JPH1183858A - Ｍｍｐ−９関連の新規腫瘍特異的抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍特異性の高い、新規腫瘍マーカー抗原を
提供し、その検出により、より確実な腫瘍の臨床診断を
可能に使用とする。 【構成】 腫瘍の存在が疑われる組織試料の抽出液を還
元条件下に置き、抗ゼラチナーゼＢ抗体と反応する分子
量サイズ約７４ｋおよび／または、好ましくは約３６ｋ
の蛋白質の存在を、上記抽出液中から検出し、当該蛋白
質が検出される場合に組織試料に腫瘍が存在すると判定
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌組織特異的に出
現するタンパク質の検出システム及びその臨床診断への
応用に関する。本発明は、生化学、臨床科学、分析化学
などの分野において重要な役割を果たすものである。

【０００２】

【従来の技術】癌の診断には超音波やＸ線検査で体内の
癌組織を画像としてとらえる方法の他に組織を検体とし
て採取して、色素、抗体等を用いて染色し、その形態の
観察により異常所見を見つけだす病理形態学的方法、腫
瘍マーカーと呼ばれる担癌状態で出現するタンパク質、
糖鎖などの物質を検出する生化学的、免疫学的方法があ
る。

【０００３】しかしながら、病理形態学的方法では形態
を観察するために組織を標本に加工したり、形態から腫
瘍の状態を見極めるといった熟練した技能が必要であ
り、誰もが簡単に実施し、客観的に判断することは困難
である。また腫瘍マーカーの検出では、マーカーとなる
それぞれの物質の癌に対する特異性が大きな問題であ
る。非癌細胞には認められず、癌化した細胞だけが産生
する物質は現在のところヒトでは知られておらず、癌化
による腫瘍マーカーの量的な変化により判断される。こ
の際には正常と異常を区別するためのカットオフ値の設
定が重要であり、腫瘍マーカーの測定法間での測定値の
差異などが誤った診断結果につながる可能性もある。ま
た、腎臓など臓器によっては癌化により産生が顕著に変
化する有用な腫瘍マーカーがない場合もある。

【０００４】一方、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９とも呼
ばれる）に関しては、次のような報告が知られている。

【０００５】１）ヒトＭＭＰ−９クローンのｃＤＮＡを
クローニングしたこと、およびヒトＭＭＰ−９の分子サ
イズは９２ｋであること（Wilhelm S. M. et al. (198
9); J. Biol. Chem. 264: 17213-17221）； ２）転移能の高い癌細胞では９５ｋＤａゼラチナーゼ
（ＭＭＰ−９）の６０ｋＤａゼラチナーゼ（ＭＭＰ−
２）に対する相対的な分泌量が高いこと（Yamagata, S.
et al (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 158,
228-234）； ３）分子量９２０００のＰｒｏＭＭＰ−９は分子量８３
０００の中間体を経て、活性型の分子量６７０００にな
ること、および、その際Ｎ末端とＣ末端の双方が切断を
受けること（Okada, Y. et al (1992) J. Biol. Chem.
267, 21712-21719）； ４）ラット１３７６２腺癌細胞の転移の度合いと血清、
血漿中のＰｒｏＭＭＰ−９のレベルは相関すること（Na
kajima, M. et al (1993) Cancer Research 53, 5802-5
807）； ５）肝癌患者の血漿中のＭＭＰ−９の免疫測定法による
測定値は肝炎、肝硬変、健常と比べて有意に高いこと
（Hayasaka, A. et al (1996) Hepatorogy 24, 1058-10
62）； ６）ゼラチナーゼＢは上皮系由来の様々な癌細胞が産生
することが知られているが、リンパ球やマクロファージ
などの炎症細胞もこれを産生すること（中島元夫，実験
医学 1994; 12: 971-979）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の問題点を解決するため、腫瘍特異性の高い、新規腫
瘍マーカー抗原を提供し、その検出により、より確実な
腫瘍の臨床診断を可能にしようとするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、腫瘍の診断に
用いることができる新規マーカーを提供するために各方
面から鋭意研究した結果、遂に完成されたものであっ
て、腫瘍組織中にマトリックスメタロプロテアーゼの一
種であるゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９とも呼ばれる）に
対するモノクローナル抗体に反応し得る新規抗原が存在
するという発見に基づいている。

【０００８】より詳細には、本発明者らは腎癌組織の抽
出物を用い、イムノブロッティングを行うと、抗ゼラチ
ナーゼＢモノクローナル抗体に反応する物質は、従来知
られていたゼラチナーゼＢの分子サイズ９２ｋの分子種
ではなく、それより小さい約７４ｋ及び３６ｋの分子種
であることを見いだした。そして、これらの成分、特に
約３６ｋに相当するバンドは、同じ患者の腎臓の正常組
織部分には少なく、腫瘍部位に多く存在することを見い
だした。

【０００９】本発明は上記事実に基づいて腫瘍の診断を
行う。すなわち、従来技術の項において述べたとおり、
ゼラチナーゼＢは上皮系由来の様々な癌細胞が産生する
ことが知られているから、腎臓を含む生体の種々の組織
の腫瘍において、抗ゼラチナーゼＢ抗体と反応する７４
ｋ及び／又は３６ｋの蛋白質が存在すると考えられる。
したがって、腫瘍の存在が疑われる組織試料の抽出液を
還元または非還元条件下に置き、抗ゼラチナーゼＢ抗体
と反応する分子量サイズ約７４ｋおよび／または、好ま
しくは約３６ｋの蛋白質の存在を、上記抽出液中から検
出し、当該蛋白質が検出される場合に組織試料に腫瘍が
存在すると判定することができる。その際、これらの蛋
白質の存在量を同一患者の正常組織中での量と比較して
腫瘍の判定をより確実に行ってもよい。

【００１０】上記還元条件とは、電気泳動において蛋白
質試料を還元条件に置く場合の程度の還元条件をいう。
例えば０．１〜２０％、好ましくは１〜１０％の濃度の
メルカプトエタノールの存在下で、蛋白質を含む試料
を、常温で数分〜数日静置する。または煮沸等の高温下
において還元を短時間で行ってもよい。

【００１１】抗ゼラチナーゼＢ抗体と反応する分子量サ
イズ約７４ｋまたは約３６ｋの蛋白質の検出に用いる抗
体は、ゼラチナーゼＢに対して公知の方法で調製した抗
体である。ポリクローナル抗体でもよいが、好ましくは
モノクローナル抗体を用いる。好ましい抗体は、限定す
るわけではないが、例えば富士薬品工業株式会社から、
抗ヒトＭＭＰ−９抗体（Anti-hMMP-9, purified IgG)の
商品名（品番Ｆ−６９）として市販されているものであ
る。この抗体の特性は次の通りである：クローン名 ：５６−２Ａ４；サブクラス ：ＩｇＧ１；特異性 ：ヒトＭＭＰ−９と特異的に反応し、ヒトＭＭＰ
−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−１３とは
反応せず、また、モルモットＭＭＰ−９とは交差反応す
る；特徴 ：ヒトゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ−９）の６２６位か
ら６４４位のアミノ酸配列に相当するＣ末ドメインのペ
プチドに対するマウス精製モノクローナル抗体である； また、本発明の方法に使用する抗体は、上記分子量サイ
ズ約７４ｋまたは約３６ｋの蛋白質を用い、これに対す
る特異的抗体を常法で調製して用いてもよい。そのため
には、例えば、前記Wilhelm ら（J. Biol. Chem. 264:
17213-17221 (1989)）により開示されているヒトゼラチ
ナーゼＢをコードするｃＤＮＡを用いて、全長のヒトゼ
ラチナーゼＢを遺伝子工学技術で製造し、これを還元し
て約７４ｋまたは約３６ｋの蛋白質を得ることが可能と
考えられる。これらの蛋白質を分子量に基づき単離精製
し、これらを別々にまたは混合して適当な動物に免疫す
ることにより、所望の抗体を得ることができる。

【００１２】本発明の方法において、分子量サイズ約７
４ｋまたは約３６ｋの蛋白質の検出は、好ましくは、検
体である生体材料を抗ゼラチナーゼＢ抗体を用いたイム
ノブロッティングにより行うと容易である。その代わり
に、組織試料中に存在する約７４ｋ及び約３６ｋの物質
をこれらに対する特異抗体で、直接または間接的に検出
することによって行ってもよい。

【００１３】本発明はさらに、抗ゼラチナーゼＢ抗体と
反応する分子量サイズ約７４ｋ及び３６ｋの物質を組織
試料中に検出するためのイムノブロッティング用キット
も提供する。

【００１４】本発明のキットは、参照物質としての分
子量サイズ約７４ｋおよび／または約３６ｋの蛋白質、
および該蛋白質と特異的に反応する抗体、例えば抗ゼ
ラチナーゼＢモノクローナル抗体を含んでなる。本発明
のキットは、必要に応じて、電気泳動に必要な、ゲル、
バッファー、分子量マーカー、試料を還元する試薬、イ
ムノブロッティングのための膜、バッファー、ブロッキ
ング液、基質液および蛍光試薬もしくは発色試薬等をさ
らに含んでよく、さらにはキットの説明書や、定量のた
めの標準曲線を含んでもよい。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の方法において組織から電
気泳動の試料を調製するには、好ましくは、組織を鋏で
細切し、緩衝液に懸濁した後ホモジナイザーやブレンダ
ーを用いてさらに破砕する。次に遠心分離により破砕液
の上清を回収し、必要に応じて適当な蛋白濃度に調製す
るために希釈または濃縮を行う。このサンプルにＳＤＳ
−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーを添加し、熱処理す
る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサンプルを分離した後、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを転写膜に重ねてブロッティング用
の装置にセットして、通電し、膜に蛋白を転写する。蛋
白が転写された膜をブロッキングし、抗ゼラチナーゼＢ
抗体を反応させた後、酵素、蛍光物質等で標識された検
出用の二次抗体を反応させる。最後にこの標識物質を検
出し、現れたバンドの分子サイズを確認する。

【００１６】次に実施例により本発明をさらに説明す
る。なお、実施例においては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元
条件下で行った例を示すが、非還元条件下でも同様の結
果を得ている。

【００１７】

【実施例】１．腎組織からの分析試料の調製 腎癌患者１８例から摘出された腎臓から腫瘍病変部位と
正常部位組織を切り出し、試料とした。予め鋏でそれぞ
れの組織を細切し、その１ｇ（湿重量）に対して、１０
mlの１０mMトリス−塩酸（pH７．５）−３mM塩化カルシ
ウム−１mM ＰＭＳＦ−０．２５Ｍスクロースまたは水
を加え、ブレンダー及びホモジナイザーで破砕した後、
５０００×ｇで１０分間遠心分離して得られた上清を分
析用サンプルとした（ＰＭＳＦはフェニルメタンスルホ
ニルフルオリドの略である）。

【００１８】サンプルの蛋白量はウシ血清アルブミンを
スタンダードとしてＢＣＡ法により定量した。

【００１９】２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッ
ティング 分析用サンプルに最終濃度が６２．５mMトリス−塩酸
（pH６．８）−２％ドデシル硫酸ナトリウム−５％ ２
−メルカプトエタノール−７％グリセロールになるよう
に電気泳動サンプルバッファーを添加し、９４℃で３分
間熱処理した。

【００２０】ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度１０〜
２０％）１レーン当たりに熱処理したサンプルの蛋白量
１０μg 相当分をチャージして、４０ｍＡの定電流で泳
動先端がゲルの下端近くになるまで泳動した。

【００２１】泳動終了後、ゲルをガラス板からはずし、
ポリビニリデンフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜、ポアサイ
ズ０．４５μm ；ミリポア製）と重ね、０．０２５Ｍト
リス−０．１９２Ｍグリシン−２０％メタノールを含む
転写用バッファー中で５０Ｖで１時間、さらに７０Ｖで
１．５時間通電して蛋白質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写
した。

【００２２】転写後のＰＶＤＦ膜をブロッキング溶液
（ブロックエース；大日本製薬製）に浸して１時間ブロ
ッキングし、その後、１０mMトリス−塩酸（pH７．５）
−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２
０ （０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ）で膜をよく洗
浄した。

【００２３】０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳで１０μ
g ／mlに希釈した抗ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ）９モノク
ローナル抗体（富士薬品工業製：品番Ｆ−６９）の溶液
に浸して１．５時間反応した。さらに０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ−ＴＢＳで膜をよく洗浄した。

【００２４】次に抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体−
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識物を１０００倍希釈し
た液に膜を浸し、１時間反応させた。１０mM トリス−
塩酸（pH７．５）−０．１５Ｍ ＮａＣｌで膜をよく洗
浄した。

【００２５】洗浄後、膜を基質液（コニカイムノステイ
ン ＨＰＰ−１０００；コニカ製）に浸し、バンドが適
当な濃さになるまで発色させた。

【００２６】３．ザイモグラフィー 各分析試料に終濃度が０．０６２５Ｍ トリス−塩酸
（pH６．８）−２％ ＳＤＳ−７％グリセロールとなる
よう還元剤を含まないＳＤＳサンプルバッファーを添加
した。１mg／mlゼラチンを含むポリアクリルアミドゲル
の各レーンに１０μg ずつ試料をチャージし、泳動を行
った。泳動後のゲルを５０mMトリス−塩酸（pH７．５，
２５℃）−０．１Ｍ ＮａＣｌ−２．５％ Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００に浸し、室温で６０分間静置した。次に
ゲルを５０mM トリス−塩酸（７．５，２５℃）−１０
mM ＣａＣｌ₂ −０．０２％ ＮａＮ₃ に浸し、３７℃
で約１８時間静置して酵素反応を行った。反応後ゲルを
ＣＢＢ(Coomassie brilliantblue)で染色し、泳動像を
観察した。

【００２７】４．結果 イムノブロッティングの典型例として、患者２、１４、
１５および１６の結果を図１に示す。図中、Ｔは腎臓癌
の患部組織であり、Ｎは同じ患者の正常部分の腎臓組織
である。同一患者のＴとＮは隣り合うレーンに結果を示
している。ＭＭＰ−９は、スタンダードとして用いた９
２ｋの市販ＭＭＰ−９標品である。還元条件下でのイム
ノブロッティングの結果、腫瘍部位の組織試料では７４
ｋおよび３６ｋのバンドが強く染色された。これらの分
子サイズはＭＭＰ−９のプロ型（９２ｋ）と活性型（８
２ｋ）のどちらとも一致しなかった。また、スタンダー
ドとして用いた市販のＭＭＰ−９は９２ｋ付近に一本の
バンドが認められた。患者１８人について、全て同様の
結果が得られた。

【００２８】一方、図１と同じ試料を用いて、非還元条
件下でザイモグラフィーを行った結果、正常部位および
腫瘍部位の両方でＭＭＰ−９のプロ型に相当すると思わ
れる９２ｋの位置に活性バンドが検出された（図示はし
ていない）。

【００２９】以上の結果から、腎癌で強く染色される２
つの成分はＭＭＰ−９特異的抗体と反応するが、これま
でに知られているＭＭＰ−９分子種とは異なる新規な腫
瘍特異的抗原であると推測される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 還元条件下でのイムノブロッティングの結
果、腫瘍部位の組織試料では７４ｋおよび３６ｋのバン
ドが強く染色されたことを示す、電気泳動の模式図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 紀平 安則 長野県伊那市伊那部1946 マイタウン伊那 301号室 (72)発明者 紀平 佳子 長野県伊那市伊那部1946 マイタウン伊那 301号室

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍の存在が疑われる組織試料の抽出液
   を還元または非還元条件下に置き、抗ゼラチナーゼＢ抗
   体と反応性を有する分子量サイズ約７４ｋまたは約３６
   ｋの蛋白質の一方または両方の存在を、上記抽出液中か
   ら検出し、当該蛋白質が検出される場合に組織試料に腫
   瘍が存在すると判定することよりなる、組織試料中の腫
   瘍の存在の判定方法。
2. 【請求項２】 下記の工程： (a) 腫瘍の存在が疑われる組織試料を用意し； (b) 上記試料に含まれる蛋白質を、還元または非還元条
   件下に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動分離し； (c) 分離された蛋白質中に、抗ゼラチナーゼＢ抗体と反
   応性を有する分子量サイズ約７４ｋまたは約３６ｋの蛋
   白質が含まれるかどうかを検出し； (d) 上記蛋白質の少なくとも一方が検出された場合、試
   料組織に腫瘍が存在すると判断する； ことからなる、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 検出工程(c) が、 工程(b) で分離された蛋白質を含むゲルをイムノブ
   ロッティング膜に重ねて、ゲル中の蛋白質を膜上に転写
   させ； 膜上に転写された蛋白質を抗ゼラチナーゼＢ抗体と
   反応させ；そして 膜上に、該抗体と反応性を有する分子量サイズ約７
   ４ｋまたは約３６ｋの蛋白質の少なくとも一方が存在す
   るか否かを検出する； ことからなる請求項２の方法。
4. 【請求項４】 膜上に上記抗体と反応性を有する分子量
   サイズ約７４ｋまたは約３６ｋの蛋白質の少なくとも一
   方が存在するか否かを検出するため、膜上の蛋白質と結
   合した抗ゼラチナーゼＢ抗体を、該抗体を認識する標識
   二次抗体の結合により検出する、請求項３の方法。
5. 【請求項５】 二次抗体の標識が、放射線標識、蛍光標
   識、酵素標識である請求項４の方法。
6. 【請求項６】 腫瘍が腎癌である、請求項１〜５のいず
   れか１項の方法。