KR101777085B1 - En2 단백질의 면역원성 단편 펩타이드 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EN2 단백질의 면역원성 단편 펩타이드 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 상기 펩타이드를 특이적으로 인식하는 방법을 통해 EN2 단백질의 정량이 가능하다. 또한 상기 펩타이드를 이용하여 제조한 항체는 기존의 EN2 단백질 항체보다 검출 민감성이 현저하게 우수하여 전립선암의 진단제 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

EN2 단백질의 면역원성 단편 펩타이드 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체 조성물 {Immunogenic segment peptide of EN2 protein, or antibody composition specifically detecting the peptide}

본 발명은 EN2 단백질의 면역원성 단편 펩타이드 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체 조성물에 관한 것이다.

전립선(prostate)은 방광 바로 밑, 직장 앞쪽에 있는 밤톨만 한 크기의 남성 생식기관으로, 정액의 일부를 만들어내고 저장하는 역할을 한다. 위로는 방광경부, 즉 방광에서 요도로 이행하는 부위와 인접해 앞쪽의 치골전립선인대에 고정되어 있고, 아래로는 비뇨생식격막에 의해 고정되어 있다. 전립선에서 발생하는 암의 대부분은 전립선 세포에서 발생하는 선암(샘세포의 암)이다. 종양 조직의 분화 정도와 세포의 특성 등에 따라 유형을 구분할 수 있다.

전립선암은 전세계적으로 가장 흔한 비뇨기계 종양 중 하나로서, 미국에서는 2016년에만 약 180,890명이 전립선암으로 새로이 진단되어 미국 내 전체 신규 종양진단의 10.7%를 차지하며, 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 빈번하게 발병이 되는 종양이다. 2009년부터 2013년까지의 통계에 비추어 전세계 100,000명의 남성 중 129.4명이 전립선암을 가지고 있으며 전립선암의 사망률은 2016년 통계로 26,120명에 이른다. 또한 전립선암은 50세 이전에는 흔하지 않은 질환이나 50세를 넘게 되면 급격히 증가하는 양상을 보인다. 최근 평균 수명의 연장으로 국내에서도 노인 남성의 수가 급증하고 전립선암을 조기에 진단하여 전이가 발생하는 등으로 악화되지 않도록 지속적인 관리를 필요로 한다.

특히 사람 전립선암은 뼈로 전이되는 성향을 가지는 것으로 보이며, 안드로겐 의존성 상태로부터 안드로겐 내성 상태로 불가피하게 진행되어 환자의 사망률을 증가시킨다고 알려져 있다. 더욱이, 전립선암 치료를 받은 남성의 약 25%는 병이 재발하여 추가적인 치료를 필요로 하는 질병으로서, 현재 미국에서 남자의 암 사망 원인 중 제2의 원인을 차지하고 있는바, 이에 대한 조기진단 및 치료가 필요한 실정이다.

현재 사용되고 있는 전립선암 진단법 중 직접적인 방법으로는, 전립선을 직접 조영하거나 조직검사를 통한 진단법이 있다. 직접 조영하거나 조직검사를 통해 진단하는 경우에는, 초기에 전립선암의 발병 여부를 진단함에 어려움이 있는 바, 체외에서 진단할 수 있는 방법의 개발이 시급하다.

간접적인 방법으로는 PSA(prostate-specific antigen) 검사를 이용하여 체외에서 검진할 수 있는 진단법이 있다. 그러나 진단에 이용되는 PSA는 악성 전립선 상피 조직뿐만 아니라 정상 및 양성에서도 생성되어 전립선암 검출에 있어서의 가성 양성율을 높이는 결과를 가져왔다. 또한, 혈청 PSA 수준이 아주 높은 경우에는 효과적인 전립선암의 표준적 진단방법으로 이용할 수 있는 반면, PSA 혈청 수준이 2-10 ng/㎖의 수준인 경우와 같이 약하게 올라가는 경우에는 확실한 전립선암 진단을 할 수 없다. 상기와 같이 약하게 올라가는 경우에는 혈청 PSA는 BPH(benign prostatic hyperplasia), 전립선염 또는 기타 신체적 외상과 같은 비-종양 질병으로부터 유래할 수 있으므로 전립선암 진단을 위한 PSA 분석은 검출 특이성과 관련하여 문제점이 존재한다.

따라서, 신규 바이오마커를 이용한 전립선암의 진단이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국공개특허 제10-2009-0111307호) 아직 미비한 실정이다. 근래에 EN2(Engrailed-2)를 바이오마커로 하여 전립선암을 진단하는 방법들이 제시된 바 있는데, EN2는 종래 전립선암 진단에 사용되는 PSA (prostate specific antigen) 검사의 검출 특이성 문제를 해결할 수 있는 바이오마커(bio-marker)로 잘 알려져 있다. EN2 단백질은 세포 내에서 전사인자로서 작용하며, 전립선암 세포 내에서만 과다 발현되어 DNA 전사 조절 장애를 초래한다. 더욱이 전립선암 세포 내에서 EN2 발현이 증가할 경우, 소변으로 배설되는 EN2 단백질 양 역시 증가하는 바 체외분석에 적합하다. 이에 미국등록특허 제8460882호, 일본공개특허 제2012-532621호 또는 미국등록특허 제8722643호 등에서 EN2 단백질을 인식하는 진단용 조성물에 관한 기술이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2016-0077788호에는 EN2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머에 관한 기술이 개시되어 있다.

일반적으로 항체라 함은 일반적으로 외부 물질(일정 이상의 크기와 조건을 갖춘 물질)(항원)을 생물체에 주입하고 생물체에서는 체액성 면역 반응을 통하여 외부 물질을 특이적으로 인식할 수 있는 부분(epitope)을 가진 항체를 형성하고 이를 혈액에서 채취하여 혈청에서 분리해낸다. 이렇게 형성된 항체는 항원을 인식하는 부분을 여러 개 가지고 있는 다클론 항체이다.

체액성 면역반응에서 항원은 여러 가지의 항원제시세포(antigen presenting cell; APC)에 의하여 작은 조각 에피토프(epitope)으로 B cell에 보여지게 (presenting)되고 B cell을 활성시킨다. B cell은 이러한 활성과정에서 항체를 만드는 전체 유전자 가운데 항원에 반응할 수 있는 항체를 만드는 유전자만 재배열 되고 나머지 불필요한 유전자는 제거되어 한가지의 항체만을 다량으로 생성하여 세포외로 분비하는 플라즈마 세포(plasma cell)로 분화한다.

항원은 일반적으로 여러개의 에피토프를 가지므로 분화된 플라즈마 세포도 여러 종류이며, 따라서 생성되는 항체도 여러가지이다. 이렇게 여러 종류의 플라즈마 세포(즉, 항체를 만드는 유전자 자체가 각각 다른)에서 분비된 여러 종류의 항체 전체 집합을 '다클론 항체'라 하며, 한 종류의 플라즈마 세포에서 만들어진 한 종류의 항체만을 '단일클론 항체'라 한다.

항체를 이용한 진단 시장은 1980년 이후로 급속히 증가되고 있으며 질병이나 증상에 따라 특이적으로 발현되는 단백질을 극소량으로도 검출할 수 있어 민감도가 우수해 높은 효율의 진단 키트 개발 및 진단 기법에 활용되고 있다. 이를 위해서는 질환 및 증상에 의해 발현되는 단백질(항원)에 특이성과 민감도를 모두 갖춘 항체 개발이 필수적이다. 특이성과 민감도를 갖춘 항체를 생성하기 위해서는 몇 가지 고려하여 항체의 효율을 극대화 할 수 있다.

첫 번째, 생성하려는 항원의 1차 서열을 비교하여 항원의 동물종과 면역동물이 이질성이 강한 것을 선택하는 것이 면역 반응을 극대화할 수 있다. 예를 들어 사람 단백질의 서열을 활용할 경우 그 서열과 이질성이 높은 동물을 선정하여 면역 반응을 유도하는 것이 높은 역가의 항체를 얻을 수 있다.

두 번째, 항원의 서열에서 번역 후 변형에 따른 수식으로의 특성과 입체 구조에 따른 항원으로서의 질이 달라질 수 있으므로 고려해서 선택한다. 특히 단백질 전체를 항원으로 사용하지 않고 일부 펩타이드 형태로 항원으로 사용할 때는 특히 고려하여 선택하여야 한다.

세 번째, 목적에 따른 항체의 특성에 맞추어 제작한다. 다클론 항체의 경우 제작이 간편하고 여러 epitope로 인한 항원 검출이 용이하고 항원에 따른 면역 동물의 선택의 폭이 넓다는 장점이 있다. 하지만 항체 특이성이 떨어지고 같은 역가의 대량 생산에는 용이하지 않다. 단일클론 항체의 경우는 배양 상층액에서의 항체를 얻을 수 있어 같은 역가의 특이성을 가지는 항체를 대량으로 생산할 수 있는 장점을 가지고 있지만 또 제작기간이 오래 걸리고 면역 동물이 제한적이며 면역염색 등의 실험에 적합하지 않다는 단점을 가지고 있다.

따라서, 일반적으로 다클론 항체 생산을 통한 항원의 특이성을 확인하고 동일한 역가의 항체를 대량생산이 필요한 경우 단일클론 항체를 제작하게 된다.

한편 본 발명자들은 전립선암 진단 관련 조성물에 관해 연구하던 중, EN2 단백질을 더욱 효과적으로 진단할 수 있는 EN2 단백질의 단편 또는 이를 인식할 수 있는 항체를 기반으로 하는 전립선암 진단 조성물을 제조함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

미국등록특허 제8460882호 (발명의 명칭 : Cancer biomarkers, 출원인 : The University of Surrey, 등록일 : 2013.06.11) 미국등록특허 제8722643호 (발명의 명칭 : Targeting EN2, PAX2, and/or DEFB1 for treatment of prostate conditions, 출원인 : Phigenix, Inc., 등록일 : 2014.05.13) 일본공개특허 제2012-532621호 (발명의 명칭 : 치료 펩티드, 폴리펩티드 및 핵산 배열, 출원인 : The University of Surrey, 공개일 : 2012.12.20) 한국공개특허 제10-2009-0111307호 (발명의 명칭 : EN2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도, 출원인 : 포항공과대학교 산학협력단, 공개일 : 2016.07.04) 한국공개특허 제10-2016-0077788호 (발명의 명칭 : 전립선 특이적 전사물 및 전립선암의 치료 및 진단에 사용되는 이의 용도, 출원인 : 엑손히트 써라퓨틱스 에스에이, 공개일 : 2009.10.26)

본 발명의 목적은 EN2 단백질의 면역원성 단편 펩타이드 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 하기의 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 관한 것이다.

서열번호 1 : PGDGEGGSKTLSLHGGAKKGGDPGGPLDGS

서열번호 2 : CTRYSDRPSSGPRSRKPKKKNPNKEDKRPR

서열번호 3 : PRSRKPKKKNPNKEDKRPRTAFTAEQLQR

상기 펩타이드는 EN2(Engrailed-2) 단백질(Accession No. NP_001418.2)의 면역원성 단편일 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 펩타이드를 특이적으로 인식하여 EN2(Engrailed-2) 단백질의 유무를 진단하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 각각을 특이적으로 인식하는 항체 조성물에 관한 것이다.

이에 본 발명은 상기 항체 조성물을 함유하는 전립선암 진단제를 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 항체를 이용한 전립선암의 진단방법을 제공한다.

이하 본 발명을 자세하게 설명한다.

본 발명에서 제공하는 펩타이드는 하기의 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

서열번호 1 : PGDGEGGSKTLSLHGGAKKGGDPGGPLDGS

서열번호 2 : CTRYSDRPSSGPRSRKPKKKNPNKEDKRPR

서열번호 3 : PRSRKPKKKNPNKEDKRPRTAFTAEQLQR

본 발명에서 비교대상으로 사용하는 시판 항체들은 하기의 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 항원으로 하여 제조된 것을 특징으로 한다.

서열번호 4 : EDKRPRTAFTAEQLQRLKAEFQTNRYLTE

서열번호 5 : GTCCAGAGGGRGGGAGGEGGASGAEGGGGAGGSEQLLGSGSREPRQNPPCAPGAGGP

LPAAGSDSPGDGEGGSKTLSLHGGAKKGGDPGGPLDGSLKARGLGGGDLSVSSDSDSSQAGANLGAQP

이들 펩타이드의 EN2 내 위치는 도 1에 나타내었다.

상기 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 EN2 단백질의 면역원성 단편으로서, 전립선암 환자의 체내에서 증감하는 EN2 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 EN2 단백질의 단편이다.

본 발명은 상기 펩타이드를 특이적으로 인식하여 EN2 단백질의 유무를 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 EN2 단백질은 포유류의 체내에 포함된 것을 체외로 추출한 것일 수 있으며, 또한 재조합 EN2 단백질일 수도 있다. 이 때 EN2 단백질의 존재 유무는 단백질 존재유무 또는 정량방법에 사용되는 통상의 실험적인 방법이라면 어떤 것이든지 이용가능하다.

또한, 본 발명은 서열번호 1, 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 각각의 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체 조성물 또는 이를 함유하는 진단제를 제공한다. 상기 진단제에는, 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등이 포함될 수 있다.

상기 진단제는 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 3종에 대한 각각의 항체를 모두 포함할 때, 1종 또는 2종의 항체를 함유한 진단제를 이용하는 것보다 전립선암을 보다 정확하게 진단할 수 있다. 예를 들어, 진단대상의 체내에 포함된 EN2 단백질을 확인하기 위해, 진단대상으로부터 채취한 시료를 3개 세트로 분주하여, 한 세트에 대해 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 대한 항체를 이용하여 EN2 단백질의 존재 유무와 농도를 확인하고, 나머지 각각의 세트에 대해 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 대한 항체와 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에 대한 항체에 대해서도 개별적으로 EN2 단백질의 존재 유무와 농도를 확인하여 총 3번 EN2 단백질에 대해서 검출 실험을 수행할 수 있다. 이러한 방법으로 상기 진단제를 이용하여 EN2 단백질을 검출할 때 진단 결과에 대한 정확도 및 신뢰도를 높일 수 있다.

한편 본 발명의 진단제에는 진단대상의 체내에 포함된 EN2 단백질을 정량할 수 있는 재조합 EN2 단백질이 포함될 수 있다.

항체는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 따라서 바람직하게는 상기 항체는 본 발명의 펩타이드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다.

상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 이용하여 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 다클론 항체는 본 발명의 펩타이드를 항원으로 하여 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 단일클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler G. and Milstein C.), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Marks et al.) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 이 후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 펩타이드에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 펩타이드에 대한 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 펩타이드과 결합하는 단일클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 원심분리, 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.

한편, 본 발명의 항체를 제조하는 방법에 대해서는 하기의 방법을 따를 수도 있다.

바람직하게는 (제1단계) 가교제를 사용하여 본 발명의 펩타이드와 운반 단백질을 결합하여 항체 제조용 항원을 준비하는 단계;

(제2단계) 상기 항원과 보조제를 혼합하여 유화하는 단계;

(제3단계) 보조제가 유화된 항원을 동물에 2~5회 7~20일 간격으로 피내주사하는 단계;

(제4단계) 항원 투여를 마친 7~20일 후, 동물의 전혈로부터 혈청을 분리해내는 단계; 및,

(제5단계) 상기 혈청으로부터 면역글로불린을 분리 정제하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 항제 제조방법에서 동물은 면역반응을 일으킬 수 있는 동물이라면 어떤 동물이라도 사용가능하며, 바람직하게는 표유류일 수 있다. 상기 제5단계의 면역글로불린은 어떤 타입이라도 사용가능하나 바람직하게는 면역글로불린 G일 수 있다.

본 발명에서 항체를 제조하기 위해, 펩타이드 1, 2 또는 3을 이용하여 면역반응을 유도할 때, 상기 펩타이드 1, 2 또는 3에 가교제(cross-linker)를 사용하여 운반 단백질(carrier protein)을 연결함으로써 항원으로 이용할 수 있다. 이 때, 운반 단백질로는 일반적으로 자체 항원성이 낮은 운반 역할만을 하는 BSA, KLH, OVA 등을 사용할 수 있으며, 펩타이드와 단백질을 연결할 수 있는 cross linker는 EDC를 포함한 glutaraldehyde - links carrier molecules to N-terminus of peptide, succinimide esters (e.g. MBS, SMCC), benzidine (BDB), - links to Tyr residues, periodate, - attaches to carbohydrate groups, isothiocyanate - used to label antibodies with fluorochromes 등을 사용할 수 있으며, 이 때 사용되는 완충용액은 사용한 linker의 특성에 맞추어 다양하게 사용가능하다.

또한, 본 발명의 펩타이드 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 전립선암의 진단방법을 제공한다.

상기 진단방법은, (1단계) 분석할 시료에서 체단백질을 분리하는 단계;

(2단계) 상기 1단계의 체단백질과 본 발명의 항체를 접촉시켜 항원-항체 복

합체를 형성하는 단계; 및,

(3단계) 상기 2단계에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 진단방법에서, 1단계의 시료는 전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상에게서 추출할 수 있으며, 바람직하게는, 포유동물(사람 또는 기타 동물)의 조직, 세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 간세포(liver cells) 등일 수 있다.

상기 1단계에서 체단백질을 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 체단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 2단계의 항원-항체 복합체란 시료 내의 체단백질에 포함된 EN2 단백질(또는 본 발명의 펩타이드 1, 2 또는 3)과 항체의 특이적인 결합물을 의미한다. 즉, 상기 복합체에서 항원은 EN2 단백질 (또는 본 발명의 펩타이드 1, 2 또는 3)을 의미한다.

즉, 상기 분석방법을 통하여 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 전립선암의 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 전립선암의 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 EN2 단백질 발현량을 판단하여 전립선암을 직접적으로 진단할 수 있다.

상기 3단계에서 전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 시료의 EN2 함량은 재조합 EN2 단백질의 농도를 확인한 표준값을 통해 확인할 수 있다. 이 때 1종 또는 2종의 항체보다 3종의 항체를 모두 사용하여 체내의 EN2 단백질에 대한 검출을 하는 것이 가장 바람직하다. 자세하게는 시료로부터 채취한 단백질을 3개의 세트로 분주하여, 각 세트에 해당되는 단백질에 각각의 항체를 반응시켜 EN2 검출을 할 수 있다.

전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 EN2 단백질 발현량은 전립선암 환자의 소변 EN2 단백질 농도 범위로 알려진 3.1~65.4 nM(Sci.Rep. 2013;3:2059)에 해당되는지를 통해 판단할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우, 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으나, 상기 기재된 범위로 제한되지는 않는다. 상기 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 발광물질로는 루시페린 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 미소입자로는 콜로이드, 금 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 진단방법은, 웨스턴 블롯(western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오크털로니면역확산법(ouchterlony immunodiffusion), 로켓면역전기영동법(rocket immunoelectrophoresis), 조직면역염색법(immunohistochemistry), 면역침전분석법(immunoprecipitation), 보체고정분석법(complement fixation assay), FACS(fluorescense activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등에 적용할 수 있으나, 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 펩타이드 또는 항체를 이용할 있는 진단대상은 EN2 단백질이 체내에 생성되는 대상라면 모두 가능하며, 사람을 포함하는 모든 포유류에 대한 진단이 가능하다. 상기 포유류는 사람, 개, 고양이, 토끼, 소, 염소, 돼지, 말 등 어떤 종류의 포유류도 모두 적용 가능하다.

본 발명은 EN2 단백질의 면역원성 단편 펩타이드 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 상기 펩타이드를 특이적으로 인식하는 방법을 통해 EN2 단백질의 정량이 가능하다. 또한 상기 펩타이드를 이용하여 제조한 항체는 기존의 EN2 단백질 항체보다 검출 민감성이 현저하게 우수하여 전립선암의 진단제 조성물로서 유용하게 이용될 수 있으며, 특히 전립선 암을 진단할 때 기존 전립선암 진단 방법인 혈액에서의 PSA(prostate-specific antigen) 검출 결과보다 높은 진단유효성이 있는 것이 확인된다.

도 1은 homeobox protein engrailed-2(EN2)의 전체 펩타이드 서열에서, 항원으로 사용된 3 종류의 펩타이드 서열과, 시판 항체에 대한 항원 펩타이드 서열을 도식화한 것이다(서열번호 1의 펩타이드 : Peptide 1, 서열번호 2의 펩타이드 : Peptide 2, 서열번호 3의 펩타이드 : Peptide 3, 서열번호 4의 펩타이드 : Company A 항체를 제조하기 위한 항원, 서열번호 5의 펩타이드 : Company B 항체를 제조하기 위한 항원).
도 2는 면역 동물을 사용하여 면역반응을 유발한 전체 시간표를 도식화한 것이다.
도 3(a~c)은 면역 유도된 동물의 혈청으로부터 분리 및 정제된 각 과정의 샘플을 SDS-PAGE로 전개한 결과를 나타낸다.
도 4(a 및 b)는 전립선암 세포주(PC3)에서 발현된 EN2 단백질에 대한 선택적 검출 정도를 western blot 실험을 통하여 나타낸 결과이다(도 4 이하에서 서열번호 1의 펩타이드에 대한 항체는 Peptide 1, Pep.1로, 서열번호 2의 펩타이드에 대한 항체는 Peptide 2, Pep.2로, 서열번호 3의 펩타이드에 대한 항체는 Peptide 3, Pep.3로 기재한다. 또한 이하 서열번호 4의 펩타이드에 대한 항체는 Company A, ComA로, 서열번호 5의 펩타이드에 대한 항체는 Company B, ComB로 기재한다).
도 5(a 및 b)는 전립선암 세포주(LNCaP)에서 발현된 EN2 단백질에 대한 선택적 검출 정도를 western blot 실험을 통하여 나타낸 결과이다.
도 6(a 및 b)은 재조합 EN2 단백질을 사용하여 각 항체의 항원 검출 가능한 농도를 western blot 실험을 통하여 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 7(a 및 b)은 재조합 EN2 단백질을 사용하여 소변에서의 항원검출 가능한 농도를 western blot 실험을 통하여 나타낸 결과이다.
도 8(a~c)은 재조합 EN2 단백질을 사용하여 정제된 항체의 검출 정도를 immunocytochemistry 실험 방법을 통하여 검증한 결과를 나타낸다.
도 9(a~c)는 재조합 EN2 단백질을 사용하여 정제된 항체와 항원과의 결합 능력에 대한 해리상수를 ELISA 방식을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 재조합 EN2 단백질을 사용하여 정제된 각 항체의 항원에 대한 친화도를 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 항체 조성물을 이용하여 소변 내의 전립선암 진단용 바이오마커인 EN2 단백질의 유무 및 발현량을 확인하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 12은 전립선암 환자 3인에 대하여 혈액으로부터 PSA(prostate-specific antigen)를 ELISA 방식을 통하여 정량 분석한 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 항체 조성물을 이용하여 소변 내의 전립선암 진단용 바이오마커인 EN2 단백질의 유무 및 발현량을 western blot 실험을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. EN2 펩타이드 선정, 합성 및 항원 준비>

실시예 1-1. 항원으로 사용할 펩타이드의 아미노산 서열 선정 및 펩타이드 합성

전문 항체 회사프로그램(Antigen profiler peptide tool - Thermo Fisher Scientific)을 통하여 EN2 전체의 단백질 서열을 30개의 아미노산을 같은 펩타이드 단위로 잘랐고, 상기 각 펩타이드를 antigenic index로 점수화하고 항원성에 대해 1부터 5까지 점수로 나누어 그 중 3.8 이상의 점수인 구간을 선정하였다. 이 때, antigenic index는 뉴클레오타이드에서 단백질로의 번역 후 수식에 따른 구조적 영향력과 입체 구조 등에 따른 항원으로서의 가능성을 점수화 한 것이다.

이렇게 선정된 구간 중 소수성 잔기가 많이 분포한 구간은 단백질의 꼬임 구조(Folding)에서 외노출이 차단되므로 선정에서 제외하였고, 위의 기준에 맞춰 선정된 펩타이드의 서열은 점수가 가장 높게 채점된 상위 10 종류의 펩타이드 중 hydrophobic(소수성) 잔기가 적은 펩타이드 3종을 선택하였다.

상기 3종의 펩타이드를 98% 순도로 10 mg 합성 의뢰하였고(애니젠, 한국), 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 같은 3종의 펩타이드를 얻었다. 이렇게 합성된 펩타이드 서열의 EN2 단백질 내 위치는 도 1에 나타내었다.

서열번호 1 : PGDGEGGSKTLSLHGGAKKGGDPGGPLDGS

서열번호 2 : CTRYSDRPSSGPRSRKPKKKNPNKEDKRPR

서열번호 3 : PRSRKPKKKNPNKEDKRPRTAFTAEQLQR

실시예 1-2. 운반 단백질과 펩타이드의 결합

실시예 1-1에서 제조한 펩타이드 3종의 크기가 작아 이를 직접 항원으로 사용하면 면역반응 유도가 어려워 운반 단백질(carrier protein - KLH (keyhole limpet hemocyanin))에 가교제(cross-linker)를 사용하여 연결하였다.

이를 위해, 각 펩타이드, 운반 단백질, 가교제를 1:1:1의 중량비로 녹여 실온에서 2시간 이상 충분히 반응시켰다. 가교제는 EDC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)를 사용하였으며 이 때 결합 완충제는 0.1 M MES (2-[N-morpholino]ethane sulfonic acid)(pH 4.5-5)를 사용하였다(이 때 완충제는 아민기의 가수분해를 유도하는 역할을 함).

반응이 끝난 후에 결합물과 잉여재료를 분리하기 위해 크기 차이를 이용한 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Column (# 89891)으로 분리하였다(KLH 400 Kd, 펩타이드 3.5 Kd로서 결합물과 비결합물의 크기 차이 이용).

이 후 이렇게 운반 단백질과 결합된 펩타이드를 항체를 제조하기 위한 항원으로 사용하였다.

실시예 1-3. 보조제와 유화된 항원 준비

항원을 면역동물에 투여하기 위하여는 생체에서 용해도가 높은 항원이 오래 머물 수 있도록 보조제(adjuvants)와의 결합이 필요하여 보조제와 항원이 유화된 상태의 조성물을 제조하였다.

또한 효과적인 면역 유발을 위해, 실시예 1-2에서 준비한 항원을 총 4번 투여하기로 하였는데, 첫 번째 투여용 항원은 면역반응을 극대화하기 위해 사멸된 mycobacterium을 포함하는 Freund's complete adjuvant (FCA)를 혼합하여 준비하였고, 나머지 3번의 투여용 항원에는 사멸된 mycobacterium이 제외된 Freund's incomplete adjuvant (FIA)을 혼합하여 준비하였다.

이 때, 수용성인 항원과 소수성인 보조제의 효과적인 유화를 위하여 초음파(probe sonication) 방법을 사용하여 항원과 보조제를 혼합하였으며, 혼합과정 중 항원에 열이 가해지지 않도록 4℃를 유지하도록 한다. 항원과 보조제는 1:1 부피로 혼합하였다.

<실시예 2. 항원을 이용한 면역 반응 유도>

실시예 2-1. 면역 동물 선정

사람의 EN2 단백질의 서열에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 동물로는 래트(Rat, wista)를 사용하였다. 면역 반응이 개체에 따른 정도가 다를 수 있으므로 개체 특이성을 고려하여 각 펩타이드 서열당 7주령의 암컷 9 개체에 면역 반응을 유도하였다.

실시예 2-2. 면역 동물 실험 시간표 및 주입 방법

면역 유발을 위한 전체 시간표는 도 2의 과정을 따랐으며, 첫 번째 항원 투여를 수행한 후, 2주 후에 재투여하였고, 이 후 10일 간격으로 2회 더 투여하여 총 4회 투여하였다. 두 번째 투여 후 미정맥 체혈을 통하여 면역 반응 정도를 확인(test bleeding)하였다. 투여방법은 피내 주사 방법(Intradermal injection)을 사용하였고, 1회 투여에 2~3 군데를 선정하여 1 개체당 총 200 ㎕를 주입하였다.

<실시예 3. 면역동물에서의 혈청 분리 및 면역글로블린 G (IgG) 정제>

실시예 3-1. 면역동물에서 혈청 분리

실시예 2-2에서 항원이 투여된 면역동물을 도 2에 따라 희생시키고 흡입 마취제(Isoflurane)를 사용하여 개복 후 후대정맥에서 전혈을 채취하였다. 전혈은 37℃에서 1시간 유지 후 2000 rpm에서 20 분간 원심분리하였고, 원심분리된 상층액에서 각 개체당 4~5 ㎖의 혈청을 얻었다.

실시예 3-2. 면역글로블린 G (IgG) 분리

혈청에는 알부민을 포함한 여러 단백질이 함유되어 있기 때문에 항체의 역가와 특이성을 높이기 위해 면역글로블린 G(IgG)만을 정제하였다.

래트 IgG에 특이적 결합을 하는 protein G가 결합된 resin (Protein G Sepharose 4 Fast Flow-GE Health care)을 사용하여 분리 및 정제하였다. 분리된 혈청을 완충제(PBS)1:1 부피로 희석하여 packing된 resin에 결합시키고 bead 2-3배 부피의 완충제로 washing한 후 elution을 진행하였다.

Elution 완충제는 protein G와 IgG와 특이적 결합을 끊기 위해 pH 2-3 완충제를 사용하였다. Elution 후에 바로 정상 pH로 올려주기 위해 Tris(pH 9)를 사용하였다.

Elution은 한 혈청 당 10개의 분획으로 나누어 받았으며 SDS-PAGE 겔에서 확인한 바, 7~9 분획에서 IgG를 얻었고(도 3a 및 3b는 peptide 3에 대한 결과로서, 도 3a에서 serum albumin을 통해 확인된 혈청 시료를 분획하여 도 3b에서 IgG의 존재를 확인함), 이를 각 펩타이드에 대해 각각 확인한 바, 도 3c와 같이 펩타이드별 혈청의 다른 단백질을 제거한 순도 높은 최종 IgG 임을 확인하였다(Whole:항체 전체, HC:항체의 heavy chain, LC:항체의 light chain). 최종적으로 얻은 각 펩타이드의 항체(IgG)는 정량 후 PBS/ 0.2% sodium azide/20% glycerol 완충제에 희석하고 분주하여 -80℃에 보관하였다. 이 때, 각 peptide 서열과 개체에 의해 얻은 IgG의 양은 하기의 표 1에 나타내었다.

Ag	Mouse	Conc.(㎎/㎖)	Vomume(㎕)
EN2-1	1	10	500
	2	10	300
	3	10	500
	4	10	500
	5	3	500
	6	10	500
	7	10	500
	8	10	500
	9	10	500
EN2-2	1	10	500
	2	10	300
	3	8	300
	4	10	500
	5	10	500
	6	10	500
	7	10	300
	8	10	500
	9	10	300
EN2-3	1	10	500
	2	10	300
	3	10	500
	4	10	500
	5	5	500
	6	5	300
	7	10	500
	8	7	300
	9	10	500

< 실시예 4. 재조합 인간 EN2 단백질의 발현 및 정제>

제작된 항체의 민감도와 정확성을 실험하기 위해 재조합 EN2 단백질을 제조하였다. 이를 위해 pET28b/EN2 plasmid를 대장균(BL21/DE3)에 형질전환하여 0.1 mM IPTG와 37℃ 조건에서 EN2 단백질을 과발현시켰다. 과발현된 대장균 세포를 lysis buffer (20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1x protease inhibitor cocktail, 1 mg/㎖ lysozyme)와 함께 초음파로 분쇄하고 원심분리하여 수용성 단백질만을 얻었다. 이를 Ni-NTA agarose bead에 EN2/His Tag과 Ni에 친연성 결합시켰다. 이후 elution buffer (20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1x protease inhibitor cocktail)로 EN2 단백질만을 분리하였고 storage buffer (50 mM Tris-HCl at pH 8.0, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 20% glycerol) 상태에서 투석(cut off 10K)을 통하여 imidazole을 제거한 후 BCA(Bicinchoninic acid) 정량 및 280nm 흡광도에 의해 단백질 농도를 정량하였다.

<실험예 1. 전립선암 세포주에서 EN2 단백질의 검출 능력 평가 (PC3 세포 주)>

실험에 사용할 전립선암 세포주 PC3(ㄾ CRL-1435™)를 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 구입하며 이를 37℃, 5% CO₂의 가습 배양기에서 25mM HEPES가 포함된 RPMI-1640 (PC3) 또는 RPMI-1640(LNCaP) 배지에 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 첨가하여 배양하였다.

EN2 발현이 높은 전립선암 세포주 PC3에서 항체(실시예 3에서 얻은 것)의 항원 검출 능력을 western blot 실험 방법으로 확인하였다. 이 때 본 발명에서 제조한 항체와 시판 EN2 항체(Company A, Company B)와 비교하여 실험하였다.

Company A : Thermo Fisher Scientific (PA5-14363)

Company B : Novus Biologicals (H00002020-M03)

이를 위해, 배양된 PC3를 protease inhibitor cocktail을 포함하는 RIRA buffer에 세포를 융해시키고 12000 rpm에서 20분간 원심분리하여 수용성 단백질을 수거하고 BCA 정량법을 통하여 단백질 총량을 정량하였다.

이를 보다 자세히 설명하면, PC3를 2x10⁶개씩 100cm² 배양접시에서 3일 동안 배양한 후, 차가운 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 2회 세척하여 세포를 수집하였고, protease inhibitor cocktail을 포함하는 RIPA 완충액에서 30분 동안 얼음에서 용해하였다. 세포 용해액을 13,000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 상층액을 취하여 BCA 방법으로 단백질의 농도를 측정하고, 용해된 단백질들을 4-15% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. PAGE를 통하여 분리된 단백질들은 PVDF 멤브레인으로 옮기고 각각의 EN2 항체를 5% skim milk/TBS-T(Tris- saline+Tween20)에 1:2000의 비율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다음날 TBS-T로 3번 세척한 후 홀스라다시 페록시다아제(HRP)가 접합된 항-RAT 항체를 5% skim milk/TBS-T에 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시켰다. TBS-T로 3번 세척한 멤브레인은 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 사용하여 2차 항체에 결합되어 있는 peroxidase의 기질인 luminol이 peroxidase에 의해 산화되면서 푸른색 빛을 내는 것을 X-ray 필름에 감광시켰다.

이 때, SDS-PAGE 겔에 PC3 세포로부터 추출된 전체 단백질을 40 ㎍/well, 20 ㎍/well, 10 ㎍/well의 양으로 well 당 20 ㎕씩 96well plate에 loading 하고 웨스턴 블롯을 수행한 후 동일한 농도를 갖는 항체(6.6 nM)를 이용하여 각 단백질의 검출능력을 확인하였으며, 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4a는 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 band 사진이며, 도 4b는 이 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 항체들(Peptide 1~3을 항원으로 하여 실시예 3에서 제조한 것)이 기존 시판 항체들(Company A, Company B)에 비교하여 EN2 단백질의 검출 결과가 현저하게 우수한 것으로 나타난다(10 ㎍/well의 단백질 처리 조건을 기준으로 했을 때 시판 항체와 비교하여 Peptide 1~3을 항원으로 하여 제조한 항체는 2~10배의 검출 정도의 차이를 보임).

<실험예 2. 전립선암 세포주에서 EN2 단백질의 검출 능력 평가 (LNCap 세포 주)>

EN2의 발현이 높은 것으로 알려진 또 다른 전립선암 세포주 중 하나인 LNCaP(ㄾ CRL-1740™) 세포를 사용하여 실험예 1과 동일한 조건으로 항체의 검출 능력을 검증하고, 이에 대한 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5a는 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 band 사진이며, 도 5b는 이 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

도 5를 참고하면, 이번 실험에서도 기존 판매되고 있는 항체(Company A 및 Company B)와 비교하여 본 발명의 항체(실시예 3에서 제조한 Peptide 1~3에 대한 항체)가 우수한 선택적 항원 검출능이 있는 것으로 확인된다. 따라서 실험예 1 및 2의 결과를 통해 실시예 3에서 제조한 항체들이 세포 특이적 결합이 아닌 EN2 항원에 대한 선택적 결합 반응을 보이는 것이 확인된다.

< 실험예 3. 재조합 EN2 단백질을 활용하여 민감도 평가>

전립선암 세포 단백질 대신, 실시예 4에서 제조한 사람 EN2 재조합 단백질을 최대 50 ng/20㎕(2.5 ng/㎕)(60 nM)부터 최소 5 ng/20㎕(0.25 ng/㎕)(6 nM)까지 농도별로 희석하여 앞의 실험예 1과 동일한 조건으로 항체의 민감도를 확인하였으며, 이에 대한 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6a는 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 band 사진이며, 도 6b는 이 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

그 결과 도 6과 같이 3가지 타입 펩타이드에 대한 항체 모두 최소 5 ng/20㎕(0.25 ng/㎕)(6 nM)까지 EN2 단백질이 검출되는 민감도를 보였다. 이는 본 발명에서 제조한 항체들이 실제 환자의 소변에서 EN2 단백질 농도를 검출할 수 있는 항체 민감도를 갖고 있음을 나타낸다(전립선암 환자의 소변 EN2 단백질 농도 범위: 3.1~65.4 nM : Sci.Rep. 2013;3:2059).

<실험예 4. 소변 내 EN2 단백질의 민감도 평가>

본 발명에서 진단대상의 시료가 전립선암 환자의 소변임을 고려하여 분비된 소변 내의 EN2 단백질을 검출할 수 있는지 실험하였다. 이를 위해, 재조합 단백질을 재조합 EN2 단백질을 일반인의 소변에 전립선암 환자의 소변에서 확인되는 농도로 첨가하여 이를 바로 시료로 사용하였다.

이 때 재조합 단백질의 농도와 전체 실험과정은 실험예 3과 같은 조건으로 진행하였고, 이에 대한 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7a는 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 band 사진이며, 도 7b는 이 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

실험결과 도 7과 같이 소변에 포함된 유/무기물의 영향력에도 불구하고 세 가지 펩타이드를 인지하는 각각의 항체 모두 최소 농도 0.25 ng/㎕(6 nM)까지 항원을 검출하였다.

<실험예 5. 세포주(LNCap)에서 면역 형광 염색 실험을 통한 검출능 평가>

전립선암 세포주 (LNCap)의 세포 내 EN2 단백질을 항원 항체 특이성에 의해 검출하였다. 1차 항체는 실시예 3에서 제조한 3종의 항체를 사용하고 2차 항체는 anti-rat IgG/FITC를 사용하였으며 세포질 내에 분포하는 항원과의 결합능은 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Microscopy)을 통하여 분석하였으며 이에 대한 형광염색 사진은 도 8에 나타내었다. 도 8a는 Peptide 1, 도 8b는 Peptide 2, 도 8c는 Peptide 3에 대한 결과를 나타낸다.

도 8을 참고하면, 3가지 타입 항체 모두 세포 내 분포 된 EN2 단백질과의 결합을 확인할 수 있으며, 이를 통해 non denaturation(비변성) 조건의 항원 검출에도 본 발명의 항체가 용이하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 6. 재조합 EN2 단백질을 활용하여 민감도 평가 (K _d : dissociation constant값 측정)>

재조합 EN2 단백질을 4℃에서 밤새 96-well plate에 붙이고 2% skim milk를 포함하는 TBST 용액으로 37℃에서 blocking을 진행하였다. 이 때 재조합 EN2 단백질을 250 ng/well로 고정하고 항체를 계대 희석하여 진행한 실험(도 9), 항체를 고정하고 항원을 0.5~50 ng/㎖ 으로 희석하여 진행한 실험(도 10)을 각각 수행하였다.

이후 각 well 마다 항체를 1차 항체로 처리, 2차 항체는 HRP가 conjugation 된 anti-rat IgG를 1/10000으로 희석하여 처리하였다. 반응 후 TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 용액을 사용하여 발색하였으며 1N sulfuric acid를 사용하여 발색 반응을 종료하였다.

ELISA reader를 통하여 결과값을 수치화하고, prism program 의 association kinetics 방법을 활용하여 Kd 값을 산출하여 도 9에 나타내었고, 도 10에는 각 항체를 통해 검출되는 EN2의 함량을 확인하였다.

도 9를 참고하면 해리상수 Kd는 항체결합부위의 1/2를 점유하는 데에 필요한 항원의 양을 이르는 것으로 항원에 대한 친화도가 큰 항체일수록 작은 해리상수를 갖게 된다. 산출된 항체의 Kd 값은 각각 peptide 1; 4.087 x 10^-13, peptide 2; 5.825 x 10^-12, peptide 3; 7.739 x 10^-13 으로 나타났다. 또한 peptide 3에 대한 항체가 가장 높은 값을 나타내었지만 일반적인 자연적 항체의 Kd 값이 10^-7~에서 10^-10의 값을 나타내는 것에 비해서 개발된 항체의 Kd 값 10^-12에서 10^-13 의 수치로 모두 높은 역가를 나타내고 있으며 이를 통하여 항원인 재조합 EN2 단백질과 높은 결합력을 보이는 항체(실시예 3에서 제조한 본 발명 항체)가 제작되었음을 알 수 있다.

또한 도 10 및 이를 수치로 나타낸 표 2를 참고하면 ELISA 실험 방법에서는 최소 농도 0.5 ng/㎖에서까지 세 항체 모두 EN2 항원 검출이 가능한 것이 확인된다.

	ELISA O.D. value (EN2 protein)
	0 ng/㎖	0.5 ng/㎖	2.5 ng/㎖	5 ng/㎖	10 ng/㎖	25 ng/㎖	50 ng/㎖
Pep1	0.22250	0.25425	0.28450	0.32425	0.42175	0.59700	0.86575
Pep2	0.22575	0.25775	0.32350	0.41600	0.62900	1.04650	1.68600
Pep3	0.21350	0.24575	0.28825	0.33400	0.46075	0.74275	1.09133

따라서, 이러한 결과들을 통하여 본 발명의 항체는 단순히 암 존재여부를 판정하는 정성적 검사뿐 아니라 소변에서 EN2 검출과 암 진행의 상관관계를 수치화하여 암 진행 여부를 가늠할 수 있는 정량적 검사에도 활용 가능한 우수한 항체임을 알 수 있다.

<실험예 7. 전립선암 환자 소변 샘플에서의 유효성 평가>

실제 검사용으로 활용된 전립선 환자 소변 샘플에서의 EN-2 검출능을 평가 하기 위하여 3명의 전립선암 환자 샘플(P1,P2,P3)을 받아 10000 g에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 모아 웨스턴 블럿에 활용하였다. 소변 샘플 15 ㎕에 4x sample buffer 5 ㎕를 혼합하여 100℃ 5분간 끓여 웨스턴 블럿을 실시하였다. 여기에 사용된 항체 농도는 3.3 nM이며, 음성 대조군(H.C.)으로는 건강한 남성 소변을 사용하였고, 이에 대한 결과는 도 13에 나타내었다. 이 때, 각 환자들이 전립선암 환자임을 나타내는 PSA 발현 결과를 실험예 6과 같은 방법으로 ELISA를 수행하여 도 12에 나타내었다.

도 13을 참고하면, 본 발명의 3종 항체 모두 실제 환자샘플에서도 EN-2 검출능이 우수함을 확인할 수 있다.

<110> Sung Kyun Biotech co., ltd. <120> Immunogenic segment peptide of EN2 protein, or antibody composition specifically detecting the peptide <130> 2017-0038 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Gly Asp Gly Glu Gly Gly Ser Lys Thr Leu Ser Leu His Gly Gly 1 5 10 15 Ala Lys Lys Gly Gly Asp Pro Gly Gly Pro Leu Asp Gly Ser 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Thr Arg Tyr Ser Asp Arg Pro Ser Ser Gly Pro Arg Ser Arg Lys 1 5 10 15 Pro Lys Lys Lys Asn Pro Asn Lys Glu Asp Lys Arg Pro Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Arg Ser Arg Lys Pro Lys Lys Lys Asn Pro Asn Lys Glu Asp Lys 1 5 10 15 Arg Pro Arg Thr Ala Phe Thr Ala Glu Gln Leu Gln Arg 20 25 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Asp Lys Arg Pro Arg Thr Ala Phe Thr Ala Glu Gln Leu Gln Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Glu Phe Gln Thr Asn Arg Tyr Leu Thr Glu 20 25 <210> 5 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ala Gly 1 5 10 15 Gly Glu Gly Gly Ala Ser Gly Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly 20 25 30 Ser Glu Gln Leu Leu Gly Ser Gly Ser Arg Glu Pro Arg Gln Asn Pro 35 40 45 Pro Cys Ala Pro Gly Ala Gly Gly Pro Leu Pro Ala Ala Gly Ser Asp 50 55 60 Ser Pro Gly Asp Gly Glu Gly Gly Ser Lys Thr Leu Ser Leu His Gly 65 70 75 80 Gly Ala Lys Lys Gly Gly Asp Pro Gly Gly Pro Leu Asp Gly Ser Leu 85 90 95 Lys Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Asp Leu Ser Val Ser Ser Asp Ser 100 105 110 Asp Ser Ser Gln Ala Gly Ala Asn Leu Gly Ala Gln Pro 115 120 125

Claims (10)

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6. 하기의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드만을 특이적으로 인식하여 EN2(Engrailed-2) 단백질의 유무를 진단하는 것을 특징으로 하는 EN 항체 조성물.
   서열번호 1 : PGDGEGGSKTLSLHGGAKKGGDPGGPLDGS
7. 하기의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드만을 특이적으로 인식하여 EN2(Engrailed-2) 단백질의 유무를 진단하는 것을 특징으로 하는 항체 조성물.
   서열번호 2 : CTRYSDRPSSGPRSRKPKKKNPNKEDKRPR
8. 하기의 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드만을 특이적으로 인식하여 EN2(Engrailed-2) 단백질의 유무를 진단하는 것을 특징으로 하는 항체 조성물.
   서열번호 3 : PRSRKPKKKNPNKEDKRPRTAFTAEQLQR
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단제.
10. 삭제

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