JPH06509641A

JPH06509641A - モノクローナル抗体ｏｘａ及びｏｘｂを用いた卵巣癌及び子宮内膜癌の診断法

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Publication number: JPH06509641A
Application number: JP5503053A
Authority: JP
Inventors: フ　フェン　ジ; ユ　インファ; バースト　ロバート　シー　ジュニア
Original assignee: デュークユニバーシティー
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1994-10-27
Also published as: EP0598000A4; AU661332B2; CA2113801A1; AU2415792A; WO1993002358A1; US5366866A; EP0598000A1; US5486456A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】モノクローナル抗体ＯＸＡ及びＯＸＢを用いた卵巣癌及び子宮内膜癌の診断法発明の分野本発明は一般にモノクローナル抗体を用いた卵巣癌の診断に関し、特に卵巣癌思考の治療に対する応答を監視する方法に関する。また、本発明は了・宮内膜癌の診断及び監視に関する。

発明の背景卵巣癌は米国では女性の癌死亡の４番目に多い原因である。

本田て生まオ］た全女性のうち、７０人に１人か卵巣癌にかかり、１００人に１人か卵巣癌て死ぬ。例えばアール・ユング氏等によるｒ　ｌ　Ｃａｎｃｅｒ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　＆　Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ　ｏｆ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｊ＋＋６＋ｔｃ３版＋９８９）（ブイ・デビタ氏、ニス・ヘルマン氏及びニス・ローセンヘルグ氏編）参照。同様の統計が多くのヨーロッパの国々で報告されている。卵巣癌は初期段階で検出するとかなり治療しやすいか、周知の通り初期段階ての検出は難しい。

ＣＡｌ２５で示す抗原決定基は、第２観察外科的監視手順（ｓｅｃｏｎｄ　１ｏｏｋ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　５ｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）にて上皮性卵巣癌を監視するために選択した現時の血清標識である。ＣＡ１２５は卵巣癌患者の８（〕〜９０９６からの血清中で増加するか、東い疾■、か存在していてさえ残りのｌＯ〜２０９６においては増加しない。例えばアール・バス１〜氏等ＩＮ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、λｌｅｄ、Ｊ１９８３年３０９巻８８３〜８７頁参照。第２観察外科的監視千順ては、ＣＡｌ２５は患者（持続性疾患（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｄｉｓｅａｓｅ）の存在に対して９６９６の陽性の断定的な値を有する）の２０９６て増加した、一方正常なＣＡ１２５レベルを有する患者の５０〜６０９６は持続性卵巣癌を有する。ジエイ・ベレク氏等「０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｙｎｅｃｏｌ、Ｊ　ｌ　９８６年６７巻６８５〜８９頁参照。従って、上皮性卵巣癌のＣＡ１２５への補足を監視する手段の必要性か長い間望まれていた。しかしなから、潜在的な新しい標識に関する以前の研究は正常なＣＡｌ２５レベルを有する持続性疾患の患者のほんの１０〜２０％を固定しただけてあった。

本発明は卵巣癌を監視する新しい方法を開発する我々の進行中の努力からできた。

発明の概要癌の存在を検出する方法を開示する。この方法は抗体か反応生成物を形成できる条件下で抗体と患者からの試料（例えは体液）を接触させ、反応生成物の存否を検出することからなる。

抗体は（ａ）モノクローナル抗体ＯＸＡ又はモノクローナル抗体ＯＸＢ、（ｂ）モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢか結合する抗原に結合する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）、又は（Ｃ）モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢか結合する抗原に結合する上記（ａ）又は（ｂ）のフラグメント、てあり得る。

特に、この方法は卵巣癌及び子宮内膜癌を検出するのに役立つ。この方法は癌かあると以前に診断された患者の治療の進行を監視するのに使用でき、又は癌かあると以前に診断されていない患者をスクリーンするのに使用できる。卵巣癌の診断及び監視に関して、この方法はＣＡ　ｌ　２５試験を補足するので、この方法は高ＣＡｌ２５レベルに対する患者の試験と同時に患者に行うことができ、結合した結果はＣＡ１２５単独てスクリーン又は監視するより癌の存否のすぐれた指示を与える。子宮内膵癌の診断及び監視に関して、ＣＡ　ｌ　２５は外科的段階ｌ又は２にて上皮性病の高い前兆とならないので、この方法は高ＣＡ１２５レベルに対する患者に同時に試駆することなく実行できる。

図面の簡単な説明図１はＨＰ　Ｌ　ＣによるＩｇＭの精製を示す。（Ａ）（Ｃがらの））（ＰＬＣゲルろ過分画の５ＤＳ−ＰＡＧＡ分析。非還元性１０９６ゲル、分画２２（レーンｌ）；分画２７（レーン２）１分画３４（レーン３）：分画４０（１ノーン４）：分画４５（レーン５）１分Ｍ４７（Ｉｚ−：／６）。（Ｂ）ＯＸＡ及び０ＸＢ（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。非還元性１０９６ゲル：０ＸＡ（レーンｌ）：０ＸＢ（レーン２）７還元性　ＯＸＡ　（レーン３）；０ＸＢ（レーン４）。（Ｃ）ＯＸΔ腹水のＨＰＬＣゲルろ過分析。

ＯＸＡ腹水をケルろ過カラム（ＴＳＫ　４０００　ＳＷ）に配して、ＨＰＬＣ装置（ヘツクマン）で分析した。分画を１分間隔て集めた。

図２は異なった細胞系からの溶解した抗原へのラベル化ＭＡＢの結合を示す。抗原抽出を非還元条件下にて６．５９６３ＤＳ−ＰＡＧＥで行う。レーンＬ４，７及び１０：０ＶＣＡ４２０からの抗原、レーン２．　５．　ｓ及びＩ　Ｉ　：０ＶＣＡＲ−３からの抗原、レーン３．　６．　９及び１２　ハフ（Ｈｕｆｆ）からの抗原。ウエスタンブロソｌへに”５ｌ−ＯＸＡ　（レーンＩ、２．　３．０．０５μｇ／ｍｆ）；　”５１−０ＸＢ　（レーン４，５，６．０．０５＃ｇ／ｍｆｆ）；　”’ｒ−ＯＣ１２５（［／　−：／１０゜１１、Ｉ　２，２０００００．ｃｐｍ／ｍＩりを重ねる。

発明の詳細な説明Ａ、抗体及び細胞系本発明の実施に使用できる抗体は、（ａ）モノクローナル抗体ＯＸＡ及びＯＸＢ、（ｂ）モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢか結合する抗原（又はより好ましくはエピトープ）に結合する抗体、及び（Ｃ）モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢか結合する抗原（又はより好ましくはエピトープ）に結合する上記（ａ）又は（ｂ）のフラグメントを含む。このような抗体及び抗体フラグメントは以下に説明するような多くの技術によって生成できる。モノクローナル抗体ＯＸＡ及びＯＸＢは以下に示すニス・ラマクリシュナン氏の研究所のエフ・スー氏及びワイ・ニー氏によって開発された。

本明細書中ての「抗体」のことばはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含むイムノグロブリンの全ての型をいう。これらのうちＩｇＭ及びＩｇＧは特に好ましい。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり、及び例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ又はヒトを含むあらゆる種の原点（ｏｒｉｇｉｎ）であり、又はギメラ抗体であり得る。例えはエム・つオルカー氏等によるｒＭｏｌｅｃ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｊ　Ｉ　９８９年２６巻４０３〜１１頁。抗体は米国特許４４７４８９３号又はカビリー氏等による米国特許４８　ｆ　６５６７にて開示された方法に従って生成される組換えモノクローナル抗体であり得る。又、抗体はシゲル氏等による米国特許４６７６９８０て開示された方法に従って作られる特異的な抗体によって化学的に構成され得る。

ＯＸＡ叉はＯＸＢ抗体か結合する抗原に結合するＯＸＡ又はＯＸＢ抗体以外の抗体は既知の技術で得られる。例えばＯＸＡ又はＯＸＢ抗体か結合する抗原を有する固定された細胞は抗原を除去ず・＼く洗剤を含む水溶液て洗浄てき、その溶液の種々の分画をクロマトグラフィ（例えは高性能液体クロマトグラフィ）により分離し、抗原をａむ分画をＯＸＡ又はＯＸＢ抗体に結合するその能力により同定する。あるいはＯＸＡ又はＯＸＢ抗体をアフィニティクロマトグラフィーカラムを与える固体支持体上に固定し、適当な患者（例えば上皮性卵巣癌であると診断さ第１た患者）からの血ｌｎ試料をこのカラムに通し、ＯＸＡ又は○ＸＢ抗体に結合した抗原かカラムから溶離し、この抗原は抗体を生Ｉ戊するのに使用される。

二のように、１ｔｉ７述の上程で生成して精製した抗原を本明細書中で開示する。このような抗原はモノクローナル抗体ＯＸ　Ａ又はＯＸＢによって認定され、少なくとも８００キロダルトンの分子量を有する。又、抗原は０ＶＣＡＲ−３及び０ＶＣＡ４２〔Ｊ細胞からなる群より選択される細胞により発現される少なくどち８００キログルトンの分子量を有する精製した抗原であり、これはＣＡｌ２５に結合する抗体によっては認定されず、この抗原は抗原を発現する細胞を洗剤で洗浄する際可溶性どなる。この抗原は水性のキャリヤ又は親液化した形態で与えられる。この抗原はポリクローナル抗体を生成するために動物を免疫化するのに使用でき、又はアッセイ標準として使用てきる。

ＯＸＡ又はＯＸＢ抗体か結合したエピ−ドブ（即ち特異的結合部位）に結合する抗体は、拮抗の結合アッセイてラベル化ＯＸ△又はＯＸＢ抗体と拮抗する能力のような、既知の技術で同定できる。

本発明の範囲内に含まれる抗体フラグメンＩ・には例えはＦａｂ、Ｆ　（ａｂ’ 　）２　及びＦ１フラグメント並びにＩｇＧ以外の抗体から得られる相当するフラグメントか含まれる。このようなフラグメントは既知の技術によって生成できる。

本発明を実施するのに使用されるポリクローナル抗体は、既知の手順でモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原を用いて適当な動物（例えばウサギ、ヤギ等）を免疫化し、この動物から免疫血清を集め、免疫血清からポリクローナル抗体を分離することによって生成できる。

本発明を実施するのに使用されるモノクローナル抗体はコーラ−及びミルスティンによるｒＮａｒｕｒｅＪ　Ｉ　９７５年２６５巻４９５〜９７頁の技術でハイブリドーマ細胞系で生成できる。例えは、適当な抗原を含む／８液をマウスに注入し、十分な時間の後、マウスを犠牲にし、牌臓を得る。その後、牌臓細胞を、典型的にポリエチレングリコールの存在下で骨髄腫細胞又はリンパ腫細胞と融合することによって不死化する。その後ハイブリトーマ細胞を適当な培地で生育させ、上澄みを所望の特異性を有するモノクローナル抗体をめてスクリーンする。

モノクローナルＦａｂフラグメントは当業者に既知の組換え技術によって大腸菌にて生成できる。ダブリュ・フーズ氏にょるｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｊ　ｌ　９８９年２４６巻１２７５〜８１頁参照。

ハイブリトーマ細胞系ＯＸＡ　（ＯＶＸ　Ｉとしても知られている）はモノクローナル抗体ＯＸＡを生成するが、これは１９９１年７月２４日にブダペスト条約の規定に基づいてアメリカ合衆国メリーランド２０８５２、ロックビル、パークローン通す１２３０１のアメリカ型培養菌コレクションに寄託され、ＡＴＣＣアクセツションナンバーＨＢ　ｌ　０８３５に指定された。この細胞系は以下に示すニス・ラマクリシュナン氏の研究所でエフ・スー氏及びワイ・ニー氏によって開発された。

ハイブリトーマ細胞系ＯＸＢ　（ＯＶＸ２としても知られてぃる）はモノクローナル抗体ＯＸＢを生成するが、これは１９９２年１月９日にブダペスト条約の規定に基づいて、アメリカ合衆国メリーランＦ２０８５２、ロックビル、パークローン通り＋２３０１のアメリカ型培養菌コレクションに寄託され、ＡＴＣＣアクセツションナンバーＨＢ　Ｉ　Ｏ９６０に指定された。

Ｂ、患者本明細書中に開示した方法は癌（例えば乳癌、子宮内膜癌又は卵巣癌）特に卵巣癌及び子宮内膜癌を有する疑いのある患者に使用でき、及び以ｍ■に癌かあると診断された患者を監視するのに、並びに以前に癌かあると診断されなかった患者をスクリーンするのに使用できる。患者は典型的にヒトの女性である。

本明細書中に開示された方法は、卵巣癌特に上皮性卵巣癌について試験するのに適用できる。上皮性卵巣癌は卵巣腫瘍の周知の分類であり、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞（ｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ）（中腎（ｍｅｓｏｎｅｐｈｒｏｉｄ）　）腫瘍、ブレンナー腫瘍、未分化癌、混合上皮性腫瘍、及び未分類」１皮性腫瘍を含む。例えはアール・スクリー氏によりｒｏｖａｒｉａｎ　Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｊ　２　８　頁　（１９８７年Ｍ、Ｐｉｖｅｒ編）参照。

本明細書に記載された方法の特別な具体例では、患者は以前に卵巣癌と診断され、既に卵巣癌に対する治療可能な限り受けており、癌又は治療のいずれかの進行を監視するのにこの方法を用いる。このような監視は第２観察外科的監視及び次の外科的監視手順の予備でなされる。例えば試料は卵巣癌に対する最初の外科的治療及び治療の進行を監視するために癌に対して抗わ１生物剤を用いて次の治療を受けた患者から集められる。

上記の通り、本発明はヒトの患者の子宮内膜癌を検出し、監視するためにも使用できる。本明細書中で使用する「子宮内膜癌」のことばはあらゆる組織学的な型の子宮内膜癌のことをいい（限定しないが）、腺癌、原線細胞腫、腺扁平上皮癌、乳頭漿液癌腫、及び明細胞癌腫を含む。一般的にジェイ・ベレック氏及びエヌーハッカー氏によるｒＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ　Ｏｎｃ。

１ｏｇｙＪ　ｌ　９８９年２９４巻参照。本発明はすへての患者又は子宮内膜癌の危険のある患者に役立つ。子宮内膜癌の危険のある患者は本発明の方法でスクリーンすることは特に正当化されるが、患者は外因性エストロゲン治療をした閉経後の婦人、肥満した閉経後の婦人（特に、子宮内膜癌、乳癌、又は卵巣癌の家系か否か）、５２才をすぎて閉経した婦人、及び無排卵性月経の閉経前の（Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ）婦人、多のう胞卵巣症（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ　ｏｖａｒｉａｎ　ｄｉｓｅａｓｅ）の婦人等を含む。

卵巣癌の診断は、放射線学的診断、骨盤超音波、膣及び子宮頚管細胞学、又はＣＡ１２５のような液性マーカーの検出のような手段も介するか、典型的には白砂て塊（ｍａｓｓ）の同定を介する。治療は典型的に細胞整復（ｃｙｔｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）手術を介してなされ、その後に抗新生物剤（例えばシスプラチン又はカルポプラチンとシクロホスファミドのようなアルキル化剤との組合わせ）を用いた治療をする。

子宮内膜癌腫の診断は今は特異的液性マーカーを利用できないので、典型的に頭内の掻爬術及び子宮内膜検査を介する。子宮内膜癌腫の治療は一般に全腹部の子宮摘出及び両側性卵管卵巣摘出術である。加えて、多くの患者は次いで放射線治療を必要とする。

本明細書に開示した方法に使用するためにヒトの患者から採取した試料は一般に、血清、血漿、又は腹水流体のような体液である。目下のところ血清が好ましい。あるいは、患者から採取した試料は組織試料（例えば、生検組織：掻爬した検体１手術中に除去した卵巣組織：等）である。

Ｃ，イＩ、ノアッセイ　フォーマット本発明に従って実施されるアッセイは均一アッセイ又は不均一アッセイであり得る。均一アッセイでは免疫学的な反応は普通、特異的抗体（例えばＯＸＡ、０ＸＢ）　、ラベル化検体及び目的の試料を含む。ラベルから出る信号は直接又は間接に、ラベル化検体への抗体の結合において修飾される。免疫学的反応及びその度合いの検出は均一溶液中で実行される。使用できる免疫化学ラベルはフリーラジカル、放射性同位体、蛍光染料、酵素、バクテリオファージ、補酵素等を含む。

石均−アッセイのアプローチでは、試薬は普通、検体、本発明の抗体（例えばＯＸＡ、０ＸＢ）及び検出可能な信号を生成する手段である。上記記載の類似の検体を使用できる。抗体は一般に、ビーズ、プレー１へ又はスライドのような支持体上に固定され、液相中に抗原を含んでいる疑いのある検体を接解させる。その後支持体を液相から分離し、支持体用又は液相のいずれかを信号を生成する手段を用いて検出可能な信号に対して検査する。信用は標本中の検体の存在に関係する。検出可能な信号を生成する手段は放射能ラベル、蛍光ラベル、酵素ラベル等の使用を謀む。例えは検出されるべき抗原か第２結合部位を含む場合は、その部位に結合する抗体は検出可能な基に接合でき、及び分離段階ｉｉ１に液相反応溶液に添加される。固体支持体上の検出ｌ■能な基の存在は試験試料中の抗原の存在を示す。適当なイムアッセイの例はラジオイムノアッセイ、イムノ蛍光法、酵素−結合イムノアッセイ等である。

当業者は本明細書中に開示した方法を実施するために使用できる多くの特異的イムノアッセイ　フォーマット及びその変形を知っている。一般にエム・マジオ氏によるｒ　Ｅｎｚｙｎ＋ｅ　−Ｊｍｍｕｎ。

ａｓｓａｙ　Ｊ　Ｉ　９８０年（シーアールシープレス社、ボカ　ラドン、エフエル）参照、また、スコルド等による米国特許第４７２７０２２号、名称ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　Ｌｉｑａｎｄ　−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｊ　、フォーレスト等による米国特許第４６５９６７８号、名称ｒ［ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆＡｎｔＩｑｅｎＳＪ　、ディピッド等による米国特許第４３７６１１０号、名称ｒ［ｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓ５ａｙｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、リットマン等による米国特許第４２７５］４９号、名称「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ＲｅｃｅｐｔｏｒＡｓｓａｙｓ」、マジオ等による米国特許第４２３３４０２号、名称ｒＲｅａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｍｏｔｈｏｄ　Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ＣｈａｎｎｅｌｉｎｇＪ　、及びポグスラスキ等による米国特許第４２３０７６７号、名称ｒＨｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓ５ａｙ　Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ａ　Ｃｏｅｎｚｙｍｅ　ａｓ　Ｌａｂｅｌ」参照。出願人は本明細書中で引用したすべての米国特許参照の開示内容を本明細書中に参考に包含することを特に意図する。本明細書中に記載したモノクローナル抗体は「２一部位」又は「サンドイッチ」アッセイで、ラベル化モノクローナル抗体及び結合モノクローナル抗体の両方への給源として働く単−細胞系を用いて使用できる。このようなアッセイは米国特許第４３７６１１０号に記載されており、この開示も本明細書中の参考に含む。

本明細書中に記載した抗体（即ちＯＸＡ、０ＸＢ）は診断アッセイのために適当な固定支持体（例えばビーズ、プレート、スライド、又はラテックス又はポリスチレンのような材料て形成したウェル）に沈降のような既知の技術て接合てき、ＣＡｌ２５に結合した抗体又は抗体フラグメントは以下に示すように任意に同し支持体に接合される。本明細書中に記載された抗体は既知の技術で放射能うヘル（例えば３５３．　１６１．　１３１１）、酵素ラベル（例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、及び蛍光ラベル（例えばフルオレセイン）のような検出可能な基に同様に抱合される。

」−記の方法を実施する診断キットは多くの方法で生成できるＯ　ｌの具体例では、診断キラ］・は（ａ）固体支持体に抱合した本発明の抗体（例えばＭａｂＯＸＡ、ＭａｂＯＸＢ）及び（ｂ）検出可能な基に抱合した本発明の第２抗体からなる。また、試薬は例えば多糖のようなタンパク質安定化剤及び緩衝剤のような補助剤を含み得る。更に診断キットは必要に応じて検出可能な基かメンバー（例えば酵素基質）である信号生成系の他のメンバー、試験においてバックグラウンド干渉を減する薬剤、コントロール試薬、試験を行う装置等を含む。テストキットの第２の具体例は（ａ）本明細書中に記載した抗体及び（ｂ）検出可能な基に接合した抗体に対して特異的に結合するパートナ−からなる。上記と同様な補助剤を含む。テストキットは試験を実施するための１枚の印刷した指導書と共に単一のコンテナー中に全要素を適当な方法でバックされる。

Ｄ、ＣＡ１２５に対する試験患者のＣＡｌ２５抗原の存在を検出し、更に患者が癌にかかっているか否かを指示する段階は本発明の方法と同時に実施される。上記の通り高レベルのＣＡ　Ｉ　２５抗原は卵巣癌、特に上皮性卵巣癌に対する現時の血清マーカーである。ＣＡｌ２５は適当な方法で検出されるが、典型的に患者からの試料をＣＡｌ２５に結合する抗体に接触することにより検出され、その後反応生成物の存否を検出する。抗体は上記に詳述したように、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ又は前述のフラグメントてあり得、又反応生成物の検出段階は」二足のようにどれか適当なイムノアッセイ、均−又は不均一アッセイを用いて行オ）れる。患者からの試料は１−記のように典型的に体液であり、上記の方法を行うのに使用する体液の同し試料である（例えば、これにモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢを接触する）。ＣＡ１２５に対する多くの試験か知られている。例えばアール・バスト氏及びアール・クナップ氏によるｒｏｖａｒｉａｎ　ＭａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｊ　Ｉ　Ｉ〜２５頁（Ｍ。

Ｐｉｖｅｒ編１９８編集９８７年このような同時的な試験は以前に卵巣癌にかかっていると診断されたことのない患者のスクリーニングのみならず以前に卵巣癌にかかっていると診断されたことかある患者を監視するために使用される。

本発明を以下の実施例において更に詳細に説明する。これらの実施例は例示であって、発明を限定するものではない。実施例においてμｌはマイクロリンドルを、μｇはマイクログラムをｍｍはミリメートルを、Ｍはモルを、ＰＢＳはリン酸緩衝溶液を、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを、ｍｃｉはミリキュリーを、ｃｐｍは放射能の表示としてカウント７分を意味し、反対の指示かない限り摂氏度である。

実施例１細胞系と抗体６の卵巣癌系：　０ＶＣＡＲ３，０ＶＣＡ４２０　（７”Ｊｆユーセッツ州、ボストン、ダナーファーバー　キャンサー　インスティチュートから得た）、０ＶＣＡ４２９　（ダナーファーバ−）、０ＶＣＡ４３２　（ダｆ−７７−ハ）　、　０ＶＣＡ４３３（ダナーファーパー）、及びＤＯＶ−１３（デユーダ）：並びに４の乳癌細胞系　ＢＴ２０．ＣＡＭＡ、−１，ＭＣＦ７．及びＳ　Ｋ　Ｂ、３を標準手順で維持した。ニス　ラマクリッシュナン等によるｒＪ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｊ　１９８９年８３巻９２１〜２６頁参照。

正常なヒトの包皮繊維芽細胞系ハフは、カイ、シンガー博士（デユーダ大学メディカルセンター）から得たものであるか、これは２　ｒｎ　Ｍ　Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１１００ｒｎ／ｍｌストレプトマイシン胎児ウソ血清（ＦＢＳ）を補充したダルベツコの最少必須培地（　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　）中で維持した（ハイクロン（Ｈｙｃ　ｌｏｎｅ））、ネズミ骨髄腫細胞系ＮＳ−１を２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニソリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１５０６ＦＢＳ，ｌｒｎＭピルビン酸ナトリウム、１９６非必須アミノ酸及び２０６８−アサグアニン（シグマ）を補充したＤ　Ｍ　ＥＭ中で維持した。

乳癌と反ＬζするネズミＭＡｂ３１７Ｇ５，２６０Ｆ９．２Ｇ３、５２０Ｃ９及びヒトの１〜ランスフエリンリセブターと反応する４５４Ａ１２（１ム　ブジョン氏等によるｒＣａｎｃｅｒＲｅｓ．Ｊ　１９８５年４５巻１２＋４−２１頁）をセタス社（カリフォルニア州，エマリーヒル）から得た。卵巣癌に対するネズミＭＡｂ　ＯＶＢ−３（エム　ライリンハム氏等によるｆＰｒｏｃ．Ｎａ　ｔ　］　Δｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡＪ　１９８７年８４巻２４７４〜７８頁）はフィッツゲラルド博士（国立衛生研究所）の贈物であった。卵巣癌に対する精製ＭＡｂ　ＭＯｖ２及びＭＯＶ８（イ．タグリアヒュ氏等によるｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．Ｊ　１９８５年４５巻３７９〜８５頁）はマリアコルナギ博士（イタリア、ミラノ，インスティテユート　ナジオナレ　ツモリ）の贈物であった。ＭＡｂ　ＯＣ１２５，　これは卵巣癌抗原ＣＡ　１　２　５と反応するか（アール、バスト氏等によるｒＪ．ＣＩｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｊ　１９８１年６８巻１３３１〜１３３７頁）これはロバ−１・　シー、バスト博士，　Ｊｒ。

（デユーダ大学メディカルセンター）により与えられた。ＭＡｂ１９−９，　これは胃腸癌と反応し及び卵巣癌と交差反応するか（エイチ．コブロウスキ氏等によるｒＳｏｍａ　ｔ．　Ｃｅ　１　１Ｇｅｎｅｔ．Ｊ　１９７８年５巻９５７〜７２頁）これは、コブロウスキ博士からの贈物てあった。

コントロールＭＡｂ　３１Ｅ６は’ｒｈｙ＋．１と反応し、ヒトの卵巣癌細胞と反応しないネズミＩｇＧ＋であり、３８４Ｆ１１はウシ脳のオブカム（Ｏｂｃａｍ）タンパク質と反応し、ヒトの卵巣癌細胞には陰性のネズミＩｇＭである。３１Ｅ６はノウィングキ博士からの贈物であり３８４Ｆ１１はザビタロイ博士から得た。

１２５　１ラベル化モノクローナル抗体ＱＣ　１　２　５はセントコルから得た。

実施例２免疫感作とハイブリトーマの生成この研究はデユーダ大学メディカルセンター（ノースカロライナ州，ダーラム）及びミネソタ大学（ミネソタ州，ミネアポリス）にあるニス、ラマクリシュナン氏の研究室のエフ、スー氏及びワイ．ニー氏か指導した。

抗体−生成ハイプリドーマはコーラ−及びミルスティンのオリジナルな方法、ｒＮａｔｕｒｅＪ　１９７５年２５６巻４９５〜９６頁の修正に従って生成される。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、０ＶＣＡ４２０　５Ｘ１０’（７）ＯＶＣＡ４２０細胞（ＭＥＭで維持）の１１・−スを用いて、その後２週間後に５Ｘ１０’の０ＶＣＡ４３２細胞（ＭＥＭで維持）のｌドースを用いて、その（餐２週間後ｆ：５Ｘ　Ｉ　Ｏ＠（７）ＯＶＣＡＲ−３細胞（ＲＰＭＩ培地で維持）の１１〜−−スを用いて、そのｖＩｔ２週間後５Ｘ１０’のＯＶＣ，Ａ４２（ｌ細胞のｌドースを用いて、その１１日１５ＸＩＯ’の０ＶＣＡ４３２細胞のｌドースを用いて、その後１日ｔ＆５Ｘ１０＠の０ＶＣＡＲ−３細胞の１ドースを用いて腹膜内的に免疫感作した。最後のｚ゛１：人後１日で動物を犠牲にした。各注入では、培養フラスコから上澄み液をアスビレーｌ−することによって？１人のために細胞を調製し、その後既知の手順に従って遊離細胞にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を添加し、その後トリプシンを中和するためにこのフラスコに培地を戻し、その後細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、その後ｌｏ１細胞／ｍｌの濃度のＰＢＳ中の細胞を再懸濁した。各マウスは最後の細胞懸濁物の５ｍｌを注入された。最後の免疫感作後３０でマウスを犠牲にし、神域を取出し、界域細胞を標準の手順に従って融合のために調製した。界域細胞はハイプリトーマ細胞を生成するための製造者の指導に従一つでポリエチレングリコール（ベーリンガーマンハインの５０量％ＰＥＧ　Ｉ　５００）の存在下でネズミ骨髄腫細胞系Ｎ５−１と融合された。

・１イブリトーマ細胞培養上澄み液を、酵素−リンク免疫吸着剤アッセイ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）により３の免疫感作細胞系及び１の正常な繊維芽細胞系に対して反応性のためにスクリーンした。

即ち、ウェル当たり５ＸｌＯ’細胞を９６ウエルの平底ブレート（コーニング）に１６〜２４時間プレートした。プレート後、細胞を１０分間０．２５％グルタルアルデヒドて固定し、その後ＰＢＳで洗浄した。ウェルにおける「非−特異的」結合部位をＰＢＳ中の２９６ウマ血清及び２９６　Ｂ　Ｓ　Ａにより３０分間室温（ＲＴ）にてブロックした。ウェルをＰＢＳでリンスし、５０〜１００μｍのハイプリドーマ培養上澄み液を添加し、ウェルを６０分間ＲＴにてインキュベートした。反応はベクターＡＢＣ−ＡＰ剤及びホスファターゼ基質（１００ｍＭ炭酸水素すトリウム中の２ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９，５，ｌ０ｍＭ塩化マグネシウム）（カリフォルニア州、バーリンゲーム、ベクターラプス（Ｌａｂｓ）インコーホレーテッドから得た）により進められた。定量的な測定かＥＬＩＳＡリーダー（オーストリアのエスエレティーラヒンスツルメンツ）にてなされる。全細胞系への３１Ｅ６の反応は陰性コントロールとしてであった。

陽性ハイブリドーマは希釈を制限することにより３〜４回サブクローン化し、Ｎ５−１培地で維持された。

本明細書中に記載した３の卵巣癌細胞系を用いる連続した免疫感作を用いて、このハイブリト−マ（ＯＸＡ及びＯＸＢて示す）を得たか、これは免疫感作に用いた３の細胞系には結合するけれとも正常な繊維芽細胞系には陰性であった。

実施例３イソタイプとＭＡｂの精製この研究室はミ不ツタ大学にあるニス、ラマクリンユナン氏の研究室のエフ、スー氏及びワイ、ニー氏によって指導された標的の細胞０ＶＣＡＲ−３をプレー１ −　Ｌ、固定し及びＥＬＩＳＡに対してブロックされた。その後細胞を１時間室温てＯＸＡ及びＯＸＢハイブリ１−−マ」二澄みを用いてインキュベートシ、その後ブｌ／−１−をＰＢＳて洗浄し、アルカリホスファターゼーラベル化抗−マウスＩｇ、ＩｇＭ、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２ａ。

Ｉ　ｇ　Ｇ　２　ｂ　、Ｉ　ｇ　Ｇ　３カツパ及びラムダ（ＳＢΔクローノタイピング　ジステノ、ｌ）を用いてインキュへ−１−シた。更に洗浄した後、ｌ　Ｑ　（］　ＩＩＩのホスファター１ご基質を各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡリーダーでＯＩ−）　４０５を測定した。＋ｇＭウェルは陽性てあった。

ＯＸ　Ａハイブリト−マ細胞を準１らしたＢＡＬＢ／Ｃマウスにｉ−Ｌ人シ１２、及び２週間後に腹水を集めた。ＭＡｂの精製はＨＰＬ←゛で行−ｆｒ。腹水を６００６硫酸アンモニウムにすって沈澱させ、透析し及びＨＰ　Ｌ　Ｃケル３過カラｊ、（スフ１０ゲルＴ　Ｓ　Ｋ　４（）（１０Ｓ　Ｗ、へ７・クマン）に充填した。ＭＡｂを他のタンパク質か１′、分離（５、及びＳＤＳポリアクリル了ミドゲル電気泳動（ＳＤ　：ｌ’；　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　）によ−）で確認した。

ハｒブ１１’−−，”ＯＸＡ及びＯＸＢは、５量（７）Ｉ　ｇＭ　（ｋ）　全分泌することを見い出された。ＩｇＭはＨＰＬＣゲル３過の１段階で容易に精製さ第１た。

実施例・１免疫組織化学的染色二の研究はミネ゛２νケ（学にあるニス、ラマクリシュナン氏のｖｔ　ｚ　ｖのエフ　スー氏及びワイ　ニー氏により指導された。

！ニー１・の正常な又は腫瘍の組織をミ子ツタ大学から得た。組織はヒトの体から取り出した後液体窒素中で急速に凍結し、−７０″Ｃて維持した。凍結組織は一１５°Ｃてクリオスタットにて５〜８μｎ］の部分に切断した。部分を１０分間アセトンて固定し、部分上の非特異的結合部位を２９６　Ｂ　Ｓ　Ａ及び２９６ウマ血清て一７０ツクし、部分をＭＡｂ　（５μｇ／ｍｌ）を用いて１晩４° Ｃてインキュへ−１・した。結合能力をベクターＡＢＣ試薬及びＤノ＼Ｂ基質（アメルシャノ、（Ａｍｅｒｓｈａｍ）０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて染色することによって検出した。

スライドはハリスヘマキソリン（フィ・ソンヤ）で反染色（Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）され、可視化され、その後光学顕微鏡（オリンパスのＡ　Ｈ−２）下で撮影した。組織部分を評価し、色強度に応して以下の範ちゅうの１にグループ分けした。陰性、１＋、２＋及び３＋。

ヒトの卵巣組織へのＯＸＡ及びＯＸＢの結合を、６の正常な卵巣組織及び２０の卵巣癌組織を用いて評価した。ＯＸＡ及びＯＸＢは２０の卵巣癌組織の１７及び１４にそれぞれ陽性であり、６の正常な卵巣組織の５及び６にそれぞれ陰性である。３８ＦＩ１．　ウソ脳オブカムタンパク質に対するネズミＩｇＭは陰性コントロールであり、及び全２０の卵巣癌組織及び６の正常な卵巣組織に明らかに陰性であった。ＭＯＶ　２．卵巣癌組織に結合することか知られているＩｇＭは陽性コントロールてあり、２０の卵巣癌組織の１０に陽性で、６の正常な卵巣組織の５に陰性であった。ＭＯＶ２及びＯＸＡの両方は１の正常な卵巣組織の腺に陽性であった。

ＯＸＡ及びＯＸＢと異なった卵巣癌組織との比較ては、ＯＸＡ及びＯＸＢか異なった反応であることか明らかとなった。ＯＸＡの結合はほとんとの組織に対するＯＸＢよりも強かったか、１の卵巣腺癌組織に関して、ＯＸＢは強く結合し一方ＯＸＡは陰性であった。

実施例５種々の細胞の結合反応性この研究はミネソタ大学にあるニス、ラマクリシュナン氏の研究室のエフ、スー氏及びワイ、ニー氏により指導された。

ＭＡｂＯＸＡをＮａ　１２’Ｉを用いて既知の手順（以下に詳細に説明）に従− 〕てヨートゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）法を用いてラベル化した。

生きた細胞のラジオイムノア・ソセイを、既、知の方法でＭＡｂの標的細胞への結合を測定するのに用いた。ワイ　ニー氏等によるｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、Ｊ　１９９’０年５０巻３２３１〜３８頁参照。細胞は川一層として成長し、トリプシン処理し、９６ウエル平底リムーバウエル（登録商標）プレート（コスタ− ）にｌＸｌ０’細胞／ウエルの密度にて播いた。３７°Ｃで一晩インギュヘートシた後、ｔ（１一層を洗浄し、種々の量のラベル化Ｎ１Δｂを４０μｌ容量にて添加し、氷上で４時間インキュベーションた。交差反応アッセイては、「ホット」ラベル化ＭＡｂを添加する前「コールド」ＭＡｂを添加し氷上で１時間インキュ・＼−トした。その後、細胞を５％ＦＢＳを含む水冷培地を用いて４回洗浄した。その後、個々のウェルを分離し、ここにおいて放射能を測定した。

放射能ラベル化ＭＡｂにより目的細胞の結合部位の計数、即ちマノクフＴ−ノンのｒＥＢＤＡ］プログラムを用いた。ジー、マノクファー　ノン氏によるｒＪ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｍｅ目＋ｏｄｓＪ　１９８５年１４巻２１３〜２２８頁参照。

」−記の生きた細胞のラジオイムノアッセイはラベル化ＭＡｂかｌｌ１ｇ／ｍ１のとき、最高の結合比（Ｂ／ＢＯ又は「結合／ハノクゲラウントＪ）であることか明らかになった。ＯＸＡ及びＯＸＢの両方は５／６卵巣細胞系と３／４乳癌系に陽性であったか正常な繊維芽細胞系ハフには陰性であった。

標的細胞−０■ＣＡ　Ｒ３及び０ＶＣＡ４２０への２ＭＡＢの結合部位の計数ては、ラベル化ＭＡｂの種々の濃度を、細胞の結合部位を飽和又はほは飽和するのに用い、その後結合を「ＥＢＤＡＪプロゲラｌ、により計数した。計数結果によるど、ＯＸＡの０ＶＣＡＲ３細胞への結合部位は細胞当り４．４１±０゜３９ＸｌＯ’、ＯＸＢの０ＶＣＡＲ３への結合部位は細胞当り１８６±０．２８Ｘ１０ ’、ＯＸＡの０ＶＣＡ４２０細胞への結合部位は細胞当たり２０．４５±１７，５４ｘｌＯ＠、ＯＸＢの０ＶＣＡ４２０細胞への結合部位は細胞当り６．２８± １．９５ＸＩＯ”’Ｃある。０ＸＡ−ＯＶＣＡ４２０＞０ＸＢ−ＯＶＣＡ４２０＞０ＸＡ−ＯＶＣＡＲ３＞０ＸＢ−ＯＶＣＡＲ３の結合部位であることか明らかである。

他のＭＡＲとの交差反応生きた細胞のラジオイムノアッセイを用いて、　１２５Ｉラベル化ＯＸＡ及びＯＸＢを卵巣癌に対してＩＯの他のＭＡＢ　（即ち、モノクローナル抗体３１７Ｇ５．２６０Ｆ９．２Ｇ３，５２０Ｃ９，４５４Ａ１２，０ＶＢ３．０ＣＩ２５．ＭＯＶ２．ＭＯＶ８．及び１９−９）と拮抗させた。０ＶＣＡＲ−３結合アッセイでは、ＯＸＡ及びＯＸＢのみかそれ自身の結合部位をブロックでき、互いに交差反応性を示した。他のｌＯのＭＡＢのす−＼てはＭＡＢ　ＯＸＡ及びＯＸＢとの交差反応は示さなかった。

実施例６イムノ蛍光アッセイこの研究はミネソタ大学にあるニス、ラマクリシュナン氏の研究室のエフ、スー氏及びワイ、ニー氏により指導された。

正常な骨髄細胞及び周辺血液細胞はミネソタ大学の健康な供与者から得られた。

細胞はインキュベーション培地（ハンクスの緩衝液、２０９６ＦＢＳ、２０単位／ｍｌヘパリン）中に懸濁し、そのｉ麦１５ｒｎｌのリンパ球分離培地（オルガノン　デクニ力　コーポレーノヨ゛））Ｊ二に加え１５分間２５０　Ｏｒ　ｐｍで遠心分離し、界面をどｌ）、細胞をイムノ蛍光アッセイのためにインキュへ− １・培地中に再懸濁した。

正常な周辺血液細胞及び骨髄細胞（５Ｘ１０’）をＰＢＳ及びｌ　’％　Ｆ　Ｂ　Ｓて洗浄し、氷上で６０分間ＭＡｂ（１００ｍｌの５μｇ／ｍｌ溶液）を用いてマイクロフユージ（ｍ　ｉ　ｃ　ｒ　ｏ　ｆｕｇｅ）チューブ中てインキコヘートシ、２回洗浄し、その浸水−１−で３（）分間抗−マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ抱合体（シグマ１１６）を用いてインキコヘ−１・した。細胞をＰＢＳて再懸濁し、フローサイトメータ（ヘクトン　ディキンノンのファクスター　プラス）で分析した。ファシス（ＦＡＣ３）分析ては両ＭＡＢ（ＯＸＡ及び０ＸＢ）か正常な周辺血液細胞及び正常な骨髄細胞に陰性であることかわかった。ここてはＴｈｙ＋、１に対してＮ１Ａｂ３１Ｅ６を陰性コントロールとして使用した。

実施例７細胞表面抗原可１８化及びイムノプロッティングこの研究はミ不ソタ大学にあるニス、ラマクリシュナン氏の研究室のエフ　スー氏及びワイ、ニー氏により指導された。

卵巣癌細胞系０ＶＣＡＲ−３，０ＶＣＡ４２０及び正常なｍ維才細胞系ハーフを１００ｍｍ皿（ファルコン）中で生育し、細胞ハーベスト（コスタ−）によりバーヘス１へし、細胞をハンクスの緩衝液で２回洗浄し及び５０ｍＮｉ１リスバツフアー（ｐＨ７，４）中の２０　ｒｎ　Ｍオクチル−β−Ｄ−グルコピラノント（カルヒオケムの０−ＧＰ）で１時間室温てサーモライン（Ｔｈｅ　ｒｍｏ　］　ｙｎｅ）ＳＰＥＣＩ−ＭＩＸミキサーで振とうすることにより可溶化した。抽出溶液をトリスバッファーで４の交換により透析し非還元条件て６　、　５９６　Ｓ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　ｉに再溶解した。電気泳動後９表面抗原は３０ｒｎＶ、１８〜２０時間でトランスプロット装置（ハイ才−ラｌ”）でイムノピロン（■ｍｍｏｂ　ｉ　Ｉ　ｏｎ）−Ｐ膜（ミリボア）に移動した。ブロワ１へをＰＢＳ中の１０９６ミルク、１９６ＢＳＡ、０．Ｉ％ＮａＮ＊及び０．＋９６ツイーンー２０で４時間室温にてブロックし、示した１２Ｍ　、、ベル化ＭＡｂ（＋０９６ミルク、１９６ＢＳＡ及びＰＢＳ溶液中０．０５Ｉｒｇ／ｍｌ）て４時間室温にてゆっくり振どうすることにより調へた。ＰＢＳ中の０．０５９６ツイーンー２０て４回洗浄後、プロットを空気乾燥し、コダックＸ−ｏ□、ＡＲフィルムトにデコボントコロネックス［光Ｊ増強スクリーンを用いて、１〜７目間 −７０°Ｃてオートラジオグラフした標的細胞０ＶＣＡＲ−３，０ＶＣＡ４２０及びコンｌ−ロール細胞ハフの表面抗原を０−ＧＰ、即ち透析により容易に除去できる付加的な利点を有する本来の状態で膜−結合タンパク質を可溶化する際に使用することを意図する非イオンの洗剤、て可溶化した。抗原は使用した条件下ではゲルに浸透しない程の高分子量のムチン様タンパク質であり、故に、８００キロダルトンより大きい分子鼠を存すると仮定した。

ウェスタンプロットフィルム（図２参照）はＯＶ、ＣΔＦｌ−３及び０ＶＣＡ４２０の高分子量表面抗原に結合するＯＸＡ及びＯＸＢの両方を示し、０ＶＣＡ４２０細胞の抗原への２のＭＡｂの結合能は０ＶＣＡＲ−３に対するよりも大きく、ＯＸＡはＯＸＢより両細胞系へ強い結合を有する。

いずれもハフ細胞に結合しないＯＸＡ及びＯＸＢ、コントロールマウスＩｇＭ３８４Ｆ１１は３の卵巣癌細胞系と反応しなかった。卵巣癌抗原ＣＡｌ２５（高分子グリコプロティン複合物）と反応することか知られているＱＣ１２５ＭＡＢはこれらの細胞系からの抗原と反応しなかった。

実施例８モノクローナル抗体ＯＸＡの放射能ヨウ素化この研究はノースカロライナ州、ダーラムのデューク大学のアール、バスト氏の研究室のエフ、スー氏及びワイ、ニー氏により指導された。

ヨートゲン法によりＮａ　ｌ！Ｊを用いてラベル化した。例えはマスホ氏等によるｒＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、Ｊ　１９８４年４４巻２８１３〜１９頁参照。要するに、５０μｌのリン酸塩バッファー（０，５Ｍ、ｐＨ７，４）を１０Ｍｍのヨードゲンを用いてコードンた１５Ｘ７５ｍｍホウケイ酸塩チューブに添加した。

モノクローナル抗体（ＰＢＳ中のｌＯμｇ）を９７．５μｍ容量に添加した。放射能ヨウ素化を０．２５ｍＣ１のＮａ”’Ｉ　（２，５μｍ）の添加により開始し、この混合物を氷上で２０分間インキュベートした。タンパク質−結合ヨウ素をＰＢＳて前平衡したＰＤ−１０カラム（アメリカ合衆国、カリフォルニア州、ブリサンドヒル、ファルマシア）のゲル３過により分離した。各０．５ｍ１文画から３μｍの試料をパラカードガンマカウンタでカウントしてタンパク質−結合放射能を測定した。ヨウ素化効率を以下の式で計算した：ヨウ素化の効率は７０〜８０９６の範囲てあった。

実施例９固相ラジオイムノアッセイラジオイムノアッセイはデューク大学にあるアール・バスト氏の研究室にて指導され。本質的にアール・バスト氏等によるｒＮ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｊ　１．９８３年３０９巻８８３〜８７頁に記載されたものと同じ方法である。要するに、このアッセイでは患者から集めた血清に含まれる抗原を結合するために固相免疫吸着剤としてＯＸＡ抗体を用いてコートしたポリスチレンピーズ（アメリカ合衆国、イリノイ州、シカゴ、プレシジョン　プラスチック　ポール、外径６．４ｍｍ）を用いた。

ｍコートビーズはマイクロ　タイターブレー１・の各ウェル中に入れられた。２以上のＯＸＡ結合部位か各抗原分子に結合するので、結合抗原は、上記の通り調製された１２％　ｌ−ラベル化ＯＸＡ抗体を用いてヒースと血清試料とを同時にインキュベートすることにより検出てきた。血清（５０μｍ）及び抗原標準をバッファ（２９６Ｂ　Ｓ　Ａ及び２％正常マウス血清を含有する１５０μｆＰＢｓ）中で希釈し、４°Ｃで一晩ＯＸＡでコートしたポリスチレンビーズて同時にインキュベートした。ビーズをＰＢＳて３回洗浄し、その後４°Ｃて一晩うベル化ＯＸＡモノクローナル抗体（２０００００ｃｐｍ／ウェル）を用いてインキュベートした。インキュベート後、ビーズをＰＢＳで更に３回洗浄し、過剰の１２５１−ラベル化ＯＸＡ抗体を除去し及びパラカードガンマカウンタでカウントした。

ラジオイムノアッセイの手順は以下に詳細に説明する。

■、ヒビー（プレッションプラスチックポール、直径６．４ｍｍ）を８０〜１００℃で１時間加熱し、１５分毎にビーズを振る。

２、ビーズを室温に下げる。

３、ＰＢＳ　（５０ｍＭＰｉ、ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　ＮａＣり中のＯＸＡ　（１００ｕ　ｇ／ｍｌ＞を加えて、３７°Ｃ２時間置き、その後４°Ｃにして一装置く。全ピースを完全にかくず。振ったり回転したりしない。

４、Ｍａｂ／？’；に！ｉを再使用のために吸引し、０．２５％グルタルアルデし）”（ＰＢＳ中）をゆっくり添加する。全ビーズをかくし、１０分間室温に置く。

５、ＰＢＳて３回リンスする。

６、ＰＢＳ中の２９６　Ｂ　Ｓ　Ａ　＋　１９６正常マウス血清により４°Ｃて一晩ブロックする。

７、直接ビーズをマルチプレートに入れる。ウェル毎にｌビーズ。

８５の標準及び２のコントロールを血清を用いて行う。

ａ）標準Ａｇ　：　（２０８μｍｍＩ！、１０Ｍｇ／ｍＡ’、４μｇ／ｒｎｌ、２　ｕ　ｇ／ｍ　１．１μｇ／ｍ＃））））コントロールの２の血清−１の低レベル及び１の高レベル９．５０μｒの標準コントロール及び標本試料を割あてたウェル（二重）にピペットて入れる。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の２０６　Ｂ　Ｓ　Ａ　＋　１９６正常マウス血清）を１５０μ！各ウエルに添加し、二重て一晩４°Ｃてインキュベートする。

１０、ＰＢＳて３回洗浄する。

＋１．　ブロッキングバッフ了−で希釈した２００μｌの１２５Ｉ−Ｍａ　ｂＯＸＡ　（Ｉ　ＯＯＯｃ　ｐｍ／ｕ　ｆｆ）を添加し、４°Ｃで一晩インキュベートする。

＋２．ＰＢＳで３回洗浄する。

１３、ガンマカウントする。

１４、バックグランドを決定するために、ＯＸＡ抗体でコートしたビーズをブロッキングバッファー単独を用いてインキュベートする。

１５、モノクローナル抗体をヨードケン法を用いてＮａ　”’１てラベル化した。要するに、５０μ！のリン酸塩バ・ソファ−（０，５Ｍ、ｐＨ７，４）を１０ μｌのヨードゲンでコートした１５Ｘ７５ｍｍホウケイ酸塩チューブに添加した。Ｍａｂ　（ＰＢＳ中のＩＯμｇ）を９７．５μ！容量にて添加した。放射能ヨウ素化を０．２５ｍＣ１のＮａ　”！　（２，５μｍ）の添加により開始し、混合物を氷上で２０分間インキュベートした。タンパク質−結合ヨウ素をＰＢＳて前平衡しであるＰＤ−１０カラム（カリフォルニア州、ブリーザント、ファルアシア）上でゲルろ過により分離した。各分画から３μｒの試料をパラカードガンマカウンタてカウントシ、タンパク質−結合放射能を測定した。ヨウ素化効率を上記の式で計算した。

以下の表１及び表２に示したように、ＯＸＡ抗原レヘしか陰性ＣＡｌ２５値及び陽性の第２観察外科的手順を有する患者の６２９６において上昇している。示された各データポイントは二重試料の平均である。表１では、ＩＣＥＤＪは診断により明らかに病気であることを意味し、ｒ＋ＢＸＪは陽性生検を有する触診可能な腫瘍を意味し、ｒＰＯＰ、＋は診断の時の術前標本を意味する。表２ではｒ＋２ＮＤＪは陽性第２観察外科的監視手順を、及びｒ＋３ＲＤＪは陽性第３観察外科的監視手順を意味する。

６．２６のＯＸＡ値を、カットオフとして使い、これより上ではＯＸＡアッセイか陽性と思われ、６．２６は平均ＯＸＡ値プラプラス４の健康なコントロールの試料中に見い出された２の標準偏差を示す。

表１１３５より大きいＣＡ１２５値は陽性である。

２６．２６より大きいＯＸＡ値は陽性である。

６．２６より大きい値は下線を付す。

表２表２（続き） ’３５より大きいＣＡ１２５値は陽性である。

”６．２６より大きいＯＸＡ値は陽性である。

６．２６より大きい値は下線を付す。

実施例１００ＸＡ抗原精製この研究はノースカロライナ、ダーラム、デューク大学にあるアール・バースト氏の研究室のエフ・スー氏及びワイ・ニー氏により指導された。

０ＶＣＡ　４２０細胞（１５０ｘ　ｌ　Ｏ’］Ｌ、：スリニ、Ｊす及ヒハンクスの緩衝作用のある塩を用いた洗浄によりハーベストされ、１０ｍ１＋の０−ＧＰ溶液（オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５０ｍＭ）リス中２０ｍＭ５ｐＨ７，４）中に再懸濁し、２時間室温で回転し、＋　４００　Ｏｒ　ｐｍにて微量遠心分離で５分間沈降した。上澄みを５０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ７，４中で一晩透析し、その後ＨＰＬＣＴＳＫ−Ｇ３０００カラムでクロマトグラフした。各ピークの活性をＯＸＡラジオイｌ、ノアッセイを用いて監視し、ラジオイムノアッセイの最高反応性を１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

実施例ＩＩモノクローナル抗体ＯＸＢの放射能ヨウ素化ＯＸＢを、上記実施例８てＯＸＡのラベル化に関連して説明したように本質的にヨードケン法を用いてＮａ１２Ｓ　Ｉてラベル化した。要するに、５０μＥのリン酸塩バッファー（０，５Ｍ、ｐＨ７，４）をＩＯμｇのヨードサンでコートした＋５Ｘ７５ｍｍホウケイ酸塩チューブに添加した。モノクローナル抗体（ＰＢＳ中のＩＯμｇ）を９７．５μｌの容量で添加した。放射能ヨウ素化を０．２５ｍＣ１のＮａ１２’　Ｉ　（２，５ｕｌ）の添加により開始し、混合物を氷上で２０分間インチユベートする。タンパク質−結合ヨウ素を、ＰＢＳで前−平衡化したＰＤ−１０カラム（アメリカ合衆国、カリフォルニア化、ブリーサン１〜ヒル、ファルマシア）でゲルろ過により分離する。各０゜５ｍ４７分画から３μｌの資料をパラカードガンマカウンタでカウントシ、タンパク質−結合放射能を測定した。ヨウ素化効率を」二足実施例８て示した式により計算する。

実施例１２０ＸＢを用いた固相ラジオイムノアッセイラソオイムノアッセイを、上記実施例９てＯＸＡを用いたラジオイムノアッセイに関連して説明したと本質的に同じ方法で行った。要するに、アッセイは、固相免疫吸着剤としてＯＸＢ抗体でコートしたポリスチレンビーズ（外径６．４ｍｍ、アメカリ合衆国、イリノイ州、シカゴ、プレシジョンプラスチックボール）を用い、患者から集めた血清に含まれる抗原に結合する。

１個のコートビーズをマイクロタイタープレートの各つ上ルに入れた。２以上のＯＸＢ結合部位か各抗原分子に結合しているので、結合した抗原をビーズと同時にインキュベートすることにより検出し及び１２６　■−ラベル化ＯＸＢ抗体を用いた血清試料を上記のようにして調製した。血清（５９μり及び抗原標準をバッファー（２９６Ｂ　Ｓ　Ａ及び２％正常マウス血清）を用いた１５０μｌのＰＢＳ）で希釈し及び４℃て一晩ＯＸＢてコードンたポリスチレンビーズと同時にインキュベ−１−した。ビーズを３回ＰＢＳで洗浄しその後４°Ｃて一晩うベル化ＯＸＢモノクローナル抗体（２００，ＯＯＯｃｐｍ／ウェル）でインキュベートする。インキュベート後ビーズを更に３回ＰＢＳで洗浄し過剰１２６１−ラベル化ＯＸＢ抗体を除去しバラカードガンマカウンタでカウントする。

ラジオイムノアッセイ手順の詳細はＯＸＡをＯＸＢに置き換える他は本質的に上記実施例９で示したと同じである。

実施例１３０ＸＢ抗原精製上記実施例２て説明した連続した免疫化て使用した３の細胞系を上記実施例８て説明したラベル化ＯＸＢ抗体を用いてＯＸＢ抗原の存在に対してアッセイする。

陽性細胞をハンクスのバッファー溶液で２回こすって洗浄することによりハーベストし、１０ｍｆｆの０−ＧＰ溶液（５０ｍＭトリス中のオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド２０ｍＭ、ｐＨ７，４）に再懸濁し、室温で２時間回転し、１４０００ｒｐｍにて微量遠心分離で５分間沈澱させた。上澄みを５０ｍＭ！−リスバッファーｐＨ７，４中で一晩透析し、その後ＨＰ　Ｉ、ＣＴＳＫ−Ｇ３０００カラムでクロマトグラフする。各ピークの活性をＯＸＢラジオイムノアッセイて監視し、ラジオイムノアッセイのピーク最高反応性をｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｅ　ｉこ濃縮しｌ、二。

実施例１４ＭＡｂＯＸＡを用いた子宮内膜癌の検出本実施例は手術前の子宮内膜癌の種々の外科的段階における一１１者から血清を集めた以外は上記実施例９と本質的に同じ方法で行−１た。外科的段階は病気の重さを表わし、段階■は最も重くなく、段階Ｉ　Ｖは最も思いことを示し、子宮内膜癌腫に対するＦＩＧＯ段階で使用したと同じ基準で手術の後決定した。既知の技術として、ノエイ、ベレク５０氏びケイ、バッカー氏によるｒＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ　ＯｎｃｏｌｏｇｙＪ　１９９１年２８９〜２９１頁参照。データはモノクローナル抗体ＣＡｌ２５に対するものを含めて、以下の表３に示す。７．２のＯＸＡ値をカットオフとして使用し、これより上をＯＸＡアッセイ陽性とし、７．２は平均ＯＸＡ値プラプラス４の健康なコントロールの試料において見い出しな２の標準偏差を示す。各抗体に対するデータは、先ず試料における患者の全数にわたる陽性反応の割合として示し、その後試料に対する陽性反応の百分率として示す。

７．２よりＯＸＡ値及び３５より大きいＣＡ］２５値はそれぞれ陽性であると思われる。子宮内膜癌を検出する場合ＣＡｌ２５よりＯＸＡかより効果的であることがデータよりわかる。例えは外科的段階Ｉにおける４８の患者につき、３４（又は７１０６）かＯＸＡにより決定すると陽性であるか、ＧＡ１２５により決定すると９（又は１９％）だけか陽性てあっｔ：。更に初期の外科的段階では、治療が成功する可能性がより高いか、ＯＸＡは子宮内膜癌を検出する場合にずっと効果的であると思われる。又、ＯＸＡを用いた陽性の結果は子宮内膜癌（子宮内膜癌てはない）（データ示さず）を患った２１の患者のうちたった３と思われる事実は重要である。これらのデータはＯＸＡモノクローナル抗体か子宮内膜癌を検出するのに役立つことを示す。

上記の実施例は本発明の例示であって、制限するものではない。本発明は含有される等価な内容と共に以下の請求範囲により規定される。

＋２３　４５６　７８９　１０１１１２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３１　Ａ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ｄ　８３１０−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０６（Ｃ１２Ｐ　２１１００Ｃ１２Ｒ１：９１）（Ｃ１２Ｐ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：９１）（３１）優先権主張番号　８７９，８６０（３２）優先臼　１９９２年５月６日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ）Ｉ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＫＲ（７２）発明者　バースト　ロバート　シー　ジュニアアメリカ合衆国　ノースカロライナ州２７５１４　チャペル　ヒル　ターキー　ファーム　ロード　６１０８

Claims

【特許請求の範囲】

１．患者から採った体液からなる試料を、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合する抗体、及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合するこれらのフラグメントからなる群から選ばれる抗体に、前記抗体が反応生成物を形成できる条件下で接触させ、及びその後前記反応生成物の存否を検出することからなるヒトの患者の癌の存在を検出する方法。
２．前記抗体が、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合する抗体及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合するこれらのフラグメントからなる群から選択される請求項１記載の方法。
３．前記癌が卵巣癌及び乳癌からなる群から選択される請求項１記載の方法。
４．前記癌が上皮性卵巣癌である請求項１記載の方法。
５．前記患者が以前に癌を有すると診断をされたことがない請求項１記載の方法。
６．方法がラジオイムノアッセイ、イムノ蛍光アッセイ、及びエンザイムイムノアッセイからなる群から選択される請求項１記載の方法。
７．前記体液が、血清、血漿、及び腹水からなる群から選択される請求項１記載の方法。
８．前記体液が、血清及び血漿からなる群から選択される請求項１記載の方法。
９．更に前記患者のＣＡ１２５抗原の存在を同時に検出する工程からなる請求項１記載の方法。
１０．以前に上皮性卵巣癌を有すると診断されたヒトの患者から集めた体液の試料を、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合する抗体、及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合するこれらのフラグメントからなる群から選択される抗体に前記抗体が反応生成物を形成できる条件下で接触させ、及びその後前記反応生成物の存否を検出することからなるヒトの患者の上皮性卵巣癌の存在を検出する方法。
１１．前記患者が以前に卵巣癌の治療を受けた請求項１０記載の方法。
１２．前記抗体がモノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合する抗体、及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合するこれらのフラグメントからなる群より選択される請求項１０記載の方法。
１３．前記抗体が、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合するモノクローナル抗体、及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合するこれらのフラグメントからなる群より選択される請求項１０記載の方法。
１４．方法がラジオイムノアッセイ、イムノ蛍光アッセイ、及びエンザイムイムノアッセイからなる群から選択される請求項１０記載の方法。
１５．前記体液が、血清、血漿、及び腹水からなる群から選択される請求項１０記載の方法。
１６．前記体液が、血清及び血漿からなる群から選択される請求項１０記載の方法。
１７．更に前記患者のＣＡｌ２５抗原の存在を同時に検出する工程からなる請求項１０記載の方法。
１８．モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合する抗体、及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合するこれらのフラグメントからなる群から選択される抗体と診断の固体支持体との抱合体。
１９．前記抗体が、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合する抗体及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合するこれらのフラグメントからなる群から選択される請求項１８記載の抱合体。
２０．前記フラグメントがＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメント、及びＦＶフラグメントからなる群から選択される請求項１８記載の抱合体。
２１．前記固体支持体がビーズ、プレート、スライド及びウェルからなる群から選択される請求項１８記載の抱合体。
２２．モノクローナル抗体ＯＸＡにより認識され、少なくとも８００キロダルトンの分子量を有する精製抗原。
２３．ＯＶＣＡＲ−３及びＯＶＣＡ４２０細胞からなる群から選択される細胞により発現され、ＣＡ１２５に結合する抗体により認識されず、洗剤を用いて抗原を発現する細胞を洗浄する際に可溶化する、少なくとも８００キロダルトンの分子量を有する精製抗原。
２４．モノクローナル抗体ＯＸＢにより認識され、少なくとも８００キロダルトンの分子量を有する精製抗原。
２５．前記患者から採った体液からなる試料を、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合する抗体、及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合する抗原に結合するこれらのフラグメントからなる群から選ばれる抗体に、前記抗体が反応生成物を形成できる条件下で接触させ、及びその後前記反応生成物の存否を検出することからなるヒトの患者の子宮内膜癌の存在を検出する方法。
２６．前記抗体が、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＢ、モノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合する抗体及びモノクローナル抗体ＯＸＡ又はＯＸＢが結合するエピトープに結合するこれらのフラグメントからなる群から選択される請求項２５記載の方法。
２７．前記抗体が、モノクローナル抗体ＯＸＡ、モノクローナル抗体ＯＸＡが結合するエピトープに結合する抗体、及びモノクローナル抗体ＯＸＡが桔合するエピトープに結合するこれらのフラグメントからなる群から選択される請求項２５記載の方法。
２８．前記患者が以前に癌を有すると診断された請求項２５記載の方法。
２９．前記体液が、血清、血漿、及び腹水からなる群から選択される請求項２５記載の方法。
３０．前記体液が、血清及び血漿からなる群から選択される請求項２５記載の方法。