JPH0582400B2 - - Google Patents

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JPH0582400B2
JPH0582400B2 JP85135217A JP13521785A JPH0582400B2 JP H0582400 B2 JPH0582400 B2 JP H0582400B2 JP 85135217 A JP85135217 A JP 85135217A JP 13521785 A JP13521785 A JP 13521785A JP H0582400 B2 JPH0582400 B2 JP H0582400B2
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Sanofi SA
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Description

【発明の詳现な説明】
〔技術分野〕 この発明は新芏な抗腫瘍性糖タンパク質グリ
コタンパク質に係わり、特にその炭氎化物単䜍
が過ペり玠酞塩むオンで酞化、修食された糖タン
パク質に関する。 本発明の新芏な糖タンパク質はリボ゜ヌムを䞍
掻性化し、か぀その効胜が持続するこずを特城ず
する。 〔埓来技術の説明〕 このリボ゜ヌムを䞍掻性化する糖タンパク質ず
はリボ゜ヌムを䞍掻性化した真栞现胞䞭でのタン
パク質合成を劚害する巚倧分子のサツカラむド単
䜍を有する党おの物質又はその分画物質を意味
し、それが倩然のもの、又は生合成されたもの
で、现胞の遺䌝型をこの目的のために修食された
ものであ぀おもよく、さらにそのアミノ酞の官胜
基が修食され抗䜓ず容易に結合するようにしたも
のであ぀おもよい。 このリボ゜ヌムを䞍掻性化する糖タンパク質を
以䞋“GPIR”ず蚘号化しお瀺す。 この明现曞においお、過ペり玠酞塩むオンずは
IO4 -むオンを意味し、さらにメタ過ペり玠酞塩
を呌称するこずもある。 このGPIRは抗䜓ずの結合により免疫毒玠を補
造する際の䞭間䜓ずしお特に有甚である。 米囜特蚱No.4340535、フランス特蚱No.2504010お
よびNo.2516794にはコンゞナゲヌトず呌ばれる抗
ガン剀の補造に぀いお開瀺があり、これは重結
合によりリシンの鎖を、砎壊されるべき现胞の
抗原に察する抗䜓又はその分画ず結合するこずに
より埗られるずしおいる。この皮の生成物を本明
现曞においおは䞀般的に免疫毒玠ず呌ぶ。 䞊蚘のリシン鎖を有する免疫毒玠に類䌌する
コンゞナゲヌトで、抗ガン剀ずしお適圓な物質も
知られおおり、これは重結合により抗䜓又は抗
䜓分画物を他のリボ゜ヌム䞍掻性化糖タンパク
質、たずえばゲロニりムマルチフロヌラム
Gelonium multiflorum、Eur.J.Biochem.
1981116447−454Cancer Res.198444
129−133、又はモモルデカカランチア
Momordica charantiaMOMから抜出さ
れた抑止䜓米囜特蚱No.4368149ず結合するこ
ずにより埗られる。 これらのGPIRはリシンの鎖ず䌌た特性を有
し、分子量が20000ないし30000皋床である
Cance Survey1982489−520。 これらの免疫毒玠の现胞毒玠掻性を皮々のアゞ
ナバント物質、たずえばアンモニりム塩、アミ
ン、あるいはカルボキシルむオノフオアたずえ
ばモネンシンおよびニゲリシンで増匷させるこ
ずができるこずも知られおいる。 しかし、免疫毒玠の治療効果は掻性化されおい
るか吊かを問わず、その抗䜓郚分を介しお砎壊さ
れるべき目暙现胞䞊に局圚化し埗る堎合にのみ十
分に効果が発揮されるのである。この免疫毒玠が
この目暙现胞䞊に局圚化し埗るか吊かは免疫毒玠
が血流および现胞倖流䜓内に、掻性化状態で目暙
现胞に到達し埗る時間および察応する抗原に匹適
する十分な濃床を以぀お留り埗るか吊かに䟝存し
おいる。 静脈内泚射埌の免疫毒玠の血挿による陀去機構
が皮々の動物に぀いお倚く研究されおいる。その
結果が生物孊的に掻性な免疫毒玠が泚射埌に急激
に枛少するこずが明らかずなり、たずえばラビツ
トの堎合、二硫化ブリツゞを含む前肢を甚い、リ
シンの鎖をヒトリンパ球の抗原T65に察する
モノクロン抗䜓抗䜓T101ず結合しお合成さ
れた免疫毒玠を甚いたモデルにおいお、泚射盎埌
の免疫毒玠の97が30分以内に消倱し、17時間以
内に99.9が消倱する。 このような免疫毒性の急激な消倱の結果、砎壊
されるべき现胞䞭の目暙抗原の高比率に察し飜和
するような免疫毒性の胜力を十分に持続させるこ
ずができなくなる。この免疫毒玠の血挿䞭での消
倱を盞応する非接合抗䜓ず比范するず、反察に、
血挿䞭の抗䜓は比范的長時間高い割合で保持され
るこずが知られおいる。最高に粟補された免疫毒
玠補剀でも非接合抗䜓が垞にある皋床残留しおい
る。この免疫毒玠ず非接合抗䜓の消倱速床の差に
より、圓初においお、極めお小さい比率であ぀た
抗䜓が数時間の埌に倚数を占めるようになり、次
第に競争により免疫毒玠の目暙に察する固定のた
めの匷力な拮抗䜓ずなる。 免疫毒玠の血挿宿存性を掻性状態で増倧させ目
暙抗原に察する占有時間および皋床を増倧させる
こずは極めお有意矩なこずである。 さらに、攟射胜でラベルしたリシンの鎖を有
する免疫毒玠を動物䞭に特定の目暙を䞎えるこず
なく泚射した生䜓局圚化実隓によれば泚射数分埌
にこの接合䜓は肝ぞうに倚く局圚するこずが分぀
た。これはリシンの鎖を非結合状態で泚射した
堎合も同じ傟向が芋られた。このこずは免疫毒玠
が现胞毒性サブナニツトを介しお肝ぞう䞭に固定
するこずを瀺しおいる。リシンの鎖はマンノヌ
ス残枣および−アセチルグルコヌスアミン残枣
を含むポリオサむド基を有する糖タンパク質であ
り、このマンノヌス残枣のあるものは末端䜍眮に
存圚しおいるこずが知られおいるAgri.Biol.
Chem.197842501。これらのマンノヌス残枣
を有する糖タンパク質を認識し埗るリセプタヌが
肝ぞう䞭に存圚する。これらのリセプタヌクツ
ペヌ现胞に䞻ずしお存圚するにより認識される
糖タンパク質は血流から代謝现胞に固定されるこ
ずにより急速に陀去される。これは特に、β−グ
ルキナロニダヌれおよびリボヌクレアヌれの堎
合に良く蚘録されおいるArch.Biochem.
Biophys.1978188418Advances in
Enzymologyニナヌペヌク、1974Pediat.
Res.197711816。これらの文献によればリ
シンの鎖を有する免疫毒玠の急激な解消は肝ぞ
う现胞、特にクツペヌ现胞でのリシン鎖のマン
ノヌス残枣の認識により説明するこずができる。 他のGPIRに぀いおの血挿䞭での解消機構、た
ずえばゲロニン又はMOMに぀いお、静脈泚射埌
に぀いお研究した結果は、リシンの鎖の堎合ず
同様にGPIRの血挿におけるレベルは急速に枛少
するこずを瀺しおいる。すなわち、ラビツトの堎
合、粟補ゲロニンの泚射埌血流䞭の93が時間
以内に消倱し、24時間以内に99.99が消倱した。 糖タンパク質に含たれるようなオサむド構造を
過ペヌド酞塩むオンで酞化するこずにより、隣接
する炭玠原子が第、第ヒドロキシル基を有す
る炭玠鎖の切断が生ずる。GPIR䞭の環状オヌズ
osesの堎合の劂く、隣接するヒドロキシル基
が第玚の堎合、酞化により炭玠䞊に぀のアル
デヒド基を生じさせ、これらの間に切断が生ず
る。 〔本発明の具䜓的説明〕 ずころで、抗腫瘍性糖タンパク質の炭氎化物単
䜍が過ペり玠酞塩むオンで酞化修食された堎合、
この糖タンパク質の生物孊的掻性が実質的に倉化
せずに持続するこずが芋い出された。 さらにリボ゜ヌムを䞍掻性化する糖タンパク質
の炭氎化物単䜍が過ペり玠酞塩むオンで酞化修食
されたずき、生物孊的掻性が持続し、生䜓血流か
ら埐々に解消されるずいう重の特城を有する新
芏な糖タンパク質が埗られるこずが意倖にも芋い
出された。 又、生化孊的研究の結果、過ペり玠酞塩で
GPIRを酞化した堎合、反応がGPIRのオサむド
郚分に遞択的に起り、ペプチド郚を構成するアミ
ノ酞の配列に党く圱響がないこずが蚌明された。 このリボ゜ヌムを䞍掻性化し、持続性を有する
新芏な糖タンパク質を以䞋、GPIR−Laず呌称す
る。 このGPIR−Laが抗䜓ず結合したずき、このコ
ンゞナゲヌト接合䜓は免疫毒性に぀いおの生
物孊的特性を維持し、血挿における消倱が遅いこ
ずが芋い出された。 したが぀お、本発明は過ペり玠酞塩むオンで酞
化修食された炭氎化物単䜍を有する新芏な抗腫瘍
性糖タンパク質を提䟛するものである。この新芏
な糖タンパク質は非修食糖タンパク質ず同様の掻
性を瀺し、か぀半枛期がより長い。さらに本発明
の新芏な糖タンパク質はそのチオヌル基を、過ペ
り玠酞アルカリ金属塩の氎溶液で0.2〜24時間、
〜15℃の枩床、暗所で凊理しお保護し、必芁に
よりチオヌル基の遮断を解陀し、公知の方法で最
終補品を分離しお埗るこずができる。 党おの抗腫瘍性糖タンパク質を公知の方法でそ
の炭氎化物単䜍を過ペり玠酞塩むオンで反応さ
せ、修食させるこずができる。 本発明における党おのGPIRは極めおわずかな
现胞毒性を瀺す。なぜならば、これらは现胞に固
定されないが、特定の现胞を認識する抗䜓ず結合
したのちは、この抗䜓が目暙タヌゲツトを認
識するず、これらの现胞に察し倧きい现胞毒性を
瀺すこずになる。 このGPIR出発物質の䟋ずしおはリシン鎖、
ゲロニン、MOMからの抜出物がある。 その他のGPIRで過ペり玠酞塩むオンに酞化さ
れる出発物質の䟋ずしおは以䞋のものが挙げられ
る。 ゞアンチン30  ゞアンサス カルペフむラス DianthinDianthus Caryophyllus ゞアンチン32  同䞊 アグロスチン  アグロステマ ギサゎ AgrostinAAgrostemma githago アグロスチン  同䞊 アグロスチン  同䞊 HCI  ヒナラ クレピタンス Hura crepitans アスパラガスオフむシ  アスパラガスオフむ
シナリス ナリス抑止䜓Asparagus officinalis この目的に沿぀お修食された遺䌝型の现胞によ
り生合成的に補造された同様の物質も有効であ
る。 リボ゜ヌムを䞍掻性化する胜力を瀺す限り䞊蚘
GPIRの分画を出発物質ずしお甚いるこずもでき
る。少なくずもチオヌル基の䞀぀が保護された倩
然リシンの鎖は奜たしい出発物質の䞀぀であ
る。 リシンの鎖は倚糖単䜍が異なるA1A2ずし
お衚わされる成分からな぀おいる。過ペり玠酞
塩による酞化はこれらA1A2鎖に察し同様にお
こなわれ、これら成分に同等の薬理効果の向䞊
を䞎える。 玔粋なリシン鎖の補法に぀いおは米囜特蚱No.
4340535に蚘茉されおいる。ゲロニンおよび
MOMに぀いおも公知である。 GPIR出発物質のチオヌル基の保護はこのチオ
ヌル基が抗䜓ず結合されるのに甚いられる堎合に
望たしい。 他の官胜基がこの結合に甚いられる堎合、たず
えばチロシンのプノヌルヒドロキシル基、又は
GPIRのアミノ基又はカルボキシル基が甚いられ
る堎合、この保護をおこな぀おも、あるいはおこ
なわなくおもよい。 ブロツキング遮断はSH基をチオヌル二
硫化物眮換又は還元により、のちに陀去し埗る化
合物ずの反応によりおこなうこずができる。その
ような化合物の䟋ずしおは2′−ゞニトロ−
5′−ゞチオゞ安息銙酞DTNB、−ピリ
ゞン−−むル−ゞスルフアニルプロピオン
酞、又はゞピリゞル−2′−ゞスルフむド、あ
るいはゞピリゞル−4′−ゞスルフむドであ
る。このような凊理をおこなわない堎合は酞化反
応の間に遊離チオヌルが消倱し、その堎合これら
は党䜓的に再生できない。過剰のブロツキング剀
は透析その他の凊理により陀去される。 過ペり玠酞塩による酞化反応はPH〜、奜た
しくは〜6.5でおこなわれる。この過ペり玠酞
塩は過剰に甚いられる。過ペり玠酞塩の濃床を酞
化される隣䜍のゞオヌルの濃床より倧きくする。
すなわち、现胞毒玠サブナニツト〜10mgmlの
濃床に察し過ペり玠酞ナトリりム10〜50mMの濃
床が適圓である。この凊理は枩床〜15℃、奜た
しくは〜℃、暗所にお0.2〜24時間でおこな
われる。 反応は残留する過ペり玠酞塩を消費する反応
剀、たずえば過剰の゚チレングリコヌルの添加に
より停止するこずができ、぀いで、副生成物を透
析等により陀去する。この反応の結果埗られた補
品は公知の方法により分離するこずができる。 出発物質のチオヌル基がブロツクされた堎合、
このブロツキング解陀はブロツクされたチオヌル
基、たずえば−メルカプト゚タノヌルを解攟さ
せ埗る還元剀で反応させおおこなうこずができ、
これによりリボ゜ヌムを䞍掻性化し、持続性を有
する新芏な糖タンパク質が埗られ、免疫毒玠を䞎
える抗䜓ずの結合のために甚いられる。 リシンの堎合、埗られる新芏な分子以䞋
−Laず蚘すは䞋蚘の劂き特城を有する。 分子量は倩然鎖ず実質的に異るものでない。
ポリアクリルアミド募配電気泳動で芋る限り、こ
の修食凊理はこのタンパク質のポリマヌを極めお
少量生成させ、劣化生成物は生じない。 遊離チオヌル基の割合がモル圓り0.7以䞊で
ある。 リシンの鎖を抑止するラビツト抗䜓に察する
免疫反応性が倩然鎖の免疫反応性ず倉らない。 非现胞モデルにおけるたんぱく質合成に察する
抑止性が倩然鎖の等量によ぀おもたらされるも
のの50以䞊である。 ラビツトに0.4mgKg䜓重の投䞎量で静脈
投䞎したのち23時間以内の鎖−Laの血
挿における残留率は10以䞊倩然の鎖に぀い
おは0.015であり500倍以䞊の増倧を瀺す。 ゲロニンの堎合も過ペり玠酞塩で酞化しお埗た
分子は以䞋の劂き特城を有す。 分子量は倩然のゲロニンのものず実質的に倉ら
ない。 倩然のゲロニンず倉らない抗ゲロニンラビツト
抗䜓に察する免疫反応性を瀺す。 ラビツトに0.3mgKg䜓重の投䞎を静脈内
投䞎したのち24時間以内に、この修食ゲロニンは
以䞊血挿に残留し倩然ゲロニンの堎合0.01
、したが぀お200倍以䞊の残留率の向䞊を瀺し
た。 このリボ゜ヌムを䞍掻性化する糖タンパク質か
らのコンゞナゲヌト又は糖タンパク質の補造はた
ずえば米囜特蚱No.4340535に蚘茉された方法でお
こなうこずができる。もし、遞ばれた现胞毒玠サ
ブナニツトが倩然に少なくずも䞀぀のチオヌルを
有し結合に適合しおいるものであれば、この基は
掻性化二硫化基を有する抗䜓又は抗䜓分画ずの反
応に甚いられる。しかし、遞ばれた现胞サブナニ
ツトが倩然にチオヌル基を有するものでなけれ
ば、遊離チオヌルを有する官胜基を少なくずも䞀
぀、公知の方法でこのサブナニツトに導入させる
こずができ、これにより䞊述の結合が継続され
る。この官胜基の導入は過ペり玠酞塩むオンによ
る酞化工皋の前におこない、この堎合、酞化工皋
の間にこのチオヌルラゞカルをブロツキングしお
おき、酞化工皋埌にこのブロツキングを解攟する
ようにしおもよいし、又酞化工皋ののちにこの導
入をおこな぀おもよい。 このようにしお埗られる修食免疫毒玠は薬理効
果に぀いお新芏な特城、すなわち本来の现胞毒性
に加えお、血挿䞭における消倱遅延性持続性
が良奜なものずなる。 実斜䟋  SH基が−゚チルマレむミドでブロツキング
されたメチル化鎖の酞化。 正しく官胜化されたリシン鎖の補造  鎖のヘキサメチル化 Means and Feeneyの方法Biochemistry
21921968によりメチル化反応を℃で
攪拌しながら0.2Mホり酞塩緩衝液PH10
䞭でおこな぀た。20mgのトリチ゚ヌト化された
tritiatedホり玠化氎玠9.5mCimmolを
含むを鎖35mlmgmlに加え、さらに
ホルムアルデヒド350ÎŒlを加えた30分間
に亘り70ÎŒlづ぀回。 過剰の添加物質を125mMリン酞塩緩衝剀
PHを甚いお連続的に透析陀去した40
を300ml時間の割合で、透析埌、タンパク質
溶液を遠心分離し、ヘキサメチル化鎖2.6
mgml含有を36.5ml埗た。  −゚チルマレむミドを甚いたブロツキング ヘキサメチル化鎖の倩然SH基を
Enzymology115411967に蚘茉の方法でブロ
ツキングした。すなわち、前の工皋で埗たリシ
ン鎖を20モル等量の−゚チルマレむミド
鎖モル圓りの存圚䞋で30℃で時間培
逊した。぀いでPHの125mMリン酞塩緩衝液
を甚いお連続的に透析しお過剰の添加物質を陀
去した。この操䜜を500ml時間の割合で20時
間繰り返した。この濃瞮ののちmgmlの割合
で含むリシン鎖の溶液13mlを埗、これには
ELLMAN詊薬で刀別し埗るようなチオヌル基
はもはや存圚しなか぀た。このようにしお埗た
生成物を以䞋、ヘキサメチル化鎖NEM
ず称呌する。  過ペり玠酞塩による酞化 䞊述の工皋で埗たNEM溶液mlを℃、PH
4.5で暗所で40分間NaIO412.8mgず反応さ
せ、぀いで、この反応を゚チレングリコヌル
600Όを添加するこずにより停止させた。぀
いで、この反応媒䜓を0.1Mの炭酞塩緩衝液
PH10を甚い連続的に透析した。500ml
時間の割合で20時間。 非现胞モデルで枬定した持続性鎖の酵玠掻
性 リシン鎖の基本的生物孊的特性はリボ゜ヌム
サブナニツト60Sの劣化により现胞䞭でのタンパ
ク質合成を阻害するこずである。 詊隓管による方法においお、ラツトの肝ぞうの
䞋䜍现胞分画で適圓に補完したものを甚いた。こ
れは人工メツセンゞダヌRNA、すなわちポリり
リデむル酞の存圚䞋で14C−プニルアニリンを
組蟌むこずができるものである。 この䞋䜍现胞分画の補造および14C−プニル
アラニンの組蟌みの枬定はBiochemica
Biophysica Acta 1973312608−615に蚘茉さ
れおいる方法で、ミクロ゜ヌム分画およびラツト
肝现胞のサむトゟル分画を甚いおおこな぀た。た
ず、この鎖を含むサンプルを適圓に垌釈した溶
液の圢で、0.2の−メチルカプト゚タノヌル
および15ÎŒgmlのりシ血枅アルブミンを含む
50mMトリスHCl緩衝液PH7.6䞭に導入し
た。 カりントデヌタを甚い、抑止剀なしの察照媒䜓
ずの比范で、リシン鎖を含む各反応媒䜓に぀い
おタンパク質䞭に組蟌たれる14C−プニルアラ
ニン抑止率を蚈算した。 この抑止掻性を枬定した結果、酞化鎖に぀い
おはIC50が2.7・10-10モルが認められた。他
方、察照鎖のIC50は1.03・10-10モルであ
り、したが぀お、この修食は鎖の掻性損倱に圱
響を䞎えおいない。 実斜䟋  この実斜䟋は過ペり玠酞ナトリりムで修食した
リシン鎖を静脈泚射した堎合の消倱の遅延性を
蚌明するためのものである。 過ペり玠酞ナトリりムによるリシン鎖の修
食 (1) DTNBを甚いた倩然SHのブロツキング リシン鎖を米囜特蚱No.4340535に蚘茉されお
いる方法で補造、粟補した。2′−ゞニトロ−
5′−ゞチオ安息銙酞DTNBの溶液20圓
量、すなわち、PHの125mMリン酞塩緩衝液に
溶かしたDTNBの0.1M溶液、385Όこの溶液
は氎酞化ナトリりムでPHに調節したを、
PBS緩衝液に溶かした5.6mgmlの割合で含むリ
シン鎖10ml溶液に加えたりん酞塩に぀いおは
20mMNaClに぀いおは150mMのPHの緩衝
液。培逊は20℃で20分間続けた。この溶液を
℃でPBS緩衝液を甚いお透析し、チオヌル基を
ブロツキングした鎖を53mgをmgmlの割合で
含む溶液ずしお埗た。 (2) ブロツキングされた鎖の過ペり玠酞塩に
よる酞化 過ペり玠酞ナトリりムの0.5M氎溶液120Όを、
1M酢酞でPHに調敎したブロツキング枈み
鎖をmgml含む溶液ml䞭に加えた。培逊は暗
所で℃で16時間おこな぀た。酞化反応停止ぱ
チレングリコヌルの1M氎溶液620Όを加えるこ
ずによりおこな぀た。培逊埌、20℃で15分間、反
応媒䜓を℃でPBS緩衝液で透析した。この過
ペり玠酞塩による酞化によりタンパク質のわずか
な析出を埗た。これを30分間、10000×で遠心
分離し陀去し、酞化およびブロツキングされた
鎖を3.4mgmlの濃床で24mg埗た。 (3) チオヌル基のブロツキング解攟 −メルカプト゚タノヌルを還元剀ずしお最終
濃床で酞化、ブロツキング化鎖PBSç·©
衝液䞭に3.4mgml含むmlに加えた。培逊を
20℃で時間おこない。぀いでこの溶液を℃で
PBS緩衝液を甚いお透析した。その結果酞化さ
れた鎖を2.8mgmlの濃床で19mg埗た。 DTNB法Enzymology197225457
Academic Pressを甚い、この修食された鎖
がモル圓り0.70の遊離チオヌル基を有するこず
が刀明した。この修食鎖の分子量はドデシルサ
ルプヌトの存圚䞋でのポリアクリルアミド募配
電気泳動により30000±3000であるこずが刀明し
た。 倚糖単䜍が酞化された鎖を、タンパク質合成
の抑止における酵玠掻性および薬理孊的特性に぀
いお研究した。 持続性鎖の酵玠掻性の非现胞モデルによる
枬定 抑止掻性を実斜䟋の方法で枬定した。その結
果、酞化鎖のIC50は×10-10モルであり、
察照鎖のIC50は1.2×10-10モルであ぀た。
したが぀お修食による鎖の掻性損倱は認められ
なか぀た。 持続性鎖−Laの薬理効果 この鎖をラビツトに耳を介しお静脈投䞎し
た。この鎖投䞎量は0.415mgKgであ぀た。血
液サンプルをヘパリン䞊に間隔をおいお採取し
た。この血挿を䞋蚘にRIM−の蚘号で瀺した
ラゞオむムノアツセむテストで分析した。 この方法は鎖を修食するこずなしに刀定し埗
る利点を有する。この刀定をマむクロ滎定プレヌ
トを甚いおおこな぀た。このプレヌトの蓋䜓には
過吞収剀スパむクが蚭けられおいお、これがベヌ
ス䞭の穎に浞入するようにな぀おいる。これらの
スパむクは固䜓盞からなるものである。リシンの
鎖を瀺し、芪和性クロマトグラフむで粟補され
た雌矊抗䜓以䞋にAc1の蚘号で瀺すをこの固
䜓盞䞊に吞収させた。この目的のため、PBSç·©
衝液䞭に10ÎŒgml含むAc1の溶液を䞊蚘穎に分
けお泚入した。䞊蚘スパむクを℃で24時間、
Ac1溶液ず最初に接觊させ、぀いで20℃で時
間、胎児りシ血枅ず接觊させ、党おの固定郚䜍を
飜和させた。この飜和した免疫吞収剀を20℃、
時間、皮々の濃床の血挿サンプル、又は既知の濃
床の鎖溶液ず接觊させ、目盛曲線を䜜成した。
PBS緩衝液で掗浄埌、この免疫吞収剀をリシン
鎖を瀺す雌矊抗䜓芪和クロマトグラフむで粟
補し、攟射胜ラベルを斜したもの、以䞋Ac2ず蚘
すず20℃で時間接觊させた。このAc2の攟射
胜ラベルはクロラミンの存圚䞋でペり玠125を
甚い、GreenwoodおよびHunterの方法
Biochem.J.196389114でおこな぀た。
このラベルしたAc2抗䜓は〜10マむクロキナヌ
リ−Όgを瀺した。このラベル化Ac2106cpmを
200Όずしお、0.1りシ血枅アルブミンを含む
PBS緩衝液䞭に導入した。PBS緩衝液䞭で掗浄
ののち、䞊スパむクを取りはずし、結合したAc2
の量を攟射胜枬定により蚈量した。サンプル䞭の
鎖の濃床は、異なる既知の濃床で鎖を導入す
るこずによ぀お䜜られた目盛曲線に察しお参照す
るこずにより枬定した。持続性鎖を動物に泚射
した際、同じ鎖を甚い盞圓する目盛曲線を䜜成
した。 この方法で枬定された血挿䞭の鎖の濃床は再
珟性があり、信頌できるものである。この探知し
きい倀は1ngmlである。各実隓間の再珟性の怜
蚎の結果、倉化関数が〜200ngmlの濃床に぀
いお10以䞋であ぀た。 これらの実隓の結果は曲線で瀺され、時間は暪
軞に、零時の血挿濃床理論倀に察する蚘録された
生成物の血挿濃床のをlogスケヌルで瞊軞に瀺
した。この倀、すなわち、“盞察血挿濃床”
RPCは䞋蚘の匏で蚈算される。 RPC時間“”で枬定した濃床泚射量血挿量×1
00 血挿量は動物の䜓重のKg圓り36mlで考えられ
おいる。 第図は倩然リシン鎖を静脈泚射した堎合の
血挿における消倱曲線を時間の関数ずしお瀺した
ものである。この曲線(1)は぀の盞を瀺しおい
る。第にこの倩然リシン鎖を泚射埌時間で
血挿䞭に残る率はわずか0.1投䞎量に察しお
であり、血液から急激に消倱するこずを瀺しおい
る。第の盞においおはこの消倱がよりゆるやか
である。 しかし、倚糖単䜍が酞化された鎖においお
は、この消倱性は著るしく改められる。すなわ
ち、鎖補品の倧郚分が消倱するもずずなる第
の消倱盞は著るしく抑制され、その結果、鎖の
血挿における残留レベルが著るしく増倧する。泚
射20時間埌では酞化鎖の濃床は修食されおいな
い鎖曲線の堎合の600倍にもなる。 実斜䟋  この実斜䟋はNEMで保護された鎖の薬物動
態孊的性質に察する過ペり玠酞塩による酞化の効
果を怜蚎するものである。  リシンの鎖の修食  −゚チルマレむミドによる遊離SHの保護 リシンの鎖をmgmlの割合で含有するリシ
ン鎖氎溶液40ml鎖4.1マむクロモルを
−メルカプト゚タノヌルの氎溶液で凊理しお鎖
の最終濃床がずなるようにした。 この溶液を時間攟眮した埌、PHの125mM
リン酞緩衝液で連続的に透析した。リン酞緩衝液
は毎時300mlの割合で40時間新しいものず亀換し
た。゚ルマンEllmanの方法を甚いお、リシ
ンの鎖モル圓り0.9圓量のSHが枬定された。 このSH基を、メ゜ツズ・むン・゚ンザむモロ
ゞヌMethods in Enzymology、115411967
に蚘茉されおいる方法によ぀お−゚チルマレむ
ミドで保護した。すなわち、䞊蚘工皋で埗たリシ
ン鎖を、この鎖モル圓り20圓量の−゚チ
ルマレむミドの存圚䞋に30℃で時間むンキナベ
ヌト。過剰の詊薬をPHの125mMリン酞緩衝液
で連続的に透析するこずによ぀お陀去した。その
際、リン酞緩衝液は、毎時500mlの割合で20時間
にわた぀お新しいものず亀換した。これにより、
゚ルマンの詊薬で枬定し埗るチオヌル基を含たな
いで鎖を濃床mgmlで含む溶液を埗た。こう
しお埗た生成物を以䞋鎖NEMずいうこず
ずする。  過ペり玠酞塩による鎖NEMの酞化 過ペり玠酞塩による鎖NEMの酞化は実
斜䟋の手法によ぀おおこな぀た。  酞化された鎖NEMの特性  酞化された鎖NEMの酵玠掻性 タンパク合成に察する阻害掻性を実斜䟋の手
法を甚いお枬定した。その結果、酞化された鎖
NEMの酵玠掻性は、IC50で4.3×10-10モル
リツトルであ぀た。  酞化された鎖NEMの薬物動態孊的性
質 酞化されたたたは酞化されおいない鎖
NEMをりサギの耳血管に䞀回泚射した。泚
射した鎖の量は0.100mgKgに盞圓するものであ
぀た。23時間埌に採取した血挿を、実斜䟋に蚘
茉した免疫枬定法を甚いお分析した。結果を以䞋
の衚に蚘茉する。
【衚】 泚射しおから23時間経過埌、酞化鎖
NEMの濃床は、酞化しおいない鎖
NEMのそれの800倍であ぀た。 実斜䟋  この実斜䟋は、酞化凊理時間が酞化鎖の薬物
動態孊的性質に及がす重芁性を怜蚎するものであ
る。 過ペり玠酞ナトリりムによる凊理時間を倉えた
以倖は実斜䟋の手法を甚いお皮の酞化鎖の
補剀を調補した。凊理時間は次の通りであ぀た。
すなわち、゚チレングリコヌルを甚いお反応
を盎ちに停止、20分、40分、2.5時間、時間、
および18時間であ぀た。 これら皮の補剀をりサギに泚射し、23時間経
過埌の鎖の血挿䞭盞察濃床を実斜䟋の手法に
より枬定した。 結果を第図に瀺す。この結果から、鎖
の血挿䞭濃床の増加は、確かに、過ペり玠酞塩に
よる酞化に基づくこず反応を盎ちに停止したず
きは、鎖の血挿䞭濃床は生の鎖に぀いおのも
のず同䞀であるからである、および最適の
効果を埗るためには、反応凊理時間を比范的長く
するこずが必芁であるこずがわかる。 実斜䟋  この実斜䟋は、酞化凊理時間がNEMで保護さ
れたメチル化鎖の薬物動態孊的性質に及がす重
芁性を怜蚎するものである。  感応化リシン鎖の調補  −゚チルマレむミドによる鎖の遊離SH
の保護 実斜䟋の手法を甚いお、鎖の遊離SHを
−゚チルマレむミドで保護した。  鎖のメチル化 このメチル化反応は、ミヌンズMeansお
よびフむヌニヌFeeneyの方法バむオケミ
ストリヌBiochemistry21921968を
甚い、PHの0.2Mホり玠酞緩衝液䞭℃で攪拌
しながらおこな぀た。チリチりム化氎玠化ホり玠
38mg47mCiミリモル含有を鎖NEM
65.5mlmgmlに加え、これにホルムア
ルデヒドヒドmlを200マむクロリツトルづ぀
回に分けお30分で添加した。 過剰の詊薬を、PHの125mMリン酞緩衝液
40mlで断続的に透析するこずによ぀お陀去し
た。透析埌、タンパク溶液を遠心した。こうし
お、濃床mgmlのメチル化鎖63mlを埗た。  過ペり玠酞塩による酞化 過ペり玠酞ナトリりムによる凊理時間を倉えた
以倖は実斜䟋の手法を甚いお皮の酞化鎖の
補剀を調補した。凊理時間は次の通りであ぀た。
すなわち、゚チレングリコヌルを甚いお反応
を盎ちに停止、20分、40分、2.5時間、時間、
および18時間であ぀た。 これら皮の補剀をりサギに泚射し、23時間経
過埌の鎖の血挿䞭盞察濃床を実斜䟋の手法に
より枬定した。 結果を第図の曲線に瀺す。この結果から、
メチル化鎖NEMの血挿䞭濃床の増加
は、確かに、過ペり玠酞塩による酞化に基づくこ
ず反応を盎ちに停止したずきは、メチル化鎖
NEMの血挿䞭濃床はこの鎖に぀いおのも
のず同䞀であるからである、および最適の
効果を埗るためには、反応凊理時間を比范的長く
するこずが必芁であるこずがわかる。 実斜䟋  本実斜䟋は、鎖を構成する぀の分子鎖
A1鎖ずA2鎖を別々に酞化した堎合、その酞
化反応は、リシンの鎖に぀いお実斜䟋で述べ
たものず類䌌の効果を及がすこずを瀺しおいる。  A1鎖ずA2鎖の切断 10.9mgmlの鎖を含有するPH7.0の125mMリ
ン酞緩衝液28ml鎖は309mgを、䞊蚘緩衝液
䞭で平衡にあるコンカナバリン以䞋、ConAず
略す112mlずセフアロヌズの入぀たカラムに泚
いだ。A1鎖は同緩衝液で溶出させた時の最初の
ピヌクで埗られ、A2鎖はPH6.0の0.1Mホり酞緩衝
液で溶出された。この緩衝液は塩化ナトリりム氎
溶液に察しお0.5M、α−メチルマンノシドに察
しお0.1Mの濃床にした。 この結果A1鎖は184mg、A2鎖は103mg埗られ
た。A1鎖ずA2鎖を窒玠の加圧䞋で限倖過によ
り濃瞮した。A2鎖はPH7.0の125mMリン酞緩衝液
で透析させた。 鎖をSDS−アクリルアミドゲル電気泳動にか
けた結果、分子量30000ず33000に察応しお぀の
バンドが珟れた。濃く染色されたA1鎖が分子量
30000のバンドで、薄く染色されたA2鎖が分子量
33000のバンドだ぀た。  リシンA1鎖およびA2鎖の過ペり玠酞ナトリ
りムによる修食 この修食は実斜䟋で述べたような効果を及が
す。ポリサツカラむドが酞化された鎖のタンパ
ク質合成阻害における酵玠掻性ず薬物動態孊的特
性を調べた。  無现胞系A1鎖及びA2鎖における酵玠掻性の
維持 阻害䜜甚を実斜䟋で述べたようにしお枬定し
た。IC50は酞化されたA1鎖およびA2鎖に察しお
それぞれ2.1×10-10mol、2.1×10-10mol
であ぀た。本実斜䟋においお比范䟋ずしお甚いた
生のA1鎖およびA2鎖のIC50はそれぞれ1.9×10-10
mol、1.0×10-10molであ぀た。埓぀お
鎖から切断された分子鎖の修食はその酵玠掻性
を枛じない。  A1鎖A1−LaおよびA2鎖A2−Laに
おける薬物動態孊的特性の維持 A1若しくはA1−La鎖たたはA2若しくはA2−
La鎖をうさぎの耳の血管から、䜓重Kg圓たり
鎖415ÎŒgの割合で、回泚射した。20時間埌に
採取した血挿サンプルを免疫詊隓RIM−実斜
䟋参照によ぀お分析した。結果を䞋衚に瀺
す。鎖及び−La鎖の倀を察照的に瀺す。
【衚】 投䞎20時間埌にはA1−La鎖およびA2−La鎖
の濃床はA1鎖およびA2鎖のそれぞれ500倍、350
倍にな぀おいる。 実斜䟋  本実斜䟋においおは鎖ずこれから切断された
A1鎖およびA2鎖の生および酞化された状態にお
ける生化孊的パタメヌタを瀺す。 本実斜䟋で甚いた鎖は実斜䟋及びで説明
したようにしお準備した。  炭氎化物郚分 これらタンパク質の炭氎化物郚分は、クランプ
Clampの方法糖タンパク質その構成、構
造及び機胜ゎツトシダルク線、5A巻、第300
−321項を甚い、ガスクロマトグラフむヌによ
぀お定量した。埗られた結果を敎理したものを
぀の衚に瀺す。
【衚】
【衚】
【衚】 これらの結果は過ペり玠酞酞化は鎖の糖類の
䞀郚を砎壊するこずを瀺しおいる。鎖分子圓
りの鎖、A1鎖及びA2鎖のマンノヌス残差は平
均しおそれぞれ3.172.112.94残差枛少し、フ
コヌス残基はほが完党に消倱し、キシロヌス残基
は平均しおそれぞれ1.241.001.05残基枛少し
た。−アセチルグルコサミン残基はわずかに枛
少しただけである。  末端配列 鎖ずこれから切断されたA1鎖およびA2鎖の
生および酞化状態における末端アミノ酞残基を
アミノ酞配列分析装眮によ぀お決定した。 埗られた結果を敎理しお䞋衚に瀺す。
【衚】
【衚】 生状態及び酞化状態の鎖、A1鎖およびA2鎖
における未端アミノ酞個の配列は互いに党く
同じこずがわか぀た。これは酞化凊理はアミノ酞
配列に圱響を䞎えないこずを瀺しおいる。たた
鎖の末端アミノ酞個の配列は本発明に先立぀
おフナツ蟲芞生物化孊、第43巻、2221頁、1979
幎によ぀おリシンの鎖に぀いお決定されたも
のず党く同じこずもわかる。  ConAセフアロヌスに察する芪和性 DTNB 5′−ゞチオビス−ニトロ安息
銙酞でマスクされた鎖即ちDTNB
DTNB−LaA1DTNBA1DTNB−
LaA2DTNB及びA2DTNB−La鎖の
ConAセフアロヌスに察する芪和性を調べた。
鎖をmg含む溶液mlをConAがml入぀たカ
ラムに泚いだ。280nmにおける吞光床を枬぀た埌
クロマトグラフむヌにかけた。PH7.0の125mMリ
ン酞緩衝液で掗浄し、ConAによ぀お保持されな
か぀た最初のピヌクが基線氎準に戻぀た埌、カラ
ムを0.1Mホり酞緩衝液で掗浄した。この緩衝液
は塩化ナトリりム氎溶液に察しお0.5Mα−メ
チルマンノシドに察しお0.1Mの濃床にした。
280nmにおける吞光床を癟分率で衚瀺した結果を
䞋衚にたずめた。
【衚】 ConAはマンノヌス末端をも぀た糖タンパク質
に芪和性をも぀おいるこずが知られおいる。この
ような残基をも぀た鎖はConAず結合する。こ
れはより倚くマンノヌスで眮換されたA2鎖にお
いお特に顕著にわかる。たた酞化するずこの芪和
性が消倱するこずが芋い出されるが、これはこの
皮の糖質残基に共通に認められる。  モル吞光係数 cmの決定 280nmにおける吞収係数 cmずはml圓
たりタンパク質をmg含む溶液の280nmにおける
吞収係数で、これを甚いお暙準玔床のりシ血枅ア
ルブミンを䜿぀たFOLIN詊隓によ぀おタンパク
質濃床を決定した。 結果を䞋衚に芁玄した。
【衚】 分子鎖䞭のチオヌル基をDTNBでマスクする
ずニトロベンゟむル基を生じるため280nmにおけ
る吞収が倧きく増加する。酞化埌は280nmにおけ
る吞収に倧きな倉化は芳察されなか぀た。これは
酞化は280nmにおける吞収に関係するアミノ酞に
圱響を䞎えなか぀たこずを瀺しおいる。  等電点電気泳動 鎖を等電点泳動によ぀お分離するずPH7.5な
いし8.0の間に等電点バンドを生じ、これは鎖、
A1鎖及びA2鎖のどれも同じであ぀た。 生状態及び酞化状態の鎖、A1鎖およびA2鎖
の等電点を比范したずころ、マスクされおいない
堎合は鎖に特城的なバンド党おがPHで0.5、酞
性方向に移動した。この等電点移動は生状態ず酞
化状態のものが重なるこずなく起こ぀たので、
鎖の分子は党お酞化によ぀お圱響を受けたず考え
られる。 実斜䟋  本実斜䟋においおは生のゲロニンを動物に静脈
泚射した堎合のその急消倱ず過ペり玠酞ナトリり
ムによ぀お倉性させたゲロニンを同様に泚射した
埌のそのゆ぀くりずした消倱に぀いお説明する。  過ペり玠酞ナトリりムによるゲロニンの修食 ゲロニンをゲロニりムムルチフロヌルム
Gelonium multiflorumから生化孊ゞダヌナ
ル、第255巻、6947−6953頁、1980幎に述べおあ
る方法で抜出し、粟補した。実斜䟋でリシン
鎖に぀いお述べたのず同じ方法で酞化反応を行぀
た。しかしチオヌル基のDTNBによるマスクは
行぀おいない。 実際ゲロニンの倩然のチオヌル基を甚いおゲロ
ニンず抗䜓をカツプリングさせるこずはあたり行
なわれおいないので、チオヌル基は、酞化埌、ガ
ン研究Cancer Res.、第44巻、129−133頁、
1984幎においお説明された技術を甚いお人工的に
導入した。過ペり玠酞ナトリりム0.5M氎溶液21ÎŒ
をml圓たりmgのゲロニンを含む溶液mlに
リン酞緩衝溶液䞭で加え、1M酢酞でPHをにし
た。これを暗所で16時間℃に保぀た。反応は
1M゚チレングリコヌル氎溶液を105Ό加えお終
結させた。これを20℃で分間保枩した埌、反応
物を℃でリン酞緩衝液䞭においお透析した。30
分間10000×で遠心分離にかけるず、ここから
濃床2.5mgmlの酞化ゲロニン2.9mgが埗られた。 リシン鎖ず同じように、ゲロニンの基本的特
性はリボ゜ヌムの60Sサブナニツトの分解によ぀
お真栞现胞におけるタンパク質合成を阻害するこ
ずであるバむオケミカルゞダヌナル、第207巻、
505〜509頁、1982幎。ゲロニンの堎合にも過ペ
り玠酞酞化による修食は、掻性の損倱を生じさせ
ないこずがわか぀た。 ゲロニンにおける薬物動態孊的特性の維持 生の、或いは䞊述の手続で修食されたゲロニン
をうさぎの耳の血管から䞀回泚射した。投䞎した
ゲロニンの量は0.3ないし0.4mgKgであ぀た。ヘ
パリンの存圚䞋で血液を時々採取した。血挿は以
例RIM−ず略称する攟射線免疫詊隓を甚いお
分析した。 この詊隓はRIM−詊隓ず同じ技術を甚いる。
ただしAc1溶液が本䟋ではアフむニテむヌクロマ
トグラフむヌで粟補された抗ゲロニンりサギ抗䜓
溶液である。Ac2抗䜓はRIM−詊隓ず同じ抗䜓
を攟射性同䜍䜓で暙識したものである。同䞀暙本
䞭の生のゲロニンず修食したゲロニンの濃床をそ
れぞれ暙本ずは異぀た既知の濃床の怜量線ず比范
するこずによ぀お決定した。攟射暙識の技術は
RIM−で説明したものず同じである。RIM−
詊隓はRIM−詊隓ず同等の信頌性ず再珟性
を瀺した。本実隓の結果は実斜䟋でリシンの
鎖に぀いお瀺したのず同じ方法で瀺す。 図は生の及び修食したゲロニンを静脈泚射し
た堎合の血挿䞭濃床曲線を時間の関数ずしお衚わ
しおいる。生のゲロニンは99.99が24時間で消
倱したこずから、生のリシン鎖ず同じように血
䞭から非垞に急速に消倱するこずがわかる曲線
。ゲロニンのポリサツカリド単䜍が酞化され
おいる堎合は曲線圢が倧きく違う。投䞎24時間埌
に酞化したゲロニンの濃床は生のゲロニンの300
倍ある曲線。 埓぀おこれらの結果はリシン鎖ず同じよう
に、過ペり玠酞酞化はゲロニンの消倱を枬るのに
甚いられる糖類を、この機胜を劚げる皋床にたで
修食するこずを瀺しおいる。 実斜䟋  本実斜䟋は(1)モモルデむカ・カランテむア
momordica charantiaから抜出したGPIR
MOMを動物ぞ静脈泚射した埌のその急速な消倱
ず(2)過ペり玠酞ナトリりムで修食したGPIR
MOMを同じように泚射した埌のゆ぀くりずした
消倱に関する。  GPIR MOMの過ペり玠酞ナトリりムによる
修食 GPIR MOMをMomordica charantia皮子の
内生胞子から、バむオケミカルゞャヌナル
Biochemical Journal第186巻、443−452頁、
1980幎で説明されおいる方法で抜出し粟補した。
生のMOM及び修食されたMOMの薬物動態孊的
特性を攟射暙識したGPIR MOMを甚いお調べ
た。MOMはクロラミンの存圚䞋で125Iを甚い
お暙識した。攟射性125Iをml圓り100ÎŒCi含む溶
液10Όずクロラミンをml圓り2.5mg含む溶液
30Όを、MOMをml圓りmg含む溶液100ÎŒ
にリン酞緩衝溶液䞭で加えた。反応液を宀枩で
分間保぀た、反応はml圓りメタ重亜硫酞ナトリ
りム0.5mgを含む溶液400Όを加えお終結させた。
反応物は未反応のペり玠を攟射暙識されたタンパ
ク質から分離するためにSephadex  25のカラ
ムを甚い0.1のゲラチンを含むリン酞緩衝液で
ゲル過した。10000×で30分間遠心分離にか
けたずころ、濃床0.04mgmlの攟射暙識された
MOMが80ÎŒg埗られた。 酞化反応は実斜䟋においおリシンの鎖に぀
いお説明したのず同じ条件䞋で行なわれた。䜆し
チオヌル基をDTNBでマスクする凊理はなく、
タンパク質の濃床は125倍䜎く40ÎŒgであ
る。0.5M過ペり玠酞ナトリりム氎溶液20Όを攟
射暙識されたMOMをml圓たり0.04mg含む
溶液mlに加え、1M酢酞でPHをにした。この
反応液を暗所で16時間℃に保぀た。反応は1M
゚チレングリコヌル氎溶液を100Ό加えお終結
させた。15分間20℃に保぀た埌、反応物を℃の
䞋にリン酞緩衝液で透析した。10000×で30分
間遠心分離にかけたずころ濃床0.021mgmlの酞
化されたMOMが32ÎŒg埗られた。 こうしお埗られた新しい分子の分子量は生の
MOMず実質的に盞違がない。クヌマシヌブルヌ
で染色し、ポリアクリルアミド電気泳動にかけお
みた限りでは、修食凊理はごく少量のタンパク質
ポリマヌを生じさせるのみで、䜕らの分解も匕き
起さなか぀た。  MOMの薬物動態孊的特性の持続 攟射暙識されたMOMを、前述の手続による酞
化の有無を問わず、うさぎの耳の血管に䞀回泚射
した。投䞎されたMOMの量は3.50ないし
3.55ÎŒgKgである。ヘパリン存圚䞋で時々採血を
した。血挿を濃床25のトリクロロ酢酞TCA
200Όず䞀緒に℃で30分間保枩した。酞で沈
殿させた沈降物䞭の攟射胜を枬定した。この分析
法によれば、圱響を受けなか぀たMOM分子の血
挿レベルの枬定が可胜になる。TCAで沈殿しな
い䜎分子の分解生成物は考慮に入れなか぀た。こ
れらの実隓結果は血䞭に残存する攟射胜を初期量
に察する癟分率にしお時間の関数で衚した。この
倀は“初期血挿攟射胜癟分率IPRず呌ば
れ、次匏で算出する。 I.P.R.×PV×1000.2× ここでは0.2mlのブラズマから時間埌に怜
出された攟射胜、は投䞎された党攟射胜、PV
は血挿量うさぎの䜓重Kg圓り36mlあるず考え
られおいるである。 図に瀺したのは、酞化されたたたは酞化され
ないMOMを静脈泚射した埌の血挿䞭濃床であ
る。MOMは、血䞭のMOMの99.9が時間で
消倱したこずから、生のリシン鎖ず同じよう
に、血䞭から急速に消倱するこずがわかる曲線
。MOMの糖質残基が酞化された堎合は、濃
床の枛少速床が䜎䞋した曲線。投䞎時間
埌に酞化されたMOMの濃床は酞化されおいない
MOMのそれの60倍にな぀た。埓぀おこれらの結
果は過ペり玠酞酞化はMOMの短時間消倱の原因
である糖類を修食するこずを瀺しおいる。 実斜䟋 10 本実斜䟋は(1)デむアントりス・カリオフむルス
Dianthus caryophyllusから抜出したGRIRデ
むアンチンを動物ぞ静脈泚射した埌のその急速な
消倱ず(2)過ペり玠酞ナトリりムで修食したGRIR
デむアンチンを同じように泚射した埌のゆ぀くり
ずした消倱に関する。  デむアンチン30の過ペり玠酞ナトリりムによ
る修食 デむアンチン30をDianthus caryophyllusの葉
からバむオケミカルゞダヌナルBiochemical
Journal第195巻、339−405頁、1981幎で説明さ
れおいる方法で抜出し、粟補した。酞化された又
は酞化されおいないデむアンチン30の薬物動態孊
的特性を攟射暙識したデむアンチンを甚いお調べ
た。ペり玠化及び酞化反応は実斜䟋でMOMに
぀いお説明したのず同じ条件䞋で行぀た。 こうしお埗られた新しく酞化されたデむアンチ
ン分子の分子量は生のデむアンチン30ず実質的に
盞違がない。  デむアンチン30の薬物動態孊的特性の持続 攟射暙識されたデむアンチンを前述の手続によ
る酞化の有無を問わず、うさぎの耳の血管に䞀回
泚射した。デむアンチンの血挿䞭濃床は実斜䟋
でMOMに぀いお説明したのず同じ方法で枬定し
た。図は酞化されたデむアンチン曲線又
は酞化されないデむアンチン曲線の血挿䞭
濃床を時間の関数で衚わしたものである。デむア
ンチン30はMOMず同じように初期量の99.9が
時間以内に急速に消倱しおいる。䞀方デむアン
チン30の糖質残基が酞化された堎合は、濃床の枛
少速床が倧きく䜎䞋した。投䞎時間埌に酞化さ
れたデむアンチンの濃床は酞化されおいない
MOMのそれの80倍にな぀た。酞化されたデむア
ンチンの濃床は24時間た぀おもただ高か぀た初
期量の。 これらの結果もたた、過ペり玠酞酞化はデむア
ンチンの短時間消倱の原因である糖質を修食する
こずを瀺しおいる。 実斜䟋 11 リシン鎖を掻性化されたゞスルフむド基で眮
換し人間の现胞を阻害する抗䜓ず反応させた抱
合䜓を準備する。  人間の现胞を阻害する抗䜓T101抗䜓 この抗䜓は免疫孊ゞダヌナルJournal of
Immunology第125巻、725−737頁、1980
幎においお説明された方法によ぀お準備した。  酞化されたリシンの鎖 リシンの鎖は実斜䟋で説明した方法によ぀
お準備した。 人間の现胞を阻害する掻性化抗䜓 −゚チル−−ゞメチルアミノプロピル−
−カルボゞむミドをml圓り60.3mg含む溶液20ÎŒ
を−ピリゞニル−−ゞスフアニルプロ
ピオン酞をml圓り20mg含む溶液100Όにtert−
ブタノヌル䞭で加え、混合物を分間宀枩で攟眮
した。こうしお埗られた溶液68Όを、ml圓り
抗䜓8.9mgを含む溶液mlにリン酞緩衝液䞭で加
えた。この混合物を15分間30℃で攪拌し、その埌
℃䞋でリン酞緩衝液においお透析した。次いで
タンパク質溶液を遠心分離し、掻性化抗䜓を7.9
mgmlの濃床で15mg埗た。−メルカプト゚タノ
ヌルずの亀換反応によ぀お攟出されたピリゞン−
−チオンの343nmにおける吞収をみるず、この
抗䜓は1mol圓り3.8個の掻性化された混合ゞスル
フむド基を有しおいるこずがわか぀た。 持続䜜甚のあるリシン鎖を含有する免疫毒
玠の準備 修食された鎖をml圓り2.87mg含む溶液2.46
mlず䞊述の方法によ぀お埗られた掻性化抗䜓の溶
液1.5mlを準備し濃床7.9mgml即ち掻性化抗
䜓を11.8mg含む、この混合物を20℃で20時間攟
眮した。この溶液を遠心分離にかけ、セフアデツ
クスG100を甚いお過し、粟補した。溶出物の
光孊密床を280nmで枬定した。抗䜓ず鎖の䞡方
を含む分画を合わせるず免疫毒玠をml圓り0.7
mg含む溶液15ml即ち免疫毒玠は10.5mgが埗ら
れた。この溶液は抗䜓ずカツプリングされた酞化
鎖をml圓り0.14mg含有する。 埓぀おこの方法による平均カツプリング床は抗
䜓1molに぀き酞化鎖1.2molである。 䞊蚘の方法で埗た酞化されたリシン鎖を含む
免疫毒玠IT−LaT101に぀いお、その薬物
動態孊的特性ず暙的现胞に察する现胞毒性を調べ
た。 実斜䟋 12 本実斜䟋においおは、持続䜜甚をも぀リシン
鎖を含む免疫毒玠IT−LaT101ず略す
の血挿䞭濃床がゆ぀くりず枛少するずいう性質を
獲埗するこずを瀺す。 方法 実斜䟋11で説明した手続で準備された抱合䜓を
うさぎの耳の血管に䞀床泚射した。投䞎された量
は鎖に぀いお䜓重Kg圓たり0.415mgである。
ペパリンの存圚䞋で血液を時々採血した。血挿を
攟射線免疫詊隓RIM−ず略すによ぀お
箇所分析した。 この詊隓はRIM−ず同じ技術を甚いお行わ
れた。䜆しAc2溶液は本詊隓においおはRIM−
の技術を甚いおアフむニテむヌクロマトグラフむ
ヌによ぀お粟補され、攟射暙識されたマりスの
IgGを阻害するダギの抗䜓である。このサンプル
における修食された免疫毒玠の濃床は既知の異぀
た濃床から導いた怜量線を甚いお決定した。
RIM−詊隓はRIM−ず同じ信頌性及び再珟
性を有する。 比范察照のため、生のリシン鎖を掻性化され
たゞスルフむド基で眮換した抗䜓の反応から埗ら
れたITT101の抱合䜓ず同じ条件䞋で比范䟋の詊
隓を行぀た。この抱合䜓の準備ず现菌毒性はフラ
ンス囜特蚱出願第2516794号で説明した方法によ
぀お行぀た。これらの実隓結果は実斜䟋でカツ
プリングされおいない鎖に぀いお行぀たのず同
じ方法で瀺した。 結果 図は静脈泚射されたITT101及びIT−La
T101の血挿䞭濃床曲線を瀺しおいる。投䞎24時
間埌にIT−LaT101掻性现胞毒玠はITT101
の140倍にな぀おいた。この事実は酞化された
鎖の薬物動態孊的特性は抗䜓ずカツプリングされ
た埌も保持されおいるこずを瀺しおいる。 実斜䟋 13 本実斜䟋においおはIT−LaT101の暙的
现胞に察する现胞毒玠特性の保存に぀いお述べ
る。 リシン鎖の基本的な生物孊的特性は现胞䞭の
タンパク質合成をリボ゜ヌムの60Sサブナニツト
の分解によ぀お阻害するこずである。 この方法は培逊䞭のガン现胞に14Cで暙識した
ロむシン以䞋14C−ロむシンをいうを取り蟌
たせお研究されおいる物質の効果を枬定する现胞
系を甚いる。 甚いられる现胞は、抗原T65を運ぶ人間の癜
血病から誘導されるCEM现胞系に属する。この
现胞は目的の物質の存圚䞋で保枩した埌、现胞ぞ
の14C−ロむシンの取り蟌みの皋床を枬定した。
この枬定には生物化孊ゞャヌナルJournal of
Biological Chemistry第249å·»11号、3557−
3562頁で説明された、タンパク質合成量を枬定す
るのに14C−ロむシンのトレヌサヌを甚いる方法
によ぀お行う。取り蟌たれた攟射胜はろ過した现
胞の党䜓に぀いお枬定した。 定量の基準ずしお線量効果曲線を描くこずが
できる。この曲線暪軞には目的物質䞭の鎖のモ
ル濃床、瞊軞には、タンパク質合成を阻害する物
質の存圚しない比范现胞における14C−ロむシン
の取り蟌み量に察する癟分率をプロツトしお埗ら
れる。 こうしおそれぞれの物質に぀いお14C−ロむシ
ン取り蟌み量を50阻害する濃床たたは50阻害
濃床IC50を決定するこずができる。 図は恒枩媒䜓䞭で10mM塩化アンモニりムの
存圚䞋でIT−LaT101ずカツプリングされ
おいない鎖に぀いお行぀た同じ実隓から曲線を
瀺しおいる。この図をみるずIT−LaT101
は同䞀条件で枬定されたカツプリングも酞化され
おいない鎖に比べ玄䞇倍の非垞に匷い现胞毒
性IC505.5×10-12を有するこずがわかる。 実斜䟋 14 本実斜䟋はクロヌン原性詊隓においお確認され
たCEM暙的现胞に察するIT−LaT101ず
ITT101の现胞毒性的効胜の比范を瀺す。免疫毒
玠は暙的现胞を䞀぀䞀぀砎壊する䜜甚を担う。こ
の䜜甚は感床の高い技術を甚いお枬定するこずが
できる。コロニヌ圢成阻害詊隓によれば、䞀個の
生存现胞を数癟䞇の死んだ现胞から芋い出せるた
めこの可胜性がある。これは人間のCEMリンパ
系に応じたゲル媒䜓における最適な培逊条件によ
぀お可胜になる。 コロニヌ圢成阻害詊隓による现胞毒玠の枬定
技術 クロヌニングに甚いられる媒䜓はケトグルタル
酞ナトリりムミリmol、オキサロ酢酞ナトリり
ムミリmol、の䞍掻性仔りシ血枅及び10
の䞍掻性りマ血枅が加えられたRPMI1640であ
る。最初に0.3の寒倩溶液アガロヌス型、
シグマSIGMA研究所補をペトリ皿のこの
媒䜓䞭に薄局のようにしお甚意し、℃で凝固さ
せた。现胞は37℃に保枩した0.275寒倩溶液ず
混ぜ合せ、それから最初の寒倩局䞊に流し蟌んで
凝固させた。これに甚いた寒倩の濃床は、クロヌ
ニングの効率、コロニヌの倧きさ及び媒䜓の均䞀
性の䞉者を同時に最適化する目的で行぀た予備詊
隓の結果から定めた。恒枩に保぀おから15日埌
に、自動コロニヌ蚈数噚“アルチツク”、ダむナ
テツク瀟、米囜を甚いおコロニヌを蚈数した。
クロヌニング効率、即ち免疫毒玠凊理で生き残぀
た现胞の正確な数を決定するには、接皮された现
胞の数を圢成されたコロニヌの数の関数ずしお衚
す怜量線を぀くるこずが倧切である。発明者等は
この怜量線から埗られるクロヌニング効率は、现
胞を免疫毒玠凊理した堎合よくみられるように、
死んだ现胞が高い割合であ぀おも圱響されないこ
ずを蚌明した。 免疫毒玠凊理は、10の䞍掻性仔りシ血枅ず10
ミリmolの塩化アンモニりムを含むRPMI1640媒
䜓の党量mlに察しおそれぞれ異぀た濃床のIT
−LaT101及びITT101の免疫毒玠を甚い、
指数的に成長しおいる现胞を保枩するこずによ぀
お行う。保枩はの二酞化炭玠を含む雰囲気䞋
で詊隓管を氎平方向に振るこずニナヌブルンス
りむツク瀟“ゞラトリ−−”攪拌噚を甚いお
2500rpmのペヌスによ぀お37℃に保぀た。生存
现胞の数が怜量線によ぀お最倧感床範囲で枬定で
きるように寒倩溶液ず混合する前に、现胞を掗浄
し、それぞれ異぀た垌釈にしお準備した。結果は
次の関係匏を甚い、クロヌニング効率から倖挿し
お生存现胞の絶察数で衚した。生存现胞の絶察数
は次匏で衚わされる。×、ここではペト リ皿皿圓りのクロヌンの数、は现胞の垌釈因
子、は怜量線の募配から求められたクロヌニン
グ効率である。それぞれの倀は回の詊隓結果の
平均をず぀た。 結果 図は塩化アンモニりム10ミリmolの存圚䞋に
おけるCEM现胞に察するIT−LaT101及び
ITT101免疫毒玠の现胞毒性曲線を免疫毒玠の濃
床鎖のモル濃床の関数ずしお衚しおいる。
これら぀の毒玠の効率は同じオヌダヌの倧きさ
であるこずは明らかである。现胞数枛少の床合は
䞡者ずも倧きいが、これは10-11皋床の䜎い濃
床においおは残存生存现胞の割合は初期倀に比べ
お0.001のオヌダヌにな぀おしたうからである。
この効果は高床に特異的である。䜕故ならこれら
の濃床においおはカツプリングされおいない鎖
ず非特異的な免疫毒玠は、これらの现胞に察しお
効果をも぀おいないこずが蚌明されたからであ
る。 本実斜䟋によ぀おIT−LaT101は埓来の
ITT101ず実質的に同䞀な特異现胞毒性を有する
こずがわかる。 実斜䟋 15 リシンの酞化され官胜基を導入した鎖
NEMず掻性化されたゞスルフむド基で眮換
した人間の现胞を阻害する抗䜓T62抗原に䜜
甚する抗䜓ずの抱合䜓。カツプリングは掻性化
されたゞルフむド基ず鎖の官胜基を導入された
糖質残基の間で起こる。  免疫毒玠の準備  官胜基を導入した鎖の準備 鎖のSH基を−゚チルマレむミドでマスク
し、次いで実斜䟋で説明した方法を甚いお18時
間かけお酞化した。 シスタミンずのカツプリング PH9.5の炭酞緩衝液で透析した埌、タンパク質
をml圓り4.65mg含む溶液5.2mlを塩酞シスタミ
ン18mgず共に25℃で時間保枩した。こうしお保
枩したものをホり氎玠化ナトリりム鎖モル
に぀き200等量即ち0.1N氎酞化ナトリりム溶液
mlに17.6mgのホり氎玠化ナトリりムを含む溶液
156Όを甚い、25℃で時間還元した。 過剰の詊薬はPHのリン酞緩衝液125mMで連
続透析しお陀去した。固定したシスタミンのゞス
ルフむドブリツゞを30℃で時間埌に濃床に
なるような−メルカプト゚タノヌルで還元し、
その埌さらにPHの125mMリン酞緩衝液で連続
透析毎時300mlで党量20した。透析及び遠
心分離埌、鎖1mol圓り0.25個のSH基を゚ルマ
ン法によ぀お定量した。  抗䜓の準備実斜䟋11参照  カツプリング反応 修食されたリシン鎖の溶液1.5ml鎖は
0.058ÎŒmolを前蚘で埗られた掻性化抗䜓溶
液211Ό抗䜓は0.006ÎŒmolに加えた。この混
合物を30℃で18時間反応させた。次いでこの反応
物をリン酞緩衝液リン酞塩10mM、塩化ナトリ
りム140mMの割合でPH7.4で透析した。遠心分
離埌、ポリアクリロアミド電気泳動にかけるず、
埗られた免疫毒玠は平均しお抗䜓1mol圓り鎖
0.8個のカツプリング床を有するこずがわか぀た。  免疫毒玠ITNEM−La−システアミン
T101の性質  特異的现胞毒玠掻性 前述の手続で準備した免疫毒玠はCEM暙的现
胞に察しお非垞に匷力な现胞毒玠掻性IC50
1.2×10-11、実斜䟋13で説明した枬定法による
を有する。  血挿䞭濃床の枛少 免疫毒玠をうさぎの耳の血管に䞀回泚射した。
血挿サンプルは22時間埌に採取しお、RIA−免
疫怜定法実斜䟋12参照によ぀お分析した。結
果を䞋衚に瀺す。IT101の倀は盞察的な倀で瀺し
おある。
【衚】 投䞎22時間埌に、修食された鎖を含むITの
濃床はITT101の30倍あ぀た。 実斜䟋 16 メチル化され、酞化され、官胜基を導入された
リシン鎖NEMず人間の现胞を阻害する
抗䜓T65抗原に察する抗䜓の抱合䜓。カツプ
リングは掻性化されたゞスルフむド基ず鎖の修
食された糖質残基の間で起こる。  免疫毒玠の準備  官胜基を導入した鎖の準備 鎖のSH基を−゚チルマレむミドでマスク
し、次いで実斜䟋で説明した方法を甚いお18時
間かけおメチル化ず酞化を行぀た。 システミンずのカツプリング PH9.5の0.1M炭酞緩衝液で透析した埌、タンパ
ク質をml圓り4.65mg含む溶液18.5mlを塩酞シス
テミン35.6mgず共に25℃で時間保枩した。こう
しお保枩したものをホり氎玠化ナトリりム鎖
モルに぀き、200等量即ち0.1N氎酞化ナトリり
ム溶液mlに17.6mgのホり氎玠化ナトリりムを含
む溶液395Όを甚い25℃で時間還元した。 過剰の詊薬はPHのリン酞緩衝液125mMで連
続透析しお陀去した。固定したシステミンのゞス
ルフむドブリツゞを30℃で時間埌に濃床に
なるような−メルカプト゚タノヌルで還元し、
その埌さらにPHの125mMリン酞緩衝液で連続
透析毎時300mlで党量20した。透析及び遠
心分離埌鎖1mol圓り0.32個のSH基を゚ルマン
法によ぀お定量した。  修食された抗䜓の準備 ゚チルアルコヌル䞭に−サクシニミデむル−
−ピリゞニル−−ゞチオプロピオネヌト2.12
mgを含む溶液をT101抗䜓をml圓り4.4mg含む溶
液23.5ml抗䜓は0.68ÎŒmolになるに加えた。混
合物を30分間25℃で攪拌し、次いでPHの
125mMリン酞緩衝液で透析した。その埌タンパ
ク質溶液を遠心分離にかけ、修食された抗䜓を
ml圓り4.2mg含む溶液23.5mlを埗た。 −メルカプト゚タノヌルずの亀換反応によ぀
お攟出されたピリゞン−−チオンの343nmにお
いお分光分析したずころ、埗られた抗䜓はモル
圓り3.2個の掻性化された混合ゞスルフむド基を
有しおいるこずがわか぀た。  カツプリング反応 修食されたリシン鎖の溶液7.3ml鎖は
0.275ÎŒmolを前蚘で埗られた掻性化抗䜓溶
液781Ό抗䜓0.022ÎŒmolに加えた。この混合
物を30℃で18時間反応させた。次いでこの反応物
をリン酞緩衝液リン酞塩10mM、塩化ナトリり
ム120mMの割合でPH7.4で透析した。 遠心分離埌、ポリアクリロアミド電気泳動にか
けるず埗られた免疫毒玠は平均しお抗䜓1mol圓
り酞化されメチル化された鎖NEM0.8個の
カツプリング床を有するこずがわか぀た。 䞊述の方法で埗たメチル化され酞化されたリシ
ン鎖NEMを含む免疫毒玠の薬物動態孊的
特性ず暙的现胞に察する特異的现胞毒性を調べ
た。  ITメチル化NEM−La−シスタアミン
T101免疫毒玠の特性  特異的现胞毒玠掻性 前述の手続で準備した免疫毒玠はCEM暙的现
胞に察しお非垞に匷力な现胞毒玠掻性IC50
×10-12、実斜䟋13で説明した枬定法によるを
有する。  血挿䞭濃床の枛少 免疫毒玠をうさぎの耳の血管に䞀回泚射した。
血挿サンプルは22時間埌に採取しお、RIA−免
疫怜定法実斜䟋12参照によ぀お分析した。結
果を䞋衚に瀺す。IT101の倀は盞察的な倀で瀺し
おある。
【衚】 投䞎22時間埌に、修食された鎖を含むITの
濃床はITT101の17.5倍あ぀た。 実斜䟋 17 酞化された鎖の動物の䜓党䜓ぞの毒物孊的特
性免疫毒玠の毒性は等モル量における鎖ず同
じオヌダヌの倧きさであるを調べるこずは重芁
である。これはチダヌルズリバヌフランスCD1マ
りスに静脈泚射された酞化鎖の半数臎死量を生
の鎖ずの比范においお決定するこずによ぀お行
われる。 その結果を䞋衚に瀺す。
【衚】 䞊の結果は酞化された鎖の毒性は生の鎖よ
り䜎いこずを瀺しおいる。これは鎖が酞化によ
぀お修食されるず鎖の血挿䞭濃床は著しく増加
するけれども、その毒性は増加するどころか、反
察にかなり枛少するこずを意味しおいる。 埓぀お修食された现胞毒性サブナニツトを包む
免疫毒玠は人間の治療薬ずしお䜿える。これらの
修食された免疫毒玠は、暙的现胞が免疫毒玠を準
備するのに甚いられる抗䜓によ぀お識別されるよ
うなガンたたはガンでない病気の治療に甚いられ
る。最適な投䞎量ず治療時間は問題の病気にかか
぀た患者ずその病気の特質に応じお定められるべ
きである。 より䞀般的な蚀葉でいえば、糖質単䜍が過ペり
玠むオンによ぀お修食され、察応する修食のない
抗腫瘍糖タンパク質よりも半枛期の長い抗腫瘍糖
タンパク質は薬ずしお有甚だずいうこずである。 埓぀おもう䞀぀の特城によれば、本発明は糖質
単䜍が過ペり玠酞むオンの酞化によ぀お修食され
おいる抗腫瘍糖タンパク質が泚射奜たしくは静脈
泚射に適しお圢態にな぀おいる抗腫瘍薬に関す
る。
【図面の簡単な説明】
第図ないし第図は本発明の糖タンパク質の
特性を瀺す線図である。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  糖鎖単䜍が過ペり玠酞むオンによる酞化によ
    ぀お修食されおいる、抗腫瘍䜜甚を有する糖タン
    パク。  リボ゜ヌムを䞍掻化する糖タンパクであ぀
    お、その糖鎖単䜍が過ペり玠酞むオンによる酞化
    によ぀お修食されおおり、リボ゜ヌムを䞍掻化す
    る未修食糖タンパクず実質に同䞀の掻性を有しか
    ぀それよりも長い掻性半枛期を有する糖タンパ
    ク。  リボ゜ヌムを䞍掻化し、延長された䜜甚を有
    する糖タンパクであ぀お、圓該チオヌル基が堎合
    に応じお保護されおいる糖タンパクの氎溶液を過
    ペり玠酞アルカリ金属の氎溶液で、光の䞍存圚䞋
    に、℃ないし15℃の枩床で0.2ないし24時間凊
    理し、堎合に応じおチオヌル基の保護基を陀去
    し、および埗られた生成物を単離するこずによ぀
    お埗られた糖タンパク。  糖タンパクの氎溶液がリシンの鎖の氎溶液
    である特蚱請求の範囲第項蚘茉の糖タンパク。  リシンの鎖が感応化されおいる特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の糖タンパク。  リシンの鎖がメチル化によ぀お感応化され
    おいる特蚱請求の範囲第項蚘茉の糖タンパク。  糖タンパクの氎溶液がゲロニンの氎溶液であ
    る特蚱請求の範囲第項蚘茉の糖タンパク。  糖タンパクの氎溶液がGPIR MOMの氎溶液
    である特蚱請求の範囲第項蚘茉の糖タンパク。  糖タンパクの氎溶液がGPIRゞアンチン30の
    氎溶液である特蚱請求の範囲第項蚘茉の糖タン
    パク。  糖タンパクの氎溶液が、ゞアンチン32、ア
    グロスチン、アグロスチン、HCIたたはアス
    パラガス・オフむシナリス由来阻害剀の氎溶液で
    ある特蚱請求の範囲第項蚘茉の糖タンパク。  生のリシンもしくは生のリシンの鎖断片
    であるリシン鎖から、たたは遺䌝型が修食され
    た现胞によ぀お生合成されたリシン鎖もしくは
    その断片から補造された特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の糖タンパク。  少なくずも぀のチオヌル基が2′−ゞ
    ニトロ−5′−ゞチオゞベンゟ゚ヌトずの反応
    により保護されおいるリシン鎖の氎溶液を過ペ
    り玠酞ナトリりムの氎溶液で、光の䞍存圚䞋に、
    玄℃の枩床で0.2ないし24時間凊理し、぀いで
    −メルカプト゚タノヌルで凊理し、埗られた生
    成物を単離するこずによ぀お埗られた特蚱請求の
    範囲第項蚘茉の糖タンパク。  ゲロニンの氎溶液を過ペり玠酞ナトリりム
    の氎溶液で、光の䞍存圚䞋に、玄℃の枩床で
    0.2ないし24時間凊理し、぀いで−メルカプト
    ゚タノヌルで凊理し、埗られた生成物を単離する
    こずによ぀お埗たものである特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の糖タンパク。  未修食の、抗腫瘍性糖タンパクを過ペり玠
    酞むオンによる酞化凊理に䟛するこずを特城ずす
    る抗腫瘍䜜甚を有する糖タンパクの補造方法。  リボ゜ヌムを䞍掻化し、延長された䜜甚を
    有する糖タンパクの補造方法であ぀お、圓該チオ
    ヌル基が堎合に応じお保護されおいる糖タンパク
    の氎溶液を過ペり玠酞アルカリ金属の氎溶液で、
    光の䞍存圚䞋に、℃ないし15℃の枩床で0.2な
    いし24時間凊理し、堎合に応じおチオヌル基の保
    護基を陀去し、および埗られた生成物を単離する
    こずを特城ずする補造方法。  出発糖タンパクが生のリシンもしくは生の
    リシンの鎖断片であるリシン鎖、たたは遺䌝
    型が修食された现胞によ぀お生合成されたリシン
    鎖もしくはその断片である特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の補造方法。
JP60135217A 1984-06-20 1985-06-20 抗腫瘍䜜甚を有する糖タンパクおよびその補造方法 Granted JPS6112628A (ja)

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