JPH06506824A - モノクロナール抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクロナール抗体 隨血圀！ 本発明は、Ｋ１と称するモノクロナール抗体、およびその使用方法に関する。

特に、Ｋ１モノクロナール抗体は、数種の癌の治療と診断に用いることが出来る 。

１１蓋１ 人間の転移癌に対する、放射線あるいは化学療法のような現在の治療方法では、 急速に成長する癌細胞を選択的に殺す薬剤が中心となっている。残念ながら、骨 髄あるいは消化管上皮のような正常な重要組織とは違って、腫瘍の多くはあまり 早い速度では成長しない。

もう１つの治療アプローチとして、腫瘍細胞表面の特異な化学構造を標的とし、 最も頻繁に採用される例では、この標的分子と選択的に結び付く抗体を用いる方 法が挙げられる。この種の治療アプローチの１つに、抗体と植物毒素または細菌 毒素のような細胞殺傷性物質とを結合させたものがある。この抗体・毒素錯体、 言い替えると免疫毒素類（ｉｍｍｕｎｏ　ｔ　ｏｘ　ｉ　ｎ　ｓ）は、組織培養 及び動物実験による腫瘍系モデルにおいて選択的な腫瘍細胞殺傷効果を示すこと が認められている（Ｐａｓｔａｎ　ｅｔ　ａｔ、、Ｃｅ１ｌ　４７：　６４１− ６４８　（１９８６））。

ヒトの治療用としてこのような腫瘍特異性を持つ抗体を遊離しようと多くの試み がなされたが、選択的に腫瘍細胞のみに結び付いて、他の正常な重要組織には結 び付かない抗体として同定されたものは、現在でもなお極めて小数である。従っ て、免疫主導の治療を行ってゆく上で、このような腫瘍特異性を持つ抗体を遊離 することは重要である。

モノクロナール抗体方法論は、テラー／ミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　 Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）よって初めて発表され（Ｎａｔｕｒｅ　１５６：４９５−４ ９７　（１９７５））、さらにコブロフスキーら（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　ｅｔ　 ａｌ）の特許（米国特許番号第４．１７２，１２４号）で開示されたものがあり 、これにより、抗体を純粋な形で遊離して治療薬にすることが出来るようになっ た。しかしながら、二つの理由からこれまでに遊離された多くの抗体を使用する ことができなかった。腫瘍細胞に反応するモノクロナール抗体は、重要なヒトの 正常組織にも反応してしまうのが第一の理由。第二の理由としては、多くの遊離 抗体は表面成分に結び付くが、この表面成分がトキシン共役系かエンドサイト− シスにより細胞内に入り込むのを能率的に仲介しないことが挙げられる。本発明 は、選択的にある種のヒト腫瘍に結び付くが、多くの正常７　な重要組織のには 結び付がないモノクロナール抗体、Ｋ１に関する。このモノクロナール抗体は、 免疫毒素の標的用成分として添加されると、毒性物質を効果的に細胞内には入り 込ませることが出来ることが認められている。

従来から、卵巣癌患者の血漿に流れ込む抗原と反応する抗体が遊離されていた。

この流入抗原ＣＡ１２５と反応する抗体０Ｃ１２５は、−次および再発卵巣癌の 診断に用いられてきた（Ｂａｓｔ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｌ−ふユユユ、ユ」！ヨ、」４６８：１３３１　（１９８１））。しかしながら 、Ｋ１モノクロナール抗体が細胞表面上で認識するエピトープは、０Ｃ１２５が 認識するエピトープとは全く異なる。さらに、Ｋ１と反応する抗原は、卵巣癌患 者の血漿に流れ込まない。血漿に流れ込まないことがら、血流中に注入された直 後でも循環している抗原により中和されることないので、Ｋ１は、免疫療法に好 適の抗体である。

本明細書で引用する米国特許および文献はすべて、引用することにより本明細書 の一部とする。

光遭じと４石 本発明は、Ｋ１と称するモノクロナール抗体およびその使用方法に関する。

特にこの抗体は、数種の腫瘍の治療と診断に際して、治療力のある標的剤として 用いることが出来る。

さらに詳しくは、本発明は、霊長類の正常組織、培養されているヒトの悪性細胞 系およびヒトの腫瘍において発現することを特徴とする細胞表面の抗原に対して 特異的なモノクロナール抗体を産生じ、且つ該抗原が培養基または血漿に流入し ないハイブリドーマに関する。このハイブリドーマ細胞系は、１９９０年１０月 １０ＥＩ、寄託番号ＡＴＣＣＨＢ　１０５７０として寄託されている。

本発明は特に、上記の特性を持つ細胞表面の抗原に特異的であり、且つハイブリ ドーマによって産生されるモノクロナール抗体そのものに関する。このモノクロ ナール抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のクラスに属する。

上記した培養されたヒトの細胞系は、例えば、０ＶＣＡＲ−２，０ＶＣＡＲ−３ ，０ＶＣＡＲ−４，１８４７、ＨＴＢ　７７、ＨｅＬａ　Ｓ３、ＫＢ、ＡＧＳお よびＨＴＢ１０３よりなる群から選ばれる。抗原を表現する霊長類の正常組織は 、例えば中皮である。ヒトの腫瘍は、例えば卵巣癌腫、食道癌腫または頚部（Ｃ ｅｒｖｉｃａｌ）癌腫由来のものである。

さらに本発明は、治療効果を生むのに充分な量のモノクロナール抗体の複合体（ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を治療を必要としている患者に投与することよりなる癌の 治療方法を提供する。

治療対象となる癌の種類は、例えば卵巣癌である。

抗体は、例えば毒素（ｔｏｘｉｎ）、放射性同位体または化学療法剤と複合させ る。抗体は細胞殺傷作用を仲介するため修飾しテモよい。

さらにまた本発明は、診断を行うのに充分な量のモノクロナール抗体を患者に投 与することよりなる癌の診断方法を提供する。モノクロナール抗体には放射能標 識を付してもよい。

さらにまた本発明は、癌の成長を抑制するに充分な濃度のモノクロナール抗体と 医薬的に許容できる担体を含有してなる医薬組成物をも提供する。

さらにまた本発明は、患者から組織または体液サンプルを採取する工程と、モノ クルナール抗体を上記サンプルに添加する工程と、上記サンプル中の抗体の存在 を視覚化する工程とから成る癌の診断方法を提供する。

区１１引薩ｍ礼朋 図１は、卵巣癌患者の血清サンプルを、放射能標識を付した抗体により検査した 結果を示す図である。

Ｋ１または０Ｃ１２５をマイクロタイター・ウェル中に置き、表８に類似の手順 でもって患者の血清サンプルまたは培養基の上澄み液をこれに添加した。Ｋ１（ Ｋｌ系）で前処理をした別のウェルにヨウ素化した放射性Ｋｌを入れたもの、あ るいは標識をっけない０Ｃ１２５抗体（ＯＣ１２５系）で前処理をしたウェルに 放射性０Ｃ１２５を入れたものと、前掲のウェルとを一緒にインキュベートした 。表８と同じように、０ＶＣＡＲ−３培養基の上澄み液（濃縮物を１＝３で希釈 したもの、測定値は２で除す）では、０Ｃ１２５の結合が標識を付けた０Ｃ１２ ５によって検出された。

これとは対照的に、結合したに１加えてインキュベートした上澄み液では、ヨウ 素化に１を用いて検出を図ったが、検知できなかった。精製ＣＡ　１２５抗原の 標準サンプルは、０Ｃ１２５系とは反応することが認められたが、Ｋ１系とは反 応しなかった。患者の血清サンプルは０Ｃ１２５系とは各種強度のシグナルを示 したが、ＫＩ系とのシグナルは認められなかった。Ｋ１系は、トリプシン処理に より０Ｃ１２５が破壊された０ＶＣＡＲ−３細胞のトリプシン塩（ｔｒｙｐｓｔ ｎａｔｅ）では弱いシグナルを検出したが、０Ｃ１２５系ではシグナルは認めな かった。これら二つの標識を各種水準の充分な放射能が認められ、充分な感度を 有することが認められた。

Ｂの−　な！日 本発明のに１モノクロナ一ル抗体を産生ずる方法としては次が挙げられる。先ず 、例えば過ヨウ素酸塩で次に、免疫性卵巣癌細胞に対して反応性のあるマウスの 膜層細胞を分離する。この反応性膜層細胞とＡＧ８マウス骨髄腫細胞とを融合し て、ハイブリドーマあるいはクローンを作る。そして、免疫細胞に対する反応性 を基準にクローンを選定する。続いて、このクローゝ　ンを卵巣癌と正常組織に 暴露して二次スクリーニングを行う。この方法で選んだクローンは、癌との反応 性は高いが、ヒトの正常細胞とは反応しない。抗体は、コ　マウスで腹水生産し たクローンから作ったり、クロー鷺　ンの培養上澄み液を採取して、得ることが できる。そゝ　して抗体を精製することができる。

この抗体に反応するエピトープの所在位置と分布によって、抗体が癌の治療と診 断に効用があるか、否かが決って来る。この点については、ヒトの正常組織と癌 およびカニクイザルの正常組織を用いて試験を行う。

次の表１に、反応性の分布とに１抗体と反応するエピトープの位置を示す。特に 表１には、Ｋ１反応性エピトープが腹膜、６膜、胸膜の中皮細胞の装膜に存在し ていること、および限られてはいるが、気管上皮、扁桃腺上皮と輸卵管上皮にも 分布していることを示している。

表１　ヒト組織とサル組織内のＫｌと０ＣＩ２５の免ｇＥＭＩｌ化学分析的局在 表４（Ｉ！き） 正常組織　ＫＩ　０ＣＩ２５ 肝臓　（−）（１／１）　（−）（Ｉハ）腎Ｈ（−１（１／Ｉ）　（−１（１／ ｌ）心筋　（−）（＋／＋１　（−Ｈ１／１）脳　（−０２／２）　（−１（２ ／２１を髄　（−１（１／１１　（−）（＋、／Ｉ）リンパ節　（−１（＋／ｌ ）　（−）（１／＋１骨格筋　（−１（１／１）　（−１（Ｉハ）末稍神経　（ −３（１ハ）　（−１（１／１１食道　（−）（１／＋１　（−Ｈ１／Ｉ）小１ −　（−ン（１／ｌＮ＋＋　ＷＩＭ）　（−）（Ｚ／２）Ｄ＋　漿＊＞胃　（− ；手す　漿履ン（２／２）　（−、漿１町を除くン（２／２）結ＩＩ　（−）（ ｒハ）（＋＋　Ｍｉｌｌｉ）　（−：　ｊｊＦＩＬＧ除＜　）（＋／Ｉ）膀胱　 （−）（Ｊハ）　（−）（１／］）＃ｌｌ　（−）（２／２）　（−）（＋／２ ）（＋１）（１／２）唾ｊｌｉｌｌ　（−＞（２／２）　（−）（３／’Ｊ）乳 腺　（−）（Ｉハ）　（−３（Ｉハ）膣ＩＩ　（−３＋Ｉハ）　（−）（１／ｌ ）甲状腺　（−）（１／Ｉ）　（−Ｈ１／＋１上皮小体　（−）　（１／Ｉ　） 　（−）　（Ｉハ）卵Ｊｌ！　（＋４　ｆｉｌｌ）（＋／ＩＩ　（＋＋　（ｆｆ ｉ膜）（＋／＋１子宮頚萱　（＋＋　先端線上皮）（１／＋１　（＋÷先先端上 上皮（２／２）子宮　（÷先端子宮内膜；＋十漿膿Ｈ１／＋１　（＋＋先軒宮内 膜：十十漿装膜１／ｌ）胸膜　（−）（＋ハ）　（−１（ｌハ）気管　（＋＋　 基底上皮；−Ｕ）　（＋＋　先端上皮、＋十不均−騨）（１／ｌ）舌　（−）（ ＋／１）　（−）（ｌハ）この試験を行うに当り、新鮮な組織を凍結し、低温で サンプル片を作成、アセトンで後固定（ｐａｇｊ−ｆｉｘル、袴に表示する場合 を除きＩＯｕｇ／■１の一次抗体でインキュベートしたものを用いて免疫組織化 学分析を行った。標識には、西洋ワサビペルオキ７ダーゼに複合しているヤギの アンチマウス免疫グロブリンＧをジアミノベ／ジンを用いて展開して、親和力に よってＭＳｆＬ、先ずへ７トキシリン、続いて四酸化オスミウムで処理したもの を用いた。

（−１−闇夜なＬ；＋−中等度；＋十冨強い）（に／ｙ−テストされた１個のサ ンプルのうち、このパターンがＹ信のサンプルに認められた）　（不ＩＩ　−ｈ ｅｔｅｒｏ（ａｎｅｏｕｔンに１の反応性を、従来から開示されている抗体であ る０Ｃ１２５（Ｂａｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　６８ ：１３３１（１９８１））と比較してみよう。例えば、サルの気管では、Ｋ１抗 体は分化が進んでいない上皮の基底細胞に０Ｃ１２５よりも高い選択性を持って 反応する。気管支と子宮内膜についても、これら二つの抗体間に違いが認められ る。また、Ｋ１は中皮に強く反応する。

Ｋ１あるいは０Ｃ１２５と反応する抗原エピトープか存在することから、これら の抗体を免疫療法に使用すると正常組織部位が危険であると考えられるかも知れ ない。しかしながら、この抗体は健全な細胞の先端部位で反応するので、腫瘍部 位と較べれば、同じ正常細胞の基底表面を間接的に浸す血流がこれらの反応性部 位に近づくことは出来にくい。Ｋ１と０Ｃ１２５とが上記のように異なることか ら、これらの抗体に反応するエピトープの性質、恐らくは分子の種類か化学的に 大きく異なっていると考えられる。

各種癌細胞かに１とどの様に反応するかを検討することにより、Ｋ１モノクロナ ール抗体の性質がより詳細に明らかになると共に、診断薬治療薬としての効用も 確立される。　（下記表２参照）。例えば、卵巣腫瘍、子宮頚部腫瘍および胃腫 瘍由来の各種細胞系はに１エピトープを表現していることはすでに立証されてい る。

コレラノ細胞ニハ、例えば０ＶＣＡＲ−２，０ＶＣＡＲ−３、○ＶＣＡＲ−４、 １８７４、ＨＴＢ７７、　ＨｅＬａ　Ｓ３、ＫＢＳ　ＡＧＳＳ　ＨＴＢ１０３　 （例えば、Ｋａｔｏ　ＩＩＩ）がある。しかしながら、これらの細胞系のあるも の（例えば、１８４７、ＡＧＳ、Ｋａｔｏ　ＩＩＩ）は、ＱＣ−１２５と反応し ない。

０Ｃ１２５抗原を発現しないある細胞とに１が反応し、Ｋ１抗原を発現しないあ る細胞と０Ｃ１２５が反応するところから、これら二つの抗体はエピトープが異 なっているばかりでなく、分子も全く異なっているものと思われる。また、ある 種の細胞系かに１と均質な反応をしているので、生体内でもある種の癌がこの抗 体に対して均質な反応を示す可能性も考えられる。

一つの癌の細胞全部と均質な反応をすることは、−区分の癌細胞ばかりではなく 、一つの癌のあらゆる細胞を撲滅して免疫療法を成功させる大きな要因となる。

表２　蛍光抗体法によるヒトの培養細胞内のＫｌと０Ｃ１２５の局在細胞の種類 　Ｋ１．　０Ｃ１２Ｓ ＯＶＣＡＲ−２（卵巣癌）＋＋＋十　不均一（３０駕）ＯＶＣＡＲ−３（卵巣癌 ）　＋＋　不均一　＋＋＋　不均一０ｖＣＡＲ−４（卵巣癌）　＋十不均−十十 ＋十不均−０ＶＣＡＲ−５（卵巣癌） １δ４７（卵巣癌）十＋＋ ＨＴＢフフ（卵巣癌）十＋十不均−（ｆｆ０％）　＋十不均−（１０χ）２７８ ０　（卵巣癌） １１７Ｎ３３　（子宮頚部癌） １１ｅＬａ　Ｓ３　（子宮頚部癌）　＋＋　＋＋罠Ｂ（子宮頚部癌）　＋＋＋　 −（（Ｓ％＋＋）＾ａｓ（ｊｌＦ癌）＋＋ １１７ＢＩ０３　（肩痛）＋＋ ＦＥＭＸ　（黒色Ｗ） ＴＩＴ−２９（結腸癌） Ａ４３１　（類表皮癌）　＋＋＋　（＜５蔦）１１７８２Ｇ　（乳癌） ＭＤ＾−ＭＢ−４６８（乳癌） ＭＣＦ−７（乳癌）　＋＋＋（（１％）ＤＵ１４５　（前立腺癌）　十十不均− 不均一＝ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　；　−＝なし；＋＝若干：十＋＝中等度 ：　＋＋＋＝強い：＋＋＋→−＝非常に強い 癌に対してに１と０Ｃ１２５の反応かどのような発現度となるのか、従ってこれ ら二つの抗体と反応するのはとのような抗原、具体的にはどのようなエピトープ であるのかを検討した。　（表３と表４とを参照）。

Ｋ１は、例えば多くの卵巣癌を始め、他にも食道癌、子宮頚部癌など数種の癌に 反応する。これらの実験結果によれば、各種腫瘍のに１と０Ｃ１２５が異なる細 胞、または、異なる水準で発現したエピトープを認識できることを示しており、 従ってこれらの抗体で認識された二つのエピトープは、恐らくは同一のエピトー プではない。

表３　ヒトの腫瘍とに１および０ＣＩ２５との反応に１または０Ｃ１２Ｓの　を 六す 腫瘍中の反応性細胞のパーセント別区分ＫＩ　Ｉ　２　１　０　４　１　０　１ 　０　０　０　２　７（４＋＊ｕｅ、）　ｌ９ＯＣＩ２５　８　３　０　０　０ 　０　０　０　１　１　０　０　Ｇ（４ｍｕｃ、）　１９［（ｂｒｅａｓｔ　ｃ ｉｒｃｌｎｏｍａ）！ｕｌ！１（ｃｏｌｏｎ　ｃａｒｅ！ｎｏｓｉ）ＫＩ　ＯＯ Ｇ　Ｉ　Ｉ　ＯＯｌ　０　０　０　０　２０　２３皇ｆｉ（ｅｓｏｐｈａｇｅｍ ｌ　ｅａｒｅｌｎｏｓａｌｆｉ（ｌｕｎｇｅａｒｅｉｎｏ＊ｍ） 試験対象としたその他腫瘍 前立腺（ｐｒｏ＠ｔａｔａ）癌　（−）　（２／２１　（−）　（２／２）子宮 頚部（ｅｅｒｖｌｃａｌ）癌　（＋＋）　（１／Ｉ）　（＋ｋ）（＋／ｌ）子宮 内１１（ｅｎｄｏｓｅｔｒｌａｌ）癌　（−）　（＋／＋１　（弱く不均一＋） （＋／＋１腫瘍のうちで、単一のパター／が細胞の９５％以上を占めるものが認 められたが、低温で作成したサンプルの保存が限られているため、残りの数パー セントで強度が興なるのか、否かを判定することはできなかった。

表４　Ｋｌと０Ｃ１２５に対する各腫瘍細胞における活性細胞の反応の／（−セ ントと強度の比較さらに、下記の表５に蛍光抗体法による実験結果を示す。Ｋ１ と０Ｃ１２５に反応性を持つエピトープ＋１、「他の」抗体に対する反応と交差 的競合をしな０゜さらにまた、表６と表７（下記）に示すよう１こ、これら二つ の抗体は、細胞に結合する上で交差的（こ競合しない。これらの結果は、Ｋ１と ０Ｃ１２５とｈ（それぞれ全く異なるエピトープを認識することを明確（こ示し ている。

表５　に１と０Ｃ１２Ｓ間の競合的結合の蛍光抗体性分析表６　放射能標識抗体 の競合 マイクロタイタープレートによる細胞の分析競合をしない。

表７　ＫＩおよび０ＣＩ２Ｓ間の生体細胞に対する競合的結合によるＥＬＩＳＡ 分析１２５は競合しない。

さらに、０Ｃ１２５とは異なり、Ｋ１は卵巣癌（ＯＶＣＡＲ−３）の培養細胞の 培養基に流し込んだ抗原とあまり反応しない（下記表８、図１）。従って、Ｋ１ に反応する抗原は、０ＶＣＡＲ−３細胞の培養基には流れ込んで行かないものと 考えられる。卵巣癌患者の血清サンプルの分析試験においても同様の結果が観察 された（図１）。これらの結果から、Ｋ１に反応する抗原は卵巣癌細胞から流れ 出すことがなく、免疫療法で使用する抗体としてに１が０Ｃ１２５よりも遥かに 適していることが分かる。さらにまた、精製されたＣＡ１２５抗原は、Ｋ１と反 応しないことも注目に値する。ＣＡ１２５は０Ｃ１２５に反応する標準抗原であ る。

表８　培養上澄み液の放射能標識の抗体による分析ウェル上の抗体　０ＶＣＡＲ −３培養上澄み液の希釈率　ウェル当りＣＰＭＯＣ１２Ｓ　な　し　＋６６０５ １：３　１５５２９ １　：２４３　３９２ ブランク　３０２ ＯＶＣＡＲ−３細胞に結合するに１と０Ｃ１２５をマイクロタイター・プレート に置き、定量的に酵素とリンクさせた（ＥＬＩＳＡ法）免疫吸着分析（ｉｍｍｕ ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙｓ）を行った。その結果では、Ｋ１と０Ｃ１２ ５とを一緒に添加すると、広い濃度範囲（１−５０μｇ／ｍｌ）において、それ ぞれの抗体単独の値よりも遥かに高いシグナルを出すことが分かった（下記表９ ）。この事実から、エピトープはお互いに物理的に充分に離れていて、両方がそ れぞれ独立して同時に占有されることが出来ると考えられる。

表９　Ｋ１と０Ｃ１２５の両方の付加結合ＥＬＩＳＡ検定ウェル当つりの吸光　 ＸＩＯ’　“ 抗体の濃度（μｇ／ｍｌ）　Ｋ　１単独　０ＣＩ２５単独　Ｋｌ＋０Ｃ１２５付 加的を仮定の予想値０．３　１８０　２３８　３９０　４１８１．０　１９０　 ２６４　４０７　４５４３．０　２００　２６４　４０９　４６４１０．０　２ ００　２８９　４２１　４８９表５から表９の結果から、Ｋ１は、０Ｃ１２５エ ピトープとは全く異なるエピトープと、物理的に離れた部位で反応することを示 している。さらに、Ｋ１と０Ｃ１２５それぞれに反応する抗原が異なっており、 正常細胞と若干の癌において発現が類似してはいるが、この二つの抗体は、免疫 療法で相異なる効用を持つ全く異なった二つの分子である可能性かある。ＣＡ１ ２５は患者の血清に流入する特性ががあり、このため血清による診断に効用があ る。その反面、この同じ特性のためＣＡ１２５抗原が循環して、治療用の抗体複 合体を中和してしまい、免疫療法の効用を減じてしまっている。Ｋ１に反応する 抗原は、癌細胞に結びついたまま残り、免疫毒素による選択的な細胞殺傷を可能 にしうる生存細胞を標的化することを可能にするので、Ｋ１は免疫療法に好適で ある。二つの抗原が全く異なる分子に存在するのであれば、Ｋ１の方が抗原の発 現を司る遺伝子を単離して、潜在的に有用な新しい試薬を作り出し易いかもしれ ない。

かってＣＡ１２５抗原の遺伝子の単離を試みたが、失敗に終わった。恐らく原因 は、○Ｃ１２５抗体に反応する抗原のエピトープの構造の一部に多量の炭水化物 があるせいであろうと思われる。このような炭水化物の付加物は、ＣＡ１２５の 発現を司る遺伝子を単離するために使わなくてはならない細菌系中にはない。

Ｋ１抗原の遺伝子は、細菌の発現系で失われるような炭水化物の付加物またはそ の他の翻訳後の変更を必要としないかもしれないので、Ｋ１抗体は、Ｋ１に反応 する抗原の構造上の遺伝子を単離するのに効用があるかもしれない。この様な遺 伝子を発現することによって、純粋な抗原を作ること、抗原分子上の異なるエピ トープに対して第二世代のモノクロナール抗体を単離すること、および異なる癌 サンプル中のこの抗原の遺伝子を遺伝学的手法でスクリーニングするために用い る試薬を用意することが可能となる。

Ｋ１エピトープのその他の特性を検討した結果では、トリプシンで処理すると細 胞からに１エピトープを取り除くことが出来ることが分かった。また、細胞を過 ヨウ素酸塩で処理すると、０Ｃ１２５との反応性は低くなるが、Ｋ１との反応性 は僅かながら高くなる。細胞抽出物にタンパク質イムノプロット（ｉｍｍｕｎ。

ｂｌｏｔｓ）をしたもの、培養した０ＶＣＡＲの上澄み液、精製したＣＡ　１２ ５抗原についてＳＤＳ・ゲル・プロットを行ったところ高分子量（＞２００キロ ダルトン）の０Ｃ１２５と反応するスミアを示すが、同じ領域でに１とは反応し なかった。従って、Ｋ１抗原の真の化学的性質はどんなものかの点は明らかにな っていない。しかしながら、Ｋ１抗原の化学的性質または構造は、ＣＡ１２５と は明かに異なっている。

上記の諸点から、Ｋ１が数種の癌の治療と診断に有用であることは明かである。

Ｋ１モノクロナール抗体は、多数の、例えばヒトの通常タイプの卵巣癌、子宮頚 部癌、食道癌の表面に発現されたエピトープを認識する。さらに、この抗体が正 常組織と著しい反応をしめすのは、腹膜、胸膜、６膜の装膜表面の中皮とだけで あると思われる。従って、Ｋ１を使用する免疫療法において毒性のある副作用は 、比較的にマイナーであると考えられる。さらに、この抗体とサルの正常組織と は交差的に反応するので、前臨床試験でこれらの反応部位を評価することが出来 る。

より具体的には、Ｋ１は、管理型癌療法においてに１と毒素類、放射性同位元素 あるいは化学療法剤それぞれとの複合体を含み、且つこれらに限定されない免疫 療法剤をつくる際の標的メカニズムとして用いることが出来る。抗体の不変領域 をヒトその他の種の不変領域に変換することを含む遺伝学的手法を用いて、抗体 の構造を操作することが出来る。従って、免疫療法の複合体は、天然のままの抗 体か、遺伝学的手法で変形した抗体の何れかを含有することとなる。さらに、ク ローン化されたに１抗体の可変部遺伝子を用いて融合タンパクを開発することが 出来る。

例えば、Ｋ１マウス抗体遺伝子においてヒト免疫グロブリンＧの不変領域を置換 すると、免疫系が害されていない患者において、抗体が主導する細胞の殺傷を仲 介する上で効用が高いヒト・マウス・キメラ抗体を作ることが出来、免疫毒素と 較べて毒性の低い免疫療法となるであろう。

Ｋ１はまた、放射能イメジーング法を用いる腫瘍塊のイメジーングなど免疫診断 検定の標的メカニズムとして使うこともできる。また、Ｋ１と反”応する抗原の 発現は、癌の病因の診断や、転位の組織分布のための免疫組織化学的な病理診断 手段として有用である。具体的には、組織サンプル（例えば、生検）または細胞 調製物（例えば、パパニコラウ・スミア、卵巣癌浸出物など）を用いて免疫組織 化学的な病理診断を行うことが出来る。この他にも、外科診査の際にに１抗体に 放射能標識をつけて腫瘍の位置診断を行うこともできる。

以下本発明を実施例により詳しく説明する。但し、この実施例を理由として本発 明を限定してはならない。

及立五−１ Ｌ１仄迷り豆１ ヒトの癌細胞系０ＶＣＡＲ−２，３，４，５、Ｋ　Ｂ。

ＡＧＳ、ＭＣＦ−７、ＨＴ−２９、ＭＤＡ−ＭＢ−４６９、ＤＵ１４５、ＨＴＢ ２０およびＨＴＢ３３は、従来から開示されていた（Ｈａｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ａ ｈ　Ｅｄ、（１９８８））。マウスに、ヒトの正常な腎臓の膜に対する耐性を与 えた（Ｍａｔｔｈｅｗ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｎｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ。

１００ニア３−８２　（１９８７））。続いて、このマウスに０ＶＣＡＲ−３細 胞で免疫性を与えた（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ二ｏｃ、Ｎａ ｔｌ工Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４：２４７４−７８　（１９８７））。但し 、培養細胞は過ヨウ素酸塩で処理した。過ヨウ素酸塩で処理するのはアンチ・マ ウス免疫グロブリンＧを細胞表面に結びつけて、マウス抗体を運んでいるリンパ 球に対する免疫抗原の標的特性を向上させるために行うものである。免疫性を与 えられたマウスから膜層を摘出懸濁し、懸濁した牌臓から０ＶＣＡＲ−３と反応 する細胞を選び出し、続いてパンニング法（ｐａｎｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）に より融合させた。選び出された膜層細胞を、ＡＧ８マウス骨髄腫細胞（ＡＧＳ　 ｍｏｕｓｅ　ｍｙｅ　ｌｏｍａ　ｃｅＩＩｓ）と融合させて、クローンを形成し た。２週間後に、生存０ＶＣＡＲ−３細胞にローダミンによる間接蛍光抗体法を 行うスクリーンファスト（Ｓ　ｃ　ｒ　ｅ　ｅｎＦａｓｔ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。

Ｉｎｄ、、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）大規模スクリーニング室を使用し てクローンのスクリーニングを行った。この様にして選ばれたクローンに対して 、ヒトの癌よび正常細胞から冷温によって作ったサンプルにペルオキシダーゼ免 疫組織化学法を実施して、第二次スクリーニングを行った。一つのクローン、Ｋ １が選び出されたか、このに１は卵巣の嚢胞腺癌とは反応したが、正常な肝臓、 腎臓、結腸、小腸、骨髄、小脳、肺、心臓または大脳皮質には反応しなかった。

このクローンは、もともとは、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）抗体クローンであっ たが、バンニング・イソタイプ値スウィッチ法（ｐａｎｎｉｎｇ−ｉｓｏｔｙｐ ｅｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）（Ｃｈａｎｇら、発表準備中）を用いて クローン細胞継代培養をした後、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）変異体に転換した ものである。

再クローンの後、Ｋ１ハイブリドーマの形成されたインタイブを検定したところ 、マウス免疫グロブリンＧ、ｋ（ＩｇＧ、ｋ）であった。免疫グロブリンＧのク ローンをマウスの腹水で生産するか、あるいは培養基の上澄み液を採取して抗体 を得て、タンパクＡ　ＦＰＬＣアフィニティカラムを用いて抗体を精製した。

実ＪｆＬ例−−上」− に１　と　応　るエピトープの　を＼！　るためのペルオキシダーゼ　疫組　化 ′法の　用ヒトおよびカニクイサルの正常組織の新鮮凍結サンプルならびにヒト 腫瘍のサンプルから冷温にて切片をつくり、カバーグラスの上に乗せ、Ｋ１を一 次抗体として用いて、前述のペルオキシダーゼ免疫組織化学法（Ｗｉ　ｌｌｉｎ ｇｈａｍ、ＦＯＣＵＳ　１２：６２−６７　（１９９０））を実施した。ペルオ キシダーゼ基質とジアミノベンジジンとの反応を利用して、各種組織中の反応性 抗原の局在を検出した。この実施例では、反応性抗原の局在がヒトおよびサル双 方の組織のうち、腹膜、胸膜、心腹を裏打ちしている中皮にあることが証明され た。量は減るが、反応性抗原はまた、気管、扁桃腺、輸卵管の上皮にも見いださ れた。ヒト腫瘍サンプルでは、卵巣、食道および子宮頚部それぞれの腫瘍かに１ と反応し、程度は低くなるが乳腫瘍と結腸腫瘍とも反応した。

１１叢−ユユニ ゛による　、のに１　との　応 の測定 ヒトの生きている癌細胞系を培養した後、培養基すべてを洗い流し、モノクロナ ール抗体に１（１μｇ／ｍｌ）と共に緩衝食塩水中で４℃によりインキュベート した。洗った後、細胞をローダミンと複合しているヤギのアンチマウス免疫グロ ブリンＧ抗体中でインキュベートした後、フォルムアルデヒドで固定し、前述し た蛍光顕微鏡により観察を行って（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ、ＦＯＣＵＳ　１２： ６２−６７　（１９９０））結合している抗体を検出した。Ｋ１抗体に強い反応 を示した細胞のうちには、例えばＫＧＳ　ＨｅＬａ　Ｓ３．０ＶＣＡＲ−３、Ａ ＧＳＳ　Ｋａｔｏ　ＩＩＩおよび１８４７細胞があった。

及五五−ユｊ Ｋ１エピトープ反応性に　する直　競合アツセイ余剰の無標識競合剤としてのに １または０Ｃ１２５抗体（２５μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で、生きて いる０ＶＣＡＲ−３を、Ｋ１抗体または０ＣＩ２５抗体（１０μｇ　／　ｍ　ｌ 　）のローダミン標識の直接複合体と一緒に４℃でインキュベートした。このイ ンキュベートを行う前に、この細胞を同一の無標識の競合体である抗体と共に前 インキュベートした。インキュベート後、細胞を洗い、フォルムアルデヒドで固 定して蛍光顕微鏡で観察を行った。Ｋ１−ローダミンは、競合剤としての抗体の 不存在下または競合剤としての０Ｃ１２５の存在下では、強い標識を示したが、 Ｋ１が競合剤として使用された場合、標識を全く示さなかった。反対に０Ｃ１２ ５の場合には、競合剤の不存在下、または余剰のに１が競合抗体として存在する ときに、強い標識を示し、０Ｃ１２５を競合剤として使用すると標識を全く示さ なかった。この結果は、０ＣＩ２５とに１のエピトープの間には、交差反応力へ 無０ことを示している。

ＰＭ 平成５年６月２５日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞表面の抗原に対して特異性を持つモノクローナル抗体を産生するハイブ リドーマであって、該抗体が霊長類の正常細胞、培養されたヒトの悪性細胞系、 およびヒトの腫瘍に発現することを特徴とし、該抗原が培養基または血漿に流れ 込まない上記ハイブリドーマ。
2. ２．細胞表面の抗原に特異性を持ち、且つ免疫グロブリンＧクラスであるモノク ロナール抗体であって、該抗原が霊長類の正常細胞、培養されたヒトの悪性細胞 系、およびヒトの腫瘍に発現することを特徴とし、該抗原が培養基または血漿に 流れ込まない上記モノクローナル抗体。
3. ３．上記培養ヒト悪性細胞系がＯＶＣＡＲ−２、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ− ４、１８４７、ＨＴＢ７７、ＨｅＬａ　Ｓ３、ＫＢ、ＡＧＳおよびＨＴＢ１０３ からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１に記載のハイブリドーマ。
4. ４．上記ヒト培養悪性細胞系がＯＶＣＡＲ−２、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ− ４、１８４７、ＨＴＢ７７、ＨｅＬａ　Ｓ３、ＫＢ、ＡＧＳおよびＨＴＢ１０３ からなる群より選ばれることを特徴とする請求項２に記載のモノクロナール抗体 。
5. ５．上記ヒト腫瘍が卵巣癌、食道癌または子宮頸部癌に由来する請求項１に記載 のハイブリドーマ。
6. ６．上記ヒト腫瘍が卵巣癌、食道癌または子宮頸癌に由来する請求項２に記載の モノクロナール抗体。
7. ７．上記霊長類正常組織が中皮である請求項１に記載のハイブリドーマ。
8. ８．上記霊長類正常組織が中皮である請求項２に記載のモノクロナール抗体。
9. ９．寄託番号がＡＴＣＣ　ＨＢ　１０５７０のハイブリドーマ細胞系。
10. １０．請求項１に記載のハイブリドーマによって産生されるモノクロナール抗体 。
11. １１．上記抗体がＫ１であることを特徴とする請求項２に記載のモノクロナール 抗体。
12. １２．請求項２に記載のモノクロナール抗体の複合体の癌の治療への使用。
13. １３．上記癌が卵巣癌である請求項１２に記載の使用。
14. １４．上記抗体が毒素、放射能同位元素または化学療法剤と複合している請求項 １２に記載の使用。
15. １５．上記抗体が細胞の殺傷を仲介するように修飾されている請求項１２に記載 の使用。
16. １６．請求項２に記載のモノクロナール抗体の癌の診断への使用。
17. １７．上記モノクロナール抗体が放射能標識を付されている請求項１６に記載の 使用。
18. １８．放射能標識の存在を視覚化することにより診断する請求項１６に記載の使 用。
19. １９．癌の成長を阻止するに充分な濃度の請求項２に記載のモノクロナール抗体 と医薬的に許容できる担体を含有して成る医薬組成物。
20. ２０．患者から組織または体液サンプルを採取し、請求項２に記載のモノクロナ ール抗体を該サンプルに添加し、該サンプル中の抗体の存在を視覚化することを 特徴とする請求項２に記載のモノクロナール抗体の癌の診断への使用。