JPH0219324A

JPH0219324A - 卵巣細胞に対するモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH0219324A
Application number: JP63153661A
Authority: JP
Inventors: Pastan Ira; アイラ　パスタン; J Fitzgerald David; デビット　ジェイ．フィッツジェラルド; Willingham Mark; マーク　ウィリングハム
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-06-23
Filing date: 1988-06-23
Publication date: 1990-01-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】癌の化学療法及び他の免疫学的治療法への現在のアプロ
ーチは、細胞−特異的治療剤の使用に集中する。理想的
には、免疫毒素が、標的細胞と非標的細胞との間を高度
に識別すべきである。本発明は、モノクローナル抗体Ｏ
ＶＢ−３（ヒト卵巣癌細胞に特異的に結合する）とプソ
イドモナスの外毒素との間に形成される免疫毒素接合体
を開示する。

モノクローナル抗体の方法論の出現が、Ｋｏｐｒｏｗｓ
ｋ　ｉなど（アメリカ特許筒４，１７２，１２４号）に
開示されて以来、広範囲の種類のヒＩ・の疾病を処置す
るために企画された多くのモノクローナル抗体が開発さ
れて来た。しかしながら、２つの問題が、この方法をよ
り広範囲にわたって実施することを妨げて来た。第１に
、目的のヒト細胞（たとえば癌細胞）に対する多くのモ
ノクローナル抗体がまた、非標的のヒト細胞（正常細胞
）にも結合する。第２に、毒素供給系の多くは、そのｄ
１素の有効性を滅じ、標的細胞中への毒素の侵入能力を
滅じ、又は標的の部位に十分な量の毒素を供給するため
に十分特異的でない。本発明は、正常な細胞と癌細胞と
の間を識別し、ヒト卵巣癌細胞に対してひじように特異
的であり、そして毒素の侵入及び致死活性を破壊しない
で癌細胞に毒素を運び、そして供給することができる免
疫毒素を開示する。この態様において、本発明は、癌の
化学療法の分野における長い間の欠点、すなわち卵巣癌
モノクローナル抗体は、はとんど存在せず、そして存在
するモノクローナル抗体は、癌細胞が内毒素を取込むた
めの条件下で外毒素を供給することができない点を満足
せしめる。さらに、本発明は、正常なヒト細胞に結合し
ないで、卵巣癌細胞に特異的に結合する有効な免疫毒素
を産生ずるために、最近開発された技法を使用する。

本発明は、゛プソイドモナスの外毒素接合の免疫毒素（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　Ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅＩｍｍｕｎｏｔｕｘ　１ｎｓ）”と称するア
メリカ特許第４，５４５，９８５号に同じ発明者により
開示された発見を基礎にする。この特許は、プソイドモ
ナスの外毒素（該毒素は目的のヒト腫ｆＦ１細胞を選択
的に殺すであろう）を変性するために本発明に使用され
る方法を開示するので、この開示を引用によりこの明細
書中に組み入れる。

本発明は、この方法に対する改良であり、高い特異性の
モノクローナル抗体の産生により、本発明の生成物によ
りヒト卵巣癌が標的にされ、そして治療され得る。

プソイドモナスの外毒素（ＰＥ）は、あるヒト腫瘍を認
識する種々のモノクローナル抗体及びヒトＸ抗原血液型
物質を認識するモノクローナル抗体に接合されている（
Ｒｉｃｌ＋ｅｒｔなど、Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｃｍ、　
。

２５８　：　８９０２〜８９０７（１９８３）　；及び
Ｆｒｅｄｍａｎなど、Ｊ。

Ｄｉｏｌ　、Ｃｂｅｍ、、２５８　：　１１２０６〜１
１２１０（１９８３）　’］　、その毒素接合体は、適
切な標的細胞を特異的に殺す。

ＰＥは、細胞上で特定の受容体と反応する種々のペプチ
ド、タンパク質類及び増殖因子に接合することができる
。これらは、肉腫増殖因子、メラニン細胞刺激ホルモン
（ＭＳＦ旬ンマトスタチン、グルカゴン、インシュリン
、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、カルシト
ニン、α２−マクログロブリン及びリシン−プラジキニ
ンを含む。

プソイドモナスの外毒素は、容易に多量に調製されるの
で、ヒトは、普通それに対する中和抗体を有さない（ジ
フテリア毒素に関してはよくあるが）ので、それが接合
される前、サブユニットに分離される必要がない（リジ
ン毒素は必要であるンので、他の毒素（たとえばりシン
又はジフテリア毒素）より特に好ましい。

Ｕ謁α東筐本発明の対象物質、ずなわちモノクローナル抗体ＯＶＢ
−３は、ＡＴＣＣ隘１１８９１４７としてマリーランド
州のロックビルにある八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、そして
３０年間又は、そのような寄託に対するａｆ＆の分譲要
求ｆ＆　５年間、又はいずれにせよ特許の存続期間の間
保持されるであろう。寄託物は、寄託の期間の間、培養
物が変化し又は死滅する場合、取り換えられるであろう
。

提定ゆ固成プソイドモナスの外毒素（ＰＥ）は既知であり、そして
プソイドモナスアエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａ７）から単離される、容易に入手できる毒素である。

本発明に使用される特定の外毒素は、５ｗ１ｓｓ　Ｓｅ
ｒｕｍ　Ｃｏｍｐａｎｙを通して商業的に入手できる。

ＰＥを本発明のために選択した。なぜならば、それは、
延長因子２の酵素的（ＡＤＰ−リボシル化）不活性化を
触媒することによってタンパク質合成を阻害するために
、細胞のシトソール中で作用するからである。

卵巣癌細胞に対して特異的なモノクローナル抗体（Ｍａ
ｂ）は存在するが〔たとえば、１３ａｓｔなど、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、ＩＩｔｖｅｓｔ、、６８　：　１３３１〜１
３３７（１９８１）　；及びＴｓｕｊｉなど、Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、４５　：　２３５８〜２３８
２（１９８５）を９照のこと〕、シかしヒト卵巣癌細胞
により十分に取込まれず、又は本発明のモノクローナル
抗体により示される特異性成を示さない。

モノクローナル抗体ＯＶＢ　−３は、従来の方法により
産生される。一般的に、マウスを、０ＶＣＡＲ−３、す
なわちヒト卵巣癌細胞系により免疫感作する（Ｈａａ＋
１ｌｉｔｏｎなど、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｃｓｅａｒｃｂ、
４３　：　５３７９〜５３８９（１９８３）に記載され
る〕。次に、感作されたマウスからの肺臓細胞を、骨髄
腫細胞系と融合せしめ、このようにして、ヒト卵巣癌細
胞に対して特異的に結合するモノクローナル抗体を産生
ずることができるハイブリドーマを形成する。そのよう
な１つのＭａｂ、ずなわちＯＶＢ　−３は、ヒト卵巣癌
に対してひじょうに特異的であり、そしてプソイドモナ
スの外毒素接合体を指示するために使用される。

第１表は、種々の卵巣癌細胞系及び正常なヒＩ・細胞と
モノクローナル抗体ＯＶＢ　−３との反応性を示す。こ
の表は、本発明のモノクローナル抗体がヒト卵巣癌細胞
に対してひじように特異的であることを示す。

プソイドモナスの外毒素−モツクローナル抗体０Ｖ８−
３接合体（ＰＥ　−ＯＶＢ　−３）は、ジルスフイド交
換反応を用いるか又はチオエーテル結合の形成によるい
ずれかにより構成される。一般的に、毒素の分子当り２
個のチオール基を導入するために、ＰＥを２−イミノチ
オラン（正式には、メチル４−メルカプト−ブチルイミ
デート）により処理する。この段階は、場合によっては
、０．１５ＭのＫＰＯ，（ｐＨ８，０）及び１ｍＭのＥ
ＧＴ＾溶液中で行なわれる。

次に、」二足段階からの誘導体化されたＰＥを、ジチオ
ビス（２−ニトロ安思香酸）（ＤＴＮＢ＞と反応せしめ
る。分子当り１つのスルフィドリル基を導入するために
、精製されなＯＶ［３−３をまた、２−イミノチオラン
により処理する。次に、その処理された抗体を、ｐＨ８
，０で、過剰処理されなＰＥを共に混合し、そして２３
℃て２時間インキュへ−１・せしめる。その反応の終り
で、その１）１１を７．０に調整し、そして接合体を形
成しなかった又は１個の未反応−Ｓ　Ｈ基を有するＰＥ
分子からＴＮＢを除去するために、システ、インを添加
する。

他方、抗体を、ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキ
シ−スクシンイミドエステル（ＭＢＳ）により変性する
ことができ、そしてその得られた活性化された抗体を、
Ｓｌｌ　−ＰＥ　−Ｓ１１と反応せしめ、チオエーテル
基を片む接＆体を生成することかできる。この接合体は
、ジルスフイド結合の還元により不活性化され得ないの
で、動物環境下でより安定する。

その得られたＰＥ−ＯＶＢ−３接合体を、ゲル濾過によ
り精製する。典型的には、３〜’）ｍｇ／ｍｌの接合体
１〜５ｍａを、［（Ｐ　Ｌ　Ｃゲル濾過カラムＩ’：　
ＴＳＫ　−２５０（６００Ｘ　２１．５ｍｍ＞　）上に
負荷する。空隙体積中の凝集体は低活性を示し、そして
捨てられる。生来の抗体よりも高い分子量を有する２種
の接合体のピークがカラムに含まれる。これらは、２：
１及び１：１の比の抗体：毒素接合体に一致する。両ピ
ークは高い活性を有するが、しかし、通常１：１の接合
体のみがさらに研究のために使用される。

その接合体をヒト卵巣癌細胞に添加し、そしてタンパク
質合成の阻害又は細胞の死を測定することによって、そ
れをアッセイする。接合体のＡＤＰ−リボシル化活性を
また、ｐｉｔｚｇｅｒａｌｄなど、恒肚。

３２　：　６０７（１９８３）に記載されているように
して、’Ｃ−ＮＡＤを用いて、無細胞抽出物、通常網状
赤血球分解物中においてアッセイする。すべての実験は
、マウスにおける不２−り弘で、又は組織培養における
ヒト細胞上での−（７ビトロでのいづれかで行なわれた
。

生理的食塩水０．５ｍｌ中、約５０ｘｌＯ６個の卵巣癌
細胞を、ヌードマウスに腹腔内注射する。これらの癌細
胞を４〜５日間定着し、そして次に、ＰＥ−０ＶＩ）−
３を４日ごとに注射により投与する。処理されなかった
マウスは、多量の悪性腹水により４０日？麦死んだ。Ｐ
Ｅ−ＯＶＢ−３はこれらの卵巣癌細胞に対して細胞毒性
であり、そして十分な％のそれらの細胞を殺し、処理を
受けなかったマウス、抗体のみを受けたマウス又は無関
係な抗体−ＰＥ接合体を受けたマウスよりも４０〜５０
日長く生きることができる６さラニ、ＰＥ　−ＯＶＢ　
−３ハ、ＯＶ［３−３受ｇ体を発現する細胞に対して細
胞毒性であるが、しかし受容体−陰性細胞に対しては不
活性である。

以下余白剃」−り卵巣腫瘍（Ｎｕｌｌ）＃　］、　（０，Ｓ、）　　　　　　　　　　　　（＋
　＋）＃２（（：、）　　　　　　　　　　　　　　（
−１−十）卵巣腫１′Ｉ（ΔＩａｂａｍａ）　：　　　
　　　　　　　　＜り返し：８６−Ｍ（不完全に分化さ
れた腺癌）　　（十＋）　　＃２−（＋十変動）８６−
Ｒ（ムチンの十分に分化された１腺癌）　　（＋＋）　　＃２−（＋＋）８１−Ｎ（
混成された不完全に分化されたミュラー癌）　　（＋＋）　　＃２−（十十）８
６−０（重症の嚢胞腺癌）、　　　　＜−）　　　＃２
−（＋／−）−（１−）乳１１’Ｊｉ′Ｊｆ！Ｊ（Ｃｅ
ｔｕｓ）　：ＢＣＮＡ　（侵入性小葉症又は腺管癌）（＋−＋＋＋）Ｂ（ＪＩＡ（侵入性腺骨癌）　　　　　　　（＋−＋＋
＋）ＢＣ［Ｉ＾く乳房のパゲット病）（−）ＢＣＴ八（
侵入性硬性症）　　　　　　　（十／−）組　　織前立服精巣卵巣子宮検出された反応性（＋＋十）分ン必：　（＋／−）上皮細胞（−）輸精管（＝）

Claims

【特許請求の範囲】１、ＡＴＣＣアクセション番号ＨＢ９１４７の細胞系に
より産生されるモノクローナル抗体ＯＶＢ−３。２、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の外毒
素に結合された卵巣癌細胞に特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体ＯＶＢ−３を含んで成る、ヒト卵巣癌の化学
療法的緩和のための免疫毒素接合体。３、卵巣癌細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体
に結合されたプソイドモナスの外毒素（ＰＥ）を含んで
成る免疫毒素接合体であつて、ここで前記ＰＥが２−イ
ミノチオランによる処理により、続いてジチオビス（２
−ニトロ安息香酸）による処理により変性され、そして
前記モノクローナル抗体が、前記ＰＥと記モノクローナ
ル抗体との間にジスルフィド又はチオエーテル結合の形
成をもたらす条件下で、２−イミノチオラン及びｍ−マ
レイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルから成る群から選択された試薬による処理により変
性されることを特徴とする免疫毒素接合体。