blevet beskrevet (Biochemical Journal (1980), 186, 443-452). Naturligt eller modificeret MOMs farmakokinetiske egenskaber blev fastslået 30 ved anvendelse af radioaktivt GPIR MOM. MOM radiomærkes på ty-rosinerne med radioaktivt jod-125 i nærværelse af chloramin T.

10 mikroliter af en opløsning af radioaktivt jod-125 indeholdende 100 pCi/ml og 30 mikroliter af en opløsning af chloramin T indeholdende 2,5 mg/ml i vand sættes til 1O0 mikroliter af 35 en opløsning indeholdende 1 mg/ml MOM i PBS-puffer. Reaktionen lades forløbe i et minut ved omgivelsernes temperatur. Reaktionen standses ved tilsætning af 400 mikroliter af en opløs- DK 166626 B1 33 ning af natriummetabisulfit indeholdende 0,5 mg/ml. Reaktionsmediet kromatograferes ved hjælp af gelfi 1 trering på en søjle af "sephadex" G25 med PBS-puffer indeholdende 0,1% gelatine med henblik på at skille det radiomærkede protein fra det 5 uomsatte jod. Efter centrifugering ved 10.000 x g i 30 minutter fører dette til 80 mikrogram radiomærket Μ0Μ i en koncentration på 0.04 mg/ml.

Oxidationsreaktionen udføres under de samme betingelser som 10 beskrevet for ricins A-kæde i eksempel 2, med den undtagelse, at det trin, hvori thiolgrupperne blokeres med OTNB, udelades, og at koncentrationen af protein er 125 gange mindre (40 pg/ml }. 20 mikroliter af en 0,5 M opløsning af natriumperi odat i vand sættes til 1 ml af en opløsning indeholdende 0.04 mg/ml 15 radiomærket MOM, der er bragt til pH 6 med 1 M eddikesyre. Inkubation lades forløbe i 16 timer ved 4°C i mørke. Reaktionen standses ved tilsætning 100 mikroliter af en 1 M vandig opløsning af ethylenglycol. Efter inkubation i 15 minutter ved 20°C dialyseres ved 4°C mod PBS-puffer. Efter centrifugering ved 20 10.000 x g i 30 minutter fører dette til 32 mikrogram oxideret MOM i en koncentration på 0.021 mg/ml.

Det således opnåede nye molekyle har en molekylvægt, der ikke er signifikant forskellig fra det naturlige MOMs molekylvægt.

25 Såvidt det er muligt at se ved hjælp af polyacrylamidgra-dientelektrophorese efter fremkaldelse med coomassie-blåt eller radioautograf i, frembringer modifikationsprocessen kun proteinpolymerer i en meget lille mængde og danner ikke noget nedbrydningsprodukt.

30 2) - Farmakokinetiske egenskaber hos MOM med forlænget v i rkni nq

Det radiomærkede MOM, uanset om det er oxideret eller ikke er 35 oxideret ved hjælp af de ovenfor forklarede procedurer, administreres til kaniner ved hjælp af en injektion i en ørevene. Mængden af injiceret MOM er mellem 3,50 og 3,55 mikrogram/kg.

DK 166626 B1 34

Blodprøver udtages med mellemrum på heparin. Plasmaerne (200 mikroliter) inkuberes med trichloreddikesyre (TCA) (200 mi-kroliter i en koncentration på 25%) i 30 minutter ved 4°C. Efter centrifugering, kan radioaktiviten indeholdt i det sedi-5 ment, som kan udfældes ved hjælp af syren, bestemmes. Denne analysemetode gør det muligt at måle plasmamængden af de intakte MOM-moleky1 er og hvilke som helst lavmolekylære nedbrydningsprodukter, som ikke kan udfældes ved hjælp af TCA, tages ikke i betragtning.

10

Resultaterne af disse eksperimenter er angivet som procenten af den oprindelige radioaktivitet, der forbliver i blodstrømmen som funktion af tiden. Denne værdi, som kaldes "procentdelen af den oprindelige plasmaradioaktivitet" (% IPR), bere-15 gnes under anvendelse af følgende udtryk: r x PV x 100 % I.P.R. = _

0.2 x R

20 hvor: r = radioaktivitet målt på tidspunktet t i 0,2 ml plasma , R = total injiceret radioaktivitet, 25 PV = plasmavolumen (betragtes som værende lig med 36 ml/kg af dyrets legemsvægt).

Plasmaeliminationskurverne som funktion af tiden for det oxiderede eller ikke-oxiderede Μ0Μ efter intravenøs injektion er 30 vist i fig. 5. Μ0Μ forsvinder ligesom naturligt ricins A-kæde meget hurtigt fra blodstrømmen, eftersom 99.9% af det i blodstrømmen tilstedeværende MOM forsvinder i løbet af 8 timer (kurve 1). Når Η0Μ er blevet oxideret i sine sukkergrupper, formindskes elimineringshastigheden (kurve 2): 8 timer efter injektion er mængden af oxideret MOM 60 gange større end mængden af det ikke-oxiderede MOM. Disse resultater dokumenterer, at periodatoxidation har modificeret de sukkerarter, som 35 DK 166626 B1 35 indgår i den genkendelsesproces, der er ansvarlig for den hurtige eliminering af MOM.

Eksempel 10: 5

Dette eksempel viser: 1. den hurtige eliminering af GPIR-Dianthin, der er extraheret fra Dianthus cariofyllus, og 10 2. den langsomme eliminering af GPIR-Dianthin, der er modificeret med natriumperiodat, efter intravenøs injektion i øret.

1) - Modifikation af Dianthin 30 med natriumperiodat 15

Dianthin 30 blev fremstillet og renset ud fra Dianthus caryop-hyllusblade ved hjælp af den metode, som blevet beskrevet (Biochemical Journal (1981 ), 195, 339-4-05). Oxideret eller ikke -oxideret Dianthin 30‘s farmakokinetiske egenskaber blev 20 fastslået ved anvendelse af radioakt ivt Dianthin. Joder i ngs-og oxidationsreaktioner udføres under de samme betingelser som beskrevet for MOM i eksempel 9.

Det således opnåede nye oxiderede Dianthinmolekyle har en 25 molekylvægt, der ikke er signifikant anderledes end molekylvægten af det naturlige Dianthin 30.

2) - Farmakokinetlske egenskaber hos Dianthin 30 med forlænget vi rkninq 30

Det oxiderede eller ikke-oxiderede radiomærkede Dianthin administreres til kaniner ved hjælp en enkelt injektion i en ørevene. Plasmamængden af Dianthin måles ved hjælp af den samme procedure som beskrevet for MOM i eksempel 9. Fig. 6 viser 35 plasmaeliminationskurverne som funktion af tid for det oxiderede Dianthin (kurve 2) eller ikke-oxiderede Dianthin (kurve 1). Dianthin 30 forsvinder ligesom MOM meget hurtigt fra blod- DK 166626 B1 36 strømmen, eftersom 99,9¾ af den oprindeligt tilstedeværende mængde forsvinder i løbet af 2 timer. Når Dianthin 30 er ble-vete oxideret i kulhydratgrupperne, bliver eliminationskinetikken på den anden side gjort betydelig langsommere. To timer 5 efter injektion er dianthinmængden 80 gange større end mængden af ikke-oxideret Dianthin. Mængden af oxideret Dianthin forbliver høj udover 24 timer (3% af den oprindelige værdi efter 24 timer) .

10 Atter her viser disse resultater, at periodatoxidation har modificeret de sukkerarter, der er involveret i den genkendelsesproces, som er ansvarlig for den hurtige eliminering af de Di anthi net.

15 Eksempel 11:

Konjugat opnået ved omsætning af et antistof, som inhiberer humane T-celler (et antistof rettet mod antigenet T65), og som er substitueret med aktiverede disulfidgrupper, med ricins 20 oxiderede A-kæde.

a) Antistof, der inhiberer humane T-celler (eller antistof T101) 25 Dette antistof opnåedes ved hjælp af fremgangsmåden beskrevet i Journal of Immunology, 1980, 125(2), 725-737.

b) Ricins oxiderede A-kæde: Ricins A-kæde blev fremstillet på den i eksempel 2 angivne måde.

30 II) Aktiverede antistoffer der,inhiberer humane T- celler 20 mikroliter af en opløsning indeholdende 60.3 mg/ml 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl-3-carbodiimid sættes til 100 mikroliter 35 af en opløsning indeholdende 20 mg/ml 3-(pyridin-2-yldi sy1fa-nyl) propionsyre i tert.-butanol, og blandingen lades henstå i 3 minutter ved omgivelsernes temperatur. 68 mikroliter af den DK 166626 B1 37 således opnåede opløsning sættes til 2 ml af en antistofopløs-ning indeholdende 8,9 mg/ml i PBS-puffer. Blandingen omrøres i 15 minutter ved 30eC og dialyseres derpå mod PBS-puffer ved 4°C. Efter dialyse centrifugeres proteinopløsningen til opnå-5 else af 15 mg aktiveret antistof i en koncentration på 7,9 mg/ml. Ved hjælp spektrofotometrisk analyse ved 343 nm af den ved udveksling med 2-mercatoethanol frigjorte pyridin-2-thion viser det sig, at det opnåede antistof bærer 3,8 aktiverede, blandede di sulfidgrupper pr. mol antistof.

10 III) Fremstilling af immunotoksinet indeholdende ricinets A-kæde med forlænget virkning 2,46 ml modificeret A-kæde indeholdende 2,87 mg/ml sættes til 15 1,5 ml af opløsningen af den som ovenfor anført opnåede opløs ning af aktiveret antistof (koncentration: 7,9 mg/ml, d.v.s.

11,8 mg aktiverede antistoffer) og blandingen inkuberes i 20 timer ved 20eC. Opløsningen centrifugeres og renses derpå ved filtrering på en "Sephadex" GlOO-søjle, idet afgangsstrømmens 20 optiske tæthed måles ved 280 nm. Kombination af fraktionerne indeholdende både antistoffet og A-kæden resulterer i 15 ml immunotoxinopløsning indeholdende 0,7 mg/ml, d.v.s. 10,5 mg. Denne opløsning indeholder 0.14 mg oxideret A-kæde koblet med antistoffet pr. ml.

25

Den gennemsnitlige koblingsgrad i dette præparat er derfor 1,2 mol oxideret A-kæde pr. mol antistof.

Immunotoxinet indeholdende ricins oxiderede A-kæde, IT (A-la) 30 T101, opnået som ovenfor anført, blev undersøgt for dets far- makokinetiske egenskaber og dets specifikke cytotoxiske egenskaber overfor målcellerne.

Eksempel 12:

Dette eksempel viser erhvervelsen af egenskaber til langsom plasmaelimination hos immunotoxinerne indeholdende ricins 35 DK 166626 B1 38 A-kæde med forlænget virkning, der forkortes til IT (A-La)TlOl.

I - Procedure 5

Konjugatet fremstillet ved den i eksempel 11 forklarede procedure administreres til kaniner ved hjælp af en enkelt injektion i en ørevene. Den injicerede mængde svarer til 0,415 mg/kg, udtrykt som A-kæde. Blodprøver udtages med mellemrum på 10 heparin. Plasmaerne analyseres ved hjælp af en radioimmunome-trisk prøve med to steder, der nedenfor er forkortet til RlM-3.

Denne prøve udføres ved hjælp af den samme teknik, som blev 15 benyttet til prøven RIM-1, med den undtagelse, at opløsningen Ac2 her er en opløsning af gedantistoffer, der inhiberer mus IgG, renset ved hjælp af affinitetskromatografi og radiomærket som beskrevet for metoden RIM-1.

20 Koncentrationen af modificeret immunotoxin i de til bestemmelse beregnede prøver måles ved reference til en kalibreringskurve, der er frembragt ved at indføre det modificerede immu-notoxin i forskellige koncentrationer. Prøven RIM-3 har de samme pål i deligheds-reproducerbarhedsegenskaber som beskrevet 25 for metoden RIM-1.

Til sammenligning udføres en kontrolundersøgelse under de samme betingelser med konjugatet omtalt som IT T101, der opnås ved omsætning af det samme antistof T101, substitueret med ak-30 tiverede disulfidgrupper, med ricins naturlige A-kæde. Dette konjugats fremstilling og cytotoksiske egenskaber er beskrevet i fransk fremlæggelsesskrift nr. 2 516 794. Resultaterne af disse forsøg er angivet på samme måde som for ricins ukoblede A-kæde i eksempel 1.

35 DK 166626 B1 39 II - Resul tater

Fig. 7 viser plasmaeliminationskurverne som funktion af tiden for IT T101 og IT (A-La) T101, der er injiceret intravenøst.

5 Fireogtyve timer efter injektion er koncentrationen af aktivt immunotoxin 140 gange større for IT (A-La) T101 end for IT T101. Dette faktum viser, at den oxiderede A-kædes nye farma-kokinetiske egenskaber bibeholdes efter kobling med et antistof.

10

Eksempel 13;

Dette eksempel viser bevarelsen af de specifikke cytotoksiske egenskaber hos IT (A-La) T101 overfor målcellerne.

15

Ricins A-kædes fundamentale biologiske egenskab består i at inhibere proteinsyntesen i celler ved nedbrydning af den ribo-somale sub-enhed 60S. Metoden benytter en cellemodel, i hvilken virkningen af de undersøgte stoffer på inkorporeringen af 20 l^C-leucin i cancerceller under dyrkning måles.

De benyttede celler tilhører CEM-cellelinien hidrørende fra en human T-leukæmi, der bærer antigenet T65. Cellerne inkuberes i nærværelse af det stof, der skal undersøges, og efter afslut-25 tet inkubation måles inkorporeringsgraden af l^C-leucin i de på denne måde behandlede celler.

Denne måling foretages ved hjælp af en tilpasset metode i forhold den i Journal of Biological Chemistry 1974, 249(11), 30 3557-3562, beskrevne ved anvendelse af sporstoffet cl^-leucin til bestemmelse af proteinsyntesegraden. Den inkorporerede radioaktivitet bestemmes her på hele celler, som er isoleret ved hjælp af filtrering.

35 p§ basis af disse bestemmelser er det muligt at optegne dosis/ virkning-kurverne, idet man efter abscissen afsætter den molære koncentration af A-kæde i stofferne, der skal undersøges, DK 166626 B1 40 og efter ordinaten afsætter inkorporeringen af cl^·— 1 eucin udtrykt som en procentdel af inkorporeringen i kontrol cel 1 er under fravær af noget stof, der påvirker proteinsyntese.

5 Det er således muligt for hvert stof, der skal undersøges, at bestemme den koncentration, som forårsager en 50% inhibering af inkorporeringen af Cl4-leucin, eller "50% inhiberende koncentration" (IC50)· 10 Fig. 8 viser de kurver, der opnås ved det samme forsøg med IT (A-La) T101 og den ukoblede oxiderede A-kæde i nærværelse af 10 mM ammoni umchlorid i inkubationsmediet. Det kan af denne figur ses, at IT (A-La) T101 har en meget kraftig cytotoxisk virkning (IC50 = 5.5 · 10~12M), hvilket er ca. 80.000 gange 15 mere end virkningen af den ukoblede oxiderede A-kæde, målt under de samme betingelser.

Eksempel 14 20 Dette eksempel viser den forholdsmæssige cytotoxiske effektivitet af IT (A-La) T101 og IT T101 overfor CEM-målcel lerne, målt ved en clonogen prøve.

Immunotoxiner er forudbestemt til udslettelse af hver eneste 25 af målcellerne. Denne opførsel kan kun bedømmes med en meget følsom metode; prøver til inhibering af kolonidannelse fremby-der denne mulighed, fordi en enkelt overlevende celle kan afsløres blandt flere millioner døde celler. Dette muliggøres ved hjælp af optimale dyrkningsbetingelser i et geleret me-30 dium, der anvendes til den humane CEM lymfoide linie.

I- Metode til måling af cytotoxititet ved inhibering af kolonidannelse 35 Det til cloning benyttede medium er mediet RPMI 1640, hvortil 1 mmol/1 natrium-alfa-ketog1utarat, 1 mmol/1 natriumoxalace- tat, 5% inaktiveret kalvefosterserum og 10% i nakt i veret heste- DK 166626 B1 41 serum sættes. En første 0f3 % agaropløsning (Agarose type VII, SIGMA laboratories) fremstilles i dette medium, placeres som et tyndt lag i små Petriskåle og størknes ved + 4°C. Cellerne blandes med en anden ved 37°C opbevaret 0,275% agaropløsning, 5 som derpå påføres på det første lag og størknes. Disse koncentrationer af agar blev valgt efter en forudgående undersøgelse roed henblik på samtidig optimering af kloningseffektiviteten, koloniernes størrrelse og mediets konsistens.

10 Efter 15 dage i inkubatoren tælles kolonierne under anvendelse af en automatisk kolonitæller ("ARTEK", DYNATECH, U.S.A.). Til bestemmelse af kloningseffektiviten og således det nøjagtige antal celler, der overlever immunotoxinbehandlingen, er det vigtigt at tilvejebringe en kalibreringslinje, der viser an-15 tallet af podede celler som funktion af antallet af dannede kolonier. Det er blevet godtgjort, at kloningseffektiviteten angivet ved hjælp af denne ka1 i brer ings1 inje er praktisk taget upåvirket af tilstedeværelsen af en stor mængde døde celler, hvilket er den situation, der naturligt kommer til at forelig-20 ge, når cellerne behandles med immunotoxinet.

Immunotoxinbehandl i ngen udføres ved inkubation af cellerne i den eksponentielle vækstfase og i en koncentration på 10®/ml med immunotoxinet IT (A-La) T101 eller IT T101 i forskellige 25 koncentrationer i en samlet mængde på 1 ml af mediet RPMI 1640 indeholdende 10% inaktiveret kalvefosterserum og 10 mmol/liter ammoniumchlorid. Inkubationen finder sted ved 37°C under en atmosfære indeholdende 5% carbondioxid og med horisontal rystning af prøverørene (2500 omdrejninger pr. min. med en "GIRA-30 TORY G- 2" ryster, NEW-BRUNSWICK). Cellerne vaskes derpå, og forskellige fortyndinger fremstilles før blanding med agaropløsningen, så at antallet af overlevende celler kan måles i zonen med maximal følsomhed angivet ved hjælp af kalibreringslinjen. Resultaterne udtrykkes som det absolutte antal overle-35 vende celler, ekstrapoleret fra kloningseffektiviteten, under DK 166626 B1 42 anvendelse af følgende relation: absolut antal overlevende celler: C x d

E

5 hvor C er antallet af kloner pr. Petriskål, d er fortyndingsfaktoren for det undersøgte cellepræparat, og E er kloningseffektiviteten angivet ved ka1ibrerings1 injens hældning. Hvert punkt svarer til gennemsnittet af tre prøver.

10 II - Resultater

Fig. 9 viser kurverne for den cytotoksiske virkning af immuno-toxinerne IT (A-La) T101 og IT T101 på CEM-cellerne i nærvæ-relse af 10 mM ammoniumchlorid, som funktion af immunotoxin-koncentrationen (udtrykt som molariteten af A-kæde). Det fremgår, at effektiviterne af disse to produkter er af samme størrelsesorden. Den resulterende formindskelse af antallet af celler er ekstremt stor i begge tilfælde, eftersom mængden af 20 tilbageværende overlevende celler er af størrelsen 0,001% af begyndelsesværdien ved koncentrationer så lave som 10“H M. Denne virkning er overordentlig specifik, eftersom det ved disse koncentrationer blev godtgjort, at den ukoblede A-kæde eller et uspecifikt immunotoxin ikke har nogen virkning på 25 disse celler.

Dette eksempel viser, at IT (A-La) T101 har specifikke cyto-toxicitetsegenskaber, der er praktisk taget identiske med konventionelt IT TIOl's cytotoxicitetsegenskaber.

30

Eksempel 15

Konjugat opnået ved omsætning af et antistof, som inhiberer humane T-celler (et antistof rettet mod antigenet T65), og 35 som er substitueret med aktiverede disulfidgrupper, med ricins oxiderede og funktionaliserede A-kæde (NEM), idet koblingen finder sted mellem de aktiverede di sulfidgrupper.og A-kædens funktional iserede sukkergrupper.

DK 166626 B1 43 1) - Fremstilling af immunotoksinet a) Fremstilling af den funktionaliserede A-kæde 5 A-kæden blokeres med N-ethylmaleimid på dens SH-gruppe og oxideres derpå i 18 timer ved hjælp af den i eksempel 3 beskrevne procedure.

Kobling med cystamin 10

Efter dialyse mod carbonatpuffer med pH 9,5 inkuberes 5,2 ml af en proteinopløsning indeholdende 4.65 mg/ml sammen med 18 mg cystaminhydrochlorid i 2 timer ved 25°C. Denne inkubation efterfølges af reduktion med natriumborhydrid (200 ekvivale-15 nter pr mol A-kæde, d.v.s. 156 mikroliter af en opløsning indeholdende 17,6 mg i 1 ml 0,1 N NaOH) i 2 timer ved 25°C.

Overskuddet af reagens fjernes ved hjælp af kontinuerlig dialyse mod 125 mM phosphatpuffer med pH 7. Den fixerede cystamins 20 disulfidbro reduceres derpå med 2-mercaptoethanol til en slut-koncentration på 5 procent i 1 time ved 30° C, idet dette efterfølges af yderligere kontinuerlig dialyse mod 125 mM phosphatpuffer med pH 7 (20 liter ved 300 ml/time). Efter dialyse og centrifugering bestemtes 0,25 SH pr mol A-kæde ved 25 Ellman's metode.

b) Fremstilling af antistoffet (se eksempel 11) c) Koblingsreaktion 30 1,5 ml af opløsningen af ricins modificerede A-kæde (d.v.s.

0,058 mikromol) sættes til 211 mikroliter af opløsningen af det som ovenfor anført opnåede aktiverede antistof (d.v.s. 0,006 mikromol). Blandingen lades reagere i 18 timer ved 30eC. Reaktionsmediet dialyseres derpå mod PBS-puffer (10 mM med 35 hensyn til phosphat og 140 mM med hensyn til natriumchlorid, pH 7,4). Efter centrifugering og undersøgelse ved hjælp af polyacrylamidgradientelektroforese viser det sig, at det DK 166626 Bl 44 opnåede immunotoxin har en gennemsnitlig koblingsgrad for det- t, te præprarat på 0,8 A-kæde (NEM) pr. mol antistof.

2) - Immunotoxinet IT (A(NEM)-La-cysteamin) TIOl's egenskaber 5

Specifik cytotoksisk aktivitet

Det viser sig, at dette immunotoxin, fremstillet ved den ovenfor forklarede procedure, har en meget kraftig cytotoxisk 1° virkning på CEM-målcellerne (IC50 = l,2xlO“H M, fastslået ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 13) b) Plasmaeliminering

Immunotoxinet administreres til kaniner ved hjælp af en enkelt injektion i en ørevene (50 mikrogram A-kæde/kg). Plasmaprøver, 15 er opsamlet efter 22 timer, analyseres ved hjælp af immun- oprøven RIA-3 (eksempel 12). Resultaterne er vist i nedenstående tabel. Værdierne for IT T101 er angivet til sammenligning.

20

Relativ plasmakoncentration 22 timer efter injektion IT (A(NEM)-La-cysteamin)T101 2,4% 25 it T101 0,08%

Toogtyve timer efter injektion er koncentrationen af IT indeholdende modificeret A-kæde 30 gange større end i tilfælde af IT T101.

30

Eksempel 16;

Konjugat opnået ved omsætning af et antistof, der inhiberer humane T-celler (et antistof rettet mod antigenet T65), og som 3 5 er substitueret med aktiverede disulfidgrupper, med ricins me-thylerede, oxiderede og funktionaliserede A-kæde (NEM), idet koblingen finder sted mellem de aktiverede disulfidgrupper og A-kædens modificerede sukkergrupper.

DK 166626 B1 45 1) - Fremstilling af immunotoxinet a) Fremstilling af den funktionaliserede A-kæde 5 A-kæden blokeres med N-ethylmaleimid på sin SH-gruppe og me-thyleres og oxideres derpå i 18 timer ved hjælp af den i eksempel 5 beskrevne metode.

Kobling med cystamin 10

Efter dialyse mod 0,1 M carbonatpuffer med pH 9,5 inkuberes 18,5 ml af en proteinopløsning indeholdende 2,5 mg/ml sammen med 35,6 mg cystaminhydrochlorid i 2 timer ved 25°C. Denne inkubation efterfølges af reduktion med natriumborhydrid (200 15 ækvivalenter pr. mol A-kæde, dvs. 395 mikroliter af en opløsning indeholdende 17,6 mg i 1 ml 0,1 N NaOH) i 2 timer ved 25°C.

Reagensoverskuddet fjernes ved kontinuerlig dialyse mod 125 mM 20 phosphatpuffer med pH 7. Den fikserede cystamins disulfidbro reduceres derpå med 2-mercaptoethanol til en slutkoncentration på 5% i 1 time ved 30eC, idet dette efterfølges af yderligere kontinuerlig dialyse mod 125 mM phosphatpuffer med pH 7 (20 1 ved 300 ml/time). Efter dialyse og centrifugering, bestemtes 25 0,32 SH pr. mol A-kæde ved hjælp af Ellman's metode.

b) Fremstilling af det modificerede antistof En opløsning indeholdende 2,12 mg N-succinimidyl-3-pyridin-2-yldithiopropionat i ethylalkohgol 30 sættes til 23,5 ml af en opløsning af antistof T101 indeholdende 4,4 mg/ml (dvs. 0,68 mikromol). Denne blanding omrøres i 30 min. ved 25°C og dialyseres derpå mod 125 mM phosphatpuf-fer med pH 7. Efter dialyse, centrifugeres proteinopløsningen til opnåelse af 23,5 ml af en opløsning indeholdende 4,2 mg 35 modificeret antistof pr. ml.

Ved hjælp af spektrophotometrisk analyse ved 343 nm af den ved udveksling med 2-mercaptoethanol frigjorte pyridin-2-thion vi DK 166626 B1 46 ser det sig, at det opnåede antistof bærer 3,2 aktiverede, blandede disulfidgrupper pr. mol antistof.

c) koblingsreaktion 5 7,3 ml af opløsningen af ricins modificerede A-kæde (dvs.

0,275 mikromol) sættes til 781 mikroliter af den som oven for anført opnåede opløsning af aktiveret antistof (dvs. 0,022 mikromol). Blandingen lades reagere i 18 timer ved 30eC. Reaktionsmediet dialyseres derpå mod PBS-puffer (10 mM med hensyn 10 til phosphat, 120 mM med hensyn til natriumchlorid, pH 7,4).

Efter centrifugering og undersøgelse ved hjælp af polyacryla-midgradientelectrophorese viser det sig, at det opnåede immu-notoksin har en gennemsnitlig koblingsgrad for dette præparat 15 på 0,8 oxideret, methyleret A-kæde (NEM) pr. mol antistof.

Immunotoksfnet indeholdende ricins methylerede, oxiderede A-kæde (NEM), opnået som oven for anført, blev undersøgt for dets pharmakokinetiske egenskaber og dets specifikke cytotok-20 s icitetsegenskaber over for målcellerne.

2) Egenskaber hos immunotoksinet IT (methyleret A(NEM)-la-cysteamin) T101 25 a) Specifik cytotoksicitetsvirkning

Det viser sig, at dette immunotoksin, fremstillet ved den oven for forklarede procedure, har en meget kraftig cytotoksisk virkning på CEM-målcel lerne (IC50 = 7 x fastslået ved den i eksempel 13 beskrevne metode).

30 b) Plasmaeliminering

Immunotoksinet administreres til kaniner ved hjælp af en enkelt injektion i en ørevene (81 mikrogram-A-kæde/kg). Plasmaprøverne opsamles efter 24 timer og analyseres ved hjælp 35 af immunprøven RIA-3 (eksempel 12). Resultaterne er vist i nedenstående tabel.

DK 166626 B1 47 Værdierne for IT T101 er angivet til sammenligning.

Relativ p1asmakoncentrat i _ on efter 22 timer 5 IT (methyleret A(NEM)-La-cysteamin) 1,4% T101 IT T101 0,08% 10 __ 22 timer efter injektion er koncentrationen af IT indeholdende modificeret A-kæde 17,5 gange større end i tilfælde af IT T101.

15

Eksempel 17

Toksicitet af i mus injiceret A-kæde med forlænget virkning.

2Q Det var vigtigt at undersøge den samlede toksikologiske virkning af den oxiderede A-kæde på hele dyret (idet immunotoksi-nernes toksicitet er af samme størrelsesorden som toksiciteten af A-kæden i lige molære doser). Dette blev foretaget ved bestemmelse af den 50% dødelige dosis af den oxiderede A-kæde, 25 administreret intravenøst til Charles River, France CDl-mus ved sammenligning med den 50% dødelige dosis af den naturlige A-kæde.

De fundne værdier er vist i den følgende tabel.

30 ld50 (mikrogram/mus) 35 Naturlig A-kæde 550

Oxideret A-kæde 800

Claims (13)

1. Antitumoralt glycoprotein, som inaktiverer ribosomer (GPIR), kendetegnet ved, at dets kulhydratenheder er modificeret ved oxidation med periodationen, hvorhos gly-coproteinet er forskelligt fra det hele ricin. DK 166626 B1

2. Glycoprotein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har i det væsentlige den samme virkning som og en længere halveringstid end det umodificerede glycoprotein, som i nakt i -verer ribosomer. 5

3. Glycoprotein ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det er opnået ved behandling af en vandig opløsning af et glycoprotein, som inaktiverer ribosomer, og hvis thiolgrupper eventuelt er beskyttede, med en vandig opløsning af et alkali- 10 metalperiodat i et tidsrum fra 0,2 til 24 timer, ved en temperatur fra 0 til 10°C og i fravær af lys, at thiolgrupperne om ønsket afblokeres, og at slutproduktet isoleres ved hjælp af kendte metoder. 15 4.. Glycoprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den vandige opløsning af glycoprotein er en vandig opløsning af ricins A-kæde.

5. Glycoprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at 20 ricins A-kæde er funktionaliseret, f.eks. ved methylering.

6. Glycoprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den vandige opløsning af glycoprotein er en vandig opløsning af gelonin. 25

7. Glycoprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den vandige opløsning af glycoprotein er en vandig opløsning af GPIR MOM.

8. Glycoprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den vandige opløsning af glycoprotein er en vandig opløsning af GPIR Dianthin 30. 1 Glycoprotein ifølge krav 3, kendetegnet ved, at 35 den vandige opløsning af glycoprotein er en vandig opløsning af Dianthin 32, Agrostin A, Agrostin B, Agrostin C, HCI eller Asparagus officinalis inhibitor. DK 166626 B1

10. Glycoprotein ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det er opnået enten udfra en A-kæde i ricin, som er naturlig ricins A-kæde eller et fragment af naturlig ricins A-kæde, eller udfra en A-kæde i ricin eller et fragment deraf fremstil- 5 let biosyntetisk ved hjælp af en celle, hvis genotype er blevet passende modificeret.

11. Glycoprotein ifølge krav 4 eller 9, kendetegnet ved, at det er opnået ved behandling af en vandig opløsning af 10 ricins A-kæde, hvori mindst en af thiolgrupperne er beskyttet ved omsætning med 2,2'-di nitro-5,5'-dithiodibenzoat, med en vandig opløsning af natriumperiodat i et tidsrum fra 0,2 til 24 timer ved en temperatur på ca 4°C og i fravær af lys, behandling af blandingen med 2-mercaptoethanol samt isolation af 15 det resulterende produkt ved hjælp af kendte metoder.

12. Glycoprotein ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er opnået ved behandling af en vandig opløsning af gelonin med en vandig opløsning af natriumperiodat, i et tidsrum fra 20 0,2 til 24 timer, ved en temperatur på ca 4eC og i fravær lys, behandling af blandingen med 2-mercaptoethanol og isolation af det resulterende produkt ved hjælp af kendte metoder.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af et antitumoralt glycop-25 rotein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det umo- dificerede, antitumorale glycoprotein underkastes oxidation med periodationer.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af et glycoprotein ifølge 30 krav 2, kendetegnet ved, at en vandig opløsning af et glycoprotein, som i nakt i verer ri bosomer, og hvis thiolgrupper eventuelt er beskyttet, behandles med en vandig opløsning af et alkal imetalper iodat i et tidsrum fra 0,2 til 24 timer ved en temperatur fra 0 til 15°C og i fravær af lys, at thiol-35 gruppen eventuelt afblokeres, og at slutproduktet isoleres ved hjælp af kendte metoder. DK 166626 B1

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at det benyttede udgangsmateriale er enten en A-kæde i ricin, som er naturlig ricins A-kæde eller fragment af naturlig ri-cins A-kæde, eller en A-kæde i ricin eller et fragment deraf, 5 der er produceret biosyntetisk ved hjælp af en celle, hvis genotype er blevet passende modificeret. 10 15 20 25 30 35