JPS6112628A - 抗腫瘍作用を有する糖タンパクおよびその製造方法 - Google Patents
抗腫瘍作用を有する糖タンパクおよびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
この発明は新規な抗肺瘍性糖タンパク質（グリコタンパ
ク質）に係わり、特にその炭水化物単位が過ヨウ素酸塩
イオンで酸化、修飾された糖タンパク質に関する。
ク質）に係わり、特にその炭水化物単位が過ヨウ素酸塩
イオンで酸化、修飾された糖タンパク質に関する。
本発明の新規な糖タンパク質はリボソームを不活性化し
、かつその効能が持続することを特徴とする。
、かつその効能が持続することを特徴とする。
とのりｇソームを不活性化する糖タンパク質とはり？ソ
ームを不活性化ルｆ： ・東７ｒ＋、細胞中でのタンパ
ク質合成を妨害する巨大分子のサツカライド単位を有す
る全ての物質又はその分画物質を意味し、それが天然の
もの、又は生合成されたもので、細胞の遺伝型をこの目
的のために修飾されたものであってもよく、さらにその
アミノ酸の官能基が修飾され抗体と容易に結合するよう
にしたものでありてもよい。
ームを不活性化ルｆ： ・東７ｒ＋、細胞中でのタンパ
ク質合成を妨害する巨大分子のサツカライド単位を有す
る全ての物質又はその分画物質を意味し、それが天然の
もの、又は生合成されたもので、細胞の遺伝型をこの目
的のために修飾されたものであってもよく、さらにその
アミノ酸の官能基が修飾され抗体と容易に結合するよう
にしたものでありてもよい。
このりがソームを不活性化する糖タンノぐり質を以下″
ＧＰＩＲ”と記号化して示す。
ＧＰＩＲ”と記号化して示す。
このＦＪＡ細をにおいて、過ヨウ素酸塩イオンとはｒＯ
４−イオンを意味し、さらにメタ過ヨウ素酸塩を呼称す
ることもある。
４−イオンを意味し、さらにメタ過ヨウ素酸塩を呼称す
ることもある。
このＧＰＩＲは抗体との結合により免疫毒素を製造する
際の中間体として特に有用である。
際の中間体として特に有用である。
米国特許４４，３４０，５３５、フランス特許屋２，５
０４，０１０およびＡ２，５１６，７９４にはコンジュ
ゲートと呼ばれる抗ガン剤の製造について開示があり、
これは２重結合によシリジンのＡ鎖を、破壊されるべき
細胞の抗原に対する抗体又はその分画と結合することに
より得られるとしている。この種の生成物を本明細書に
おいては一般的に免疫毒素と呼ぶ。
０４，０１０およびＡ２，５１６，７９４にはコンジュ
ゲートと呼ばれる抗ガン剤の製造について開示があり、
これは２重結合によシリジンのＡ鎖を、破壊されるべき
細胞の抗原に対する抗体又はその分画と結合することに
より得られるとしている。この種の生成物を本明細書に
おいては一般的に免疫毒素と呼ぶ。
上記のリシンＡ鎖を有する免疫毒素に類似するコンジュ
ゲートで、抗ガン剤として適当な物質も知られてお９、
これは２重結合により抗体又は抗体分画物を他のす？ソ
ーム不活性化糖タンパク質、たとえばグロニウムマルチ
フローラム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕ
ｍ）、（Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
ゲートで、抗ガン剤として適当な物質も知られてお９、
これは２重結合により抗体又は抗体分画物を他のす？ソ
ーム不活性化糖タンパク質、たとえばグロニウムマルチ
フローラム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕ
ｍ）、（Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。
１９８１ 、１１６ 、４４７−４５４ ；Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ、。
ｒ Ｒｅｓ、。
１９８４．４４．１２９−１３３）、又はモモルデカカ
ランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ａｈａｒａｎｔｉａ）
（ＭＯＭ）から抽出された抑止体（米国特許Ａ’４，
３６８，１４９ ）と結合することによシ得られる。
ランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ａｈａｒａｎｔｉａ）
（ＭＯＭ）から抽出された抑止体（米国特許Ａ’４，
３６８，１４９ ）と結合することによシ得られる。
これらのＧＰＩＲはリシンのＡ鎖と似た特性を有し、分
子量が２０，０００ないし３０，０００程度である（Ｃ
ａｎｅｅ ５ｕｒｖｅｙ、１９８２ 、１ 、４８９−
５２０）。
子量が２０，０００ないし３０，０００程度である（Ｃ
ａｎｅｅ ５ｕｒｖｅｙ、１９８２ 、１ 、４８９−
５２０）。
これらの免疫毒素の細胞毒素活性を種々のアジュバント
物質、たとえばアンモニウム塩、アミン、あるいはカル
ブキシルイオノフオア（たとえば“モネンシンおよびニ
ゲリシン）で増強させることができることも知られてい
る。
物質、たとえばアンモニウム塩、アミン、あるいはカル
ブキシルイオノフオア（たとえば“モネンシンおよびニ
ゲリシン）で増強させることができることも知られてい
る。
しかし、免疫毒素の治療効果は活性化されているか否か
を問わず、その抗体部分を介して破壊されるべき目標細
胞上に局在化し得る場合にのみ十分に効果が発揮される
のである。この免疫毒素がこの目標細胞上に局在化し得
るか否かは免疫毒素が血流および細胞外流体内に、活性
化状態で目標細胞に到達し得る時間および対応する抗原
に匹適する十分な濃度を以って留り得るか否かに依存し
ている。
を問わず、その抗体部分を介して破壊されるべき目標細
胞上に局在化し得る場合にのみ十分に効果が発揮される
のである。この免疫毒素がこの目標細胞上に局在化し得
るか否かは免疫毒素が血流および細胞外流体内に、活性
化状態で目標細胞に到達し得る時間および対応する抗原
に匹適する十分な濃度を以って留り得るか否かに依存し
ている。
静脈内注射後の免疫毒素の血漿による除去機構が種々の
動物について多く研究されている。 ゛その結果
が生物学的に活性な免疫毒素が注射後に急激に減少する
ことが明らかと−なり、たとえばラビットの場合、二硫
化ブリッジを含む前肢を用い、リシンのＡ鎖をヒトＴリ
ン／１球の抗原Ｔ６５に対するモノクロ、ン抗体（抗体
Ｔｌ０Ｉ）と結合、して合成された免疫毒素を用いたモ
デルにおいて、注射直後の免疫毒素の９７％が３０分以
内に消失し、１７時間以内に’９９．９ ％が消失する
。
動物について多く研究されている。 ゛その結果
が生物学的に活性な免疫毒素が注射後に急激に減少する
ことが明らかと−なり、たとえばラビットの場合、二硫
化ブリッジを含む前肢を用い、リシンのＡ鎖をヒトＴリ
ン／１球の抗原Ｔ６５に対するモノクロ、ン抗体（抗体
Ｔｌ０Ｉ）と結合、して合成された免疫毒素を用いたモ
デルにおいて、注射直後の免疫毒素の９７％が３０分以
内に消失し、１７時間以内に’９９．９ ％が消失する
。
このような免疫毒性の急激な消失の結果、破壊されるべ
き細胞中の目標抗原の高比率に対し 、飽和するよう
な免疫毒性の能力を十分に持続させることかできなくな
る。この免疫毒素の血漿中での消失を相応する非接合抗
体と比較すると、反対に、血漿中の抗体は比較的長時間
高い割合で保持されることが知られている。最高に精製
された免疫毒素製剤でも非接合抗体が常にある程度残留
している。この免疫毒素と非接合抗体の消失速度の差に
よシ、当初において、゛極めて小さい比率であっ九抗体
が数時間の後に多数を占めるようになり、次第に競争に
よシ免疫毒素、の目標に対する固定のための強力な拮抗
体となる。
き細胞中の目標抗原の高比率に対し 、飽和するよう
な免疫毒性の能力を十分に持続させることかできなくな
る。この免疫毒素の血漿中での消失を相応する非接合抗
体と比較すると、反対に、血漿中の抗体は比較的長時間
高い割合で保持されることが知られている。最高に精製
された免疫毒素製剤でも非接合抗体が常にある程度残留
している。この免疫毒素と非接合抗体の消失速度の差に
よシ、当初において、゛極めて小さい比率であっ九抗体
が数時間の後に多数を占めるようになり、次第に競争に
よシ免疫毒素、の目標に対する固定のための強力な拮抗
体となる。
免疫毒素の血漿宿存性を活性状態で増大させ目標抗原に
対する占有時間および程度を増大させることは極めて有
意義なことである。
対する占有時間および程度を増大させることは極めて有
意義なことである。
さらに、放”射籠でラベルしたリシンのＡ鎖を有する免
疫毒素を動物中に特定の目標を与えることなく注射した
生体局在化実験によれば注射数分後にこの接合体は肝そ
うに多く局在することが分った。これはリシンのＡ鎖を
非結合状態で注射しまた場合も同じ傾向が見られた。こ
のことは免疫毒素が細胞毒性丈ブユニットを介して肝そ
う中に固定することを示している。リシンのＡ鎖はマン
ノース残液およびＮ−アセチルグルコースアミン残渣を
含むポリオサイド基ヲ有する糖タンパク質であり、この
マンノース残渣のあるものは末端位置に存在しているこ
とが知られている（Ａｇｒｉ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、 １９７８，４２゜５０１）。これらのマンノース残
渣を有する糖タンパク質を認識し得るリセグターが肝そ
う中に存在する。これらのりセグター（クツ被−細胞に
主として存在する）により認識される糖タンパク質は血
流から代謝細胞に固定されることにより急速に除去され
る。これは特に、β−グルキュロニダーゼおよびリボヌ
クレア７ゼＢの場合に良く記録されている（Ａｒｃｈ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 、 。
疫毒素を動物中に特定の目標を与えることなく注射した
生体局在化実験によれば注射数分後にこの接合体は肝そ
うに多く局在することが分った。これはリシンのＡ鎖を
非結合状態で注射しまた場合も同じ傾向が見られた。こ
のことは免疫毒素が細胞毒性丈ブユニットを介して肝そ
う中に固定することを示している。リシンのＡ鎖はマン
ノース残液およびＮ−アセチルグルコースアミン残渣を
含むポリオサイド基ヲ有する糖タンパク質であり、この
マンノース残渣のあるものは末端位置に存在しているこ
とが知られている（Ａｇｒｉ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、 １９７８，４２゜５０１）。これらのマンノース残
渣を有する糖タンパク質を認識し得るリセグターが肝そ
う中に存在する。これらのりセグター（クツ被−細胞に
主として存在する）により認識される糖タンパク質は血
流から代謝細胞に固定されることにより急速に除去され
る。これは特に、β−グルキュロニダーゼおよびリボヌ
クレア７ゼＢの場合に良く記録されている（Ａｒｃｈ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ 、 。
１９７８ 、１８８ 、４１８ ； Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 。
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 。
ニューヨーク、 １９７４：Ｐｅｄｉａｔ、 Ｒｅｓ、
、１９７７゜１１．８１６）。これらの文献によれはリ
シンのＡ鎖を有する免疫毒素の急激な解消は肝そう細胞
、特にクッペー細胞でのリシンＡ鎖のマンノース残渣の
認識により説明することができる。 ′他のＧＰ
ＩＲについての血漿中での解消機構、たとえばゲロニン
又はＭＯＭについて、静脈注射後について研究した結果
は、リシンのＡ鎖の場合と同様にＧＰＩＲの血漿におけ
るレベルは急速に減少することを示している。すなわち
、ラビットの場合、精製ゲロニンの注射後血流中の９３
％が１時間以内に消失し、２４時間以内に９９．９９％
が消失した。
、１９７７゜１１．８１６）。これらの文献によれはリ
シンのＡ鎖を有する免疫毒素の急激な解消は肝そう細胞
、特にクッペー細胞でのリシンＡ鎖のマンノース残渣の
認識により説明することができる。 ′他のＧＰ
ＩＲについての血漿中での解消機構、たとえばゲロニン
又はＭＯＭについて、静脈注射後について研究した結果
は、リシンのＡ鎖の場合と同様にＧＰＩＲの血漿におけ
るレベルは急速に減少することを示している。すなわち
、ラビットの場合、精製ゲロニンの注射後血流中の９３
％が１時間以内に消失し、２４時間以内に９９．９９％
が消失した。
糖タンパク質に含まれるようなオサイド構造を過ヨード
酸塩イオンで酸化することによυ、隣接する炭素原子が
第１、第２ヒドロキシル基を有する炭素鎖の切断が生ず
る。ＧＰＩＲ中の環状オーズ（ｏｓｅ＋＋）の場合の如
く、隣接するヒドロキシル基が第２級の場合、酸化によ
り炭素上に２つのアルデヒド基を生じさせ、これらの間
に切断が生ずる。
酸塩イオンで酸化することによυ、隣接する炭素原子が
第１、第２ヒドロキシル基を有する炭素鎖の切断が生ず
る。ＧＰＩＲ中の環状オーズ（ｏｓｅ＋＋）の場合の如
く、隣接するヒドロキシル基が第２級の場合、酸化によ
り炭素上に２つのアルデヒド基を生じさせ、これらの間
に切断が生ずる。
ところで、抗腫瘍性糖タ／バク質の炭水化物単位が過ヨ
ウ素酸塩イオンで酸化修飾された場合、この糖タンパク
質の生物学的活性が実質的に変化せずに持続するこ、と
が見い出された。
ウ素酸塩イオンで酸化修飾された場合、この糖タンパク
質の生物学的活性が実質的に変化せずに持続するこ、と
が見い出された。
さらにり？ソームを不活性化する糖タンノぐり質の炭水
化物単位が過ヨウ素酸塩イオンで酸化修飾されたとき、
生物学的活性が持続し、生体血流から徐々に解消される
という２重め特徴を有する新規な糖タンパク質が得られ
ることが意外にも見い出された。
化物単位が過ヨウ素酸塩イオンで酸化修飾されたとき、
生物学的活性が持続し、生体血流から徐々に解消される
という２重め特徴を有する新規な糖タンパク質が得られ
ることが意外にも見い出された。
又、生化学的研究の結果、過ヨウ素酸塩でＧＰＩＲを酸
化した場合、反応がＧＰＩＲのオサイド部分に選択的に
起９、ペゾチド部を構成するアミン駿の配列に全く影響
がないことが証明された。
化した場合、反応がＧＰＩＲのオサイド部分に選択的に
起９、ペゾチド部を構成するアミン駿の配列に全く影響
がないことが証明された。
このＩＪ ｆソームな不活性化し、持続性を有する新規
な糖タンパク質を以下、ＧＰＩＲ−Ｌａと称呼する。
な糖タンパク質を以下、ＧＰＩＲ−Ｌａと称呼する。
とのＧＰＩＲ−Ｌａが抗体と結合したとき、このコンシ
ュダート（接合体）は免疫毒性についての生物学的特性
を維持し、血漿における消失が遅２いことが見い出され
た。
ュダート（接合体）は免疫毒性についての生物学的特性
を維持し、血漿における消失が遅２いことが見い出され
た。
したがって、本発明は過ヨウ素酸塩イオンで酸化修飾さ
れた炭水化物単位を有する新規な抗腫瘍性糖タンパク質
を提供するものである。この新規な糖タンパク質は非修
飾糖タンパク質と同様の活性を示し、かつ半減期がより
長い・さらに本発明の新規な糖タンパク質はそのチオー
ル基を、過ヨウ素酸アルカリ金属塩の水溶液で０２〜２
４時間、０〜１５℃の温度、暗所で処理して保護し、必
要によりチオール基の遮断を解除し、公知の方法で最＃
！製品を分離して得ることができる。
れた炭水化物単位を有する新規な抗腫瘍性糖タンパク質
を提供するものである。この新規な糖タンパク質は非修
飾糖タンパク質と同様の活性を示し、かつ半減期がより
長い・さらに本発明の新規な糖タンパク質はそのチオー
ル基を、過ヨウ素酸アルカリ金属塩の水溶液で０２〜２
４時間、０〜１５℃の温度、暗所で処理して保護し、必
要によりチオール基の遮断を解除し、公知の方法で最＃
！製品を分離して得ることができる。
全ての抗腫瘍性糖タンパク質を公知の方法でその炭水化
物単位を過ヨウ素酸塩イオンで反応させ、修飾させるこ
とができる。
物単位を過ヨウ素酸塩イオンで反応させ、修飾させるこ
とができる。
本発明における全てのＧＰＩＲは極めてわずかな細胞毒
性を示す。なぜならば、これらは細胞に固定されないが
、特定の細胞を認識する抗体と結合したのちは、この抗
体が目標（ターゲット）を認識すると、これらの細胞に
対し大きい細胞毒性“を示すことになる。
性を示す。なぜならば、これらは細胞に固定されないが
、特定の細胞を認識する抗体と結合したのちは、この抗
体が目標（ターゲット）を認識すると、これらの細胞に
対し大きい細胞毒性“を示すことになる。
このＧＰＩＲ出発物質の例としてはリシンＡ鎖、ゲロニ
ン、ＭＯＭからの抽、出物がある。
ン、ＭＯＭからの抽、出物がある。
その他のＧＰＩＲで過ヨウ素酸塩イオンに酸化される出
発物質の例としては以下のものが挙がられる。
発物質の例としては以下のものが挙がられる。
ジアンチン３０ ・・・ジアンサス カルヨフィラ
ス（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）
（Ｄｉａｎｔｈｕｓ Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌ、ｕｓ
）ジアンチン３２ ・・・同 上 アグロスチ／Ａ ・・・ アゲロスチン ギサゴ（Ａ
ｇｒｏｓｔｉｎ Ａ ） （Ａｇｒｏｓｔｅｍ
ｍａ ｇｌｔｈａｇｏ ）アゲロスチンＢ ・・・同
上 アゲロスチンＣ・・・同 上 ＭＣＩ ・・・ヒュラ クレビタンス
（Ｈｕｒａ ｃｒｅｐｔ ｔａｎｓ ）アスパラガスオ
フ身シ・・・アスパラガスオフィシナリスナリス抑止体
（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌ
ｉｓ ）この目的に沿って修飾された遺伝型の細胞によ
り生合成的に製造された同様の物質も有効である。
ス（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）
（Ｄｉａｎｔｈｕｓ Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌ、ｕｓ
）ジアンチン３２ ・・・同 上 アグロスチ／Ａ ・・・ アゲロスチン ギサゴ（Ａ
ｇｒｏｓｔｉｎ Ａ ） （Ａｇｒｏｓｔｅｍ
ｍａ ｇｌｔｈａｇｏ ）アゲロスチンＢ ・・・同
上 アゲロスチンＣ・・・同 上 ＭＣＩ ・・・ヒュラ クレビタンス
（Ｈｕｒａ ｃｒｅｐｔ ｔａｎｓ ）アスパラガスオ
フ身シ・・・アスパラガスオフィシナリスナリス抑止体
（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌ
ｉｓ ）この目的に沿って修飾された遺伝型の細胞によ
り生合成的に製造された同様の物質も有効である。
リ？ソームを不活性化する能力を示す限り上記ＧＰＩＲ
の分画を出発物質として用いることもできる。少なくと
もチオール基の一つが保護された天然リシンのＡ鎖は好
ましい出発物質の一つである。
の分画を出発物質として用いることもできる。少なくと
もチオール基の一つが保護された天然リシンのＡ鎖は好
ましい出発物質の一つである。
リシンのＡ鎖は多糖単位が異なるＡＪ、Ａ２として表わ
される２成分からな・・っている。過ヨウ素酸塩による
酸化はこれらＡ１．Ａ２鎖に対し同様におこなわれ、こ
れら２成分・に同等の薬理効果の向上を与える。
される２成分からな・・っている。過ヨウ素酸塩による
酸化はこれらＡ１．Ａ２鎖に対し同様におこなわれ、こ
れら２成分・に同等の薬理効果の向上を与える。
純粋なリシンＡ鎖の製法については米国特許Ａ ４，３
４０，５３５に記載されている。ゲロニンおよびＭＯＭ
についても公知である。
４０，５３５に記載されている。ゲロニンおよびＭＯＭ
についても公知である。
ＧＰＩＲ出発物質のチオール基の保護はこのチオール基
が抗体と結合されるのに用いられる場合に望ましい。
が抗体と結合されるのに用いられる場合に望ましい。
他の官能基がとの結合に用いられる場合、たとえばチロ
シンのフェノールヒドロキシル基、又はＧＰＩＲのアミ
ノ基又はカル？キシル基が用いられる場合、この保護を
おこなっても、あるいはおこなわなくてもよい。
シンのフェノールヒドロキシル基、又はＧＰＩＲのアミ
ノ基又はカル？キシル基が用いられる場合、この保護を
おこなっても、あるいはおこなわなくてもよい。
ブロッキング（遮断）はＳＨ基をチオール／二値化物置
換又は還元によシ、のちに除去し得る化合物との反応に
よシおこなうことができる。
換又は還元によシ、のちに除去し得る化合物との反応に
よシおこなうことができる。
そのような化合物の例としては２，２′−ジニトロ−５
，５’−ジチオジ安息香酸（ＤＴＮＢ ）、３−（ピリ
ジン−２−イルージスルファニル）ノロピオン酸、又は
ジピリジル−２，２′−ジスルフィド、あるいはジピリ
ジル−４，４′−ジスルフィドである。このような処理
をおこなわない場合は酸化反応の間に遊離チオールが消
失し、その場合これらは全体的に再生できない。過剰の
ブロッキング剤は透析その他の処理により除去−される
。
，５’−ジチオジ安息香酸（ＤＴＮＢ ）、３−（ピリ
ジン−２−イルージスルファニル）ノロピオン酸、又は
ジピリジル−２，２′−ジスルフィド、あるいはジピリ
ジル−４，４′−ジスルフィドである。このような処理
をおこなわない場合は酸化反応の間に遊離チオールが消
失し、その場合これらは全体的に再生できない。過剰の
ブロッキング剤は透析その他の処理により除去−される
。
過ヨウ素酸塩による酸化反応はｐｌ（３〜７、好ましく
は５〜６．５でおこなわれる。この過ヨウ素酸塩は過剰
に用いられる。過ヨウ素酸塩の濃度を酸化される隣位の
ジオールの濃度よシ大きくする。すなわち、細胞毒素サ
グユニット１〜１０ ｗ７ｆｎｌの濃度に対し過ヨウ素
酸ナトリウムｌＯ〜５０ｍＭの濃度が適当である。この
処理は温度Ｏ〜１５℃、好ましくは１〜５℃、暗所にて
０．２〜２４時間でおこなわれる。
は５〜６．５でおこなわれる。この過ヨウ素酸塩は過剰
に用いられる。過ヨウ素酸塩の濃度を酸化される隣位の
ジオールの濃度よシ大きくする。すなわち、細胞毒素サ
グユニット１〜１０ ｗ７ｆｎｌの濃度に対し過ヨウ素
酸ナトリウムｌＯ〜５０ｍＭの濃度が適当である。この
処理は温度Ｏ〜１５℃、好ましくは１〜５℃、暗所にて
０．２〜２４時間でおこなわれる。
反応は残留する過ヨウ素酸塩を消費する反応剤、たとえ
ば過剰のエチレングリコールの添加によシ停止すること
ができ、ついで、副生成物を透析等により除去する。こ
の反応の結果得られた製品は公知の方法によシ分離する
ことができる。
ば過剰のエチレングリコールの添加によシ停止すること
ができ、ついで、副生成物を透析等により除去する。こ
の反応の結果得られた製品は公知の方法によシ分離する
ことができる。
出発物質のチオール基がブロックされた場合、このブロ
ッキング解除はブロックされたチオール基、たとえば２
−メルカノトエタノールを解放させ得る還元剤で反応さ
せておこなうことができ、これによシリボソームを不活
性化し、持続性を有する新規な糖タンノ４り質が得られ
、免疫毒素を与える抗体との結合のために用いられる。
ッキング解除はブロックされたチオール基、たとえば２
−メルカノトエタノールを解放させ得る還元剤で反応さ
せておこなうことができ、これによシリボソームを不活
性化し、持続性を有する新規な糖タンノ４り質が得られ
、免疫毒素を与える抗体との結合のために用いられる。
リシンＡの場合、得られる新規な分子（以下Ａ、−Ｌａ
と記す）は下記の如き特徴を有する。
と記す）は下記の如き特徴を有する。
分子量は天然Ａ鎖と実質的に異るものでない。
ポリアクリルアミド勾配電気泳動で見る限シ、この修飾
処理はこのタンパク質のポリマーを極めて少量生成させ
、゛劣化生成物は生じない。
処理はこのタンパク質のポリマーを極めて少量生成させ
、゛劣化生成物は生じない。
遊離チオール基の割合が１モル当り０．７以上である。
リシンのＡ鎖を抑止するラビット抗体に対する免疫反応
性が天然Ａ鎖の免疫反応性と変らない。
性が天然Ａ鎖の免疫反応性と変らない。
、 非細胞モデルにおけるたんばく質合成に対する抑止
性が天然Ａ鎖の等量によってもたらされるものの６０チ
以上である。
性が天然Ａ鎖の等量によってもたらされるものの６０チ
以上である。
ラビットに０．４ Ｔｌ９Ａ（体重）゛の投与量で静脈
投与したのち２３時間以内のＡ鎖（Ａ−Ｌａ）の血漿に
おける残留率は１０％以上（天然のＡ゛鎖については０
．０１５％）であり５００倍以上の増大を示す。
投与したのち２３時間以内のＡ鎖（Ａ−Ｌａ）の血漿に
おける残留率は１０％以上（天然のＡ゛鎖については０
．０１５％）であり５００倍以上の増大を示す。
ゲロニンの場合も過ヨウ素酸塩で酸化して得た分子は以
下の如き特徴を有す。
下の如き特徴を有す。
分子量は天然のゲロニンのものと実質的に変らない。
天然のゲロニンと変らない抗ゲロニン２ビット抗体に対
する免疫反応性を示す。
する免疫反応性を示す。
ラビットに０．３ｒｒｙ／ｋｇ （体重）の投与を静脈
内投与したのぢ２４時間以内に、この修飾ゲロニンは３
チ以上血漿に残留しく天然ゲロニンの場合０．０１％）
、シたがって２００倍以上の残留率の向上を示した。
内投与したのぢ２４時間以内に、この修飾ゲロニンは３
チ以上血漿に残留しく天然ゲロニンの場合０．０１％）
、シたがって２００倍以上の残留率の向上を示した。
このリボソームを不活性化する糖タンパク質からのコン
、ジ−ゲート又は糖タンノクク質の製造はたとえば米国
特許Ａ ４，３４０，５３５に記載された方法でおこな
うことができる。もし、選ばれた細胞毒素サブユニット
が天然に少なくとも一つのチオールを有し結合に適合し
ているものであれば、この基は活性化二硫化基を有する
抗体又は硫体分画との反応に用いられる。しかし、選ば
れた細胞サブユニットが天然にチオール基を有するもの
でなければ、遊離チオールを有する官能基を少なくとも
一つ、公知の方法でこのサブユニットに導入させること
がでキ、２これにょシ上述の結合が継続される。この官
能基の導入は過ヨウ素酸塩イオンによる酸化工程の前に
おこない、この場合、酸化工程の間にこのチオールラジ
カルをブロッキングしておき、酸化工程後にこのブロク
ヤングを解放するようにしてもよいし、又酸化工程のの
ちにこの導入をおこなってもよい。
、ジ−ゲート又は糖タンノクク質の製造はたとえば米国
特許Ａ ４，３４０，５３５に記載された方法でおこな
うことができる。もし、選ばれた細胞毒素サブユニット
が天然に少なくとも一つのチオールを有し結合に適合し
ているものであれば、この基は活性化二硫化基を有する
抗体又は硫体分画との反応に用いられる。しかし、選ば
れた細胞サブユニットが天然にチオール基を有するもの
でなければ、遊離チオールを有する官能基を少なくとも
一つ、公知の方法でこのサブユニットに導入させること
がでキ、２これにょシ上述の結合が継続される。この官
能基の導入は過ヨウ素酸塩イオンによる酸化工程の前に
おこない、この場合、酸化工程の間にこのチオールラジ
カルをブロッキングしておき、酸化工程後にこのブロク
ヤングを解放するようにしてもよいし、又酸化工程のの
ちにこの導入をおこなってもよい。
このようにして得られる修飾免疫毒素は薬理効果につい
て新規な特徴、すなわち本来の細胞毒性に加えて、血漿
中におけ゛不消失遅延性（持続性）が良好なものとなる
。
て新規な特徴、すなわち本来の細胞毒性に加えて、血漿
中におけ゛不消失遅延性（持続性）が良好なものとなる
。
実施例１
Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ の方法（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌ２１９２（１９６Ｂ））によジ
メチル化反応を０℃で攪拌しながら０．２Ｍホウ酸塩緩
衝液（ｐｉ（＝ｔｏ）中でおこなった。２０１ｎ９のト
リチェート化された（ｔｒ％ｔｌａｔｅｄ）ホウ素化水
素（９，５ｍＣｉ／ｍｍｏｌを含む）をＡ鎖３５ｍ、（
３４省）に加え、さらに６チホルムアルデヒド３５０μ
ノを加えた（３０分間に亘９７０μｌづつ５回）。
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌ２１９２（１９６Ｂ））によジ
メチル化反応を０℃で攪拌しながら０．２Ｍホウ酸塩緩
衝液（ｐｉ（＝ｔｏ）中でおこなった。２０１ｎ９のト
リチェート化された（ｔｒ％ｔｌａｔｅｄ）ホウ素化水
素（９，５ｍＣｉ／ｍｍｏｌを含む）をＡ鎖３５ｍ、（
３４省）に加え、さらに６チホルムアルデヒド３５０μ
ノを加えた（３０分間に亘９７０μｌづつ５回）。
過剰の添加物質を１２５ ｍＭ リン酸塩緩衝剤（ｐｌ
−１７）を用いて連続的に透析除去己た（４０１を３０
０ ＊／時間の割合で）、透析後、タンノ４り質溶液を
遠心分離し、ヘキサメチル化Ａ鎖（２，６１％省含有）
を３６．５−得た◇２） Ｎ−エチルマレイミドを用
いたブロクヤングへキザメチル化Ａ鎖の天然ＳＨ基をＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌ １．５４１ （１９６７）に記
載の方法でブロッキングした。すなわち、前の工程で得
たリシンＡ鎖を２０モル等量のＮ−エチルマレイミド（
Ａ鎖１モル当り）の存在下で３０℃で２時間培養した。
−１７）を用いて連続的に透析除去己た（４０１を３０
０ ＊／時間の割合で）、透析後、タンノ４り質溶液を
遠心分離し、ヘキサメチル化Ａ鎖（２，６１％省含有）
を３６．５−得た◇２） Ｎ−エチルマレイミドを用
いたブロクヤングへキザメチル化Ａ鎖の天然ＳＨ基をＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌ １．５４１ （１９６７）に記
載の方法でブロッキングした。すなわち、前の工程で得
たリシンＡ鎖を２０モル等量のＮ−エチルマレイミド（
Ａ鎖１モル当り）の存在下で３０℃で２時間培養した。
ついでｐ）１７０１２５ ｍＭ リン酸塩緩衝液を用い
て連続的に透析して過剰の添加物質を除去した。この操
作を５００ｆｎ！、７時間の割合で２０時間繰り返した
。この濃縮ののち７簀−の割合で含むリシンＡ鎖の溶液
１３−を得、これにはＥＬＬｌｖｌＡＮ試薬で判別し得
るようなチオール基はもはや存在しなかった。このよう
にして得た生成物を以下、ヘキサメチル化Ａ 鎖（ＮＥ
Ｍ）と称呼する。
て連続的に透析して過剰の添加物質を除去した。この操
作を５００ｆｎ！、７時間の割合で２０時間繰り返した
。この濃縮ののち７簀−の割合で含むリシンＡ鎖の溶液
１３−を得、これにはＥＬＬｌｖｌＡＮ試薬で判別し得
るようなチオール基はもはや存在しなかった。このよう
にして得た生成物を以下、ヘキサメチル化Ａ 鎖（ＮＥ
Ｍ）と称呼する。
３）過ヨウ素酸塩による酸化
上述の工程で得九ＮＥＭ溶液６−を０℃、−二４．５で
暗所で４０分間ＮａＺＯ４（］、 ２．８１ｖ）と反応
させ、ついで、この反応をエチレングリコール６００μ
ノを添加することによシ停止させた。
暗所で４０分間ＮａＺＯ４（］、 ２．８１ｖ）と反応
させ、ついで、この反応をエチレングリコール６００μ
ノを添加することによシ停止させた。
ついで、この反応媒体を０．１Ｍの炭酸塩緩衝液（ｐｉ
（＝１０）を用い連続的に透析した（５００ｔｎｔ／’
時間の割合で２０時間）。
（＝１０）を用い連続的に透析した（５００ｔｎｔ／’
時間の割合で２０時間）。
■、非細胞モデルで測定した持続性Ａ鎖の酵素活性
リシンＡ鎖の基本的生物学的特性はりテソームサブユニ
ット６０８の劣化により細胞中でのタンパク質合成を阻
害することでるる。
ット６０８の劣化により細胞中でのタンパク質合成を阻
害することでるる。
試験管による方法において、ラットの肝ぞうの下位細胞
分画で適当に補完したものを用いた。
分画で適当に補完したものを用いた。
これは人工メツセンジャーＲＮＡ １すなわちボリルウ
リディル酸の存在下で Ｃ−フェニルアニリンを組込む
ことができるものである。
リディル酸の存在下で Ｃ−フェニルアニリンを組込む
ことができるものである。
この下位細胞分画の製造および１４Ｃ−７エニルアラニ
ンの組込みの測定はＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＢｉｏｐｈｙ
ａｉｃａ Ａｃｔａ １９７３＋３１２，６０８−６１
５に記載されている方法で、ミクロンーム分画およびラ
ット肝細胞のサイドシル分画を用いておこなった。まず
、とのＡ鎖を含むサンプルを適当に希釈した溶液の形で
、０．２％の２−メチルカプトエタノールおよび１５μ
Ｉ／、−のウシ血清ア□ ルブミンを含む５０ ｍＭ
）リスＨＣ１緩衝、液（ｐｌｉ＝７．６）中に導入し
た。
ンの組込みの測定はＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＢｉｏｐｈｙ
ａｉｃａ Ａｃｔａ １９７３＋３１２，６０８−６１
５に記載されている方法で、ミクロンーム分画およびラ
ット肝細胞のサイドシル分画を用いておこなった。まず
、とのＡ鎖を含むサンプルを適当に希釈した溶液の形で
、０．２％の２−メチルカプトエタノールおよび１５μ
Ｉ／、−のウシ血清ア□ ルブミンを含む５０ ｍＭ
）リスＨＣ１緩衝、液（ｐｌｉ＝７．６）中に導入し
た。
カウン゛トデ〜りを用い１、抑止剤なしの対照媒体との
比較刃、リシンＡ鎖を含む各反応媒体にライてタンノ母
２質中に組込まれる Ｃ−フェニルアラニンの抑止率（
４）を計算した。
比較刃、リシンＡ鎖を含む各反応媒体にライてタンノ母
２質中に組込まれる Ｃ−フェニルアラニンの抑止率（
４）を計算した。
この抑止活性を測定した結果、酸化Ａ鎖についてはＩＣ
５ｏが２．７・ｌ□−１０モル／ｌが認められた。
５ｏが２．７・ｌ□−１０モル／ｌが認められた。
他方、対照Ａ鎖のＩＣ５ｏは１．０３ ・１０−”モル
／Ｊｌであり、したがって、この修飾はＡ鎖の活性損失
に影響を与えていない。
／Ｊｌであり、したがって、この修飾はＡ鎖の活性損失
に影響を与えていない。
寒ＪＪＬλ
この実施例は過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したリシンＡ
鎖を静脈注射した場合の消失の遅延性を証明するため゛
のものである。
鎖を静脈注射した場合の消失の遅延性を証明するため゛
のものである。
リシンＡ鎖を米国特許Ａ ４，３４０，５３５に記載さ
れている方法で製造、精製した。２，２′−ジニトロ−
５，５′−ジチ第２安息香酸（ＤＴＮＢ ）の溶液２０
当量、すなわち、Ｐ）（７の１２５ｍＭＩＪン酸塩緩衝
液に溶かしたＤＴＮＢの０．１Ｍ溶液、３８５μｌ（こ
の溶液は水酸化ナトリウムで声ニアに調節した）を、Ｐ
ＢＳ緩衝液に溶かした５、 ６ ｗ／ｋｌの割合で含む
リシンＡ鎖１０ｍ／溶液に加えた（りん酸塩については
２０ ｍＭ 、 ＮａＣＬについては１５０ｍＭのｐＨ
ニアの緩衝液）。培養は２０℃で２０分間続けた。この
溶液を４℃でＰＢ８緩衝液を用いて透析し、チオール基
をブロッキングし九Ａ鎖を５３■を５−の割合で含む溶
液として得た。
れている方法で製造、精製した。２，２′−ジニトロ−
５，５′−ジチ第２安息香酸（ＤＴＮＢ ）の溶液２０
当量、すなわち、Ｐ）（７の１２５ｍＭＩＪン酸塩緩衝
液に溶かしたＤＴＮＢの０．１Ｍ溶液、３８５μｌ（こ
の溶液は水酸化ナトリウムで声ニアに調節した）を、Ｐ
ＢＳ緩衝液に溶かした５、 ６ ｗ／ｋｌの割合で含む
リシンＡ鎖１０ｍ／溶液に加えた（りん酸塩については
２０ ｍＭ 、 ＮａＣＬについては１５０ｍＭのｐＨ
ニアの緩衝液）。培養は２０℃で２０分間続けた。この
溶液を４℃でＰＢ８緩衝液を用いて透析し、チオール基
をブロッキングし九Ａ鎖を５３■を５−の割合で含む溶
液として得た。
（２） プロ５．キングされたＡ の過ヨウ 塩過
ヨウ素酸ナトリウムの０．５Ｍ水溶液１２０μｌを、１
Ｍ酢酸で声：６に調整した、ブロッキング済みＡ鎖を５
１含む溶液６ｄ中に加えた。
ヨウ素酸ナトリウムの０．５Ｍ水溶液１２０μｌを、１
Ｍ酢酸で声：６に調整した、ブロッキング済みＡ鎖を５
１含む溶液６ｄ中に加えた。
培養は暗所で４℃で１６時間おこなった。酸化反応停止
はエチレングーリコールの１Ｍ水溶液６２０μｌを加え
ることによりおこなった。培養後、２０℃で１５分間、
反応媒体を４℃でＰＢＳ緩衝液で透析した。この過ヨウ
素酸塩による酸化によりタンノ４り質のわずかな析出を
得た。これを３０分間１．１０，０００ ｘ Ｇで遠心
分離し除去し、酸化およびブロッキングされ九Ａ鎖を３
．４ 吟包の濃度で２４．ｒｖ得た。
はエチレングーリコールの１Ｍ水溶液６２０μｌを加え
ることによりおこなった。培養後、２０℃で１５分間、
反応媒体を４℃でＰＢＳ緩衝液で透析した。この過ヨウ
素酸塩による酸化によりタンノ４り質のわずかな析出を
得た。これを３０分間１．１０，０００ ｘ Ｇで遠心
分離し除去し、酸化およびブロッキングされ九Ａ鎖を３
．４ 吟包の濃度で２４．ｒｖ得た。
（３） チオール基のブロッキング
２−メルカプトエタノールを還元剤として最終濃度１％
で酸化、ブロッキング化Ａ鎖（ＰＢＳ緩衝液中に３．４
−含む）６−に加えた。培養を２０℃で１時間お仁ない
、ついでこの溶液を４℃でＰＢＳ緩衝液を用いて透析し
た。その結果酸化され九Ａ鎖を２．８ｗｆＩＬｌの濃度
で１９ダ得た。
で酸化、ブロッキング化Ａ鎖（ＰＢＳ緩衝液中に３．４
−含む）６−に加えた。培養を２０℃で１時間お仁ない
、ついでこの溶液を４℃でＰＢＳ緩衝液を用いて透析し
た。その結果酸化され九Ａ鎖を２．８ｗｆＩＬｌの濃度
で１９ダ得た。
ＤＴＮＢ法（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ＊ １９７２ ＋
２５ ＋ ４５７Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を用
い、この修飾されたＡ鎖が１モル当り０．７０の遊離チ
オール基を有することが判明した。この修飾Ａ鎖の分子
量はドデシルサルフェートの存在下でのポリアクリルア
ミド勾配電気泳動によシ３０，０００±３，０００であ
ることが判明した。、 多糖単位が酸化されたＡ鎖を、タンパク質合成の抑止に
おける酵素活性および薬理学的特性について研究した。
２５ ＋ ４５７Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を用
い、この修飾されたＡ鎖が１モル当り０．７０の遊離チ
オール基を有することが判明した。この修飾Ａ鎖の分子
量はドデシルサルフェートの存在下でのポリアクリルア
ミド勾配電気泳動によシ３０，０００±３，０００であ
ることが判明した。、 多糖単位が酸化されたＡ鎖を、タンパク質合成の抑止に
おける酵素活性および薬理学的特性について研究した。
抑止活性を実施例１の方法で測定した。その結果、酸化
Ａ鎖のＩＣ５ｏは３Ｘ１０”−１０モル／ｌであ゛ ９
、一対照Ａ鎖のＩＣ５ｏは１．２Ｘ１０−１０モル／ｌ
であった。したがって修飾によるＡ鎖の活性損失は認め
られなかった。
Ａ鎖のＩＣ５ｏは３Ｘ１０”−１０モル／ｌであ゛ ９
、一対照Ａ鎖のＩＣ５ｏは１．２Ｘ１０−１０モル／ｌ
であった。したがって修飾によるＡ鎖の活性損失は認め
られなかった。
［Ｉ Ａ Ａ −Ｌａ の
理この人鎖をラビットに耳を介して静脈投与した。こ
のＡ鎖投与量は０．４１５ｗｑＡＸ＆であった。血液サ
ンプルをヘパリン上に間隔をおいて採取した。この血漿
を下記にＲＩＭ−１の記号で示したう。
理この人鎖をラビットに耳を介して静脈投与した。こ
のＡ鎖投与量は０．４１５ｗｑＡＸ＆であった。血液サ
ンプルをヘパリン上に間隔をおいて採取した。この血漿
を下記にＲＩＭ−１の記号で示したう。
ジオイムノアッセイテストで分析した。
この方法はＡ鎖を修飾することなしに判定し得る利点を
有する。この判定をマイクロ滴定プレートを用いておこ
なった。このグレートの蓋体には過吸収剤スＡ’イクが
設けられていて、これがペース中の穴に浸入するように
なっている。
有する。この判定をマイクロ滴定プレートを用いておこ
なった。このグレートの蓋体には過吸収剤スＡ’イクが
設けられていて、これがペース中の穴に浸入するように
なっている。
これらのスパイクは固体相からなるものである。
リシンのＡ鎖を示し、親和性クロマドグ２フイで精製さ
れた雌羊抗体（以下にＡＣｌの記号で示す）をこの固体
指上に吸収させた。この目的のため、ＰＢＳ緩衝液中に
１０μｇ７ｆｎｌ含むＡｃｌの溶液を上記穴に分けて注
入した。上記スパイクを４℃で２４時間、Ａｃｌ溶液と
最初に接触させ、ついで２０℃で３時間、胎児ウシ血清
と接触させ、全ての固定部位を飽和させた。この飽和し
た免疫吸収剤を２０℃、３時間、種々の濃度の血漿サン
プル、又は既知の濃度のＡ鎖溶液と接触させ、目盛曲線
を作成した。ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、この免疫吸収剤を
リシンＡ鎖を示す雌羊抗体（親和クロマトグラフィで精
製し、放射能ラベルを施したもの、以下Ａｃ２と記す）
と２０℃で２時間接触させた。このＡｃ２の放射能２ペ
ルはクロラミンＴの存在下でヨウ素１２５を用い、Ｇｒ
ｅ ｅ ｎｗｏ ｏ ｄおよびＨｕｎｔｅｒの方法（
Ｂｉｏｃｈｅｚｎ 、Ｊ、。
れた雌羊抗体（以下にＡＣｌの記号で示す）をこの固体
指上に吸収させた。この目的のため、ＰＢＳ緩衝液中に
１０μｇ７ｆｎｌ含むＡｃｌの溶液を上記穴に分けて注
入した。上記スパイクを４℃で２４時間、Ａｃｌ溶液と
最初に接触させ、ついで２０℃で３時間、胎児ウシ血清
と接触させ、全ての固定部位を飽和させた。この飽和し
た免疫吸収剤を２０℃、３時間、種々の濃度の血漿サン
プル、又は既知の濃度のＡ鎖溶液と接触させ、目盛曲線
を作成した。ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、この免疫吸収剤を
リシンＡ鎖を示す雌羊抗体（親和クロマトグラフィで精
製し、放射能ラベルを施したもの、以下Ａｃ２と記す）
と２０℃で２時間接触させた。このＡｃ２の放射能２ペ
ルはクロラミンＴの存在下でヨウ素１２５を用い、Ｇｒ
ｅ ｅ ｎｗｏ ｏ ｄおよびＨｕｎｔｅｒの方法（
Ｂｉｏｃｈｅｚｎ 、Ｊ、。
１９６３．８９，１１４）でおこなった。このラベルし
たＡＣｌ抗体は、５〜１０マイクロキー−リー／μｙを
示した。このラベル化Ａｃ２１０ ｃｐｍを２００μノ
として、０．１チツク血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝
液中に導入した。ＰＢＳ緩衝液中で洗浄ののち、上スパ
イクを取りはずし、結合したＡｃ２の量を放射能測定に
より計量した。サンプル中のＡ鎖の濃度は、異なる既知
の濃度でＡ鎖を導入することによって作られた目盛曲縁
に対して参照することにより測定した。持続性Ａ鎖を動
物に注射した際、同じＡ鎖を用い相当する目盛曲線を作
成した。
たＡＣｌ抗体は、５〜１０マイクロキー−リー／μｙを
示した。このラベル化Ａｃ２１０ ｃｐｍを２００μノ
として、０．１チツク血清アルブミンを含むＰＢＳ緩衝
液中に導入した。ＰＢＳ緩衝液中で洗浄ののち、上スパ
イクを取りはずし、結合したＡｃ２の量を放射能測定に
より計量した。サンプル中のＡ鎖の濃度は、異なる既知
の濃度でＡ鎖を導入することによって作られた目盛曲縁
に対して参照することにより測定した。持続性Ａ鎖を動
物に注射した際、同じＡ鎖を用い相当する目盛曲線を作
成した。
この方法で測定された血漿中のＡ鎖の濃度は再現性があ
り、信頼できるものである。この探知しきい値は１ｎｇ
／ｆＲ１！である。各実験間の再現性の検討の結果、変
化関数が１〜２００ｎＩＩ／ｋｌの濃度について１０％
以下であった。
り、信頼できるものである。この探知しきい値は１ｎｇ
／ｆＲ１！である。各実験間の再現性の検討の結果、変
化関数が１〜２００ｎＩＩ／ｋｌの濃度について１０％
以下であった。
これらの実験の結果は曲線で示され、時間は横軸に、零
時の血漿濃度理論値に対する記録された生成物の血漿濃
度のチをｌｏｇスケールで縦軸に、示した。この値、す
なわち、“相対血漿濃度”（ＲＰＣ）は下記の式で計算
される。
時の血漿濃度理論値に対する記録された生成物の血漿濃
度のチをｌｏｇスケールで縦軸に、示した。この値、す
なわち、“相対血漿濃度”（ＲＰＣ）は下記の式で計算
される。
血漿量は動物の体重の１ｋｇ当り３６ゴで考えられてい
る。
る。
第１図は天然リシンＡ鎖を静脈注射した場合の血漿にお
ける消失曲線を時間の関数として示したものである。こ
の曲線（１）は２つの相を示している。第１にこの天然
リシンＡ鎖を注射後３時間で血漿中に残る率はわずか０
．１ ％ （投与量に対して）であり、血液から急激に
消失することを示している。第２の相においてはこの消
失がよシゆるやかである。
ける消失曲線を時間の関数として示したものである。こ
の曲線（１）は２つの相を示している。第１にこの天然
リシンＡ鎖を注射後３時間で血漿中に残る率はわずか０
．１ ％ （投与量に対して）であり、血液から急激に
消失することを示している。第２の相においてはこの消
失がよシゆるやかである。
しかし、多糖単位が酸化されたＡ鎖においては、この消
失性は著るしく改められる。すなわち、Ａ＠製品の大部
分が消失するもととなる第１の消失相は著るしく抑制さ
れ、その結果、Ａ鎖の血漿における残留レベルが著るし
く増大する。注射２０時間後では酸化Ａ鎖の濃度は修飾
されていないＡ鎖（曲線２）の場合の６００倍にもなる
。
失性は著るしく改められる。すなわち、Ａ＠製品の大部
分が消失するもととなる第１の消失相は著るしく抑制さ
れ、その結果、Ａ鎖の血漿における残留レベルが著るし
く増大する。注射２０時間後では酸化Ａ鎖の濃度は修飾
されていないＡ鎖（曲線２）の場合の６００倍にもなる
。
実施例３
この実施例は■Ｍで保護されたＡ鎖の薬物動態学的性質
に対する過ヨウ素酸塩による酸化の効果を検討するもの
である。
に対する過ヨウ素酸塩による酸化の効果を検討するもの
である。
１） ｌシンのＡ の 飾 ・ａ） Ｎ−
エチルマレイミドによる遊離ＳＨの保護リシンのＡ鎖を
ｇ ｑ／ｕｔｌの割合で含有するリシンＡ鎖水溶液４０
１１１７（Ａ鎖４．１マイクロモル）を２′・−メルカ
ゾトエタノールの水溶液で処理してＡ鎖の最終濃度が１
％となるようにした。
エチルマレイミドによる遊離ＳＨの保護リシンのＡ鎖を
ｇ ｑ／ｕｔｌの割合で含有するリシンＡ鎖水溶液４０
１１１７（Ａ鎖４．１マイクロモル）を２′・−メルカ
ゾトエタノールの水溶液で処理してＡ鎖の最終濃度が１
％となるようにした。
この溶液を、１時間放置した後、Ｐ）（７の１２５ｒｒ
Ｍリン酸緩衝液で連続的に透析した。リン酸緩衝液は毎
時３０（１／！（７）ｊ割合で４０時間新しいものと交
換した。エルマン（Ｅｌｌｍａｎ ）の方゛法を用いて
、リシンのＡ鎖１モル当り０． ｇ当量のＳＨが測定さ
れ、た。
Ｍリン酸緩衝液で連続的に透析した。リン酸緩衝液は毎
時３０（１／！（７）ｊ割合で４０時間新しいものと交
換した。エルマン（Ｅｌｌｍａｎ ）の方゛法を用いて
、リシンのＡ鎖１モル当り０． ｇ当量のＳＨが測定さ
れ、た。
このＳＨ基を、メソッズ・イン・エンディモロジー（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ’ｚ、ｙｍｏｌｏｇｙ） ｔ
１１ ｒ ５４１（１９６７）に記載されている方法
によってＮ−エチルマレイミドで保護した。すなわち、
上記工程で得たリシンＡ鎖を、とのＡ鎖１モル当９２０
当量のＮ−エチルマレイミドの存在下に３０℃で２時間
インキ−ベート。過剰の試薬なｐ）ｆ７の１２５１′ｒ
ＩＭリン酸緩衝液で連続的に透析することによって除去
した。その際、リン酸緩衝液は、毎時５００ｄの割合で
２０時間にわたって新しいものと交換した。これにより
、エルマンの試薬で測定し得るチオール基を含まないで
Ａ鎖を濃度７吟舗で含む溶液を得た。こうして得た生成
物を以下Ａ鎖（ＮＥＭ）ということとする。
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ’ｚ、ｙｍｏｌｏｇｙ） ｔ
１１ ｒ ５４１（１９６７）に記載されている方法
によってＮ−エチルマレイミドで保護した。すなわち、
上記工程で得たリシンＡ鎖を、とのＡ鎖１モル当９２０
当量のＮ−エチルマレイミドの存在下に３０℃で２時間
インキ−ベート。過剰の試薬なｐ）ｆ７の１２５１′ｒ
ＩＭリン酸緩衝液で連続的に透析することによって除去
した。その際、リン酸緩衝液は、毎時５００ｄの割合で
２０時間にわたって新しいものと交換した。これにより
、エルマンの試薬で測定し得るチオール基を含まないで
Ａ鎖を濃度７吟舗で含む溶液を得た。こうして得た生成
物を以下Ａ鎖（ＮＥＭ）ということとする。
ｂ）過ヨウ素酸塩によるＡ鎖（ＮＥＭ）の酸化過ヨウ素
酸塩によるＡ鎖（ＮＥＭ）の酸化は実施例２の手法によ
っておこなった。
酸塩によるＡ鎖（ＮＥＭ）の酸化は実施例２の手法によ
っておこなった。
２） ヒされたＡＮＥＭ の
ａ）酸化されたＡ鎖（ＮＥＭ）の酵素活性タンパク合成
に対する阻害活性を実施例１の手法を用いて測定した。
に対する阻害活性を実施例１の手法を用いて測定した。
その結果、酸化されたＡ鎖（ＮＥＭ）の酵素活性は、工
Ｃ５ｏで４．３ Ｘ １０−１０モル／リットルであっ
た。
Ｃ５ｏで４．３ Ｘ １０−１０モル／リットルであっ
た。
ｂ）酸化されｆＣＡ鎖（ＮＥＭ）の薬物動態学的性質酸
化されたまたは酸化されていないＡ鎖（ＮＥＭ）をウサ
ギの耳血管に一回注射した。注射した鎖の量は０．１０
０％’に９に相当するものであった。２３時間後に採取
した血漿を、実施例２に記載した免疫測定法を用いて分
析した。結果を以下の表に記載する。
化されたまたは酸化されていないＡ鎖（ＮＥＭ）をウサ
ギの耳血管に一回注射した。注射した鎖の量は０．１０
０％’に９に相当するものであった。２３時間後に採取
した血漿を、実施例２に記載した免疫測定法を用いて分
析した。結果を以下の表に記載する。
注射してから２３時間経過後、酸化Ａ鎖（ＮＥＭ）の濃
度は、酸化していないＡ鎖（ＮＫＭ）のそれの８００倍
であった。
度は、酸化していないＡ鎖（ＮＫＭ）のそれの８００倍
であった。
実施例４
この実施例は、酸化処理時間が酸化Ａ鎖の薬物動態学的
性質に及ぼす重要性を検討するものである。
性質に及ぼす重要性を検討するものである。
過ヨウ素酸ナトリウムによる処理時間を変えた以外は実
施例２の手法を用いて６種の酸化Ａ鎖の製剤を調製した
。処理時間は次の通りであった。すなわち、０（工゛チ
レングリコールを用いて反応を直ちに停止）、２０分、
４０分、２．５時間、４時間、および１８時間であった
。
施例２の手法を用いて６種の酸化Ａ鎖の製剤を調製した
。処理時間は次の通りであった。すなわち、０（工゛チ
レングリコールを用いて反応を直ちに停止）、２０分、
４０分、２．５時間、４時間、および１８時間であった
。
これら６種の製剤をウサギに注射し、２３時間経過後の
Ａ鎖の血漿中相対濃度を実施例１０手法によシ測定した
。
Ａ鎖の血漿中相対濃度を実施例１０手法によシ測定した
。
結果を第２図に示す。この結果から、１）Ａ鎖の血漿中
濃度の増加は、確かに、過ヨウ素酸塩による酸化に基づ
くこと（反応を直ちに停止したときは、Ａ鎖の血漿中濃
度は生のＡ鎖についてのものと同一であるからである）
、および２）最適の効果を得るためには、反応処理時間
を比較的長くすることが必要であることがわかる。
濃度の増加は、確かに、過ヨウ素酸塩による酸化に基づ
くこと（反応を直ちに停止したときは、Ａ鎖の血漿中濃
度は生のＡ鎖についてのものと同一であるからである）
、および２）最適の効果を得るためには、反応処理時間
を比較的長くすることが必要であることがわかる。
実施例５
この実施例は、酸化処理時間がＮＥＭで保護されたメチ
ル化Ａ＠の薬物動態学的性質に及ぼす重要性を検討する
ものである。
ル化Ａ＠の薬物動態学的性質に及ぼす重要性を検討する
ものである。
１） 化リシンＡ の調製
ａ） Ｎ−エチルマレイミドによるＡ鎖の遊離Ｓ）［
の保護 実施例１０手法を用いて、Ａ鎖の遊離ＳＲをＮ−エチル
マレイミドで保護した。
の保護 実施例１０手法を用いて、Ａ鎖の遊離ＳＲをＮ−エチル
マレイミドで保護した。
ｂ） ａ鎖のメチル化
このメチル化反応は、ミーンズ（Ｍｅａｎｓ）およ。
びフィーニー（Ｆｅｅｎｅ）’ ）の方法（バイオケミ
スト リ ＝ （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ７
ｍ ２１９２＊ １９６８）を用い、Ｐｊ（１０
の０，２Ｍホウ素酸緩衝液中０℃・で攪拌しながらおこ
なった。チリチウム化水素化ホウ素３８ ’？ （４７
ｍＣｔ／ｍＣ上ル含有）をＡ鎖（ＮＥＭ） ６５．５ｍ
１（３ＷＶｆｎｌ）に加え、これに６チホルムアルデヒ
ドヒド１−を２００マイクロリツトルづつ５回に分けて
３０分で添加した。
スト リ ＝ （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ７
ｍ ２１９２＊ １９６８）を用い、Ｐｊ（１０
の０，２Ｍホウ素酸緩衝液中０℃・で攪拌しながらおこ
なった。チリチウム化水素化ホウ素３８ ’？ （４７
ｍＣｔ／ｍＣ上ル含有）をＡ鎖（ＮＥＭ） ６５．５ｍ
１（３ＷＶｆｎｌ）に加え、これに６チホルムアルデヒ
ドヒド１−を２００マイクロリツトルづつ５回に分けて
３０分で添加した。
過剰の試薬を、ｐＨ７の１２５ｎ＋Ｍリン酸緩衝液（４
０ｍ）で断続的に透析することによって除去した。透析
後、タンパク溶液を遠心した。こうして、濃度ψｄのメ
チル化Ａ鎖６３ＷＬｌを得た。
０ｍ）で断続的に透析することによって除去した。透析
後、タンパク溶液を遠心した。こうして、濃度ψｄのメ
チル化Ａ鎖６３ＷＬｌを得た。
ｃ） −ｉｆＭヨウ素酸塩酸塩る酸化過ヨウ素酸ナト
リウムによる処理時間を変えた以外は実施例２０手法を
用いて６種の酸化Ａ鎖の製剤を調製した。処理時間は次
の通りであった。すなわち、Ｏ（エチレングリコールを
用いて反応を直ちに停止）、２０分、４０分、２．５時
間、４時間、および１８時間であった。
リウムによる処理時間を変えた以外は実施例２０手法を
用いて６種の酸化Ａ鎖の製剤を調製した。処理時間は次
の通りであった。すなわち、Ｏ（エチレングリコールを
用いて反応を直ちに停止）、２０分、４０分、２．５時
間、４時間、および１８時間であった。
これら６種の製剤をウサギに注射し、２３時間経過後の
Ａ鎖の血漿中相対濃度を実施例１の手法により測定した
。
Ａ鎖の血漿中相対濃度を実施例１の手法により測定した
。
結果を第３図の曲線２に示す。この結果から、１）メチ
ル化Ａ鎖（ＮＥＭ）の血漿中濃度の増加は、確かに、過
ヨウ素酸塩による酸化に基づくこと（反応を直ちに停止
したときは、メチル化Ａ鎖（ＮＥＭ）の血漿中濃度はこ
の人鎖についてのものと同一であるからである）、およ
び２）最適の効果を得るためには、反応処理時間を比較
的長くすることが必要であることがわかる。
ル化Ａ鎖（ＮＥＭ）の血漿中濃度の増加は、確かに、過
ヨウ素酸塩による酸化に基づくこと（反応を直ちに停止
したときは、メチル化Ａ鎖（ＮＥＭ）の血漿中濃度はこ
の人鎖についてのものと同一であるからである）、およ
び２）最適の効果を得るためには、反応処理時間を比較
的長くすることが必要であることがわかる。
実施例６
本実施例は、Ａ鎖を構成する２つの分子鎖（Ａ１鎖とＡ
２鎖）を別々に酸化した場合、その酸化反応は、リシン
のＡ鎖について実施例２で述べたものと類似の効果を及
はすことを示している。
２鎖）を別々に酸化した場合、その酸化反応は、リシン
のＡ鎖について実施例２で述べたものと類似の効果を及
はすことを示している。
１）Ａ１鎖とＡ２鎖の切断
１０、９１０Ａ鎖を含有する−７．０の１２５ｒｒＭリ
ン酸緩衝液２８ゴ（Ａ鎖は３０９ダ）を、上記緩衝液中
で平衡にあるコンカナバリン（以下、Ｃｏｎ Ａと略す
）１１２−とセファローズの入ったカラムに注いだ。Ａ
ノ＠は同緩衝液で溶出させた時の最初のピークで得られ
、Ａ２鎖はｐｉ（６，０の０．１Ｍホウ酸緩衝液で溶出
された。この緩衝液は塩化ナトリウム水溶液に対して０
．５Ｍ、α−メチルマンノシドに対して０．１Ｍの濃度
にした・この結果Ａ１鎖は１８４１＊ｇ、Ａ２鎖は１０
３〜得られた。Ａ）鎖とＡ２鎖を窒素の加圧下で限外濾
過により濃縮した。Ａ２鎖はｐ）１７．０の１２５ ｍ
Ｍ リン酸緩衝液で透析させた。
ン酸緩衝液２８ゴ（Ａ鎖は３０９ダ）を、上記緩衝液中
で平衡にあるコンカナバリン（以下、Ｃｏｎ Ａと略す
）１１２−とセファローズの入ったカラムに注いだ。Ａ
ノ＠は同緩衝液で溶出させた時の最初のピークで得られ
、Ａ２鎖はｐｉ（６，０の０．１Ｍホウ酸緩衝液で溶出
された。この緩衝液は塩化ナトリウム水溶液に対して０
．５Ｍ、α−メチルマンノシドに対して０．１Ｍの濃度
にした・この結果Ａ１鎖は１８４１＊ｇ、Ａ２鎖は１０
３〜得られた。Ａ）鎖とＡ２鎖を窒素の加圧下で限外濾
過により濃縮した。Ａ２鎖はｐ）１７．０の１２５ ｍ
Ｍ リン酸緩衝液で透析させた。
Ａ鎖を８ＤＳ−アクリルアミドグル電気泳動に分子量３
０，０００のバンドで、薄く染色され九Ａ２０が分子量
３３，０００のバンドだった。
０，０００のバンドで、薄く染色され九Ａ２０が分子量
３３，０００のバンドだった。
２）リシンＡｌ鎖およびＡ２＠の過ヨウ素酸ナトリウム
による修飾 この修飾は実施例２で述べたような効果を及ぼす。ポリ
サッカライドが酸化されたＡ＠のタンパク質合成阻害に
おける酵素活性と薬物動態学的特性を調べた。
による修飾 この修飾は実施例２で述べたような効果を及ぼす。ポリ
サッカライドが酸化されたＡ＠のタンパク質合成阻害に
おける酵素活性と薬物動態学的特性を調べた。
３）無細胞系Ａ１鎖及びＡ２鎖における酵素活性の維持
゛ 阻害作用を実施例１で述べたようにして測定した。ＩＣ
５ｏは酸化されたＡ１鎖およびＡ２鎖に対してそれぞれ
２． Ｉ Ｘ １０−”ｍｏｌ／Ｃ２，Ｉ Ｘ １０−
”ｍｏｌ／Ｊであった。本実施例において比較例としで
用いた生のＡ１鎖および人２鎖のＩＣ５ｏはそれぞれ１
゜９ Ｘ １０ ｍｏ１／ｌ ％ １．ＯＸ １０
ｍｏｌ／／であった。従ってＡ鎖から切断された分子
鎖の修飾はその酵素活性を減じない。
゛ 阻害作用を実施例１で述べたようにして測定した。ＩＣ
５ｏは酸化されたＡ１鎖およびＡ２鎖に対してそれぞれ
２． Ｉ Ｘ １０−”ｍｏｌ／Ｃ２，Ｉ Ｘ １０−
”ｍｏｌ／Ｊであった。本実施例において比較例としで
用いた生のＡ１鎖および人２鎖のＩＣ５ｏはそれぞれ１
゜９ Ｘ １０ ｍｏ１／ｌ ％ １．ＯＸ １０
ｍｏｌ／／であった。従ってＡ鎖から切断された分子
鎖の修飾はその酵素活性を減じない。
４）Ａノ鎖（ＡＪ−Ｌａ）およびＡ２鎖（Ａ２− Ｌａ
）における薬物動態学的特性の維持 ＡＪ若しくは１−Ｌａ鎖またはＡ２若しくはＡＪ −Ｌ
ａ鎖をうさぎの耳の血管から、体重１に９尚たシＡ＠４
１５μｇの割合で、１回注射した。２０時間後に採取し
た血漿サンプルを免疫試験ＲＩＭ−１（実施例２参照）
によって分析した。結果を下表に示す。Ａ鎖及びＡ−Ｉ
４鎖の値を対照的に示す。
）における薬物動態学的特性の維持 ＡＪ若しくは１−Ｌａ鎖またはＡ２若しくはＡＪ −Ｌ
ａ鎖をうさぎの耳の血管から、体重１に９尚たシＡ＠４
１５μｇの割合で、１回注射した。２０時間後に採取し
た血漿サンプルを免疫試験ＲＩＭ−１（実施例２参照）
によって分析した。結果を下表に示す。Ａ鎖及びＡ−Ｉ
４鎖の値を対照的に示す。
投与２０時間後にはＡ Ｉ −Ｌａ鎖およびＡ２− Ｌ
ａ鎖の濃度はＡ１鎖およびＡ２鎖のそれぞれ５００倍、
３５０倍になっている。
ａ鎖の濃度はＡ１鎖およびＡ２鎖のそれぞれ５００倍、
３５０倍になっている。
実施例７
本実施例においてはＡ鎖とこれから切断されたＡノ鎖お
よびＡ２鎖の生および酸化された状態における生化学的
パタメータを示す。
よびＡ２鎖の生および酸化された状態における生化学的
パタメータを示す。
本実施例で用いたＡ鎖は実施例２及び６で説明したよう
にして準備した。
にして準備した。
１）炭水化物部分
これらタンパク質の炭水化物部分は、クランプ（Ｃｌａ
ｍｐ）の方法（糖タンパク質：その構成、構造及び機能
（ゴットシャルク編）、５Ａ巻、第３００−３２１頁）
を用い、ガスクロマトグラフィーによりて定量した。得
られた結果を整理したものを２つの表に示す。
ｍｐ）の方法（糖タンパク質：その構成、構造及び機能
（ゴットシャルク編）、５Ａ巻、第３００−３２１頁）
を用い、ガスクロマトグラフィーによりて定量した。得
られた結果を整理したものを２つの表に示す。
百分率構成
モル構成
（３０，６２５という分子量を基にして、結果は１分子
当りプラスマイナス０．５の残基がある平均値で示した
０） これらの結果は過ヨウ素酸酸化はＡ鎖の糖類の一部を破
壊することを示している。Ａ＠１分子分子当人鎖、Ａ１
鎖及びＡ２鎖のマンノース残差は平均してそれぞれ３．
１７ 、２．１１ 、２．９４残差減少し、７コース残
基はほぼ完全に消失し、キシロース残基は平均してそれ
ぞれ１．２４゜１．００，１．０５残基減少した。Ｎ−
アセチルグルコサミン残基はわずかに減少しただけであ
る。
当りプラスマイナス０．５の残基がある平均値で示した
０） これらの結果は過ヨウ素酸酸化はＡ鎖の糖類の一部を破
壊することを示している。Ａ＠１分子分子当人鎖、Ａ１
鎖及びＡ２鎖のマンノース残差は平均してそれぞれ３．
１７ 、２．１１ 、２．９４残差減少し、７コース残
基はほぼ完全に消失し、キシロース残基は平均してそれ
ぞれ１．２４゜１．００，１．０５残基減少した。Ｎ−
アセチルグルコサミン残基はわずかに減少しただけであ
る。
２） Ｎ末端配列
Ａ鎖とこれから切断されたＡノ鎖およびＡ２鎖の生およ
び酸化状態におけるＮ末端アミノ酸残基金アミノ酸配列
分析装置によって決定した。
び酸化状態におけるＮ末端アミノ酸残基金アミノ酸配列
分析装置によって決定した。
得られた結果を整理して下表に示す。
生状態及び酸化状態のＡ鎖、ＡＪ鎖及びＡ２鎖における
Ｎ末端アミノ°ｒＭ９個の配列は互いにオたＡ鎖のＮ末
端アミノ酸９個の配列は本発明に先立ってフ・ナラ（農
芸生物化学、第４３巻。
Ｎ末端アミノ°ｒＭ９個の配列は互いにオたＡ鎖のＮ末
端アミノ酸９個の配列は本発明に先立ってフ・ナラ（農
芸生物化学、第４３巻。
２２２１頁、１９７９年）によってリシンのＡ鎖につい
て決定されたものと全く同じこともわかる。
て決定されたものと全く同じこともわかる。
３）ＣｏｎＡ／セファロース忙対する親和性ＤＴＮＢ
５．．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）でマス
クされたＡ鎖即ちＡ（ＤＴＮＢ） 、 Ａ（ＤＴＮＢ）
−Ｌｍ。
５．．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）でマス
クされたＡ鎖即ちＡ（ＤＴＮＢ） 、 Ａ（ＤＴＮＢ）
−Ｌｍ。
ＡＪ（ＤＴＮＢ） １ＡＪ（ＤＴＮＢ）−Ｌａ 、 Ａ
２（ＤＴＮＢ）及びＡＪ（ＤＴＮＢ）”Ｌａ鎖のＣｏｎ
Ａ／セフ７ Ｃ１−スに対する親和性ｆｔ調べた。Ａ
鎖を１〜含む溶液ｌゴをＣｏｎＡが１ＩＩｌｌ入りたカ
ラムに注いだ。２８０ｎｍにおける吸Ｑ度を測った後ク
ロマドグ２フイーにかけた。ｐＨ７，０の１２５ｍＭリ
ンｉ！ＩＩ２緩衝液で洗浄しｓ ＣｏｎＡ Ｋよって保
持されなかった最初のピークが基線水準に戻った後、カ
ラムｔ−０，１Ｍトリウム水溶液に対して０．５Ｍ、α
−メチルマンノシドに対して０．１Ｍの嬢度にした。２
８０表にまとめた。
２（ＤＴＮＢ）及びＡＪ（ＤＴＮＢ）”Ｌａ鎖のＣｏｎ
Ａ／セフ７ Ｃ１−スに対する親和性ｆｔ調べた。Ａ
鎖を１〜含む溶液ｌゴをＣｏｎＡが１ＩＩｌｌ入りたカ
ラムに注いだ。２８０ｎｍにおける吸Ｑ度を測った後ク
ロマドグ２フイーにかけた。ｐＨ７，０の１２５ｍＭリ
ンｉ！ＩＩ２緩衝液で洗浄しｓ ＣｏｎＡ Ｋよって保
持されなかった最初のピークが基線水準に戻った後、カ
ラムｔ−０，１Ｍトリウム水溶液に対して０．５Ｍ、α
−メチルマンノシドに対して０．１Ｍの嬢度にした。２
８０表にまとめた。
ＣｏｎＡ＋：！マンノース末端をもった糖メン・やり質
に親和性をもっていることが知られている。
に親和性をもっていることが知られている。
このような残基金もったＡｄはＣ６ｎ Ａと結合する。
これはより多くマンノースでに換されたＡ２鎖において
特にＲ著にわかる。また酸化するとこの親和性が消失す
ることが見い出されるが、これはこの棟の糖質残基、８
通に認められる。
特にＲ著にわかる。また酸化するとこの親和性が消失す
ることが見い出されるが、これはこの棟の糖質残基、８
通に認められる。
」−１
１％
４）モル吸光係数（Ｅ ）の決定
当たりタン・母り質を１ｍ９含む溶液の２８０ｎｍにお
ける吸収係数で、これを用いて標準純度のウシ血清アル
ブミンを使ったＦＯＬＩＮ試験によってタンパク質一度
を決定した・ 結果を下表に要約した。
ける吸収係数で、これを用いて標準純度のウシ血清アル
ブミンを使ったＦＯＬＩＮ試験によってタンパク質一度
を決定した・ 結果を下表に要約した。
分子鎖中のチオール基ＩＤＴＮＢでマスクするとニトロ
ベンゾイル基を生じるため２８０ｎｍにおける吸収が大
きく増加する。酸化後は２８０ｎｍにおける吸収忙大き
な変化は観察されなかった。
ベンゾイル基を生じるため２８０ｎｍにおける吸収が大
きく増加する。酸化後は２８０ｎｍにおける吸収忙大き
な変化は観察されなかった。
これは酸化は２８０ｎｍｉＣおける吸収忙関係するアミ
ノ酸に影Ｉ＃を与えなかったことを示している。
ノ酸に影Ｉ＃を与えなかったことを示している。
５）等電点電気泳動
Ａｄを等電点泳動によって分離するとＰＨ７，ｓないし
８．０の間に等電点バンドを生じ、これはＡｄ、Ａ７鎖
及びＡ２＠のどれも同じであった。
８．０の間に等電点バンドを生じ、これはＡｄ、Ａ７鎖
及びＡ２＠のどれも同じであった。
生状態及び酸化状態のＡ鎖、Ａ１鎖およびＡ２鎖の等電
点を比較したところ、マスクされていない場合はＡ鎖に
特徴的なバンド全てが声で０、５・酸性方向に移動した
。この等電点移動は生状態と酸ｒヒ状態のものが１なる
ことなく起こったので、Ａ鎖の分子は全て酸化によって
影響を受けたと考えられる。
点を比較したところ、マスクされていない場合はＡ鎖に
特徴的なバンド全てが声で０、５・酸性方向に移動した
。この等電点移動は生状態と酸ｒヒ状態のものが１なる
ことなく起こったので、Ａ鎖の分子は全て酸化によって
影響を受けたと考えられる。
実施例８
本実施的においては生のゲロニンを動物に静脈注射した
場合のその急消失と過ヨウ素酸ナトリウムによって変性
させたゲロニンを同様に注射した後のそのゆっくりとし
た消失について説明する。
場合のその急消失と過ヨウ素酸ナトリウムによって変性
させたゲロニンを同様に注射した後のそのゆっくりとし
た消失について説明する。
１）過ヨウ素阪ナトリウムによるゲロニンの修飾
ゲロニンをグロニウムムルチフロールム（Ｇａｌｏｎｉ
ｕｍ ｍｕｌＨｆｌｏｒｕｍ）から生化学ジャーナル。
ｕｍ ｍｕｌＨｆｌｏｒｕｍ）から生化学ジャーナル。
第２５５巻、 ６９４７−６９５３頁、１．９８０年に
述べである方法で抽出し、精製した。実施例２でリシン
Ａ鎖について述べたのと同じ方法で酸化反応を行りた。
述べである方法で抽出し、精製した。実施例２でリシン
Ａ鎖について述べたのと同じ方法で酸化反応を行りた。
しかしチオール基のＤＴＮＨによるマスクは行っていな
い。
い。
実際ゲロニンの天然のチオール基を用いてグロ二′°ン
と抗体をカップリングさせることはあまり行なわれてい
ないので、チオール基は、酸化後、ガン研究（Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ、） ｐ第４４巻、１２９−１３３頁、１
９８４年において説明された技術を用いて人工的に導入
した。過ヨウ素酸ナトリウム０．５Ｍ水溶液２１μｌを
１ｄ゛当たり１〜のゲロニンを含む溶液１ｍにリン酸緩
衝溶液中で加え、１Ｍ酢酸でｐＨを６にした。これを暗
所で１６時間４℃に保った。反応はＩＭエチレングリコ
ール水溶液ｔ−１０５μ！加えて終結させた。
と抗体をカップリングさせることはあまり行なわれてい
ないので、チオール基は、酸化後、ガン研究（Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ、） ｐ第４４巻、１２９−１３３頁、１
９８４年において説明された技術を用いて人工的に導入
した。過ヨウ素酸ナトリウム０．５Ｍ水溶液２１μｌを
１ｄ゛当たり１〜のゲロニンを含む溶液１ｍにリン酸緩
衝溶液中で加え、１Ｍ酢酸でｐＨを６にした。これを暗
所で１６時間４℃に保った。反応はＩＭエチレングリコ
ール水溶液ｔ−１０５μ！加えて終結させた。
これを２０℃で４分間保温した後、反応物を４℃でリン
酸緩衝液中において透析し友。３０分間１０，０００ｘ
、＠で遠心分離にかけると、ζこから一度２．５ ＩＩ
り／ｍｌの酸化ゲロニン２９ダが得られた。
゛ リシンＡ鋲と同じように、ゲロニンの基本的特性はリボ
ソーム゛の６ＯＳサブユニツトの分解によって真核細胞
におけるタンパク質合成を阻害することである（バイオ
ケミカルジャーナル。
酸緩衝液中において透析し友。３０分間１０，０００ｘ
、＠で遠心分離にかけると、ζこから一度２．５ ＩＩ
り／ｍｌの酸化ゲロニン２９ダが得られた。
゛ リシンＡ鋲と同じように、ゲロニンの基本的特性はリボ
ソーム゛の６ＯＳサブユニツトの分解によって真核細胞
におけるタンパク質合成を阻害することである（バイオ
ケミカルジャーナル。
第２０７巻、５０５〜５０９頁、１９８２年９゜り゛ロ
ニンの場合にもＪヨウ素酸酸比による修飾は、活性の損
失を生じさせないことがわかった。
ニンの場合にもＪヨウ素酸酸比による修飾は、活性の損
失を生じさせないことがわかった。
■ り゛ロニンにおける薬物動態学的特性の維持
生の、或いは上述の手続で修飾されたｒ口二）をうさぎ
の耳の血管から一回注射した。投与したゲロニンの量は
０．３ないし０．４ ＩＩＶｋｇでめった。へ・千９ン
の存在下で血液を時々採取した。血漿は以下ＲＩＭ−，
２と略称する放射線免疫試験を用いて分析した。
の耳の血管から一回注射した。投与したゲロニンの量は
０．３ないし０．４ ＩＩＶｋｇでめった。へ・千９ン
の存在下で血液を時々採取した。血漿は以下ＲＩＭ−，
２と略称する放射線免疫試験を用いて分析した。
この試験はＲＩＭ−７試験と同じ技術を用いる。
抗体溶液である。Ａｃ２抗体はＲＩＭ−７試験と同じ抗
体を放射性同位体で標識したものである。同−標本中の
生のゲロニンと修飾したゲロニンの １濃度をそ
れぞれ標本とは異った既知の一度の検量線と比較するこ
とによって決定した。放射標識の技術はＲＩＭ−Ｊで説
明したものと同じである。
体を放射性同位体で標識したものである。同−標本中の
生のゲロニンと修飾したゲロニンの １濃度をそ
れぞれ標本とは異った既知の一度の検量線と比較するこ
とによって決定した。放射標識の技術はＲＩＭ−Ｊで説
明したものと同じである。
ＲＩＭ−２試験はＲＩＭ−Ｊ試験と同等の信頼性と再現
性を示した。本実験の結果は実施例２でリシンのＡ鎖に
ついて示したのと同じ方法で示す。
性を示した。本実験の結果は実施例２でリシンのＡ鎖に
ついて示したのと同じ方法で示す。
図４は生の及び修飾したゲロニンを静脈注射した場合の
血漿中濃度曲ｌ／Ｍを時間の関数として表わしている。
血漿中濃度曲ｌ／Ｍを時間の関数として表わしている。
生のゲロニンは９９．９９％が２４時間で消失したこと
から、生のリシンＡ鎖と同じように血中から非常に急速
に消失することがわかる（曲＃１）。ゲロニンのポリサ
ツカリド単位が酸化されている場合は曲線形が犬きく違
う。投与２４時間後に酸ｆヒしたゲロニンの一度は生の
ゲロニンの３００倍ある（曲線２）。
から、生のリシンＡ鎖と同じように血中から非常に急速
に消失することがわかる（曲＃１）。ゲロニンのポリサ
ツカリド単位が酸化されている場合は曲線形が犬きく違
う。投与２４時間後に酸ｆヒしたゲロニンの一度は生の
ゲロニンの３００倍ある（曲線２）。
従ってこれらの結果はリシン人鎖と同じよう忙、過ヨワ
素酸酸化はゲロニンの消失ｔ−測るのに用いられる糖類
を、°この機能を妨げる程度にまで修飾することを示し
ている。
素酸酸化はゲロニンの消失ｔ−測るのに用いられる糖類
を、°この機能を妨げる程度にまで修飾することを示し
ている。
実施例９
本実施ｐ！Ｉは（１）モモルディ力・カランティア（ｍ
ｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）から抽出した
ＧＰＩＲＭＯＭｔ−動物へ静脈注射した後のその急速な
消失と（２）過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したＧＰＩＲ
ＭＯＭを同じように注射した後のゆっくりとしたの失に
関する。
ｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）から抽出した
ＧＰＩＲＭＯＭｔ−動物へ静脈注射した後のその急速な
消失と（２）過ヨウ素酸ナトリウムで修飾したＧＰＩＲ
ＭＯＭを同じように注射した後のゆっくりとしたの失に
関する。
１） ＧＰＩＲＭＯＭの過ヨウ素酸ナトリウムによる
修飾 ＧＰＩＲＭＯＭｆ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎ
ｔｉａ種子の内生胞子から、バイオケミカルジャーナル （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａυ第１８６巻
、４４３−４５２頁、１９８０年で説明されている方法
で抽出し精製した。生のＭＯＭ及び修飾されたｍＭの薬
物動態学的特性を放射標識したＧＰＩＲＭＯＭを用いて
調べた。ＭＯＭはクロラミンＴの存在下で１２５工を用
いて標識した。放射性 Ｉを１ｍ当り１００μＣｉ含む
溶液１０μ）とクロラミンＴを１ｄ当り２．５〜含む溶
液３０／ｊＡ”ｋ、ＭＯＭをｉｙ当９１ ｍ９含む溶液
１’００μｊにリン酸緩衝溶液中で加えた。反応液を室
温で１分間保った。反応はｌ ｔｎｌ当りメタ重亜硫酸
ナトリウム０．５〜ｔｌ−含む溶液４００μｌを加えて
終結させた。反応物は未反応のヨウ素を放射標識された
タンパク質から分離するために５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５ （７） 力、ｙ Ａ ｔ 用い０、１チのグラチ
ンを含むリン酸緩衝液でｒル濾過した。ｌｏ、ｏ ｏ
ｏ’ ｘ ｇで３０分間遠心分離にかけたところ、濃度
０．０４４〜の放射標識されたＭＯＭが８０μＩ得られ
た。
修飾 ＧＰＩＲＭＯＭｆ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎ
ｔｉａ種子の内生胞子から、バイオケミカルジャーナル （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａυ第１８６巻
、４４３−４５２頁、１９８０年で説明されている方法
で抽出し精製した。生のＭＯＭ及び修飾されたｍＭの薬
物動態学的特性を放射標識したＧＰＩＲＭＯＭを用いて
調べた。ＭＯＭはクロラミンＴの存在下で１２５工を用
いて標識した。放射性 Ｉを１ｍ当り１００μＣｉ含む
溶液１０μ）とクロラミンＴを１ｄ当り２．５〜含む溶
液３０／ｊＡ”ｋ、ＭＯＭをｉｙ当９１ ｍ９含む溶液
１’００μｊにリン酸緩衝溶液中で加えた。反応液を室
温で１分間保った。反応はｌ ｔｎｌ当りメタ重亜硫酸
ナトリウム０．５〜ｔｌ−含む溶液４００μｌを加えて
終結させた。反応物は未反応のヨウ素を放射標識された
タンパク質から分離するために５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２５ （７） 力、ｙ Ａ ｔ 用い０、１チのグラチ
ンを含むリン酸緩衝液でｒル濾過した。ｌｏ、ｏ ｏ
ｏ’ ｘ ｇで３０分間遠心分離にかけたところ、濃度
０．０４４〜の放射標識されたＭＯＭが８０μＩ得られ
た。
酸化反応は実施例２においてリシンのＡ鎖について説明
したのと同じ条件下で行なわれた。
したのと同じ条件下で行なわれた。
但しチオール基をＤＴＮＢでマスクする処理はなく、タ
ンパク質の濃度は１２５倍低く４０μＷで４る。０．５
Ｍ過ヨウ素酸ナトリクラム溶液２０μノを放射標識され
たＭＯＭを（１４当たり） ０．０４〃ジ含む溶液１ｄ
に加え、１Ｍ酢酸で−を６にした。この反応液を暗所で
１６時間４℃に保った。
ンパク質の濃度は１２５倍低く４０μＷで４る。０．５
Ｍ過ヨウ素酸ナトリクラム溶液２０μノを放射標識され
たＭＯＭを（１４当たり） ０．０４〃ジ含む溶液１ｄ
に加え、１Ｍ酢酸で−を６にした。この反応液を暗所で
１６時間４℃に保った。
反応はＩＭエナレングリコール水溶１’ｌｌ（ｔ−１０
０μノ加えて終結させた。°１５分間２０℃に保った後
、反応物を４℃の下にリン酸緩衝液で透析した。１０．
ｏｏｏ、ｘｙで３０分間遠心分離Ｋがけたところ濃度０
．０−２１ ｍｙ７ｆｒｔｌの酸化されｆｃ ＭＯＭ
２５（３２μｇ得られた。
０μノ加えて終結させた。°１５分間２０℃に保った後
、反応物を４℃の下にリン酸緩衝液で透析した。１０．
ｏｏｏ、ｘｙで３０分間遠心分離Ｋがけたところ濃度０
．０−２１ ｍｙ７ｆｒｔｌの酸化されｆｃ ＭＯＭ
２５（３２μｇ得られた。
こうして得られた新しい分子の分子量は生のＭＯＭと実
質的に相違がない。クーマシーブルーで染色し、ポリア
クリルアミド電気泳動にかけテミ７’ｖ １ｉｆｔ ＋
１ テは、修飾処理はごく少量のタンパク質ポリマーを
生じさせるのみで、何らの分解も引き起さなかった。
質的に相違がない。クーマシーブルーで染色し、ポリア
クリルアミド電気泳動にかけテミ７’ｖ １ｉｆｔ ＋
１ テは、修飾処理はごく少量のタンパク質ポリマーを
生じさせるのみで、何らの分解も引き起さなかった。
２） ＭＯＭの薬物動態学的特性の持続放射標識され
たＭＯＭを、前述の手続による酸化の有無を問わず、う
さぎの耳の血管に一回注射した。投与されたＭＯＭの量
は３．５０ないし３．５５μ９Ａ９である。へ・ｆｊ７
ン存在下で時々採血をした。血漿−＋ｍ度２５％のトリ
クロロ酢酸（ＴＣＡ） ２ ’００μｌと一緒に４℃で
３０分間保温した。酸で沈殿させた沈降物中の放射能を
測定した。この分析法によれは、影響を受けなかったＭ
ＯＭ分子の血漿レベルの測定が可能になる。
たＭＯＭを、前述の手続による酸化の有無を問わず、う
さぎの耳の血管に一回注射した。投与されたＭＯＭの量
は３．５０ないし３．５５μ９Ａ９である。へ・ｆｊ７
ン存在下で時々採血をした。血漿−＋ｍ度２５％のトリ
クロロ酢酸（ＴＣＡ） ２ ’００μｌと一緒に４℃で
３０分間保温した。酸で沈殿させた沈降物中の放射能を
測定した。この分析法によれは、影響を受けなかったＭ
ＯＭ分子の血漿レベルの測定が可能になる。
ＴＣＡで沈殿しない低分子の分解生成物は考慮に入れな
かった・これらの実験結果は血中に残存する放射能を初
期量に対する百分率にして時間の関数で表した。この値
は“初期血漿放射能百分率（％ＩＰＲ）と呼ばれ、次式
で算出する。
かった・これらの実験結果は血中に残存する放射能を初
期量に対する百分率にして時間の関数で表した。この値
は“初期血漿放射能百分率（％ＩＰＲ）と呼ばれ、次式
で算出する。
ここでｒは０．２コのプラズマからｔ時間後に検出され
た放射能、凡は投与された全放射能、ｐｖは血漿量（う
さぎの体重１ｋｇ当り３６ａあると考えられている）で
ある。
た放射能、凡は投与された全放射能、ｐｖは血漿量（う
さぎの体重１ｋｇ当り３６ａあると考えられている）で
ある。
図５建示したのは、酸化されたまたは酸化されないＭＯ
Ｍを静脈注射した後の血漿中濃度である。 ＭＯＭは、
海中のＭＯＭの９９，９％が８時間で消失したことから
、生のリシンＡ鎖と同じように、血中から急速に消失す
ることがわかる（曲線１）・ＭＯＭのｉ質残基が酸比さ
れた場合は、濃度の減少速度が低下した（曲線２）。投
与８時間後に酸化されたＭＯＭの濃度は酸化されていな
ｌ、−、ＭＯＭのそれの６０倍になった。従ってこれら
の結果は過ヨＩ７素酸酸化はＭＯＭの短時間消失の原因
である糖類を修飾することを示している。
Ｍを静脈注射した後の血漿中濃度である。 ＭＯＭは、
海中のＭＯＭの９９，９％が８時間で消失したことから
、生のリシンＡ鎖と同じように、血中から急速に消失す
ることがわかる（曲線１）・ＭＯＭのｉ質残基が酸比さ
れた場合は、濃度の減少速度が低下した（曲線２）。投
与８時間後に酸化されたＭＯＭの濃度は酸化されていな
ｌ、−、ＭＯＭのそれの６０倍になった。従ってこれら
の結果は過ヨＩ７素酸酸化はＭＯＭの短時間消失の原因
である糖類を修飾することを示している。
実施例１０
本実施例は（１）ディアントウス・カリオフィルス（Ｉ
Ｈａｎｔｈｕｓ’ｃａｒｙｏｐｈｙＮｕｓ）から抽出し
たＧＲＩＲディアンチンを動物へ静脈注射した後のその
急速な消失と（２）過ヨウ素酸す１１ウムで修飾したＧ
ＲＩＲディアンチンを同じように注射した後のゆっくつ
とした消失に関−子る。 ′１）ディアンチン３
０の過ヨウ素酸ナトリウムによる修飾 ディアンテン３０ ｆ Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏ
ｐｈｙｌｌｕ＠の葉からバイオケミカルジャーナル（Ｂ
ｊ ｏｃｈｅｍｉ−ｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）第１９５
巻、３３９−４０５頁、１９８１年で説明されている方
法で抽出し、精製した。酸化された又は酸化されていな
いディアンチン３０の薬物動態学的特性を放射標識した
ディアンチンを用いて調べた。ヨウ素化及び酸化反応は
実施例９でＭＯＭについて説明したのと同じ条件下で行
りた。
Ｈａｎｔｈｕｓ’ｃａｒｙｏｐｈｙＮｕｓ）から抽出し
たＧＲＩＲディアンチンを動物へ静脈注射した後のその
急速な消失と（２）過ヨウ素酸す１１ウムで修飾したＧ
ＲＩＲディアンチンを同じように注射した後のゆっくつ
とした消失に関−子る。 ′１）ディアンチン３
０の過ヨウ素酸ナトリウムによる修飾 ディアンテン３０ ｆ Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏ
ｐｈｙｌｌｕ＠の葉からバイオケミカルジャーナル（Ｂ
ｊ ｏｃｈｅｍｉ−ｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）第１９５
巻、３３９−４０５頁、１９８１年で説明されている方
法で抽出し、精製した。酸化された又は酸化されていな
いディアンチン３０の薬物動態学的特性を放射標識した
ディアンチンを用いて調べた。ヨウ素化及び酸化反応は
実施例９でＭＯＭについて説明したのと同じ条件下で行
りた。
こうして得られた新しく酸化されたディアンチン分子の
分子蓋は生のディアンテン３ｏと実質的に相違が・ない
。
分子蓋は生のディアンテン３ｏと実質的に相違が・ない
。
２）ディアンチン３０の薬物動態学的特性の持続
放射標識されたディアンチンを前述の手続による酸化の
有無を問わず、うさぎの耳の血管に一回注射した。ディ
アンテンの血漿中濃度は実施例９でＭＯＭについて説明
したのと同じ方法で測定した。図６は酸ｆとされたディ
アンチ／（曲線１）又は酸化されないディアンチン（曲
＃２）の血漿中濃度を時間の関数で表わしたものである
。ディアンチン３０はＭＯＭと同じように初期量の９９
．９％が２時間以内に急速に消失している一方ディアン
チン３０の糖質残基が酸化された場合は、濃度の減少速
度が大きく低下した。
有無を問わず、うさぎの耳の血管に一回注射した。ディ
アンテンの血漿中濃度は実施例９でＭＯＭについて説明
したのと同じ方法で測定した。図６は酸ｆとされたディ
アンチ／（曲線１）又は酸化されないディアンチン（曲
＃２）の血漿中濃度を時間の関数で表わしたものである
。ディアンチン３０はＭＯＭと同じように初期量の９９
．９％が２時間以内に急速に消失している一方ディアン
チン３０の糖質残基が酸化された場合は、濃度の減少速
度が大きく低下した。
投与２時間後に酸「ヒされたディアンチ、ンの濃度は酸
比されていな？ ＭＯＭのそれの８０倍になった。酸化
されたディアンチンの濃度は２４時間たっでもまだ評か
った（初期量の３チ）。
比されていな？ ＭＯＭのそれの８０倍になった。酸化
されたディアンチンの濃度は２４時間たっでもまだ評か
った（初期量の３チ）。
これらの結果も捷た、過ヨウ素酸酸化はディアンテンの
短時間消失の原因である糖質を修飾することを示してい
る。
短時間消失の原因である糖質を修飾することを示してい
る。
実姉例１１
リシンＡ鎖を活性化されたジスルフィド基で置換し人間
のＴ細胞ｆＩ：阻害する抗体と反応させた１包含゛体全
準備する。
のＴ細胞ｆＩ：阻害する抗体と反応させた１包含゛体全
準備する。
ａ）人間のＴ細胞を阻害する抗体（ＴＪ（７Ｊ抗体〕こ
の抗体は免疫学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｍ
ｍｕｎｏｘｏｇｙ）第１２５ （２）巻、７２５−７３
７頁、１９８０年において説明された方法によって準備
した。
の抗体は免疫学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｍ
ｍｕｎｏｘｏｇｙ）第１２５ （２）巻、７２５−７３
７頁、１９８０年において説明された方法によって準備
した。
ｂ）酸ｆヒされたリシンのＡ鎖
リシンのＡ鎖は実施例２で説明した方法によって準備し
た。
た。
Ｉ）人間のＴ細胞を阻害する活性化抗体１−エチル−３
−ツメチルアミノゾロピル−３−カルボジイミドを１ゴ
当り６０，３〜含む溶液２０μｌを３−（ピリジニル−
２−ノスファニル）ゾロピオン酸を１ｄ当り２０〜含む
溶液１００μｌにｔａｒｔ−ブタノール中で加え、混合
物を３分間室温で放置した。こうして得られた溶液６８
μｌを、ｌ−当り抗体８．９ ｍ９を含む溶液２ゴにリ
ン酸緩衝液中で加えた。この混合物を１５分間３０℃で
攪拌し、その後４℃下でリン酸緩衝液において透析し念
。次いでタンパク質溶液を遠心分離し、活性化抗体を７
．９繋ゼの礎度で１５１Ｑ得た。２−メルカプトエタノ
ールとの交換反応によって放出されたピリジン−２−チ
オンの３４３ｎｍＫおける吸収をみると、この抗体は１
ｍｏ１当り３，８個の活性化された混合ジスルフィド基
を有していることがわかった。
−ツメチルアミノゾロピル−３−カルボジイミドを１ゴ
当り６０，３〜含む溶液２０μｌを３−（ピリジニル−
２−ノスファニル）ゾロピオン酸を１ｄ当り２０〜含む
溶液１００μｌにｔａｒｔ−ブタノール中で加え、混合
物を３分間室温で放置した。こうして得られた溶液６８
μｌを、ｌ−当り抗体８．９ ｍ９を含む溶液２ゴにリ
ン酸緩衝液中で加えた。この混合物を１５分間３０℃で
攪拌し、その後４℃下でリン酸緩衝液において透析し念
。次いでタンパク質溶液を遠心分離し、活性化抗体を７
．９繋ゼの礎度で１５１Ｑ得た。２−メルカプトエタノ
ールとの交換反応によって放出されたピリジン−２−チ
オンの３４３ｎｍＫおける吸収をみると、この抗体は１
ｍｏ１当り３，８個の活性化された混合ジスルフィド基
を有していることがわかった。
…）持続作用のあるリシンＡ鎖を官有する免疫毒素の準
備 修飾されたＡ鎖をＩＷＬｌ当り２．８７ダ含む溶液２．
４６７ｄν上述の方法によって得られた活性化抗体の溶
液１．５ ｍ ’ｉ準備しく＃度７．９〜〜：即ち活性
化抗体’ｉ１１．８〜含む）、この混合物を２０℃で２
０時間放置した。この溶液を遠心分離にかけ、セファデ
ックスＧ１００ｔ−用いて濾過し、ＮＪ！！した。溶出
物の光学密度を２’８０ｎｍで測定した。抗体と＾鎖の
両方を含む分画を合わせると免疫毒素を１１ｒＬｌ当り
０．７１Ｑ含む溶液１５ｍ１ （即ち免疫毒素は１０．
５７１１Ｐ）が得られた。こ。
備 修飾されたＡ鎖をＩＷＬｌ当り２．８７ダ含む溶液２．
４６７ｄν上述の方法によって得られた活性化抗体の溶
液１．５ ｍ ’ｉ準備しく＃度７．９〜〜：即ち活性
化抗体’ｉ１１．８〜含む）、この混合物を２０℃で２
０時間放置した。この溶液を遠心分離にかけ、セファデ
ックスＧ１００ｔ−用いて濾過し、ＮＪ！！した。溶出
物の光学密度を２’８０ｎｍで測定した。抗体と＾鎖の
両方を含む分画を合わせると免疫毒素を１１ｒＬｌ当り
０．７１Ｑ含む溶液１５ｍ１ （即ち免疫毒素は１０．
５７１１Ｐ）が得られた。こ。
の溶液は抗体とカップリングされた酸化Ａ鎖をｘｍｌ当
り０．１４ｍ９含有する。
り０．１４ｍ９含有する。
従ってこの方法による平均カップリング度は抗体１ ｍ
ｏｌにつき酸化Ａ鎖１．２ ｍａｌである。
ｏｌにつき酸化Ａ鎖１．２ ｍａｌである。
上記の方法で得た酸化されたリシンＡ鎖を含む免疫１ｍ
ｆｇ ＩＴ（Ａ−Ｉ、ａ ）ＴＩ （ＨＫついて、そ
の薬物動態学的特性と標的細胞に対する細胞毒性を調べ
たＯ 実施例１２ 本実施例においては、持続作用をもつリシンＡ鎖を含む
免疫毒素（ＩＴ（Ａ−Ｌａ）Ｔ７０Ｊと略す〕の血漿中
濃度がゆっくりと減少するという性質を獲得することを
示す・ 体を５さぎの耳の血管に一度注射した。投与された量は
Ａ鎖忙ついて体重１ｋｇ当たり０．４１５■である。＜
Ａ リンの存在下で血液を時々採血した。血漿を放射
線免疫試験（ＲＩＭ−Ｊと略す）によって（２箇所）分
析した。
ｆｇ ＩＴ（Ａ−Ｉ、ａ ）ＴＩ （ＨＫついて、そ
の薬物動態学的特性と標的細胞に対する細胞毒性を調べ
たＯ 実施例１２ 本実施例においては、持続作用をもつリシンＡ鎖を含む
免疫毒素（ＩＴ（Ａ−Ｌａ）Ｔ７０Ｊと略す〕の血漿中
濃度がゆっくりと減少するという性質を獲得することを
示す・ 体を５さぎの耳の血管に一度注射した。投与された量は
Ａ鎖忙ついて体重１ｋｇ当たり０．４１５■である。＜
Ａ リンの存在下で血液を時々採血した。血漿を放射
線免疫試験（ＲＩＭ−Ｊと略す）によって（２箇所）分
析した。
この試験はＲＩＭ−１と同じ技術を用いて行われた。但
しＡｃ２溶液は本試験においてはＲＩＭ−Ｊの技術を用
いてアフィニテ°イークロマトダラフィーによって精製
され、放射標識されたマウスのＩｇＧを阻害するヤギの
抗体である。このサンプル忙おける修飾きれた免疫毒素
の濃度は既知の異った濃度から導いた検ＵＳを用いて決
定した。
しＡｃ２溶液は本試験においてはＲＩＭ−Ｊの技術を用
いてアフィニテ°イークロマトダラフィーによって精製
され、放射標識されたマウスのＩｇＧを阻害するヤギの
抗体である。このサンプル忙おける修飾きれた免疫毒素
の濃度は既知の異った濃度から導いた検ＵＳを用いて決
定した。
ＲＩＭ−３試験はＲＩＭ−Ｊと同じ信頼性及び再現性を
有する。
有する。
比較対照のため、生のリシンＡ鎖を活性化さ試験を行−
た。この泡９体の準備と細動毒性しまフランス国特許出
ａ第２，５１６，７９４号で説明した方法によって行っ
た。これらの実験結果は実施例２でカッノリ゛ングされ
ていないＡ鎖について行ったのと同じ方法で示した。
た。この泡９体の準備と細動毒性しまフランス国特許出
ａ第２，５１６，７９４号で説明した方法によって行っ
た。これらの実験結果は実施例２でカッノリ゛ングされ
ていないＡ鎖について行ったのと同じ方法で示した。
■ 結果
図７は静脈注射されたＩＴＴＪＯＪ及びＩＴ（Ａ−Ｌａ
）１４０倍になっていた。、この事実は酸化されたＡ鎖
の薬物動態学的特性は抗体とカッブリングされた後も保
持されていることを示してｂる。
）１４０倍になっていた。、この事実は酸化されたＡ鎖
の薬物動態学的特性は抗体とカッブリングされた後も保
持されていることを示してｂる。
実施例１３
本実施例においてはＩＴ（Ａ−Ｌａ）ＴＩ（７Ｊの標的
細胞に対する細Ｑ毒素特性の保存について述べる・リン
ンＡ鎖の基本的な生物学的特性は細胞中のタンパク質合
成をり？ンームの６０ＳｔｆＪＬニツトの分解によって
阻害することである。
細胞に対する細Ｑ毒素特性の保存について述べる・リン
ンＡ鎖の基本的な生物学的特性は細胞中のタンパク質合
成をり？ンームの６０ＳｔｆＪＬニツトの分解によって
阻害することである。
この方法は培養中のガン細胞に１４０で標識したロイシ
ン（以下１４ｃｍロイシンをいう）ｆｔ取り込渣せて研
究されている物質の効果を測定する細胞糸を用いる。
ン（以下１４ｃｍロイシンをいう）ｆｔ取り込渣せて研
究されている物質の効果を測定する細胞糸を用いる。
用いられる細胞は、抗原Ｔ６５ ｋ運ぶ人間のＴ白血病
から誘導されるＯＥＭ細胞系に属する。この細胞は目的
の物質の存在下で保温した後、細胞への Ｃ−胃イシン
の取り込みの程度を測定した。この側足には生物化学ジ
ャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｌｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２４９巻１１号、３５５７
−３５６２頁で説明された、タン・母り質合成ｊｌｔ−
測定するのに１４ｃｍロイシンのトレーサーを用する方
法によって行う。取り込まれ九放°射能はろ過した細胞
の全体について測定した。
から誘導されるＯＥＭ細胞系に属する。この細胞は目的
の物質の存在下で保温した後、細胞への Ｃ−胃イシン
の取り込みの程度を測定した。この側足には生物化学ジ
ャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｌｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２４９巻１１号、３５５７
−３５６２頁で説明された、タン・母り質合成ｊｌｔ−
測定するのに１４ｃｍロイシンのトレーサーを用する方
法によって行う。取り込まれ九放°射能はろ過した細胞
の全体について測定した。
定量の基準として線量／効果曲線を描くことができる。
この曲線横軸には目的物質中のＡ鎖のモル濃度、縦軸に
は、タンパク質合成を阻害する物質の存在しない比較細
胞における１４Ｃ−ロイシンの取り込み量に対する百分
率をプロットして得られる。
は、タンパク質合成を阻害する物質の存在しない比較細
胞における１４Ｃ−ロイシンの取り込み量に対する百分
率をプロットして得られる。
こうしてそれぞれの物質について Ｃ−ロイシン取り込
み量を５０％阻害する濃度または５０チ阻害濃度（■Ｃ
３ｏ）を決定することができる。
み量を５０％阻害する濃度または５０チ阻害濃度（■Ｃ
３ｏ）を決定することができる。
図８は恒温媒体中で１０ｍ￥塩化アンモニウムの存在下
でＩＴ（Ａ−Ｌａ）Ｔ７ｏｚとカッブリングされていな
いＡ釧について行った同じ実験から曲線を示している。
でＩＴ（Ａ−Ｌａ）Ｔ７ｏｚとカッブリングされていな
いＡ釧について行った同じ実験から曲線を示している。
この図をみるとＩ’ｌ’（Ａ−Ｌｈ）ＴＩＯＩは同一条
件で測定されたカッ７６リングも酸化されていない人知
に比べ約８万倍の非常に強い細胞毒性（ＩＣ５ｏ＝ ５
．５ ＸＩ Ｏ−”Ｍ） ｆ！：有することがわかる。
件で測定されたカッ７６リングも酸化されていない人知
に比べ約８万倍の非常に強い細胞毒性（ＩＣ５ｏ＝ ５
．５ ＸＩ Ｏ−”Ｍ） ｆ！：有することがわかる。
実施例１４
本実施例はクローン原性試験においで確認含れたＣＥＭ
標的細胞に対するＩＴ（Ａ−ＬＩＬ）ＴＪ ＯｉとＩＴ
ＴＩＯＩ の細胞毒性的効能の比較を示す。免疫毎素は
標的細胞金一つ一つ破壊する作用を担う。
標的細胞に対するＩＴ（Ａ−ＬＩＬ）ＴＪ ＯｉとＩＴ
ＴＩＯＩ の細胞毒性的効能の比較を示す。免疫毎素は
標的細胞金一つ一つ破壊する作用を担う。
この作用は感度の高い技術を用いて測定することができ
る。コロニー形成阻害試験によれば、−個の生存細胞を
数百万の死んだ細胞から見い出せるためこの可能性があ
る。これは人間のＯＥＭリンパ系に応じたｒル媒体にお
ける最適な培ｑｔ、条件によりて可能になる。 ■
コロニー形成阻害試験による細胞毒素の測定技術 りｏ −ニングに用いられる媒体はクトグルタル酸ナト
リウム１ミリｍｏｌ、オキサロ酢酸ナトリウム１ミリｍ
ｏｌ、５チの不活性仔ウシ血清及び１０％の不活性ウマ
血清が加えられたＲＰＭ１１６４０である。最初に０．
３％の寒天溶液（アガロースＶＭ型、シダーｒ’ （Ｓ
ＩＧＭＡ）研究／Ｔｌ１）をペトリ皿のこの媒体中に
薄層のようにして用意し。
る。コロニー形成阻害試験によれば、−個の生存細胞を
数百万の死んだ細胞から見い出せるためこの可能性があ
る。これは人間のＯＥＭリンパ系に応じたｒル媒体にお
ける最適な培ｑｔ、条件によりて可能になる。 ■
コロニー形成阻害試験による細胞毒素の測定技術 りｏ −ニングに用いられる媒体はクトグルタル酸ナト
リウム１ミリｍｏｌ、オキサロ酢酸ナトリウム１ミリｍ
ｏｌ、５チの不活性仔ウシ血清及び１０％の不活性ウマ
血清が加えられたＲＰＭ１１６４０である。最初に０．
３％の寒天溶液（アガロースＶＭ型、シダーｒ’ （Ｓ
ＩＧＭＡ）研究／Ｔｌ１）をペトリ皿のこの媒体中に
薄層のようにして用意し。
４℃で凝固させた。、細胞は３７℃に保温した０、２７
５％寒天溶液と混ぜ合せ、それから最初の寒天層上忙流
し込んで凝固させた。これに用いた寒天の濃度は、クロ
ーニングの効率、コロニーの大きさ及び媒体の均一性の
三者を同時に最適化する目的で行った予備試験の結果か
ら定めた。恒温に保ってから１５日後に、自動コロニー
計数器（″アルチック“、ダイナチック社。
５％寒天溶液と混ぜ合せ、それから最初の寒天層上忙流
し込んで凝固させた。これに用いた寒天の濃度は、クロ
ーニングの効率、コロニーの大きさ及び媒体の均一性の
三者を同時に最適化する目的で行った予備試験の結果か
ら定めた。恒温に保ってから１５日後に、自動コロニー
計数器（″アルチック“、ダイナチック社。
米国）を用すてコロニーを計数した。クローニング効率
、Ｂνち免疫毒素処理で生き残った細胞の正確な数を決
定するには、接種された細胞の数を形成されたコロニー
の数の関数として表す検量線をつくることが大切である
。発明者等はこの検量線から得られるクローニング効率
は、細胞を免疫毒素処理した場合よくみられるように、
死んだ細胞が高い割合であっても影響されないととｔｌ
−証明した°。
、Ｂνち免疫毒素処理で生き残った細胞の正確な数を決
定するには、接種された細胞の数を形成されたコロニー
の数の関数として表す検量線をつくることが大切である
。発明者等はこの検量線から得られるクローニング効率
は、細胞を免疫毒素処理した場合よくみられるように、
死んだ細胞が高い割合であっても影響されないととｔｌ
−証明した°。
免疫毒素処理は、１０％の不活性仔ウシ血清と１０ミ’
Ｊｍｏｌの塩化アンモニウムを含むＲＰＭＩノｅ４ｏ媒
体の全量２１／ＩＩＫ対してそれぞれ異りた濃度のＩＴ
（Ａ−Ｌａ ）ＴＪ ＯＪ及びＩＴＴＴａ２Ｏ２免疫毒
素を用い、指数的に成長している細胞を保温することに
よって行う。保温は５チの二酸化炭素を含６雰囲気下で
試験管を水平方向に振ること（ニーープルンスウィック
社”シラトリーＧ−２＃攪拌器を用いて２５００ ｒｐ
ｍのベース）によって３７℃に保った。生存細胞の数が
検量線によって最大感度範囲で測定できるように寒天溶
液と混合する前に、細胞を洗浄し、それぞれ異った希釈
にして準備した。結果は次の関係式を用い・クローニン
グ効率から外挿して生存細胞の絶対数で表した。生存細
胞の絶対数は次式で表わされる。坦、ここでＣは４トリ
皿１皿当りのクローン゛の数、ｄは細胞の希釈因子、Ｅ
は検量線の勾配から求・められたクローニング効率であ
る。それぞれの値は３回の試験結果の平均をとった◎ ■ 結果 図９は塩化アンモニウム１０ミリｍｏｌの存在下におけ
るＣＥＭ細胞に対するＩＴ（Ａ−Ｌａ）ＴＩＯＩ及びＩ
ＴＴＪ（７７免疫毒素の細胞毒性曲線を免疫毒素の濃度
（Ａ鎖のモル濃度）の関数として表している。これら２
つのＳ素の効率は同じオーダーの大きさであることは明
らかである。細胞数減少の度合は両者とも大きいが、こ
れは１０−”Ｍ程度の低い濃度においては残存生存細胞
の割合は初期値に比べて０．００１％のオーダーになっ
てしまうからである。この効果は烏度に特異的である。
Ｊｍｏｌの塩化アンモニウムを含むＲＰＭＩノｅ４ｏ媒
体の全量２１／ＩＩＫ対してそれぞれ異りた濃度のＩＴ
（Ａ−Ｌａ ）ＴＪ ＯＪ及びＩＴＴＴａ２Ｏ２免疫毒
素を用い、指数的に成長している細胞を保温することに
よって行う。保温は５チの二酸化炭素を含６雰囲気下で
試験管を水平方向に振ること（ニーープルンスウィック
社”シラトリーＧ−２＃攪拌器を用いて２５００ ｒｐ
ｍのベース）によって３７℃に保った。生存細胞の数が
検量線によって最大感度範囲で測定できるように寒天溶
液と混合する前に、細胞を洗浄し、それぞれ異った希釈
にして準備した。結果は次の関係式を用い・クローニン
グ効率から外挿して生存細胞の絶対数で表した。生存細
胞の絶対数は次式で表わされる。坦、ここでＣは４トリ
皿１皿当りのクローン゛の数、ｄは細胞の希釈因子、Ｅ
は検量線の勾配から求・められたクローニング効率であ
る。それぞれの値は３回の試験結果の平均をとった◎ ■ 結果 図９は塩化アンモニウム１０ミリｍｏｌの存在下におけ
るＣＥＭ細胞に対するＩＴ（Ａ−Ｌａ）ＴＩＯＩ及びＩ
ＴＴＪ（７７免疫毒素の細胞毒性曲線を免疫毒素の濃度
（Ａ鎖のモル濃度）の関数として表している。これら２
つのＳ素の効率は同じオーダーの大きさであることは明
らかである。細胞数減少の度合は両者とも大きいが、こ
れは１０−”Ｍ程度の低い濃度においては残存生存細胞
の割合は初期値に比べて０．００１％のオーダーになっ
てしまうからである。この効果は烏度に特異的である。
何故ならこれらの濃度においてはカップリングされてい
ないＡ鎖と非特異的な免疫毒素は、これらの細胞に対し
て効果、をもっていないことが証明されたからである。
ないＡ鎖と非特異的な免疫毒素は、これらの細胞に対し
て効果、をもっていないことが証明されたからである。
本実施例によってＩＴ（Ａ−Ｌａ）ＴＪ１７Ｊは従来の
ＩＴ’ｆ１０１と実質的に同一な特異細胞獣性を有°す
ることがわかる。
ＩＴ’ｆ１０１と実質的に同一な特異細胞獣性を有°す
ることがわかる。
実施例１５
リシンの酸化され官能基を導入したＡ鎖（ＮＥＭ）と活
性化されたジスルフィド基で置換した人間のＴ細胞を阻
害する抗体（Ｔ６２抗原に作用する抗体）との抱合体。
性化されたジスルフィド基で置換した人間のＴ細胞を阻
害する抗体（Ｔ６２抗原に作用する抗体）との抱合体。
カップリングは活性化されたジルフィト基とＡ鎖の官能
基を導入された糖質残基の間で起こる。
基を導入された糖質残基の間で起こる。
１）免疫毒素の準備
ａ）官能基を尋人したＡ鎖の準備
Ａ鎖のＳＨ基ｉＮ−エチルマレイミドでマスクし。
次いで実施例３で説明した方法を用いて１８時間かけて
酸化した。
酸化した。
シスタミンとのカップリング
ＰＨ９，！５の炭酸緩衝液で透析した後、タンパク質２
１ ｍｌ当り４．６５ ｍ９含む溶＃１５．２ｄｉ塩酸
シスタミン゛１８ｒｖと共に本５℃で２時間保温した。
１ ｍｌ当り４．６５ ｍ９含む溶＃１５．２ｄｉ塩酸
シスタミン゛１８ｒｖと共に本５℃で２時間保温した。
こ５して保温したものをホウ水素化ナトリウム（Ａ＠１
モルにつき２００等量即ち０．１Ｎ水酸ｆｔｓナトリウ
ム溶液１４に１７．６雫のホウ水素化す、トリウムを含
む溶液１５６μ／）を用い、２５℃で２時間還元した。
モルにつき２００等量即ち０．１Ｎ水酸ｆｔｓナトリウ
ム溶液１４に１７．６雫のホウ水素化す、トリウムを含
む溶液１５６μ／）を用い、２５℃で２時間還元した。
過剰の試薬はＰＨ７のリン酸緩衝液１２５ｒｒＭで連続
透析して除去した。固定したシスタミンのジスルフィド
ブリッジを３０℃で１時間後に濃度５チになるよ５な２
−メルヵグトエタノールで還元し、その後さらにｐＨ７
の１２５ｎ）Ｍｊｌン酸緩衝液で連続透析（毎時３００
ゴで全量２０１）した。透析及び遠心分ａＶ、Ａ鎖１ｍ
ｏ１当り０．２５個のＳＨ基をエルマン法によって定量
した。
透析して除去した。固定したシスタミンのジスルフィド
ブリッジを３０℃で１時間後に濃度５チになるよ５な２
−メルヵグトエタノールで還元し、その後さらにｐＨ７
の１２５ｎ）Ｍｊｌン酸緩衝液で連続透析（毎時３００
ゴで全量２０１）した。透析及び遠心分ａＶ、Ａ鎖１ｍ
ｏ１当り０．２５個のＳＨ基をエルマン法によって定量
した。
ｂ）抗体の準備（実施例１１参照）
Ｃ）カップリング反応
修飾されたリシンＡ鎖の溶液１．５１ｎｌ（Ａ鎖は０．
０５８μｍｏｌ）を前記ｂ）で得られた活性化抗体溶液
２１１μノ（抗体は０．００６μｍｏｌ ）に加えた。
０５８μｍｏｌ）を前記ｂ）で得られた活性化抗体溶液
２１１μノ（抗体は０．００６μｍｏｌ ）に加えた。
この混合物を３０℃で１８時間反応させた。次いでこの
反応物をリン酸緩衝液（リン酸塩１０ｍＭ、塩化ナトリ
ウム１４０ｍＭの割合でｐｋ′１７．４ ）で透析した
口遠心分離後、ポリアクリロアミド電気泳動にかけると
、得られた免疫毒素は平均して抗体１ｍｏ１当りＡ鎖０
．８個のカップリング度を有することがわかった。
反応物をリン酸緩衝液（リン酸塩１０ｍＭ、塩化ナトリ
ウム１４０ｍＭの割合でｐｋ′１７．４ ）で透析した
口遠心分離後、ポリアクリロアミド電気泳動にかけると
、得られた免疫毒素は平均して抗体１ｍｏ１当りＡ鎖０
．８個のカップリング度を有することがわかった。
２）免疫毒素ＩＴ（Ａ（ＮｇＭ）−Ｌａ−システアミン
）ＴＪ ０１の性質 ａ）特異的細胞毒素活性 前述の手続で準備した免疫毒素はＯＥＭ標的細胞に対し
て非常に強力な細胞毒素活性（Ｉｃ５ｏ＝１．２Ｘ１０
、実施ｆＩ１１３で説明した測定法による）を有す
る。
）ＴＪ ０１の性質 ａ）特異的細胞毒素活性 前述の手続で準備した免疫毒素はＯＥＭ標的細胞に対し
て非常に強力な細胞毒素活性（Ｉｃ５ｏ＝１．２Ｘ１０
、実施ｆＩ１１３で説明した測定法による）を有す
る。
ｂ）血漿中濃度の減少
免疫毒素をうさぎの耳の道管に一回注射した。
血漿サンプルは２２時間後忙採取して、ＲＩＡ〜３免疫
検定法〔実施例１２参照〕によって分析した。結果を下
表に示す。ＩＴＪ（１７の値は相対的な値で示しである
。
検定法〔実施例１２参照〕によって分析した。結果を下
表に示す。ＩＴＪ（１７の値は相対的な値で示しである
。
投与２２時間後に、修飾されたＡ鎖を含むＩＴの濃度は
ＩＴＴＪｏ） の３０倍あった。
ＩＴＴＪｏ） の３０倍あった。
実施例１６
メチル化され、酸化され、官能基を導入されたリシンＡ
鎖（ＮＥＭ）と人間のＴ細胞を阻害する抗体（Ｔ６５抗
原に対する抗体）の抱合体。カップリングは活性化され
たジスルフィド基とＡ鎖の修飾された糖質残基の間で起
こる。
鎖（ＮＥＭ）と人間のＴ細胞を阻害する抗体（Ｔ６５抗
原に対する抗体）の抱合体。カップリングは活性化され
たジスルフィド基とＡ鎖の修飾された糖質残基の間で起
こる。
ｌ）免疫毒素の準備
ａ）官能基を導入したＡ鎖の準備
Ａ鎖の８Ｈ基をＮ−エチルマレイミドでマスクし、次い
で実施例５で説明した方法を用いて１８時間かげてメチ
ル化と酸化を行った。
で実施例５で説明した方法を用いて１８時間かげてメチ
ル化と酸化を行った。
ｐＨｇ、 ’５の０．１Ｍ炭酸緩衝液で透析した後、タ
ンパク質を１ ｒｕＡ当り４． ′６−５ ｍｇ含む溶
液１８．５Ｍを塩酸シスνミン３５．６ ｍ９と共に２
５℃で２時間保温した。こうして採湯したものをポウ水
素化ナトリウム（Ａ鎖１モルにつき、２０（１，量即ち
０．１＃７ｋｆＲ比ナトリウム溶液１ゴに１７６６ηの
ホク水素ｆヒナトリウムを含む溶液３９５μｌ）を用い
２５℃で２時間還元した。
ンパク質を１ ｒｕＡ当り４． ′６−５ ｍｇ含む溶
液１８．５Ｍを塩酸シスνミン３５．６ ｍ９と共に２
５℃で２時間保温した。こうして採湯したものをポウ水
素化ナトリウム（Ａ鎖１モルにつき、２０（１，量即ち
０．１＃７ｋｆＲ比ナトリウム溶液１ゴに１７６６ηの
ホク水素ｆヒナトリウムを含む溶液３９５μｌ）を用い
２５℃で２時間還元した。
過剰の試薬はＰＨ７のリン酸Ｍ衝液１２５ｍＭで連続透
析して除去した。固定したシスψミンのジスルフィドブ
リッジを３０Ｃで１時間後に濃度５％になるような２−
メルカプトエタノールで還元し、その後さらＦｃｐＨ７
の１２５ｍＭ！Ｊン酸緩衝液で連続透析（毎時３００プ
で全量２０１）した。透析及び遠心分離後Ａ鎖１ｍ’ｏ
ｌ当り０．３２個のＳＨ基をエルマン法によって定量し
た。
析して除去した。固定したシスψミンのジスルフィドブ
リッジを３０Ｃで１時間後に濃度５％になるような２−
メルカプトエタノールで還元し、その後さらＦｃｐＨ７
の１２５ｍＭ！Ｊン酸緩衝液で連続透析（毎時３００プ
で全量２０１）した。透析及び遠心分離後Ａ鎖１ｍ’ｏ
ｌ当り０．３２個のＳＨ基をエルマン法によって定量し
た。
ｂ）修飾された抗体の準備
エチルアルコール中にＮ−サクシニミディルー３−ビリ
ノニル−２−ジチオゾロビオネート２．１２１ｖを含む
溶液をＴ７θノ抗体を１ｄ当り４．４ダ含む溶液２３，
５ゴ（抗体はｏ、６８μｍｏｌになる）Ｋ加えた。混合
物を３０分間２５℃で攪拌し、次いでＰ［（７の１２５
ｒｒＭＩ）ン酸緩衝液で透析した・その後タン・千り質
溶液を遠心分離Ｋがけ、修飾された抗体を１ｄ当り４．
２Ｉｎ９含む溶液２３．５ｍを得た。
ノニル−２−ジチオゾロビオネート２．１２１ｖを含む
溶液をＴ７θノ抗体を１ｄ当り４．４ダ含む溶液２３，
５ゴ（抗体はｏ、６８μｍｏｌになる）Ｋ加えた。混合
物を３０分間２５℃で攪拌し、次いでＰ［（７の１２５
ｒｒＭＩ）ン酸緩衝液で透析した・その後タン・千り質
溶液を遠心分離Ｋがけ、修飾された抗体を１ｄ当り４．
２Ｉｎ９含む溶液２３．５ｍを得た。
２−メルカプトエタノールとの交換反応によって放出さ
れたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおいて分光分
析した七ころ、得られた抗体は１モル当り３．２個の活
性化された混合ジスルフィド基を有して込ることが・わ
かった。
れたピリジン−２−チオンの３４３ｎｍにおいて分光分
析した七ころ、得られた抗体は１モル当り３．２個の活
性化された混合ジスルフィド基を有して込ることが・わ
かった。
Ｃ）カップリング反応
修飾されたリシンＡ鎖の溶液７゜３ ａＪ （Ａ鎖は０
４２°７５μｍｏｌ ）を前記ｂ）で得られた活性化抗
体溶液７Ｂ’１ｔｔｌ（抗体０．０２２μｍｏｌ ）に
加えた。
４２°７５μｍｏｌ ）を前記ｂ）で得られた活性化抗
体溶液７Ｂ’１ｔｔｌ（抗体０．０２２μｍｏｌ ）に
加えた。
この混合物を３０℃で１８時間反応させた・次いでこの
反応物をリンＨＩＲ緩ＷＪ液（リン、酸塩１０ｍＭ、塩
化ナトリウム１２０＋ｎＭの割合でｐＨ７，４）で透析
した。
反応物をリンＨＩＲ緩ＷＪ液（リン、酸塩１０ｍＭ、塩
化ナトリウム１２０＋ｎＭの割合でｐＨ７，４）で透析
した。
遠心分離後、ポリアクリロアミド電気泳動にかけると得
られた免疫毒素は平均して抗体１ｍｏ１当り酸化されメ
チル化されたＡ鎖（ＮＥＭ）０．８個のカッシリング度
を有することがわかった。
られた免疫毒素は平均して抗体１ｍｏ１当り酸化されメ
チル化されたＡ鎖（ＮＥＭ）０．８個のカッシリング度
を有することがわかった。
上述の方法で得たメチル化され酸化されたリシンＡ鎖（
ＮＥＭ） ｔ−含む免疫毒素の薬物動態学的特性と標的
細胞に対する特異的細胞毒性を調べた。
ＮＥＭ） ｔ−含む免疫毒素の薬物動態学的特性と標的
細胞に対する特異的細胞毒性を調べた。
２） ＩＴ（メチル化Ａ （ＮＥＭ）−Ｌａ−シスタ
アミン）ＴノＯノ免疫毒素の特性 ａ）特異的細胞毒素活性 前述の手瞬で準備した免疫毒素はＣＥＭ標的細胞に対し
て非常に強力な細胞毒素活性（ＩＣ５ｏ＝７Ｘ１０
、実施例１３で説明した測定法による）を有する。
アミン）ＴノＯノ免疫毒素の特性 ａ）特異的細胞毒素活性 前述の手瞬で準備した免疫毒素はＣＥＭ標的細胞に対し
て非常に強力な細胞毒素活性（ＩＣ５ｏ＝７Ｘ１０
、実施例１３で説明した測定法による）を有する。
ｂ〕 血漿中濃度の減少
免疫毒素をうさぎの耳の血管に一回注射した。
血漿サンプルは２２時間後に採取して、 ＲＩＡ−Ｊ免
疫検定法（実施例１２参照）によって分析した。結果を
下表に示す。ｌＴｌ０Ｊの値は相対的な値で示しである
。
疫検定法（実施例１２参照）によって分析した。結果を
下表に示す。ｌＴｌ０Ｊの値は相対的な値で示しである
。
投与２２時間後に、修飾されたＡ鎖を含むＩＴＯａ度ハ
ＩＴＴＪｏｉｃＤ １７．５倍あツタ。
ＩＴＴＪｏｉｃＤ １７．５倍あツタ。
実施例１７
酸化されたＡ鎖の動物の体全体への毒物学的特性（免疫
毒素の毒性は等モルＪｌにおけるＡ鎖と同じオーダーの
大きさである）を調べることは重要である。これはチャ
ールズリノ９−フランスＣＤＪマウスに静脈注射された
酸化Ａ鎖の半数致死量を生のＡ鎖との比較において決定
することによりて行われる。
毒素の毒性は等モルＪｌにおけるＡ鎖と同じオーダーの
大きさである）を調べることは重要である。これはチャ
ールズリノ９−フランスＣＤＪマウスに静脈注射された
酸化Ａ鎖の半数致死量を生のＡ鎖との比較において決定
することによりて行われる。
その結果を下表に示す。
上の結果は酸化されたＡ鎖の毒性は生のＡ鎖より低いこ
とを示している。これはＡ鎖が酸化によって修飾される
とＡ鎖の血漿中濃度は著しく増加するけれども、その毒
性は増加するどころか、反対にかなり減少するこ°とを
意味している。
とを示している。これはＡ鎖が酸化によって修飾される
とＡ鎖の血漿中濃度は著しく増加するけれども、その毒
性は増加するどころか、反対にかなり減少するこ°とを
意味している。
従って修飾された細胞毒性サブユニットを包む免疫毒素
は人間の治療薬として使える。これらの修飾された免疫
毒素は、標的細胞が免疫毒素を準備するのに用いられる
抗体によって識別されるようなガンまたはガンでない病
気の治療に用いられる。最適な投与量と治療時間は問題
の病気にかかった患者とその病気の特質に応じて定めら
れるべきである。
は人間の治療薬として使える。これらの修飾された免疫
毒素は、標的細胞が免疫毒素を準備するのに用いられる
抗体によって識別されるようなガンまたはガンでない病
気の治療に用いられる。最適な投与量と治療時間は問題
の病気にかかった患者とその病気の特質に応じて定めら
れるべきである。
より一般的な言葉でいえば、抛質単位が過ヨウ素イオン
によって修飾され、対応する修飾のない抗腫ｉ糖タレ・
クク質よりも半減期の長ム抗腫瘍糖タンノｆり質は薬と
して有用だということである。
によって修飾され、対応する修飾のない抗腫ｉ糖タレ・
クク質よりも半減期の長ム抗腫瘍糖タンノｆり質は薬と
して有用だということである。
従ってもう一つの特徴によれば、本発明は糖 ゛質単
位が過ヨウ素酸イオンの酸化によって修飾されている抗
腫瘍糖タンパク質が注射好１４シ〈は靜脈注射忙適して
形態になっている抗腫湯薬に関する。
位が過ヨウ素酸イオンの酸化によって修飾されている抗
腫瘍糖タンパク質が注射好１４シ〈は靜脈注射忙適して
形態になっている抗腫湯薬に関する。
第１図ないし第９図は本発明の糖タン・ｆり質の特性を
示す線図である。
示す線図である。
Claims (16)
- （１）糖鎖単位が過ヨウ素酸イオンによる酸化によって
修飾されている、抗腫瘍作用を有する糖タンパク。 - （２）リボソームを不活化する糖タンパクであって、そ
の糖鎖単位が過ヨウ素酸イオンによる酸化によって修飾
されており、リボソームを不活化する未修飾糖タンパク
と実質に同一の活性を有しかつそれよりも長い活性半減
期を有する糖タンパク。 - （３）リボソームを不活化し、延長された作用を有する
糖タンパクであって、当該チオール基が場合に応じて保
護されている糖タンパクの水溶液を過ヨウ素酸アルカリ
金属の水溶液で、光の不存在下に、０℃ないし１５℃の
温度で０．２ないし２４時間処理し、場合に応じてチオ
ール基の保護基を除去し、および得られた生成物を単離
することによって得られた糖タンパク。 - （４）糖タンパクの水溶液がリシンのＡ鎖の水溶液であ
る特許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 - （５）リシンのＡ鎖が感応化されている特許請求の範囲
第３項記載の糖タンパク。 - （６）リシンのＡ鎖がメチル化によって感応化されてい
る特許請求の範囲第５項記載の糖タンパク。 - （７）糖タンパクの水溶液がゲロニンの水溶液である特
許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 - （８）糖タンパクの水溶液がＧＰＩＲ ＭＯＭの水溶液
である特許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 - （９）糖タンパクの水溶液がＧＰＩＲジアンチン３０の
水溶液である特許請求の範囲第３項記載の糖タンパク。 - （１０）糖タンパクの水溶液が、ジアンチン３２、アグ
ロスチンＡ、アグロスチンＢ、ＨＣＩまたはアスパラガ
ス・オフィシナリス由来阻害剤の水溶液である特許請求
の範囲第３項記載の糖タンパク。 - （１１）生のリシンもしくは生のリシンのＡ鎖断片であ
るリシンＡ鎖から、または遺伝型が修飾された細胞によ
って生合成されたリシンＡ鎖もしくはその断片から製造
された特許請求の範囲第４項記載の糖タンパク。 - （１２）少なくとも１つのチオール基が２，２′−ジニ
トロ−５，５′−ジチオジベンゾエートとの反応により
保護されているリシンＡ鎖の水溶液を過ヨウ素酸ナトリ
ウムの水溶液で、光の不存在下に、約４℃の温度で０．
２ないし２４時間処理し、ついで２−メルカプトエタノ
ールで処理し、得られた生成物を単離することによって
得られた特許請求の範囲第１１項記載の糖タンパク。 - （１３）ゲロニンの水溶液を過ヨウ素酸ナトリウムの水
溶液で、光の不存在下に、約４℃の温度で０．２ないし
２４時間処理し、ついで２−メルカプトエタノールで処
理し、得られた生成物を単離することによって得たもの
である特許請求の範囲第７項記載の糖タンパク。 - （１４）未修飾の、抗腫瘍性糖タンパクを過ヨウ素酸イ
オンによる酸化処理に供することを特徴とする抗腫瘍作
用を有する糖タンパクの製造方法。 - （１５）リボソームを不活化し 延長された作用を有す
る糖タンパクの製造方法であって、当該チオール基が場
合に応じて保護されている糖タンパクの水溶液を過ヨウ
素酸アルカリ金属の水溶液で、光の不存在下に、０℃な
いし１５℃の温度で０．２ないし２４時間処理し、場合
に応じてチオール基の保護基を除去し、および得られた
生成物を単離することを特徴とする製造方法。 - （１６）出発糖タンパクが生のリシンもしくは生のリシ
ンのＡ鎖断片であるリシンＡ鎖、または遺伝型が修飾さ
れた細胞によって生合成されたリシンＡ鎖もしくはその
断片である特許請求の範囲第１５項記載の製造方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8409703 | 1984-06-20 | ||
| FR8409703A FR2566271B1 (fr) | 1984-06-20 | 1984-06-20 | Nouveaux conjugues cytotoxiques utilisables en therapeutique et procede d'obtention |
| FR8502067A FR2577137B1 (fr) | 1985-02-13 | 1985-02-13 | Glycoproteines antitumorales, modifiees sur leurs motifs glucidiques |
| FR8502067 | 1985-02-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6112628A true JPS6112628A (ja) | 1986-01-21 |
| JPH0582400B2 JPH0582400B2 (ja) | 1993-11-18 |
Family
ID=26224020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60135217A Granted JPS6112628A (ja) | 1984-06-20 | 1985-06-20 | 抗腫瘍作用を有する糖タンパクおよびその製造方法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0172045B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6112628A (ja) |
| KR (1) | KR930000058B1 (ja) |
| AT (1) | ATE40700T1 (ja) |
| AU (1) | AU593211B2 (ja) |
| CA (1) | CA1248874A (ja) |
| DE (1) | DE3568167D1 (ja) |
| DK (1) | DK166626B1 (ja) |
| ES (1) | ES8605681A1 (ja) |
| GR (1) | GR851497B (ja) |
| IE (1) | IE58514B1 (ja) |
| IL (1) | IL75484A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ212439A (ja) |
| PT (1) | PT80662B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5250532A (en) * | 1991-04-11 | 1993-10-05 | Dowelanco | 3,4,N-trisubstituted-4,5-dihydro-1H-pyrazole-1-carboxamides and their use as insecticides |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2577135B1 (fr) * | 1985-02-13 | 1989-12-15 | Sanofi Sa | Immunotoxines a longue duree d'action comportant un constituant glycopeptidique inactivant les ribosomes modifie sur ses motifs polysaccharidiques |
| IL80973A (en) * | 1985-12-20 | 1992-08-18 | Sanofi Sa | Modified ribosome-inactivating glycoproteins,their preparation,immunotoxins containing them and pharmaceutical compositions containing such immunotoxins |
| FR2602682B1 (fr) * | 1986-08-12 | 1988-12-02 | Sanofi Sa | Immunotoxines a longue duree d'action in vivo comportant une glycoproteine inhibant les ribosomes, modifiee par oxydation des motifs osidiques et formation d'une base de schiff |
| FR2601679B1 (fr) * | 1986-07-15 | 1990-05-25 | Sanofi Sa | Immunotoxines, procede de preparation et compositions pharmaceutiques en contenant |
| DE4106389A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Behringwerke Ag | Fusionsproteine zur prodrug-aktivierung, ihre herstellung und verwendung |
| US6610299B1 (en) | 1989-10-19 | 2003-08-26 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates |
| US7241595B2 (en) | 1989-10-20 | 2007-07-10 | Sanofi-Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates |
| US6475486B1 (en) | 1990-10-18 | 2002-11-05 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates |
| GB9808485D0 (en) * | 1998-04-21 | 1998-06-17 | Univ Cambridge Tech | Improvements relating to immunotherapy |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL47372A (en) * | 1975-05-27 | 1979-10-31 | Yeda Res & Dev | Fab'dimers bound to daunomycin or adriamycin,their preparation and pharmaceutical compositions containing same |
| FR2437213A1 (fr) * | 1978-09-28 | 1980-04-25 | Cm Ind | Produits cytotoxiques formes par liaison covalente de la chaine a de la ricine avec un anticorps et leur procede de preparation |
| JPS5616418A (en) * | 1979-07-20 | 1981-02-17 | Teijin Ltd | Antitumor protein complex and its preparation |
| JPS5843926A (ja) * | 1981-09-08 | 1983-03-14 | Suntory Ltd | 選択性制癌剤 |
-
1985
- 1985-06-09 PT PT80662A patent/PT80662B/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-06-11 IL IL75484A patent/IL75484A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-06-13 CA CA000483940A patent/CA1248874A/en not_active Expired
- 1985-06-13 AU AU43646/85A patent/AU593211B2/en not_active Ceased
- 1985-06-17 NZ NZ212439A patent/NZ212439A/xx unknown
- 1985-06-18 AT AT85401201T patent/ATE40700T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-18 DE DE8585401201T patent/DE3568167D1/de not_active Expired
- 1985-06-18 IE IE151185A patent/IE58514B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-06-18 EP EP85401201A patent/EP0172045B1/fr not_active Expired
- 1985-06-19 GR GR851497A patent/GR851497B/el unknown
- 1985-06-19 KR KR1019850004354A patent/KR930000058B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1985-06-19 ES ES544337A patent/ES8605681A1/es not_active Expired
- 1985-06-19 DK DK277985A patent/DK166626B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-20 JP JP60135217A patent/JPS6112628A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5250532A (en) * | 1991-04-11 | 1993-10-05 | Dowelanco | 3,4,N-trisubstituted-4,5-dihydro-1H-pyrazole-1-carboxamides and their use as insecticides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0172045A1 (fr) | 1986-02-19 |
| ATE40700T1 (de) | 1989-02-15 |
| EP0172045B1 (fr) | 1989-02-08 |
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| PT80662B (en) | 1986-12-09 |
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| DE3568167D1 (en) | 1989-03-16 |
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| NZ212439A (en) | 1989-01-27 |
| PT80662A (en) | 1985-07-01 |
| KR930000058B1 (ko) | 1993-01-06 |
| CA1248874A (en) | 1989-01-17 |
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