JP2008535865A - 抗ｐｓｍａコンジュゲート抗体 - Google Patents

Abstract

本願明細書に記載の発明は、新規な組成物と、癌の治療方法と、癌の診断方法と、医薬組成物と、前立腺特異的膜抗原に免疫特異的に結合し、ＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる抗体を含むコンジュゲート抗体を作製する方法とを含むものである。

Description

関連出願
本件出願は、２００５年４月８日に出願された米国仮出願第６０／６６９，３４７に関するものであり、その全体を本願明細書に援用する。

技術分野
本発明は、癌の治療、予防および診断に効果的な方法と装置との開発に関する。特に、本発明は、前立腺特異的膜抗原に免疫特異的に結合し、かつＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる抗体の使用を含む癌の治療方法、予防方法および診断方法を対象とする。

発明の背景
米国では、米国人男性に最も多く診断される悪性腫瘍であることから、前立腺癌が何より重大な健康問題のひとつとなっている。米国癌協会の推定によれば、２０００年には新たに１８０，４００例の前立腺癌症例が診断され、この疾患で３１，９００名が死亡している。前立腺癌患者の５年生存率は、限局性疾患での８８％から転移性疾患での２９％までにわたる。症例数が急増したのは、ひとつにはこの疾患に対する認識が高まったことに加え、分泌タンパク質である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）や前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）などの臨床マーカーが広く用いられるようになったことが要因だと思われる（Ｃｈｉａｒｏｄａ（１９９１年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１、第２４９８〜２５０５頁）。

良性腫瘍（ＢＰＨ）や新生組織形成（前立腺癌）、感染症（前立腺炎）といった諸症状の影響を受ける重要な病理部位のひとつに、前立腺がある。前立腺癌は男性の癌による死因の第２位である（Ｃｈｉａｒｏｄａ（１９９１年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１、第２４９８〜２５０５頁）。ところが、男性の癌発生部位では前立腺が第１位である。この２つの実態のずれは、男性が高齢になるにつれ、特に他の要因が関与しやすい年齢である６０歳よりも高齢で、前立腺癌の生じる頻度が増加することに関連している。また、前立腺癌は生物学的悪性度の分布が大きいため、検出後も腫瘍が潜在性組織腫瘍（ｌａｔｅｎｔ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｔｕｍｏｒ）のままで臨床的に重度なものとはならない人がいる一方で、腫瘍が急速に進行して転移し、２〜５年という比較的短い期間で患者が死亡する場合もある（Ｃｈｉａｒｏｄａ（１９９１年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１、第２４９８〜２５０５頁、Ｗａｒｎｅｒら（１９９１年） Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ １８、第２５〜３３頁）。

前立腺癌細胞には、極めて高い濃度で産生される２種類の特異的タンパク質として、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）と前立腺特異抗原（ＰＳＡ）がある（Ｈｅｎｔｔｕら（１９８９年） Ｂｉｏｃｈ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．１６０、第９０３〜９０８頁、Ｎｇｕｙｅｎら（１９９０年） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．３５、第１４５０〜１４５５頁、Ｙｏｎｇら（１９９１年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１、第３７４８〜３７５２頁）。これらのタンパク質は、治療法に対する応答を追跡できるのが特徴であり、このような目的で用いられてきた。癌が発生すると、分泌物を排出する正常な腺管構造が失われるなど腺の正常な構造様式に変化が生じ、分泌物が血清に漏れ出してくる。このため、前立腺癌に対する有力なスクリーニング法として血清ＰＳＡを測定することが提案されている。実際に、正常組織または良性組織での場合に照らすと、この癌ではＰＳＡおよび／またはＰＡＰの相対量が違ってくる。

ＰＡＰは、転移の進展を検出するための最も古い血清マーカーのひとつであった（Ｎｇｕｙｅｎら（１９９０年） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．３５、第１４５０〜１４５５頁））。ＰＡＰはチロシンリン酸を加水分解するもので、基質特異性の範囲が広い。発癌性形質転換が起こると、チロシンリン酸化反応が増大することが多い。腫瘍性形質転換時には、チロシン残基のリン酸化反応で活性化されたタンパク質の不活性化に役立つホスファターゼ活性が弱くなると仮定されている。場合によっては、チロシンホスファターゼ活性を持つホスファターゼを挿入すれば悪性表現型が逆転することもある。

ＰＳＡはタンパク質分解酵素であるが、その活性の喪失が癌の発生とどのように相関しているのかは容易には分からない（Ｈｅｎｔｔｕら（１９８９年） Ｂｉｏｃｈ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．１６０、第９０３〜９０８頁、Ｙｏｎｇら（１９９１年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１、第３７４８〜３７５２頁）。ＰＳＡのタンパク質分解活性は亜鉛により阻害される。正常な前立腺では亜鉛濃度が高いが、前立腺癌では低くなる。おそらく、亜鉛が失われることでＰＳＡのタンパク質分解活性が増す余地があるのであろう。タンパク質分解酵素は転移に関与し、タンパク質分解酵素によっては分裂活性を刺激するものもあるため、増大する可能性のあるＰＳＡ活性が腫瘍の転移や進展に何らかの影響をおよぼしているのではないかと考えられる（Ｌｉｏｔｔａ（１９８６年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６、第１〜７頁）。ＰＳＡとＰＡＰは両方とも前立腺分泌物中に含まれる。どちらも、その産生はアンドロゲンの有無に左右されるようであり、アンドロゲンを除去するといずれも実質的に減少する。

前立腺膜に局在しているようにみえる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）も、前立腺癌のマーカーとみなされてきた。ＰＳＭＡは、ほぼすべての前立腺癌で発現される（Ｂｏｓｔｗｉｃｋら（１９９８年） Ｃａｎｃｅｒ，８２、第２２５６〜２２６１頁）。最近の研究によれば、ＰＳＭＡは小腸上皮（刷子縁）細胞、近位尿細管細胞および唾液腺によっても発現されるが、これらの正常な組織における発現レベルは、前立腺組織の場合の１００分の１から１，０００分の１である。こうした正常なＰＳＭＡ発現細胞は通常、細胞の刷子縁／管腔部位にあるため、循環抗体に曝露されることはない（Ｎａｎｕｓら（２００３年） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，１７０，Ｓ８４〜Ｓ８９）。さらに、ＰＳＡなどの前立腺に関係する他の抗体とは異なり、ＰＳＭＡは細胞表面にあるＩＩ型の内在性膜タンパク質であり、分泌されたものではないため、モノクローナル抗体療法の優れた標的となっている（Ｎａｎｕｓら（２００３年） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，１７０，Ｓ８４〜Ｓ８９）。

この抗原は、前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰに対するモノクローナル抗体を生成したところ同定されたものである（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら（１９９３年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３、第２２７〜２３０頁）。ＬＮＣａＰは、かなりの処置を受けたホルモン抵抗性患者のリンパ節から樹立された細胞株である（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら（１９８３年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３、第１８０９〜１８１８頁）。この細胞株は、異数体の男性核型を有することが判明したが、ＰＳＡとＰＡＰの両方を産生するという点で前立腺の分化機能を維持していた。この細胞株は、高親和性、高特異性のアンドロゲン受容体を有していた。ＬＮＣａＰ細胞でマウスを免役し、この感作動物からハイブリドーマを得た。そこからモノクローナル抗体を作出し、７Ｅ１１−Ｃ５と名付けた（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら（１９９３年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３、第２２７〜２３０頁）。抗体染色が起こる場所は細胞膜の位置と一致し、ＬＮＣａＰ細胞膜の単離画分は、免疫ブロット法とＥＬＩＳＡ法で強い陽性反応を示した。

このモノクローナル抗体は、前立腺癌患者の血清中の免疫反応物質の検出にも使用された（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら（１９９３年） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３、第２２７〜２３０頁）。免疫反応性は、病期Ｄ−２の患者の約６０％で検出可能であり、病期がこれよりも前の段階にある患者では比率がわずかに低下したものの、後者群の患者は少数であった。良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の患者では陰性であった。明らかな疾病が認められない患者は陰性であったが、寛解期にあるとはいえ、活動期の安定状態、または進行状態にある患者の５０〜６０％では血清反応が陽性を示した。前立腺腫瘍のない患者は、７Ｅ１１−Ｃ５に対して免疫反応を示さなかった。

７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体は現在、分子イメージング剤として使用されており、ＰＳＭＡを標的にした最初の、そして現時点で唯一の商品である。この７Ｅ１１−Ｃ５を放射性同位元素であるインジウム−１１１にリンクさせたのがＰｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ（登録商標）である。前立腺癌細胞はＰＳＭＡを選択的に発現するため、Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ（登録商標）では一般的なガンマカメラを用いて前立腺癌の程度と進展状態とを画像化することができる。米国特許第５，１６２，５０４号明細書には、モノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ５とそれを産生するハイブリドーマ細胞株とが開示および権利請求されている。また、米国特許第４，６７１，９５８号明細書、同第４，７４１，９００号明細書および４，８６７，９７３号明細書には、抗体コンジュゲートと、そのコンジュゲートを作製する方法と、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング、検査および治療上の処置のために当該コンジュゲートを使用する方法と、このような抗体に放射性同位元素をリンクさせることにより放射性同位元素を送達する方法とが開示および権利請求されている。

当該技術分野では、放射性同位元素にコンジュゲートされた抗ＰＳＭＡ抗体が他に少なくとも３種類あり、最低１種では前立腺癌治療を目的として試験がなされた。ＰＳＭＡの細胞外エピトープに高親和性で結合し、かつＰＳＭＡに特異的に局在するモノクローナル抗体に、Ｊ５９１、Ｊ４１５およびＪ５９１がある（Ｓｍｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０、第５２３７〜５２４３頁）。これらの抗体は、ＤＯＴＡリンケージを介して^１３１Ｉおよび^１１１Ｉｎで標識されている。これらの抗体でのＤＯＴＡと抗体との平均比は５：１であり、免疫反応性の明らかな消失はほとんどみられない。Ｊ５９１に平均８つのＤＯＴＡ分子がコンジュゲートすると、免疫反応性は２０％低下した（Ｓｍｉｔｈ− Ｊｏｎｅｓら（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０、第５２３７〜５２４３頁）。したがって、当該技術分野では、抗体が免疫反応性を消失しない場合、ＤＯＴＡと抗体との比に上限があることが分かる。

発明の概要
本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体を含む新規な組成物（以下、「コンジュゲート抗体（単数または複数）」と呼ぶ）であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる組成物を包含するものである。別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が、約９：１またはそれよりも大きい。

本発明はまた、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体を投与することを含む、被験者の癌を予防、治療または管理する方法であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる方法を包含するものである。別の実施形態では、そのＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きい。さらに別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きく、免疫反応性が失われるとしてもわずかである。

本発明のコンジュゲート抗体は、１つまたは複数の他の癌治療剤との併用で投与可能なものである。特に、本発明は、被験者の癌を予防、治療または管理する方法であって、本発明のコンジュゲート抗体の投与以外の１種または複数種の化学療法剤、ホルモン療法剤、生物学的療法剤／免疫療法剤および／または放射線療法剤の治療有効量または予防有効量の投与と併用および／または外科手術と併用して、１種または複数種の本発明のコンジュゲート抗体を治療有効量または予防有効量で前記被験者に投与することを含む方法を提供するものである。本発明のコンジュゲート抗体は、別々の医薬組成物で被験者に投与してもよいし、同一の組成物で投与しても構わないものである。さらに、本発明のコンジュゲート抗体は、他の治療剤の投与に先立ち、あるいは他の治療剤の投与後にも投与できると考えられる。これらの治療薬については、被験者に対して同一の投与経路または異なる投与経路で投与することができる。

また、本発明は、ヒトを含む哺乳類における癌を治療するための方法および組成物であって、ＰＳＭＡの細胞質ドメインのエピトープに対するモノクローナル抗体の結合を高めるのに効果的である、一定量の細胞毒性薬あるいは、一定量の細胞毒性薬を含む医薬組成物を、前記哺乳類に投与することを含む、方法および組成物を含むものである。一実施形態では、細胞毒性薬は、悪性細胞のアポトーシスを誘発および／または透過性を高め、および／またはこれ以外の場合には細胞膜を破壊する。別の実施形態では、本発明のコンジュゲート抗体より前またはこれと同時に、哺乳類に対して細胞毒性薬を投与する。本発明のこの態様では、細胞毒性薬が癌細胞を破壊し、それによりＰＳＭＡ抗原の細胞質ドメインを露出させることがある。

本発明はさらに、本発明のコンジュゲート抗体を用いて、ＰＳＭＡを発現する悪性細胞を有する個人を評価または診断する診断方法を提供するものである。特定の実施形態では、本発明の診断方法は、ＰＳＭＡを発現する悪性細胞のイメージング方法および局在化方法、（原発腫瘍および原発組織の体液および組織および／または原発腫瘍の周囲の組織および体液を使用する方法のみならず）原発腫瘍部位より遠位の組織および体液、たとえば、全血、痰、尿、血清、細針吸引液（すなわち生検標本）などを使用する診断方法および予後診断方法を提供するものである。他の実施形態では、本発明の診断方法は、転移のイメージング方法および局在化方法と、生体内の診断方法および予後診断方法とを提供する。こうした実施形態では、原発腫瘍を本発明のコンジュゲート抗体を用いて検出する。本発明の抗体はまた、凍結細胞もしくは凍結組織または固定細胞もしくは固定組織のアッセイの免疫組織学的分析にも利用することができる。

本発明はさらに、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体をＭｅＯ−ＤＯＴＡとコンジュゲートさせる新規かつ効率的な方法も提供する。加えて、本発明はさらに、そのコンジュゲート抗体を放射性同位元素と複合体形成させるための効率的な方法も提供するものである。

また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体１種または複数を、単独で、あるいは癌の治療法で有用な１種または複数種の他の薬剤との併用で含む医薬組成物も提供するものである。

別の実施形態では、本発明の医薬組成物または診断試薬を含むキットが得られる。

詳細な説明
放射線は有効な癌治療法であるが、正確な方向付けが困難であり、身体の非標的部を損傷するおそれがある。実際、その非選択性がゆえに治療に制約が生じることが多く、結果として正常組織に有害となる。一方で、モノクローナル抗体またはその断片は、患部細胞を選択的に標的するのに優れている。抗体は正常組織と悪性組織との抗原の相違点を利用でき、さまざまな抗腫瘍応答を起こさせることができるため、従来の治療形態よりも大きな利点がある。しかしながら、多くの場合、抗体単独では治療効果が不十分である。

どちらの問題も、モノクローナル抗体またはその断片に放射性同位元素をコンジュゲートさせることで解決できる。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、特定の標的部位に物質を送達する媒体として使用可能である。したがって、モノクローナル抗体を放射性同位元素にコンジュゲートすることは、特定の細胞を標的する有効な方法のひとつであり、このため、放射線治療の副作用が軽減される。

本願明細書に記載の発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を含む組成物であって、前記抗体またはその断片がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる、組成物に関するものである。本発明の一実施形態では、抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体は７Ｅ１１−Ｃ５である。別の実施形態では、７Ｅ１１−Ｃ５コンジュゲート抗体は、^１７７Ｌｕとの間で複合体形成される。好ましい実施形態では、コンジュゲート７Ｅ１１−Ｃ５は、同位元素と抗体との比が約９：１またはそれよりも大きな比で^１７７Ｌｕとの間で複合体形成される。また、本発明は、本発明の抗体の使用方法、処方方法および作製方法も提供する。

コンジュゲート抗体
本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる、抗体またはその断片を含むものである。ＭｅＯ−ＤＯＴＡであるα−（５−イソチオシアナト−２−メトキシフェニル）−ｌ，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−ｌ，４，７，１０−四酢酸（ダウケミカルカンパニー（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ））は、二官能性キレート剤である。二官能性キレート剤は、キレート化機能に加えて、バイオターゲティング分子（モノクローナル抗体など）にコンジュゲート（リンク）される能力を有する分子である。ＭｅＯ−ＤＯＴＡは、金属錯体を極めて安定にさせるため、イメージング処理中の自然放射能の発生が抑制され、または放射免疫療法における非標的組織に対する損傷が軽減される。本発明の一実施形態では、抗体は７Ｅ１１−Ｃ５である。別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡがリンクした抗体を、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^６４Ｃｕ、^１８７Ｒｅ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１７７Ｌｕからなる群から選択される放射性同位元素との間で複合体形成させる。別の実施形態では、抗体は、ＭｅＯ−ＤＯＴＡを介して^１７７Ｌｕにコンジュゲートされる７Ｅ１１−Ｃ５を含む。好ましい実施形態では、このＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比は、約９：１またはそれよりも大きい。

抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロテトラマーの糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、５つのヘテロテトラマー基本単位に加えてＪ鎖という付加的なポリペプチドからなり、したがって、１０の抗原結合部位を含む一方、分泌型ＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖と共に２〜５つの４本鎖の基本単位を含む多価集合体を形成することができる）。どの脊椎動物種でもＬ鎖は、定常ドメインのアミノ酸配列に応じてカッパおよびラムダと呼ばれる明らかに異なる２つのタイプのうちの１つに分類され、本発明の方法は、カッパＬ鎖またはラムダＬ鎖のどちらかを有する抗体を使用することを含む。重鎖（Ｃ_Ｈ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスまたはアイソタイプに分類することができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５つのクラスがあり、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ミューと名付けられた重鎖を有する。ガンマとアルファのクラスはさらに、Ｃ_Ｈ配列および機能の比較的小さな差異に基づき、サブクラスに分けられる。たとえば、ヒトは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２を発現する。本発明の方法は、上記のいずれかのクラスおよび／またはサブクラスのモノクローナル抗体を含む抗体を使用することを含むものである。

本願明細書で使用する場合、「可変」という語は、抗体間で可変ドメインの特定セグメントの配列が大きく異なることをいう。可変ドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体の特定の抗原に対する特異性を決定する。しかしながら、その可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸の範囲全体に均等に分布してはいない。むしろ、可変領域は、約１５〜３０個のアミノ酸からなるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的変異の少ない配列と、それぞれの長さがアミノ酸９〜１２個程度である「超可変領域」と呼ばれる極めて可変性の高いより小さな領域とからなる。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がベータシート構造である４つのフレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、ベータシート構造を結合するループを形成し、場合によってはベータシート構造の一部を形成する３つの超可変領域と結合している。各鎖の超可変領域は、フレームワーク領域によって近接して保持されており、他の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔら（１９９１年） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈを参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与してはいないが、抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）への関与など多様なエフェクター機能を呈する。

本願明細書で使用する場合、「超可変領域」という語は、抗原結合性を担う抗体のアミノ酸残基を示す。一般に、超可変領域は、抗体の特異性に寄与する「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。

本願明細書で使用する場合、「抗体またはその断片」という語は、ＰＳＭＡポリペプチドまたはＰＳＭＡポリペプチドの断片に特異的に結合するが、他の非ＰＳＭＡポリペプチドには特異的に結合しない抗体またはその断片を示す。ＰＳＭＡポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体または断片は、他の抗原と非特異的に交差反応しないことが好ましい（結合が適切なイムノアッセイにおいてＢＳＡなどの非ＰＳＭＡタンパク質と競合できないなど）。たとえば、ＰＳＭＡポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体または断片は、イムノアッセイまたは当業者に公知のその他の技法によって同定することができる。本発明の抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、細胞内発現抗体、ダイアボディ、多特異的抗体（二特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（二特異的ｓｃｆｖを含む）、単鎖抗体、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むが、これに限定されるものではない。特に、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわちＰＳＭＡ抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（抗ＰＳＭＡ抗体の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）など）とを含むものである。

本願明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という語は、実質的に均一な抗体の集合から得られた抗体を示す（言い換えれば、その集合をなす個々の抗体が、微量ながら存在することがあり得る自然発生突然変異を除けば同一であり、本願明細書にて定義された抗体断片を含む）。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して方向付けられる。さらに、相異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられる相異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対して方向付けられる。モノクローナル抗体は、その特異性だけでなく、他の抗体により汚染されることなく合成できる点でも都合がよい。修飾語句「モノクローナル」は、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきでない。たとえば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年） Ｎａｔｕｒｅ ２５６、第４９５頁に初めて説明されたハイブリドーマ法によって作出してもよいし、組換えＤＮＡ法を用いて細菌性の真核動物細胞または植物細胞で作製してもよいものである（米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」を、たとえばＣｌａｃｋｓｏｎら （１９９１年） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら（１９９１年） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２２２、第５８１〜５９７頁に説明された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。

本願明細書で使用する場合、「無傷の」抗体は、抗原結合部位ならびにＣ_Ｌおよび少なくとも重鎖定常ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３を含む抗体である。この定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（天然配列のヒト定常ドメインなど）であってもよいし、そのアミノ酸配列変異体であってもよい。無傷の抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有することが好ましい。

「抗体断片」は、無傷の抗体の一部を含み、好ましくは抗原に結合する、無傷の抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ’）_２断片ならびにダイアボディ、直鎖抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書およびＺａｐａｔａら（１９９５年） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８、第１０５７〜１０６２頁を参照のこと）、単鎖抗体分子および抗体断片から形成される多特異的抗体などがある。

抗体をパパイン消化すると、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化できることから命名された残りの「Ｆｃ」断片とが産生される。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖（Ｖ_Ｈ）の可変領域ドメインと共にＬ鎖全体と、１つの重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）とからなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、言い換えれば、抗原結合部位は１つである。抗体をペプシン処理すると、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ相当し、依然として抗原を架橋できる１つの大きなＦ（ａｂ’）_２断片が生成される。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と異なり、抗体ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインを含むＣ_Ｈ１ドメインのカルボキシ末端にさらに少数の残基を有する。本願明細書においてＦａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は当初、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。

Ｆｃ断片は、ジスルフィド結合している双方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決まる。この領域はまた、一定の種類の細胞で見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。

本願明細書で使用する場合、「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位と抗原結合部位とを含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖および１本の軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折りたたみから、抗原結合のためのアミノ酸残基を与え、かつ抗体に対する抗原結合特異性を与える６つの超可変ループ（ループはＨ鎖とＬ鎖からそれぞれ３つずつ）が出ている。ただし、１つの可変ドメイン（すなわち、抗原に対して特異的なＣＤＲを３つしか含まない半分のＦｖ）でも、この結合部位全体より親和性は低下するものの、抗原を認識し、抗原と結合する能力を有する。

本願明細書で使用する場合、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」と略されることもある「単鎖Ｆｖ」は、１つのポリペプチド鎖として連結されたＶ_Ｈ抗体ドメインとＶ_Ｌ抗体ドメインとを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドはさらに、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーを含むことが好ましい（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇら（１９９４） Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ｐｐ．２６９〜３１５を参照のこと）。

本願明細書で使用する場合、「ダイアボディ」という語は、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間の短いリンカー（約５〜約１０残基）によりｓＦｖ断片（前段落を参照）を構築することで調製される小さな抗体断片を示し、ダイアボディはＶドメインの鎖間の対合はできるが、鎖内の対合ができないので、二価断片すなわち２つの抗原結合部位を有する断片である。二重特異性ダイアボディは、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであって、その２つの抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインが相異なるポリペプチド鎖に存在する。ダイアボディは、たとえば、国際公開第９３／１１１６１号パンフレットおよびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０、第６４４４〜６４４８頁に詳細に説明されている。

「単離抗体」は、自然環境の成分から同定、単離および／または回収される抗体である。その自然環境の汚染成分は、診断目的または治療目的での抗体の使用を妨げると考えられる物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク性成分または非タンパク性成分などが挙げられる。好ましい実施形態では、抗体を抗体重量の９５％超まで精製し、最も好ましくは、重量の９９％を超えるまで精製する。単離抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分がなくなるため、組換え細胞内の原位置にある抗体を含む。しかしながら、単離抗体は通常、少なくとも１つの精製段階で調製される。

本発明の一実施形態では、コンジュゲート抗体は、癌細胞に特異的なタンパク質の細胞質ドメインのエピトープ（すなわち、癌細胞マーカー）に結合する。別の実施形態では、コンジュゲート抗体は、米国特許第５，１６２，５０４号明細書（その全体を本明細書に援用する）に記載されているような７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体を含むがこれに限定されるものではないＰＳＭＡの細胞質ドメインのエピトープに結合する抗体を含むが、これに限定されるものではない。７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣに受託番号ＨＢ１０４９４で寄託されている。

本発明の方法に用いられるコンジュゲート抗体は「キメラ」抗体を含むものであって、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、あるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来するか、あるいは別の抗体のクラスおよびサブクラスに属する抗体の対応する配列ならびにその抗体の断片（望ましい生物活性を示す場合に限る）と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１、第６８５１〜６８５５頁を参照のこと）。本願明細書で取り上げるキメラ抗体は、非ヒト哺乳類（マウスなど）に由来する可変領域の抗原結合配列と、ヒトの定常領域配列とを含む「ヒト化」抗体を含むが、これに限定されるものではない。本発明の抗体はまた、完全ヒト抗体配列も含むものである。別の実施形態では、本発明の抗体は、完全ヒト抗体であってもよい。

診断方法
本発明の抗体またはその断片は、診断用の作用剤または検出可能な作用剤として利用できる。好ましい実施形態では、抗体またはその断片は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して免疫特異的に結合するものであって、前記抗体はＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる。本発明の抗体は、特定の治療の有効性を判断するなど、臨床試験手順の一部として癌の発生もしくは進行の監視または予知に有用であり得る。さらに、この抗体は、癌性状態の発生もしくは進行の監視または予知にも有用であり得る。

別の実施形態では、本発明のコンジュゲート抗体を最初に投与した後、癌細胞を撮像し、癌性細胞の相対量を任意の方法で判断することができる。本発明は、癌を検出および／または患者の臓器もしくは身体の癌細胞に対する治療薬の効果を評価するための診断方法を含む。本方法は、ＭｅＯ−ＤＯＴＡを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる抗ＰＳＭＡ抗体を検出可能な量で含む組成物を治療前または治療後に患者に投与することを含むものである。別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きい。さらに別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比は約９：１またはそれよりも大きく、免疫反応性が失われるとしてもわずかである。治療薬の投与に続き、検出可能なモノクローナル抗体をさらに投与して、治療後に残存する癌細胞の相対量を判断することができる。治療前の画像と治療後の画像を比較検討して、治療の有効性を評価することができ、その場合、治療後に撮像される癌細胞の数が減少していれば、治療法に効果があったことになる。

本願明細書で使用する場合、「検出可能な量」という表現は、患者に投与されＰＳＭＡに結合する標識コンジュゲート抗体の量をいい、その量は、標識モノクローナル抗体が腫瘍の１つまたは複数の悪性癌細胞に結合したことを検出できるだけの十分な量である。本願明細書で使用する場合、「イメージング有効量」という語は、患者に投与される標識抗体の量をいい、その量は、腫瘍の１つまたは複数の悪性癌細胞に対する抗体の結合を撮像できるだけの十分な量である。

本発明の方法は、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）などの非侵襲的神経画像法またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）もしくは単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などのガンマ線イメージングと共に、腫瘍の悪性細胞など生体内の異常細胞の同定および定量化のために使用される本発明のコンジュゲート抗体を含むものである。「ｉｎ ｖｉｖｏイメージング」という語は、上述のような標識モノクローナル抗体の検出を可能にする任意の方法をいう。ガンマ線イメージングの場合は、検査対象の腫瘍または部位から放射される放射線を測定し、これを全結合量とするか、同じｉｎ ｖｉｖｏイメージングの間に得られる、ある組織の全結合量を、別の組織または同じ被験者の全身の全結合量に対して標準化（たとえばこうした結合量で除するなど）した比として表す。生体内の全結合量は、同一量の標識化合物と一緒に、非標識であること以外は化学的に同じ化合物をかなりの過剰量で２回目に注入して補正する必要なく、ｉｎ ｖｉｖｏイメージング法によって腫瘍または組織で検出される全シグナルとして定義される。本願明細書で使用する場合、「被験者」または「患者」という語は、哺乳類、好ましくはヒト、最も好ましくは腫瘍に悪性細胞などの異常細胞を有すると思われるヒトをいう。

ｉｎ ｖｉｖｏイメージングでは、利用可能な検出機器のタイプが、標識を選択する上で重要な要素になる。たとえば、放射性アイソトープは、本発明の方法におけるｉｎ ｖｉｖｏイメージングに特に適しているが、使用機器のタイプにより放射性同位元素の選択肢が左右されることになる。一例として、選択される放射性同位元素は、所与のタイプの機器により検出可能なある種の崩壊を起こさなければならない。もう１つの考慮すべき点は、放射性同位元素の半減期に関するものである。半減期は、標的による取り込みが最大になる時点で放射性同位元素を依然として検出可能であるだけの十分な長さであるが、一方では宿主が有害な放射線を受けないように短くすべきである。放射される適切な波長のガンマ線放射を検出するガンマ線イメージングを用いれば、同位体標識モノクローナル抗体を検出することができる。ガンマ線イメージングの方法として、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）法または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）があるが、これに限定されるものではない。ＳＰＥＣＴによる検出の場合は、選択した放射標識が粒子放出を欠くことになっても、多数の光子を生成することが好ましい。ＰＥＴによる検出の場合は、放射標識は、ＰＥＴカメラにより検出されるポジトロン放出放射性同位元素になる。

本発明において、コンジュゲート抗体は、生体内での腫瘍の検出および撮像に有用である。これらの化合物は、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）などの非侵襲的神経画像法、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）および単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）と共に使用することができる。本発明によれば、コンジュゲート抗体は、許容可能な任意の放射性同位元素で標識（複合体形成）可能なものである。たとえば、以下で説明する技術または当該技術分野で公知の技術を用いて、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^６４Ｃｕ、^１８７Ｒｅ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１７７Ｌｕが使用可能であるが、これに限定されるものではない。

本発明の診断方法では、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングおよび分光法において、核磁気共鳴分光法により検出可能なアイソトープを使用してもよい。磁気共鳴分光法で特に有用な元素には、^１９Ｆおよび^１３Ｃがあるが、これに限定されるものではない。本発明の目的に適した放射性同位元素として、ベータ放射体、ガンマ放射体、ポジトロン放射体、エックス線放射体があるが、これに限定されるものではない。これらの放射性同位元素としては、^１１１Ｉｎ、^１３１Ｉ、^１２３Ｉ、^１８Ｆ、^１１Ｃ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒがあげられるが、これに限定されるものではない。

本発明によれば、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）または磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）の使用に適した安定アイソトープには、^１９Ｆおよび^１３Ｃがあげられるが、これに限定されるものではない。組織生検標本または死後組織における腫瘍細胞などの異常細胞の生体内同定および定量化に適した放射性同位元素には、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３Ｈなどがある。これらの放射標識の例として、ＰＥＴｉｎ ｖｉｖｏイメージング向けに^６４Ｃｕまたは^１８Ｆ、ＳＰＥＣＴｉｎ ｖｉｖｏイメージング向けに^１２３Ｉまたは^１３１Ｉ、ＭＲＳおよびＭＲＩ向けに^１９Ｆ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法向けに^３Ｈまたは^１４Ｃがあるが、これに限定されるものではない。一方、診断プローブを可視化する従来のどの方法も、本発明に従って利用することができる。

一般に、同位体標識モノクローナル抗体の投与量は、患者の年齢、状態、性別および疾病の程度、もしあるとすれば禁忌、併用療法ならびに当業者により調整されるその他の可変要素によって異なる。投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲にすることが可能であるが、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。患者への投与は局所投与または全身投与であり、静脈内、動脈内、くも膜下腔内（脊髄液を介して）または脳内等に投与することができる。また、検査中の身体部位に応じて、皮内または腔内に投与される場合もある。

標識モノクローナル抗体が異常細胞に結合するのに十分な時間、たとえば３０分〜４８時間が経過した後、被験者の検査中の部位を、ＭＲＳ／ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、平面シンチレーションイメージング、ＰＥＴなど通常のイメージング法のほか、新しいイメージング法によっても検査する。必然的に、正確な手順は、上述のような患者に特有の要因により、また検査中の身体部位、投与方法および使用する標識のタイプによっても異なることになるため、具体的な手順の決定は、当業者にとって日常的に行われると考えられる。腫瘍のイメージングの場合は、結合同位体標識モノクローナル抗体の量（全結合量または特異的結合量）を測定し、化学療法での治療後に腫瘍に結合した同位体標識モノクローナル抗体の量と（比として）比較するのが好ましい。

別の実施形態では、本発明のコンジュゲート抗体は、（原発腫瘍の組織と体液および／または原発腫瘍の周囲の組織と体液を使用する方法に加えて）原発腫瘍部位より遠位の組織および体液を使用した診断および予後診断のために用いることができる。本発明の抗体は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いることで、生物学的試料のＰＭＳＡレベルを測定する目的で使用可能なものである（たとえば、Ｊａｌｋａｎｅｎら（１９８５年） Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１、第９７６〜９８５頁およびＪａｌｋａｎｅｎら（１９８７年） Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５、第３０８７〜３０９６頁を参照のこと）。抗体をベースにしたタンパク質遺伝子の発現の検出に有用な他の方法には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイがある。抗体法の適切な標識は当該技術分野において公知であり、具体的には、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、さらにはヨウ素（^１２５Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１２１Ｉｎ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ）などの放射性同位元素がある。

さらに別の実施形態では、本発明は、上述の免疫検出法とイメージング方法と共に使用するため、免疫検出キットとイメージングキットの双方を含む診断キットを提供するものである。

治療方法
本発明は、悪性細胞によって発現されるＰＳＭＡに特異的に結合するコンジュゲート抗体を投与することを含む、治療を必要とする患者においてＰＳＭＡを発現する悪性細胞を有する癌の治療方法を包含するものである。一実施形態では、コンジュゲート抗体は、ＰＳＭＡの細胞質内エピトープに結合する。別の実施形態では、コンジュゲート抗体は、その全体を本明細書に援用する米国特許第５，１６２，５０４号明細書に記載されている７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体を含むが、これに限定されるものではない。７Ｅ１１−Ｃ５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣに受託番号ＨＢ１０４９４で寄託されている。好ましい実施形態では、抗体は、ＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる。さらに別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比は約９：１またはそれよりも大きい。好ましい実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比は約９：１かまたはそれよりも大きく、免疫反応性が失われるとしてもわずかである。

癌の治療、予防または管理に有効となる本発明のコンジュゲート抗体組成物の量については、標準的な研究法で判断すればよい。一例として、癌の治療、予防または管理に有効となる組成物の投与量は、たとえばその組成物を、本願明細書に開示された、あるいは当該技術分野において公知の動物モデルなどの動物モデルに投与して判断すればよい。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを適宜利用することで、最適な投与量の範囲を特定できることもある。

当業者は、当業者に公知の複数の要因を考慮することで、推奨される有効量を（臨床試験などにより）判断することができる。その要因として、治療対象または予防対象の疾病、関連する症状、患者の体重、患者の免疫状態および投与された医薬組成物の詳細な品質を反映させるために当業者に公知のその他の要因などがある。

処方に使用する正確な用量は、投与経路および癌の重篤度にも左右されるため、開業医の判断および各患者の状況に従って判断すべきものである。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験系または動物モデルの試験系から得られる用量反応曲線から有効量を推定してもよい。

抗体の場合、患者への投与量は通常、患者の体重あたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者への投与量は患者の体重あたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、一層好ましくは患者の体重あたり１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。一般に、ヒト抗体およびヒト化抗体の人体内での半減期は、異質のポリペプチドに対する免疫応答のため、他の種から得られる抗体の場合よりも長い。したがって、ヒト抗体またはヒト化抗体の投与量を減らしたり、投与頻度を下げたりすることが可能な場合が多い。

特定の実施形態では、前立腺癌のある患者に、本発明のコンジュゲート抗体１種または複数種を有効量で投与する。別の実施形態では、本発明の抗体を、前立腺癌療法で有用な１種または複数種の有効量の他の薬剤と共に投与することができる。前立腺癌療法には、外部放射線療法、放射性同位元素（すなわち、^１２５Ｉ、パラジウム、イリジウム）の組織内刺入、リュープロライドまたは他のＬＨＲＨアゴニスト、非ステロイド性抗アンドロゲン（フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド）、ステロイド性抗アンドロゲン（酢酸シプロテロン）、リュープロライドとフルタミドの配合剤、ＤＥＳなどのエストロゲン、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、抱合エストロゲン（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）、ＤＥＳ−二リン酸、ストロンチウム−８９などの放射性同位元素、外部放射線療法とストロンチウム−８９の組み合わせ、二次ホルモン療法（アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド除去、プロゲステロンおよびケトコナゾールなど）、低用量プレドニゾン、あるいはドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン／ドセタキセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチンおよびエストラムスチン／パクリタキセルなど、ＰＳＡ、ＰＡＰおよび／またはＰＭＳＡレベルにおける症状の自覚的改善および低下をもたらすと報告されている他の化学療法があげられるが、これに限定されるものではない。

本発明を考えると、一定の好ましい実施形態には、併用療法において、各薬剤の投与に推奨される投与量よりも少ない投与量で投与を行うことが包含される。

本発明は、既知の予防薬または治療薬の投与量を、癌の予防、治療、管理または寛解に有効だと従来考えられていたよりも少量にする任意の方法を提供する。好ましくは、本発明のコンジュゲートモノクローナル抗体の用量を減らすとともに、既知の抗癌治療剤についても以前より低用量で投与する。

本発明はまた、ヒトを含む哺乳類における癌治療のための方法および組成物であって、ＰＳＭＡのエピトープ（細胞質内エピトープなど）に対する抗体の結合を増すのに有効な一定量の細胞毒性薬あるいは一定量の細胞毒性薬を含む医薬組成物を前記哺乳類に対して投与することを含む、方法および組成物を含むものである。前記細胞毒性薬については、前記抗体より前またはこれと同時に投与することができる。好ましい実施形態では、前記抗体は、ＰＳＭＡの細胞質ドメインのエピトープに結合する。別の実施形態では、前記抗体は、ＭｅＯ−ＤＯＴＡにコンジュゲートされる。特定の実施形態では、前記抗体は７Ｅ１１−Ｃ５であり、ＭｅＯ−ＤＯＴＡにコンジュゲートされる。別の実施形態では、細胞毒性薬は悪性細胞のアポトーシスを誘発および／または透過性を高め、および／またはこれ以外の場合には細胞膜を破壊する。本発明の別の態様では、本発明のコンジュゲート抗体より前またはこれと同時に、哺乳類に対して細胞毒性薬を投与する。本発明のこの態様では、細胞毒性薬が癌細胞を破壊することでＰＳＭＡ抗原の細胞質ドメインを露出させる。細胞質ドメインが露出することで、本発明のコンジュゲート抗体を用いて残存する癌細胞を標的にすることが可能になる（本明細書に援用する、２００５年１月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６０／６４３，５８９号明細書を参照のこと）。

化学療法剤の例として、ＢＣＮＵ、シスプラチン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、パクリタキセル、テモゾミド、トポテカン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロカルバジン、ダカルバジン、アルトレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、ペントスタチン、フルオロウラシル、シタラビン、アザシチジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、イダルビシン、プリカマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、フルタミド、リュープロライド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、アナストロゾール、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ミトタンおよびアミフォスチンがあげられるが、これに限定されるものではない。

別の実施形態では、治療法には、癌治療のための放射線との併用で本発明のコンジュゲート抗体を投与することが含まれる。特に、放射線の目的は、癌細胞の細胞膜を破壊して、ＰＳＭＡの細胞質ドメインなどのＰＳＭＡを露出させることである。細胞質ドメインが露出すると、抗体はＰＳＭＡに結合することができる。好ましい実施形態では、前記抗体は、ＰＳＭＡの細胞質ドメインのエピトープに結合する。別の実施形態では、前記抗体は、ＭｅＯ−ＤＯＴＡにコンジュゲートされる。特定の実施形態では、前記抗体は７Ｅ１１−Ｃ５であり、ＭｅＯ−ＤＯＴＡとコンジュゲートされる。本発明の方法はまた、癌細胞のアポトーシス（細胞死）を誘発し、転移の発生率または数を削減し、腫瘍の大きさを小さくすることを目指したものでもある。放射線治療剤に対する腫瘍細胞の抵抗性は、臨床腫瘍学における重要な課題のひとつである。したがって、本発明の文脈では、この抗体を用いる併用療法を放射線耐性腫瘍に使用して放射線治療の有効性を高めることができる（本明細書に援用する、２００５年１月１４日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６０／６４３，５８９号明細書を参照のこと）。

本発明の方法により治療できる癌のタイプには、固形腫瘍が含まれる。固形腫瘍の例としては内皮細胞癌があるが、これに限定されるものではない。内皮細胞癌の例として、腎細胞癌、結腸癌、移行上皮癌、肺癌、乳癌および前立腺腺癌があるが、これに限定されるものではない。

腎細胞癌の例には、明細胞癌、乳頭状癌、色素嫌性癌、集合管癌および分類不能癌があるが、これに限定されるものではない。肺癌の例には、腺癌、肺胞上皮癌、扁平上皮癌、大細胞癌および小細胞癌があるが、これに限定されるものではない。乳癌の例には、腺癌、非浸潤性乳管癌、上皮内小葉癌、浸潤性腺管癌、髄様癌および粘液性癌があるが、これに限定されるものではない。

本発明の方法により治療可能な固形腫瘍の別の例には、内皮細胞肉腫があるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、肉腫は軟部組織肉腫である。また、転移性腫瘍も治療可能である。

本発明の抗体を作製する方法
米国特許第５，４３５，９９０号明細書および同第５，６５２，３６１号明細書には、ＭｅＯ−ＤＯＴＡとその他の二官能性キレーターの生成方法および使用方法が開示されている。米国特許第５，４３５，９９０号明細書および第５，６５２，３６１号明細書については、すべての目的でその全体を本願明細書に援用する。

一実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡを付加するための抗体修飾を、このタンパク質のアミノ酸残基と、タンパク質を結合できる二官能性キレーターの官能基との共有結合を形成することにより、行うことができる。また、ＭｅＯ−ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して抗体に付加することも可能なものである。ＭｅＯ−ＤＯＴＡをポリペプチドにコンジュゲートさせるのに有用なリンカー分子の一例が、たとえば、ＤｅＮａｒｄｏら（１９９８年） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４、第２４８３〜２４９０頁、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（１９９９年） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０、第５５３〜５５７頁およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら（１９９９年） Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６、第９４３〜９５０（これらの文献全体を本願明細書に援用する）に開示されている。

米国特許第５，６５２，３６１号明細書および同第５，７５６，０６５号明細書には、抗体にコンジュゲート可能なキレート剤が開示されている。また、開示されたキレート剤をコンジュゲートさせる方法も、米国特許第５，６５２，３６１号明細書および同第５，７５６，０６５号明細書に開示されている。本発明のコンジュゲートの形成をもたらすのに適したどの方法も、本発明の範囲内である。一方で、反応を効果的なものにする１つの重要な点として、抗体とコンジュゲートとの比がある。コンジュゲートと抗体とを精製し、コンジュゲートさせる準備が整ったら、コンジュゲートと抗体の両方を反応混合物に添加する。コンジュゲートと抗体との比は、それぞれ約５：１、１０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１にすべきである。反応混合物のｐＨは、約１０〜約５、好ましくは約９〜約８にすべきであり、より好ましくは約８．５にすべきである。このコンジュゲーション反応は、約２０℃〜約３７℃の温度域で行われるべきものである。上述のプロトコルでは、ＭｅＯ−ＤＯＴＡキレートは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２まで、またはそれ以上、抗体に結合することができよう。一実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比は、約９：１またはそれよりも大きい。別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比は、約９：１またはそれよりも大きく、免疫反応性が失われるとしてもわずかである。

治療用放射性アイソトープの二官能性キレーター（錯化剤）への結合は、二官能性キレーター、抗体と複合体を形成していないＭｅＯ−ＤＯＴＡまたは抗体にコンジュゲートされたＭｅＯ−ＤＯＴＡからなる組成物のいずれかによって行うことができる。この錯化反応については、ｐＨ約７〜約４、好ましくは約５〜約６で行うべきであり、一層好ましくはｐＨを約５．５にすべきである。錯化反応は、少なくとも約５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭまたはこれを上回るモル濃度のアセテート緩衝液（酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなど）中で行うことができる。好ましくは、モル濃度を約１００ｍＭにすべきである。錯化反応は、約２０℃〜約３７℃の温度域で行われるべきものである。ＤＯＴＡと複合体を形成する放射性ヌクレオチドの比率は、約８０％〜約１００％にすべきであり、好ましくは約８７％〜約９５％である。

ＭｅＯ−ＤＯＴＡと複合体を形成できる放射性同位元素には、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^６４Ｃｕ、^１８７Ｒｅ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１７７Ｌｕまたはイメージングに適した任意の放射性同位元素があるが、これに限定されるものではない。

医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物（不純な組成物または非滅菌組成物など）や単位剤形の調製時に使用可能な医薬組成物（すなわち、被験者または患者への投与に適した組成物）の製造に役立つバルク製剤組成物を含む。このような組成物は、予防有効量または治療有効量の、本願明細書に開示の予防薬および／または治療薬あるいはこれらの薬剤の組み合わせと薬学的に許容可能なキャリアとを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防有効量または治療有効量の、本発明の１種または複数種の抗体と、発現を低減させる薬学的に許容可能なキャリアまたは薬剤（アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。別の実施形態では、本発明の組成物はさらに、たとえば抗癌剤などの別の治療薬を含む。

特定の実施形態では、「薬学的に許容可能な」という表現は、動物、特にヒトにおいて使用する前提で連邦政府または州政府の監督官庁に認可されているか、あるいは米国薬局方または他の一般に承認された薬局方に列挙されていることを意味する。「キャリア」とは、これと一緒に治療剤を投与する希釈剤またはビヒクルを示す。このような薬学的なキャリアには、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの油といった、石油系、動物由来、植物由来または合成系の油や水など、滅菌した液体を用いることが可能である。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましいキャリアである。生理食塩水溶液やデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、特に注射可能な溶液用の液体キャリアとして利用可能である。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白墨、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがあげられる。この組成物には、必要があれば、少量の湿潤剤または乳化剤あるいはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物については、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形をとり得る。

通常、本発明の組成物の含有成分は、別々に供給されるか、活性剤の量が明記されたアンプルまたはサシェなどの密封容器に入った凍結乾燥粉末または無水濃縮物など、単位剤形の状態で混合されている。組成物を点滴投与する場合、滅菌した製薬等級の純水または生理食塩水の入った点滴瓶を用いて分注することが可能である。組成物を注射により投与する場合、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを用いて、投与前に含有成分を混合できるようにすることが可能である。

本発明の組成物は、中性または塩の形態で処方可能なものである。薬学的に許容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される塩といったアニオンを用いて形成される塩や、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される塩といったカチオンを用いて形成される塩があげられる。

さまざまな送達系が公知であり、本発明の抗体あるいは、本発明のコンジュゲート抗体と、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体または抗体断片を発現可能な組換え細胞、受容体依存性エンドサイトーシス（たとえば、ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、第４４２９〜４４３２頁を参照のこと）など、癌の予防または治療に有用な予防薬または治療薬との組み合わせを投与する目的で利用できる。本発明の予防薬または治療薬の投与方法としては、非経口投与（皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与および皮下投与など）、硬膜外、粘膜（鼻腔内経路、吸入経路および経口経路など）があげられるが、これに限定されるものではない。特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、筋肉内投与、静脈内投与または皮下投与する。この予防薬または治療薬については、たとえば、点滴またはボーラス注入による、上皮または粘膜皮膚ライニングによる吸収（口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）などの都合のよい適当な経路で投与すればよく、また、他の生物学的活性剤と一緒に投与しても構わない。この投与については、全身投与または局所投与とすることが可能である。

特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を治療が必要な部分に局所投与すると望ましいことがあるが、これに関しては、たとえば、特に限定するものではないが、局所注入（四肢の灌流）による、注射による、あるいはインプラント（前記インプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜または繊維をはじめとする多孔性、非多孔性またはゼラチン状の材料）による方法などで達成すればよい。

キット
本発明は、本発明のモノクローナル抗体を充填した１つまたは複数の容器を含む医薬品パックまたはキットを提供するものである。一実施形態では、このキットは、治療前および治療後に患者に対して、ＭｅＯ−ＤＯＴＡを介して放射性同位元素にコンジュゲートされた抗ＰＳＭＡ抗体を含む。別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きい。さらに別の実施形態では、ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きく、免疫反応性が失われるとしてもわずかである。また、癌の治療に役立つ１種または複数種の他の予防薬または治療薬も医薬品パックまたはキットに含めることが可能である。さらに、本発明は、本発明の医薬組成物の１種または複数種の含有成分を充填した１つまたは複数の容器を含む医薬品パックまたはキットを提供するものである。このような容器には、医薬品や生物学的製剤の製造、使用または販売を管轄している政府機関によって規定された形式での注意事項（この注意事項には、人間への投与を前提にした製造機関、使用機関または販売機関による承認内容が反映されている）を任意に添付可能である。

本発明は、上述の方法で使用可能なキットを提供するものである。一実施形態において、キットは、１種または複数種の本発明のモノクローナル抗体を含む。他の実施形態において、キットはさらに、癌の治療に役立つ１種または複数種の他の予防薬または治療薬を、１種または複数種の容器に入れて含む。一実施形態において、本発明の抗体は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、前記抗体は、ＭｅＯ−ＤＯＴＡを介して^１７７Ｌｕにコンジュゲートされる７Ｅ１１−Ｃ５である。他の実施形態では、同位元素と抗体との比を約９：１またはそれよりも大きくして、コンジュゲートされた７Ｅ１１−Ｃ５と^１７７Ｌｕとの間で複合体を形成する。特定の実施形態では、他の予防薬または治療薬が化学療法剤である。他の実施形態では、予防薬または治療薬が生物療法剤またはホルモン療法剤である。

さらに説明しなくても、当業者であれば、上述した説明と以下の例示的な実施例を利用して、本発明の化合物を製造および利用し、かつ、権利請求されている方法を実施可能であると思われる。以下の作用実施例では、本発明の実施形態について述べるが、かかる実施例は本願明細書に開示する残りの内容を何ら限定するものではない。

実施例
実施例１．７Ｅ１１−Ｃ５の単離とキャラクタリゼーション
１．１ 細胞株および組織
ヒト前立腺癌腫の転移病巣からＬＮＣａＰ細胞株を樹立した。ＬＮＣａＰ細胞は、生体外で容易に増殖（最大で細胞８×１０^５個／ｃｍ^２、倍加時間６０時間）し、半固体培地でクローンを形成し、いくつかのマーカー染色体を持つ異数体（染色体数７６から９１）のヒト男性核型を示す。ＬＮＣａＰ細胞の悪性の性質が維持される。胸腺欠損ヌードマウスでは注射部位に腫瘍が発生する（体積倍加時間８６時間）。機能分化が保たれる。培養と腫瘍のどちらも前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）と前立腺特異抗原（ＰＳＡ）とを産生する。培養細胞と腫瘍細胞の細胞質画分および核画分には高親和性特異的アンドロゲン受容体が存在する。細胞質にはエストロゲン受容体が確認できる。このモデルはホルモン応答性である。生体外では、α−ジヒドロテストステロンが細胞の増殖を調節し、酸性ホスファターゼの生成を刺激する。生体内では、腫瘍の発生頻度と腫瘍出現の平均時（ｍｅａｎ ｔｉｍｅ）が、どちらの性別でも有意に異なっている。このように、ＬＮＣａＰ細胞は、実験室でヒト前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）について免疫学的研究を行う上での万能モデルとしての基準を満たしている。

メモリアルスローンケタリングインスティテュート（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から、ヒト由来の悪性細胞株７種を得た。この７種の内訳は次のとおりである。前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）由来のＤＵ−１４５およびＰＣ−３、胸部硬癌のある胸水由来のＭＣＦ−７（Ｓｏｕｌｅら（１９７３年）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．５１、第１４０９〜１４１６頁）、悪性メラノーマであるＭｅＷｏ、移行上皮癌であるＲＴ−４、結腸腺腫であるＨＴ−２９、横紋筋肉腫であるＡ２０９。ロズウェルパークメモリアルインスティテュート（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で単離して樹立した他の４種の細胞株（悪性２種と正常２種）も利用した。この４種の内訳は次のとおりである。甲状腺髄様癌ＴＴ、膵臓癌、さらには、いずれも正常な二倍体新生児包皮線維芽細胞であるＢＧ−９およびＭＬＤ（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら（１９７８年）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９、第７２０〜７２６頁、Ｃｈｅｎら（１９８２年）Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ １８、第２４〜３２頁、Ｌｅｏｎｇら（１９８２年）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １９８４年、第９５〜１０８頁を参照のこと）。上述した細胞株についてはいずれも、１０％熱失活ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン１ｍＭ、ペニシリン５０μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を加えたＲＰＭＩ培地１６４０（ロズウェルパークメモリアルインスティテュート）にて定石どおりに維持管理した。

ロズウェルパークメモリアルインスティテュートの外科手術部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ）または病理学部門（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）のいずれかから、それぞれが新鮮な、正常な組織、良性前立腺癌組織、悪性前立腺癌組織を得た。これらの組織をＭ−１樹脂包埋剤（リップショーコーポレーション（Ｌｉｐｓｈａｗ Ｃｏｒｐ））中にて短時間で冷凍し、−８０℃で保管した。

１．２．免疫化および細胞融合
１０週齢のオスのＢａｌｂ／ｃ系統マウス（ウェストセネカラボラトリー（Ｗｅｓｔ Ｓｅｎｅｃａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、ＲＰＭＩ培地１６４０に懸濁させた洗浄済み（ＲＰＭＩ培地１６４０中にて３回）の肝臓ＬＮＣａＰ細胞を、１ヶ月間隔で３ヶ月間腹腔内注射（細胞２×１０^７個／０．２ｍｌ）した。融合の３日前、このマウスに、ＲＰＭＩ培地１６４０に浮遊させた細胞２×１０^７個を腹腔内チャレンジし、１×１０^８個のＬＮＣａＰ細胞から単離した原形質膜を静脈注射した。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）（Ｎａｔｕｒｅ ２５６、第４９５〜４９７頁）によって開発された手順を改変して用いて、細胞融合を行った。マウス脾細胞（細胞１×１０^８個）を、ＨｙＢＲＬ−Ｐｒｅｐ５０％ポリエチレングリコール１４５０（ベセスダリサーチラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））中にて５×１０^７個のマウス骨髄腫細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）と融合させた。融合細胞を９６ウェルの培養皿（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、カリフォルニア州オックスナード（Ｏｘｎａｒｄ））１０枚に分配し、湿った雰囲気中７．５％ＣＯ_２の存在下でヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地にて３７℃で増殖させた。１４日後、一次スクリーンにヒツジ由来の抗マウスＩｇＧβ−ガラクトシダーゼ結合Ｆ（ａｂ’）_２画分（アマシャムコーポレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．））またはヤギ抗マウスＩｇＧ西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート（バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して、ＬＮＣａＰ細胞およびＭＬＤ（正常なヒト線維芽細胞）からの原形質膜単離物への結合能について上清をアッセイした。プラスチック製のウェルに対するＬＮＣａＰ細胞の付着性が悪かったため、一次スクリーニングのプロセスにはＬＮＣａＰホールセルに代えて乾燥膜単離物（４００ｎｇ／ウェル）を用いた。この問題を回避するために、セクション１．５で説明するようにＬＮＣａＰホールセルを用いる使い捨てマイクロフォールド系（ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））での免疫濾過を確認アッセイとして利用した。また、ニトロセルロース膜でのドット免疫結合アッセイ（セクション１．４）を利用して、ＬＮＣａＰ細胞の細胞質および原形質膜の粗調製物に対するハイブリドーマ上清の反応性（１００，０００×ｇ上清）をスクリーニングした。原形質膜および／またはＬＮＣａＰホールセルとの反応性を示す培養の特異性スペクトルを判断するために、セクション１．５で説明するように、別の９つのヒト生存細胞株、ヒト正常細胞株およびヒト腫瘍性細胞株のパネル上でのＥＬＩＳＡで培養液をさらに試験した。

１．３．原形質膜が豊富な画分の単離
公開されている方法（Ｋａｒｔｎｅｒら（１９７７年）Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．３６、第１９１〜２１１頁）を改変して用いて、ＬＮＣａＰ細胞および正常なヒト二倍体線維芽細胞種ＭＬＤから原形質膜が豊富な（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）画分を得た。簡単に説明すると、ローラーボトルに入れたＭＬＤ細胞またはプラスチック製培養フラスコに入れたＬＮＣａＰ細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回静かにすすいだ。続いて、細胞を低浸透圧の溶菌緩衝液（３ｍＭヘペス［ヒドロキシエチルピペラジン−エタンスルホン酸］（ｐＨ７．０）、０．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）で１回すすぎ、緩衝液を廃棄した。それぞれのボトルまたはフラスコに新鮮な溶菌緩衝液（５〜２５ｍｌ）を加え、室温にて３０分間放置して細胞を膨潤させた。膨潤細胞を表面から取り出し、手で振盪して破壊した。試料液滴を位相差顕微鏡で観察し、破壊の進み具合を監視した。１０ｍｌのピペットを用いて静かに粉砕（８〜１０回）し、ＬＮＣａＰ細胞の破壊を終えた。ＭＬＤ細胞を完全に細かくするのには強く振盪してピペット粉砕する必要があった。フェニル−メチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ）（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））を加えてプロテオリシスを最小限に抑えた。破壊細胞の懸濁液を１００×ｇで遠心処理して核と破壊が不十分な細胞の凝集塊とを取り除いた。核ペレットを溶菌緩衝液で１回洗浄し、遠心処理後に上清を最初の上清と合わせ、４℃にて３，０００×ｇで１０分間遠心処理した。ミトコンドリアとデブリからなるペレットを廃棄し、膜ライゼートとした上清をそれぞれ１０％、３０％、３８％蔗糖（ｗ／ｖ）１５ｍｌからなる不連続な密度勾配上に重層し、ＳＷ２５．２ローター（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ））にて６０，０００×ｇで２時間半遠心処理した。１０％蔗糖層と３０％蔗糖層との間の界面における物質のバンディングを吸引除去し、溶菌緩衝液を用いて蔗糖のない状態で洗浄し、３６，０００×ｇで６０分間の遠心処理によりペレット化した。ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、原形質膜に対するマーカーとしてのタンパク質と酵素ホスホジエステラーゼ−Ｉ（ＥＣ３．１．３．３５）のアッセイ用にアリコートを得た。ハイブリドーマ上清のスクリーニングアッセイでは１０／３０原形質膜単離物を利用した。すべての画分を分注し、使い捨て（ｓｉｎｇｌｅ−ｕｓｅ）アリコートとして−９０℃で保管した。

１．４．ドット免疫結合アッセイ
ドット免疫結合アッセイを使用して、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマの上清（Ｈａｗｋｅｓら（１９８２年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９、第１４２〜１４７頁）を大量にスクリーニングした。細胞抗原を含む原形質膜の粗単離物、１０／３０原形質膜単離物および／または細胞質画分を、洗浄したニトロセルロース濾紙グリッド（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に滴下した（１〜３μｌ）。「抗原」のタンパク質濃度は０．１から０．１ｍｇ／ｍｌの範囲であった。完全に乾燥させた後、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中にてフィルタを洗浄した。ＴＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州セントルイス）で１５分間室温にて濾紙を処理したところ、反応の実施に用いたフィルタとプラスチックの入れ物の壁面で非特異的抗体結合部位のブロックが生じた。この濾紙を、ＴＢＳを何回か変えながらハイブリドーマ上清または精製モノクローナル抗体（２〜２０μｌ）と共に６０分間インキュベートし、ブロッキングステップを繰り返した。西洋わさびペルオキシダーゼ（バイオラド）（ブロッキング溶液で１：１０００希釈）にコンジュゲートした第２の抗体である（Ｆ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＩｇＧ）を加え、３７℃で１２０分間インキュベーションを実施した。ＴＢＳで洗浄後、４−クロロ−１−ナフトール（ＴＢＳ中０．６ｍｇ／ｍｌ、メルクインコーポレイテッド（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．））と過酸化水素（０．０１％ｖ／ｖ）を用いてペルオキシダーゼ活性を付与した。白色のフィルタの背景に青色の点々で陽性反応が認められた。

細胞質画分と膜画分を免疫ブロット法で調べたところ、ＬＮＣａＰ細胞の可溶性細胞質画分は反応性ではなかったのに対し、沈降可能な（約１０５，０００×ｇ）膜に関連した画分ではモノクローナル抗体７Ｅ１１を用いたときに強い陽性のスポットが得られた。

１．５．酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
抗原の一般的な酵素免疫アッセイとモノクローナル抗体産生のスクリーニングに、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を利用した。アッセイの４〜７日前に標的細胞をマイクロタイタープレート（ファルコン）に播種（細胞２〜３０×１０^４個／ｍｌ）した。プレート上の非特異的結合部位を、細胞を生存させた状態で維持できるように処方した、特殊培地（ＦＬ）中１％（ｗ／ｖ）ブタゼラチンでブロックした。このＦＬ培地は、１５ｍＭヘペス、０．３％ＮａＣｌ、１０ｍＭＮａＮ_３およびブタゼラチン（ブロッキング用で１％、洗浄用で０．３％）を加えたｐＨ７．２〜７．４のダルベッコ変法イーグル培地（ギブコ）で構成されたものであった。ハイブリドーマ培養液（ウェルあたり５０μｌ）を加え、３７℃で６０分間インキュベーションを行った。プレートをＦＬ培地で４回洗浄し、β−ガラクトシダーゼ（ｇａｌａｃｔｏｘｉｄａｓｅ）コンジュゲートに代えて西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）_２ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．３％ブタゼラチン中１：１２５０、０．０１Ｍ ＰＢＳ）を用いた。洗浄後、基質（０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍｌ、３０％Ｈ_２Ｏ_２１０μｌ、α−フェニレンジアミン（シグマ）１０ｍｇ）１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを暗所で３０分間インキュベートし、２ＮのＨ_２ＳＯ_４／ウェル５０μｌで反応を停止させた。バイオテックＥＩＡリーダーを用いて４９０ｎｍでの吸光度を求めた。

最初に、ハイブリドーマ培養液の一次スクリーニングの手順でＬＮＣａＰ細胞から得られた原形質膜の乾燥粗単離物または乾燥細胞を用いた。緩衝液（Ｓ３ｍＭヘペス、０．３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）５０μｌ中膜タンパク質約４００ｎｇを、９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ファルコン）で乾燥させた（３５℃で一晩）。プレート上の非特異的結合部位を、０．１％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ中１％ブタゼラチンでブロックした。洗浄緩衝液が生理食塩水（ｐＨ７．６）中０．０１Ｍヘペスと０．２μＭ ＰＭＳＦとで構成されていること以外、使用した他の試薬はいずれも細胞表面酵素免疫アッセイで説明したものと同じとした。

ＬＮＣａＰ細胞は、プラスチック製のウェルにあまり付着しないため、ＥＬＩＳＡ法でプラスチック表面から剥がれてしまう。この問題を回避するために、ＬＮＣａＰホールセルを用いる使い捨てマイクロフォールド系（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック）での免疫濾過を、乾燥膜のアッセイ用の確認アッセイとして利用した。使い捨てマイクロフォールド系上の非特異的結合部位をＰＢＳ中５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でブロックした後、５％ＨＳＡ緩衝液１００μｌ中ＬＮＣａＰ細胞２．５×１０^４個を、真空を利用してフィルタ円板上に堆積させた。０．０１Ｍリン酸緩衝液中０．３％ゼラチンを用いてフィルタを洗浄後、プレートを上述したようにして処理した。しかしながら、基質と共にインキュベーション後、各ウェルから得られる反応混合物（１００μｌ）を１／２エリア（１／２ ａｒｅａ）コスタープレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））に移し、続いてＥＩＡリーダーでの顕微分光測定を行った。約５００の培養ウェルでハイブリドーマが検出された。２０６のハイブリドーマが増殖（ｅｘｐａｎｄ）に成功しており、一次ＥＬＩＳＡスクリーンでは、１２６が部分精製ＬＮＣａＰ膜と反応し、９２が無傷のＬＮＣａＰ細胞と反応し、７６が正常なヒト線維芽細胞−細胞および膜調製物と反応した。ＥＬＩＳＡ、別の１１の生存した正常細胞株と腫瘍性細胞株のパネル上で染色している免疫ペルオキシダーゼ、ＬＮＣａＰ細胞由来の細胞質画分および膜画分の免疫ブロット法を用いてさらにスクリーニングを行ったところ、ＭＡｂ ７Ｅ１１および９Ｈ１０を含む、関心の対象である２つのクローンハイブリドーマ細胞株のフィールドが狭まった。

特異性がＬＮＣａＰ細胞および膜に限定されたハイブリドーマ培養物を、限定希釈クローニング処理し、アガロース（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９８０年）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１１〜１５頁、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）などを参照のこと）でサブクローニングした。抗体産生ハイブリドーマの安定した培養物を完全培地（１０％（ｗ／ｖ）失活ウシ胎仔血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、インシュリン１０μｇ／ｍｌを加えたＲＰＭＩ １６４０培地）で増殖（ｅｘｐａｎｄ）させ、凍結保存した。クローニング後、２つの安定したモノクローナルハイブリドーマ細胞株が得られ、これをそれぞれ７Ｅ１１−Ｃ５および９Ｈ１０−Ａ４とした。

消耗後の培養液とマウス腹水液を以後の研究に用いる抗体源とした。ハイブリドーマ細胞株を含むマウスの腹水液を用いて、大量のモノクローナル抗体を得た。腹水液生成用のハイブリドーマ細胞をＲＰＭＩ １６４０培地で２回洗浄し、細胞１〜５×１０^７個／ｍｌの密度で再懸濁させた。２０ゲージの針を使って、細胞懸濁液０．２ｍｌをメスのヌードマウスの腹膜腔に注射した。動物のプレコンディショニングに毎回はプリスタンを使用しなかった。ハイブリドーマ細胞の注射後、４から５週間にわたって高力価の抗体を含む腹水液を定期的に採取した。

１．６．モノクローナル抗体のアイソタイピング
モノクローナル７Ｅ１１−Ｃ５および９Ｈ１０−Ａ４は、アイソタイプ特異的抗血清（マイルズ（Ｍｉｌｅｓ））を用いる二重ゲル拡散沈降試験で判断すると、ＩｇＧｌサブクラスに属する。この知見に一致するのが、フルオレセインまたは西洋わさびペルオキシダーゼ（バイオラド）とコンジュゲートさせたタンパク質Ａが、どちらのモノクローナルと共にインキュベーションをしてもＬＮＣａＰ細胞のスミアと反応しないという観察結果であった。

実施例２．７ＥＣ１１−Ｃ５のコンジュゲーション
０．１Ｍヘペス緩衝液中、タンパク質に対するキレート剤の比を５０および２００にし、２０℃および３７℃で４時間、ｐＨ８および９でコンジュゲートを調製した。抗体７Ｅ１１−Ｃ５の濃度は０．０２２ｍＭとした。ゲル濾過クロマトグラフィでコンジュゲートを精製した。ロット番号と反応条件を表１にまとめておく。表２から明らかなように、観察された平均負荷値は０．２から５．３であった。モル比、温度、ｐＨを増すと、コンジュゲーション反応が容易になった。

見かけ上の分子量を求めるために、高解像度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１）でタンパク質試料を分析した。各モノクローナル抗体およびそれぞれのコンジュゲートで、約２５および５０ｋＤａで明らかに異なる２つのタンパク質バンドが観察された。

コンジュゲーション後のタンパク質の完全性を求めるために、サイズ排除クロマトグラフィを実施した。非修飾タンパク質についても分析し、コンジュゲーション後に何らかの凝集が発生したかの比較検討を行った。非修飾タンパク質とコンジュゲートの相対ピーク面積を表３にまとめておく。非修飾タンパク質のクロマトグラムと、コンジュゲートの代表的なクロマトグラムを図２に示す。非修飾７Ｅ１１−Ｃ５抗体には２つのピークが認められ、このうち１つは１５．５３分の時点（面積＝１．７９％）で溶出、メインピークは１８．１３分の時点（面積＝９８．２１％）で溶出された。コンジュゲートの小さなピーク面積には、２．２から４．４％の幅がある。

実施例３．コンジュゲート抗体の複合体形成
ＭｅＯ−ＤＯＴＡ−７Ｅ１１−Ｃ５を、タンパク質濃度２．２５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．２、２０℃で、酢酸ナトリウム緩衝液中にて、^１７７Ｌｕとの間で複合体形成させた。緩衝液濃度５０、１００、２５０ｍＭの場合について検討した。サイズ排除クロマトグラフィで放射線値とＵＶを検出して、複合体形成を監視した。３０分の反応時間後に試料を分析した。結果を表４にまとめておく。

これらのデータから、複合体形成には１００ｍＭの緩衝液が最適であることが分かった。したがって、以後の複合体形成には１００ｍＭの緩衝液を選択した。

実施例４．ｐＨが複合体形成に対しておよぼす影響
１００ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液を用いて、ｐＨ５．５および６で複合体形成を実施した。ｐＨ５．５での代表的なクロマトグラムを図３に示す。３０分と２時間の時点で試料を分析した。凝集をＵＶによって判断したところ、３〜４％の間であった。ｐＨ５．５および６での複合体形成を表５にまとめておく。

これらのデータから、複合体形成反応の最適なｐＨが約５．５であることが分かる。

実施例５．高比活性コンジュゲートの調製
微量の^１７７Ｌｕ（ＨＰＬＣで放射線信号が得られるだけの十分な^１７７Ｌｕ）を用いて行う複合体形成に基づき、高比活性物質の調製に以下の条件を選択した。１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、３７℃、ｐＨ５．５、タンパク質濃度２．５ｍｇ／ｍＬ。０．５ｍｇのタンパク質と６５６ｍＣｉの^１７７Ｌｕを利用した。サイズ排除クロマトグラフィで反応を監視した。目標とする比活性は１ｍＣｉ／ｍｇとした。表６に結果をまとめておく。放射活性取り込み率９０％で計算して、複合体−コンジュゲートの比活性は１．１８ｍＣｉ／ｍｇである。３０分以内で取り込み率が最大に達する。凝集は３％である。図４に３０分の時点でのクロマトグラムを示す。

上記にて示したデータを検討したところ、本発明の抗体、好ましくは７Ｅ１１−Ｃ５のコンジュゲーションに最適な条件は、リンカーと抗体とのモル比約２００：１、３７℃、０．１Ｍヘペス緩衝液にて、ｐＨ８．５で若干攪拌しながら前記抗体を約４時間インキュベートする形である。得られる抗体はＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体とのモル比が約９：１またはそれよりも大きい状態ででコンジュゲートされる。１００ｍＭ Ｎａ−酢酸中、ｐＨ５．５、２０℃、０．５時間で最適な複合体形成反応が起こる。得られる抗体は、複合体形成率９０％で１．２ｍＣｉ／ｍｇの７Ｅ１１−Ｃ５である。当業者であれば、これらの条件を改変および変更することで、実際にコンジュゲートされ複合体形成される抗体組成物が若干変わってくることは理解できよう。

実施例６：抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）
抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）は、現在はその市販品であるＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（登録商標）の製造に用いられている７Ｅ１１Ｃ５−３モノクローナル抗体（ＣＹＴ−３５１）で構成されている。ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ（登録商標）は、ガンマ放射性同位元素（ｒａｄｉｏｉｓｔｏｐｅ）^１１１Ｉｎとの間で複合体形成されるリンカー−キレーターＧＹＫ−ＤＴＰＡ ＨＣｌ ［グリシル−チロシル−（Ｎ−Ｃ−ジエチレントリアミン五酢酸）−リシン塩酸塩］に対する重鎖に位置する炭水化物基の過ヨウ素酸酸化によってコンジュゲートされたＣＹＴ−３５１である。抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲートは、リンカー−キレーターｍｅＯ−ＤＯＴＡ［α−（５−イソチオシアナト−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸］に共有結合的にコンジュゲートされたＣＹＴ−３５１で構成される。

ＣＹＴ−３５１−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲートはヒト血清中で安定であるため、分断された（ｓｈｅｄ）リンカーおよび／または放射性同位元素による二次毒性の可能性が低くなることが明らかになっている。

実施例７：７Ｅ１１Ｃ５−３モノクローナル抗体（ＣＹＴ−３５１）
ＣＹＴ−３５１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＬＮＣａＰヒト前立腺腺癌生細胞および部分精製ＬＮＣａＰ原形質膜で免疫化することで生成されたマウス／マウスハイブリドーマ細胞株により分泌されるマウスＩｇＧｌモノクローナル抗体である。マウスの免疫化に用いるＬＮＣａＰ細胞株は、ヒト前立腺腺癌のリンパ節転移で採取した針生検から樹立された、十分にキャラクタライズされている連続細胞株である。ＬＮＣａＰ細胞は生体外で容易に増殖し、半固体培地でクローンを形成し、いくつかのマーカー染色体を持つ異数体（染色体数７６〜９１）のヒト男性核型を示し、腺癌の悪性の性質を保つ。

ＣＹＴ−３５１ハイブリドーマが樹立され、最初はＨｏｒｏｓｚｅｗｉｃｅｚら（１９８７年）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７、第９２７〜９３６頁および米国特許第５，１６２，５０４号明細書および同第５，５７８，４８４号明細書）によって説明された。ＬＮＣａＰ生細胞で免疫化したマウスの脾臓細胞をＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞と融合させた。これらの細胞を、限定希釈クローニングによって２回クローニングし、安定したハイブリドーマであるハイブリドーマ７Ｅ１１−Ｃ５を増殖（ｅｘｐａｎｄ）させ、凍結保存した。このクローンは、もともとモノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ５であったＩｇＧｌサブクラスの前立腺特異的モノクローナル抗体を分泌した。

ＣＹＴ−３５１シードストックの培養物を利用して、１００バイアルのマスターセルバンク（ＭＣＢ）を樹立した。シングルバイアルの細胞を解凍し、２．５％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を加えた基底細胞培養液入りの２５ｃｍ^２容のフラスコに細胞を回収した。続いて、これらの細胞を、７５ｃｍ^２容のフラスコと、１５０ｃｍ^２容のフラスコと、５００ｍｌ容のスピナフラスコとに増殖（ｅｘｐａｎｄ）させ、最後に３リットルのスピナに増殖させた。これらの細胞を収集し、凍結培地（２０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを加えた基本培地）に接種した。続いて、細胞を１００のバイアルに各々が細胞約９×１０^６個を含むようにアリコートし、２ＭＭ０１８０−Ｍ００１−９Ｍの表示をラベルで示し、続いて液体窒素の気相中にて保管した。血清増殖ＭＣＢから１０のバイアルを試験に用いて、調製物が滅菌状態にあり、感染性の外来因子を含まないかどうかを判断した。これらの試験の結果から、ＣＹＴ−３５１ ＭＣＢが滅菌状態にあり、感染性の外来因子を含まないものであることが分かった。

実施例８：メトキシ−ＤＯＴＡリンカー
純粋な合成手法でメトキシ−ＤＯＴＡ（α−（５−イソチオシアナト−２−メトキシフェニル）−ｌ，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）を調製する。ｍｅＤＯＴＡおよびその使用方法ならびに製造方法が、米国特許第５，４３５，９９０号明細書および同第５，６５２，３６１号明細書に開示されており、これらの内容全体を本願明細書に援用する。

実施例９：ＣＹＴ−３５１製造工程
抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）作製用のＣＹＴ−３５１中間抗体の作製に用いたセルバンク、成分、原料および製造工程については、ＧＭＰ製造工程に準拠してそのように行ったものである。

ＣＹＴ−３５１ハイブリドーマ用の増殖／生成培地は、ハイクローンラボラトリー（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手可能な定義済みの無血清培地（ＨｙＱ−ＣＣＭ（商標））であり、９２５の基本培地で構成されている。ＡｃｕＳｙｓｔ−Ｘｃｅｌｌホーローファイババイオリアクターにて、ｐＨ、温度、酸素レベルを終始監視して細胞培養を行う。試料を取り出し、グルコース、乳酸塩、ＣＹＴ−３５１の各レベルを監視する。蠕動ポンプで培地を供給する。バイオリアクターで培地を灌流し、ＣＹＴ−３５１を含有する馴化培地を収集し、濾過により清澄化し、２から８℃で保管する。この生産過程を一般に６０から７０日間継続する。

各ＣＹＴ−３５１収穫物をサンプリングし、ＣＹＴ−３５１の力価、免疫反応性、エンドトキシン、バイオバーデンについて試験する。精製前に、プールした収穫試料について、逆転写酵素、ＸＣプラーク、Ｓ＋Ｌ−Ｆｏｃｕｓ、生体外ウイルス試験により、ＣＹＴ−３５１濃度、マイコプラズマ、滅菌性、ウイルスの最小限の試験を行う。

適当な環境監視下で指定の（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ）部屋でＣＹＴ−３５１を収穫して精製し、無菌処理ができるようにする。ＣＹＴ−３５１収穫物を０．４５μｍのフィルタで濾過し、３０ｋＤａのカットオフ膜を取り付けたＰｅｌｌｉｃｏｎ接線流限外濾過装置を用いて約６から１２ｍｇ／ｍｌ ＣＹＴ−３５１まで濃縮する。濃縮に続き、濃縮されたＣＹＴ−３５１粗生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通し、低分子量成分を除去する。Ｇ−２５カラムについては、０．７Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８．０から８．４）で平衡化し、溶出する。

溶出タンパク質（ＣＹＴ−３５１）ピークを、０．７Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したタンパク質Ａ親和性カラムに流す。流したタンパク質Ａカラムをカラム容積３０の０．７Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄した後、５５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０から８．５）で短時間洗浄する。５５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０から４．５）を用いて結合ＣＹＴ−３５１をタンパク質Ａカラムから溶出させ、溶出生成物のｐＨを５５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０から８．５）で５．１から５．３に調節する。

タンパク質Ａ精製物質を、５５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１から５．３）にて平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムに通す。これは、ＣＹＴ−３５１がカラムを通るのに対し、ＤＮＡ、アルブミン、他の酸性成分が支持体に結合するという観点で、受動的な精製ステップである。

続いて、ＣＹＴ−３５１ピークを、５５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．１から５．３）で平衡化したＳ−セファロースカラムに流す。このカラムを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．９から６．１）で洗浄する。結合ＣＹＴ−３５１を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ５．９から６．１）で溶出させる。精製ＣＹＴ−３５１を滅菌した０．２２μｍで濾過し、品質管理試験用にサンプリングし、コンジュゲーションで必要になるまで２から８℃で保管した。滅菌濾過バルクＣＹＴ−３５１の承認された有効期間は２から８℃で３年である。

実施例１０：免疫コンジュゲートＣＹＴ−５００の製造工程
コンジュゲーションの前に、精製ＣＹＴ−３５１をＤＶ−２０（ＰＡＬＬ）ウイルス除去フィルタに通す。上述したＣＹＴ−３５１の商用製造工程では、８．９ログのウイルス除去量となる。ＤＶ−２０フィルタを用いると、さらに５から６ログのウイルス除去量となり、結果として約１４ログの除去量となる。

精製モノクローナル抗体ＣＹＴ−３５１を、０．５Ｍヘペス（ｐＨ８．８５）中０．２２μｍで濾過（酢酸セルロース）したｍｅＯ−ＤＯＴＡと組み合わせる。リンカーとＣＹＴ−３５１との比は７０：１であり、合計６グラムのＣＹＴ−３５１を毒物学のロット（臨床ロットもＣＹＴ−３５１ ６グラムの規模である）に使用する。反応混合物を、静かに攪拌しながら３５から３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、反応混合物を１Ｍ酢酸で７．０に調整し、反応速度を落とす。こうして得られる生成物を、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ ５０フィルタが１つあるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ系で約１９００から３００ｍｌに濃縮した。濃縮物を２〜８℃で一晩保管した。この濃縮物を、９×９０ｃｍのＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いてクロマトグラフィにかけた。メインの（生成物）画分を回収し、Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ Ｂｉｏｍａｘ ５０フィルタが１つあるＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ系を用いて約２１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。この物質（ＣＹＴ−５００）を０．２２μｍのフィルタで濾過し、２から８℃で保管した。

バルクＣＹＴ−５００を２から８℃で保管し、使用目的で放出する前に汚染物質について試験する。放出したＣＹＴ−３５１を０．２２μｍの滅菌フィルタで濾過し、１０ｍｌ容のタイプ１のホウケイ酸ガラス製バイアルに充填し、滅菌済みの２０ｍｍのストッパで栓をする。中身を充填し、ラベルを付けていないバイアルを２０ｍｍのフリップオフ圧着（ｃｒｉｍｐ）で密閉し、可視的に検査し、品質管理試験用にサンプリングする。「検疫」延期の放出物（ｐｅｎｄｉｎｇ ｒｅｌｅａｓｅ）とマークしたトレイにバイアルを載置する。

実施例１１：７Ｅ１１−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ血清の安定性
抗体−キレート剤免疫コンジュゲートの重要な要件のひとつに、関心の対象となる金属（この場合は^１７７Ｌｕ）との間で動力学的に不活性な複合体を形成することがある。これらの複合体は、タンパク質とコンジュゲートさせた後に安定でなければならず、生体内では無傷のままで二次毒性を回避すべきである。同様に、ランタノイド金属が失われると、肝臓および骨に対する放射線の線量などの毒性作用が生じる。このため、本願発明者らは、^１７７Ｌｕ標識ＣＹＴ−５００の血清安定性を試験し、これを^１１１Ｉｎ標識ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔと比較した。

サイズ排除クロマトグラフィを利用して、血清中での複合体−コンジュゲートからの放射活性（^１７７Ｌｕ）の消失について分析した。複合体形成されていない^１７７Ｌｕは、血清タンパク質と会合し、^１７７Ｌｕ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ−免疫コンジュゲート（^１７７Ｌｕ−ＣＹＴ−５００）と同様に高分子量の種で溶出されやすい。血清タンパク質がＬｕと非特異的に弱く結合することから、本願発明者らは、血清タンパク質^１７７Ｌｕ複合体と^１７７Ｌｕ−ＣＹＴ−５００とを区別することができる。^１７７Ｌｕと血清タンパク質との間の弱い会合はＤＴＰＡによって破壊されるが、ＤＴＰＡはＤＯＴＡタイプのキレートからの金属をキレート交換反応させることができない。

１パーセントの金属が複合体コンジュゲートから失われたことを測定可能かどうかを判断するために、^１７７Ｌｕ−ＣＹＴ−５００と^１７７Ｌｕ−ＭｅＯ−ＤＯＴＡとの混合物を調製した。^１７７Ｌｕ−ＣＹＴ−５００と^１７７Ｌｕ−ＭｅＯ−ＤＯＴＡとを混合する前に、これら両方の放射活性を放射線カウントで判断した。２つの試料を調製した。第１の試料では、全放射活性の７％が^１７７Ｌｕ−ＭｅＯ−ＤＯＴＡからのものであり、第２の試料では１％がそうであった。サイズ排除クロマトグラフィ分析を行った結果、放射活性の９．８および３．０％が低分子量の成分として溶出していることが明らかになった。クロマトグラフィによる方法とカウントでは、実験誤差の範囲内で同じ結果が得られた。

^１７７Ｌｕ−ＣＹＴ−５００抗体コンジュゲートをヒト血清中にてインキュベートし、ＨＰＬＣ分析を行う前にＤＴＰＡを試料に加えて非特異的結合Ｌｕを複合体化した。結果を表７にまとめておく。２週間の研究期間中、^１７７Ｌｕ−ＣＹＴ−５００では些細な金属損失が認められ（０日目に９８％、１５日目に９６％）、^１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−Ｃｙｔ−３５１（１日目に９８％、１５日目に９１％）で観察された金属の損失量が最低であった。混合物の高分子量の成分に関連した放射活性を、ＤＴＰＡの追加後にサイズ排除クロマトグラフィで求めた。

実施例１２：ラットにおける７Ｅ１１−ｍｅＯ−ＤＯＴＡの急性毒性研究
本研究の目的は、オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈注射で１回投与した場合の抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）の潜在毒性（神経毒性を含む）を判断することであった。８０匹のオスのラットを無作為に４つの群のうちの１つに関連させ、試験日（ＳＤ）に３、１５または３０ｍｇ／ｋｇの量で１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（対照物品）または抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）を１回投与した。ＳＤ４に４０匹のラット（１０匹／群）の完全な肉眼（ｆｕｌｌ ｇｒｏｓｓ）剖検を実施した。残りのラットについてはＳＤ１５に剖検した。別の２７匹のラットを３つの処理群（９匹／群）のうちの１つに割り当て、以後の毒物動態学的プロファイリングのために選択した時点での血液を回収した。

評価対象としたパラメータには、死亡率、臨床所見、体重、飼料消費量、神経毒性、眼科、臨床病理、肉眼病理、絶対臓器重量および相対臓器重量、組織病理が含まれていた。抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）での処置は、死亡率、臨床所見、体重、飼料消費量、神経毒性、眼科、臨床病理、肉眼病理、絶対臓器重量および相対臓器重量ならびに組織病理に何ら影響しなかった。したがって、本研究の条件下では、観察された無影響量（ＮＯＥＬ）は少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ（人間での想定用量の１００×）である。

実施例１３：イヌにおける７Ｅ１１−ｍｅＯ−ＤＯＴＡの急性毒性研究
本研究の目的は、オスのビーグル犬に静脈注射で１回投与した場合の抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）の潜在毒性を判断することであった。２４匹のオスのイヌを無作為に４つの群のうちの１つに関連させ、ＳＤ１に０．６、３または６ｍｇ／ｋｇの量で１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（対照物品）または抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）を１回投与した。ＳＤ４に１２匹のイヌ（１群あたり３匹）を完全な肉眼剖検を実施した。残りの１２匹のイヌについてはＳＤ１５に剖検した。評価対象としたパラメータには、死亡率、臨床所見、体重、飼料消費量、眼科、心臓病学、臨床病理、肉眼病理、絶対臓器重量および相対臓器重量、組織病理が含まれていた。

抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）での処置は、死亡率、臨床所見、体重、飼料消費量、眼科、心臓病学、臨床病理、肉眼病理または絶対臓器重量ならびに相対臓器重量に何ら影響しなかった。試験物品に関連した所見は、処置済み動物における肝臓の中心静脈の脈管炎からなるものであった。ＳＤ４の動物では病変が一層顕著であり、存在してはいるが、ＳＤ１５の動物では分解しているように見えた。ＳＤ４の動物での最も重篤な病変は、３または６ｍｇ／ｋｇ（それぞれ人間での想定用量の１０および２０×）で処置した動物で認められた。ＳＤ１５までには、病変が全体的に軽くなったことから、時間分解能を増すことが可能ではないかと思われる。結論として、抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）の静脈注射は全般的に十分に許容されるものであった。

実施例１４：７Ｅ１１−ｍｅＯ−ＤＯＴＡの心血管安全性薬理研究
本研究の目的は、オスのビーグル犬で抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）を静脈内投与後に心血管安全性を評価することであった。７匹のオスのイヌに、ＳＤ１に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、続いて抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）をＳＤ８に０．６ｍｇ／ｋｇ、ＳＤ１５に３ｍｇ／ｋｇ、ＳＤ２２および２９に６ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。各用量の投与に続いて少なくとも１週間の洗浄期間を設けた。ＳＤ１、８、１５および２２の用量後に遠隔測定で心血管プロファイリングと体温データとを収集した。他の評価対象としたパラメータには、死亡率、臨床所見、体重が含まれていた。

最大６ｍｇ／ｋｇまでの用量での抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）での処置は、血圧、心拍数、心電図のパラメータ、体温、体重または死亡率に何ら影響しなかった。１匹の動物がＳＤ２２に６ｍｇ／ｋｇの用量の投与直後にアナフィラキシーを起こした。この動物は研究から除外し、ストック群（ｓｔｏｃｋ ｃｏｌｏｎｙ）に戻した。６ｍｇ／ｋｇの単回用量と繰り返し用量のどちらでも、他の動物ではアナフィラキシーの徴候は観察されなかった。結論として、最大６ｍｇ／ｋｇまでの用量での抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）の静脈注射は全般的に十分に許容されるものであった。

実施例１５：７Ｅ１１−ｍｅＯ−ＤＯＴＡの呼吸機能研究
本研究の目的は、オスのビーグル犬で抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）を静脈内投与後に呼吸機能を評価することであった。６匹のオスのイヌに、ＳＤ１に１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ＳＤ４に６ｍｇ／ｋｇで抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）を静脈注射した。評価対象としたパラメータには、死亡率、臨床所見、体重および呼吸機能の評価内容が含まれていた。呼吸機能の評価内容には、呼吸数、血中酸素飽和度（ＳｐＯ_２）、呼気終末圧（ＥＴＣＯ_２）が含まれていた。

抗ＰＳＭＡ−ｍｅＯ−ＤＯＴＡ免疫コンジュゲート（ＣＹＴ−５００）での処置は、死亡率、臨床所見、体重または呼吸機能に何ら影響しなかった。したがって、本研究の条件下では、観察された無影響量（ＮＯＥＬ）は少なくとも６ｍｇ／ｋｇである。

以上、本発明について詳細に説明したが、本発明の範囲から逸脱することなくさまざまな改変をなし得ることは理解できよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。本願明細書で参照した引用特許、特許出願ならびに刊行物についてはいずれも、その内容全体を本願明細書に援用する。

本願明細書に引用した参考文献はいずれも、個々の刊行物または特許または特許出願全体を具体的かつ個別にあらゆる目的で本願明細書に援用したのと同じ度合いで、その内容全体をあらゆる目的で本願明細書に援用するものである。

当業者であれば明らかなように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対して多くの改変ならびに変更を行うことが可能である。本願明細書に記載の特定の実施形態は、一例としてあげたものにすぎず、本発明は添付の特許請求の範囲に記載の用語ならびに当該特許請求の範囲が画定する等価な包括的範囲によってのみ限定されるものである。

図面の簡単な説明
表１に記載の条件で調製した（ＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされる）８ロットの７Ｅ１１−Ｃ５コンジュゲートをクマシー染色した一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％）である。矢印は、重鎖（５０ｋＤＡ）および軽鎖（２５ｋＤＡ）を示す。 図２Ａは７Ｅ１１−Ｃ５抗体のサイズ排除クロマトグラムであり、図２ＢはそのＭｅＯ−ＤＯＴＡコンジュゲート（ロット２００４０２４９５−５／８））の代表的なクロマトグラムである。非修飾タンパク質および非修飾コンジュゲートの相対ピーク面積を表３にまとめてある。 図３Ａ−３Ｄは、表記の条件に基づくＭｅＯ−ＤＯＴＡ−Ｃｙｔ３５１、２００４０２４９５−２９の異なる複合体形成（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）でのサイズ排除クロマトグラムである。非修飾タンパク質および非修飾コンジュゲートの相対ピーク面積を表５にまとめてある。 ３０分の時点での高比活性コンジュゲート調製物のサイズ排除クロマトグラムである。非修飾タンパク質および非修飾コンジュゲートの相対ピーク面積を表６にまとめてある。

Claims (47)

1. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされている、抗体またはその断片。
2. 前記モノクローナル抗体が７Ｅ１１−Ｃ５である、請求項１に記載の抗体。
3. ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きい、請求項２に記載の抗体。
4. 前記放射性同位元素が、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^６４Ｃｕ_、 ^１８７Ｒｅ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１７７Ｌｕからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
5. 前記抗体が７Ｅ１１−Ｃ５であり、前記放射性同位元素が^１７７Ｌｕである、請求項１に記載の抗体。
6. 前記放射性同位元素および前記抗体が、約９：１またはそれよりも大きい比で存在する、請求項５に記載の抗体。
7. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を、それが必要な患者に投与することを含む、ＰＳＭＡを発現する悪性細胞を含む癌の治療方法であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされている、方法。
8. 前記抗体が７Ｅ１１−Ｃ５である、請求項７に記載の方法。
9. ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きい、請求項８に記載の方法。
10. 前記放射性同位元素が、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^６４Ｃｕ_、 ^１８７Ｒｅ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１７７Ｌｕからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
11. 前記抗体が７Ｅ１１−Ｃ５であり、前記放射性同位元素が^１７７Ｌｕである、請求項７に記載の方法。
12. 前記放射性同位元素および前記抗体が、約９：１またはそれよりも大きい比で存在する、請求項１１に記載の方法。
13. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を投与することを含む、患者における腫瘍のイメージング方法であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされている、方法。
14. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片に、組織試料を曝露することを含む、ＰＳＭＡを発現する悪性細胞を含む癌の診断方法であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされている、方法。
15. 前記抗体が７Ｅ１１−Ｃ５である、請求項１４に記載の方法。
16. ＭｅＯ−ＤＯＴＡと抗体との比が約９：１またはそれよりも大きい、請求項１５に記載の方法。
17. 前記放射性同位元素が、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^６４Ｃｕ_、 ^１８７Ｒｅ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１７７Ｌｕからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
18. 前記抗体が７Ｅ１１−Ｃ５であり、前記放射性同位元素が^１７７Ｌｕである、請求項１４に記載の方法。
19. 前記放射性同位元素および前記モノクローナル抗体が、約９：１またはそれよりも大きい比で存在する、請求項１４に記載の方法。
20. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片を含む医薬組成物であって、前記抗体がＭｅＯ−ＤＯＴＡリンケージを介して放射性同位元素にコンジュゲートされている、医薬組成物。
21. 前記抗体が７Ｅ１１−Ｃ５であり、前記放射性同位元素が^１７７Ｌｕである、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記放射性同位元素および前記抗体が約９：１またはそれよりも大きい比である、請求項２１に記載の組成物。
23. １以上の容器内に、請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体を含む、キット。
24. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に免疫特異的に結合する抗体またはその断片をＭｅＯ−ＤＯＴＡとコンジュゲートさせる方法であって、ＭｅＯ−ＤＯＴＡおよび前記抗体を、それぞれ約５：１またはそれよりも大きいモル比でインキュベートすることを含む、方法。
25. 前記モル比がそれぞれ約１０：１である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記モル比がそれぞれ約５０：１である、請求項２４に記載の方法。
27. 前記モル比がそれぞれ約１００：１である、請求項２４に記載の方法。
28. 前記モル比がそれぞれ約１５０：１である、請求項２４に記載の方法。
29. 前記モル比がそれぞれ約２００：１である、請求項２４に記載の方法。
30. 前記抗体が７Ｅ１１−Ｃ５である、請求項２４に記載の方法。
31. 請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体と放射性同位元素との間で複合体を形成する方法であって、複合体形成反応が、ｐＨ４．５から６．５の間で実施される、方法。
32. ｐＨが５．５である、請求項３１に記載の方法。
33. 請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体と放射性同位元素との間で複合体を形成する方法であって、複合体形成反応が、酢酸ナトリウム緩衝液濃度５０ｍＭから２５０ｍＭの間で実施される、方法。
34. 酢酸ナトリウム緩衝液が１００ｍＭである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体。
36. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体。
37. 前記抗体がヒト抗体である、請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体。
38. 前記抗体が、細胞内または細胞質内エピトープまたはドメインと結合する、請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体。
39. 前記抗体が、細胞外エピトープまたは細胞外ドメインと結合する、請求項１、２、３、４、５または６に記載の抗体。
40. 少なくとも１種の別の薬剤を投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
41. 前記別の薬剤が放射線を含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記別の薬剤が化学療法薬を含む、請求項４０に記載の方法。
43. 前記別の薬剤が細胞毒性薬を含む、請求項４０に記載の方法。
44. 前記細胞毒性薬が、ＰＳＭＡのエピトープに対する結合を強める、請求項４３に記載の方法。
45. 前記エピトープが、ＰＳＭＡの細胞質ドメインに位置する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記癌が前立腺癌である、請求項７に記載の方法。
47. 前記癌が、腎細胞癌、結腸癌、移行上皮癌、肺癌、乳癌、前立腺腺癌、乳管癌、小葉癌、浸潤性腺管癌、髄様癌、粘液性癌からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。

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