JPS61227532A - 抗体ハイブリツド分子およびその製造方法 - Google Patents

抗体ハイブリツド分子およびその製造方法

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JPS61227532A
JPS61227532A JP61040134A JP4013486A JPS61227532A JP S61227532 A JPS61227532 A JP S61227532A JP 61040134 A JP61040134 A JP 61040134A JP 4013486 A JP4013486 A JP 4013486A JP S61227532 A JPS61227532 A JP S61227532A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明抗体ハイブリッドに関し、更に詳細には有機部分
が抗体上の予じめ選択された位置に共役的に結合され、
それによって抗体の通常の機能が保持されている抗体ハ
イブリッドに関する０抗体分子はいくつかのクラスの内
の１つとして存在する。今日まで、高等を推動物におけ
る既知の５つのクラス（アイソタイプ）が免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）　　として特定されている。即ち、ＩｇＭ。
ＩｇＡ、ＩＱＧ、ＩＱＤまたはＩｇＥである。これら免
疫グロブリンについて共通の構造は２本の重鎖（Ｈ鎖）
および２本の軽鎖（Ｌ鎖）から成る単量体（単分子体）
である。ＨおよびＬ鎖は相互にジスルフィド結合によっ
て共役的に結合しておシ、２本のＨ鎖もジスルフィド結
合によって結合されてい３゜免疫グロブリンクラスのう
ちの２つであるＩｇＭおよび工ｇＡは天然に多量体とし
て存在する。４本の鎖から成る多量体はＨ鎖の不変領域
上のカルボキシ末端付近に位置するシスティン残基によ
って結合されている。
ＩＱＭ″またはＩｇＡの多量化の第一段階は二量体形成
である。普通天然で起る状況では、２つの単量体のカル
ボキシ末端から２番目のシスティン残基が、２０，００
０ダルトンのポリペプチド結合鎖（または重鎖）によっ
て結合されている。三量化の後、工ｇＭの二量体形成が
、チオールオキシドリダクターゼによって酵素的に完了
する０リチヤード・エイ・ロスおよびマリオン・イー・
コツシュランド「三量体免疫グロブリンＭの構築を触媒
するリンパ球酵素の同定Ｊ（１９８１）２５６（９）：
４６３３−９゜ＩｇＡの多量体化はまた重鎖の構築によ
って始められる。ＩＱＡ分子は主として二量体として存
在しており、更に行われる多量体化のためにどのような
他の酵素系も用いられていないと考えられる。したがっ
てＩｇＭまたはＩｇＡ単量体から成るホモ多量体がカル
ボキシ末端付近のシスティン残基によりインビボに形成
される。
本発明はモノクローナル抗体のカルボキシ末端スルフィ
ドリル残基な化学的に結合してハイブリッド分子を形成
する方法を提供する。これらのハイブリッド分子は、好
しい態様において、ある種の抗体、酵素、ホルモン、ト
キシン、担体蛋白（分子量の小さい成分の分配および増
巾系としてのみ作用する蛋白）のような別の成分と結合
したＩＱＭまたはＩｇＡクラスの抗体として定義される
。この担体蛋白は適当な標識剤または適当な細胞毒性剤
を含むことができる。
従来技術 インビボでの細胞集団消耗の概念はガンの治療において
化学治療剤または細胞毒製剤の使用という良く知られた
方法によって説明される。　ガン特異性細胞毒性が無い
ことが主な問題点であり、細胞毒性製品がガン細胞と通
常細胞の両方を殺してしまう。通常細胞に対する毒性の
ために、細胞毒性生成物の投薬量はしばしば制限される
ため、ガン細胞は新たなガンの生長を防止または遅延さ
せる程十分な程度にまで殺されない。したがって、細胞
毒製剤を直接腫瘍細胞に向ける方法の開発が望まれてい
る。
腫瘍関連抗原はガン細胞の表面または細胞質内に存在し
、また患者の血液中に見られることもある。抗腫瘍抗体
は患者の血液中に見出されることもあり、また腫瘍細胞
で動物を免疫することによって発生させることもできる
。
コーラ−とミルシュタイン（「予じめ定めた特異性を持
つ抗体を分泌する融合細胞の連続培養」ネーチャー（１
９７５）２５６；４９５−７）によって開発された技術
によって得られたモノクローナル抗体（Ｍ、Ａｂ）は、
そのＭ　ｏ　Ａ　ｂが生じた抗原を持つ細胞に対して特
異性を持つ。Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ類は腫瘍細胞との組合せに
対して特異である共通の特性を持っているが、それら細
胞に対してＭ　ｏ　Ａ　ｂ　　自体が常に細胞毒性とい
うわけではない。
しかしながら、Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ類は、化学治療剤、天然
または人工的毒素またはその断片のような細胞毒性製剤
、またはキレート化ラジオアイソトープ、またはそれら
物質の種々の組合せと結合させることもできる。ＭｏＡ
ｂ　は細胞毒性製剤を腫瘍に直接送シ込むための担体と
して使用できる。
例えば、ギリランド等（ＰＮＡＳ　　７７；４５３９−
４５４３．１９８０）はヒト直腸ガン関連抗原に対する
Ｍ　ｏ　Ａ　ｂにジフテリアまたはりシン毒素のいずれ
かを複合させた。この複合体はこの抗原を持つ細胞をイ
ンビトロで殺した。
慣用の化学治療剤であるメトトレキセートを抗−前原性
のサルコーマＭ　ｏ　Ａ　ｂと結合させたものは、培養
された前原性サルコーマ細胞に対してインビトロで細胞
毒性を示した。（エンブレトン等、Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、（
１’ａｙｃ、４９（３）：５５９−６５゜１３１■によ
って標識化された腫瘍関連モノクローナル抗体は３人の
ガン患者に対して治療のために使用され、陽性の治療結
果を得た。ハンマースミス腫瘍学グループｒ　Ｌａｎｃ
ｅｔ　１　（８３９２）　：１４４１−３，１９８４Ｊ 細胞集団消耗の別のインビトロによる説明は骨髄からの
細胞集団サブセットの除去である。白血病およびその他
の血液ガンの場合、可能な治療法は、ガン細胞を生産す
る骨髄中の幹細胞の選択的除去である。適当な腫瘍関連
抗原に対するＭｏＡｂは患者から除去された骨髄と反応
できる。生じたＭ　ｏ　Ａ　ｂ　／白血病細胞複合体は
骨髄細胞から分離し、ガン細胞を含まない種々の通常血
液細胞のための幹細胞を含む「汚染されていない」骨髄
を患者に戻すことができる。米国特許４，４８９，７１
０参照。
ケルナン等（Ｊ、　Ｉｍｍｒｂ７Ｌｏｌ　　１３３　（
１）　：１３７−４６．１９８４）はりシンＡ鎖に複合
された抗−ｐａｎ　Ｔ細胞Ｍ　ｏ　Ａ　ｂはインビトロ
骨髄中において免疫競合Ｔ細胞に対して有効であり、そ
して臨床上の骨髄移植での使用な物質であろう。
本発明のものと類似した抗体ハイブリッドの調製に関し
ては多数の先行特許がある。一般的に、それらの先行文
献は抗体部分が抗体の断片であるハイブリッドの形成を
説明するものである。全抗体が使用される場合には、結
合が行われた抗体上の部位に関しては何らの示唆もなく
また制御も為されない。米国特許４，３５０．＆　２６
は典型的な抗体断片の方策であり、これに対して米国特
許４．３４０，５３５は抗体上の反応部位の不規則の選
択を生じる技術によって抗体に結合基が最初に導入され
た抗体ハイブリッドに関する。結合基に結合されている
部分はその反応部位のため抗体の機能に悪い効果を与え
ることもある。上記２つの分類に属する他の文献として
は米国特許４，３６８，１４９および４，３７９，１４
５がある。
診断用部分 Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ類は治療用以外に別の応用、すなわち、
診断用部分の先導物としての応用がある。検出用試薬で
ガン細胞のような細胞集団を標識化することにより、問
題の細胞集団は適当な走査装置によって同定できる。現
在使用されまたは潜在的な価値のある主な検出系は、比
色、放射性、コロイド金属および螢光色素である。
放射性標識化Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ類をインビボで使用し、ヒ
トおよび動物系の両方において悪性組織を画像化した多
くの研究がある。例えば、ラーソン等（Ｊ、　Ｎｗｃｌ
、　Ｍｔｔｄ、　２４　：　１２３−９　、１９８３）
は１３１工で標識化した抗ミエローマＭ　ｏ　Ａ　ｂで
動物およびヒトの両方においてヒトミエローマ浸潤部分
を画像化した。
Ｍ　ｏ　Ａ　ｂペースの多数の製品が、アイソトープの
検出によるインビトロ診断系として現在市販されている
。例えば、ＥＩＡ検出に関してペルオキシダーゼを結合
させたＭ　ｏ　Ａ　ｂを用いるヒト線毛膜ゴナドトロピ
ン用の検出キットがある０また、ＲＩＡ検定において放
射性標識化ＭＯＡ＆を用いるジゴキシン用検出キットが
ある０ 発明の開示 本発明によれば、Ｈ鎖のカルボキシ末端付近（通常、末
端に隣接する）にシスティン残基な持つ抗体とジスルフ
ィド結合形成に利用できるスルフヒドリル基を持つ有機
部分とから成り、このシスティンスルフヒドリル基が前
記の反応性スルフヒドリル基と結合されている抗体ハイ
ブリッドが提供される。
このハイブリッドは（α）Ｈ鎖のカルボキシ末端付近に
システィン残基を持つ単量体（単分子体）の抗体と（６
）反応に利用できるスルフヒドリル基（ＳＩ（基）を持
つ有機部分とを反応させて共役のジスルフィド結合を形
成することによって製造される。上記（α）　、　（６
）において、前記抗体中のシスティン残基にあるＳＨ基
または前記有機部分のＳＨ基のいずれか１つが活性化さ
れており、他の１つは還元された形体である。
本発明は、成るクラスの抗体が、そのＨ鎖のカルボキシ
末端のＳＨ基によって自然に重合する傾向を利用したも
のである。単量体間のＳ−８結合を穏やかに還元するこ
とによシ、このカルボキシ末端ＳＨ基を活性化して、第
二の蛋白質または他の有機部分の遊離ＳＨ基と反応させ
ることができる。逆に、抗体のカルボキシ末端の遊離の
還元ＳＨ基を第二の蛋白質または他の有機部分の活性化
されたＳＨ基と反応させることが出来る０このような反
応は次の反応式で説明される：Ａ、抗体−８’−Ｘ＋Ｐ
−８Ｈ→抗体−ｓ’−ｓＰ Ｂ、抗体−８’Ｈ＋Ｐ−８−Ｘ→抗体−ｓ’−５−ｐ（
式中、Ｓ′は抗体のカルボキシ末端システィン残基の一
部であり、Ｘは脱離基であり、Ｓは第二の蛋白質（もし
くは他の有機部分）Ｐの結合硫黄原子である。） 従来の方法に対する本発明の利点のいくつかをあげれば
次のとおりである： １）免疫グロブリンの酵素によるフラグメント化を必要
としない。
２）この方法では抗体の結合領域は影響を受けないから
、結合領域の保護のための特別な処置を必要としない。
３）ピリジン−２−チオンが副生成物として遊離される
場合には、反応の進行を分光光度法で追跡できる。
反応において、穏やかな還元は、抗体の単量体の間の分
子間結合のみが破壊され、単量体内の分子内結合の破壊
が生じないように、適当な試薬を選んで行なわれる０こ
の目的のための典型的な穏やかな還元剤には、ジチオス
レイトール、メルカプトエタノール、およびシスティン
があシ、低温、適当なｐＨ１および希釈された濃度のも
のである〇抗体と結合させるべき「部分」は、抗体とＳ
−８結合を形成するために利用できるＳＨ基を有する任
意の有機部分である。この部分は、利用できるスルフヒ
ドリル（ＳＨ）基を有する蛋白質から選択でき、このよ
うな蛋白質において、ＳＨ基は天然に存在するものであ
るか、またはＳＨ基は該蛋白質に例えば米国特許第４，
３４０，５３５号中に記載されているような結合基の一
部として加えてもよい。蛋白質は、放射性、発色性、コ
ロイド金属性または螢光色素性の標識を有する標識蛋白
質であってもよい。標識蛋白質から形成されたハイブリ
ッドは、典型的にはインビトロ−ならびにインビボでの
診断の目的に利用できる。
有機部分の好ましいものには、毒素類があり、その場合
、毒素のＡ鎖を抗体に結合させる。毒素の例としては、
ジフテリア毒素（細菌由来）およびリシン（植物由来）
が含まれる。他の有機部分の例は、メトトレキセートの
ような化学療法薬もしくは剤であり、これらは例えば癌
の治療のための生体外ならびに生体内治療用途を有する
ノ・イブリッドを与える。後述の実施例で示すとおり、
有機部分は他の抗体であってもよい。
上記反応式で示した反応において、脱離基Ｘは通常、抗
体または活性化すべき有機部分のいずれかを、有機活性
化剤ＸＩ　　Ｓ　　Ｓ　　ＸＺ（式中、ＸｔおよびＸＺ
はピリド−２−イル基、ピリド−４−イル基およびフェ
ニル基から選ばれ、前記ピリジル基はアルキル基（例え
ばＣ１〜１ｏのもの）、ハロゲン原子またはカルボキシ
ル基で置換されていてよく、前記フェニル基はニトロ基
またはカルボキシル基で置換されていてよい。）と反応
させることにより導入される０ 好ましくは、反応は次の反応式に従って、有機活性化剤
の実質的モル過剰量の存在下に行なわれる： Ｒ−３Ｈ＋Ｘｔ−８−８−Ｘ２→Ｒ−８Ｓ　　Ｘｔ＋２
ＳＨ （式中、Ｒは抗体または有機部分の残基であり、Ｘｌお
よびＸＺは前記の意味を有する。）この反応は、通常は
適当な緩衝液中で、約４−１０のｐＨおよび０℃ないし
室温にて行なわれる。
本発明はポリクローナルおよびモノクローナル抗体（遺
伝子工学操作によるものを含む）の使用を包含するが、
モノクローナル抗体が好ましい０本発明で用いるモノク
ローナルＩｇＭの使用の可能性は、パトリック・ミド−
（Ｐａｔｒｉｃｋ　Ｍｉｄｏ−ＸＺ　）　　らにより、
［チューマー・ローカライゼーション・オプ・ルイス・
ラング・カルシノーマ・ウィズ・ラジオラベルド・モノ
クローナル・アンテイボディース（Ｔｕｍｏｒ　Ｌｏｃ
ａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＬｅｗｉｓ　ＬｌＬｎｇ　Ｃ
ａｒｃｉｎｏｍａ　Ｗｉｔｈ　Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅ
ｄＭｏｘｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　）　
Ｊ　、　　キャンサー・イムノロジー−イムノテラビー
（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｔｎｍ−ｔｂｎｏｌｏｇｙ　Ｉｔｎ
ｍｖｎｏｔｈｅｒａｐｙ　）　、　（１９８４）　。
１８：１９−２３において示唆されており、その中で、
放射標識モノクローナルＩｇＭが生体内環境で研究され
ている。グアンーキシアング・クイア：／　（Ｇｕａｎ
−Ｘｉａｎｇ　Ｑｘｉａｎ　）ら、「サーキュレーテイ
ング・モノクローナルＩｙＭプロテインズ・イン・Ｂセ
ル・クロニック・リンホシテイツク・リューケミア（Ｃ
ｉｒｃｒｂＬａｔｉｎｇ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＩ　ｇ
Ｍ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｂ　ｃｅｌｌ　Ｃｈｒｏ
ｎｉｃＬｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ　ｆ＝ｅｕｋｅｍｉａ　
）　：デア・アイデンティフィケーション、キャラクタ
ライゼーション・アンドーリレイジョンシップ・ツー・
メンブレンＩ　ｇＭ　（Ｔｈｅｉｒ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　、　Ｃｈａｒａｃｔｅ−ｒｉｚａｔｉｏ
ｎ　ａｎｄ　Ｆｔｅｌａｔｉｏｎｓ屓ｐ　ｔｏ　Ｍｅｍ
ｂｒａｎｅＩｇＭ）Ｊ、ザ・ジャーナル・オプφイムノ
ロジー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｒｍｂｎ
ｏｌｏｇｙ　）　、　（１９８４）。
Ｖｏｊ、１３３．Ａ６，３３９６　３４００　頁にもま
た、研究対象の患者の血液中に溶解したモノマーとして
の生体内でのＩｇＭの存在の報告中に、本発明の方法の
可能性が示唆されている０実施例 実施例１ 以下の実施例は、還元型ＩｇＭ抗体を、結合用に容易に
利用しうるＳＨ基を有しない有機物質と結合させる場合
を説明するものである。本実施例のために選ばれた有機
物質はＩＱＧ、モノクローナル抗体である。
抗体モノマーの還元型システィン基に対して成分を結合
させる効果的手段はＳＨ残基な経由するものである。該
成分中に利用しうるＳＨ残基がない場合には、反応性Ｓ
Ｈ残基な修飾剤を用いて導入する。本実施例では、活性
型ＳＨ残基がＩｇＧ。
モノクローナル抗−ＤＮＰ（ジニトロフェノール）抗体
中に、修飾剤５ＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル〕を
用いて導入された。
５ＰＤＰ（７００μｇ／−無水エタノール）を１１７Ｇ
、抗体の攪拌溶液（０，１Ｍ　　ＮａＰＯ４、０，１Ｍ
　　Ｎａｃｌ　、ｐＨ７，７からなるカップリング用緩
衝液１−当り７　ｍｇ金含有中に滴下して加える。溶液
を室温中３０分間攪拌し、次いであらかじめカツブリン
グ用緩衝液で平衡化した脱塩カラムに通す。
抗体を修飾した後、精製したモノクローナル抗−ＤＮＰ
　　ＩｇＭ抗体（７ｍｙ／ｌｒｉ　）を室温中２−１０
　ｍＭ　ＤＴＴ　（ジチオスレイトール）と共に攪拌す
る。溶液中には不活性窒素ガスを定期的に通じる。１時
間後に、溶液な脱塩カラム（あらかじめカップリング用
緩衝液で平衡化しておく）を通過させ、直ちに穏かに攪
拌中の５ＰＤＰ修飾ＩｇＧ。
抗体中に通す。３４３ナノメーターにおける吸光度（Ｏ
Ｄ）が一定になるまで（１〜２４時間）溶液を室温で攪
拌する。好ましい態様によれば、続いて溶液を濃縮し、
緩衝液に透析し、未反応酵素から結合体を除去するため
に分粒カラムで分離する。結合効率は反応中のピリジン
−２−チオンの放出モル数から計算することができる〔
吸収係数＝８．０８Ｘ１０　　Ｍ　　　ｌｌＣｍ　　（
３４３ナノメーターにおける）〕 上記方法は、本実施例のＩｇＭのかわシにＩｇＡモノマ
ーを用いても同様に行いうる。
実施例２ 抗体−抗体ハイブリッドもＩｇＭ抗体モノマー上の活性
化ＣＴＣＲ（カルボキシル末端システィン残基）を用い
て同様に作成することができる。
実施例１と同様の方法を用いて、ＩｇＭ抗体モノマー上
の還元化ＳＨ残基は、該還元化モノマーを脱塩カラム（
あらかじめカップリング用緩衝液で平衡化しておく）に
通し、直ちにジピリジルジスルフィド（カップリング用
緩衝液中の最終濃度が１ｍＭとなるよう）を加えること
によって活性化される。５ＰＤＰ修飾ＩｇＧ、抗体を還
元剤に作用させた後、脱塩カラムを通過させた溶液を活
性化ＩｇＭ抗体モノマーの攪拌溶液中に直接導く。反応
および精製行程は実施例１に記載したのと同様である。
実施例３ 本実施例においては、カップリングに用いうる天然のＳ
Ｈ基を有する有機化合物の他のカップリング形式を説明
するために、毒素リシン（ｒｉｃｉｎ）のＡ鎖を単離し
た。抗−ＤＮＰ　ＩｇＭ抗体を実施例２と同様に還元し
、活性化した。還元化リシンＡ鎖を活性化ＩｇＭの攪拌
溶液に加え、室温で１時間放置して反応させた。リン酸
緩衝液に透析した後、結合体をゲル電気泳動および酵素
免疫アッセイ法で分析した。
実施例４ 本実施例では、実施例３に記載した成分を用いる異なっ
た結合様式を説明する。本実施例では、リシンＡ鎖のＳ
Ｈ残基が活性化され、実施例１で記載したように還元型
抗体と反応する。リシンＡ鎖をジピリジルジスルフィド
（１ｍＭ）と室温で３０分間混合し、ついで脱塩カラム
を通過させる。
還元型アンチ−ＤＮＰ　　ＩｇＭ抗体を上記混合物に添
加し、室温で３０分間攪拌する。反応物をゲル電気泳動
および免疫プロッティング法で分析した。
（外５名）　　− 手続補正書 昭和６ノ年ｖ月／Ｄ日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）そのＨ鎖のカルボキシ末端付近にシステイン残基を
    有する抗体、およびジスルフィド結合を形成するために
    反応できるスルフヒドリルを持つ有機部分から成り、該
    システイン残基の硫硫が前記反応可能なスルフヒドリル
    と結合していることを特徴とする抗体ハイブリッド。 ２）前記抗体がＩｇＭおよびＩｇＡクラスの抗体から選
    択される特許請求の範囲第１項に記載の抗体ハイブリッ
    ド。 ３）前記抗体がＩｇＭ抗体である特許請求の範囲第２項
    に記載の抗体ハイブリッド。 ４）前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範
    囲第２項に記載の抗体ハイブリッド。 ５）前記有機部分がトキシン類、標識化蛋白質、抗体お
    よび化学治療薬から選択される特許請求の範囲第１項に
    記載の抗体ハイブリッド。 ６）前記有機部分が放射性標識化蛋白質である特許請求
    の範囲第５項に記載の抗体ハイブリッド。 ７）前記有機部分がトキシンのＡ鎖である特許請求の範
    囲第４項に記載の抗体ハイブリッド。 ８）トキシンの前記Ａ鎖がリシンのＡ鎖である特許請求
    の範囲第７項に記載の抗体ハイブリッド。 ９）前記抗体がＩｇＡ抗体である特許請求の範囲第２項
    に記載の抗体ハイブリッド。 １０）（α）Ｈ鎖のカルボキシ末端付近にシステイン残
    基を持つ単分子体状の抗体と（ｂ）反応に利用できるＳ
    Ｈ基を持つ有機部分とを反応させて両者の間に共役ジス
    ルフィド結合を形成させることから成り、前記抗体中の
    システインのＳＨ基または前記有機基のいずれか一方が
    活性化されており、他の一方が還元形態である抗体ハイ
    ブリッドの製造方法。 １１）前記のＳＨ基の一方が、式 Ｘ＿１−Ｓ−Ｓ−Ｘ＿２〔式中、Ｘ＿１およびＸ＿２は
    ピリド−２−イル、ピリド−４−イルまたはフェニル（
    ここで、ピリジル基はアルキル、ハロゲンまたはカルボ
    キシル基で置換されていても良く；フェニルはニトロま
    たはカルボキシル基で置換されていても良い）〕で表わ
    される有機活性化剤との反応によつて活性化される特許
    請求の範囲第１０項に記載の抗体ハイブリッドの製造方
    法。 １２）前記活性化反応が、次の反応式 Ｒ−ＳＨ＋Ｘ＿１−Ｓ−Ｓ−Ｘ＿２→Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｘ＿
    １＋Ｘ＿２ＳＨ（式中Ｒは前記抗体の残基または前記有
    機部分である）に従い、十分にモル過剰な有機活性化剤
    の存在下に行われる特許請求の範囲第１１項に記載の方
    法。 １３）前記のＲがトキシンのＡ鎖であり、Ｘ＿１がピリ
    ジル基であり、そしてＲ−Ｓ−Ｓ−Ｘ＿１がＩｇＭまた
    はＩｇＡ抗体から選ばれる単分子体の還元ＳＨ基と反応
    される特許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４）ＲがＩｇＭまたはＩｇＡから選ばれる抗体の単分
    子体の残基であり、Ｘ＿１がピリジル基であり、Ｒ−Ｓ
    −Ｓ−Ｘ＿１がトキシンのＡ鎖の還元ＳＨ基と反応され
    る特許請求の範囲第１２項に記載の方法。
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