JPH04266829A - 免疫結合体を形成するための抗体の化学修飾 - Google Patents

免疫結合体を形成するための抗体の化学修飾

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JPH04266829A
JPH04266829A JP3300686A JP30068691A JPH04266829A JP H04266829 A JPH04266829 A JP H04266829A JP 3300686 A JP3300686 A JP 3300686A JP 30068691 A JP30068691 A JP 30068691A JP H04266829 A JPH04266829 A JP H04266829A
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immunoreceptor
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JP3300686A
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Wolfgang A Wrasidlo
ウォルフガング　エー．　ラシドロ
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Brunswick Corp
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    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標的治療に適した組成
物およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】医学の分野では、特異的な標的治療物質
が理想的であると長い間考えられてきた。その理由は、
標的の型の組織あるいは細胞の破壊に十分な量を投与し
た場合、自由に循環する治療物質では、ほとんどの場合
に好ましくない副作用が起こるためである。標的が細胞
の異常集団であり、患者の正常細胞と殆ど同じである癌
のような疾病を治療する場合、副作用の深刻さは非常に
激しい。特異的標的治療薬は、非常に低い投与量で済み
、直接標的細胞へ到達するため、正常細胞への被曝は最
小になり、望ましい作用部位では細胞の致死量を提供す
る。
【０００３】現在、標的治療薬として最も卓越し有望と
考えられる方法の１つは、モノクローナル抗体の使用で
ある。実質的に、細胞上あるいは組織上の全ての表面分
子構造に、特異的に結合するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを選択する技術は現在十分確立され
ている。現在、大量生産設備により、全ての望ましいモ
ノクローナル抗体を、治療に用いる量生産し得る。全て
のバクテリア、ウィルス、異常な型の細胞、あるいはそ
の他の組織に対する特異的標的物質が生産され得る。例
えば、癌細胞の様な異常細胞を特異的に認識するモノク
ローナル抗体を生産し得る。これらの細胞は特殊な細胞
表面分子を幾種類か発現するためである。
【０００４】ある種のモノクローナル抗体は、本質的機
能をブロックする部位への結合のために、抗体自体が治
療活性を有することが示されている。しかしながら、こ
のような例は稀で、一般的に応用できるわけではない。 完全な治療薬はまた、薬物あるいは放射性同位元素の様
な、細胞障害性薬剤からなり、そして意図した目的が効
果的に達成されるような方法で、標的認識物質と細胞障
害性薬剤とをともに結合させなければならない。非常に
多くの細胞障害性薬剤がすでに開発され、使用のために
市販されている。しかしながら、特異的標的細胞障害性
薬剤の開発において、直面する重大な問題は、常に、標
的認識物質と細胞障害性薬剤を適切に結合する方法であ
る。
【０００５】抗体を直接薬剤と結合させる標準的方法、
抗体、薬剤およびリンカー分子を同時に反応させる標準
的方法、あるいはまず薬剤にリンカー分子を結合した後
、この活性化複合体を抗体と反応させる標準的方法は、
どれも不適切であったことが証明されている。これらの
標準方法の最も一般的な問題点は、副反応生成物の形成
および多量体様の架橋生成物の形成であった。これらの
問題点により、収量の減少、精製上の問題が起こり、そ
して不溶性で不活性な複合体を生じ得る。
【０００６】標的認識物質と、細胞障害性薬剤との理想
的結合法はこうあるべきであると記述するのは簡単であ
る。複合体は標的に到達するまでは安定でなければなら
ず、次に作用部位において分解され、活性な細胞障害性
薬剤を放出しなければならない。さらに、生産の目的に
は、結合の過程は、迅速に進行せねばならず、高い反応
率と低い副反応率が要求される。複合体は簡単に精製さ
れるべきで、使用前の保存にも安定であるべきである。 これらの要求項目は、このような標的治療物質の開発の
とるに足らない側面に過ぎないことが証明されている。 実際、多くの望ましい応用に対する、適切なモノクロー
ナル抗体、および薬剤は、現在市販されているが、いま
だに実用的な結合の方法が求められている。
【０００７】本明細書には、抗体分子を使用される適当
なリンカー化合物に合うように修飾する方法を用いて、
抗体と毒性物質とを結合させる新しいアプローチが記載
してある。
【０００８】
【発明の要旨】構造Ｉ−Ｌを有する組成物質が提供され
、ここでＩは免疫受容体であり、そしてＬは１つの官能
基を介して免疫受容体上のあるクラスの化学残基と結合
し、そして免疫受容体上にあるものとは異なるクラスの
第２の未結合の官能基を有する、二官能性リンカーであ
る。このＩ−Ｌ組成物は、単官能性の化学反応基を有し
、複合していない免疫受容体と実質的に同等の特異性お
よび免疫反応性によって特徴づけられる。Ｘが細胞障害
性薬剤物質である、構造Ｉ−Ｌ−Ｘを有する免疫結合体
もまた提供される。このような組成物を製造する方法も
提供される。免疫受容体を介して腫瘍細胞抗原に選択的
に結合するＩ−Ｌ−Ｘ免疫結合体を、治療有効量哺乳類
動物に投与し、腫瘍の成長を抑制する方法も提供される
。
【０００９】
【発明の構成】本発明は免疫結合体の簡易で効果的な製
造法に関する。この方法は、二官能性リンカーを使用し
、まず免疫受容体と結合させ、単官能性の化学反応基を
有する免疫受容体−リンカー化合物を作成する。この単
官能性の反応基は、免疫受容体同士の架橋および望まし
くない副産物の形成を伴わずに、細胞障害性薬剤と反応
させ得るという点で好都合である。このことにより免疫
結合体の収量は大きく改善される。望ましい型の細胞上
の抗原を特異的に認識する免疫受容体を含有するこの免
疫結合体は、いかなる型の細胞に対する標的付けに用い
ても安定である。従って、製造した免疫結合体は、培養
物中および哺乳動物中の腫瘍成長の抑制に応用できる。
【００１０】本発明の好ましい実施態様では、免疫受容
体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体か
らなる群から選択される。
【００１１】本発明の好ましい実施態様では、二官能性
リンカーは、酸無水物、イソシアネート類およびクロロ
ギ酸エステル類からなる群から選択される。
【００１２】本発明の好ましい実施態様では、二官能性
のリンカー分子との化学反応によりモノクローナル抗体
（ＭＡｂ）中のリジンのアミノ末端側鎖の修飾が起こり
、望ましい細胞障害性薬剤との反応のためのリンカー分
子上の適切な残基が使用可能な状態で残る。結果として
生じたＭＡｂ−リンカー化合物は、希望する薬剤上の希
望する化学残基と反応性で、単官能性になるように化学
的に改変されているかあるいはされ得る。最終的なＭＡ
ｂ−リンカー薬剤結合体は、作用部位に到達するまでの
間（血流中を循環している間も含む）は安定であり、そ
して、標的細胞あるいは組織に取り込まれた時、加水分
解的あるいは酵素分解的に分解され、活性な薬剤あるい
は薬剤誘導体を放出する。この好ましい実施態様は、次
の式で一般化され得る：つまり、Ｉ−Ｌ−Ｘであり、こ
こでＩは免疫受容体、Ｌは細胞毒であるＸを結合するた
めに化学的にＩ−Ｌ複合体を単官能性にするための二官
能性リンカーである。
【００１３】本明細書の用語「免疫受容体」とは、免疫
系のタンパク質のことであり、標的細胞に選択的結合性
を示す。免疫タンパク質とは、例えば、モノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体およびＴ−細胞受容体等であ
り得る。本用語は、さらに免疫受容体の機能的断片を包
含するように意味する。本明細書の用語「機能的断片」
とは、完全な分子が標的細胞に示すのと同等の選択的結
合性を示す断片をさす。選択的結合には標的細胞に対す
る免疫受容体の結合特異性および親和性が包含される。 結合は、例えばタンパク質抗原のような細胞表面分子へ
の結合であり得る。その他の細胞表面分子への結合例に
は、免疫受容体が抗原に選択的結合性を示す限りにおい
ては、炭水化物、脂質、無機分子、ポリペプチドおよび
ペプチド等の抗原が包含され得る。標的細胞は免疫受容
体によって結合され得る細胞表面分子を有していれば、
いかなる細胞あるいは細胞集団でもあり得る。これは、
培養されている細胞および組織内の細胞を包含する。
【００１４】本明細書の用語「リンカー」は、免疫受容
体と細胞障害性薬剤との間に架橋状構造を形成する分子
を指す。リンカーは免疫受容体−リンカー複合体が単官
能性の化学反応基を有するように免疫受容体を修飾する
のに用いられる。本明細書の用語「二官能性リンカー」
とは、細胞障害性薬剤を免疫受容体に結合する目的のた
めの、少なくとも２つの官能基を含むリンカーを指す。 例えば、１つの官能基は免疫受容体とリンカーとの結合
形成に用いられる。第２の官能基は免疫受容体−リンカ
ー複合体と細胞障害性薬剤との間の結合形成に用いられ
る。このようなリンカーは、例えば無水ジグリコール酸
および無水シトラコン酸であり得る。
【００１５】本明細書の用語「官能基」とは、共有結合
形成に用いられ得、そして特定の化学的反応性を示す化
学残基を指す。特定の化学反応性によって、その化学残
基がどの様なタイプの官能基に属しているのか、そして
どの様なタイプの化学反応が結合形成に用いられ得るの
かが決まる。例えば、カルボキシル基は１級アミンとは
反応性があるが、カルボキシル基同士では、反応性はな
い。１級アミンと結合形成能を示すというような化学反
応性によって、カルボン酸を構成する官能基のタイプが
決まる。同様に、１級アミンおよび水酸基は無水ジグリ
コール酸および無水シトラコン酸のような酸無水物と反
応性である。この特定の化学反応性により、１級アミン
と水酸基とは共に酸無水物と反応性であるため、同じ官
能基として扱う。官能基は、免疫受容体、二官能性リン
カーおよび細胞障害性薬剤上に見いだされる。
【００１６】本明細書の用語「単官能性の化学反応基」
は、類似の化学反応性を有し、そのために同じ官能基と
して分類される２種あるいはそれ以上の化学残基を指す
。単官能性の化学反応基を有する免疫受容体は、２種あ
るいはそれ以上の単官能性を示す化学残基を有する。 例えば、グルタミン酸残基とアスパラギン酸残基は、カ
ルボキシル基のみに着目する場合、単官能性を示す。し
かしながら、免疫受容体上のリジン残基の１級アミン部
分について言えば、カルボキシル基と１級アミンという
２つのタイプの部分は、単官能性を示さない。リジン残
基の１級アミン部分は、カルボキシル基部分と反応する
が、カルボキシル基部分同士では反応しない。
【００１７】本発明は、二官能性リンカーＬに結合した
免疫受容体Ｉ、即ち構造Ｉ−Ｌを提供する。さらにこの
ような化合物を製造する方法をも提供する。二官能性リ
ンカーはリンカー上の官能基を介して免疫受容体上のあ
るクラスの化学残基と結合する。結合したリンカーは、
単官能性の化学反応基を有する免疫受容体を作成するた
めに、リンカーが結合している免疫受容体上の化学残基
とは異なる第２の官能基を有している。この単官能性の
化学反応性免疫受容体は、複合していない免疫受容体と
実質的に同等の特異性及び免疫反応性を有することによ
り特徴づけられる。
【００１８】二官能性リンカーが結合する免疫受容体は
、モノクローナル抗体が好ましいが、ポリクローナル抗
体あるいは標的細胞に選択的結合を示す他の免疫系タン
パク質でもあり得る。モノクローナル抗体は、ほぼ全て
の所望の抗原に対して選択的に結合するように作成され
得、そして大量に生産され得るため、有益である。
【００１９】好ましい実施態様では、二官能性リンカー
と結合する免疫受容体上の化学残基のクラスは、１級ア
ミン、カルボキシル基、フェノール性水酸基およびチオ
ール基からなる群から選択される。
【００２０】好ましい実施態様では、二官能性リンカー
に含まれる、免疫受容体Ｉの化学残基のクラスとは異な
るクラスの化学残基は、１級アミン、カルボキシル基、
フェノール性水酸基およびチオール基からなる群から選
択される。
【００２１】結合を形成するために用いられている細胞
障害性薬剤あるいは免疫受容体上の化学残基の少なくと
も１つが、２つの反応物の何れにも存在しているような
場合には、単官能性基を作成することが望まれる。この
ような場合、所望の免疫受容体−細胞障害性薬剤結合体
に加えて、免疫受容体および／あるいは細胞障害性薬剤
間での結合形成が起こる。この１つの例は、免疫受容体
上のカルボキシル基へ細胞障害性薬剤が１級アミンを介
して結合されることである。細胞障害性薬剤と免疫受容
体との所望のアミド結合形成に加えて、第１の免疫受容
体上の１級アミンと第２の免疫受容体上のカルボキシル
基との間にもアミド結合が生じる。
【００２２】前述のような架橋反応を解消するために、
本発明では、第１の官能性基の化学残基と反応し得、そ
の結果、異なった化学反応性の第２の官能基が付与され
るようなリンカーを提供している。官能基の化学反応性
を第２の官能基のタイプに変えることにより、２種の化
学残基を単官能性にすることができる。このことにより
、さらに細胞障害性薬剤が結合する部位の数が増大する
。
【００２３】２種の官能基を単官能性にする特定の例と
しては、次に示す反応を通じて、免疫受容体上の１級ア
ミンに無水シトラコン酸リンカーを結合させる場合があ
る。ただし、Ｉ−ＮＨ２は免疫受容体上の１級アミンを
表している。
【００２４】
【化１】
【００２５】上記の反応により、１級アミンがカルボキ
シル基部分に置き変わった免疫受容体−リンカー化合物
が生成される。変換された１級アミンは、免疫受容体上
のカルボキシル残基と単官能性となり、例えば、多くの
細胞障害性薬剤の１級アミンと架橋反応無しの結合形成
に使用することができる。
【００２６】無水シトラコン酸以外の二官能性リンカー
も、異なる細胞障害性薬剤上に存在する種々の残基に必
要なこと、および細胞障害性薬剤上に存在する付加的な
官能基に必要な化学条件に適応するために用い得る。例
えば、無水シトラコン酸と類似の化学的反応性を示す、
他の酸無水物をも用い得、これには、例えば、無水ジグ
リコール酸、無水ジメチルマレイン酸および無水シスア
コニット酸等が含まれる。これらのリンカーの任意のも
のと免疫受容体上の１級アミンとの反応は、無水シトラ
コン酸の場合と類似であり、無水ジグリコール酸の場合
、下に示す通りである。
【００２７】
【化２】
【００２８】さらに、イソシアネート類およびクロロギ
酸エステル類を含む二官能性リンカーは、１級アミン以
外の化学残基を第２のタイプの化学残基に関して、単官
能性基に変換するのに用い得る。従って、これらの付加
されたリンカーは、単官能性の化学反応性を有する分子
を生成するために用い得る免疫受容体上の可能な化学残
基のタイプを増加させる役割を果たす。使用し得る化学
残基には、炭水化物鎖上のアルデヒド基、チロシンのフ
ェノール性水酸基、およびシスティンのチオール基が含
まれる。使用されるリンカーのタイプは、結合生成に用
いられる細胞障害性薬剤および免疫受容体上に含有され
る官能基に依存し、そしてまた、交差反応し得る両分子
上の付加的な官能基にも依存する。当業者は、単官能性
の化学反応基を有する所望の免疫受容体を生成するため
に、化学反応およびリンカーを選択し得る。
【００２９】本発明は、二官能性リンカーを介して細胞
障害性薬剤と結合した免疫受容体を提供し、そしてこの
ような免疫結合体を製造する方法をも提供する。二官能
性リンカーは１つの官能基を介して免疫受容体上の１つ
のクラスの化学残基に結合し、そして免疫受容体上のも
のとは異なるクラスの化学残基である第２の官能基を有
し、単官能性の化学反応基を有する免疫受容体を形成す
る。この単官能性化学反応基は細胞毒と結合し、構造Ｉ
−Ｌ−Ｘの免疫結合体を形成する。ここでＩは免疫受容
体、Ｌは二官能性リンカー、Ｘは細胞毒である。この免
疫結合体は、未結合の免疫受容体と実質的に同等の特異
性を有することを特徴とする。
【００３０】好ましい実施態様では、免疫受容体は、モ
ノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体からなる
群から選択される。
【００３１】好ましい実施態様では、二官能性リンカー
が、酸無水物、イソシアネート類およびクロロギ酸エス
テル類からなる群から選択される。
【００３２】好ましい実施態様では、免疫受容体上の化
学残基のクラスが、１級アミン、カルボキシル基、フェ
ノール性水酸基、およびチオール基からなる群から選択
される。
【００３３】好ましい実施態様では、免疫受容体上のク
ラスと異なるクラスの化学残基が、１級アミン、カルボ
キシル基、フェノール性水酸基、およびチオール基から
なる群から選択される。
【００３４】上記の単官能性化学反応基を含有する免疫
受容体−リンカー化合物は種々の細胞障害性薬剤と反応
させ、所望の標的細胞に特異的で、標的細胞を破壊する
のに有用な免疫結合体が製造され得る。ドキソルビシン
（ＤＸＲ）およびダウノルビシンは非常に強い細胞障害
性薬剤の一例である。他の細胞障害性薬剤も本発明に使
用し得、当業者には公知である。ＤＸＲおよび官能基と
して１級アミンを含有する他の細胞障害性薬剤を、免疫
受容体−リンカー化合物に結合させることは、次式（化
３）によって行われる。
【００３５】
【化３】
【００３６】ここで、化合物Ｉは、免疫受容体−無水シ
トラコン酸リンカー複合体、Ｈ２Ｎ−ＤＸＲは、ドキソ
ルビシンの１級アミン残基、および化合物ＩＩは、対応
するＩ−Ｌ−Ｘ免疫結合体を表している。
【００３７】最終目標に至るには、種々の化学的経路が
あるが、統一した概念は、まずＭＡｂをリンカー分子の
付加により単官能性の反応性分子に変換し、次に薬剤分
子上の所望の化学残基と反応させるために修飾するか活
性化するかあるいは直接用い得るというものである。こ
の結合方法の最も好ましい実施態様は、酸無水物リンカ
ーとの反応を介してＭＡｂ上のリジンのアミノ基の修飾
を行い、反応性のカルボキシル基を有するＭＡｂ−Ｌ複
合体を生成させる。薬剤と直接にあるいは活性化した後
に反応させ得る点からは、この複合体は単官能性である
。カルボキシル基は、アミノ基よりも、ずっと優先的に
反応し得るためである。薬剤との反応が、より完全に進
行し、副反応および架橋反応が少なくなるという結果に
なる。
【００３８】上記の好ましい方法および逆の方法、即ち
、リンカーを薬剤に結合し、その後にＭＡｂと反応させ
ること、のどちらがよいのか見分ける方法はこれまでに
はない。しかし、本発明に至る実験により、ここに詳細
を記載した方法が著しく有利であることが示された。逆
の方法で行うと、エステルおよび全ての反応可能な官能
基で結合している結合体の混合物を生成する過剰の副反
応が起こる結果になる。得られた生成物は高度の沈澱し
た産物（主に架橋したＭＡｂ多量体）および不活性の結
合物のため、特異的活性が低い。本発明に記載の好まし
い方法で行うと、全体的な収量がより高く、特異活性の
より高い生成物が得られ、従って、ＭＡｂ−薬剤結合体
を生成させる従来の方法よりも明らかに有利である。
【００３９】本発明はさらに、酸に対し不安定な二官能
性リンカーを提供する。免疫受容体に細胞障害性薬剤を
結合させるのに用いた場合、上記リンカーの全ては、血
液および細胞外マトリックス中の生理的条件下では安定
であるが、リソソーム内の約４という低ｐＨ中では不安
定である。酸性条件下で免疫受容体−無水シトラコン酸
リンカー免疫結合体からＤＸＲが放出されるメカニズム
を次式に示す。
【００４０】
【化４】
【００４１】免疫受容体が標的細胞表面上の抗原に結合
すると、貪食作用を介して、免疫受容体は複合している
物質とともに細胞内へ取り込まれる。貪食されると、本
発明にあるような免疫結合体は、細胞間のリソソーム部
位へ向かう。この部位のｐＨは酸性で、巨大分子の分解
を補助する。細胞障害性薬剤の、酸分解性リンカーによ
る結合は有益である。この部位の中に入れば、細胞障害
性薬剤が放出され、意図される機能を自由に発揮できる
ためである。同様に、例えば、酵素的に分解可能なリン
カーもまた使用し得る。このようなリンカーには、プロ
テアーゼで分解され得るペプチドリンカーが含まれる。 この細胞間輸送メカニズムは、不安定でないリンカー分
子を用いるよりも迅速で効果的である。
【００４２】本発明のＩ−Ｌ化合物およびＩ−Ｌ−Ｘ免
疫結合体は全て、免疫反応性および結合特異性を保持し
た条件下で反応させる。未結合の免疫受容体と比べて高
い水準の活性および特異性を残存しているのは、まず免
疫受容体上に単官能性の化学反応基を生成させたためで
ある。
【００４３】さらに、当業者は、免疫受容体の結合ポケ
ットを保護する条件下でリンカーと薬剤とを結合させる
ことにより、免疫反応性および特異性を保証し得る。例
えば、活性の損失を引き起こす前記の免疫受容体の架橋
および沈澱に加えて、免疫受容体の結合ポケット内の残
基がリンカーあるいは細胞障害性薬剤と結合を形成し得
る。結合ポケット内の残基を介して単官能性の化合物あ
るいは免疫結合体を形成すると、免疫反応性の欠如を招
き得る。これらの残基が、抗原の認識および抗原との結
合に必要であり得るからである。この問題は、まず抗原
と結合させた免疫受容体にリンカーおよび細胞障害性薬
剤を結合させることにより、克服し得る。抗原により結
合ポケットを保護することで、リンカーと結合形成可能
な任意の化学残基が、物理的な結合形成から保護される
。例えば、抗原が結合した溶液中の免疫受容体、不溶性
担体上の抗原と結合した免疫受容体、あるいは参考とし
てここに援用する米国特許出願第０７／４１９，３３７
号に記載の界面濃縮技術を用いて、化学反応を行い得る
。これらの方法は当業者に公知である。
【００４４】本発明は、標的細胞へ細胞障害性薬剤を運
搬する方法および、標的細胞または哺乳類動物に治療有
効量の構造Ｉ−Ｌ−Ｘである免疫結合体を投与すること
により、腫瘍の成長を抑制する方法をも提供している。 ここで、Ｉは標的細胞あるいは腫瘍細胞抗原に選択的に
結合する免疫受容体であり、Ｌは１つの官能基を介して
免疫受容体上の１つのクラスの化学残基に結合し、そし
て免疫受容体上にあるものとは異なるクラスの化学残基
を有する第２の官能基を含有し、単官能性の化学反応基
を有する免疫受容体を形成する二官能性リンカーである
。この単官能基を細胞障害性薬剤と結合させ、未結合の
免疫受容体と実質的に同等の特異性を有することを特徴
とする免疫結合体を生成させた。
【００４５】細胞障害性薬剤とは、細胞に対し、直接細
胞障害性作用を示す物質、あるいは生体中で細胞に対し
細胞障害性作用を示す物質に変換し得る物質である。こ
のような細胞障害性薬剤の例としては、ドキソルビシン
、ダウノルビシン、およびアクチノマイシンＤがある。 これらの薬剤は、細胞表面抗原に対して特異的な全ての
免疫受容体に結合し得る。標的抗原としては、例えば、
ウィルス抗原、あるいはバクテリア抗原が包含され得る
。細胞障害性薬剤誘導体は、希望する標的特異性を有す
る全ての抗体あるいは抗体のフラグメントとも結合する
一般薬剤（ｇｅｎｅｒａｌ　ａｇｅｎｔ）として調製し
得る。この誘導体はまた、Ｔ細胞受容体のような他のタ
イプの標的細胞結合タンパク質とも結合するように調製
し得る。 これらのタイプのタンパク質は全て、特定の標的細胞抗
原に対し、特異的に結合する。
【００４６】本発明の免疫結合体は、標的細胞に対して
細胞障害作用を与えるために使用され得る。例えば、組
織中のＴ細胞あるいはＢ細胞のような特定の細胞集団を
破壊するために、免疫結合体を使用することが可能であ
る。このことは、所望のＴ細胞あるいはＢ細胞の集団に
対して特異的結合を示す免疫受容体に細胞障害性薬剤を
結合させることによりなされる。同様にして、培養物中
の汚染している細胞集団から特定の細胞タイプを精製し
得る。このことは、汚染物質である細胞タイプに対して
結合特異性をもつ免疫受容体を含有する免疫結合体で培
養物を処理することによりなされる。従って、本発明は
、標的細胞に対し選択的結合性を示す免疫結合体を、有
効量標的細胞に投与することにより、標的細胞に細胞障
害効果を与える方法を提供している。免疫結合体は、薬
学的に許容し得る担体に結合させ得る。
【００４７】以下の実施例は、発明を説明するためのも
のであり、発明を限定するものではない。
【００４８】
【実施例】（実施例１） （無水ジグリコール酸リンカーを介した、モノクローナ
ルＡｂＫＳ−１／４のドキソルビシンへの結合）ドキソ
ルビシン（ＤＸＲ）へのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）
ＫＳ−１／４の結合は、二段階の過程で行った。まず、
ＫＳ−１／４はリジン残基を介して二官能性リンカーで
ある無水ジグリコール酸（ＤＧＡ）と結合させ、抗体−
リンカー複合体（ＭＡｂ−Ｌ）を生成させた。６ｍｌの
ＫＳ−１／４（１６．９ｍｇ／ｍｌ）溶液をｐＨ９．３
に調整し、攪拌しながら、１８ｍｇの固体のＤＧＡを加
えた。 全ての結晶が溶解するまでｐＨを再調整し、ｐＨ９．０
とした。溶液はその後さらに３０分攪拌し、最終的にｐ
Ｈ８．１となった。Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｐｌｅａｓａｎ
ｔ　Ｈｉｌｌ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いて、製造元の
指示に従って、出発物質および生成物を等電点電気泳動
し、反応をモニターした（図１参照）。結合前にｐＩ６
．８であったＫＳ−１／４（レーン１および２）の等電
点が、結合後（レーン３および４）では、ｐＩ５．４に
定量的に変化しているのが観察された。
【００４９】別の一連の反応では、上記ＭＡｂ−Ｌ複合
体へのＤＸＲの結合の、その他の条件を検討した。
【００５０】（ａ）　　ＭＡｂ−Ｌ溶液のｐＨを６．１
に下げ、２ｍｇの固体のＤＸＲを加え、その後２ｍｇの
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミド塩酸塩（ＥＣＤＩ）を加えた。反応混合物は
、さらに３０分間攪拌した。最終生成物（ＭＡｂ−Ｌ−
ＤＸＲ）の精製は、セファデックスＧ−２５を用いたゲ
ル濾過により行った（ＮＡＰ−５カラムを製造元の指示
に従って用いた；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｐｌｅａｓａ
ｎｔ　Ｈｉｌｌ，　ＣＡ，　ＵＳＡ，カタログＮｏ．１
７０８５３−０１）。精製した結合物は実施例３に記載
の通り、薬剤と抗体の比が３．９であった。
【００５１】（ｂ）　　ＭＡｂ−Ｌ結合体溶液（１０ｍ
ｇ／ｍｌ濃度のもの１ｍｌ）の別の一部をｐＨ５．８に
調整した後、２ｍｇのＥＣＤＩを加えた。清澄で無色の
溶液をｐＨが６．４５で安定化するまで、４５分間攪拌
した。前もってｐＨを６．０に調整した後、２ｍｇのＤ
ＸＲ塩酸をＮ−メチルピロリドンに溶解した溶液を（２
０μｌずつ３回に分けて）加えた。この清澄で赤レンガ
色の溶液をｐＨが６．６になるまで１時間攪拌した。生
成物（０．５ｍｌを１．０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ）で希釈したもの）を前述のように、セファデック
スＧ−２５を用いて精製した。図２はＭＡｂ−ＬへのＤ
ＸＲの結合を示したものである。最終生産物の２００か
ら６００ｎｍの間の波長における紫外吸収曲線を示して
いる。精製した生産物の二つのピークはそれぞれの構成
成分（即ち、抗体の吸収極大＝２８０ｎｍ，およびＤＸ
Ｒの吸収極大＝４８５ｎｍ）の吸収極大に対応している
。
【００５２】（ｃ）　　ＭＡｂ−Ｌ溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ濃度のもの１．１ｍｌ）のｐＨを５．８に調製した後
、１０ｍｇの前記ＥＣＤＩを加えた。１．５時間反応さ
せた後、３μｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）で中和し
た２．５ｍｇのＤＸＲの溶液８０μｌ）を加えた。３０
分後、この試料のうち、１００μｌをセファデックスＧ
−５０（ＮＩＣＫカラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，　Ｐｌ
ｅａｓａｎｔ　Ｈｉｌｌ，　ＣＡ，　ＵＳＡ，カタログ
Ｎｏ．７０８５５０９１を製造元の指示に従って使用し
た）を用いてゲル濾過し精製した。精製した結合体の２
００から６００ｎｍの間の吸収曲線は上記（ｂ）に記述
したのと同様に分析した。２８０ｎｍと４８５ｎｍにピ
ークが観察され、ＭＡｂ−Ｌ複合体にＤＸＲが化学的に
結合していることが示された。
【００５３】これらの３種類の反応条件のうち、（ｃ）
に記述した方法が、薬剤／抗体モル比が一番高い結果と
なったことから、好ましい。
【００５４】（実施例２） （無水ジグリコール酸を介したモノクローナル抗体ＬＭ
６０９とドキソルビシンの結合）モノクローナル抗体Ｌ
Ｍ６０９を、実施例１に記載したのと類似の反応条件下
で、リンカー分子の無水ジグリコール酸（ＤＧＡ）と反
応させた。 まず、ＬＭ６０９（１１．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもの１．
６ｍｌ）のｐＨを１０．５に調整した。１ＮのＮａＯＨ
でｐＨを９．０に保ちながら、２４ｍｇのＤＧＡを加え
た。室温で１時間インキュベートし、実施例１と同様に
セファデックスＧ−２５を用いたゲル濾過で精製し、Ｍ
Ａｂ−Ｌ複合体の溶液を得た。精製した生成物のｐＨを
５．５に調整し、３００倍過剰（７ｍｇ）のＥＣＤＩと
９０分間反応させた。３０倍過剰（２ｍｇ）のＤＸＲを
ＭＡｂ−Ｌ複合体に加えた。添加の前に、２ｍｇのＤＸ
Ｒを１μｌのＴＥＡを含むジメチルアセトアミド９９μ
ｌに溶解した。反応は室温で行い、その様子は図３に示
す。ＤＸＲの添加により溶液のｐＨは６．７へ急激に上
昇し、精製用に０．５ｍｌを取り出した。得られたＭＡ
ｂ−Ｌ−ＤＸＲ複合体は実施例１の記載の通りＧ−２５
を用いたゲル溶出クロマトグラフィーにより精製した。
【００５５】（実施例３） （無水シトラコン酸リンカー部分を介したＤＸＲとＬＭ
６０９の結合）本実施例では、ＤＸＲをモノクローナル
抗体ＬＭ６０９に結合させる化学残基として、無水シト
ラコン酸を用いた。無水シトラコン酸をＭＡｂに結合す
るための至適モル比を決定するために同時に数種類の反
応を行った。即ちＬＭ６０９に対して、（ａ）５０倍、
（ｂ）１００倍、（ｃ）２００倍及び（ｄ）５００倍の
過剰の無水シトラコン酸を加えた。具体的には１ｍｌ（
１０．５ｍｇ）のＬＭ６０９に対して、それぞれ、（ａ
）０．３８ｍｇを含む５μｌ、（ｂ）０．７６ｍｇを含
む１０μｌ、（ｃ）１．５１ｍｇを含む２０μｌ、そし
て（ｄ）３．７９ｍｇを含む５０μｌの無水シトラコン
酸（ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）保存溶液）を加
えた。 これらはｐＨ９．３〜９．８で混合し、そして混合後に
ｐＨを８．７〜９．２に調整した。ｐＨを９．０より下
に保持しながら１時間、室温で反応を続けた。生成物は
実施例１と同様にセファデックスＧ−５０を用いたゲル
濾過により精製した。
【００５６】活性化および引き続くＤＸＲとの結合のた
めに、上記の各ＭＡｂ−Ｌ複合体を過剰のＥＣＤＩと反
応させた。即ち、上記４種の溶液全てに１．５ｍｇのＥ
ＣＤＩを加え、ｐＨが８．０になるまで２時間反応させ
た。ＤＸＲ５ｍｇを２μｌのＴＥＡを含む２００μｌの
Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、上記４種の
ＭＡｂ−Ｌ溶液に５０μｌづつ加えた。ｐＨは７．４〜
７．２に下がった。一晩、室温で反応を行った。インキ
ュベート後２時間後から沈澱物が視認できるようになり
、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により回収した。
【００５７】結合の割合を測定するために、４８５ｎｍ
および２８０ｎｍの吸光度を調べその比率を計算した。 表１に４種類の条件における薬剤−抗体結合比率（Ａｂ
ｓ２８０／Ａｂｓ４８５）を示した。使用した全ての無
水シトラコン酸の割合においてＤＸＲとＬＭ６０９との
結合が観察された。最適モル比は第３の反応（２００分
子のリンカーと１分子の抗体）で得られた。
【００５８】
【表１】
【００５９】（実施例４） （無水シトラコン酸を介したＤＸＲとモノクローナル抗
体９．２．２７との結合）モノクローナル抗体９．２．
２７の溶液３ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）を１ＮのＮａＯＨ
でｐＨ９．５に調整した。３５μｌの無水シトラコン酸
（１３６倍過剰）のＮＭＰ保存溶液を添加する間、ｐＨ
は９．０に保持した。５分後、ｐＨは８．５に下がった
。 この清澄な溶液をさらに１時間攪拌し、得られたＭＡｂ
−Ｌ生成物は実施例１と同様にＧ−２５を用いたゲル濾
過クロマトグラフィーにより精製した。
【００６０】ＤＸＲのＭＡｂ−Ｌ複合体への結合および
活性化のために、上述の精製したＭＡｂ−Ｌ複合体の２
．９ｍｌをｐＨ６．０に調整し、その後３．３ｍｇのＥ
ＣＤＩを添加した。２時間室温で攪拌しながら反応を行
った。２５倍モルの過剰量のＤＸＲを加えた。赤い清澄
な溶液を１８時間室温で反応させた。 最終生成物ＭＡｂ−Ｌ−ＤＸＲと他の夾雑物を分離する
ために他の実施例同様Ｇ−２５を用いたクロマトグラフ
ィー分離を行った。
【００６１】ＤＸＲのＭＡｂ−Ｌ複合物への結合の反応
速度を調べるために同時に一連の結合実験を行った。本
実施例では、上述のように調製したＭＡｂ−Ｌ複合体に
３．９ｍｇのＥＣＤＩを加え、そして反応をｐＨ７．５
、１２℃で行った。図４に結合反応の経時反応曲線を示
した。反応の割合は各測定時間におけるＡ２８０／Ａ４
８５比率により求められた。図４は、最初の４時間以内
に反応の７５％が完了していることを示している。
【００６２】（実施例５） （ＥＬＩＳＡによる結合抗体の免疫反応性測定）９．２
．２７とＤＸＲの結合抗体（実施例４で得られたＭＡｂ
−Ｌ−ＤＸＲ生成物）が、結合活性および抗原特異性を
保持しているかどうかを確認するため、メラノーマ細胞
株Ｍ２１を用いＥＬＩＳＡを行った（図５）。この細胞
株は、モノクローナル抗体９．２．２７により認識され
る特異的抗原を発現している。
【００６３】対数増殖期にある適切な細胞株を１ｍＭ　
ＥＤＴＡを用いて回収した。細胞は１０００×ｇで遠心
分離し、１×ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットは１
×１０６細胞／ｍｌになるように１×ＰＢＳに再懸濁し
た。１２連のマイクロピペッターを用い、９６ウェルの
フレキシブルプレート（ファルコン＃３９１２，Ｂｅｃ
ｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　＆　Ｃｏ．，　Ｐａｌｏ
　Ａｌｔａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）に各ウェルに５０μｌ
、即ち５×１０４細胞／ウェルずつプレートした。この
９６ウェルプレートを乾燥した３７℃のインキュベータ
ーにウェルが完全に乾くまで３〜５日間入れた。 特異性アッセイに用いる前に、新品のプレートを精製し
たモノクローナル抗体標準品で試験した。
【００６４】上述のように、調製した乾いた細胞付着プ
レート（標的細胞および非標的細胞の両方）を０．５％
のＢＳＡを含有するＰＢＳ（０．５％−ＢＳＡ／ＰＢＳ
）２００μｌでコートした。 プレートを振盪器にのせ、１時間室温においた。さらに
１時間室温でインキュベートした後、以下のように０．
５％−ＢＳＡ／ＰＢＳでプレートを洗浄した。まず、１
回目の洗浄では、３００μｌの０．５％−ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓを加え、すぐに払い落し、テリタオル上に押さえつけ
て乾燥した。残りの洗浄では、３００μｌの０．５％−
ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、室温で３〜５分間インキュベー
トした後、払い落し乾燥した。最後の洗浄の後、テリタ
オル上にプレートを押さえつけて乾燥した。
【００６５】上記の、調製および洗浄のなされたプレー
トに、１０μｇ／ｍｌから１ｐｇ／ｍｌまで系列希釈さ
れた標準試料およびサンプルを１ウェル当り１００μｌ
加えた。サンプルは０．５％−ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈し
た。サンプルは、１時間室温で振盪しながら、インキュ
ベートした。インキュベート後、プレートは上記のよう
に洗浄し、０．５％−ＢＳＡ／ＰＢＳで１：４，０００
に希釈した二次抗体（西洋わさびペルオキシダーゼ結合
のヤギ抗マウス）を１ウェル当り１００μｌ加えた。３
０分間室温で振盪し、抗体を結合させた。プレートを上
述のように再洗浄し、ウェル当り１００μｌのＯＰＤ／
リン酸−クエン酸緩衝液（４０ｍｌのリン酸−クエン酸
緩衝液、１２ｍｇのオルトフェニレンジアミン、６μｌ
のＨ２Ｏ２）を加え、５〜２０分間振盪し、ペルオキシ
ダーゼ染色の発色を行った。４Ｎの硫酸をウェル当り５
０μｌ加え、発色反応を停止させ、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　
ＭｕｌｔｉｓｋａｎＭＣＣ／３４０　ＥＬＩＳＡｒｅａ
ｄｅｒで４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】その結果、未結合およびに結合抗体はとも
に対照の抗体（ＫＳ−１／４）に比べ、Ｍ２１細胞株に
特異的に結合した。さらに、ＭＡｂ−Ｌ−ＤＸＲ結合体
はその機能的活性の殆ど全てを保持しており（図５の９
．７．２７と２６８．６７ｂを比較のこと）、上述の化
学反応過程および残基は、抗原結合性およびに抗原特異
性に好ましくない効果は全く与えていないことを示して
いる。
【００６７】（実施例６） （フローサイトメトリーによる結合抗体の免疫反応性測
定）実施例４で得られた結合抗体の免疫反応性をＡ１７
２およびＴ９８Ｇの神経膠種細胞株をフローサイトメト
リー（ＦＡＣＳ）分析により測定した（図６）。Ａ１７
２は９．２．２７により認識される抗原を発現しており
、Ｔ９８Ｇは９．２．２７とは反応しない。細胞株は下
記のように調製し、ＦＡＣＳ分析に供した。
【００６８】まず、１試料当り５×１０５〜１×１０６
細胞を回収し、コニカルチューブに入れ、氷中に保持し
た。細胞をＰＢＳ／アジド／ＢＳＡ（ＰＢＳ＋０．０２
％−ＮａＮ３＋０．１％−ＢＳＡ）で２回洗浄し、１０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清は完全に吸引除
去した。この細胞ペレットに１００μｌの容量で種々の
濃度のモノクローナル抗体９．２．２７およびそのＤＸ
Ｒ結合体（実施例４の２６８．６７ｄ）を加えた。陰性
対照には、抗体を加えなかった。抗体を細胞とともに氷
中で３０〜６０分間インキュベートした後、上記のよう
に２回ＰＢＳ／アジド／ＢＳＡで洗浄した。最終の遠心
分離の後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，　ＩＮ，ＵＳＡ）を５０倍希釈で１００μｌずつ各
試料に加えた。ＦＩＴＣ結合抗体は暗所で氷中３０〜６
０分間インキュベートした後、ＰＢＳ／アジド／ＢＳＡ
洗浄を２回行った。細胞ペレットは０．５μｌのＰＢＳ
／アジド／ＢＳＡに再懸濁し、丸底試験管に移し換えた
。細胞は０．５％のパラホルムアルデヒドで固定処理を
行った。細胞を予め１ｎｇ／ｍｌより多い濃度のプロピ
ジウム・アイオダイド（Ｓｉｇｍａ，　Ｓｔ．　Ｌｏｕ
ｉｓ，　ＭＯ，　ＵＳＡ）と５分間インキュベートした
後、ＰＢＳ／アジド／ＢＳＡで洗浄することにより、死
細胞はＦＡＣＳ分析では除外した。
【００６９】その結果は、元の抗体およびその結合型共
に抗原発現細胞株に特異的であることを示した。結合抗
体は対照に比べて、８０％の抗原反応性を保持していた
。
【００７０】（実施例７） （ＤＸＲ結合抗体の細胞障害能）細胞株ＤＡＯＹおよび
Ｕ２５１を１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲ
ＰＭＩ組織培養培地中で培養した。１０４個の腫瘍細胞
を１００μｌの容量としてプレートし、抗体結合体と２
時間インキュベートした。その後、プレートを組織培養
培地で３回洗浄し、一晩インキュベートした。各ウェル
に１μＣｉの３Ｈ−チミジンを加え、１６時間インキュ
ベートした後、Ｓｋａｔｒｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｈａｒｖｅ
ｓｔｅｒを装着したガラス繊維フィルター上に細胞を回
収した。このフィルターをＥｃｏｌｕｍｅシンチレーシ
ョン溶液（ＩＣＮ，　Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，　ＵＳＡ）
に入れ、シンチレーションカウンターで計数を行った。 未処理の対照細胞に対する百分率で表した３Ｈ−チミジ
ンの取り込み量を細胞障害能を表すために用いる。結果
を図７に示す。
【００７１】（実施例８） （ヌードマウスに対する結合抗体の細胞障害能）ヌード
マウスＢａｌｂ／ｃ（Ｎｕ／Ｎｕ）（Ｉｍｄｙｎｅ　Ｉ
ｎｃ．，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　ＣＡ，ＵＳＡ）に２
×１０６／ｍｌの濃度のＭ−２１腫瘍細胞を注入した。 免疫結合体の注入前の７日間マウスを生存させた。マウ
スに、食塩水、ＬＭ６０９（未結合の対照）（５００μ
ｇ／２００μｌ）、ＤＸＲ（３０μｇ／２００μｌ）、
ＤＸＲ（３０μｇ／２００μｌ）　＋　ＬＭ６０９（５
００μｇ／１００μｌ）の両方、Ｈ３６−ＤＸＲ（特異
性のない抗体の結合物）（５００μｇ／１００μｌ）、
あるいはＬＭ６０９−ＤＸＲ（特異抗体の複合物）（５
００μｇ／１００μｌ）、の何れかを注入した。インビ
ボの動物腫瘍の研究は、特にＭ−２１細胞株による触知
可能で測定可能な皮膚腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃ（Ｎｕ
／Ｎｕ）無胸腺マウス中で行った。治療開始時には、全
てのマウス上に約３×３ｍｍすなわち９ｍｍ２の触知で
きる測定可能な腫瘍が存在した。次の６種の条件での個
々の実験に各々１０匹のマウスを用いた。すなわち、Ｐ
ＢＳ対照、抗体単独、薬剤単独、Ｍ−２１上の抗原に特
異的な免疫結合体、Ｍ−２１上の抗原に非特異的な免疫
結合体、および抗体と薬剤との組み合わせ、である。各
マウスは週に１度の腹腔注射を２週間受けた。マウスは
毎日元気に生きているかどうか確認した。カリパスを使
って３日毎に腫瘍部断面の最大縦横径を測定した。縦・
横の腫瘍断面最大径の積を求め、腫瘍サイズとして記録
した。その結果を図８にグラフとして示す。対照の注射
をしたマウス群では、腫瘍が２７０ｍｍ２にまで成長し
た。ＬＭ６０９−ＤＸＲの注射をしたマウス群では腫瘍
の成長が著しく妨げられ、治療の２週間後にそのサイズ
は２０−［４０］ｍｍ２であった。
【００７２】現時点での好ましい実施態様を参考に本発
明を記述してきたが、本発明から逸脱することなく、当
業者は容易に種々の応用を実施し得ると理解されるべき
である。従って、本発明は次の特許請求の範囲によって
のみ限定される。
【００７３】本発明では、免疫受容体Ｉおよび免疫受容
体上の１クラスの化学残基に１つの官能基を介して結合
し、免疫受容体上の化学残基とは異なる第２の未結合官
能基を有する二官能性リンカーＬからなる、構造Ｉ−Ｌ
を有する組成物質が提供されている。このＩ−Ｌ組成物
は単官能性の化学反応基を含有し、そして複合していな
い免疫受容体と実質的に同等の特異性およびに免疫反応
性を有することを特徴としている。Ｘが細胞障害性薬剤
である構造Ｉ−Ｌ−Ｘの免疫結合体も提供されている。 このような組成物を製造する方法もさらに提供されてい
る。免疫受容体を介して腫瘍細胞抗原と選択的に結合す
る免疫結合体Ｉ−Ｌ−Ｘを哺乳類動物に治療有効量投与
することにより腫瘍の成長を抑制する方法が提供されて
いる。
【図面の簡単な説明】
【図１】無水ジグリコール酸リンカーへ結合する前（レ
ーン１および２）および後（レーン３および４）のモノ
クローナル抗体の等電点の変化を示している。
【図２】単官能性の化学的に反応し得るモノクローナル
抗体−リンカー複合体へのＤＸＲの結合を示している。
【図３】ＤＸＲのモノクローナル抗体−無水ジグリコー
ル酸リンカー複合体に対する反応の進行を示している。
【図４】ＤＸＲのモノクローナル抗体−無水シトラコン
酸リンカー複合体に対する反応の進行を示している。
【図５】非結合の抗体（白丸）、結合抗体（黒丸）およ
び非結合の非特異性のない抗体（四角）の免疫反応性を
示している。
【図６】フローサイトメトリーで測定した、標的細胞Ａ
１７２に対する、非結合の抗体（白丸）、および結合抗
体（黒丸）、および標的でない細胞Ｔ９８６に対する非
結合の抗体（三角）、および結合抗体（四角）の免疫反
応性を示している。
【図７】ＤＸＲ単独での、ＤＡＯＹ（Ｘ）細胞株および
Ｕ２５１（ｔ）細胞株に対する細胞障害性、並びに結合
抗体のＤＡＯＹ（丸）細胞株、およびＵ２５１（四角）
細胞株に対する細胞障害性を示している。
【図８】ＤＸＲ免疫結合体を用いたヌードマウスの腫瘍
細胞に対する標的付けを示しており；食塩水対照（黒丸
）；非結合のＬＭ６０９モノクローナル抗体（白丸）；
ＤＸＲ単独（白四角）；ＤＸＲおよびＬＭ６０９（黒四
角）；非特異性の抗体との結合したＤＸＲ（Ｈ３６−Ｄ
ＸＲ，（三角））、およびＬＭ６０９−ＤＸＲ免疫結合
体（Ｘ）である。

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　構造Ｉ―Ｌを含む組成物質であって：
    Ｉは、免疫受容体；およびＬは、該免疫受容体上のある
    クラスの化学残基に１つの官能基を介して結合している
    二官能性リンカーであって、該免疫受容体上の化学残基
    とは異なるクラスの第２の未結合官能基を有する、二官
    能性リンカー；である、複合していない免疫受容体と、
    実質的に同等の特異性および免疫反応性によって特徴づ
    けられる、単官能性の化学反応基を有する、組成物質。
  2. 【請求項２】　　前記免疫受容体が、モノクローナル抗
    体あるいはポリクローナル抗体からなる群から選択され
    る、請求項１に記載の組成物質。
  3. 【請求項３】　　前記二官能性リンカーが、酸無水物、
    イソシアネート類およびクロロギ酸エステル類からなる
    群から選択される、請求項１に記載の組成物質。
  4. 【請求項４】　　前記免疫受容体上の化学残基のクラス
    が、１級アミン、カルボキシル基、フェノール性水酸基
    およびチオール基からなる群から選択される請求項１に
    記載の組成物質。
  5. 【請求項５】　　前記免疫受容体上のクラスと異なるク
    ラスの化学残基が、１級アミン、カルボキシル基、フェ
    ノール性水酸基、およびチオール基からなる群から選択
    される、請求項１に記載の組成物質。
  6. 【請求項６】　　構造Ｉ―Ｌ−Ｘを含む組成物質であっ
    て、Ｉは、免疫受容体；Ｘは、細胞障害性薬剤；および
    Ｌは、該免疫受容体上のあるクラスの化学残基に１つの
    官能基を介して結合している二官能性リンカーであって
    、該免疫受容体上の化学残基とは異なるクラスの第２の
    未結合官能基を有する、二官能性リンカー；であり、該
    二官能性リンカーは、単官能性の化学反応性基を有する
    該免疫受容体上に結合しており、該単官能性の化学反応
    性基がＸに結合する、結合していない免疫受容体と実質
    的に同等の特異性および免疫反応性によって特徴づけら
    れる、組成物質。
  7. 【請求項７】　　前記免疫受容体が、モノクローナル抗
    体あるいはポリクローナル抗体からなる群から選択され
    る、請求項６に記載の組成物質。
  8. 【請求項８】　　前記二官能性リンカーが、酸無水物、
    イソシアネート類およびクロロギ酸エステル類からなる
    群から選択される、請求項６に記載の組成物質。
  9. 【請求項９】　　前記化学残基のクラスが、１級アミン
    、カルボキシル基、フェノール性水酸基、およびチオー
    ル基からなる群から選択される、請求項６に記載の組成
    物質。
  10. 【請求項１０】　　前記免疫受容体上のクラスと異なる
    クラスの化学残基が、１級アミン、カルボキシル基、フ
    ェノール性水酸基、およびチオール基からなる群から選
    択される、請求項６に記載の組成物質。
  11. 【請求項１１】　　免疫受容体リンカー複合体を製造す
    る方法であって、二官能性リンカーを、免疫受容体上の
    あるクラスの化学残基に、１つの官能基を介して結合さ
    せる工程を含み、該二官能性リンカーは、該免疫受容体
    上のクラスと異なるクラスの化学残基である第２の官能
    基を有し、複合していない免疫受容体と実質的に同等の
    特異性および免疫反応性を有することを特徴とする、単
    官能性の化学反応基を有する、免疫受容体を形成する、
    方法。
  12. 【請求項１２】　　前記免疫受容体が、モノクローナル
    抗体およびポリクローナル抗体からなる群から選択され
    る、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】　　前記二官能性リンカーが、酸無水物
    、イソシアネート類、およびクロロギ酸エステル類から
    なる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】　　前記免疫受容体上の化学残基のクラ
    スが、１級アミン、カルボキシル基、フェノール性水酸
    基およびチオール基からなる群から選択される、請求項
    １１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】　　前記免疫受容体上のクラスと異なる
    クラスの化学残基が、１級アミン、カルボキシル基、フ
    ェノール性水酸基およびチオール基からなる群から選択
    される、請求項１１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】　　免疫結合体の製造方法であって、（
    ａ）　　二官能性のリンカーを免疫受容体上のあるクラ
    スの化学残基に、１つの官能基を介して結合させる工程
    であって、該二官能性リンカーが、該免疫受容体上の化
    学残基とは異なるクラスの第２の官能基を有し、単官能
    性の化学反応性基を有する免疫受容体を製造する、工程
    ；および（ｂ）　　該単官能性の化学反応性基へ細胞障
    害性薬剤を結合させ、構造Ｉ―Ｌ―Ｘを有する免疫結合
    体を製造する工程であって、Ｉは免疫受容体であり、Ｌ
    は二官能性リンカーであり、そしてＸは細胞障害性薬剤
    であり、該免疫結合体は、結合していない免疫受容体と
    実質的に同等の特異性および免疫反応性を有することを
    特徴とする、工程；を含む、方法。
  17. 【請求項１７】　　前記免疫受容体が、モノクローナル
    抗体あるいはポリクローナル抗体からなる群から選択さ
    れる、請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】　　前記二官能性リンカーが、酸無水物
    、イソシアネート類およびクロロギ酸エステル類からな
    る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  19. 【請求項１９】　　前記免疫受容体上の化学残基のクラ
    スが、１級アミン、カルボキシル基、フェノール性水酸
    基およびチオール基からなる群から選択される、請求項
    １６に記載の方法。
  20. 【請求項２０】　　前記免疫受容体上にあるクラスと異
    なるクラスの化学残基が、１級アミン、カルボキシル基
    、フェノール性水酸基およびチオール基からなる群から
    選択される、請求項１６に記載の方法。
  21. 【請求項２１】　　前記免疫受容体を介して、腫瘍細胞
    抗原と選択的に結合する請求項６に記載の組成物質を、
    哺乳類動物に治療上有効量投与することにより、腫瘍の
    成長を抑制する方法。
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