JP2009527230A - Trop−2の表面発現を証明する細胞の細胞傷害性媒介 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規のスクリーニングパラダイムを使用した癌性疾患改変抗体の産生方法に関する。エンドポイントとしての癌細胞の細胞傷害性を使用した抗癌抗体の分離により、このプロセスによって治療および診断目的の抗癌抗体の産生が可能になる。抗体を、癌の病期分類および診断を補助するために使用することができ、これを使用して、原発性腫瘍および腫瘍転移を治療することができる。抗癌抗体を、毒素、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、および造血系細胞に抱合することができる。
【選択図】図4
【選択図】図4
Description
本発明は、癌性疾患改変抗体(cancerous disease modifying antibodies)(CDMAB)の単離および産生ならびに任意選択的に1つまたは複数の化学療法薬と組み合わせた治療および診断プロセスにおけるCDMABの使用に関する。本発明は、さらに、本発明のCDMABを使用する結合アッセイに関する。
TROP−2は、ほとんどの癌腫およびいくつかの正常なヒト組織上に発現する細胞表面糖タンパク質である。これは、ヒト栄養胚葉細胞上の抗原を認識したヒト絨毛癌細胞株BeWoに対して惹起した2つのマウスモノクローナル抗体によって認識される分子として最初に定義された(Faulk 1978)。この分子は、他の研究者らによって独立して発見されており、この抗原を記載するのに多数の名称が与えられている。したがって、TROP−2は、GA733−1および上皮糖タンパク質−1(EGP−I)とも呼ばれていた(Basu 1995,Fornaro 1995)。
TROP−2遺伝子は、RNA中間体を介した相同遺伝子GA733−2(上皮糖タンパク質−2、EpCAM、およびTrop−1としても公知)の後位によって形成されたと考えられる無イントロン遺伝子である。TROP−2遺伝子は、染色体Ip32にマッピングされている(Calabrese 2001)。TROP−2のタンパク質成分の分子量は、約35キロダルトンである。その分子量は、細胞外ドメインの不均一なN結合型グリコシル化によって11〜13キロダルトン増加し得る。細胞外ドメイン中に多数のシステイン残基が存在し、これにより、ジスルフィド架橋部位を形成することができる。TROP−2は、タンパク質キナーゼC(Ca2+依存性タンパク質キナーゼ)の基質であり、細胞内セリン303残基をリン酸化することが示されている(Basu 1995)。細胞質Ca2+の上昇によって認められるように、TROP−2の抗TROP−2抗体との架橋によってカルシウムシグナルを伝達することも示されている(Ripani 1998)。これらのデータはTROP−2の生理学的機能としてのシグナル伝達を支持するにもかかわらず、今日まで、生理学的リガンドは同定されていない。cDNAマイクロアレイテクノロジーを使用した大規模遺伝子発現分析において、TROP−2が卵巣上皮と比較して漿液卵巣乳頭状癌で最も高く過剰発現することが報告された遺伝子群のメンバーとして同定されたので、最近、TROP−2発現と癌との間の関連が示されている(Santin 2004)。
TROP−2の発現プロフィールは、多数の異なるTROP−2抗体を使用した免疫組織化学(IHC)およびフローサイトメトリー研究によって解明されている。抗TROP−2抗体162−25.3および162−46.2は、ヒト絨毛癌細胞株BeWoでのマウスの免疫化によって産生され、一連の腫瘍およびリンパ細胞株および末梢血単核球に対するその反応性について調査された。この研究では、両抗体は栄養胚葉特異的なようである一方で(試験した4つの絨毛癌細胞株のうちで3つが染色した)、他のリンパ細胞株または腫瘍細胞株(線維肉腫、頸部肉腫、結腸癌、黒色腫、神経芽細胞腫、赤白血病に相当する)は、直接免疫蛍光FACSアッセイで染色されなかった。さらに、正常な末梢血細胞は染色されなかった。抗体を、ホルマリン固定パラフィン包埋胎盤組織切片および肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、およびリンパ節組織の正常な凍結切片の染色について試験した。胎盤組織切片が両抗体で染色される一方で、他の正常組織は染色されなかった(Lipinski 1981)。これら2つの抗体は、in vitro診断研究での使用について厳格に報告されている。
抗TROP−2抗体MOv16を、不十分に分化した卵巣癌OvCa4343/83の粗膜調製物でのマウスの免疫化によって生成した。MOv16を、良性および悪性卵巣腫瘍の凍結組織切片に対する反応について試験した。MOv16は、54個の悪性卵巣腫瘍のうちの31個および16個の良性卵巣腫瘍のうちの2個と反応した。試験した5個の粘液性卵巣腫瘍のうち、MOv16は完全に非反応性を示した。MOv16を、一連の凍結非卵巣悪性腫瘍に対する反応性についても試験し、189個の乳癌切片のうちの117個および18個の肺癌切片のうちの12個に結合することが見出された。MOv16は、試験した16個の非上皮腫瘍(脂肪肉縮、軟骨肉腫、内皮腫、組織球腫、および未分化胚細胞腫が含まれる)で完全に非反応性を示した。凍結正常組織切片に対して試験した場合、MOv−16は、乳房、膵臓、腎臓、および前立腺の切片と反応した。使用した組織切片数は報告されていないが、MOv16反応性は、肺、脾臓、皮膚、卵巣、胸腺、耳下腺、胃、喉頭、子宮、および結腸の切片に対して陰性であると報告されている。著者は、MOv16がパラフィン包埋組織に非反応性を示したので、凍結組織切片を使用したと言及していた(Miotti 1987)。この抗体はまた、in vitro診断研究での使用についてしか報告されていなかった。
抗TROP−2抗体Rs7−3G11(RS7)を、外科的に摘出した肺のヒト原発性扁平上皮癌由来の粗膜調製物でのマウスの免疫化によって生成した。IHCを使用して、ヒトの腫瘍組織および正常組織の凍結切片に対するRS7染色を試験した。RS7は、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、および扁平上皮癌に相当する40個の切片のうちの33個に結合した。正常組織のうち、RS7は、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、および前立腺の20個の組織切片のうち16個に結合した一方で、5個の脾臓組織切片は染色されなかった。この研究では、著者は、腫瘍中の抗原密度は正常な上皮組織よりも高いようであると言及していた(Stein 1990)。
腫瘍組織および正常組織の両方に対してさらなるRS7の組織特異性研究を行った。RS7を、凍結腫瘍切片のパネルに対して試験し、肺、胃、腎臓、膀胱、結腸、乳房、卵巣、子宮、および前立腺に相当する77個の切片の65個に結合した。試験した5つのリンパ腫に結合しなかった。RS7を、全部で24の組織型から構成される85個の凍結ヒト正常組織切片のパネルに対して試験した。13種の正常組織(肺、気管支、気管、食道、結腸、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、皮膚、甲状腺、乳房、および前立腺)の39個の切片は、RS7によって染色された。この研究の著者は、陽性染色が認められた組織おいて、反応性は、一般に、上皮細胞、特に管および腺に制限されると言及していた。RS7がホルマリン固定パラフィン包埋切片に反応性を示さなかったので、この研究が凍結切片に制限されるとも言及していた(Stein 1993)。
ポリクローナルTROP−2抗体を、ヒトTROP−2の細胞質ドメインの169と182との間のアミノ酸位置に対応する合成ペプチドでのマウスの免疫化によって調製した。ポリクローナル抗体を、ホルマリン固定ヒト食道過形成および癌腫組織を含んだ組織アレイスライドに対して試験した。55個の癌腫検体のうちの10個は、ポリクローナル抗体での強い染色を示した一方で、軽度過形成組織は非常に弱く染色され、発現レベルが悪性形質転換に関連し得ることを示している(Nakashima 2004)。
概して、異なる抗TROP−2抗体を使用して得たIHC反応パターンは一貫していた。癌における発現は主に癌腫で見出され、ほとんどの癌腫が反応性を示した。正常組織では、発現は上皮起源の細胞に限定されるようであり、癌腫の染色が対応する正常な上皮組織の染色よりも強いといういくつかの証拠が存在した。
IHC研究での使用に加えて、抗体RS7を、ヌードマウス異種移植片モデルにおける腫瘍標的化研究からなる最初の実験のinvivoモデルで試験した。i.v.注射した放射性標識RS7は、Calu−3(肺腺癌)またはGW−39(結腸癌)腫瘍のいずれかを保有するマウスの腫瘍中に特異的に蓄積することが示された(Stein 1990)。異種移植片系における放射性標識RS7の生体分布を調査し、免疫抱合体としてのRS7の治療可能性を研究するためにさらなる研究を行った。この研究では、Calu−3ヒト肺腺癌異種移植片を保有するヌードマウスにおける131I標識RS7F(ab’)2の治療有効性を調査した。Calu−3細胞とのマウスの3週間のインキュベーション後、腫瘍サイズが約0.3〜0.9グラムに到達した場合、6〜7匹のマウスからなる群を、1.0mCiの131I−RS7−F(ab’)2または1.5mCiの131I−RS7−F(ab’)2のいずれかのi.v.での単回投与で処置し、類似の非処置コントロールマウス群と比較した。1.0mCiの131I−RS7−F(ab’)2の単回投与により、約5週間にわたって腫瘍成長が抑制された一方で、1.5mCiの131I−RS7−F(ab’)2の単回投与によって腫瘍成長が抑制され、平均腫瘍サイズは、放射性抗体の注射から8週間まで処置前のサイズを超えなかった。1.5mCiの131I−RS7−F(ab’)2を投与したマウスは平均18.7%の体重減少を経験し、これは、処置に関連する毒性の存在を示していた。この研究では、裸のRS7またはRS7のF(ab’)2フラグメントでの処置の影響は試験していなかった(Stein 1994a)。MDA−MB−468乳癌異種移植片モデルにおける131I−RS7の影響を試験するために別の研究を行った。約0.1cm3のMDA−MB−468腫瘍を保有する10匹のマウスからなる群を、250μCiの131I−RS7または250マイクロCiの131I−Ag8(アイソタイプ適合コントロール抗体)のいずれかの単回i.v.投与を使用して処置した。6匹の群を、30μmの非標識RS7またはAg8のいずれかの単回i.v.投与を使用して処置した。131I−RS7で処置した動物で腫瘍の完全な退行が認められ(腫瘍が一過性に再発した1匹の動物を除く)、この退行が11週間の観察期間にわたって持続した。腫瘍退行は、131I−Ag8処置マウスでも認められたが、2週間と5週間との間のみで認められ、残りの研究期間は腫瘍成長の継続または持続のいずれかが認められた。非標識RS7またはAg8を投与したマウスの腫瘍成長は阻害されず、Ag8処置マウスと比較してRS7処置マウスの平均腫瘍体積にいかなる相違も認められなかった。約0.2〜0.3cm3のより大きなMDA−MB−468腫瘍を保有する10匹のマウスからなる2つのさらなる群を、わずかにより多い用量の275μCiの131I−Rs7または275μCiの131I Ag8のいずれかで処置し、類似の非処置マウス群と比較した。腫瘍体積を、毎週15週間測定した。この場合に非処置マウスと比較して131I−RS7処置マウスの間で腫瘍成長の有意差が存在したにもかかわらず、131I−RS7処置マウスの腫瘍成長は131I−Ag8処置マウスと比較して有意差はなかった。これは、有効性の一部が、照射の非特異的影響に起因し得ることを示していた。0.2〜0.3cm3の腫瘍を含むマウスにおいて非標識抗体は試験されなかった(Shih 1995)。
放射免疫療法に最適な放射性標識を選択するための免疫抱合体としてのRS7の有効性を試験するさらなる多数の研究が存在している(Stein 2001a,Stein 2001b,Stein 2003)。RS7のヒト化バージョンも生成されているが、前臨床異種移植片モデルにおいて放射性抱合体(radioconjugate)として試験されているだけである(Govindan 2004)。これらの研究は、RS7を使用した前に記載の研究と類似の好ましい効果を示すが、ある研究では、放射性標識RS7を前に決定した最大耐量で送達させた場合でさえ、毒性を生じ、死至るマウスもあった(Stein 2001a)。これらの研究においてマウスにおける異種移植片腫瘍の有効な処置を放射性標識RS7を使用して達成されたにもかかわらず、裸のRS7は評価されていなかった。
ノイラミニダーゼ前処置H3922ヒト乳癌細胞でのマウスの免疫化により、抗TROP−2モノクローナル抗体BR110が産生された(米国特許第5,850,854号に開示されており、その先行特許の項を参照のこと)。免疫組織学により、ヒト凍結組織検体を使用して、BR110は、広範なヒト癌腫検体(肺、結腸、乳房、卵巣、腎臓、食道、膵臓、皮膚、肺、および扁桃腺の癌腫検体が含まれる)に反応することが示された。ヒト組織切片を試験していなかった。in vitro研究により、BR110がヒト癌腫細胞株H3396またはH3922に対してADCCまたはCDC活性を持たないことが証明された。in vitro研究では、ヒト癌細胞株H3619、H2987、MCF−7、H3396、およびH2981に対するBR110−免疫毒素の細胞傷害性を分析した。試験した細胞株のEC50は、それぞれ、0.06、0.001、0.05、0.09、および>5μg/mLであった。裸のBR110抗体についての細胞傷害性データは開示されていなかった。裸のBR110または免疫抱合BR110についてのin vivoデータは開示されていなかった。
卵巣癌細胞化物Colo316でのマウスの免疫化から生成されたTROP−2を標的にする多数のさらなる抗体(MR54、MR6、およびMR23など)(Stein 1994b)およびT24膀胱癌細胞株でのマウスの免疫化によって生成された抗体T16(Fradet 1984)が生成されている。これらの抗体の使用は、TROP−2抗原の生化学的特徴づけおよび組織発現研究に制限されている。in vitroおよびin vivoにおけるこれらの抗体の抗癌有効性についての報告は存在していない。RS7は、前臨床癌モデルにおける治療有効性について試験された唯一の抗体であり、その使用は放射性同位体のキャリアに制限されていた。in vitroおよびin vivoにおける前臨床癌モデルにおいて治療有効性を示すいかなる裸のTROP−2抗体も報告されていない。
癌療法としてのモノクローナル抗体:癌を示す各個体は固有のものであり、人によって異なる癌を有する。このことにもかかわらず、現在の治療法は、同一の病期の同一の癌型を有する全ての患者を同一の方法で治療している。これらの患者の少なくとも30%は、一次治療に失敗し、それによってさらなる一連の治療を行い、治療失敗、転移、最終的には死亡の確率が増加するであろう。優れた治療法は、特定の個体のための個別化療法(customization of therapy)であろう。個別化に順応できる現在唯一の治療法は、手術である。化学療法および放射線治療は、患者に合わせることができず、多くの場合、手術のみでは治癒には不十分である。
モノクローナル抗体の出現で、各抗体を1つのエピトープに指向することができるので、個別化療法のための方法を開発できる可能性がより現実的になった。さらに、特定の個体の腫瘍を独自に定義する種々のエピトープに指向する抗体の組み合わせを産生することが可能である。
癌性細胞が形質転換細胞に特異的な抗原を含むことが癌性細胞と正常細胞との間の有意差であると認識されているので、これらの癌抗原への特異的結合によって形質転換細胞を特異的に標的にするようにモノクローナル抗体をデザインすることができると科学界で長きにわたって考えられれおり、それ故に、モノクローナル抗体が癌細胞を排除するための「特効薬」としての役立つと信じられている。しかし、現在、単一のモノクローナル抗体が全ての癌の症例で役立つことはできず、モノクローナル抗体を、クラスとして(標的癌治療として)位置づけることができると広く認識されている。ここに開示の発明の教示にしたがって単離したモノクローナル抗体は、例えば、腫瘍の全身腫瘍組織量の減少によって患者に有利な様式で癌性疾患過程を改変することが示されており、これを、本明細書中で、癌性疾患改変抗体(CDMAB)または「抗癌抗体」と様々にいう。
現在のところ、癌患者は、通常、治療の選択肢はほとんどない。癌療法への厳格に管理されたアプローチにより、総生存率および総罹患率を改善している。しかし、特定の個体に対しては、この改善された統計値は、必ずしもその個別の状況の改善と相関しない。
したがって、同一コホートの他の患者とは無関係に各腫瘍を施術者が治療することができた方法を考え出した場合、これにより、個別化療法の固有のアプローチを一人一人の患者に合わせられるであろう。かかる一連の治療法は、理想的には、治癒率を増大させ、より良い結果が得られ、それによって長い間の切実な要求が満たされるであろう。
組織学的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒト癌治療における成果は限定的である。リンパ腫および白血病はヒト血漿を使用して治療されているが、緩和または応答はほとんど延長されなかった。さらに、再現性を欠き、化学療法と比較してさらなる利点は得られなかった。乳癌、黒色腫、および腎細胞癌などの固形腫瘍は、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、およびウマ血清でも治療されており、同様に、予想不可能であり、且つ無益な結果が得られている。
固形腫瘍についてのモノクローナル抗体の臨床試験が多数行われている。1980年代に、ヒト乳癌についての少なくとも4つの臨床試験が行われ、この試験により、特異的抗原に対する抗体を使用するか、組織選択性に基づいて、少なくとも47人の患者からたった1人しか反応者が得られなかった。1998年になって初めて、シスプラチンと組み合わせたヒト化抗Her2/neu抗体(ハーセプチン(登録商標))を使用して首尾よく臨床試験が行われた。この試験では、37人の患者を反応について評価し、その約1/4が部分的な反応率を有し、さらなる1/4がわずかまたは安定に疾患が進行した。反応者の進行時間の中央値は、8.4ヶ月であり、反応持続時時間の中央値は5.3ヶ月であった。
ハーセプチン(登録商標)は、タキソール(登録商標)と組み合わせた初回使用について1998年に承認された。臨床試験の結果は、タキソール(登録商標)のみを投与した群(3.0ヶ月)と比較した抗体療法+タキソール(登録商標)を投与した患者の疾患進行期間の中央値の増加(6.9ヶ月)を示した。生存期間の中央値もわずかに増大した:タキソール(登録商標)治療のみの治療群の18ヶ月に対して、ハーセプチン(登録商標)+タキソール(登録商標)治療を行った治療群の22ヶ月。さらに、タキソール(登録商標)のみと比較した抗体+タキソール(登録商標)の組み合わせ群において完全な反応者(2人に対して8人)および部分的反応者(15人に対して34人)の両方の数が増加した。しかし、ハーセプチン(登録商標)およびタキソール(登録商標)を使用した治療は、タキソール(治療)治療のみと比較して、心臓毒性の発生率がより高くなった(ぞれぞれ、1%に対して13%)。また、ハーセプチン(登録商標)療法は、ヒト上皮成長因子受容体2(Her2/neu)(現在、機能的または生物学的に重要なリガンドか知られていない受容体)を過剰発現する(免疫組織化学(IHC)分析によって決定した場合)患者(転移性乳癌患者の約25%)にのみ有効であった。したがって、乳癌患者の要求の多くは依然として満たされていない。ハーセプチン(登録商標)治療から恩恵を受けることができる患者でさえ、依然として化学療法が必要であり、その結果、少なくともいくらかの程度で、この種の治療の副作用に対処しなければならないであろう。
結腸直腸癌を調査する臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質標的に対する抗体を含む。腺癌に対していくらかの特異性を有する17−1Aなどの抗体に対して60人超における第二相臨床試験を行い、たった1人しか部分的反応を示さなかった。他の試験では、17−1Aの使用により、さらなるシクロホスファミドを使用したプロトコールにおいて、52人の患者のうちでわずかに1人が完全に反応し、2人で小さな反応が認められた。今まで、17−1Aの第III相臨床試験では、第III期結腸癌のアジュバント療法として有効性を改善しなかった。画像化について最初に承認されたヒト化マウスモノクローナル抗体も、腫瘍を退行しなかった。
ごく最近になって、モノクローナル抗体を使用した結腸直腸癌臨床研究から任意の肯定的な結果が得られた。2004年に、エルビタックス(登録商標)は、イリノテカンベースの化学療法が無効なEGFR発現転移性結腸直腸癌患者の二次治療として承認された。2治療群を使用した第II相臨床研究および単一治療群を使用した研究の両方由来の結果は、イリノテカンと組み合わせたエルビタックス(登録商標)の反応率がそれぞれ23%および15%であり、疾患進行の中央値がそれぞれ4.1ヶ月および6.5ヶ月であることを示した。同一の2治療群を使用した第II相臨床研究および別の単一治療群を使用した研究由来の結果は、エルビタックス(登録商標)のみでの治療によって反応率がそれぞれ11%および9%であり、疾患進行の中央値がそれぞれ1.5ヶ月および4.2ヶ月であることを示した。
その結果として、スイスおよび米国の両方におけるイリノテカンと組み合わせたエルビタックス(登録商標)治療ならびに米国におけるエルビタックス(登録商標)のみの治療は、初回イリノテカン両方を失敗した結腸癌患者の二次治療として承認されている。したがって、ハーセプチン(登録商標)のように、スイスにおける治療は、モノクローナル抗体と化学療法との組み合わせとしてのみ承認されている。さらに、スイスおよび米国での治療は、患者の二次治療としてのみ承認されている。また、2004年に、アバスチン(登録商標)は、転移性結腸直腸癌の初回治療として静脈内5−フルオロウラシルベースの化学療法と組み合わせた使用について承認された。第III相臨床試験の結果は、5−フルオロウラシルのみで治療した患者と比較して、アバスチン(登録商標)+5−フルオロウラシルで治療した患者の生存の中央値が延長(ぞれそれ、16ヶ月に対して20ヶ月)されたことを証明した。しかし、ハーセプチン(登録商標)およびエルビタックス(登録商標)のように、治療は、モノクローナル抗体と化学療法との組み合わせとしてのみ承認されている。
肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および胃癌についての結果も依然として芳しくない。非小細胞肺癌についての最も有望な最近の結果は第II相臨床試験に由来し、この治療は化学療法薬であるタキソテール(登録商標)と組み合わせた細胞死滅薬であるドキソルビシンに抱合したモノクローナル抗体(SGN−15;dox−BR96、抗Sialyl−LeX)を含む。タキソテール(登録商標)は、肺癌の二次治療のための唯一のFDA承認化学療法薬である。初期データは、タキソテール(登録商標)のみと比較した全生存率の改善を示す。本研究のために採用した62人の患者のうち、2/3にタキソテール(登録商標)と組み合わせたSGN−15を投与する一方で、残りの1/3にタキソテール(登録商標)のみを投与した。タキソテール(登録商標)のみを投与した患者の5.9ヶ月と比較して、タキソテール(登録商標)と組み合わせたSGN−15を投与した患者について、全生存の中央値は7.3ヶ月であった。1年および18ヶ月での全生存は、タキソテール(登録商標)のみを投与した患者についてのそれぞれ24%および8%と比較して、SNG−15+タキソテール(登録商標)を投与した患者についてはそれぞれ29%および18%であった。さらなる臨床試験を計画している。
前臨床的に、黒色腫に対するモノクローナル抗体の使用である程度の成果がいくつかあげられている。これらの抗体で臨床試験に到達したものはほとんどなく、今日まで、第III相臨床試験で好ましい結果が承認も証明もされていない。
疾患を治療する新規の薬物は、疾患の病理発生に寄与し得る30,000種の公知の遺伝子産物のうちで関連標的の同定不足によってその発見が妨げられている。腫瘍学研究では、潜在的な薬物標的は、腫瘍細胞中に過剰発現されるという事実のために、しばしば簡潔に選択される。このようにして同定された標的を、多数の化合物との相互作用についてスクリーニングする。潜在的な抗体療法の場合、これらの候補化合物は、通常、Kohler and Milsteinによって定められた原理に従ったモノクローナル抗体の伝統的生成方法に由来する(1975,Nature,256,495−497,Kohler and Milstein)。脾臓細胞を、抗原(例えば、全血、細胞画分、精製抗原)で免疫化したマウスから回収し、免疫化したハイブリドーマパートナーと融合する。得られたハイブリドーマをスクリーニングし、標的に最も強く結合する抗体の分泌について選択する。癌細胞に指向する多数の治療および診断抗体(ハーセプチン(登録商標)およびリツキシマブが含まれる)を、これらの方法を使用して産生し、その親和性に基づいて選択されている。このストラテジーの欠点は、2つある。第1に、治療抗体または診断抗体の結合のための適切な標的の選択が、組織特異的発癌過程周辺の知識不足およびこの知識不足によるこれらの標的を同定する過度に単純化した方法(過剰発現による選択など)のために制限される。第2に、最も高い親和性で受容体に結合する薬物分子が、通常は、シグナルを開始または阻害する可能性が最も高いという仮定は、常に正しいというわけではないかもしれない。
乳癌および結腸癌の治療がいくらか進歩しているにもかかわらず、単剤両方または同時治療のいずれかとしての有効な抗体療法の同定および開発は、全ての癌型に不適切であった。
先行特許:特許文献1は、患者の腫瘍由来の細胞をMHC遺伝子でトランスフェクションし、これを患者の細胞または組織からクローニングすることができる過程を開示する。次いで、これらのトランスフェクションされた細胞を使用して、患者にワクチン接種する。
特許文献2は、哺乳動物の新生物細胞および星状細胞の内部細胞成分に特異的であるが、外部成分には特異的ではないモノクローナル抗体を得る工程、モノクローナル抗体を標識する工程、標識された抗体を新生物細胞を死滅させる治療を受けた哺乳動物の組織と接触させる工程、および新生物細胞を分解する内部細胞成分への標識抗体の結合の測定によって治療法の有効性を決定する工程を含む過程を開示する。ヒト細胞内抗原に指向する抗体の調製では、特許権者は、悪性細胞がかかる抗原の都合の良い供給源であることを認識している。
特許文献3は、新規の抗体およびその産生方法を提供している。具体的には、本特許は、ヒト腫瘍(例えば、結腸および肺の腫瘍)に関連するタンパク質抗原に強く結合する一方で、正常な細胞にははるかに弱く結合する性質を有するモノクローナル抗体の形成を教示している。
特許文献4は、ヒト癌患者から腫瘍組織を外科的に取り出す工程、癌組織を処置して腫瘍組織を得る工程、腫瘍細胞を照射して、生存可能であるが非腫瘍化する工程、およびこれらの細胞を使用して原発性腫瘍の再発を阻害すると同時に転移を阻害することができる患者用のワクチンを調製する工程を含む癌の治療方法を提供する。本特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応性を示すモノクローナル抗体の開発を教示している。第4段落45行目(以下を参照のこと)に記載のように、特許権者は、ヒト新形成における有効な特異的免疫療法薬を発現するモノクローナル抗体の開発において原発性腫瘍細胞を使用している。
特許文献5は、ヒト癌腫に特徴的であるが、起源となる上皮組織に依存しない糖タンパク質抗原を教示している。
特許文献6は、Her2発現細胞中でアポトーシスを誘導する抗Her2抗体、この抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、この抗体を使用した癌の治療方法、およびこの抗体を含む薬学的組成物を示す。
特許文献7は、腫瘍または非腫瘍組織供給源から精製したムチン抗原に対するモノクローナル抗体の産生のための新規のハイブリドーマ細胞株を記載している。
特許文献8は、所望の抗原に特異的な抗体を産生する非とリンパ球の生成方法、モノクローナル抗体の産生方法、およびこの方法によって産生されたモノクローナル抗体を示す。本特許は、特に、癌の診断および治療に有用な抗HDヒトモノクローナル抗体の産生を示す。
特許文献9は、ヒト癌腫細胞と反応性を示す抗体、抗体フラグメント、抗体抱合体、および短鎖免疫毒素に関する。分子がヒト癌腫表面上に存在する細胞膜抗原と反応性を示し、さらに、抗体が癌腫細胞内で内在化し、抗体−薬物抱合体および抗体−毒素抱合体を形成させる能力を有するという点で、これらの抗体が機能する機構は二要素からなる。その非修飾形態では、抗体はまた、特定の濃度で細胞傷害性を示す。
特許文献10は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、高齢の哺乳動物由来の抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は、免疫系で見出される1つの天然抗体型であると言われる。自己抗体が「高齢哺乳動物」に由来するので、自己抗体が実際に治療を受ける患者に由来する必要はない。さらに、本特許は、高齢哺乳動物由来の天然およびモノクローナル抗核自己抗体およびモノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を開示する。
特許文献11は、GA733−1に指向する特異的抗体BR110を開示している。この特許は、免疫毒素抱合体としてのBR110のin vitro機能を開示している。裸の抗体としてのこの抗体のin vitro機能は開示していなかった。この抗体のin vivo機能も開示していなかった。
特許文献12は、抗原(EGP−Iが含まれるが、これらに限定されない)の宿主に指向する免疫毒素抱合抗体(RS7が含まれるが、これらに限定されない)を特許請求の範囲に記載している。免疫毒素は、リボ核酸分解活性を有する免疫毒素に制限される。しかし、実施例は、CD22に指向する特異的免疫毒素抱合抗体LL2のみを開示している。この出願では、RS7のin vitro機能またはin vivo機能を開示していなかった。
特許文献13は、EGP−Iに対して指向する特異的抗体RS7を開示している。この出願は、放射性標識抱合体としてのRS7のin vitro機能を開示している。裸の抗体としてのこの抗体のin vitro機能は開示していなかった。この出願は、放射性標識抱合体および非標識抱合体の連続投与に起因するRS7のin vivo機能を開示している。しかし、この研究は、1人の患者に制限され、任意の認められた機能が非標識抗体に起因するかどうかは知られていない。裸の抗体の投与に起因するRS7のin vivo機能は存在しなかった。
米国特許第5,750,102号
米国特許第4,861,581号
米国特許第5,171,665号
米国特許第5,484,596号
米国特許第5,693,763号
米国特許第5,783,186号
米国特許第5,849,876号
米国特許第5,869,268号
米国特許第5,869,045号
米国特許第5,780,033号
米国特許第5,850,854号
米国特許第6,653,104号
米国特許出願番号20040001825A1号
本願は、癌性疾患改変モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離するための米国特許第6,180,357号に教示の患者特異的抗癌抗体の産生方法を使用する。これらの抗体を、1つの腫瘍のために特異的に作製することができ、それにより、癌療法の個別化が可能となる。本願の文脈内で、細胞死滅(細胞傷害性)または細胞成長阻害(細胞増殖抑制性)特性のいずれかを有する抗癌抗体を、以後、細胞毒性という。これらの抗体を、癌の病期分類および診断を補助するために使用することができ、これを使用して、腫瘍転移を治療することができる。これらの抗体を、予防治療による癌防止のために使用する個ともできる。伝統的な創薬パラダイムにしたがって生成した抗体と異なり、この方法で生成した抗体は、悪性組織の成長および/または生存に不可欠であることが以前に示されていない分子および経路を標的にすることができる。さらに、これらの抗体の結合親和性は、より強い親和性の相互作用に従い得る細胞傷害事象の開始要件に合わせられる。また、標準的な化学治療様式(例えば、放射性核種)を本発明のCDMABと抱合し、それにより、前述の化学療法の使用を集中させることは、本発明の範囲内である。CDMABを、毒素、細胞傷害性部分、酵素(例えば、ビオチン抱合酵素)、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、または造血系細胞に抱合し、それにより、抗体抱合体を形成することもできる。CDMABを、単独で使用するか、1つまたは複数のCDMAB/化学療法薬と組み合わせて使用することができる。
個別化抗癌治療が見込まれると、患者の管理方法が変化する。有望な臨床的シナリオは、腫瘍サンプルを提示時に得て、保存することである。このサンプルから、腫瘍を、既存の癌性疾患改変抗体のパネルから分類することができる。患者を慣習的に病期分類するが、利用可能な抗体を、患者のさらなる病期分類に利用することができる。患者を即座に既存の抗体で処置し、腫瘍に特異的な抗体のパネルを、本明細書中で概説した方法を使用するか本明細書中に開示したスクリーニング方法と併せたファージディスプレイライブラリーの使用して産生することができる。他の腫瘍が処置されるエピトープと同一のいくつかのエピトープを保有し得る可能性があるので、生成された全ての抗体を、抗癌抗体のライブラリーに添加する。本方法によって産生された抗体を使用して、これらの抗体に結合する癌を有する多数の患者の癌性疾患を治療するのに有用であり得る。
抗癌抗体に加えて、多様な治療計画の一部として現在推奨されている治療法を受けるために患者を選択することができる。本発明の方法によって単離した抗体が非癌性細胞に対して比較して非毒性を示すという事実により、高用量で使用される抗体と組み合わせるか、単独か、従来の治療法と併せて使用することが可能である。治療指数が高いことにより、短い時間的尺度で再治療することも可能であり、それにより、治療耐性細胞が出現する可能性が減少するはずである。
患者が初期治療では効果がないか、転移している場合、再治療のために腫瘍に対する特異的抗体の生成過程を繰り返すことができる。さらに、抗癌抗体を、患者から得た赤血球に抱合し、転移治療のために再注入することができる。転移性癌の有効な治療はほとんどなく、通常、転移は死に至る悪い結果の前兆となる。しかし、転移性癌は、通常、十分に脈管形成されており、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位に抗体を濃縮する効果があり得る。転移前でさえも、ほとんどの癌細胞は、その生存のために宿主の血液の供給に依存しており、赤血球に抱合した抗癌抗体はin situ腫瘍に対しても有効であり得る。あるいは、抗体を、他の造血細胞(リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞など)に抱合することができる。
5つの抗体クラスが存在し、それぞれ、その重鎖によって授与される機能に関連する。一般に、裸の抗体による癌細胞の死滅は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)または補体依存性細胞傷害性(CDC)のいずれかによって媒介される。例えば、マウスIgMおよびIgG2a抗体は、補体系のC−1成分の結合およびそれによる古典的補体活性化経路の活性化によってヒト補体を活性化し、それにより、腫瘍を溶解することができる。ヒト抗体について、最も有効な補体活性化抗体は、一般に、IgMおよびIgG1である。IgG2aおよびIgG3アイソタイプのマウス抗体は、Fc受容体を有する細胞傷害性細胞を動員し、それにより、単球、マクロファージ、顆粒球、および一定のリンパ球によって細胞を死滅させるのに有効である。IgG1およびIgG3アイソタイプの両方のヒト抗体は、ADCCを媒介する。
Fc領域によって媒介される細胞傷害性には、エフェクター細胞、その対応する受容体、またはタンパク質(例えば、NK細胞、T細胞、および補体)が存在することが必要である。これらのエフェクター機構の非存在下では、抗体のFc部分は不活性である。抗体のFc部分は、in vivoで抗体の薬物動態学に影響を与える性質を付与することができるが、in vitroではこれを作動しない。
抗体を試験する細胞傷害性アッセイには、いかなるエフェクター機構も存在せず、in vitroで行う。これらのアッセイには、エフェクター細胞(NK、マクロファージ、またはT細胞)または補体が存在しない。これらのアッセイが、共に何を付加するかによって完全に定義されるので、各成分を特徴づけることができる。本明細書中で使用したアッセイは、標的細胞、培地、および血清のみを含む。標的細胞は、癌細胞または線維芽細胞であるので、エフェクター機能を持たない。エフェクター機能特性を持つ外因性細胞を使用しないので、この機能を有する細胞要素が存在しない。培地は、補体やいかなる細胞も含まない。標的細胞の成長を支持するために使用した血清は、補体活性を持たないことが供給元によって開示されている。さらに、本発明者らの研究室では、使用した血清中に補体活性が存在しないことを立証している。したがって、本発明者らの研究は、抗体の影響がFabによって媒介される抗原結合の影響に完全に起因すると言う事実を証明する。有効に、標的細胞は、Fcの受容体を持たないので、Fabのみと遭遇し、相互作用する。ハイブリドーマは標的細胞を使用して試験した完全な免疫グロブリンを分泌するにもかかわらず、細胞と相互作用する免疫グロブリンの一部のみがFabであり、これが抗原結合フラグメントとして作用する。
特許請求の範囲に記載の抗体および抗原結合フラグメントに関して、本願は、出願時に、図1中のデータによって証明するように、細胞傷害性を証明している。上記に指摘し、且つ客観的証拠によって確認するように、この影響は、腫瘍細胞へのFabの結合に完全に起因する。
Fcによって採用されるエフェクター機構と無関係な標的抗原への抗体の直接的結合による抗体媒介細胞傷害性の十分な証拠が技術的に存在する。これについての最良の証拠は、補足的細胞または補体(これらの機構を正式に排除するため)を使用しないin vitro実験である。これらの実験型を、完全な免疫グロブリンまたはF(ab)’2フラグメントなどの抗原結合フラグメントを使用して行った。これらの実験型では、抗体または抗原結合フラグメントは、抗Her2抗体および抗EGFR抗体(共に癌療法における販売について米国FDAによって承認されている)の場合などで標的細胞のアポトーシスを直接誘導することができる。
抗体媒介癌死滅の別の可能な機構は、細胞膜中の種々の化学結合の加水分解を触媒するように機能する抗体およびその関連する糖タンパク質または糖脂質(いわゆる、触媒抗体)の使用を介し得る。
3つのさらなる抗体媒介癌細胞死滅機構が存在する。1つ目は、癌細胞上に存在する推定抗原に対して免疫応答を起こすように身体を誘導するためのワクチンとしての抗体の使用である。2つ目は、成長受容体を標的にしてその機能を妨害するか、その機能が効率的に喪失するように受容体を下方制御するための抗体の使用である。3つ目は、細胞死を指示し得る細胞表面部分の直接ライゲーション(TRAIL R1またはTRAIL R2などの死滅受容体またはαVβ3などのインテグリン分子のライゲーション)に及ぼすかかる抗体の影響である。
制癌剤の臨床的有用性は、患者に体する許容可能なリスクプロフィール下での薬物の利点に基づく。癌療法では、一般に、生存が最も求められている利点であるが、延命に加えて多数の他の十分に認識される利点が存在する。治療によって生存に有害な影響を及ぼさないこれらの他の利点には、症状の緩和、有害事象からの防御、再発期間または無病生存期間の延長、および進行期間の延長が含まれる。これらの基準は一般に許容されており、米国食品医薬品局(F.D.A.)などの規制機関は、これらの利点が得られる薬物を承認している(Hirschfeld et al.Critical Reviews in Oncology/Hematolgy 42:137−143 2002)。これらの基準に加えて、これらの利点型を予測することができる他のエンドポイントが存在することが十分に認識されている。1つには、U.S.F.D.A.によって許可された加速承認審査方式は、患者の利点を予想する可能性が高い代替審査であると認識されている。2003年末現在、この審査方式によって16種の薬物が承認されており、これらのうち、4つが完全承認(full approval)に移行している(すなわち、追跡研究によって、代用評価項目によって予想された患者の直接的利点が証明された)。固形腫瘍における薬物の影響を決定するための1つの重要なエンドポイントは、治療に対する反応の測値絵による腫瘍の全身腫瘍組織量の評価である(Therasse et al.Journal of the National Cancer Institute 92(3):205−216 2000)。かかる評価のための臨床基準(RECIST基準)は、Solid Tumors Working Group(癌の国際的専門グループ)の反応評価基準(Response Evaluation Criteria)によって推奨されている。RECIST基準にしたがって適切なコントロール群と比較した客観的反応として示される腫瘍の全身腫瘍組織量に及ぼす影響が証明されている薬物は、最終的に、患者に直接的な利点が得られる。前臨床場面では、腫瘍の全身腫瘍組織量は、一般に、評価および文書化がより容易である。前臨床研究を臨床場面に変換することができる点において、前臨床モデルで生存期間が延長される薬物は、最も臨床での利用が期待される。臨床治療に対する肯定的反応と類似して、前臨床場面で腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させる薬物も、疾患に対して有意に直接的影響を及ぼし得る。生存の延長が最も求められている制癌剤治療による臨床結果であるにもかかわらず、臨床的に有用な他の利点が存在し、疾患進行の遅延、生存の延長、またはその両方と相関し得る腫瘍の全身腫瘍組織量の減少によっても直接的な利点が得られ、臨床的に影響を及ぼし得ることが明確である(Eckhardt et al.Developmental Therapeutics:Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds;ASCO Educational Book,39th Annual Meeting,2003,pages 209−219)。
本発明は、細胞傷害性アッセイ、動物モデルにおける確立されていない腫瘍の成長および確立された腫瘍の成長ならびに癌性疾患を罹患した動物モデルにおける生存期間の延長におけるその影響によって同定されたAR52A301.5の開発および使用を説明する。本発明は、標的分子(TROP−2)上に存在するエピトープに特異的に結合し、裸の抗体として悪性腫瘍細胞に対してin vitro細胞傷害性を示すが、正常な細胞には示さず、裸の抗体としてヒト癌のin vivoモデルにおいて腫瘍成長の阻害および生存の延長も直接媒介する試薬を最初に記載しているという点で癌治療分野において進歩している。類似の性質を持つことが示されていないので、これは任意の他の前に記載の抗TROP−2抗体に関して進歩している。また、一定の腫瘍型の成長および発達に関連する事象におけるTROP−2の直接的関与を最初に明確に証明しているので、この分野を進歩させている。また、ヒト患者において類似の抗癌性を示す可能性があるので、癌療法を進歩させている。さらなる進歩は、抗癌抗体ライブラリー中にこれらの抗体を含めることにより、異なる抗癌抗体の適切な組み合わせを決定し、それにより、腫瘍の成長および発達を最も有効に標的化および阻害することによって異なる抗原マーカーを発現する腫瘍を標的化する可能性を増大させることである。
まとめると、本発明は、投与した場合に哺乳動物中で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させることができる治療薬の標的としてのAR52A301.5抗原の使用を教示する。本発明はまた、CDMAB(AR52A301.5)ならびにその誘導体および抗原結合フラグメントの使用、ならびにその抗原を標的化して哺乳動物中で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減少させ、それにより、処置した哺乳動物の生存を延長するためのそのリガンドを誘導する細胞傷害性を教示する。さらに、本発明はまた、この抗原を発現する腫瘍を保有する哺乳動物の診断、治療法の予想、および予後診断に有用であり得る癌性細胞中のAR52A301.5抗原の検出の使用を教示する。
したがって、本発明の目的は、特定の個体に由来する癌性細胞または1つまたは複数の特定の癌細胞株に対して惹起した癌性疾患改変抗体(CDMAB)であって、CDMABは癌細胞に対して細胞傷害性を示すと同時に非癌性細胞に対して比較的非毒性を示す、CDMABを産生し、それにより、ハイブリドーマ細胞株およびハイブリドーマ細胞株がコードされる対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントを単離する方法を使用することである。
本発明のさらなる目的は、癌性疾患改変抗体、そのリガンド、および抗原結合フラグメントを教示することである。
本発明のさらなる目的は、その細胞傷害性が抗体依存性細胞傷害性によって媒介される癌性疾患改変抗体を産生することである。
本発明のなおさらなる目的は、その細胞傷害性が補体依存性細胞傷害性によって媒介される癌性疾患改変抗体を産生することである。
本発明のなおさらなる目的は、その細胞傷害性が細胞化学結合での加水分解を触媒する能力の関数である癌性疾患改変抗体を産生することである。
本発明のなおさらなる目的は、癌の診断、予後診断、およびモニタリングのための結合アッセイで有用である癌性疾患改変抗体を産生することである。
本発明の他の目的および利点は、以下の記載から明らかになるであろう。以下の記載は、説明および例示を目的として、本発明の一定の実施形態を記載する。
(図面の簡単な説明)
図1は、細胞株細胞株OCC−1、OVCAR−3、およびCCD−27skに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害率および結合レベルを比較する。
図2は、癌および正常細胞株に対するAR52A301.5および抗EGFR抗体コントロールの結合を表にしている。データを、平均蛍光強度のアイソタイプコントロールに対する増加倍数として示す。
図3は、いくつかの癌細胞株および非癌細胞株に指向するAR52A301.5および抗EGFR抗体の代表的なFACSヒストグラムを含む。
図4は、予防BxPC−3膵臓癌モデルにおける腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図5は、予防BxPC−3膵臓癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図6は、確立BxPC−3膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図7は、確立BxPC−3膵臓癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図8は、予防PL45膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図9は、予防PL45膵臓癌モデルの生存率に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。
図10は、予防PL45膵臓癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図11は、予防PC−3前立腺癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図12は、予防PC−3前立腺癌モデルの生存率に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。
図13は、予防PC−3前立腺癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図14は、予防Colo205結腸癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図15は、予防Colo205結腸癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図16は、MDA−MB−231細胞(レーン1)の全膜画分由来のサンプルならびにPC−3(レーン2)およびCCD−27sk(レーン3)細胞株由来の全細胞溶解物由来のサンプルのウェスタンブロット。ブロットを、AR47A6.4.2およびAR52A301.5を使用して探索した。分子量マーカーを左側に示す。
図17は、MDA−MB−231細胞株の全膜画分由来のAR47A6.4.2(レーン1)およびアイソタイプコントロール(レーン2)での免疫沈降によって調製した免疫複合体のウェスタンブロット。MDA−MB−231の全膜フラクションとインキュベーションしていない抗体抱合タンパク質G−セファロースビーズも、ネガティブコントロールとして使用した(レーン3および4)。複製ブロットを、抗体AR47A6.4.2、AR52A301.5(ハイブリドーマ上清)、IgG2aアイソタイプコントロールを使用するか、一次抗体を使用しないで探索した。サンプルを、還元条件下および非還元条件下でのSDS−PAGE電気泳動によって分析した。分子量マーカーを左側に示す。
図18は、組換えヒトTROP−2のウェスタンブロット。各レーンを、AR52A301.5(レーン1)およびAR47A6.4.2(レーン3)ならびにアイソタイプコントロール抗体(レーン2および4)で探索した。
図19は、AR52A301.5で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化(G)および脱グリコシル化(D)したMDA−MB−231膜タンパク質(MB−231)および組換えヒトTROP−2(rhTROP−2)。
図20は、抗ヒトTROP−2で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化(G)および脱グリコシル化(D)したMDA−MB−231膜タンパク質(MB−231)および組換えヒトTROP−2(rhTROP−2)。
図21は、1B7.11 IgG1アイソタイプコントロールで探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化(G)および脱グリコシル化(D)したMDA−MB−231膜タンパク質(MB−231)および組換えヒトTROP−2(rhTROP−2)。
図22は、異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトTROP−2のウェスタンブロット。レーン3〜7を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR52A301.5とそれぞれ混合したビオチン化AR52A301.5で探索した。レーン9〜13を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR47A6.4.2とそれぞれ混合したビオチン化AR52A301.5で探索した。レーン15〜19を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化8A3B.6とそれぞれ混合したビオチン化AR52A301.5で探索した。レーン8および14をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン8を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン1、2、および20を、TBSTのみとインキュベーションした。
図23は、異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトTROP−2のウェスタンブロット。レーン3〜7を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR52A301.5とそれぞれ混合したビオチン化AR47A6.4.2で探索した。レーン9〜13を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR47A6.4.2とそれぞれ混合したビオチン化AR47A6.4.2で探索した。レーン15〜19を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化1B7.11とそれぞれ混合したビオチン化AR47A6.4.2で探索した。レーン8および14をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン8を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン1、2、および20を、TBSTのみとインキュベーションした。
図24は、正常なヒト組織マイクロアレイにおけるAR52A301.5対ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのIHC比較を表にしている。
図25は、正常なヒト組織マイクロアレイ由来のAR52A301.5(A)またはアイソタイプコントロール抗体(B)を使用して得た脾臓ならびにAR52A301.5(C)またはアイソタイプコントロール抗体(D)を使用して得た脳組織の結合パターンを示す代表的顕微鏡写真。倍率は200倍である。
図26は、異なる正常なヒト組織マイクロアレイ由来の種々のヒト腫瘍および正常な組織切片におけるAR52A301.5のIHC比較を表にしている。
図27は、種々のヒト腫瘍組織マイクロアレイ由来のAR52A301.5(A)またはアイソタイプコントロール抗体(B)を使用して得た乳房腫瘍組織、AR52A301.5(C)またはアイソタイプコントロール抗体(D)を使用して得た前立腺腫瘍組織、AR52A301.5(E)またはアイソタイプコントロール抗体(F)を使用して得た膵臓腫瘍組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は200倍である。
図28は、異なる正常な種の組織マイクロアレイ由来の種々のヒトおよび他の種の正常な組織切片におけるAR52A301.5のIHC比較を表にしている。
図29は、種々の複数の種の組織マイクロアレイ由来のAR52A301.5(A)またはアイソタイプコントロール抗体(B)を使用して得た正常なヒト腎臓組織、AR52A301.5(C)またはアイソタイプコントロール抗体(D)を使用して得た正常なカニクイザル腎臓組織、およびAR52A301.5(E)またはアイソタイプコントロール抗体(F)を使用して得た正常なアカゲザル組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は200倍である。
図30は、AR52A301.5のマウス配列決定で使用した全オリゴヌクレオチドプライマーの配列(配列番号9〜46)。
図31は、AR52A301.5のVH領域およびVL領域のRT/PCR増幅のアガロースゲル。
図32は、AR52A301.5のVH−B、VH−E、およびVL−GのPCRコロニースクリーンのアガロースゲル。
図33は、AR52A301.5のVLアミノ酸配列(配列番号8)。
図34は、AR52A301.5のVHアミノ酸配列(配列番号7)。
図1は、細胞株細胞株OCC−1、OVCAR−3、およびCCD−27skに対するハイブリドーマ上清の細胞傷害率および結合レベルを比較する。
図2は、癌および正常細胞株に対するAR52A301.5および抗EGFR抗体コントロールの結合を表にしている。データを、平均蛍光強度のアイソタイプコントロールに対する増加倍数として示す。
図3は、いくつかの癌細胞株および非癌細胞株に指向するAR52A301.5および抗EGFR抗体の代表的なFACSヒストグラムを含む。
図4は、予防BxPC−3膵臓癌モデルにおける腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図5は、予防BxPC−3膵臓癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図6は、確立BxPC−3膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図7は、確立BxPC−3膵臓癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図8は、予防PL45膵臓癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図9は、予防PL45膵臓癌モデルの生存率に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。
図10は、予防PL45膵臓癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図11は、予防PC−3前立腺癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図12は、予防PC−3前立腺癌モデルの生存率に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。
図13は、予防PC−3前立腺癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図14は、予防Colo205結腸癌モデルの腫瘍成長に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。縦線は、抗体を投与した期間を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図15は、予防Colo205結腸癌モデルの体重に及ぼすAR52A301.5の影響を示す。データポイントは、平均+/−SEMを示す。
図16は、MDA−MB−231細胞(レーン1)の全膜画分由来のサンプルならびにPC−3(レーン2)およびCCD−27sk(レーン3)細胞株由来の全細胞溶解物由来のサンプルのウェスタンブロット。ブロットを、AR47A6.4.2およびAR52A301.5を使用して探索した。分子量マーカーを左側に示す。
図17は、MDA−MB−231細胞株の全膜画分由来のAR47A6.4.2(レーン1)およびアイソタイプコントロール(レーン2)での免疫沈降によって調製した免疫複合体のウェスタンブロット。MDA−MB−231の全膜フラクションとインキュベーションしていない抗体抱合タンパク質G−セファロースビーズも、ネガティブコントロールとして使用した(レーン3および4)。複製ブロットを、抗体AR47A6.4.2、AR52A301.5(ハイブリドーマ上清)、IgG2aアイソタイプコントロールを使用するか、一次抗体を使用しないで探索した。サンプルを、還元条件下および非還元条件下でのSDS−PAGE電気泳動によって分析した。分子量マーカーを左側に示す。
図18は、組換えヒトTROP−2のウェスタンブロット。各レーンを、AR52A301.5(レーン1)およびAR47A6.4.2(レーン3)ならびにアイソタイプコントロール抗体(レーン2および4)で探索した。
図19は、AR52A301.5で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化(G)および脱グリコシル化(D)したMDA−MB−231膜タンパク質(MB−231)および組換えヒトTROP−2(rhTROP−2)。
図20は、抗ヒトTROP−2で探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化(G)および脱グリコシル化(D)したMDA−MB−231膜タンパク質(MB−231)および組換えヒトTROP−2(rhTROP−2)。
図21は、1B7.11 IgG1アイソタイプコントロールで探索した、変性条件下および非変性条件下でグリコシル化(G)および脱グリコシル化(D)したMDA−MB−231膜タンパク質(MB−231)および組換えヒトTROP−2(rhTROP−2)。
図22は、異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトTROP−2のウェスタンブロット。レーン3〜7を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR52A301.5とそれぞれ混合したビオチン化AR52A301.5で探索した。レーン9〜13を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR47A6.4.2とそれぞれ混合したビオチン化AR52A301.5で探索した。レーン15〜19を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化8A3B.6とそれぞれ混合したビオチン化AR52A301.5で探索した。レーン8および14をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン8を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン1、2、および20を、TBSTのみとインキュベーションした。
図23は、異なる一次抗体溶液で探索した組換えヒトTROP−2のウェスタンブロット。レーン3〜7を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR52A301.5とそれぞれ混合したビオチン化AR47A6.4.2で探索した。レーン9〜13を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化AR47A6.4.2とそれぞれ混合したビオチン化AR47A6.4.2で探索した。レーン15〜19を、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの非ビオチン化1B7.11とそれぞれ混合したビオチン化AR47A6.4.2で探索した。レーン8および14をネガティブコントロール溶液とインキュベーションし、レーン8を二次溶液中でインキュベーションしなかった。レーン1、2、および20を、TBSTのみとインキュベーションした。
図24は、正常なヒト組織マイクロアレイにおけるAR52A301.5対ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのIHC比較を表にしている。
図25は、正常なヒト組織マイクロアレイ由来のAR52A301.5(A)またはアイソタイプコントロール抗体(B)を使用して得た脾臓ならびにAR52A301.5(C)またはアイソタイプコントロール抗体(D)を使用して得た脳組織の結合パターンを示す代表的顕微鏡写真。倍率は200倍である。
図26は、異なる正常なヒト組織マイクロアレイ由来の種々のヒト腫瘍および正常な組織切片におけるAR52A301.5のIHC比較を表にしている。
図27は、種々のヒト腫瘍組織マイクロアレイ由来のAR52A301.5(A)またはアイソタイプコントロール抗体(B)を使用して得た乳房腫瘍組織、AR52A301.5(C)またはアイソタイプコントロール抗体(D)を使用して得た前立腺腫瘍組織、AR52A301.5(E)またはアイソタイプコントロール抗体(F)を使用して得た膵臓腫瘍組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は200倍である。
図28は、異なる正常な種の組織マイクロアレイ由来の種々のヒトおよび他の種の正常な組織切片におけるAR52A301.5のIHC比較を表にしている。
図29は、種々の複数の種の組織マイクロアレイ由来のAR52A301.5(A)またはアイソタイプコントロール抗体(B)を使用して得た正常なヒト腎臓組織、AR52A301.5(C)またはアイソタイプコントロール抗体(D)を使用して得た正常なカニクイザル腎臓組織、およびAR52A301.5(E)またはアイソタイプコントロール抗体(F)を使用して得た正常なアカゲザル組織の結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真。倍率は200倍である。
図30は、AR52A301.5のマウス配列決定で使用した全オリゴヌクレオチドプライマーの配列(配列番号9〜46)。
図31は、AR52A301.5のVH領域およびVL領域のRT/PCR増幅のアガロースゲル。
図32は、AR52A301.5のVH−B、VH−E、およびVL−GのPCRコロニースクリーンのアガロースゲル。
図33は、AR52A301.5のVLアミノ酸配列(配列番号8)。
図34は、AR52A301.5のVHアミノ酸配列(配列番号7)。
一般に、概要、説明、実施例、および特許請求の範囲で使用した場合、以下の用語または句は、示した定義を有する。
用語「抗体」を、最も広い意味で使用し、具体的には、例えば、単一のモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、脱免疫化(de−immunized)抗体、マウス抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体が含まれる)、多エピトープ特異性を有する中和抗体、単鎖抗体、二特異性抗体(diabody)、三特異性抗体(triabody)、免疫抱合体、および抗体フラグメント(以下を参照のこと)を対象とする。
本明細書中で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得た抗体をいう(すなわち、この集団を含む各抗体は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いて同一である)。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向する。その特異性に加えて、他の抗体によって汚染されることなく合成することができるという点で、モノクローナル抗体は有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法によって抗体を産生する必要があると解釈される。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体を、Kohler et al.,Nature,256:495(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ(マウスまたはヒト)法によって作製することができるか、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと)によって作製することができる。「モノクローナル抗体」を、例えば、Clackson et al.,Nature,352:624−628(1991)およびMarks et al,J.MoI.Biol,222:581−597(1991)に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくは、抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、全長未満の抗体(Fab、Fab’、
F(ab’)2、およびFvフラグメント)、二特異性抗体、単鎖抗体分子、単鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質、抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれる。
F(ab’)2、およびFvフラグメント)、二特異性抗体、単鎖抗体分子、単鎖抗体、単一ドメイン抗体分子、融合タンパク質、組換えタンパク質、抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれる。
「インタクトな」抗体は、抗原結合可変領域ならびに軽鎖定常ドメイン(CL)および重鎖定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)を含む抗体である。定常ドメインは、未変性配列の定常ドメイン(例えば、ヒト未変性配列の定常ドメイン)またはそのアミノ酸配列変異型であり得る。好ましくは、インスタントな抗体は、1つまたは複数のエフェクター機能を有する。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体を、異なる「クラス」に割り当てることができる。インタクトな抗体には5つの主なクラス(IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM)が存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2)にさらに分類することができる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
抗体「エフェクター機能」は、抗体のFc領域(未変性配列のFc領域またはアミノ酸配列変異Fc領域)に起因し得る生物活性をいう。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合、補体依存性細胞傷害性、Fc受容体結合、抗体依存性細胞誘導細胞傷害性(ADCC)、食作用、細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体;BCR)の下方制御などが含まれる。
「抗体依存性細胞誘導細胞傷害性」および「ADCC」は、Fc受容体(FcR)(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞を溶解する細胞媒介反応をいう。ADCCの媒介のための初代細胞(NK細胞)はFcγRIIIのみを発現するのに対して、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現発現は、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457−92(1991)の464頁の表3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、in vitro ADCCアッセイ(米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記載のアッセイなど)を行うことができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、目的の分子のADCC活性を、in vivoで(例えば、動物モデル(Clynes et al.PNAS(USA)95:652−656(1998)などに記載の動物モデルなど)で)評価することができる。
「エフェクター細胞」は、1つまたは複数のFcRを発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を実施する。ADCCを媒介するヒト白血球には、末梢血単核球(PBMC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、細胞傷害性T細胞、および好中球が含まれ、PBMCおよびNK細胞が好ましい。エフェクター細胞を、その未変性供給源(例えば、本明細書中に記載の血液またはPBMC)から単離することができる。
用語「Fc受容体」または「FcR」を、抗体のFc領域に結合する受容体を説明するために使用する。好ましいFcRは、未変性配列のヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体(γ受容体)に結合するFcRであり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体(対立遺伝子変異形(variant)およびこれらの受容体の選択的スプライシング形態が含まれる)が含まれる。FcγRII受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するFcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「阻害受容体」)が含まれる。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメイン中に免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメイン中に免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含む(Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203−234(1997)の概説を参照のこと)。FcRは、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457−92(1991);Capel et al,Immunomethods 4:25−34(1994);およびde Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330−41(1995)に概説されている。他のFcR(将来的に同定されるFcRが含まれる)は、本明細書中の用語「FcR」に含まれる。この用語には、母親のIgGの胎児への輸送を担う新生児受容体FcRnも含まれる(Guyer et al,J.Immunol.1 17:587(1976)およびKim et al,Eur.J.Immunol.24:2429(1994))。
「補体依存性細胞傷害性」または「CDC」は、補体の存在下で分子が標的を溶解する能力をいう。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した分子(例えば、抗体)への補体系(C1q)の第1成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano−Santoro et al,J.Immunol.Methods 202:163(1996)に記載のCDCアッセイを行うことができる。
用語「可変」は、可変ドメインの一定の部分の配列が抗体間で非常に異なるという事実をいい、その特定の抗原に対する特定の各抗体の結合および特異性で使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。可変性は、軽鎖および重鎖の両可変ドメイン中に超可変領域と呼ばれる3つのセグメント中に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分を、フレームワーク領域(FR)と呼ぶ。未変性重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、4つのFRを含み、これらは主にβシート立体配置を取り、3つの超可変領域によって結合してループ結合を形成し、いくつかの場合、βシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変領域は、FRによって他の鎖由来の超可変領域と極めて接近してつなぎ合わされ、これが、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)を参照のこと)。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す(抗体依存性細胞傷害性(ADCC)における抗体の関与など)。
本明細書中で使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、および89〜97(L3)ならびに重鎖可変ドメイン中の残基31〜35(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3);Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))および/または「超可変ループ」由来の残基(例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基2632(L1)、50〜52(L2)、および91〜96(L3)ならびに重鎖可変ドメイン中の残基26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3);Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901−917(1987))を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書中で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。抗体のパパイン消化により、「Fab」ドメインと呼ばれる2つの同一の抗原結合フラグメント(それぞれ、単一の抗原結合部位を有する)および残りの「Fc」フラグメント(その名称は容易に結晶化する能力を反映している)が産生される。ペプシン処理により、F(ab’)2フラグメントが得られ、これは、2つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、1つの重鎖および1つの軽鎖の可変ドメインが強固に非共有結合した二量体からなる。この立体配置において、各可変ドメインの3つの超可変領域が相互作用して、VH−VL二量体表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に、6つの超可変領域が、抗体に抗原結合親和性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的に3つの超可変領域のみを含むFvの半分)は、全結合部位よりも低い親和性にもかかわらず、抗原を認識して結合する能力を有する。Fab領域は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab’フラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に少数のシステイン(抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインが含まれる)が付加されている点がFabフラグメントと異なる。Fab’−SHは、本明細書中で、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも1つの遊離チオール基を保有するFab’についての表示である。F(ab’)2抗体フラグメントは、当初は、このフラグメント間にヒンジシステインを有するFab’フラグメント対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確な型の1つに割り当てることができる。
「単鎖Fv」または「scFv」抗体フラグメントは、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することができる。scFvの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antivbody,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,New York,pp.269−315(1994)を参照のこと。
用語「二特異性抗体」は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいう。このフラグメントは、同一のポリペプチド鎖中の可変軽鎖ドメイン(VL)に連結した可変重鎖ドメイン(VH)を含む(VH−VL)。短すぎて同一鎖上で2つのドメインが対合できないリンカーの使用により、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと強制的に対合し、2つの抗原結合部位が作製される。二特異性抗体は、例えば、欧州特許第404,097号;WO 93/11161;およびHollinger et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448(1993)により完全に記載されている。
用語「三特異性抗体」または「三価抗体」は、3つの単鎖抗体の組み合わせをいう。三特異性抗体を、VLまたはVHドメインのアミノ酸末端を使用して(すなわち、いかなるリンカー配列も使用しない)構築する。三特異性抗体は、環状のヘッドトゥーテール様式で整列されたポリペプチドを有する3つ7のFvヘッドを有する。三特異性抗体の可能な高次構造は、互いに平面に対して120°の角度で存在する3つの結合部位を有する平面である。三特異性抗体は、単一特異性、二重特異性、または三重特異性であり得る。
「単離」抗体は、同定され、その自然環境成分から単離および/または回収された抗体である。その自然環境の夾雑成分は、抗体の診断または治療での使用を妨害する可能性のある材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性の溶質が含まれ得る。単離抗体には、組換え細胞内のin situ抗体が含まれる。これは、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないからである。しかし、通常、単離抗体を、少なくとも1つの精製工程によって調製するであろう。
目的の抗原(例えば、TROP−2抗原)「に結合する」抗体は、抗体が抗原を発現する細胞の標的化における治療薬または診断薬として有用であるような十分な親和性で抗原に結合することができる抗体である。抗体がTROP−2に結合する抗体である場合、通常、他の受容体とは対照的にTROP−2に優先的に結合し、非特異的Fc接触または他の抗原と共通の翻訳後修飾などの偶発的な結合は含まれず、他のタンパク質と有意に交差反応しない抗体であり得る。目的の抗原に結合する抗体の検出方法は当該分野で周知であり、FACS、細胞ELISA、およびウェスタンブロットなどのアッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書中で使用される場合、表現「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」は、相互交換可能に使用され、全てのかかる表示には、子孫が含まれる。意図的または非意図的な変異により、全ての子孫はDNA含有量が正確に同一でなくて良い。最初に形質転換した細胞についてスクリーニングした場合に同一の機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。異なる表示が意図される場合、文脈から明らかであろう。
「処置(treatment)または処置(treating)」は、標的化した病態または障害を防止または遅延(減少)することを目的とする治療上の処置および予防または防止手段の両方をいう。処置を必要とする者には、既に障害を有する者および障害を有する傾向のある者または障害を防止すべき者が含まれる。したがって、本明細書中の処置すべき哺乳動物は、障害を有するか障害に罹りやすいか影響を受けやすいと診断され得る。
用語「癌」および「癌性」は、典型的には、無秩序な細胞の成長または死滅によって特徴づけられる哺乳動物の生理学的容態をいうか説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれ得るが、これらに限定されない。かかる癌のより詳細な例には、扁平上皮癌(例えば、扁平上皮癌(epithelial squamous cell cancer))、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺の扁平上皮癌が含まれる)、腹膜癌、肝細胞癌、消化管の癌または胃癌(消化管癌が含まれる)、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌が含まれる。
「化学療法薬」は、癌治療に有用な化合物である。化学療法薬の例には、以下が含まれる:アルキル化剤(チオテパおよびシクロスホスファミド(サイトキサン(商標))など);アルキルスルホナート(ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど);アジリジン(ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)など);エチレンイミンおよびメチリアメラミン(methylamelamine)(アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロロメラミン(trimethylolomelamine)が含まれる);ナイトロジェンマスタード(クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、エンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど);ニトロソ尿素(nitrosureas)(カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど);抗生物質(アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン(carabicin)、カルノマイシン(carnomycin)、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど);代謝拮抗物質(メトトレキサートおよび5−フルオロウラシル(5−FU)など);葉酸アナログ(デノプテリン(denopterin)、メトトレキサート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトトレキサートなど);プリンアナログ(フルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど);ピリミジンアナログ(アンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、5−FUなど);アンドロゲン(カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど);抗副腎物質(anti−adrenal)(アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補給物質(folic acid replenisher)(フロリン酸(frolinic acid)など);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エデトラキサート(edatraxate);デホファミン(defofamine);デメコルシン;ジアジクオン;エフロールニチン(elformithine);エリプチニウムアセタート;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダニン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標);ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2"−triクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキサン(例えば、パクリタキセル(タキソール(登録商標)、Bristol−Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)およびドセタキセル(タキソテール(登録商標)、Aventis、Rhone−Poulenc Rorer、Antony、France);クロラムブシル;ゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金アナログ(シスプラチンおよびカルボプラチンなど);ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イフォスファミド;マイトマイシン C;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT−11;トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン;および上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体。腫瘍のホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン薬(抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)−イミダゾール、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(フェアストン)が含まれる);抗アンドロゲン(フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど))、および上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体も本定義に含まれる。
治療するための「哺乳動物」は、哺乳動物に分類される任意の動物(ヒト、マウス、SCIDマウス、ヌードマウス、またはマウス系統、家畜、動物園の動物、競技用動物(ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシなど)が含まれる)をいう。好ましくは、本明細書中の哺乳動物は、ヒトである。
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法(固相技術を使用したホスホトリエステル、亜リン酸塩、またはホスホルアミダイト化学(1988年3月4日公開の欧州特許第266,032号に記載の技術など)またはFroehler et ah,Nucl.Acids Res.,14:5399−5407,1986に記載のデオキシヌクレオシドHホスホン酸中間体を介した技術など)によって化学合成される短い一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。次いで、オリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲルで精製する。
本発明によれば、非ヒト(例えば、マウス)免疫グロブリンの「ヒト化」および/または「キメラ」形態は、元の抗体と比較してヒト抗マウス抗体(HAMA)、ヒト抗キメラ抗体(HACA)、またはヒト抗ヒト抗体(HAHA)の応答を減少させる特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそのフラグメント(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、または抗体の他の抗原結合サブシーケンスなど)を含み、所望の影響の再現に必要な非ヒト免疫グロブリン由来の必要な部分(例えば、CDR、抗原結合領域、および可変領域など)を含むと同時に非ヒト免疫グロブリンに匹敵する結合特性を保持する抗体をいう。大部分で、ヒト化抗体は、レシピエント抗体の相補性決定領域(CDR)由来の残基を所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種(マウス、ラット、またはウサギなど)のCDR由来の残基(ドナー抗体)に置換するヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基を、対応する非ヒトFR残基に置換する。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体や移入されるCDRまたはFR配列のいずれでも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾により、抗体の能力がさらに洗練および至適化される。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのCDR領域は非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に相当し、全てまたは実質的に全てのFR残基はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR残基である。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部(典型的には、ヒト免疫グロブリンのFc少なくとも一部)を含むであろう。
「脱免疫化」抗体は、所与の種に体して非免疫原性を示すかより小さな免疫原性を示す免疫グロブリンである。抗体の構造代替物によって脱免疫化を行うことができる。当業者に公知の任意の脱免疫化技術を使用することができる。1つの適切な抗体の脱免疫化技術は、例えば、2000年6月15日に公開のWO 00/34317号に記載されている。
「アポトーシス」を誘導する抗体は、アネキシンVの結合、カスパーゼ活性、DNAの断片化、細胞の縮み、小胞体の膨張、細胞の断片化、および/または膜小胞(アポトーシス小体と呼ばれる)の形成(これらに限定されない)によって例示される任意の手段によってプログラム細胞死を誘導する抗体である。
本明細書中で使用される場合、「抗体誘導細胞傷害性」は、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生されたハイブリドーマ上清または抗体由来の細胞傷害効果を意味すると理解される。この効果は、必ずしも結合の程度に関連するわけではない。
本明細書を通して、ハイブリドーマ細胞株およびこれらによって産生される単離モノクローナル抗体を、二者択一的に、内部表示(internal desigunation)(AR52A301.5)または寄託番号(Depository Designation)(IDAC141205−03)という。
本明細書中で使用される場合、「抗体−リガンド」は、標的抗原の少なくとも1つのエピトープに対して結合親和性を示し、インタクトな抗体分子、抗体フラグメント、および少なくとも抗原結合領域またはその一部(すなわち、抗体分子の可変部分)を有する任意の分子(例えば、IDAC141205−03と指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合される抗原(IDAC141205−03抗原)の少なくとも1つのエピトープを特異的に認識して結合するFv分子、Fab分子、Fab’分子、F(ab’)2分子、二重特異性抗体、融合タンパク質、または任意の遺伝子操作された分子)であり得る部分を含む。
本明細書中で使用される場合、「癌性疾患改変抗体」(CDMAB)は、患者に有利な様式(例えば、腫瘍保有個体の全身腫瘍組織量の減少または生存の延長)で癌性脂環過程を改変するモノクローナル抗体およびその抗体−リガンドをいう。
「CDMAB関連結合薬」は、その最も広い意味で、少なくとも1つのCDMAB標的エピトープに競合的に結合する任意の形態のヒトまたは非ヒト抗体、抗体フラグメント、または抗体リガンドなどが含まれるが、これらに限定されないと理解される。
「競合結合剤」は、少なくとも1つのCDMAB標的エピトープに対する結合親和性を有する任意の形態のヒトまたは非ヒト抗体、抗体フラグメント、または抗体リガンドなどが含まれると理解される。
処置すべき腫瘍には、原発性腫瘍および転移性腫瘍ならびに難治性腫瘍が含まれる。難治性腫瘍には、化学療法薬のみ、抗体のみ、照射のみ、またはその組み合わせを使用した治療に応答できないか耐性を示す腫瘍が含まれる。難治性腫瘍はまた、かかる薬剤での治療によって阻害される用であるが、治療中断から5年以内、時折10年まで、またはそれを超えて再発する腫瘍を含む。
治療することができる腫瘍には、非脈管形成腫瘍、実質的に依然として脈管形成腫瘍しない腫瘍、および脈管形成腫瘍が含まれる。適宜に治療することができる固形腫瘍の例には、乳癌、肺癌、直腸結腸癌、膵臓癌、膠腫、およびリンパ腫が含まれる。かかる腫瘍のいくつかの例には、類上皮腫、扁平細胞腫(squamous tumor)(頭頸部腫瘍など)、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍(小細胞肺癌および非小細胞肺癌が含まれる)、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、および肝臓腫瘍が含まれる。他の例には、カポジ肉腫、CNS新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫、大脳転移、黒色腫、消化管癌、腎癌、肉腫、横紋筋肉腫、膠芽細胞腫、好ましくは、多形性膠芽細胞腫および平滑筋肉腫が含まれる。
本明細書中で使用される場合、「抗原結合領域」は、標的抗原を認識する分子の一部を意味する。
本明細書中で使用される場合、「競合的に阻害する」は、従来の相互抗体競合アッセイを使用してIDAC141205−03と指定されたハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体(IDAC 141205−03抗体)が指向する決定部位を認識して結合することができることを意味する(Belanger L.,Sylvestre C.and Dufour D.(1973),Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures.Clinica Chimica Acta 48,15)。
本明細書中で使用される場合、「標的抗原」は、IDAC141205−03抗原またはその一部である。
本明細書中で使用される場合、「免疫抱合体」は、任意の分子またはCDMAB(細胞毒素、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍薬、または治療薬に化学的または生物学的に結合した抗体など)を意味する。抗体またはCDMABを、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、細胞毒素、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、酵素、毒素、抗腫瘍薬、または治療薬に結合することができる。免疫抱合体の例には、抗体毒素化学抱合体および抗体−毒素融合タンパク質が含まれる。
抗腫瘍薬としての使用に適切な放射性物質は、当業者に公知である。例えば、131Iまたは211Atを使用する。これらの同位体を、従来の技術を使用して抗体に結合する(例えば、Pedley et al.,Br.J.Cancer 68,69−73(1993))。あるいは、抗体に結合する抗腫瘍薬は、プロドラッグを活性化させる酵素である。一旦抗体複合体が投与されると腫瘍部位に到達するまで不活性形態を維持し、腫瘍部位でその細胞毒形態に変換されるプロドラッグを投与することができる。実際には、抗体−酵素抱合体を患者に投与し、治療すべき組織領域に局在させる。次いで、治療すべき組織領域で細胞傷害薬に変換するようにプロドラッグを患者に投与する。あるいは、抗体に抱合した抗腫瘍薬は、サイトカイン(インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−4(IL−4)、または腫瘍壊死因子α(TNF−α)など)である。サイトカインが他の組織に影響を及ぼすことなく腫瘍の損傷または破壊を媒介するように、抗体によってサイトカインが腫瘍を標的にする。従来の組換えDNA技術を使用して、サイトカインをDNAレベルで抗体に融合する。インターフェロンを使用することもできる。
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、抗原結合領域が生物学的に活性な分子(例えば、毒素、酵素、蛍光タンパク質、発光マーカー、ポリペプチドタグ、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、またはタンパク質薬)に連結された任意のキメラタンパク質を意味する。
本発明は、さらに、標的またはレポーター部分が結合してイル本発明のCDMABを意図する。標的部分は、結合対の第1のメンバーである。抗腫瘍薬を、例えば、かかる対の第2のメンバーに抱合し、それにより、抗原結合タンパク質が結合する部位に指向する。かかる結合対の一般例は、アビジンおよびビオチンである。好ましい実施形態では、ビオチンを、本発明のCDMABの標的抗原に抱合し、それにより、アビジンまたはストレプトアビジンが抱合する抗腫瘍薬または他の部分の標的が得られる。あるいは、ビオチンまたは別のかかる部分を、本発明のCDMABの標的抗原に連結し、例えば、検出可能なシグナル発生物質をアビジンまたはストレプトアビジンに抱合する診断系でレポーターとして使用する。
検出可能なシグナル発生物質は、in vivoおよびin vitroでの診断で有用である。シグナル発生物質は、外部手段(通常、電磁波放射線の測定)によって検出可能な測定シグナルを発生する。大部分で、シグナル発生物質は、酵素または発色団であるか、蛍光、リン光、または化学発光によって発光する。発色団には、紫外領域もしくは可視領域で光を吸収する色素が含まれ、酵素触媒反応の基質または分解産物であり得る。
さらに、当業者に周知の調査方法または診断方法のためのin vivoおよびin vitroでの本発明のCDMABの使用が本発明の範囲内に含まれる。本明細書中で意図するように診断方法を実施するために、本発明は、さらに、本発明のCDMABを含むキットを含み得る。かかるキットは、かかる個体の細胞上のCDMABの標的抗原の過剰発現の検出による一定の癌型のリスクのある個体の同定に有用であろう。
診断アッセイキット
腫瘍の存在の決定のために、診断アッセイキットの形態で本発明のCDMABを使用することが意図される。患者中の腫瘍を、一般に、1つまたは複数の腫瘍特異的抗原(例えば、患者から得た生体サンプル(血液、血清、尿、および/または腫瘍生検など)中のタンパク質および/またはかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド)の存在に基づいて検出する。
腫瘍の存在の決定のために、診断アッセイキットの形態で本発明のCDMABを使用することが意図される。患者中の腫瘍を、一般に、1つまたは複数の腫瘍特異的抗原(例えば、患者から得た生体サンプル(血液、血清、尿、および/または腫瘍生検など)中のタンパク質および/またはかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド)の存在に基づいて検出する。
タンパク質は、特定の腫瘍(例えば、結腸腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、または前立腺腫瘍)の有無を示すマーカーとして機能する。抗原が他の癌性腫瘍の検出のために使用されることがさらに意図される。本発明のCDMABから構成される結合薬またはCDMAB関連結合薬を診断アッセイキット中に含めることにより、生体サンプル中の結合薬に結合する抗原のレベルを検出することができる。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを使用して、腫瘍タンパク質をコードするmRNAレベルを検出することができ、このレベルは、癌の有無も示す。結合アッセイで診断するために、正常な組織中に存在する抗原レベルに関して、統計的に有意な抗原レベルと相関するデータを作製し、それにより、癌性腫瘍の存在を明確に診断する結合を認識する。当業者に公知のように、サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するための結合薬を使用するための本発明の診断アッセイに複数の形式が有用であることが意図される。例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988に例示されている。上記診断アッセイ形質の任意および全ての組み合わせ、並べ替え、または修正形態がさらに意図される。
患者中の癌の有無を、典型的には、(a)患者から得た生体サンプルを結合薬と接触させること、(b)サンプル中の結合薬に結合するポリペプチドレベルを検出すること、および(c)ポリペプチドレベルと所定のカットオフ値を比較することによって決定する。
例示的実施形態では、アッセイがサンプルの残存物由来のポリペプチドに結合してこれを除去するための固体支持体上に固定したCDMABベースの結合薬の使用を含むことが意図される。次いで、結合したポリペプチドを、レポーター基を含み、結合薬/ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出することができる。例示的検出試薬には、ポリペプチドもしくは抗体に特異的に結合するCDMABベースの結合薬または結合薬に特異的に結合する他の薬剤(抗免疫グロブリン、タンパク質G、タンパク質A、またはレクチンなど)が含まれ得る。別の実施形態では、ポリペプチドをレポーター基で標識し、結合薬のサンプルとのインキュベーション後に固定した結合薬と結合させる競合アッセイを使用することができることが意図される。サンプルと固定した結合薬が示す反応性は、サンプル成分が結合薬への標識ポリペプチドの結合を阻害する範囲である。かかるアッセイでの使用に適切なポリペプチドには、結合薬が結合親和性を有する全長腫瘍特異的タンパク質および/またはその部分が含まれる。
タンパク質を結合することができる当業者に公知の任意の材料の形態であり得る固体支持体を有する診断キットを提供する。適切な例には、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜が含まれ得る。あるは、支持体は、ビーズまたはディスク(ガラス、グラスファイバー、ラテックス、またはプラスチック材料(ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルなど)など)であり得る。支持体は、磁性粒子または光ファイバーセンサ(例えば、米国特許第5,359,681号に開示のものなど)であり得る。
特許および科学文献に十分に記載されている当業者に公知の種々の技術を使用して、結合剤を固体支持体上に固定すると認識される。用語「固定」は、吸着などの非共有結合および共有結合の両方をいい、本発明の文脈では、支持体上の作用因子(agent)と官能基との直接結合であり得るか、架橋剤による連結であり得る。好ましいが非限定的な実施形態では、吸着によるマイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への固定が好ましい。適切な緩衝液中での結合薬の固体支持体との適切な時間の接触によって吸着することができる。接触時間は温度に伴って変化することができ、一般に、約1時間と約1日との間の範囲内であろう。
支持体と結合薬の官能基(ヒドロキシル基またはアミノ基など)との両方と反応する二官能性試薬との支持体の第1の反応によって、結合薬を抗体支持体に共有結合する。例えば、ベンゾキノンを使用した適切なポリマーコーティングまたは支持体上のアルデヒド基の結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合によって、結合剤を支持体に共有結合することができる。(例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook,1991 ,at A12 A13を参照のこと)。
診断アッセイキットは2抗体サンドイッチアッセイの形態を取るとさらに認識される。サンプル内のポリペプチドが固定した抗体に結合するように抗体(例えば、固体支持体(一般に、マイクロタイタープレートのウェル)上に固定した本発明に開示のCDMAB)をサンプルと接触させることによってこのアッセイを行うことができる。次いで、非結合サンプルを固定したポリペプチド−抗体複合体から除去し、レポーター基を含む検出試薬(好ましくは、ポリペプチド上の異なる部位に結合することができる第2の抗体)を添加する。次いで、固体支持体に結合したままの検出試薬の量を、特異的レポーター基に適切な方法を使用して決定する。
特定の実施形態では、上記のように一旦抗体が支持体上に固定されると、支持体上の残りのタンパク質結合部分が当業者に公知の任意の適切な遮断薬(ウシ血清アルブミンまたはTween20(商標)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)など)の使用によって遮断されることが意図される。次いで、固定化抗体をサンプルと共にインキュベーションし、ポリペプチドを抗体と結合させる。インキュベーション前に、サンプルを、適切な希釈剤(リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)など)で希釈することができる。一般に、適切な接触時間(すなわち、インキュベーション時間)を、具体的に選択した腫瘍を有する個体から得たサンプル内のポリペプチドの存在の検出に十分なに相当するように選択する。好ましくは、接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡を達成するレベル少なくとも約95%である結合レベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡を達成するのに必要な時間を、ある期間にわたる結合レベルのアッセイによって容易に決定することができることを認識するであろう。
非結合サンプルを適切な緩衝液での固体支持体の洗浄によって除去することがさらに意図される。次いで、レポーター基を含む二次抗体を、固体支持体に添加する。結合ポリペプチドを検出するのに十分な時間、固定化した抗体−ポリペプチド複合体との検出試薬のインキュベーションを行う。その後、非結合検出試薬を除去し、結合検出試薬をレポーター基を使用して検出する。レポーター基の検出に使用した方法は、選択したレポーター基の型(例えば、放射性基)に特異的である必要があり、シンチレーションカウンティングまたはオートラジオグラフィ法が一般に適切である。分光法を使用して、色素、発光基、および蛍光基を検出することができる。異なるレポーター基(一般に、放射性基、蛍光基、または酵素)にカップリングしたアビジンを使用して検出することができる。酵素レポーター基を、一般に、基質の添加(一般に、特定の期間)およびその後の反応産物の分光分析または他の分析によって検出することができる。
癌(前立腺癌など)の有無を決定するために本発明の診断アッセイキットを使用するために、固体支持体に結合したままであるレポーター基から検出されたシグナルを、一般に、所定のカットオフ値に相当するシグナルと比較する。例えば、癌検出のための例示的カットオフ値は、固定化抗体を癌を罹患していない患者由来のサンプルとインキュベーションした場合に得られる平均シグナルであり得る。一般に、所定のカットオフ値より約3標準偏差高いシグナルを生成するサンプルを、癌陽性と見なす。別の実施形態では、カットオフ値を、Sackett et al.,Clinical Epidemiology.A Basic Science for Clinical Medicine,Little Brown and Co.,1985,p.106−7.による受診者動作特性曲線(Receiver Operator Curve)を使用して決定することができる。かかる実施形態では、カットオフ値を、診断試験の結果についてのそれぞれの起こり得るカットオフ値に相当する真の陽性率(すなわち、有病正診率)と偽陽性率(100%特異性)との対のプロットから決定することができる。左上の隅に最も近いプロットのカットオフ値(すなわち、最も広い領域を囲む値)は、最も正確なカットオフ値であり、この方法によって決定したカットオフよりも高いシグナルを生成するサンプルを陽性と見なすことができる。あるいは、カットオフ値を、プロットに沿って左にシフトして、偽陽性率を最小にするか、右にシフトして議員正率を最小にすることができる。一般に、この方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生成するサンプルを、癌陽性と見なす。
キットによって可能な診断アッセイを、結合薬を膜(ニトロセルロース膜など)に固定した流入(flow−through)形態またはストリップ試験形態のいずれかで行うと認識される。流入試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜と通過するにつれて、固定結合薬に結合する。第2に、標識した結合薬は、第2の結合薬を含む溶液が膜を流れるのにつれて、結合薬−ポリペプチド複合体に結合する。結合した第2の結合薬を、上記のように検出することができる。ストリップ試験形式では、結合薬が結合した膜の一方の末端を、サンプルを含む溶液に浸漬する。サンプルは、第2の結合薬を含む領域を介して膜に沿って固定化結合薬領域に移動する。固定化抗体領域での第2の結合薬の濃度は、癌の存在を示す。視覚的に読み取ることができる結合部位でのパターン(線)の存在は、肯定的試験を示す。かかるパターンの非存在は、否定的結果を示す。一般に、結合薬の膜固定量を、生体サンプルが上記考察の形式で2抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生成するのに十分なポリペプチドレベルを含む場合、視覚的に認識可能なパターンが生成されるように選択する。本発明の診断アッセイでの使用に好ましい結合薬は、本発明に開示の抗体、その抗原結合フラグメント、および本明細書中に記載の任意のCDMAB関連結合薬である。抗体の膜固定量は、診断アッセイを行うのに有効な任意の量であり、約25ng〜約1μgの範囲であり得る。典型的には、かかる試験を、非常に少量の生体サンプルを使用して行うことができる。
さらに、本発明のCDMABを、その標的抗原を同定する能力の研究で使用することができる。
本明細書中に記載の発明をより完全に理解するために、以下の説明を記載する。
本発明は、IDAC141205−03抗原を特異的に認識して結合するCDMAB(すなわち、IDAC141205−03 CDMAB)を提供する。
IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のCDMABは、ハイブリドーマIDAC141205−03によって産生されたその標的抗原に対する単離モノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合的に阻害する抗原結合領域を有する限り、任意の形態であり得る。したがって、IDAC141205−03抗体と同一の結合特異性を有する任意の組換えタンパク質(例えば、抗体を第2のタンパク質(リンホカインまたは腫瘍阻害成長因子など)と組み合わせた融合タンパク質)は、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の1つの実施形態では、CDMABは、IDAC141205−03抗体である。
他の実施形態では、CDMABは抗原結合フラグメントであり、Fv分子(単鎖Fv分子など)、Fab分子、Fab’分子、F(ab’)2分子、融合タンパク質、二重特異性抗体、異種抗体、またはIDAC141205−03抗体の抗原結合領域を有する任意の組換え分子であり得る。本発明のCDMABは、IDAC141205−03モノクローナル抗体が指向するエピトープに指向する。
本発明のCDMABを、修飾して誘導体分子を産生することができる(すなわち、分子内のアミノ酸修飾による)。化学修飾も可能である。直接変異、親和成熟法(methods of affinity maturation)、ファージディスプレイ、または鎖シャフリングによる修飾も可能である。
親和性および特異性を、CDRおよび/またはフェニルアラニントリプトファン(FW)残基の変異ならびに所望の特徴を有する抗原結合部位のスクリーニングによって修飾または改変することができる(例えば、Yang et al,J.Mol.Biol.,(1995)254:392−403)。1つの方法は、別の同一の抗原結合部位集団中の2〜20個のアミノ酸のサブセットが特定の位置で見出される容易、各残基または残基の組み合わせを無作為化することである。あるいは、誤りがちなPCR法によって残基の範囲にわたって変異を誘導することができる(例えば、Hawkins et al,J.Mol.Biol.,(1992)226:889−96)。別の例では、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターを、大腸菌変異株中で増殖させることができる(例えば、Low et al,J.Mol.Biol.,(1996)250:359−68)。これらの変異誘発方法は、当業者に公知の多数の方法の例である。
本発明の抗体の親和性の別の増加様式は、鎖シャフリングを行うことである。この鎖シャフリングは、重鎖または軽鎖を他の重鎖または軽鎖と無作為に対合して、より高い親和性を有する抗体を調製する。抗体の種々のCDRを、他の抗体中の対応するCDRとシャフリングすることもできる。
誘導体分子は、ポリペプチドの機能的性質を保持しているであろう。すなわち、かかる置換を行った分子は、依然としてIDAC141205−03抗原またはその一部にポリペプチドが結合するであろう。
これらのアミノ酸置換には、当該分野で「保存的」置換として公知のアミノ酸置換が含まれるが、必ずしもこれに限定されない。
例えば、タンパク質化学の十分に確立された原理は、タンパク質の高次構造または機能のいずれも変化させることなく、タンパク質を「保存的アミノ酸置換」と表題をつけた一定のアミノ酸置換を行うことができることである。
かかる変化には、イソロイシン(I)、バリン(V)、およびロイシン(L)と任意の他のこれらの疎水性アミノ酸との置換;アスパラギン酸(D)とグルタミン酸(E)との置換およびその逆;グルタミン酸(Q)とアスパラギン(N)との置換およびその逆;ならびにセリン(S)とトレオニン(T)との置換およびその逆のいずれかが含まれる。タンパク質の三次元構造に置ける特定のアミノ酸の環境およびその役割に応じて、他の置換も保存的置換と見なすことができる。例えば、アラニンとバリン(V)との交換が可能であるので、グリシン(G)およびアラニン(A)は、高い頻度で交換可能である。比較的疎水性を示すメチオニン(M)を、高い頻度でロイシンおよびイソロイシンと交換することができ、時折バリンと交換することができる。リジン(K)およびアルギニン(R)を、アミノ酸残基の有意な特徴がその電荷であり、且つこれら2つのアミノ酸残基のpKの相違は有意ではない位置で高い頻度で交換可能である。さらなる他の変化を、特定の条件下で「保存的」と見なすことができる。
実施例1
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株AR52A301.5
ハイブリドーマ細胞株AR52A301.5を、ブダペスト条約に従って、2005年12月14日に、International Depository Authority of Canada(IDAC),Bureau of Microbiology,Health Canada,1015 Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada,R3E 3R2に受入番号141205−03で寄託した。37 CFR 1.808にしたがって、寄託されている材料の公衆への提供可能性に関して寄託者によって課せられている制限の全てが、特許が付与されたとき、取り消し不能の条件で撤回される。寄託機関が生育能力のあるサンプルを分譲することができない場合、寄託物を置換する。
ハイブリドーマ産生−ハイブリドーマ細胞株AR52A301.5
ハイブリドーマ細胞株AR52A301.5を、ブダペスト条約に従って、2005年12月14日に、International Depository Authority of Canada(IDAC),Bureau of Microbiology,Health Canada,1015 Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada,R3E 3R2に受入番号141205−03で寄託した。37 CFR 1.808にしたがって、寄託されている材料の公衆への提供可能性に関して寄託者によって課せられている制限の全てが、特許が付与されたとき、取り消し不能の条件で撤回される。寄託機関が生育能力のあるサンプルを分譲することができない場合、寄託物を置換する。
抗癌抗体 AR52A301.5を産生するハイブリドーマを産生するために、凍結ヒト卵巣腫瘍組織(類内膜癌(endometroid adenocarcinoma);Genomics Collaborative,Cambridge,MA)の単一細胞上清を、PBS.IMMUNEASY(商標)(Qiagen,Venlo,Netherlands)中で調製し、アジュバントを、穏やかな混合によって調製した。5〜7週齢のBALB/cマウスを、200万個の細胞を含む50μlの抗原−アジュバントの腹腔内注射によって免疫化した。最近調製された抗原−アジュバントを使用して、最初の免疫化から2週間後および5週間後に、約200万個の細胞を含む50〜60μlで腹腔内にて両方のAR52A301.5免疫化マウスを追加免疫した。脾臓を、最後の免疫化から3日後に融合のために使用した。単離非細胞のNSO−1骨髄腫パートナーとの融合によってハイブリドーマを調製した。融合物由来の上清を、ハイブリドーマのサブクローンから試験した。
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体がIgGまたはIgMアイソタイプであるかどうかを決定するために、ELISAアッセイを行った。4℃の100μl/ウェルのヤギ抗マウスIgG+IgM(H+L)を2.4μg/mL含むコーティング緩衝液(0.1 M炭酸/重炭酸緩衝液、pH 9.2〜9.6)を、ELISAプレートに一晩添加した。プレートを、洗浄緩衝液(PBS+0.05%Tween−20)で3回洗浄した。100μl/ウェルのブロッキング緩衝液(5%ミルクを含む洗浄緩衝液)を、プレートに室温で1時間添加し、洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μl/ウェルのハイブリドーマ上清を添加し、プレートを室温で1時間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、ヤギ抗マウスIgGまたはIgM西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体の100,000 倍希釈物(1%のミルクを含むPBSで希釈)のいずれかを100μl/ウェルで添加した。室温で1時間のプレートのインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。100μl/ウェルのTMB溶液を、室温で1〜3分間インキュベーションした。50μl/ウェルの2M H2SO4の添加によって呈色反応を停止させ、プレートを、Perkin−Elmer HTS7000プレートリーダーで450nmを読み取った。図1に示すように、AR52A301.5ハイブリドーマは、IgGアイソタイプの一次抗体を分泌した。
ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗体のサブクラスを決定するために、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ分類キット(HyCult Biotechnology,Frontstraat,Netherlands)を使用してアイソタイプ分類実験を行った。500μlの緩衝液を、ラット抗マウスサブクラス特異的抗体を含む試験ストリップに添加した。500μlのハイブリドーマ上清を試験管に添加し、穏やかな撹拌によって浸漬させた。捕捉マウス免疫グロブリンを、コロイド粒子にカップリングした第2のラットモノクローナル抗体によって直接検出した。これらの2つのタンパク質の組み合わせにより、アイソタイプを分析するための視覚シグナルを得る。抗癌抗体AR52A301.5は、IgG1由来のκアイソタイプである。
1ラウンドの限界希釈後、ハイブリドーマ上清を、細胞ELISAアッセイ中の標的細胞に結合した抗体について試験した。以下の2つのヒト卵巣癌細胞株および1つのヒト正常皮膚細胞株を試験した:OCC−1、OVCAR−3、およびCCD−27sk。OCC−1を除く全ての細胞株を、American Type Tissue Collection(ATCC,Manassas,VA)から入手した。OCC−1卵巣癌細胞株を、Ottawa Regional Cancer Center(Ottawa,ON)から入手した。
使用前にプレーした細胞を固定した。プレートを、室温のMgCl2およびCaCl2を含むPBSで3回洗浄した。PBSで希釈した100μlの2%パラホルムアルデヒドを、各ウェルに室温で10分間添加し、その後に破棄した。プレートを、室温のMgCl2およびCaCl2を含むPBSで再度3回洗浄した。100μl/ウェルの5%ミルクを含む洗浄緩衝液(PBS+0.05%Tween−20)を使用して、室温で1時間ブロッキングした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、ハイブリドーマ上清を、75μl/ウェルにて室温で1時間添加した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、100μl/ウェルの西洋ワサビペルオキシダーゼに抱合したヤギ抗マウスIgG抗体の25,000倍希釈物(1%ミルクを含むPBS中で希釈)を添加した。室温で1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、100 μl/ウェルのTMB基質を、室温で1〜3分間インキュベーションした。50μl/ウェルの2M H2SO4で反応を停止させ、プレートを、Perkin−Elmer HTS7000プレートリーダーで450nmを読み取った。図1で表にした結果を、前に試験した細胞株に結合しないことが示されている自家IgGアイソタイプコントロールと比較したバックグラウンドの倍数として示した。ハイブリドーマAR52A301.5由来の抗体は、卵巣癌細胞株OVCAR−3への結合を示した。AR52A301.5は、正常皮膚細胞株CCD−27skへの検出可能な結合レベルを示さなかった。
抗体結合試験と併せて、以下の細胞株におけるハイブリドーマ上清の細胞傷害効果を試験した:OCC−1、OVCAR−3、およびCCD−27sk。カルセインAMを、Molecular Probes(Eugene,OR)から入手した。以下に概説のように変更して、製造者の説明書にしたがってアッセイを行った。細胞を、所定の適切な密度でアッセイ前にプレートした。2日後、75μlハイブリドーママイクロタイタープレート由来の上清を細胞プレートに移し、5%CO2インクベーターで5日間インキュベーションした。ポジティブコントロールの役割を果たすウェルを空になるまで吸引し、100μlのアジ化ナトリウム(NaN3)またはシクロヘキシミドを添加した。処置5日後、プレートを逆にしてブロットを乾燥させることによってプレートを空にした。MgCl2およびCaCl2を含む室温のDPBS(Dulbeccoのリン酸緩衝化生理食塩水)を、マルチチャネルスクイーズボトルから各ウェルに分注し、3回軽く叩き、逆にしてブロットを乾燥させることによって空にした。MgCl2およびCaCl2を含むDPBS中で希釈した50μlの蛍光カルセイン色素を各ウェルに添加し、37℃で5%CO2インキュベーター中にて37℃で30分間インキュベーションした。プレートを、Perkin−Elmer HTS7000蛍光プレートリーダーで読み取り、Microsoft Excelでデータを分析した。結果を、図1に表で示す。AR52A301.5 ハイブリドーマ由来の上清は、OVCAR−3細胞に対して24%の特異的細胞傷害性を示した。これは、ポジティブコントロールであるシクロヘキシミドを使用して得た細胞傷害性の53%であった。図1由来の結果は、AR52A301.5の細胞傷害効果が癌細胞型に対する結合レベルと比例することを証明する。OCC−1細胞と比較してOVCAR−3細胞で得られた細胞傷害性レベルはより高く、OVCAR−3細胞のより高い結合レベルと一致した。図1に表で示すように、AR52A301.5は、CCD−27sk正常細胞株で細胞傷害性を示さなかった。公知の非特異的細胞傷害薬であるシクロヘキシミドおよびアジ化ナトリウムは、一般に、予想通りの細胞傷害性を示した。
実施例2
in vitro結合
AR52A301.5モノクローナル抗体を、CL−1000フラスコ(BD Biosciences,Oakville,ON)中でハイブリドーマを培養し、1週間に2回の回収および再播種を行うことによって産生した。ProteinG Sepharose4 Fast Flow(Amersham Biosciences,Baie d’Urfe,QC)を使用した標準的な抗体精製手順に従った。脱免疫化抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体をい使用することは、本発明の範囲内に含まれる。
in vitro結合
AR52A301.5モノクローナル抗体を、CL−1000フラスコ(BD Biosciences,Oakville,ON)中でハイブリドーマを培養し、1週間に2回の回収および再播種を行うことによって産生した。ProteinG Sepharose4 Fast Flow(Amersham Biosciences,Baie d’Urfe,QC)を使用した標準的な抗体精製手順に従った。脱免疫化抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体をい使用することは、本発明の範囲内に含まれる。
膵臓(BxPC−3、AsPC−1、およびPL45)、結腸(DLD−1、Lovo、SW1116、HT−29、およびColo−205)、乳房(MDA−MB−468およびMCF−7)、前立腺(PC−3およびDU−145)、肺(NCI−H520およびA549)、食道(T.Tn)、甲状腺(SW579)、頭頸部(FaDu)、および卵巣(OCC−1、C−13、OVCA−429、Sk−OV−3、OV2008、Hey、A2780−cp、A2780−S、およびOVCAR−3)の癌細胞株ならびに皮膚(CCD−27sk)および肺(Hs888.Lu)由来の非細胞株へのAR52A301.2の結合を、フローサイトメトリー(FACS)によって評価した。卵巣癌細胞株の大部分を除く全細胞株を、American Type Tissue Collection(ATCC,Manassas,VA)から入手した。C−13、OV2008、Hey、A2780−cp、A2780−S、OCC−1、およびOVCA−429卵巣癌細胞株を、Ottawa Regional Cancer Center(Ottawa,ON)から入手した。
DPBS(Ca++およびMg++を含まない)で単層を最初に洗浄することによって、FACS用の細胞を調製した。次いで、37℃で、細胞分離緩衝液(INVITROGEN,Burlington,ON)を使用して、その細胞培養プレートから細胞を取り除いた。遠心分離および回収後、細胞を、MgCl2、CaCl2、および2%ウシ胎児血清を含む4℃のDPBS(染色培地)に再懸濁し、計数し、適切な細胞密度に等分し、スピンダウンによって細胞をペレットにし、20μg/mLの試験抗体(AR52A301.5)またはコントロール抗体(アイソタイプコントロール、抗EGFR)の存在下で4℃の染色培地中に氷上で30分間再懸濁した。Alexa Fluor 546抱合二次抗体の添加前に、細胞を染色培地で1回洗浄した。次いで、Alexa Fluor 546抱合抗体を含む染色培地を、4℃で30分間添加した。次いで、最後に細胞を洗浄し、固定培地(1.5%パラホルムアルデヒドを含む染色培地)に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリー捕捉を、FACSarray(商標)System Software(BD Biosciences,Oakville,ON)を使用したFACSarray(商標)でのサンプルの流れによって評価した。FSCおよびSSC検出器の電圧および振幅の増加の調整によって、細胞の前方向(FSC)および側方散乱(SSC)を設定した。細胞が約1〜5単位の中程度の蛍光強度を有する一定のピークを有するように、蛍光(Alexa−546)チャネルのための検出器を非染色細胞の流れによって調整した。各サンプルのために、約10,000のゲーティング事象(染色された固定細胞)を分析のために獲得し、結果を図3に示す。
図2は、平均蛍光強度のアイソタイプコントロールに対する増加倍数として示す。AR52A301.5抗体の代表的ヒストグラムを、図3にまとめた。AR52A301.5は、膵臓癌細胞株BxPC−3(29.4倍)、乳癌細胞株MDA−MB−468(22.7倍)、頭頸部癌細胞株FaDu(59.8倍)、卵巣癌細胞株 OV2008、OVAR−3、およびC−13(32.7倍、22.1倍、および38.7倍)、および結腸癌細胞株Colo−205およびDLD−1(38.6倍および82.8倍)への強い結合を示した。結合は、卵巣癌細胞株Hey、OCC−1、OVCA−429、およびOVCAR−3(それぞれ、5.9倍、17.8倍、3.4倍、および22.1倍)、乳癌細胞株MCF−7(16.0倍)、前立腺癌細胞株PC−3およびDU−145(5.0倍および3.9倍)、食道癌細胞株T.Tn(18.6倍)、結腸癌細胞株HT−29(6.7倍)、および膵臓細胞株PL45(12.9倍)でも認められ、肺癌細胞株NCI−H520(2.1倍)および非癌肺細胞株Hs888.Lu(2.6倍)でより弱い結合が認められた。皮膚由来の非癌細胞株(CCD−27sk)は、これらの条件下で検出できなかった。これらのデータは、AR52A301.5は、種々の癌細胞株に明確に結合するが、試験したいくつかの株としか細胞傷害性に関連しなかったという点で、機能的特異性を示すことを証明する。
実施例3
BxPC−3細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例1および2は、いくつかの異なる癌適応症にわたる検出可能な結合によってAR52A301.5がヒト癌細胞株に対して抗癌性を示すことを証明した。図4および5を参照して、6〜8週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト膵臓癌細胞(BxPC−3)を含む100μlの生理食塩水を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、5匹からなる3つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、同一の様式で、1週間に1回、7週間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって7日毎に8週間にわたって測定するか、各動物がCanadian Council for Animal Care(CCAC)エンドポイントに到達するまで測定した。動物の体重を、1週間に1回、研究期間にわたって記録した。研究終了時に、CCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
BxPC−3細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例1および2は、いくつかの異なる癌適応症にわたる検出可能な結合によってAR52A301.5がヒト癌細胞株に対して抗癌性を示すことを証明した。図4および5を参照して、6〜8週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト膵臓癌細胞(BxPC−3)を含む100μlの生理食塩水を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、5匹からなる3つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、同一の様式で、1週間に1回、7週間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって7日毎に8週間にわたって測定するか、各動物がCanadian Council for Animal Care(CCAC)エンドポイントに到達するまで測定した。動物の体重を、1週間に1回、研究期間にわたって記録した。研究終了時に、CCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
AR52A301.5はまた、ヒト膵臓癌のin vivo予防モデルで、腫瘍成長を防止し、全身腫瘍組織量を減少させた。移植55日後(最後の投与の6日後)に、AR52A301.5処置群の平均腫瘍体積は、緩衝液コントロール処置群より70%減少した(p<0.002;図4)。
研究を通して、毒性の臨床的徴候は認められなかった。図5に示す体重を、健康および成長障害の代替物として使用した。群内で、研究期間にわたって、コントロール群で有意でない10%の体重増加が認められた。その上、AR52A301.5処置群で有意でない体重増加(平均19.6 g〜21.2gの8%の増加)が認められた。
まとめると、AR52A301.5は、このヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて十分に耐性を示し、全身腫瘍組織量を減少させた。
実施例4
BxPC−3細胞を使用したin vivoでの確立腫瘍の実験
ヒト膵臓癌のBxPC−3モデルに対するAR52A301.5の有効性をさらに決定するために、抗体を、確立されたBxPC−3異種移植片モデルに対して試験した。図6および7を参照して、6〜8週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト膵臓癌細胞(BxPC−3)を含む100μlの生理食塩水を、首筋への皮下注射によって移植した。腫瘍成長を、カリパスによって毎週測定した。コホートの大部分が移植33日後に平均腫瘍体積が85mm3(56〜111の範囲)に到達した場合、9匹のマウスを、2つの治療群にそれぞれ無作為に割り当てた。AR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、20mg/kgの抗体用量で、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体を、同一の様式で、移植53日後まで1週間に3回、全部で10回投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約7日毎に移植63日後までか、各動物がCanadian Council for Animal Care(CCAC)エンドポイントに到達するまで測定した。動物の体重を、1週間に1回、研究期間にわたって記録した。研究終了時に、CCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
BxPC−3細胞を使用したin vivoでの確立腫瘍の実験
ヒト膵臓癌のBxPC−3モデルに対するAR52A301.5の有効性をさらに決定するために、抗体を、確立されたBxPC−3異種移植片モデルに対して試験した。図6および7を参照して、6〜8週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト膵臓癌細胞(BxPC−3)を含む100μlの生理食塩水を、首筋への皮下注射によって移植した。腫瘍成長を、カリパスによって毎週測定した。コホートの大部分が移植33日後に平均腫瘍体積が85mm3(56〜111の範囲)に到達した場合、9匹のマウスを、2つの治療群にそれぞれ無作為に割り当てた。AR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、20mg/kgの抗体用量で、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体を、同一の様式で、移植53日後まで1週間に3回、全部で10回投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約7日毎に移植63日後までか、各動物がCanadian Council for Animal Care(CCAC)エンドポイントに到達するまで測定した。動物の体重を、1週間に1回、研究期間にわたって記録した。研究終了時に、CCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
AR52A301.5は、確立ヒト膵臓癌モデルにおいて全身腫瘍組織量を有意に減少させた。54日目に、AR52A301.5治療動物の平均腫瘍体積は、コントロール動物治療動物の平均腫瘍体積の58%であった(p<0.002;図6)。これらの結果は、AR52A301.5の51%のT/Cに相当する。
1週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代替物として使用した。図7に認められるように、研究終了時の2つの抗体処置群およびコントロールの間で平均体重に有意差は認められなかった。さらに、全群の体重は、研究を通して有意に変化しなかった。
まとめると、AR52A301.5は、この確立ヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて十分に耐性を示し、全身腫瘍組織量を減少させた。AR52A301.5は、ヒト膵臓癌の防止モデル確立モデルにおける有効性を証明した。
実施例5
PL45細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例3および4は、AR52A301.5がヒト膵臓癌細胞株に対して抗癌性を示すことを証明した。ヒト膵臓細胞株に対するAR52A301.5の有効性を決定するために、抗体を、PL45ヒト膵臓癌の異種移植片モデルに対して試験した。図8、9、および10を参照して、8〜10週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト膵臓癌細胞(PL45)を含む100μlのPBS溶液を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、10匹からなる2つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、1週間に1回、研究期間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約7日毎に測定した。9回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって1週間に1回記録した。研究終了時に、CCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
PL45細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例3および4は、AR52A301.5がヒト膵臓癌細胞株に対して抗癌性を示すことを証明した。ヒト膵臓細胞株に対するAR52A301.5の有効性を決定するために、抗体を、PL45ヒト膵臓癌の異種移植片モデルに対して試験した。図8、9、および10を参照して、8〜10週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト膵臓癌細胞(PL45)を含む100μlのPBS溶液を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、10匹からなる2つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、1週間に1回、研究期間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約7日毎に測定した。9回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって1週間に1回記録した。研究終了時に、CCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
AR52A301.5は、ヒト膵臓癌細胞のin vivo予防モデルで、PL45の腫瘍成長を有意に阻害した。コントロール群および抗体治療群のほとんど全てのマウスが依然として生存している場合、77日目(最後の抗体投与の20日後)に決定したところ、ARIUS抗体AR52A301.5での処置により、PL45腫瘍の成長は、緩衝液処置群と比較して、46.8%減少した(p=0.00068、t検定)(図8)。研究を120日目(最後の投与の45日後)まで継続し、その時点で、腫瘍体積のためにコントロール群を研究から排除した。しかし、AR52A301.5治療群の40%が、この時点で依然として生存していた(図9)。
研究を通して、毒性の臨床的徴候は認められなかった。1週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代わりにした。研究期間にわたって、全群で平均体重が増加した(図10)。13日目と77日目との間の平均体重増加は、コントロール群で3.39g(17.4%)およびAR52A301.5治療群で2.86g(14.5%)であった。治療期間または77日目(最後の投与の20日後)の各群の間で有意差は認められなかった。
まとめると、AR52A301.5は、77日目にこのヒト膵臓癌異種移植モデルにおいて十分に耐性を示し、全身腫瘍組織量を有意に減少させた。AR52A301.5治療はまた、緩衝液治療と比較して、生存率の増加も証明した。したがって、AR52A301.5は、2つの異なるヒト膵臓癌モデルで有効性を証明した。
実施例6
PC−3細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例3、4、および5は、AR52A301.5が2つの異なるヒト膵臓癌異種移植片モデルに対して抗癌性を示すことを証明した。異なるヒト癌異種移植片モデルに対するAR52A302.5の有効性を決定するために、抗体を、PC−3前立腺癌異種移植片モデルに対して試験した。図11、12、および13を参照して、8〜10週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト前立腺癌細胞(PC−3)を含む100μlのPBS溶液を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、10匹からなる2つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、1週間に1回、研究期間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約7日毎に測定した。8回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって1週間に1回記録した。研究終了時に、エンドポイントに到達した場合のCCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
PC−3細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例3、4、および5は、AR52A301.5が2つの異なるヒト膵臓癌異種移植片モデルに対して抗癌性を示すことを証明した。異なるヒト癌異種移植片モデルに対するAR52A302.5の有効性を決定するために、抗体を、PC−3前立腺癌異種移植片モデルに対して試験した。図11、12、および13を参照して、8〜10週齢の雌SCIDマウスに、500万個のヒト前立腺癌細胞(PC−3)を含む100μlのPBS溶液を、首筋への皮下注射によって移植した。マウスを、10匹からなる2つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、1週間に1回、研究期間にわたって投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約7日毎に測定した。8回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって1週間に1回記録した。研究終了時に、エンドポイントに到達した場合のCCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
AR52A301.5は、ヒト前立腺癌のPC−3in vivo予防モデルで、腫瘍成長を阻害した。コントロール群および抗体治療群のほとんど全てのマウスが依然として生存している場合、5回投与後の32日目に決定したところ、ARIUS抗体AR52A301.5での処置により、PC−3腫瘍の成長は、緩衝液処置群と比較して、30.9%減少した(p=0.01443、t検定)(図11)。研究を47日目(最後の投与の3日前)まで継続し、その時点で、腫瘍体積/病変のためにコントロール群の全マウスを研究から排除した。しかし、AR52A301.5治療群のマウスの40%が、この時点で依然として生存していた(図12)。
研究を通して、毒性の明らかな臨床的徴候は認められなかった。1週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代わりにした。平均体重は、比較的一定のままであった(図13)。治療期間中および/または32日目(5回投与後)の各群の間で有意差は認められなかった。
まとめると、AR52A301.5は、このヒト前立腺癌異種移植片モデルにおいて十分に耐性を示し、腫瘍成長を減少させた。抗体を使用した処置はまた、コントロール群と比較して生存に有利であることが証明された。AR52A301.5は、2つの異なるヒト癌適応症(膵臓および前立腺)に対する有効性が証明された。
実施例7
Colo205細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例3、4、5、および6は、AR52A301.5が2つの異なるヒト膵臓癌および前立腺癌の異種移植片モデルに対して抗癌性を示すことを証明した。異なるヒト癌異種移植片モデルに対するAR52A302.5の有効性を決定するために、抗体を、Colo205結腸癌異種移植片モデルに対して試験した。図14および15を参照して、8〜10週齢の雌SCIDマウスに、500万個の結腸癌細胞(Colo205)を含む100μlのPBS溶液を、各マウスの右脇腹への皮下注射によって移植した。マウスを、10匹からなる2つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、最初の2週間は1週間に1回、さらなる3週間は1週間に2回投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約3〜4日毎に測定した。8回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって腫瘍を測定した時に記録した。研究終了時に、エンドポイントに到達した場合のCCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
Colo205細胞を使用したin vivo腫瘍予防実験
実施例3、4、5、および6は、AR52A301.5が2つの異なるヒト膵臓癌および前立腺癌の異種移植片モデルに対して抗癌性を示すことを証明した。異なるヒト癌異種移植片モデルに対するAR52A302.5の有効性を決定するために、抗体を、Colo205結腸癌異種移植片モデルに対して試験した。図14および15を参照して、8〜10週齢の雌SCIDマウスに、500万個の結腸癌細胞(Colo205)を含む100μlのPBS溶液を、各マウスの右脇腹への皮下注射によって移植した。マウスを、10匹からなる2つの治療群に無作為に分けた。移植1日後、20mg/kgのAR52A301.5試験抗体または緩衝液コントロールを、2.7mM KCl、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および20mM Na2HPO4を含む希釈剤でのストック濃度からの希釈後に300μlの体積を各コホートに腹腔内投与した。次いで、抗体およびコントロールサンプルを、最初の2週間は1週間に1回、さらなる3週間は1週間に2回投与した。腫瘍成長を、カリパスによって約3〜4日毎に測定した。8回の抗体投与後に研究を完了した。動物の体重を、研究期間にわたって腫瘍を測定した時に記録した。研究終了時に、エンドポイントに到達した場合のCCACガイダンスにしたがって、全動物を安楽死させた。
AR52A301.5は、ヒト結腸癌のColo205in vivo予防モデルで、腫瘍成長を有意に阻害した。27日目(最後の投与の4日前)に決定したところ、ARIUS抗体AR52A301.5での処置により、Colo205結腸腫瘍の成長は、緩衝液処置群と比較して、35.9%減少した(p=0.01872、t検定)(図14)。
研究を通して、毒性の明らかな臨床的徴候は認められなかった。1週間間隔で測定した体重を、健康および成長障害の代わりにした。治療期間を通して、群間で平均体重の有意差は認められなかった(図15)。
まとめると、AR52A301.5は、このヒト結腸癌異種移植片モデルにおいて十分に耐性を示し、腫瘍成長を有意に減少させた。AR52A301.5は、3つの異なるヒト癌適応症(膵臓、前立腺、および結腸)に対する有効性が証明された。2つの異なる十分に認識されたヒト癌疾患モデルで治療上の利点が認められ、他の哺乳動物(ヒトが含まれる)における治療法についてのこの抗体の薬理学的利点および薬学的利点が示唆された。
実施例8
抗体AR52A301.5のヒトTROP−2との交差反応の同定
ウェスタンブロットの結果により、AR52A301.5が抗体AR47A6.4.2(ヒトTROP−2に結合することが公知;図16)によって認識される性質に類似の性質のバンドと交差作用することが示唆された。AR52A301.5によって認識される抗原をさらに特徴づけるために、この抗体を、MDA−MB−231(MB−231)細胞の全膜画分由来のAR47A6.4.2を使用して調製した免疫複合体のウェスタンブロットのプローブとして使用した。
抗体AR52A301.5のヒトTROP−2との交差反応の同定
ウェスタンブロットの結果により、AR52A301.5が抗体AR47A6.4.2(ヒトTROP−2に結合することが公知;図16)によって認識される性質に類似の性質のバンドと交差作用することが示唆された。AR52A301.5によって認識される抗原をさらに特徴づけるために、この抗体を、MDA−MB−231(MB−231)細胞の全膜画分由来のAR47A6.4.2を使用して調製した免疫複合体のウェスタンブロットのプローブとして使用した。
全細胞膜を、MB−231乳癌細胞のコンフルエントな培養物から調製した。細胞スタックから培地を除去し、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄した。細胞を、分離緩衝液(Gibco−BRL;Grand Island,NY)を使用して、プラットフォーム震盪機にて37℃で20分間分離した。細胞を回収し、900gにて4℃で10分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットを、PBS中に再懸濁し、900gにて4℃で10分間遠心分離することによって洗浄した。次いで、ペレットを、必要になるまで−80℃で保存した。膜を調製するために、細胞ペレットを解凍し、50mLの完全プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche;Laval QC)あたり1錠を含む均質化緩衝液を、1gの細胞あたり3mLの緩衝液の比率で再懸濁した。細胞懸濁液を、氷上のpolytronホモジナイザーを使用した均質化に供して、細胞を溶解した。細胞ホモジネートを、15,000gにて4℃で10分間遠心分離して、核粒子を除去した。上清を採取し、管に分割し、75,600gにて4℃で90分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、各膜ペレットを、約5mLの均質化緩衝液に再懸濁した。全管由来の膜ペレットを合わせ、再度分割し、75,600gにて4℃で90分間遠心分離した。上清を慎重に除去し、ペレットを秤量した。1%TritonX−100を含む可溶化緩衝液を、1gの膜ペレットあたり3mLの緩衝液の比率でペレットに添加した。氷上のプラットフォーム震盪機での300rpmで1時間の震盪によって膜を溶解した。膜上清を、75,600gで遠心分離して、可溶性物質をペレット化した。可溶化膜タンパク質を含む上清を管から慎重に取り出し、タンパク質濃度をアッセイし、−80℃で保存した。
MB−231の全膜画分を、1×RIPA緩衝液で1mg/mLの最終タンパク質濃度に希釈した。このサンプルを、同一サイズの2つのアリコートに分割した。各アリコートを、AR47A6.4.2または8A3B.6アイソタイプコントロール抗体のいずれかと抱合した抗体抱合タンパク質Gセファロースと4℃で2時間インキュベーションした。洗浄後、各抗体抱合ビーズサンプルを、2つの同一アリコートに分けた。IPサンプル組の1つおよびそれぞれのAR47A6.4.2および8A3B.6抱合「偽IP」ビーズの1組を、1×非還元SDS−PAGEサンプル緩衝液で再懸濁し、第2の組を1×還元SDS−PAGEサンプル緩衝液で再懸濁した。ボイル後、各サンプル由来の同一アリコートを、10%SDS−ポリアクリルアミドゲルの複製(replicate)レーンにロードした。SDS−PAGE後、ゲルをPVDF膜に移し、後者を5%ミルクを含むTBSTで1時間ブロッキングし、その後に抗体AR47A6.4.2、AR52A301.5、アイソタイプコントロール抗体8A3B.6と共に、または一次抗体なしでブロッキング緩衝液中にて室温で2時間インキュベーションした。上記のようにブロットを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスIgG(Fcフラグメント特異的)とインキュベーションし、ブロッキング緩衝液で希釈し、室温で1時間インキュベーションした。上記のように洗浄後、製造者の説明書にしたがって、ブロットをECL Plus試薬で発色させた。この実験由来の結果(図17)は、抗体AR52A301.5はAR47A6.4.2によって免疫沈降した抗原と特異的に交差反応し、後者の抗体によって認識される抗原と同一の見かけ上の分子量を有することを証明する。結果はまた、ウェスタンブロットのプローブとして使用した場合、AR47A6.4.2の交差反応性は、AR47A6.4.2免疫複合体の還元SDS−PAGEサンプル緩衝液とのボイルによって消失することを示す。しかし、還元条件下でのAR52A301.5の同一の免疫複合体との交差反応性は検出可能な影響を受けず、両抗体が同一抗原上の異なるエピトープと交差反応し得ることが示唆された。AR47A6.4.2によって認識されるエピトープがジスルフィド結合依存性高次構造エピトープのようであり、AR52A301.5によって認識されるエピトープの場合ではないようである。
抗体AR52A301.5によって認識される抗原の性質をさらに確立するために、SDS−PAGEの非還元条件下で調製した組換えヒトTROP−2のウェスタンブロット(R&D Systems,Minneapolis,MN)を、AR52A301.5およびAR47A6.4.2で探索した。この実験由来の結果(図18)は、AR47A6.4.2およびAR52A301.5の両方が組換えTROP−2と特異的に交差反応することを示す。したがって、本発明者らは、モノクローナル抗体AR52A301.5によって認識されるエピトープもヒトTROP−2抗原内に含まれていたと結論づけることができる。
実施例9
脱グリコシル化研究
AR52A301.5の結合に及ぼすグリコシル化の影響を決定するために、製造者(Enzymatic Deglycosylation Kit,Prozyme,San Leandro,CA)の説明書通りに変性条件下および非変性条件下で脱グリコシル化反応を設定した。変性反応のために、0.4μgの組換えTROP−2(rhTROP−2;R&D Systems,Minneapolis,MN)または100μgのMDA−MB−231膜タンパク質(上記のように単離)を、水で30μlに希釈した。10μlのインキュベーション緩衝液(5×、0.25M NaH2PO4、pH7.0)および2.5μlの変性溶液(2%SDS、1M β−メルカプトエタノール)を添加し、反応物を5分間ボイルした。一旦反応物が室温に冷却すると、2.5μlの界面活性剤溶液(15%NP−40)および1μlの以下の各酵素を添加した:N−グリカナーゼ(登録商標)PNGase F(≧5U/mL)、シアリダーゼA(商標)(≧5U/mL)、O−グリカナーゼ(登録商標)(≧1.25U/mL)、β(1−4)ガラクトシダーゼ(3U/mL)、およびβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ(40U/mL)。脱グリコシル化酵素の代わりに5μlの水を含むコントロール反応物を含めた。非変性反応のために、0.4μgのrhTROP−2または100μgのMDA−MB−231膜タンパク質を、水で35μlに希釈した。上記列挙の1μlの各酵素と共に10μlのインキュベーション緩衝液を添加した。脱グリコシル化酵素の代わりに5μlの水を含むコントロール反応物を含めた。全反応物を、37℃で24時間インキュベーションした。
脱グリコシル化研究
AR52A301.5の結合に及ぼすグリコシル化の影響を決定するために、製造者(Enzymatic Deglycosylation Kit,Prozyme,San Leandro,CA)の説明書通りに変性条件下および非変性条件下で脱グリコシル化反応を設定した。変性反応のために、0.4μgの組換えTROP−2(rhTROP−2;R&D Systems,Minneapolis,MN)または100μgのMDA−MB−231膜タンパク質(上記のように単離)を、水で30μlに希釈した。10μlのインキュベーション緩衝液(5×、0.25M NaH2PO4、pH7.0)および2.5μlの変性溶液(2%SDS、1M β−メルカプトエタノール)を添加し、反応物を5分間ボイルした。一旦反応物が室温に冷却すると、2.5μlの界面活性剤溶液(15%NP−40)および1μlの以下の各酵素を添加した:N−グリカナーゼ(登録商標)PNGase F(≧5U/mL)、シアリダーゼA(商標)(≧5U/mL)、O−グリカナーゼ(登録商標)(≧1.25U/mL)、β(1−4)ガラクトシダーゼ(3U/mL)、およびβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ(40U/mL)。脱グリコシル化酵素の代わりに5μlの水を含むコントロール反応物を含めた。非変性反応のために、0.4μgのrhTROP−2または100μgのMDA−MB−231膜タンパク質を、水で35μlに希釈した。上記列挙の1μlの各酵素と共に10μlのインキュベーション緩衝液を添加した。脱グリコシル化酵素の代わりに5μlの水を含むコントロール反応物を含めた。全反応物を、37℃で24時間インキュベーションした。
脱グリコシル化後、SDS−PAGEのための反応物を調製した。16.7μlの還元または非還元サンプルロード緩衝液(4×)を、変性反応物および非変性反応物にそれぞれ添加した。サンプルを5分間ボイルし、室温に冷却した。16.7μlの各反応物を、四連の12%SDS−PAGEゲルにロードした。色素の前側がはみ出すまで、ゲルを150Vで泳動した。タンパク質を、40Vで一晩PVDF膜に移した。膜を、TBST(0.05%Tween−20を含むTris緩衝化生理食塩水)を使用して調製した5%ミルクで1時間ブロッキングし、その後に一次抗体と2時間インキュベーションした。各一次抗体を、5%ミルクで5μg/mLに希釈し、抗ヒトTROP−2以外は、2μg/mLに希釈した。ブロットを、AR52A301.5、抗ヒトTROP−2(R&D Systems,Minneapolis,MN)、または1B7.11(所内で産生)IgG1アイソタイプコントロールの1つとインキュベーションした。一次抗体のインキュベーション後、ブロットをTBSTで3回(それぞれ10分間)洗浄した。ブロットを、5%ミルクで50,000倍希釈したヤギ抗マウスIgG Fc HRP二次抗体と1時間インキュベーションし、次いで、TBSTで3回洗浄した(各10分間)。ブロットを、ECL Plusウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare,Life Sciences formerly Amersham Biosciences;Piscataway,NJ)およびX線現像液で現像した。
図19〜21は、AR52A301.5、抗ヒトTROP−2、および1B7.11 IgG1アイソタイプコントロールでそれぞれ探索した3ブロットの結果を示す。図19(AR52A301.5で探索したブロット)は、レーン1に類似のサイズのバンドを示す。このバンドは、図20(抗ヒトTROP−2で探索したブロット)で検出できない。レーン2由来のサンプルの反応性バンド(非変性および脱グリコシル化MB−231の全膜画分)は、約37kDaにシフトし、AR52A301.5(図19)および市販の抗TROP−2抗体(図20)ブロットによって認識されるが、アイソタイプコントロール(図21)によって認識されなかった。いかなるブロットにおいてもレーン5または6(変性、非脱グリコシル化、および脱グリコシル化したMB−231の全膜画分)中にバンドは検出されず、抗体が還元条件下での全膜画分中の標的タンパク質に検出可能に結合しなかったことを示す。
組換えヒトTROP−2は、図19および20(AR52A301.5および抗ヒトTROP−2でそれぞれ探索されたブロット)中のレーン3および4(それぞれ、非変性非脱グリコシル化および脱グリコシル化rhTROP−2)に非常に強い非常に高分子量のバンド(見かけ上の分子量22OkDa超)として出現し、これは、rhTROP−2のジスルフィド結合によって結合した多量体に相当する。図19(AR52A301.5で探索したブロット)中のレーン3(非変性非脱グリコシル化rhTROP−2)中の約70kDaおよびレーン4(非変性および脱グリコシル化rhTROP−2)中の約55kDaの強度の低いバンドが出現し、これは、rhTROP−2の単量体形態に相当する。それぞれ220kDaおよび70kDaを超える多量体バンドおよび単量体バンドの両方の見かけ上の分子量の220kDaおよび55kDa未満へのシフト(レーン3および4)は、脱グリコシル化による炭水化物基の喪失に起因する。還元条件下で(レーン7および8)、rhTROP−2はより小さな単量体ポリペプチドとしてのみ検出され、グリコシダーゼ混合物での処理の際に見かけ上の分子量が約20kDa減少する(図20)。図21(アイソタイプコントロール抗体1B7.11で探索したブロット)は、いかなるレーンにおいても反応性を示さない。
使用した全ての抗ヒトTROP−2抗体(AR52A301.5および市販の抗ヒトTROP−2抗体)は、グリコシダーゼ混合物での処理前および処理後にMDA−MB−231由来の全膜調製物中のヒトTROP−2抗原および精製組換えヒトTROP−2を認識した。この結果により、本実験で使用される特定のグリコシダーゼ混合物によって除去されなかった炭水化物基に結合することができるということを除外できないにもかかわらず、抗体が非炭水化物エピトープ(おそらく、ポリペプチドエピトープ)を認識することができることが示唆される。
実施例10
競合実験
AR47A6.4.2およびAR52A301.5の結合特性をさらに特徴づけるために、AR47A6.4.2およびAR52A301.5がTROP−2の類似のエピトープまたは異なるエピトープを認識するかどうかを決定するためのウェスタンブロットによって、抗体競合実験を行った。ヒトTROP−2の細胞外ドメインおよびヒトIgG1のFc領域を含み、マウス骨髄腫細胞株NS0(R&D Systems,Minneapolis,MN)によって発現される2μgの組換え融合ポリペプチドを、2つの各10%ポリアクリルアミドゲルの全長に及ぶ分離ウェルコームを使用した非還元条件下でのSDS−PAGEに供した。ゲル由来のタンパク質を、40Vにて4℃で約17時間、PVDF膜に移した。膜を、震盪プラットフォーム上で5%脱脂粉乳を含むTBSTにて室温で1時間ブロッキングした。膜を、約20mLのTBSTで2回洗浄し、20の個別のチャネルを作製し、そこに異なる探索溶液を適用したウェスタンマルチスクリーン装置に入れた。事前にビオチン化したAR47A6.4.2およびAR52A301.5を、EZ−Link NHS−PEO固相ビオチン化キット(Pierce,Rockford,IL)を使用して調製した。一次抗体溶液を、ビオチン化AR47A6.4.2またはビオチン化AR52A301.5の種々の濃度の非ビオチン化抗体との混合によって調製した。具体的には、0.05μg/mLのビオチン化AR52A301.5を含む3%脱脂粉乳のTBST溶液+0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、または1000μg/mLの非ビオチン化抗体を含む溶液を調製した。使用した非ビオチン化抗体は、AR52A301.5、AR47A6.4.2、およびコントロール抗体8A3B.6(抗ブルータングウイルス;IgG2a、κ、所内で精製)であった。0.05μg/mLのビオチン化AR47A6.4.2を含む溶液を、上記と同一濃度の非ビオチン化抗体AR52A301.5、AR47A6.4.2、およびコントロール抗体1B7.11(抗TNP;IgG1、κ、20μg/mL、所内で精製)を使用して調製した。3%脱脂粉乳を含むTBSTからなるネガティブコントロール溶液を、各膜上の2つのチャネルに添加した。
競合実験
AR47A6.4.2およびAR52A301.5の結合特性をさらに特徴づけるために、AR47A6.4.2およびAR52A301.5がTROP−2の類似のエピトープまたは異なるエピトープを認識するかどうかを決定するためのウェスタンブロットによって、抗体競合実験を行った。ヒトTROP−2の細胞外ドメインおよびヒトIgG1のFc領域を含み、マウス骨髄腫細胞株NS0(R&D Systems,Minneapolis,MN)によって発現される2μgの組換え融合ポリペプチドを、2つの各10%ポリアクリルアミドゲルの全長に及ぶ分離ウェルコームを使用した非還元条件下でのSDS−PAGEに供した。ゲル由来のタンパク質を、40Vにて4℃で約17時間、PVDF膜に移した。膜を、震盪プラットフォーム上で5%脱脂粉乳を含むTBSTにて室温で1時間ブロッキングした。膜を、約20mLのTBSTで2回洗浄し、20の個別のチャネルを作製し、そこに異なる探索溶液を適用したウェスタンマルチスクリーン装置に入れた。事前にビオチン化したAR47A6.4.2およびAR52A301.5を、EZ−Link NHS−PEO固相ビオチン化キット(Pierce,Rockford,IL)を使用して調製した。一次抗体溶液を、ビオチン化AR47A6.4.2またはビオチン化AR52A301.5の種々の濃度の非ビオチン化抗体との混合によって調製した。具体的には、0.05μg/mLのビオチン化AR52A301.5を含む3%脱脂粉乳のTBST溶液+0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、または1000μg/mLの非ビオチン化抗体を含む溶液を調製した。使用した非ビオチン化抗体は、AR52A301.5、AR47A6.4.2、およびコントロール抗体8A3B.6(抗ブルータングウイルス;IgG2a、κ、所内で精製)であった。0.05μg/mLのビオチン化AR47A6.4.2を含む溶液を、上記と同一濃度の非ビオチン化抗体AR52A301.5、AR47A6.4.2、およびコントロール抗体1B7.11(抗TNP;IgG1、κ、20μg/mL、所内で精製)を使用して調製した。3%脱脂粉乳を含むTBSTからなるネガティブコントロール溶液を、各膜上の2つのチャネルに添加した。
一次抗体溶液を、膜上の個別のチャネル中にて震盪プラットフォーム上にて室温で2時間インキュベーションした。各チャネルを、震盪プラットフォーム上にてTBSTを使用して10分間で3回洗浄した。3%ミルクを含むTBST溶液のみをネガティブコントロールとして適用した各膜上の1つのチャネルを除き、0.01μg/mLのペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン(Jackson Immunoresearch,West Grove PA)を含む3%脱脂粉乳のTBST溶液からなる二次溶液を、膜上の各チャネルに適用した。膜を、震盪プラットフォーム上にて室温で1時間二次溶液中でインキュベートした。各チャネルを、震盪プラットフォーム上にてTBSTを使用して10分間で3回洗浄した。膜を、マルチスクリーン装置から取り出し、製造者の説明書に従って化学発光増強検出溶液(GE Healthcare,Life Sciences formerly Amersham Biosciences;Piscataway,NJ)とインキュベートした。次いで、膜を、フィルムに露光し、現像した。
図22および23は、抗体競合実験の結果を示す。ビオチン化AR52A301.5の結合は、50μg/mLおよびそれを超える濃度の非ビオチン化AR52A301.5で完全に阻害される一方で(1000倍過剰;図22のレーン3〜7)、AR47A6.4.2の結合は、500μg/mLおよびこれを超える濃度の非ビオチン化AR47A6.4.2で完全に阻害される(10000倍過剰;図23のレーン9〜13)。ビオチン化AR52A301.5の結合は、IgG2aアイソタイプコントロール抗体を含むいかなるサンプル中でも阻害されず(図22のレーン5〜19)、ビオチン化AR47A6.4.2の結合は、IgG1アイソタイプコントロール抗体を含むいかなるサンプル中でも阻害されなかった(図23のレーン15〜19)。これは、同一の非ビオチン化抗体と混合したビオチン化抗体を用いて認められた結合の阻害が、過剰な抗体のみの非特異的相互作用ではなく、非ビオチン化抗体による抗原結合部位の占領に起因していたことを示す。ビオチン化AR52A301.5の結合は、AR47A6.4.2を含む任意のサンプル中で完全に阻害されず、ビオチン化AR47A6.4.2の結合は、AR52A301.5を含む任意のサンプル中で完全に阻害されなかった。しかし、両ウェスタンブロットでは、5μg/mL、50μg/mL、500μg/mL、および1000μg/mLの他の非ビオチン化TROP−2抗体での各ビオチン化TROP−2抗体の反応性は、過剰なアイソタイプコントロール抗体の対応するレーンよりも強度が低かった。これらの結果は、AR52A301.5の結合がAR47A6.4.2のTROP−2への結合およびその逆を防止しないことを示す。まとめると、競合ウェスタンブロットの結果により、AR47A6.4.2およびAR52A301.5によって認識されるTROP−2分子のエピトープは相互に異なるが、一方の抗体の結合が他方の結合に影響を及ぼすことが示唆される。
実施例11
ヒト正常組織の染色
ヒト正常組織中のAR52A301.5抗原分布を特徴づけるためにIHC研究を行った。スライドを、冷(−20℃)アセトン中で10分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、4℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でそれぞれ2分間で3回リンスし、その後に、3%過酸化水素中で10分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、PBS中にて5分間で3回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液(Dako,Toronto,Ontario)中にて室温で5分間インキュベーションした。AR52A301.5、抗ヒト筋肉アクチン(Clone HHF35,Dako,Toronto,Ontario)、抗TROP−2クローン77220.11(R&D System Inc.,MN,USA)、またはアイソタイプコントロール抗体(クロコウジカビグルコースオキシダーゼ(哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素)に指向する;Dako,Toronto,Ontario)を、抗体希釈緩衝液(Dako,Toronto,Ontario)でその作業濃度(0.5μg/mLであった抗アクチンおよび市販のTROP−2が1μg/mLであったことを除き、各抗体について5μg/mL)に希釈し、室温で1時間(overnight for 1 hour)インキュベーションした。スライドを、PBSにて各2分間で3回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のHRP抱合二次抗体(Dako Envision System,Toronto,Ontario)にて室温で30分間検出/視覚化した。この工程の後、スライドを、PBSにて各5分間で3回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのDAB(3,3’−ジアミノベンジジン四塩酸塩,Dako,Toronto,Ontario)色素原基質溶液の室温で10分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Meyerヘマトキシリン(Sigma Diagnostics,Oakville,ON)での対比染色後、スライドを段階的エタノール(75〜100%)で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤(Dako Faramount,Toronto,Ontario)を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。スライドを、Axiovert 200(Ziess Canada,Toronto,ON)を使用して顕微鏡的に試験し、デジタル画像を撮り、Northern Eclipse Imaging Software(Mississauga,ON)を使用して保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理組織学者によって解明した。
ヒト正常組織の染色
ヒト正常組織中のAR52A301.5抗原分布を特徴づけるためにIHC研究を行った。スライドを、冷(−20℃)アセトン中で10分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、4℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でそれぞれ2分間で3回リンスし、その後に、3%過酸化水素中で10分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、PBS中にて5分間で3回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液(Dako,Toronto,Ontario)中にて室温で5分間インキュベーションした。AR52A301.5、抗ヒト筋肉アクチン(Clone HHF35,Dako,Toronto,Ontario)、抗TROP−2クローン77220.11(R&D System Inc.,MN,USA)、またはアイソタイプコントロール抗体(クロコウジカビグルコースオキシダーゼ(哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素)に指向する;Dako,Toronto,Ontario)を、抗体希釈緩衝液(Dako,Toronto,Ontario)でその作業濃度(0.5μg/mLであった抗アクチンおよび市販のTROP−2が1μg/mLであったことを除き、各抗体について5μg/mL)に希釈し、室温で1時間(overnight for 1 hour)インキュベーションした。スライドを、PBSにて各2分間で3回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のHRP抱合二次抗体(Dako Envision System,Toronto,Ontario)にて室温で30分間検出/視覚化した。この工程の後、スライドを、PBSにて各5分間で3回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのDAB(3,3’−ジアミノベンジジン四塩酸塩,Dako,Toronto,Ontario)色素原基質溶液の室温で10分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Meyerヘマトキシリン(Sigma Diagnostics,Oakville,ON)での対比染色後、スライドを段階的エタノール(75〜100%)で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤(Dako Faramount,Toronto,Ontario)を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。スライドを、Axiovert 200(Ziess Canada,Toronto,ON)を使用して顕微鏡的に試験し、デジタル画像を撮り、Northern Eclipse Imaging Software(Mississauga,ON)を使用して保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理組織学者によって解明した。
12種のヒト正常器官、卵巣、膵臓、甲状腺、脳(大脳、小脳)、肺、脾臓、子宮、子宮頸部、心臓、皮膚、および骨格筋への抗体の結合を、ヒト正常組織スクリーニングアレイ(Biochain,CA,USA)を使用して行った。組織マイクロアレイは、20種のヒト正常器官を含んでいたが、そのうちの8種は、剥離またはバックグラウンド染色のいずれかによって制限不可能であった。図24は、ヒト正常組織アレイのAR52A301.5染色の結果のまとめを示す。AR52A301.5は、上皮組織(血管内皮、甲状腺の濾胞上皮、膵臓の腺房および導管上皮、肺胞上皮、皮膚の表皮角化細胞)の制限された結合を示した。抗体はまた、脾臓のリンパ組織への曖昧な結合および脳神経組織の負の結合を示した(図25)。細胞局在化は、拡散した染色パターンで、細胞質および膜質で起こった。AR52A301.5は、市販の抗TROP−2抗体よりもヒト正常組織への結合が制限された。
実施例12
多腫瘍組織染色
ヒト癌中のAR52A301.5抗原の蔓延(prevalence)を特徴づけるためにIHC研究を行った。スライドを、−80℃から−20℃に移した。1時間後、スライドを、冷(−20℃)アセトン中で10分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、4℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でそれぞれ2分間で3回リンスし、その後に、3%過酸化水素中で10分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、PBS中にて5分間で3回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液(Dako,Toronto,Ontario)中にて室温で5分間インキュベーションした。AR52A301.10、抗サイトケラチン7クローンOV−TL 12/30(Dako,Toronto,Ontario)、またはアイソタイプコントロール抗体(クロコウジカビグルコースオキシダーゼ(哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素)に指向する;Dako,Toronto,Ontario)を、抗体希釈緩衝液(Dako,Toronto,Ontario)でその作業濃度(0.5μg/mLであった抗アクチンおよび直ぐに使用できる抗サイトケラチン7を除き、各抗体について5μg/mL)に希釈し、室温で1時間インキュベーションした。スライドを、PBSにて各2分間で3回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のHRP抱合二次抗体(Dako Envision System,Toronto,Ontario)にて室温で30分間検出/視覚化した。この工程の後、スライドを、PBSにて各5分間で3回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのDAB(3,3’−ジアミノベンジジン四塩酸塩,Dako,Toronto,Ontario)色素原基質溶液の室温で10分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Meyerヘマトキシリン(Sigma Diagnostics,Oakville,ON)での対比染色後、スライドを段階的エタノール(75〜100%)で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤(Dako Faramount,Toronto,Ontario)を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。膵臓アレイ(Tri Star,Rockville,MD)のために、以下の修正を除いて、同一のプロトコールに従った。組織切片を最初に室温で2時間風乾し、アセトンでの固定後に30分間再度風乾した。3%過酸化水素を含むメタノールを使用して、内因性過酸化水素を15分間ブロッキングした。この工程を、一次抗体インキュベーション後に行った。
多腫瘍組織染色
ヒト癌中のAR52A301.5抗原の蔓延(prevalence)を特徴づけるためにIHC研究を行った。スライドを、−80℃から−20℃に移した。1時間後、スライドを、冷(−20℃)アセトン中で10分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、4℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でそれぞれ2分間で3回リンスし、その後に、3%過酸化水素中で10分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、PBS中にて5分間で3回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液(Dako,Toronto,Ontario)中にて室温で5分間インキュベーションした。AR52A301.10、抗サイトケラチン7クローンOV−TL 12/30(Dako,Toronto,Ontario)、またはアイソタイプコントロール抗体(クロコウジカビグルコースオキシダーゼ(哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素)に指向する;Dako,Toronto,Ontario)を、抗体希釈緩衝液(Dako,Toronto,Ontario)でその作業濃度(0.5μg/mLであった抗アクチンおよび直ぐに使用できる抗サイトケラチン7を除き、各抗体について5μg/mL)に希釈し、室温で1時間インキュベーションした。スライドを、PBSにて各2分間で3回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のHRP抱合二次抗体(Dako Envision System,Toronto,Ontario)にて室温で30分間検出/視覚化した。この工程の後、スライドを、PBSにて各5分間で3回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのDAB(3,3’−ジアミノベンジジン四塩酸塩,Dako,Toronto,Ontario)色素原基質溶液の室温で10分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Meyerヘマトキシリン(Sigma Diagnostics,Oakville,ON)での対比染色後、スライドを段階的エタノール(75〜100%)で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤(Dako Faramount,Toronto,Ontario)を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。膵臓アレイ(Tri Star,Rockville,MD)のために、以下の修正を除いて、同一のプロトコールに従った。組織切片を最初に室温で2時間風乾し、アセトンでの固定後に30分間再度風乾した。3%過酸化水素を含むメタノールを使用して、内因性過酸化水素を15分間ブロッキングした。この工程を、一次抗体インキュベーション後に行った。
スライドを、Axiovert 200(Ziess Canada,Toronto,ON)を使用して顕微鏡的に試験し、デジタル画像を撮り、Northern Eclipse Imaging Software(Mississauga,ON)を使用して保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理組織学者によって解明した。
図26は、種々のヒト腫瘍およびその対応する正常組織切片(8結腸癌、9卵巣癌、および2正常卵巣、10乳癌、および3正常乳房、9肺癌および2正常肺、13前立腺癌および3正常前立腺、ならびに13膵臓癌および4正常膵臓)のAR52A301.5染色の結果のまとめを示す。組織は、3つの異なる組織マイクロアレイ(Tri Star,Rockville,MD)上に分布した。AR52A301.5抗体は、結腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、および膵臓癌に中等度から強い結合を示した(ぞれぞれ、4/8(50%)、7/9(78%)、7/10(70%)、6/9(67%)、12/13(92%)、および2/13(15%))(図27)。さらに、結腸癌、卵巣癌、乳癌、肺癌、および膵臓癌の切片に曖昧から弱い結合が認められた(それぞれ、3/8(38%)、1/9(11%)、3/10(30%)、3/9(33%)、および1/13(8%))。全ての試験した腫瘍では、結合は腫瘍細胞に特異的であった。対応する正常組織について、抗体は、2/2の卵巣組織および1/3の乳房組織に結合を示さなかった。1/2の肺および4/4の膵臓の正常組織で曖昧から弱い結合が認められ、2/3の乳房、1/2の肺、および3/3の前立腺の正常組織への中程度から強い結合も認められた。結合は、正常器官の上皮組織に制限された。ポジティブコントロール抗体である抗サイトケラチン7または抗アクチンは、上皮組織および筋肉組織にそれぞれ予想される正の結合を示した。負のIgGアイソタイプコントロールは、いかなる試験組織にも検出可能な結合を示さなかった。
実施例13
多種組織染色
種々の種の凍結正常組織のAR52A301.5抗原交差反応性を特徴づけて前臨床毒物学モデルを選択するために、IHC研究を行った。SCIDマウス正常組織(所内で採取)、ラット正常組織アレイ(Biochain,CA,USA)、多種脳アレイ(Biochain,CA,USA)、および多種肝臓アレイ(Biochain,CA,USA)の切片を、−80℃から−20℃に移した。1時間後、スライドを、冷(−20℃)アセトン中で10分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、4℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でそれぞれ2分間で3回リンスし、その後に、3%過酸化水素中で10分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、PBS中にて5分間で3回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液(Dako,Toronto,Ontario)中にて室温で5分間インキュベーションした。AR52A301.5、抗Grp94(Stressgen,Victoria,BC,Canada)、抗ヒト筋肉アクチン(Clone HHF35,Dako,Toronto,Ontario)、またはアイソタイプコントロール抗体(クロコウジカビグルコースオキシダーゼ(哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素)に指向する;Dako,Toronto,Ontario)を、抗体希釈緩衝液(Dako,Toronto,Ontario)でその作業濃度(0.5μg/mLであった抗アクチンを除き、各抗体について5μg/mL)に希釈し、室温で1時間インキュベーションした。スライドを、PBSにて各2分間で3回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のHRP抱合二次抗体(Dako Envision System,Toronto,Ontario)にて室温で30分間検出/視覚化した。この工程の後、スライドを、PBSにて各5分間で3回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのDAB(3,3’−ジアミノベンジジン四塩酸塩,Dako,Toronto,Ontario)色素原基質溶液の室温で10分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Meyerヘマトキシリン(Sigma Diagnostics,Oakville,ON)での対比染色後、スライドを段階的エタノール(75〜100%)で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤(Dako Faramount,Toronto,Ontario)を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。ヒト、カニクイザル、ウサギ、ハムスター、およびアカゲザルの各切片(Biochain,CA,USA)のために、以下の修正を用いて、同一のプロトコールに従った。最初の工程について、組織切片を室温で30分間風乾し、アセトン固定を用いずに冷PBSで洗浄した(製造者由来の切片は、アセトン固定されていた)。3%過酸化水素を含むメタノールを使用して、内因性過酸化水素を20分間ブロッキングした。この工程を、一次抗体インキュベーション後に行った。
多種組織染色
種々の種の凍結正常組織のAR52A301.5抗原交差反応性を特徴づけて前臨床毒物学モデルを選択するために、IHC研究を行った。SCIDマウス正常組織(所内で採取)、ラット正常組織アレイ(Biochain,CA,USA)、多種脳アレイ(Biochain,CA,USA)、および多種肝臓アレイ(Biochain,CA,USA)の切片を、−80℃から−20℃に移した。1時間後、スライドを、冷(−20℃)アセトン中で10分間後固定し、次いで、室温にした。スライドを、4℃の冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でそれぞれ2分間で3回リンスし、その後に、3%過酸化水素中で10分間の洗浄を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングした。次いで、スライドを、PBS中にて5分間で3回洗浄し、その後にユニバーサルブロッキング溶液(Dako,Toronto,Ontario)中にて室温で5分間インキュベーションした。AR52A301.5、抗Grp94(Stressgen,Victoria,BC,Canada)、抗ヒト筋肉アクチン(Clone HHF35,Dako,Toronto,Ontario)、またはアイソタイプコントロール抗体(クロコウジカビグルコースオキシダーゼ(哺乳動物組織中に存在も誘導もされない酵素)に指向する;Dako,Toronto,Ontario)を、抗体希釈緩衝液(Dako,Toronto,Ontario)でその作業濃度(0.5μg/mLであった抗アクチンを除き、各抗体について5μg/mL)に希釈し、室温で1時間インキュベーションした。スライドを、PBSにて各2分間で3回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、入手した状態のHRP抱合二次抗体(Dako Envision System,Toronto,Ontario)にて室温で30分間検出/視覚化した。この工程の後、スライドを、PBSにて各5分間で3回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のためのDAB(3,3’−ジアミノベンジジン四塩酸塩,Dako,Toronto,Ontario)色素原基質溶液の室温で10分間の添加によって呈色反応を行った。水道水中でのスライドの洗浄によって、発色反応を停止させた。Meyerヘマトキシリン(Sigma Diagnostics,Oakville,ON)での対比染色後、スライドを段階的エタノール(75〜100%)で脱水し、キシレンで明澄化した。封入剤(Dako Faramount,Toronto,Ontario)を使用して、スライドにカバーガラスをのせた。ヒト、カニクイザル、ウサギ、ハムスター、およびアカゲザルの各切片(Biochain,CA,USA)のために、以下の修正を用いて、同一のプロトコールに従った。最初の工程について、組織切片を室温で30分間風乾し、アセトン固定を用いずに冷PBSで洗浄した(製造者由来の切片は、アセトン固定されていた)。3%過酸化水素を含むメタノールを使用して、内因性過酸化水素を20分間ブロッキングした。この工程を、一次抗体インキュベーション後に行った。
一次抗体の免疫反応性を、入手した状態の抗マウスHRP抱合二次抗体(Dako Envision System,Toronto,Ontario)にて室温で30分間検出/視覚化した。スライドを、Axiovert 200(Ziess Canada,Toronto,ON)を使用して顕微鏡的に試験し、デジタル画像を撮り、Northern Eclipse Imaging Software(Mississauga,ON)を使用して保存した。結果を読み取り、スコアリングし、病理組織学者によって解明した。
SCIDマウス正常組織(所内で採取)、ラット、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウシ、ウマ、イヌ、およびブタの脳組織(Biochain,CA,USA)、ラット、ヤギ、ニワトリ、およびウシ由来の肝臓組織(Biochain,CA,USA)、ならびにヒト、カニクイザル、アカゲザル、ウサギ、ハムスター、およびモルモットの各組織切片(Biochain,CA,USA)のパネルへの抗体の結合を決定した。ポジティブコントロール抗体である抗体アクチン(クローンHHF35,Dako,Toronto,Ontario)は、筋肉組織への予想される特異的結合を示した。ポジティブコントロール抗体である抗Grp94(Stressgen,Victoria,BC)は、主に上皮組織への予想される正の結合を示した。アイソタイプネガティブコントロール抗体(Dako,Toronto,Ontario)は、一般に、試験組織への検出可能な結合を示さなかった。ネガティブコントロール中に明らかなバックグラウンド染色を示した組織切片を、解釈から排除した。
図28は、ヒトおよび種々の正常組織のAR52A301.5染色の結果を表にしている。AR52A301.5は、試験したウサギ、マウス、ラット、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ハムスター、ニワトリ、ウマ、ウマ、またはブタの正常組織への結合を示さなかった。正常なイヌ組織について、対応するヒト組織で認められる結合と異なる結合が認められた。カニクイザル正常組織について、AR52A301.5は、カニクイザルで結合が認められなかった卵巣を除く全ての試験器官について、対応するヒト組織に類似の組織特異性を示した(図29)。アカゲザル正常組織について、AR52A301.5は、全ての試験器官の対応するヒト組織で認められる組織特異性と類似の組織特異性を示した(図29)。アカゲザル正常組織パネルがカニクイザルについて試験したパネルより小さかったことに留意すべきである。染色プロフィールに基づいて、カニクイザルおよびアカゲザルの両方は、AR52A301.5に適切な毒物学モデルであると見なされる。
実施例14
AR52A301.5マウス配列
1.0 配列ベクターへの可変領域遺伝子のクローニング
抗体キメラの産生を容易にするために、重鎖および軽鎖の両方の可変領域をコードする遺伝子を、個別に市販の配列決定ベクターpGEM−Teasy(Promega Corp.,Madison,WI)にクローニングした。
AR52A301.5マウス配列
1.0 配列ベクターへの可変領域遺伝子のクローニング
抗体キメラの産生を容易にするために、重鎖および軽鎖の両方の可変領域をコードする遺伝子を、個別に市販の配列決定ベクターpGEM−Teasy(Promega Corp.,Madison,WI)にクローニングした。
1.1 mRNAの単離
PolyA Tract System 1000 mRNA抽出キット(Promega Corp.,Madison,WI)を使用して、伝令リボ核酸(mRNA)を、コンフルエントなMaster Cell Bank(AR52A301.5)ハイブリドーマ細胞の培養物から単離した。mRNAを、さらなる用途で必要になるまで−80℃で保存した。
PolyA Tract System 1000 mRNA抽出キット(Promega Corp.,Madison,WI)を使用して、伝令リボ核酸(mRNA)を、コンフルエントなMaster Cell Bank(AR52A301.5)ハイブリドーマ細胞の培養物から単離した。mRNAを、さらなる用途で必要になるまで−80℃で保存した。
1.2 可変領域遺伝子のRT−PCR増幅
軽鎖および重鎖の可変領域を増幅するために個別の反応を行った。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により、mRNAテンプレートから相補デオキシリボ核酸(cDNA)を合成し、ターゲティングされた遺伝子を特異的に増幅した。
軽鎖および重鎖の可変領域を増幅するために個別の反応を行った。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により、mRNAテンプレートから相補デオキシリボ核酸(cDNA)を合成し、ターゲティングされた遺伝子を特異的に増幅した。
軽鎖について、5.0μlのmRNAを、1.0μlの20pmol/μlのMuIgGκVL−3’プライマーOL040および5.5μlの無ヌクレアーゼ水(Promega Corp.,Madison,WI)と混合した。λ軽鎖について、5.0μlのmRNAを、1.0μlの20pmol/μlのMuIgGλVL−3’プライマーOL042および5.5μlの無ヌクレアーゼ水(Promega Corp.,Madison,WI)と混合した。γ重鎖について、5μlのmRNAを、1.0μlの20pmol/μlのMuIgGVH−3’プライマーOL023および5.5μlの無ヌクレアーゼ水(Promega Corp.,Madison,WI)と混合した。3つ全ての反応混合物を、70℃に設定したサーマルサイクラーの予熱ブロック中に5分間入れた。次いで、反応混合物を、氷上で5分間冷却し、その後、各4.0μlのImPrommII 5×反応緩衝液(Promega Corp.,Madison,WI)、0.5μlのRNasinリボヌクレアーゼインヒビター(Promega Corp.,Madison,WI)、2.0μlの25mM MgCl2(Promega Corp.,Madison,WI)、1.0μlの10mM dNTPミックス(Promega Corp.,Madison,WI)、および1.0μlのImpromII逆転写酵素(Promega Corp.,Madison,WI)に添加した。これらの反応混合物を、室温で5分間インキュベーションし、その後、42℃に設定した予熱PCRブロックに1時間移した。この後、逆転写酵素を、PCRブロック中での70℃で15分間のインキュベーションによって熱失活させた。
次いで、重鎖および軽鎖の配列を、プライマープールを使用して特異的に増幅した(プライマー配列については、図30を参照のこと;配列番号9〜46)。プライマー作業溶液を、以下のように作製した。
1.5’単一プライマー(MuIgVH5’−AおよびB;MuIgκVLh5’−A、B、およびC;MuIgλVL5’−A)は、20μMの濃度で各プライマーを含んでいた。
2.5’プライマープール(MuIgVH5’−C〜F;MuIgκVLh5’−D〜G)は、5μMの濃度で各構成性プライマーを含んでいた。
1.5’単一プライマー(MuIgVH5’−AおよびB;MuIgκVLh5’−A、B、およびC;MuIgλVL5’−A)は、20μMの濃度で各プライマーを含んでいた。
2.5’プライマープール(MuIgVH5’−C〜F;MuIgκVLh5’−D〜G)は、5μMの濃度で各構成性プライマーを含んでいた。
重鎖および軽鎖の配列を、cDNAから増幅した。PCRマスターミックスを、37.5μlの10×Hi−Fi Expand PCR緩衝液(Roche,Mannheim,Germany)、7.5μlの10mM dNTPミックス(Invitrogen,Paisley,UK)、および3.75μlのHi−Fi Expand DNAポリメラーゼ(Roche,Mannheim,Germany)を273.75μlの無ヌクレアーゼ水に添加することによって調製した。このマスターミックスを、21.5μlアリコートで氷上の15個の薄壁PCR管に分注した。これらの6つの管に、2.5μlのMulgVH−3’逆転写反応ミックスおよび1.0μlの重鎖5’プライマーミックスA〜Fを添加した。別の7つの管に、2.5μlのMuIgκVL−3’逆転写反応物および1.0μlの軽鎖5’プライマーミックスA〜Gを添加した。最後の管に、2.5μlのMuIgλVL−3’逆転写反応物および1.0μlのλ軽鎖プライマーMuIgλVL5’−Aを添加した。反応物を、サーマルサイクラーのブロックに入れ、95℃に2分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、94℃で30秒間、55℃で1分間、および72℃で30秒間の40サイクルで行った。最後に、PCR産物を、72℃で5分間加熱し、次いで、4℃で保存した。PCR産物を、QIAquick PCR精製キット(QIAGEN,Crawley,UK)を使用して精製した。
図31は、RT−PCR反応の結果を示す。重鎖反応(レーン2〜7)は、MuIgVH5’−B(レーン3)およびMuIgVH5’−E(レーン6)を使用して増幅した500bpの強いバンドを示す。軽鎖反応(レーン8〜15)は、順方向プライマーMuIgκVL5’−G(レーン14)を使用して増幅した強い450bp産物のバンドを示す。これらの反応由来のPCR産物を、QIAquick PCR 精製キット(QIAGEN,Crawley,UK)を使用して精製した。
1.3 配列決定ベクターへのクローニング
軽鎖Gおよび重鎖BおよびEの精製PCR産物を、pGEM−T easy Vector SystemI(Promega Corp.,Madison,WI)を使用して、pGEM−T easyベクターに個別にクローニングした。軽鎖および重鎖の両反応物を、5.0μlの2×ライゲーション緩衝液、1.0μl pGEM−T easyベクター、および1.0μl T4 DNAリガーゼへの3.0μlの精製PCR産物の添加によって調製した。製造者の説明書にしたがって、プラスミドを、サブクローニンググレードのXL1−blueコンピテント大腸菌(Stratgene,La Jolla,CA)に形質転換した。全形質転換のために、2.0μlのライゲーション反応物を使用した。
軽鎖Gおよび重鎖BおよびEの精製PCR産物を、pGEM−T easy Vector SystemI(Promega Corp.,Madison,WI)を使用して、pGEM−T easyベクターに個別にクローニングした。軽鎖および重鎖の両反応物を、5.0μlの2×ライゲーション緩衝液、1.0μl pGEM−T easyベクター、および1.0μl T4 DNAリガーゼへの3.0μlの精製PCR産物の添加によって調製した。製造者の説明書にしたがって、プラスミドを、サブクローニンググレードのXL1−blueコンピテント大腸菌(Stratgene,La Jolla,CA)に形質転換した。全形質転換のために、2.0μlのライゲーション反応物を使用した。
各反応由来の100μlの形質転換細胞を、50μg/mL アンピシリン(Sigma,Poole,UK)を含むLuriaブロス(LB)寒天(Q−Biogene,Cambridge,UK)プレート上にプレートした。プレートを逆さにし、37℃っでインキュベーションした。
3つの各プレート由来の8つのクローンを選択し、これを使用して、20μl滅菌水に接種した。385.2μl滅菌水、25.5μlジメチルスルホキシミド(Sigma,Poole,UK)、51μlの10×Taq緩衝液(Invitrogen,Paisley,UK)、10.2μlの10mM dNTPミックス(Invitrogen,Paisley,UK)、5.1μlの50pmol/μlプライマーOL001、5.1μlの50pmol/μlプライマーOL002、および2.5μlのTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen,Paisley,UK)の混合によってPCRマスターミックスを調製した。このマスターミックスを、19μlアリコートで24個のPCR反応管に分注した。これらの各反応管に、1.0μlの接種したコロニー懸濁液を添加した。PCR反応物を、サーマルサイクラーのブロックに入れ、95℃に5分間加熱した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を、94℃で1分間、55℃で1分間、および72℃で1分間の25サイクルで行った。最後に、PCR産物を、72℃で10分間加熱した。次いで、各反応由来の5μlを、1%アガロースゲルで泳動した。
図32は、AR52A301.5VH−Bの8コロニーおよびAR52A301.5VH−Eの8コロニー由来のPCRスクリーニング反応を示す。8個のVHBコロニーのうちの7個(VHB−2〜VHB−8)(レーン2〜8)および8個のVH−Eコロニーの1個(VHE−2)(レーン11)は、650bp産物バンドに陽性であり、500bp産物のpGEM−T easyベクターへの首尾のよいクローニングを示す。残りのVHBおよび7個のVH−E反応物により、異なる分子量のバンドが得られ、500bpインサートの負の結果を示した。
図32はまた、AR52A301.5VL−Gの8コロニー由来のPCRスクリーニング反応を示す。8個のVLGコロニーのうちの4個(VLG−2、VLG−5、VLG−6、およびVLG−7)(レーン19、22、23、および24)は、600bp産物バンドに陽性であり、pGEM−T easyベクターへの450bp産物の首尾のよいクローニングを示す。残りの4VL−G反応により、異なる分子量のバンドが産生され、450bpインサートの負の結果を示した。
各ライゲーション由来の最大で4個の正のコロニーを選択し、50mg/Lアンピシリン(Sigma,Poole,UK)を含む5mLの2YT(Sigma,Poole,UK)ブロスに接種した。培養物を、撹拌しながら37℃で一晩インキュベーションした。Qiagen,QIAprep Spin Miniprepキット(Qiagen,Crawley,UK)を使用して、各培養物からプラスミドDNAを抽出した。
1.4 DNA配列決定
9個のAR52A301.5VLおよびVHクローン(VLG−2、VLG−5、VLG−6、VLG−7、VHB−2、VHB−3、VHB−4、VHB−5、およびVHE−2)由来のプラスミドDNAを、Geneservice Ltd.DNA配列決定装置(Cambridge,UK)で配列決定した。配列を図33および34に列挙し、相補性決定領域(CDR)に下線を引いた。図33は、配列番号8を示し、下線を引いたCDRを配列番号4〜6と指定する。図34は配列番号7を示し、下線を引いたCDRを配列番号1〜3と指定する。CDRの定義およびアミノ酸配列のナンバリングを、Kabat et al.(1991)に従って行う。Kabatナンバリングは、図33および34中のアミノ酸配列の上に列挙している。Kabatナンバリングに適合するために、AR52A301.5軽鎖CDR3中にハイフン(図33)を挿入した。
9個のAR52A301.5VLおよびVHクローン(VLG−2、VLG−5、VLG−6、VLG−7、VHB−2、VHB−3、VHB−4、VHB−5、およびVHE−2)由来のプラスミドDNAを、Geneservice Ltd.DNA配列決定装置(Cambridge,UK)で配列決定した。配列を図33および34に列挙し、相補性決定領域(CDR)に下線を引いた。図33は、配列番号8を示し、下線を引いたCDRを配列番号4〜6と指定する。図34は配列番号7を示し、下線を引いたCDRを配列番号1〜3と指定する。CDRの定義およびアミノ酸配列のナンバリングを、Kabat et al.(1991)に従って行う。Kabatナンバリングは、図33および34中のアミノ酸配列の上に列挙している。Kabatナンバリングに適合するために、AR52A301.5軽鎖CDR3中にハイフン(図33)を挿入した。
正確なAR52A301.5VL配列は、5’プライマーMuIgκVL−Gで増幅した4つの全クローン中で見出された。正確なAR52A301.5VH配列は、5’プライマーMuIgVH−Bで増幅した4つの全クローンで見出された。5’プライマーMuIgVH−Eで増幅した産物の配列は、マウスIgG配列と整列しなかった。
実施例15
競合結合薬の単離
抗体をかんがみて、当業者は、競合阻害CDMAB(例えば、同一エピトープを認識する抗体である競合抗体)を生成することができる(Belanger L et al.Clinica Chimica Acta 48:15−18(1973))。1つの方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原での免疫化が必要である。サンプルには、組織、単離タンパク質、または細胞株が含まれ得るが、これらに限定されない。得られたハイブリドーマを、競合アッセイを使用してスクリーニングすることができ、このアッセイは、ELISA、FACS、またはウェスタンブロッティングなどの試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するアッセイである。別の方法は、ファージディスプレイ抗体ライブラリーおよび抗原の少なくとも1つのエピトープを認識する抗体のパニングを使用することができる(Rubinstein JL et al.Anal Biochem 314:294−300(2003))。いずれにしても、標的抗原の少なくとも1つのエピトープへの元の標識抗体の結合を示す能力に基づいて抗体を選択する。したがって、かかる抗体は、元の抗体として抗原の少なくとも1つのエピトープを認識するという特徴を有するであろう。
競合結合薬の単離
抗体をかんがみて、当業者は、競合阻害CDMAB(例えば、同一エピトープを認識する抗体である競合抗体)を生成することができる(Belanger L et al.Clinica Chimica Acta 48:15−18(1973))。1つの方法は、抗体によって認識される抗原を発現する免疫原での免疫化が必要である。サンプルには、組織、単離タンパク質、または細胞株が含まれ得るが、これらに限定されない。得られたハイブリドーマを、競合アッセイを使用してスクリーニングすることができ、このアッセイは、ELISA、FACS、またはウェスタンブロッティングなどの試験抗体の結合を阻害する抗体を同定するアッセイである。別の方法は、ファージディスプレイ抗体ライブラリーおよび抗原の少なくとも1つのエピトープを認識する抗体のパニングを使用することができる(Rubinstein JL et al.Anal Biochem 314:294−300(2003))。いずれにしても、標的抗原の少なくとも1つのエピトープへの元の標識抗体の結合を示す能力に基づいて抗体を選択する。したがって、かかる抗体は、元の抗体として抗原の少なくとも1つのエピトープを認識するという特徴を有するであろう。
実施例16
AR52A301.5モノクローナル抗体の可変領域のクローニング
AR52A301.5ハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体の重鎖(VH)および軽鎖(VL)由来の可変領域の配列を決定した(実施例14)。キメラIgGおよびヒト化IgGを生成するために、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを、適切な発現用ベクターにサブクローニングすることができる。
AR52A301.5モノクローナル抗体の可変領域のクローニング
AR52A301.5ハイブリドーマ細胞株によって産生されたモノクローナル抗体の重鎖(VH)および軽鎖(VL)由来の可変領域の配列を決定した(実施例14)。キメラIgGおよびヒト化IgGを生成するために、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを、適切な発現用ベクターにサブクローニングすることができる。
別の実施形態では、AR52A301.5またはその脱免疫化、キメラ、またはヒト化バージョンを、抗体を発現し、回収することができるようなトランスジェニック動物中での抗体をコードする核酸の発現によって産生する。例えば、回収および精製を容易にする組織特異的様式で、抗体を発現することができる。1つのかかる実施形態では、本発明の抗体を、授乳時に分泌させるために乳腺中で発現する。トランスジェニック動物には、マウス、ヤギ、およびウサギが含まれるが、これらに限定されない。
(i)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体をコードするDNA(実施例1に概説)を、従来の手順(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用による)を使用して容易に単離および配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、かかるDNAの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、DNAを発現ベクターに入れ、次いで、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることができるが、免疫グロブリンタンパク質を産生しない場合、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによってDNAを修飾することもできる。キメラ抗体またはハイブリッド抗体を、合成タンパク質化学における公知の方法(架橋剤に関連する方法が含まれる)を使用して、in vitroで調製することもできる。例えば、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって免疫毒素を構築することができる。この目的に適切な試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル−4−メルカプトブチリミダートが含まれる。
モノクローナル抗体をコードするDNA(実施例1に概説)を、従来の手順(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの使用による)を使用して容易に単離および配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、かかるDNAの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、DNAを発現ベクターに入れ、次いで、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトすることができるが、免疫グロブリンタンパク質を産生しない場合、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによってDNAを修飾することもできる。キメラ抗体またはハイブリッド抗体を、合成タンパク質化学における公知の方法(架橋剤に関連する方法が含まれる)を使用して、in vitroで調製することもできる。例えば、ジスルフィド交換反応の使用またはチオエーテル結合の形成によって免疫毒素を構築することができる。この目的に適切な試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル−4−メルカプトブチリミダートが含まれる。
(ii)ヒト化抗体
ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来の抗体に導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基を、しばしば「移入」残基といい、この用語は、典型的には、「移入」可変ドメインから引き継いでいる。げっ歯類CDRまたはCDR配列との対応するヒト抗体配列の置換によるWinter and co−workersの方法によってヒト化することができる。(Jones et al,Nature 321:522−525(1986);Riechmann et al,Nature 332:323−327(1988);Verhoeyen et al,Science 239:1534−1536(1988);Clark,Immunol.Today 21:397−402(2000)での概説)。
ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来の抗体に導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基を、しばしば「移入」残基といい、この用語は、典型的には、「移入」可変ドメインから引き継いでいる。げっ歯類CDRまたはCDR配列との対応するヒト抗体配列の置換によるWinter and co−workersの方法によってヒト化することができる。(Jones et al,Nature 321:522−525(1986);Riechmann et al,Nature 332:323−327(1988);Verhoeyen et al,Science 239:1534−1536(1988);Clark,Immunol.Today 21:397−402(2000)での概説)。
ヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析過程によって、ヒト化抗体を調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、これは、当業者に良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の探索可能な三次元高次構造を例示および表示するコンピュータプログラムを利用可能である。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の起こり得る役割を分析可能である(すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析)。このような方法で、所望の抗体特性(標的抗原に対する親和性の増加など)が達成されるように、FR残基を選択し、コンセンサス配列および移入配列と組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関連する。
(iii)抗体フラグメント
抗体フラグメントの産生のための種々の技術が開発されている。これらのフラグメントを、組換え宿主細胞によって産生することができる(Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548−557(1999);Little et al.,Immunol.Today 21:364−370(2000)に概説)。例えば、Fab’−SHフラグメントを、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてF(ab’)2フラグメントを形成することができる(Carter et al.,Biotechnology 10:163−167(1992))。別の実施形態では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab’)2を形成して、F(ab’)2分子のアセンブリを促進する。別のアプローチに従って、Fv、Fab、またはF(ab’)2フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。
抗体フラグメントの産生のための種々の技術が開発されている。これらのフラグメントを、組換え宿主細胞によって産生することができる(Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548−557(1999);Little et al.,Immunol.Today 21:364−370(2000)に概説)。例えば、Fab’−SHフラグメントを、大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングしてF(ab’)2フラグメントを形成することができる(Carter et al.,Biotechnology 10:163−167(1992))。別の実施形態では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab’)2を形成して、F(ab’)2分子のアセンブリを促進する。別のアプローチに従って、Fv、Fab、またはF(ab’)2フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。
実施例17
本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体を、癌の予防/治療用組成物として使用することができる。本発明の抗体を含む癌の予防/治療用組成物は毒性が低く、液体調製物の形態または適切な調製物の薬学的組成物としてヒトまたは哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に、経口または非経口(例えば、静脈内、腹腔内、皮下など)で投与することができる。本発明の抗体自体を投与することができるか、適切な組成物として投与することができる。投与に使用される組成物は、本発明の抗体またはその塩と共に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。かかる組成物を、経口または非経口投与に適切な薬学的調製物の形態で提供する。
本発明の抗体を含む組成物
本発明の抗体を、癌の予防/治療用組成物として使用することができる。本発明の抗体を含む癌の予防/治療用組成物は毒性が低く、液体調製物の形態または適切な調製物の薬学的組成物としてヒトまたは哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に、経口または非経口(例えば、静脈内、腹腔内、皮下など)で投与することができる。本発明の抗体自体を投与することができるか、適切な組成物として投与することができる。投与に使用される組成物は、本発明の抗体またはその塩と共に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。かかる組成物を、経口または非経口投与に適切な薬学的調製物の形態で提供する。
非経口投与のための組成物の例は、注射用調製物、座剤などである。注射用調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、および筋肉内注射、点滴、関節内注射などの投薬形態が含まれ得る。これらの注射用調製物を、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物を、本発明の抗体またはその塩の慣習的に注射のために使用される滅菌水性溶剤または油性溶剤への溶解、懸濁、または乳化によって調製することができる。注射用水性溶剤として、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の助剤などを含む等張液が存在する。注射用水性溶剤を、適切な可溶化剤(アルコール(例えば、エタノール)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート80、HCO−50(硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン(50モル)付加物))など)と組み合わせて使用することができる。油性溶剤として、油性溶剤として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などを使用する。油性溶剤を、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの溶解補助剤と組み合わせて使用することができる。このようにして調製した注射剤を、適切なアンプルに充填する。直腸投与のために使用される座剤を、本発明の抗体またはその塩と従来の座剤の基剤とのブレンドによって調製することができる。経口投与用組成物には、固体または液体の調製物、具体的には、錠剤(ドラジェおよびフィルムコーティング錠が含まれる)、丸薬、顆粒、散剤調製物、カプセル(軟カプセルが含まれる)、シロップ、乳濁液、懸濁液などが含まれる。かかる組成物を公知の方法によって製造し、かかる組成物は、薬学的調製物分野で慣習的に使用されるビヒクル、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。錠剤のためのビヒクルまたは賦形剤の例は、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウムなどである。
有利には、上記で使用される経口または非経口用の組成物を、有効成分の用量に適合させた単位用量を有する薬学的調製物に調製する。かかる単位用量調製物には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射剤(アンプル)、座剤などが含まれるが、これらに限定されない。上記化合物の含有量は、一般に、単位投薬形態あたり5〜500mgである。上記抗体は、特に注射形態では約5〜約100mg含まれ、他の形態には10〜250mg含まれることが好ましい。
本発明の抗体を含む上記予防/治療薬または調整剤の用量は、投与される被験体、標的疾患、容態、投与経路などに応じて変化し得る。例えば、治療/防止のために使用する場合(例えば、成人の乳癌)、本発明の抗体を、約0.01〜約20mg/kg体重、好ましくは約0.1〜約10mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜約5mg/kg体重の用量で約1〜5回/日、好ましくは約1〜3回/日の頻度で静脈内に投与することが有利である。他の非経口投与および経口投与では、薬剤を、上記用量に相当する用量で投与することができる。容態が特に重篤である場合、容態にしたがって用量を増大させることができる。
本発明の抗体を、そのまままたは適切な組成物の形態で投与することができる。投与に使用される組成物は、上記抗体またはその塩と共に薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含むことができる。かかる組成物を、経口投与または非経口投与(例えば、静脈内注射、皮下注射など)に適切な薬学的調製物の形態で提供する。上記の各組成物は、他の有効成分をさらに含むことができる。さらに、本発明の抗体を、他の薬物(例えば、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、イフォスファミドなど)、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキサート、5−フルオロウラシルなど)、抗腫瘍抗生物質(例えば、マイトマイシン、アドリアマイシンなど)、植物由来抗腫瘍薬(例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソールなど)、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカンなど)と組み合わせて使用することができる。本発明の抗体および上記薬物を、同時または時間をずらして患者に投与することができる。
特に癌のための本明細書中に記載の治療方法を、他の抗体または化学療法薬の投与によって実施することもできる。例えば、特に結腸癌治療の場合、EGFRに対する抗体(エルビタックス(登録商標)(セツキシマブ)など)も投与することができる。エルビタックス(登録商標)は、乾癬治療にも有効であることが示されている。組み合わせ用の他の抗体には、特に乳癌治療の場合のハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、特に結腸癌治療の場合のアバスチン(登録商標)、および特に非小細胞肺癌治療の場合のSGN−15が含まれる。本発明の抗体を、同一または他の経路を介して、他の抗体/化学療法薬と同時または個別に投与することができる。
使用される化学療法薬/他の抗体投与計画には、患者の容態の治療に最適であると考えられる任意の投与計画が含まれる。異なる悪性疾患には、特異的抗腫瘍抗体および特異的化学療法薬を使用する必要があり得、これらを一人一人の患者に合わせて決定する。本発明の好ましい実施形態では、化学療法薬を、抗体療法と同時、より好ましくは抗体療法後に投与する。しかし、本発明は任意の特定の方法または投与経路に制限されないことを強調すべきである。
多数の証拠により、AR52A301.5が、TROP−2上に存在するエピトープのライゲーションによって抗癌効果を媒介し、生存を延長することが示される。実施例8および9では、AR52A301.5抗体を使用して、MDA−MB−231細胞などの発現細胞から同族抗原を免疫沈降することができることを示している。さらに、実施例1、2、および11〜13では、AR52A301.5抗体を、例示の技術(FACS、細胞ELISA、またはIHCが含まれるが、これらに限定されない)を使用して、この抗体に特異的に結合するTROP−2抗原部分を発現する細胞および/または組織の検出で使用することができることを示している。
したがって、FACS、細胞ELISA、またはIHCアッセイを使用して、免疫沈降したAR52A301.5抗原がかかる細胞または組織へのAR52A301.5の結合を阻害することができることを示し得る。さらに、AR52A301.5抗体と同様に、他の抗TROP−2抗体を使用して、TROP−2抗原の他の形態を免疫沈降および単離することができ、この抗原を使用して、同一アッセイ型を使用して抗原を発現する細胞または組織への抗体の結合を阻害することができる。
本明細書中に言及した全ての特許および刊行物は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、各刊行物が具体的且つ個別に参考として援用されることを示すのと同一の範囲で、本明細書中で参考として援用される。
本発明の一定の形態を例示しているが、本明細書中に記載され、示されている特定の形態またはその一部の配置に制限されないと理解すべきである。本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、本発明が明細書中に示し、そして記載した事項に制限されると見なすべきではないということが、当業者に明らかであろう。当業者は、目的を実施して記載の目的および利点ならびに特有の目的および利点が得られるように本発明を十分に適合させることを容易に認識するであろう。本明細書中に記載の任意のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順、および技術は、現在のところ好ましい実施形態の代表であり、これらは本発明の例示を意図し、本発明の範囲を制限することを意図しない。当業者は、本発明を変更し、他で使用するが、これらは本発明の精神の範囲内に含まれ、添付の特許請求の範囲によって定義される。本発明は、特定の好ましい実施形態と併せて記載しているにもかかわらず、特許請求の範囲に記載の発明がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、当業者に自明の本発明の実施のための記載の様式の種々の修正形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
Claims (60)
- IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体。
- IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体または該ヒト化抗体から産生された抗原結合フラグメント。
- IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体または該キメラ抗体から産生された抗原結合フラグメント。
- IDACに受入番号141205−03で寄託された単離ハイブリドーマ細胞株。
- ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍から選択される組織サンプル中の癌性細胞の抗体誘導細胞傷害性を開始する方法であって、
該ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍由来の組織サンプルを準備する工程、
IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体、またはそのCDMABを準備する工程であって、該CDMABが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、準備する工程、および
該単離モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそのCDMABを該組織サンプルと接触させる工程、
を含み、
該単離モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそのCDMABの該組織サンプルとの結合により、細胞傷害性が誘導される、方法。 - 請求項1に記載の単離モノクローナル抗体のCDMAB。
- 請求項2に記載のヒト化抗体のCDMAB。
- 請求項3に記載のキメラ抗体のCDMAB。
- 細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的、またはレポーター部分、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーと抱合した、請求項1、請求項2、請求項3、請求項6、請求項7、または請求項8のいずれか1項に記載の単離抗体またはそのCDMAB。
- ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのCDMABに特異的に結合する抗原の少なくとも1つのエピトープを発現し、該CDMABが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、哺乳動物における抗体誘導細胞傷害性に感受性を示すヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を軽減する方法であって、該モノクローナル抗体またはそのCDMABを、該哺乳動物の膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有用な量で該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
- 前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項11に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが補体を活性化する、請求項10に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項10に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項10に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項10に記載の方法。
- IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的に結合する、モノクローナル抗体。
- ヒト腫瘍がIDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのCDMABに特異的に結合する抗原の少なくとも1つのエピトープを発現し、該CDMABが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させる方法であって、該モノクローナル抗体またはそのCDMABを、該哺乳動物の膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有用な量で該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
- 前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項18に記載の方法。
- 前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項19に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが補体を活性化する、請求項18に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項18に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項18に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項18に記載の方法。
- ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍がIDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのCDMABに特異的に結合する抗原の少なくとも1つのエピトープを発現し、該CDMABが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させる方法であって、該哺乳動物の膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の少なくとも1つの化学療法薬と併せて該モノクローナル抗体またはそのCDMABを該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
- 前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項26に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが補体を活性化する、請求項25に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項25に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項25に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項25に記載の方法。
- IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体、またはIDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体によって特異的に結合するヒト腫瘍から選択される組織サンプル中の癌性細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
該ヒト腫瘍由来の組織サンプルを準備する工程、
IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同一のエピトープを認識する該単離モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそのCDMABの少なくとも1つを準備する工程、
少なくとも1つの準備した該抗体またはそのCDMABを該組織サンプルと接触させる工程、および
少なくとも1つの準備した該抗体またはそのCDMABの該組織サンプルとの結合を決定する工程、
を含み、
該組織サンプル中の該癌性細胞の存在が示される、結合アッセイ。 - ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍がIDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのCDMABに特異的に結合する抗原の少なくとも1つのエピトープを発現し、該CDMABが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるためのモノクローナル抗体の使用であって、該哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の該モノクローナル抗体またはそのCDMABを該哺乳動物に投与する工程を含む、使用。
- 前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項34に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが補体を活性化する、請求項33に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項33に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項33に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項33に記載の方法。
- ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍がIDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのCDMABに特異的に結合する抗原の少なくとも1つのエピトープを発現し、該CDMABが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるためのモノクローナル抗体の使用であって、該哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の少なくとも1つの化学療法薬と併せて該モノクローナル抗体またはそのCDMABを該哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
- 前記単離モノクローナル抗体を細胞傷害性部分に抱合する、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞傷害性部分が放射性同位体である、請求項41に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが補体を活性化する、請求項40に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが抗体依存性細胞傷害性を媒介する、請求項40に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のヒト化抗体である、請求項40に記載の方法。
- 前記単離モノクローナル抗体が、IDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体のキメラ抗体である、請求項40に記載の方法。
- 請求項1、請求項2、請求項3、請求項6、請求項7、請求項8、請求項17、請求項49、請求項50、請求項54、請求項55、または請求項56のいずれか1項に記載の抗体またはCDMAB、
抗体またはその抗原結合部分と細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーとの抱合体、および
必要量の薬学的に許容可能なキャリアを組み合わせて含むヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効な組成物であって、前記組成物が、該ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効である、組成物。 - ヒト癌性腫瘍がIDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのCDMABに特異的に結合する抗原の少なくとも1つのエピトープを発現し、該CDMABが該単離モノクローナル抗体のその標的抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、ヒト癌性腫瘍の存在を検出するためのアッセイキットであって、該キットがIDACに受入番号141205−03で寄託されたハイブリドーマによって産生された単離モノクローナル抗体またはそのCDMABおよびモノクローナル抗体またはそのCDMABがポリペプチドに結合するかどうかを検出するための手段、特定のカットオフレベルでの該ポリペプチドの損座剤によって該ヒト癌性腫瘍が存在すると診断される、アッセイキット。
- ヒトTROP−2に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはそのCDMABであって、該単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが、IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体と同一のヒトTROP−2のエピトープと反応し、該単離モノクローナル抗体またはそのCDMABが、該単離モノクローナル抗体のその標的ヒトTROP−2抗原への結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、単離モノクローナル抗体またはそのCDMAB。
- IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと同一のエピトープを認識する単離モノクローナル抗体またはそのCDMABであって、該モノクローナル抗体またはそのCDMABが、単離モノクローナル抗体のその標的エピトープへの結合を競合的に阻害する能力によって特徴づけられる、単離モノクローナル抗体またはそのCDMAB。
- IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトTROP−2抗原の少なくとも1つのエピトープを発現するヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させるプロセスであって、IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する少なくとも1つの単離モノクローナル抗体またはそのCDMABを該ヒト腫瘍を罹患している個体に投与する工程を含み、該エピトープの結合により、膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の全身腫瘍組織量が減少する、プロセス。
- IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体によって特異的に結合されるヒトTROP−2抗原の少なくとも1つのエピトープを発現するヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍を減少させるプロセスであって、少なくとも1つの化学療法薬と併せてIDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体によって結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する少なくとも1つの単離モノクローナル抗体またはそのCDMABを該ヒト腫瘍を罹患している個体に投与する工程を含み、該投与により腫瘍の全身腫瘍組織量が減少する、プロセス。
- IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生された抗原結合フラグメントによって特異的に認識されるTROP−2を発現する細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、
細胞サンプルを準備する工程、
IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生された抗原結合フラグメントを準備する工程、
該単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを該細胞サンプルと接触させる工程、および
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの該細胞サンプルとの結合を決定する工程、とを含み、
該単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントによって特異的に結合されるTROP−2の抗原を発現する細胞の存在を決定するが決定される、結合アッセイ。 - IDAC受入番号141205−05を有するハイブリドーマ細胞株AR47A6.4.2によって産生された単離モノクローナル抗体と同一のヒトTROP−2のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号1、配列番号2、および配列番号3の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号4、配列番号5、および配列番号6の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域またはそのヒトTROP−2結合フラグメントを含む、モノクローナル抗体。
- IDAC受入番号141205−05を有するハイブリドーマ細胞株AR47A6.4.2によって産生された単離モノクローナル抗体と同一のヒトTROP−2のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号1、配列番号2、および配列番号3の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、配列番号4、配列番号5、および配列番号6の相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、ならびにヒト抗体の重鎖および軽鎖由来の可変ドメインフレームワーク領域またはヒト抗体コンセンサスフレームワークまたはそのヒトTROP−2結合フラグメントを含む、モノクローナル抗体。
- ヒトTROP−2に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号7の重鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号8の軽鎖可変領域のアミノ酸配列またはそのヒトTROP−2結合フラグメントを含む、モノクローナル抗体。
- IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生された抗原結合フラグメントに特異的に結合する抗原を発現する、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療によって生存を延長し、疾患の進行を遅延させる方法であって、哺乳動物の腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の該モノクローナル抗体を該哺乳動物に投与し、それにより、疾患の進行が遅延し、生存が延長される工程を含む、方法。
- IDAC受入番号141205−03を有するハイブリドーマ細胞株AR52A301.5によって産生された単離モノクローナル抗体または該単離モノクローナル抗体から産生されたTROP−2結合フラグメントに特異的に結合するTROP−2を発現する、哺乳動物のヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療によって生存を延長し、疾患の進行を遅延させる方法であって、哺乳動物の腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量の該モノクローナル抗体を該哺乳動物に投与し、それにより、疾患の進行が遅延し、生存が延長される工程を含む、方法。
- 請求項1、請求項2、請求項3、請求項6、請求項7、請求項8、請求項17、請求項49、請求項50、請求項54、請求項55、または請求項56のいずれか1項に記載の抗体またはCDMABおよび
必要量の薬学的に許容可能なキャリア
を併せて含むヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効な組成物であって、該組成物が、該ヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効である、組成物。 - 請求項1、請求項2、請求項3、請求項6、請求項7、請求項8、請求項17、請求項49、請求項50、請求項54、請求項55、または請求項56のいずれか1項に記載の抗体またはCDMABと細胞傷害性部分、酵素、放射性化合物、サイトカイン、インターフェロン、標的またはレポーター部分、および造血系細胞からなる群から選択されるメンバーとの抱合体、および
必要量の薬学的に許容可能なキャリア
を組み合わせて含むヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効な組成物であって、
該組成物がヒト膵臓腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、または結腸腫瘍の治療に有効である、組成物。
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