PL142316B1 - Process for preparing immunoenzymatic coniugates - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza- nia nowych komiugatów, laczacych, poprzez wia¬ zanie kowafancyjme, enzym z przeciwcialem, sto¬ sowanych w leczeniu ludzi.Nowy produkty otrzymane sposobom wedlug wynalazku stanowiace koiniugaty utworzone po¬ przez wiazanie kowalencyjne specyficznego en¬ zymu i przeciwcial lub fragmentów przeciwcial slkierowamych przeciwko, antygenowi niesionemu przez komónkii docelowe w dalszej czesci opisu nazywane beda koniugatami immunoenzymatyoz- nymi.Komiugatty immunoenzymatyczne sa zlozonymi sztucznymi czasteczkami, w których enzym przy¬ laczony poprzez wiazanie kowalencyjne do prze¬ ciwciala skierowanego przeciwko antygenowi nie¬ sionemu przez komórka doicelowe.. We wczesniejszych friamouiskiich oplisach paten¬ towych nr'nr 2 437 213, 2 466 252, 2 504 010 i 8 121 836 opisano wytwarzanie produktów przaoiwnowotwo- rowych zwanych koniugatami, otrzymanych przez przylaczenie, poprzez wiazanie kowalencyjne, lan¬ cucha A rycyny do przeciwcial skierowanych prze-' ciwko antygenowi niesionemu przez komór¬ ke przeznaczona do zniszczenia Tego typu produkty okreslane sa nazwa rodzajowa immuno- toksyny.We francuskim opisie patentowym nr 2 516 794 opisano ponadto wlasciwosc jonów amonowych /w postaci dowolnej soli a zwlaszcza chlorku/ sku¬ tecznego wzmacniania dzialania cytotoiksycznego tyah immunotoksyn.Wedlug wynalazku sposób wytwarzania koniu¬ gatów imjmjunoenzyniatyciznych miedzy przeciwcia- 8 lam lub fragmentem przaciwdlala, które ma zar- chowana zdolnosc rozpoznawania wybranego anty¬ genu, z enzymem zdolnym do uwalniania jonów amonowych, z substratów naturalnych dobrze to¬ lerowanych przez wyzisize 'organizmy zwierzece po¬ lo lega na tym, ze przeprowadza sie sprzeganie che¬ miczne, za pomoca wiazania kowalencyjnego, pro¬ teiny majacej grupe tiolowa odpowiadajacej wzo¬ rowi PiSH, z druga proteina P2 do której wpro¬ wadzono grupe podatna na reakcje z grupa tio- 15 Iowa, o wzorze -S-S-X, w którym X oznacza rod¬ nik aktywujacy, lub o wzorze 2, w którym Z oz¬ nacza strukture zwiekszajaca odleglosc, w srodo¬ wisku wodnym, w temiperatutrze ponizej okolo 30°C, przy - pH 5—9. Podane powyzej symbole 20 Pi i P2 oznaczaja przeciwcialo lub enzym zdefi¬ niowane powyzej.Na ogól stosuje sile proteine P2 z grupa dwu- isiarczkowa lub rnadeinotimiidowa. Stosowane enzymy sa zwiazkami znanymi. Sto- 25 isowane przeciwcialo bedzie mialo charakter badz poiiiklonalny, gdy bedzie pochodzilo z konwencjo¬ nalnej immunilzacjji prowadzonej u zwierzecia, badz monoklonalny gdy bedzie wytworzone przez klon komórek hybrydowych otrzymanych przez pola- 30 czernie limfocytów i komórek szpiczaka. Takie 142 316142316 3 przeciwcialo bedzie moglo byc stosowane badz w postaci pelnych czasteczek immunoglobuliny o zdol¬ nosci rozpoznawania wybranego antygen/u, badz w postaci dowodnego fragmentu tych czasteczek zachowujacego zdolnosc rozpoznawania ^wybranego amtygenu, a zwlaszcza w positaici fragmentów znai- nych pod nazwami Fi/aibV2,^ Fab i Fab'.Przeprowadzenie sprzegania1 chemicznego' pomie¬ dzy przeciwcialem, lub fragmentem przeciwciala, i enzymem moze- byc dokoniaine rózriymii sposoba- mi, pod- warunkiem, ze wybrana metoda: — zachowa' aktywnosci biologiczne odpowiiednio obu* skladników kcn'iugatu: przeciwciala i enzy¬ mu; — zajpewnii p^oce^ojwi jc zadowalajaca odtwarzal¬ nosc i jdobra wydajnosc sprzegania; — jpozwoliii zapanowac; nad wartoscia stosoinku enzyiitL/prizeciiwciallo w olpzymanyjm kondugacie; — doprowadzi do produktu trwajego i rozpu¬ szczalnego -wywodzie..' Warunki te sipeln'iiaja metody, w których do1 tworzenia wiazania pomiedzy obiema proteinaimd stosuje sie jedna lub kilka grup tiolowych. Gru¬ py te moga nalezec do jednej badz do drugiej sprzeganej proteiny, lub tez moga byc satuczne wprowa/dzoine do jednej z tych protein, która nie posiada z naitury swej grupy tiólowej.Jesli grupai lub grupy tiolowe musza byc wpro¬ wadzone sztucznlie do jednej z tych proitein, to mozna to przeprowadzic dzialaniem na proteine bezwodnika SHacetytlomerkaptobursztynowego, zdol¬ nego do acylowanda grup aminowych proteiny.Nastepnie mozna uwolnic griupy ticdowe przez eli¬ minacje zabezpieczajacego rodnika acetylowego, dzdalanlieim hydroksyloaminy, jak to opisano w li¬ teraturze /Airohiveis o-f Bdoaheiritijstry and Biophy- sAas 119, 41—49 /1967l'i/. Dializa pozwala nai usu¬ niecie nadmijsnu reagentów oraz produktów reak¬ cji o niskim ciezarze czasteczkowym. W celu wpro¬ wadzania grup tiiolowych do sprzeganych proitein mozna równiez stasowac inne metody opisane w literaturze.Wedlug wynalazku, tylko te z dwóch protein, która zawiera jedna lub kilka grup tiolowych, poddaje sie reakcji z druga proteina do której wprowadzono wczesniej jedna lub kilka grup funk¬ cyjnych zdolnych ido reakcji z tiolamii. Dla wy¬ tworzenia trwalego i okreslonego wiazania ko- wallencyjnego reakcje prowadzi sie w srodowitsku wodnym, przy pH 5—9, w temperaturze nile prze^ kraczaijacej 30°C. Tafcie wiazanie kowalencyjne bedzie zwlaszcza wiazaniem dwusliarczkowyim badz wiazaniem tioaterowym. Ponlizej sybmbolem Pi oznaczono te z dwu fsrotein, która ma grupe loib grupy tiolowe a symbolem P2 druga proteine do spraegiania.V Przypadek wiazania dwusiair-czkowego: Wy¬ twarzanie koniugatu mozna przedstawiic schematem: Pl-SH + F2-,S-S-X Pi-S-S^P2 + XSH w którym: -S-S-X oznacza aktywowana grupe dwuisiarczikowa mieszana, w ' której X oznacza rodnik aktywator. : Proteine P2 padsitawiona aktywowanym, atomem" siarki otrzymuje sie z sarniej proteiny P2 przez podstawienie za pomoca odczynnika zawierajacego aktywowany altom siarki wedlug schematu: P2 + Y-R-S-S-X - P2-R-S-S-X w którym P2 oznacza podstawiana proteine, Y oznacza grupe funkcyjna pozwalajaca na zwia¬ zanie kowalencyjne odczynnika z proteina, R oz- io nacza grupe która moze zawierac równoczesnie podstawniki Y i -S-S-Y zas X oznacza rodnik aktywator.Grupa funkcyjna Y jest grupa zdolna do po¬ laczenia sie w sposób kowalencyjny z dowolna 15 z grup nieis)Jonych przi:z lancuchy boczne amino-4 kwasów — skladników podstawianej proteiny.Sposród n:ich szczególnie wskazane sa terminal¬ ne grupy aminowe rodników lizylowych zawar¬ tych w proteinie.' W tym przypadku Y moze 20 zwlaiszcza oznaczac grupe karboksylowa, która be¬ dzie mogla byc przylaczenia do grup aminowych proteiny w obecnosci srodka wfiazacego, takiego jak karbcidwiiimild, a zwlaszcza rozpuszczalny w wodzie r-etylo-3-i/3-idwuetyloamino-iDropylofkaribD- 25 dwuimid; chlorek kwasu kairbofcsylowego zdolny do reakcji bezposrednio z acylowanymii grupami aimiinowymi; tak zwany ester aktywny taki jak eister orto- lub psra-^ nitro- lub dwun':ir lub tez ester N-hydroksysukcynimidowy reaguja- 30 cy bezposrednio z acylowanyimi grupami . amino- wymi; bezwodnik wewnetrzny kwasu dwukarbo- kisyIow s^io, taki jak na przyklad bezwodnik bur¬ sztynowy reagujacy spontanicznie z grupami ami- , nowymi z wytworzeniem wiazan amidowych; u- 35 grupowanie imidoeistru o wzorze -C/=NH/ORi w którym Rj oznacza gruipe alkilowa reagujaca z grupami aminowymi proteiny wedlug reakcji przed¬ stawionej schematem 1. ¦ , Rodnik -S-S-X oznacza dwusiarczek mieszamy 40 aktywowany zdolny do reakcji z wolnym rodni¬ ki jem tiolcwym. W dwusiarczku mieszanym X moze zwlaszcza onzaczac grupe 2-pirydylowa lub 4-pirydylowa ewentualnie podstawiona jednym lub kilkoma rodnikami! alk'iliowymii, atomami chlorow- 45 ca», grupami karbcksylowymi. X moze takze oz¬ naczac grupe fenyIowa, korzystnie podstawiona jedna lub kilkoma grupami miitrowymi lub karbo- ksylcwymi. X moze wreszCile oznaczac grupe al- ikoksykiatrbonylowa taka jak grupa metcksykartoo- 50 nylowiai . * . Rodnik R oznaozai kazdy rodnik zdolny do nlie- snenia równoczesnie podstsiwników" Y i S^S-X. Wi¬ nien on byc tak dobrany, aby nie zawieral grup mogacych zaklócac bieg dalszych reakcji z uzyty- 56 mi odczynnikami i syntezowanymi proiduktami.Grupa R moze byc zwlaszcza grupa i/'CH2/n, w której n jesit równe 1—10 lub grupa R3-*CH-CH-R4, w której R4 oznacza altom wodoru lub grupe alkilowa o 1—8 atomach wegla a R3 oznacza pod- W .stawniik obojejtny w stoisunku do stosowalnych póz¬ niej odczynników, takiii jak grupa karbaminowia -NH^C,/0/-OR5, w której R5 oznacza grupe alki¬ lowa prosta lub rozgaleziona o 1—5 atomach we¬ gla a zwlaszcza grupre t-butylowa. 65 Reiakcje zwiazku Y-R-S-S-X z proiteina P2 pro-142 316 wadzi siie w jednorodnej faizie cieklej, najczesciej w wodzie lub w roztworze, bufoiroiwym. Gdy wy¬ magaj tego rcizipuisiziczailnosc odczynników, do sro¬ dowiska reakcji monzia dodac do 2(fi/o objetoscio¬ wych rozpuszczalnika organicznego mieszajacego sie z woda, takiego jak alkohol a zwlaszcza t- -butanol.Reakcje prowadzi sie w tempeinaiturize pokojo¬ wej, w ciagu kilku do 24 godzin. Nastepnie zai pomoca diiiailllzy utsiuwa sie produkty o niskkn cie¬ zarze czasteczkowym, a zwlaszcza nadmiar odczyn¬ ników.- Spoisób ten pozwala zazwyczaj nia wpro- wadzemiie 1—15 ugrupowan poidistawników na mol proteiny.Przy uzyciu, talkich zwiazków, wiazanie z pro¬ teina P2 prowadzi sie przez zetkniecie w roz¬ tworze wodnym, obu protein, w temperaturze niie . przekraczajacej 30°C, w ciagu od kilku godzin do jednego dnia. Otrzymany roztwór wodny dia- liizuje sie w celu usuniecia produktów o niskim ciezarze czasteczkowym, po czym oczyszcza sie ko- niugat róznymi znanymi^ sposobami. 2j/ Przypadek" wiaziamda tioaterowago: Wytwarza¬ nie koniiiugiaitu polega ma reakcji Pi-SH z proteiina P2) do której wprowadzono uprzednio rodniik mai- leinojmiidiowy.Reakcja moze byc przedstawiona schematem 2, w którym Z oznacza strukture zwiekszajaca od¬ leglosc, alifatyczna lub ajromatyczna", zawierajaca 1—JO atomów weglan Proteine P2 podstawiona, matleanoimideim^ otrzy¬ muje sile z samej proteiny P2 przez .podstawienie grup aminowych proteiny za pomoca odczynnika niosacego grupe maleiooiimiidowa, wedlug schemai- tu 3,, w którym Yj oznacza badz grupe karboksy¬ lowa, wówczas reakcje prowadzi sie po zaktywo- waniu grupy karboksylowej w obecnosci srodka wiazacego takiego jiaik kartoidwuiinid a zwlaiszcza rozpuszczalny w wodzie l-etylo-3-i/3-dwuetyloiaimii- nio-propyloiTkairibodwuJimid, badz tak zwany ester aktywny taki jak eslter orto- lub para-, niitro- lub dwuniitrofenylowy, lub tez ester N-hydroksy- sukcynimidowy reagujacy bezposredinio z acylo- wanymi grupami aminowymi!.Wytwarzanie talkicih odczynników opisatfio zwla¬ szcza w Helvetica Chimlica Acta 58, 531—541 /1975/.Niieiktóre odczynniki z' tej klaisy sa dostepne w handlu.Reakcje zwiazku o wzorze 1 z proteina P2 pro¬ wadzi sie w jednorodnej fazie cieklej, najczesciej w wO'dz:e lub w roztworze buforowym. Gdy wy- rnaiga tego rozpuiszczalncisc odczynmkow, do sro¬ dowiska reakcji miozna dodaic do 2Q% objetoscior wych roizpuiszczallnika organicznego mteszajacego sie z woda, takiiego jak alkohol a zwlaszcza t- -butanoil.Reakcje prowadzi sie w temperaturze pokojo¬ wej w ciagu od kilku do 24 godzin. Nastepnie -prowadzi sie diiaillize w celu usuniecia produktów o niskim ciezarze' czasteczkowym, a zwlaszcza nad¬ miaru reagentów. Sposób ten pozwala na wpro¬ wadzenie na 1 ml proteiny zazwyczaj 1—15 u- grupowan podstawników: Przy uzyciiiu takicji zwiazków, sprzegan-ie, z pro¬ teina Pi prowadzi sie przez kontaktowanie obu 10 15 proten w roztworze wodnym, w temperaturze iftie przekraczajacej 30°C, w czasie od kilku go¬ dzin do jednego dmia. Otrzymainy roztwór duali- jzuje sie w celu usuniecia produktów o niskim cieisirze czaisteczkowym. Koniiugat moze byc na¬ stepnie oczyszczony róznymi znanymi 'sposobami..Takie kcimiugaty immiunoenzymatyczne moga byc otrzymane z dowolnego1 enzymiu. Jednakze, w ce¬ lu uzycia tych kcirjjugisJtów, korzystne jest sto¬ sowalnie enzymów zdolnych do uwalniania jonu amonowego z naituralnych subsitraftów dobrze to¬ lerowanych przez wyzsze organizmy zwierzece.Wedlug klasyfikacji miedzynarodowej, przedsta¬ wionej na przyklad w Comprehensiiye Biochemi- stry tom 13, wyd. 3 ^1973/,: M. Florkin i E. A.Stortiz Edibors /Elseviiie:n/,' enzymy stosowane w lecznictwie w ramaich^ wynialazku moga miescic is'ie zwlaszcza w grupie 1 /loksydoreduktazy/ a w (szczególnosci w podgrupie 1—4 zawierajacej de- 20 ihydrazy aminokwasu i aminooksydazy;. — w grupie. 3 /hydrolazy/ a. w szczególnosci w . podgrupie 3-5 zawierajacej enzymy hydrolizujace amidy, amjdyny i inne wiazanie C-N /z wylacze¬ niem wiazan peptydowychi,'; — w grupie 4 /liazy/ a w szczególnosci w poidr- grupach '4-2 i 4-3 zawierajacych- enzymy kata¬ lizujace reakcje degradacji z utworzeniem zwiaz¬ ków nienasyconych.Ponizej przedstawiano wykaz enzymów nadaja¬ cych s':ie do syntezy sposobem wedlug wynalazku.W kazdym przypadku zaznaczono równiez kod stosowany do oznaczania tych enzymów w no^ menklaturze mJiedzyoa&rodowej. 1-4-1-1: alanino-dehydraza ' 1-4-iI-3: glutaminiano^diehydraza NAD /P/+ l-4-il-5: ddhydraza L-aniinokwasów 1-4-3-2:* olksydaza L-aminokwaisów 3-5-lil: aispanaginaza 3-5-1-2: glutaminaza • < ' 3-5-1-4: amidaza 3-5-1-5: uraaaa 3-5-3-6: arginiino-ideziminaza 3-5-4-4: aidenozyno-dezamioiiaza 3_5_4l6: adienozynomionofosforano-oksiaminaza 3-5-4-21: kreatynino-idezaiminaza 4-2-1-13: L-seryno-dehydraitaza 4-2-1-16: L-teonino-dehydraitaiza 25 30 35 40 45 50 4-3-1-1 4-3-1-3 4-3-1-5 Sole aispartato-amonia-liaza /lub aispartaza/ hiistydyno-amonia-liaziai .,ifUib hiistydazay/ fenyloaliamino-amooia-liaza. amonowe - wzmacniaja selektywna aktyw- 60 65 nosc cytotoksyczna itnmunotoksyn. Daje to rózne ikiorzysci w dwóch typach sytuacji: a. Za» kazdym razeni gdy immunotoksyina sto-^ sowana jesit jako srodek cytctoksyczny selektyw¬ ny in vitro do zniszczenia komórek docelowych, W przypadku stosowania leczniczego, taka sy¬ tuacje napotyka sie zwlaiszcza gdy immumotoksy- na jest uzyta jako srodek cytctoksyczny w lecze¬ niu szpiku pacjentów bialaiczkowych, u których tak potraktowany szpik -bedzie pózniej trtanisplan- towany, tak jak to opisano przez zglaszajacego we francuskim opisie paitentowym nr 2 516 794. b. Gdy immunotoksyne stosuje sie in vivo jako srodek leczniczy u czlowiieka, za kazdym razem142 316 8 gdy mozna choriemu podac, wczesniej, równoczes- anie lub v po immunortotosynie, podaje sie sól amo- mowa zapewniajaca wzmocnienie dzialania tamu- notoksyny, jak to opisano w podanym wyzej opi¬ sie patentowym.Jednakze, w tym ostatnim przypadku stosowar nia immunotoksyny in vivo, uzycie, równiez in v»iivo9 soli amonowej dla uzyskania efektu wzmac¬ niajacego, wiiaze s!ie z pewnymi ograniczeniami spowodowanymi wlasna toksycznoscia jonów amo- 10 ku przy leczeniu pacjenta. wysokim stezeniu — a wiec substrat ten winien byc podany choremu — wówczais bedzie miala miejsce maksymalna elastycznosc stosowania le- kii, * gdyz bedzie mozna regulowac swobodnie i niezaleznie od siebie moment podawainia, czais po- daiwaniai i dawke kazdego z trzech podawanych skladników, a miianowicie immunotoksyny, kondu- gattu immunoenzymatycznego i substraitu, w za¬ leznosci od optymalnych warunków podawania le- nowych i z faktu, ze stosunkowo trudno jest u- trzymac w sposób trwaly wystarczajace stezenie jonów amonowych w plynach biologicznych cho¬ rego. - Prace prowadzone przez zglaszajacego pozwolily 15 .na znaczne zmniejszenie ograniczen zwiazanych ze stosowaniieim jonów amonowych, przy pelnym za¬ chowaniu korzysci wzmacniania! przez te jony aktywnosci cytoitoksycznej i przyspieszania kine¬ tyki dzialania immunotokisyn. Prace te wykazaly, 20 ze dzialanie wzmacniajace i przyspieszajaee uzy¬ skane przez dodatek do immunotoksyn soli anio¬ nowej w odpowiiiednim stezeniu moze byc równie 'dobrze otrzymane wówczas, gdy jony te bec^a wy- c. W podatnych wyzej warunkach kieruje sie w.sposób selektywny do komórek docelowych przy¬ najmniej dwiie substancje niezbedne do uzyskai- nia poza.damego rezultatu. — z jednej strony lancuch A rycyny, stanowia¬ cy czynnik cytoltokisyczny wlaczony ido- koniugaitu zwanego immunot PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1.