KR910000029B1 - 효소와 항체의 공유 결합에 의해 결합된 접합체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

효소와 항체의 공유 결합에 의해 결합된 접합체의 제조방법
제1도는 실시예 2에 따라 측정된 "IC 50"을 나타내는 도면이다.
제2도는 실시예 4에 따라 측정된 "IC 50"을 나타내는 도면이다.
본 발명은 효소와 항체의 공유 결합에 의해 결합된 신규 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따라 얻어진 신규 생성물은 특정 효소와 표적 세포에 의해 운반된 항원에 대항하는 항체 또는 항체의 단편을 공유 결합시킴으로써 제조된 접합체이다.
이 화합물은 하기에 면역 효소적 접합체로 명명한다.
이 면역 효소적 접합체는 효소가 표적 세포에 의해 운반된 항원에 대항하는 항체와 공유 결합에 의해 결합된 인공의 혼합된 분자이다.
사용된 효소는 공지의 화합물이다. 사용된 항체는 동물에 공지의 면역을 시킴으로써 얻어진 것이라면 다클론성 항체이며, 림파구와 골수종 세포 사이의 융합으로 얻어진 혼성 세포의 클론에 의해 생산된 것이라면 단클론성 항체이다. 상술한 항체는 선택된 항원을 인지할 수 있는 능력을 가진 면역 글리부린의 분자 전체로써 또는 선택된 항원을 인지할 수 있는 능력을 가진 면역 글로부린 분자의 단편 특히 F(ab')2, Fab 및 Fab'로 공지된 단편으로써 사용될 수 있다.
항체(또는 항체의 단편)와 효소의 화학적 결합은 접합체의 두성분 즉 항체와 효소의 생물적 활성을 보존하며, 만족스런 재생산성 및 바람직한 결합 수율을 나타낼 수 있으며, 생성된 접합체에 있어 효소/항체 비율을 조절할 수 있으며, 안정성 있고 수용성의 생성물을 제조할 수 있는 조건을 가진 많은 방법에 의해 수행될 수 있다.
이런 조건을 갖춘 방법들 중에서, 가장 편리한 방법은 하나이상의 티올기를 사용하여 두 단백질 사이의 결합을 수행하는 것이다. 이 티올기는 결합될 단백질중 하나에 속해 있거나 또는 티올을 포함하지 않은 단백질에 인공적으로 도입된 것일 수 있다.
하나 이상의 티올기를 단백질에 인공적으로 도입하려면, 단백질의 아미노기를 아실화할 수 있는 S-아세틸 메르캡토숙신산 무수물을 상기 단백질에 작용시킨다. 그러므로, 티올기는 "생화학 및 생체 물리의 보고(ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS) 119, 41-49, (1967)"에 기재된 바와 같이 히드록실아민을 작용시켜 보호아세틸기를 제거함으로써 나타난다. 투석은 저분자량의 반응 생성물뿐만 아니라 과량의 시약도 제거할 수 있다. 문헌에 기재된 다른 방법들도 결합될 하나의 단백질에 티올기를 도입하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, 하나 이상의 티올기를 함유하는 두 단백질은 티올과 반응할 수 있는 하나 이상의 기를 미리 도입한 다른 단백질과 액체 매질, pH 5~9 및 30℃를 넘지 않는 온도에서 반응하여 안정한 특정 공유 결합을 나타낸다. 상기 공유 결합은 특히 디설파이드 결합 또는 티오에테르 결합일 것이다. 하기에서, P1은 티올기 또는 티올기류를 운반하는 두 단백질을 나타내며, P2는 결합될 다른 단백질을 나타낸다.
1) 디설파이드 결합의 경우 :
접합체의 제조는 하기 도식에 의해 나타낼 수 있다.
Figure kpo00001
상기식에서 -S-S-X는 X가 활성제 기인 활성화 혼합된 디설파이드기를 나타낸다.
활성화 황원자에 의해 치환된 단백질 P2는 하기 도식에 따라 시약, 즉 활성화 황원자의 담체 그 자체를 가하여 치환시킴으로써 단백질 P2그 자체로부터 얻어진다.
Figure kpo00002
상기식에서 P2는 치환된 단백질이며, Y는 단백질에 시약을 공유 고정시키는 기이다. R은 치환체 Y와 -S-S-X를 동시에 운반하는 기이며, X는 활성제기이다.
관능기 Y는 치환된 단백질을 구성하는 아미노산의 측쇄에 의해 운반되는 기중의 어떤 것과 공유 결합할 수 있는 기이다. 이들중에서, 단백질에 포함된 리실기의 말단 아미노기는 특히 주목된다.
이 경우에 Y는 특히 -카르보디이미드와 같은 결합제 및 특히 1-에틸-3-(3-디에틸-아미노프로필)카르보디이미드와 같은 수용성 유도체의 존재하 단백질의 아미노기와 결합할 수 있는 카르복실기, -아미노기와 직접 반응하여 이들을 아실화시킬 수 있는 카르복실산의 염화물, -아미노기와 직접 반응하여 이들을 아실화시킬 수 있는 오르토- 또는 파라-, 니트로- 또는 디니트로-페닐의 에스테르 또는 N-히드록시 숙신이미드의 에스테르와 가은 소위 "활성화"에스테르, -아민기와 자발적으로 반응ㅎ여 아미드 결합을 하는, 예를 들면 숙신산 무수물과 같은 카르복실이산의 내부 무수물, - 아미도에스테르기
Figure kpo00003
(식중, R1은 반응
Figure kpo00004
에 따라 단백질의 아미노기와 반응하는 알킬기이다)를 나타낸다.
-S-S-X기는 유리 티올기와 반응할 수 있는 활성화 혼합디설파이드로 정의된다. 특히 이 혼합 디설파이드에 있어서, X는 하나 이상의 알킬, 할로겐, 카르복실기에 의해 치환될 수 있는 2-피리딜 또는 4-피리딜기로 정의된다. X는 또한 하나 이상의 니트로- 또는 카르복실기에 의해 치환된 페닐기이다. 또한 X는 메톡시카르보닐기와 같은 알콕시카르보닐기를 나타낼 수 있다.
R기는 치환체 Y 및 S-S-X를 동시에 운반할 수 있는 기로 정의된다. 또한 사용된 시약과 합성된 생성물이 반응을 방해할 수 없는 것으로 선택되어야 한다.
특히, R기는 n이 1~10인 -(CH2)n기 또는
Figure kpo00005
기일 수 있다.
상기식에서 R4는 수소 또는 1~8탄소원자를 가진 알킬기이며, R3는 카르바메이트기(
Figure kpo00006
; R5는 1~5탄소원자를 가진 직쇄 또는 측쇄알킬기 특히 터시오부틸(tertiobutyl기)로 정의됨)와 같은 사용된 시약에 대해 불활성인 치환체로 정의된다.
화합물 Y-R-S-S-X와 단백질 P2의 반응은 물 또는 완충용액과 같은 균일한 액상에서 수행된다. 시약의 용해도를 맞출때 알콜 및 특히 3급 부탄올과 같은 물에 잘 혼화되는 유기용매를 20부피 %이하로 반응 매질에 가할 수 있다.
이 반응은 수~24시간의 유동적 시간동안 주위온도에서 수행된다. 그리고난후 저분자량의 생성물 및 특히 과량의 시약을 제거하기 위해 투석을 한다. 이 방법은 단백질의 몰당 1~15의 치환기를 도입할 수 있게 한다.
이런 화합물을 사용하여, 단백질 P1과의 결합은 수~24시간의 유동적인 시간동안 30℃를 넘지 않는 온도에서 수용액중에 두 단백질을 넣음으로써 수행된다. 얻어진 용액을 투석하여 저분자량의 생성물을 제거하고, 접합체는 각종 공지의 방법에 의해 정제한다.
2) 티오에테르 결합의 경우 :
접합체의 제조는 P1-SH를 말레이미드기가 미리 도입된 단백질 P2와 반응시키는 것이다.
Figure kpo00007
상기식에서 Z는 1~10탄소원자를 가진 지방족 또는 방향족 공간 구조이다.
말레이미드가 치환된 단백질 P2는 하기 도식에 따라 말레이미드기의 담체 그 자체의 시약을 가하여 단백질의 아미노기를 치환함으로써 단백질 P2그 자체로부터 얻어진다.
Figure kpo00008
상기식에서 Y는 : -카르복실기, 반응은 카르보디이미드와 같은 결합제 및 특히 1-에틸 3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드와 같은 수용성 유도체의 존재하 카르복실기를 활성화한 후 수행됨.
-또는 아미노기와 자발적으로 반응하여 이들을 아실화하는 오르토- 또는 파라-, 니트로- 또는 디니트로페닐의 에스테르, 또는 N-히드록시 숙신이미드의 에스테르와 같은 소위 "활성화"에스테르를 나타낸다.
이 시약의 제조는 특히 헬베티칼 키미카 액타(Helvetical Chimica Acta) 58, 5" 1-541, (1975)에 기재되어 있다. 같은 류의 다른 시약들은 시장에서 구입할 수 있다.
화합물
Figure kpo00009
와 단백질 P2의 반응은 물 또는 완충용액과 같은 균일한 액상에서 수행된다. 시약의 용해도를 맞출때, 알콜 및 특히 3급 부탄올과 같은 물에 잘 혼화되는 유기 용매를 20부피 %이하로 반응매질에 가할 수 있다.
반응은 수~24시간의 유동시간 동안 주위 온도에서 수행된다. 그리고난 후 저분자량의 생성물 및 특히 과량의 시약을 제거하기 위해 투석을 한다. 이 방법은 단백질의 몰당 1~15의 치환기를 도입할 수 있게 한다.
이런 화합물을 사용하여, 단백질 P1과의 결합은 수~24시간의 유동적인 시간동안 30℃를 넘지 않는 온도에서 두 단백질을 수용액중에 넣음으로써 수행된다. 얻어진 용액을 투석하여 저분자량의 생성물을 제거하고, 접합체는 각종 공지의 방법에 의해 정제한다.
이런 면역 효소적 접합체는 어떤 효소로도 제조될 수 있다. 그러나, 지정된 하술될 약학적 이용을 위해, 바람직한 효소는 고등 동물에서 잘 견디는 천연기질로부터 암모늄 이온을 방출할 수 있는 것이다.
예를 들어 M.폴로르킨 및 E.H.스토르츠의 "컴프리 헨시브 바이오케미스트리" 3판(1973) 13권에 기재된 바와 같은 국제적 분류에 따라, 본 발명에 사용되는 제약적으로 적당한 효소는 주로 -제1족(옥시도리덕타아제) 및 특히 아미노산-디히드로게나아제 및 아미노-옥시다아제를 포함하는 제1-4아족에서 -제3족(히드록라아제) 및 특히 아미드, 아미딘 및 다른 C-N결합(펩티드 결합은 제외)을 가수분해하는 효소를 포함하는 제3-5아족에서 -제4족(리아제) 및 특히 불포화 화합물을 형성하여 분해반응을 촉매하는 효소를 포함하는 제4-2 및 4-3아족에서 발견된다.
다음은 본 발명에 따라 면역 효소적 접합체를 편리하게 제조할 수 있는 효소들이다. 또한 각 경우는 국제적 명명법에서 이 효소들을 정의하는데 사용된 코우드이다.
1-4-1-1 : 알라닌 디히드로게나아제
1-4-1-3 : 글루타메이트 디히드로게나아제 NAD(P)+
1-4-1-5 : L-아미노산 디히드로게나아제
1-4-3-2 : L-아미노산 옥시다아제
3-5-1-1 : 아스파라기나아제
3-5-1-2 : 글루타미나아제
3-5-1-4 : 아미다아제
3-5-1-5 : 우레아제
3-5-3-6 : 아르기닌 디아미나아제
3-5-4-4 : 아데노신 디아미나아제
3-5-4-6 : 아데노신 모노포스페이트디아미나아제
3-5-4-21 : 크레아티닌 디아미나아제
4-2-1-13 : L-세린 디히드라타아제
4-2-1-16 : L-트레오닌 디히드라타아제
4-3-1-1 : 아스파르테이트-암모니아-리아제(또는 아스파르타아제)
4-3-1-3 : 히스티딘-암모니아-리아제(또는 히스티다제)
4-3-1-5 : 페닐알라닌-암모니아-리아제
본 발명의 두번째 측면은 이 면역 효소에 접합체를 인체의 치료에 이용하는 것에 관한 것이다.
최초 프랑스 특허출원 제7827838, 8107596 및 8121836호에서, 본 출원인은 A사슬 또는 라이신(ricin)을 파괴된 세포에 의해 운반된 항원에 대항하는 항체 또는 항체의 단편과 공유 결합에 의해 결합시킴으로써 얻어진 접합체 항종양 생성물의 제조를 기술하고 있다. 이런 형태의 생성물은 본 출원에서 면역 독소라는 일반적 이름으로 정의된다.
또한 프랑스 특허출원 제8121836호에는 이 면역독소의 세포독성 작용을 효과적으로 나타내는 암모늄이온(그의 염 및 특히 염화물의 형태)의 특성이 기재되어 있다.
면역 독소의 선택적인 세포 독성 작용을 나타내는 암모늄염의 특성은 다음 두 경우에 많은 장점을 갖는다.
a) 면역 독소가 표적 세포를 파괴하기 위해 시험관내에서 선택적 세포 독성제로서 사용되는 경우
치료에 있어서, 이 특별한 경우는 예를 들면 본 출원인의 프랑스 특허 출원 제8121826호에 기재된 바와 같이 면역 독소를 세포 독성제로서 사용하여 백혈병 환자의 골수를 처리하고 처리된 골수를 환자에 다시 이식하는 경우이다.
b) 면역 독소가 인체의 치료를 위해 생체내에서 사용되는 경우
상술한 특허 출원에 기재된 바와 같이 면역 독소의 효과를 포텐셜화하기 위해 면역 독소를 투여하기전, 또는 동시에 또는 후에 환자에게 암모늄염을 투여하는 경우
그러나 후자의 경우, 면역독소를 생체내에서 사용할때, 포텐셜화 효과를 위해 암모늄염을 생체내에 사용하는 것은 암모늄이온의 실제적 독성에 의한 어떤 한계 및 환자의 생체액내의 충분한 암모늄 이온 농도를 장시간 동안 유지하는 것이 비교적 어렵다는 단점을 가진다.
본 출원인에 의한 연구는 암모늄 이온에 의한 세포 독성적 작용을 포텐셜화하는 이점과 면역 독소 작용의 동력을 유지시키면서 암모늄 이온의 사용에 관련된 제한을 상당한 정도로 감소시키고 있다.
이 작업은 암모늄염을 적당한 농도로 면역 독소에 가함으로써 얻어진 포텐셜화 및 촉진 효과는 만일 암모늄 이온이 자연에 존재하는 또는 인공적으로 세포 주위에 도입된 비독성 기질로부터 효소적 반응에 의해 표적 세포의 인접한 주위에서 제조된다면 마찬가지로 얻어질 수 있다는 것을 나타내고 있다.
이 작업은 또한 암모늄 이온의 생산 반응을 촉매하는 효소가 표적 세포의 표면에 존재하는 항원을 받아들일 수 있는 항체(또는 항체의 단편)와 결합될때 이런 결과가 특히 효과적으로 얻어진다는 것을 나타내고 있다.
이 방법들은 상당한 이점을 가지며 하기에 기재된 바와 같다.
a) 사용된 효소는 표적 세포의 막에 있는 항원에 대한 항체(또는 항체의 단편)의 친화력 때문에 표적 세포의 막에 농축된다. 결과로서, 효소적 반응으로부터의 생성물로서 NH4 *의 방출은 단지 표적 세포의 막 근처에서 일어나며, 이것은 암모늄 이온의 일반적 독성에 관련된 위험을 감소시키며, 암모늄 이온과 표적 세포의 상호 작용을 도와준다.
b) 이 효소적 반응은 기질이 존재하는한 계속적으로 NH4 *이온을 생산하며, 이때 기질은 비독성인 것으로 선택되므로, 이 방법은 포텐셜화 메카니즘의 사용에 큰 유동성을 갖게 한다.
만일 기질이 내생(內生)이며, 적당한 농도를 가진다면, 포텐셜화 면역 효소적 접합체는 각 특허에 기재된 최적 조건에 따라 면역 독소를 투여하기전 또는 동시에 또는 후에 투여될 수 있다.
더우기, 기질이 혈액 및 세포의 액체에 충분히 고농도로 존재하지 않으며 기질이 환자에 투여되어야만 하도록 효소를 선택한다면, 각 환자의 처리를 위한 최적 조건에 대하여 투여시간, 지속성 및 투여된 세 성분 즉 면역독소, 면역 효소적 접합체 및 기질의 양을 자유롭게 독립적으로 조정할 수 있기 때문에 약을 사용하는 적용성이 최대에 도달하게 된다.
c) 상기에 기재된 조건에서, 바람직한 결과를 위해 필요한 둘이상의 효과인자는 선택적으로 표적 세포에 도입된다 :
하나는 면역 독소 접합체에 포함된 세포 독성 효과 인자인 라이신의 A사슬.
또 하나는 포텐셜화계의 필수성분이며 면역 효소적 접합체에 포함된 효소.
이들 효과인자는 표적 세포에 의해 관리되고 선택적으로 표적 세포에 고정된다는 점에서 모든 경우 표적 세포의 표면에 존재하는 항원에 인지하는 항체(또는 항체의 단편)와 결합한다. 만일 사용된 항체가 파괴된 세포에 엄격한 종 특이성을 갖는 항원을 인지할 수 있다면, 같은 항체는 또한 다른 효과인자와 결합하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 더 일반적인 경우, 표적 세포에 의해 운반되는 다른 항원을 인지하는 다른 항체를 선택할 수도 있다. 각 항체가 표적 세포에 매우 엄격한 종 특이성을 갖지 않는다할지라도, 선택된 두 항원이 둘다 비표적 세포에 존재할 것이라는 것은 가능하며, 따라서 이것은 면역 독소의 세포독성의 종 특이성을 증가시키는 강력한 수단이다.
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
면역 효소 접합체는 활성화된 디설파이드기에 의하여 치환된 항-디니트로테닐 항체를 식물원의 우레아제와 반응시킴으로써 얻어진다.
a) 항-디니트로페닐 항체(항-DNP)
이 항체는 하이브리도마 F9가 이식된 Balb/C계통 생쥐의 복부 수종액으로부터 종래의 기술에 의하여 정제된 단클론성 항체이다.
상기 하이브리도마는 몰당 20개의 DNP기가 우선적으로 고정된 소의 γ-글로부린으로 면역된 Balb/C계통의 생쥐의 비장 세포와 뮤린 NS 1골수종주의 세포를 융합시켜 그 자체가 얻어지며, 종래의 방법에 따라 클로닝에 의하여 분리된다. 생성된 항체는 G형이며 그의 친화도 상수(ε-DNP-리신에 대하여 측정)가 1.8×108M-1인 동형상 2b의 면역 글로부린이다.
b) 활성화된 항-DNP항체
이 물질의 최초 출원 제78 27838호와 추가 특허 제79 24655호, 그리고 81 07596 및 81 21836호에 기재된 방법과 유사한 방법에 따라 전술한 항체로부터 얻어진다. 이와 같이 얻어진 20㎎의 항 DNP항체는 몰당 1.2활성제 기를 포함한다.
c) 우레아제
사용된 효소는 ㎎당 170단위로 분석된 시그마원(VII형, U 0376참고)의 우레아제이다. 1단위는 20℃, pH 7.0에서 우레아로부터 분당 1마이크로 몰의 NH4 +를 방출하는 효소의 양이다.
상기 효소는 본래 분자량 480,000의 몰당 27티올기를 갖는다. 엘만(ELLMAN)법에 의하여 분석될 수 있는 상기 티올기들은 효소 활성에 모두 필요하지는 않다. 몇가지가 활성화된 항체와의 결합에 사용될 수 있다.
d) 항체와 효소의 결합
pH 7.0의 0.125M 포스페이트 완충액에 7.2㎎/㎖의 활성화된 항체를 녹인 용액 0.625㎖, 즉 4.5㎎의 활성화된 항체에 5㎎의 우레아제를 용해시킨다. 25℃에서 14시간 동안 배양시킨다.
반응 혼합물을 PBS완충액(포스페이트 10mM, 염화나트륨 140mM, pH 7.4)에 평형된 세파로오즈 6B(Pharmacia)겔 컬럼상에 크로마토그래피한다. 용출액을 280㎚에서 광학 밀도를 측정함으로써 조절하여 썸머법(SUMMER Method, Methods in Enzymology Vol. II. page 378. S.B. Colomick and N.O. Kaplan Ed., Academic Press, 1955)에 따라 우레아제의 활성을 측정한다.
최강의 우레아제 활성을 갖는 획분을 재배합하여 6.5단위/㎖의 접합체 용액 8㎖를 수득한다.
상기 용액의 획분을 몰당 6DNP기로 치환되었으며 시아노겐 브로마이드에 의해 미리 활성화된 세파로오즈 4B의 매트릭스에 용해되지 않는 소의 알부민 혈청 컬럼에 흡수시킨다면, 우레아제의 활성은 컬럼에 흡수된 채로 남아 있다는 것이 발견된다. 이것은 또한 접합체에 존재하는 항체는 DNP합텐을 인지하는 능력을 보유하고 있으며, 우레아제는 상기 항체와 실제로 결합한다는 것을 나타낸다.
[실시예 2]
[항 T65 면역 독소의 포텐셜화]
상기에 기재된 바에 따라 얻어진 본 발명의 접합체는 생물적 특성, 더 특별하게는 적당한 세포 모델에서 항-T65 면역 독소의 활성을 포텐셜화하는 능력에 대하여 연구되고 있다.
상기 모델은 본래 항원 T65를 운반하는 림포브라스토이드 인체 CEM세포 스톡의 세포로 구성된다. 상기 항원은 사용된 면역 독소에 대하여 모델의 첫번째 표적 항원이 된다. 또한 최초 출원 제78 27838호에 기재된 방법에 따라 트리니트로페닐 합텐(TNP)으로 이들 세포를 표지시킬 수 있다. 상기 합텐은 시험된 면역 효소적 접합체에 포함된 항-DNP항체에 의해 완전히 인지되며 이와같이 모델의 두번째 표적 항원이 된다. TNP합텐으로 세포를 처리한 것은 세포의 생존 능력이 변하지 않으며, 이 세포에 항-T65 면역 독소가 고정하는 것도 방해하지 않는다.
면역 독소의 근본적 특성은 표적 세포의 단백질 합성을 방해하는 것이므로, 배양액중의 암세포에 14C-류신이 통합되는데 있어 시험될 물질의 효과를 측정하는 시험 방법을 사용한다.
이런 측정 방법은 저널 어브 바이오로지칼 케미스트리, 1974, 249, (ii), 3557-62에 기재된 방법중에서 선택된 방법에 따라 단백질 합성의 속도를 측정하기 위해 14C-류신 추적자를 사용하여 수행한다. 통합된 방사선 물질의 측정은 여과에 의해 분리된 세포 전체에 한다. 이와 같은 측정에 의해 복용량/효과 커브를 그리며, X축은 시험된 물질의 사슬 A의 몰 농도로 하고 Y축은 단백질 합성에 영향을 주는 물질 부재하에 비교 세포의 통합 %로써 표시된 14C-류신의 통합으로 한다.
연구된 각 물질에 대해, 14C-류신 통합의 50%를 억제하는 농도 또는 "억제 농도 50"(IC 50)이 측정된다.
이 실험에서 다른 시험은 하기와 같다. 상응하는 실험적 결과는 제1도와 같다.
a) 참고 물질로서 지정된 농도의 라이신 또는 분리된 사슬 A의 존재하 37℃에서 18시간 동안 CEM세포를 배양한 후, 방사선 추적자를 세포에 통합한다. 측정된 IC 50은 라이신 및 사슬 A에 대해 각각 4×10-12M 및 4.5×10-8M이다. 또한 이 측정치들은 TNP합텐으로 표지된 CEM세포에서 얻어진 것과는 구별된다(커브 1, CEM에서 라이신 및 커브 2, CEM에서 사슬 A 라이신).
b) 최초 출원 78 27838호 및 추가 출원 79 24655에 기재된 바와 같이 얻어진 황-DNP특이성의 면역 독소의 존재하 37℃에서 18시간 동안 TNP에 의해 표지된 CEM세포를 배양하고, 방사성 추적자를 통합한다. 얻어진 세포 독성 커브의 모양 및 IC 50(1.5×10-9M)의 값은 이들 세포가 항-DNP면역 독소의 세포 독성 효과에 민감하다는 것을 나타내며, 따라서 이들 세포는 TNP에 의해 정확히 표지되었다는 것이 확인된다(커브 3).
c) 5U/㎖농도의 비-접합 우레아제의 존재하 4℃에서 1시간 동안 TNP에 의해 표지된 CEM세포를 배양하고, 세척한 후, 항-T65 면역 독소 및 우레아 5M의 존재하에 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 방사성 추적자를 통합한다. 수득된 IC 50은 5×10-9M이다. 이 값은 우레아제 처리를 하지 않고, 우레아제 세척 후 배양배지에 우레아제가 없으며, 상기와 같은 조건에서 TNP로 표지하지 않은 CEM세포를 사용하여 수득된 것과 동일하다. 이 시험은 비접합 우레아제 존재하의 배양은 우레아제를 세포에 결합시키지 않으며, 그 결과 항 T65 면역 독소의 효과를 포텐셜화하지 않는다는 것을 나타낸다(커브 4).
d) 6.5U/㎖농도의 상기에 기재된 면역 효소적 접합체의 존재하 4℃에서 1시간 동안 TNP에 의해 표지된 CEM세포를 배양한다. 한편 이 접합체는 이와같은 조건에서 사용될 때 사용된 세포에 고유의 세포 독성을 갖지 않는다. 이들 세포를 세척하여 고정되지 않은 모든 접합체를 제거하고, 항-T65 면역 독소 및 우레아 5M의 존재하 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 최종적으로 이 세포에 방사선 추적자를 통합한다. 측정된 IC 50은 3.5×10-13M이다(커브 5).
이 결과는 면역 효소적 접합체의 포텐셜화 효과가 표적 세포에 대한 면역 독소의 세포 독성 활성을 약 14,000배 증가시킨다는 것을 나타낸다.
이런 시험은 포텐셜화 효과가 면역적 특이성에 상응하는 항원에 면역 효소적 접합체의 고정을 포함한다는 것을 증명한다.
상기 고정은 세포의 세척에도 잘 견디며, 면역 독소와 함께 배양 배지에 있는 우레아로부터 NH4 +이온을 방출하는 효소적으로 활성인 우레아제가 표면에 남아 있어 NH4 +이온의 효과를 포텐셜화시킨다. 얻어진 포텐셜화 효과는 배양 배지에 암모늄 클로라이드 10mM을 가했을때 관찰된 것과 매우 유사하다.
인공적으로 암모늄 클로라이드를 첨가한 경우에서와 같이, 상기 포텐셜화 효과는 라이신 또는 라이신의 사슬 A 또는 연구된 세포의 비특이적 면역 독소로는 얻어지지 않는다.
본 실시예의 조건에 있어, 사용된 면역 효소적 접합체의 존재하 항 T65 면역 독소의 세포 독성 활성은 라이신 사슬의 활성의 약 130,000배이며, 이것은 라이신의 활성보다 약 11배 더 강한 것이다.
[실시예 3]
[말레이미드기에 의해 치환된 항-DNP항체와 식물성원의 우레아제를 반응시킴으로써 얻어진 면역 효소적 접합체]
a) 항-DNP항체
이 항체는 하이브리도마 F9가 이식된 Balb/c계통 생주의 복부 수종액으로부터 종래의 기술에 의하여 정제된 단클론성 항체이다.
상기 하이브리도마는 몰당 20개의 DNP기가 우선적으로 고정된 소의 γ-글로부린으로 면역된 Balb/c계통의 생주의 비장 세포와 뮤린 NS 1골수종주의 세포를 융합시켜 그 자체가 얻어지며, 종래의 방법에 따라 클로닝에 의하여 분리된다. 생성된 항체는 G형이며 그의 친화도 상수(ε-DNP-리신에 대하여 측정)가 1.8×108M-1인 동형상 2b의 면역 글로부린이다.
b) 활성화된 항-DNP항체
2.5㎖의 항-DNP항체 용액(pH 7.0인 포스페이트 125mM 완충액중에 9.7㎎/㎖의 농도)에 0.4㎎의 m-말레이미도 벤조산의 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 함유한 10㎕의 디메틸포름아미드를 가한다. 이 혼합물을 25℃에서 30분동안 배양한다. 이 용액을 포스페이트 125mM(pH 7.0) 완충액에서 발란스된 10㎖의 세파덱스 G25 컬럼에 넣는다. 280㎚에서 광학 밀도를 측정하여 용출을 조절한다. 2.5㎖가 컬럼의 배제 부피로부터 회수된다. 치환 비율은 과량의 14C-시스테인과 반응시킴으로써 획분에서 측정된다.
그러므로 이 용액은 항체 1몰당 3.5말레이미드기의 치환비율로, ㎖당 8㎎의항체 농도로 얻어진다.
c) 우레아제
사용된 효소는 170단위/㎎에서 분석된 시그마원(VII형, U 0376참고)의 우레아제이다. 1단위는 20℃, pH 7.0에서 우레아로부터 분당 1마이크로 몰의 NH4 +를 방출하는 효소의 양이다.
상기 효소는 본래 분자량 480,000의 몰당 27티올기를 갖는다. 엘만법에 의하여 분석될 수 있는 상기 티올기들은 효소 활성에 모두 필요하지는 않다. 몇가지가 활성화된 항체와의 결합에 사용될 수 있다.
d) 항체와 효소의 결합
G25 컬럼에서 염을 제거한 후 즉시, 2.4㎖의 활성화된 항체 용액을 pH 7.0의 포스페이트 125mM완충액에서 2.0㎖의 우레아제 용액(농도 24㎎/㎖)과 혼합한다. 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 배양한 후, 원심 분리하여 PBS 온충액에서 발란스한 450㎖ 세파덱스 G200 겔 컬럼에 넣는다. 용출은 280㎚에서 광학 밀도를 측정하고, 섬머법에 따라 우레아제 활성을 측정하여 조절한다.
강한 우레아제 활성을 가진 획분을 다시 모아 14㎖의 접합체 용액(102단위/㎖의 농도)을 얻는다.
만일 이 용액의 획분이 단백질 A-세파로오즈 겔 컬럼에서 크로마토그래피된다면 30%의 우레아제 활성도 컬럼에 남아있지 않는 것으로 발견된다. 우레아제 활성의 나머지는 pH 3.5의 완충액에 의해 항체와 동시에 용출된다. 비교 시험은 항체와 결합되지 않은 우레아제가 컬럼에 의해 고정되지 않는다는 것을 나타낸다. 이것은 재수집된 획분의 우레아제 활성의 70%가 항체-우레아제 접합체에 속한다는 것을 나타낸다.
하기에 기재된 시험에 있어, 오염된 유리 우레아제는 사용된 조건에서 효과가 없기 때문에 용액으로부터 제거되지 않는다.
[실시예 4]
[실시예 3의 면역 효소적 접합체에 의한 항 T65 면역 독소의 포텐셜화]
상기에 기재된 바에 따라 얻어진 본 발명의 접합체(실시예 3)는 생물적 특성, 더 특별하게는 적당한 세포 모델에서 항-T65 면역 독소의 활성을 포텐셜화하는 능력에 대하여 시험된다.
상기 모델은 본래 항원 T65를 운반하는 림포브라스토이드 인체 CEM세포 스톡의 세포로 구성된다. 상기 항원은 사용된 면역 독소에 대하여 모델의 첫번째 표적 항원이 된다. 또한 최초 출원 제78 27838호에 기재된 방법에 따라 트리니트로페닐 합텐(TNP)으로 이들 세포를 표지할 수 있다. 상기 합텐은 시험된 면역 효소적 접합체에 포함된 항-DNP항체에 의해 완전히 인지되며, 따라서 모델의 두번째 표적 항원이 된다. TNP합텐으로 세포를 표지한 것은 세포의 생존 능력이 변하지 않으며 이 세포에 항-T65 면역 독소가 고정하는 것도 방해하지 않는다.
면역 독소의 근본적 특성은 표적 세포의 단백질 합성을 방해하는 것이므로, 배양액중의 암세포에 14C-류신이 통합되는데 있어 시험될 물질의 효과를 측정하는 시험 방법을 사용한다.
이런 측정 방법은 저널 어브 바이오로지칼 케미스트리, 1974, 249, (ii), 3557-62에 기재된 방법중에서 선택된 방법에 따라 단백질 합성 비율을 측정하기 위해 14C-류신 추적자를 사용하여 수행한다. 통합된 방사성 물질의 측정은 여과에 의해 분리된 세포 전체에 한다.
이와 같은 측정에 의해 복용량/효과 커브를 그리며, X축은 시험된 물질의 사슬 A의 몰농도로 하고 Y축은 단백질 합성에 영향을 주는 물질 부재하에 비교 세포의 통합 %로써 표시된 14C-류신의 통합으로 한다.
시험된 각 물질에 대해, 14C-류신 통합의 50%를 억제하는 농도 또는 "억제 농도 50"(IC 50)이 측정된다.
이 실험의 다른 시험은 하기와 같다. 상응하는 실험적 결과는 제2도와 같다.
a) 실시예 2a)에서 수행한 비교 시험은 이들이 본 실시예에서 유효하므로 반복하지 않는다.
b) 최초 출원 제81 21836호에 기재된 바와 같이 얻어진 항-T65 특이성 면역 독소의 존재하 37℃에서 18시간 동안 TNP에 의해 표지된 CEM세포를 배양하고, 방사선 추적자를 통합한다. 세포 독성 커브는 동일한 배양 조건에서 TNP로 표지하지 않은 동일 세포에서 얻어진 것과 동일하므로 TNP에 의해 표지된 세포도 영향을 미치는 것이 확실하다(커브 6).
c) 1U/㎖의 비접합 우레아제 존재하 4℃에서 1시간 동안 TNP에 의해 표지된 CEM세포를 배양하여 세척하고, 단일 농도 10-9M의 항-T65 면역 독소 및 우레아제 5mM의 존재하 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 방사선 추적자와 통합한다.
이 시험에서 얻어진 14C-류신 통합치(65%)는 시험 b)에서 같은 농도의 항-T65 면역 독소로 얻어진 것과 구별되지 않는다. 이와 같은 결과는 비접합 우레아제 존재하의 배양은 우레아제를 세포에 결합시키지 않아 항-T65 면역 독소 효과의 포텐셜화도 일어나지 않는다는 것을 나타낸다.
d) 1.02U/㎖농도의 상술한 면역 효소적 접합체의 존재하 4℃에서 1시간 동안 TNP에 의해 표지된 CEM세포를 배양한다. 또한 이 조건에서 사용할때 접합체가 사용된 세포에 고유의 세포 독성을 가지지 않음을 확인한다. 세포를 세척하여 고정되지 않은 접합체를 제거하고 항-T65 면역 독소 및 우레아 5mM의 존재하 37℃에서 18시간동안 배양한다. 최종적으로 이 세포에 방사선 추적자를 통합한다. 측정된 IC 50은 2.4×10-13M이다(커브 7).
실시예 1의 접합체를 사용하여 얻어진 것과 비교할때 이 결과는 면역 독소에 대한 면역 효소적 접합체의 현저한 포텐셜화 효과를 나타낸다.
이런 시험은 포텐셜화 효과가 면역적 특이성에 상응하는 항원에 면역 효소적 접합체의 고정을 나타낸다는 것을 증명한다.
상기 고정은 세포의 세척에도 잘 견디며, 면역 독소와 함께 배양 배지에 있는 우레아로부터 NH4 +이온을 방출하는 효소적으로 활성인 우레아제가 표면에 남아 있어 NH4 +이온의 효과를 포텐셜화한다.
얻어진 포텐셜화 효과는 면역 효소적 접합체/기질계 대신 암모늄 클로라이드 10mM을 배양 배지에 가하여 배양하였을때 관찰된 것과 매우 유사하다.
암모늄 클로라이드를 가한 경우, 측정된 IC 50은 제2도에서 해당하는 커브에 나타난 바와 같이 3.8×10-13M이다(커브 8).
상술한 실시예는 본 발명의 생성물이 인체 치료에 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 새로운 약제는 바람직한 정맥 투여를 위해 주사 가능한 형태일 수 있다. 이들은 면역 독소의 제조를 위해 사용된 항체에 반응하는 종양성 또는 비종양성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 또한 이들은 환자의 상태 및 질환의 성질과 같은 경우에 알맞은 복용량 및 조건을 사용한다.

Claims (5)

  1. 선택된 항원을 인지하는 능력을 보유한 항체 또는 항체의 단편과 고등 동물 유기체에서 내성이 있는 천연 기질로부터 암모늄 이온을 생산할 수 있는 효소를 공유 결합에 의해 화학적 결합함을 특징으로 하는 면역 효소적 접합체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 공유 결합이 디설파이드 결합임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 공유 결합이 티오에테르 결합임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 티올기를 가진 단백질 즉 P1SH를 수성 매질, pH 5~9 및 약 30℃이하의 온도에서 디설파이드 결합을 갖는 기 및 티올과 반응하는 기 즉 P2-S-S-X가 미리 도입된 또다른 단백질 P2와 반응함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 티올기를 가진 단백질 즉 P1SH를 수성 매질 및 약 30℃이하의 온도에서 말레이미드기를 미리 도입한 또다른 단백질 P2즉
    Figure kpo00010
    (상기식에서 Z는 공간 구조임)와 반응함을 특징으로 하는 접합체의 제조방법.
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