CN103372221B - 用于蛋白质、肽和其他分子的改进的f-18标记的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了用于例如PET成像技术的F-18标记分子的组合物和合成方法以及用途。在特定的实施方案中，标记的分子可以是肽或蛋白质，虽然其他类型的分子(包括但不限于适体、寡核苷酸和核酸)可被标记并用于此类成像研究。在优选的实施方案中，F-18标记可通过形成金属络合物并将F-18-金属络合物结合至螯合部分(诸如DOTA、NOTA、DTPA、TETA或NETA)而与靶向分子轭合。在其他的实施方案中，金属可首先与螯合基团轭合，随后F-18结合至金属。在其他优选的实施方案中，F-18标记的部分可包含可靶向的轭合物，其可与双特异性或多特异性抗体联合使用，以将F-18靶向到与疾病、医疗状况或病原体相关的细胞或组织上表达的抗原。示例性结果显示F-18标记的可靶向轭合物肽于37℃下在人血清中稳定数小时，有足够的时间进行PET成像分析。

Description

用于蛋白质、肽和其他分子的改进的F-18标记的方法和组 合物
本申请是国际申请号为PCT/US2007/088064、国际申请日为2007年12月19日、进入国家阶段的申请号为200780048376.8、发明名称为“用于蛋白质、肽和其他分子的改进的F-18标记的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2007年1月11日提交的美国临时专利申请第60/884,521号的权益。
领域
在某些实施方案中，本发明涉及用F-18标记肽的简单方法，其可用于体内成像。施用于患者时，F-18标记肽的优选比活性将为约1,000至2,000Ci/mmol。也可使用100至数万Ci/mmol范围内的比活性。优选地，F-18标记的完成不需要纯化步骤来分离未标记的肽和标记的肽。
背景
正电子成像术(PET)成像提供了高分辨率和从PET图像定量。肽或其他小分子可用正电子发射体(仅举几例，18F、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、94mTc、86Y和124I)标记。从同位素的核发射的正电子根据使用的同位素而以不同能量喷射。当正电子与电子反应时，两种511keVγ射线以相反的方向发射。喷射的正电子的能量控制正电子在其通过撞击电子而被湮灭之前飞行的平均距离。喷射能越高，正电子与电子碰撞前飞行得越远。希望PET同位素具有低喷射能，以使正电子在其产生被PET照相机成像的两种511keVγ射线前从靶位点飞行的距离最小。发射正电子的许多同位素在其衰变链中也具有其他发射，诸如γ射线、α粒子或β粒子。希望具有为纯的正电子发射体的PET同位素，以便将任何发射量测定问题减至最小。
同位素的半衰期也是重要的，因为半衰期必须足够长，以便将同位素连接至靶向分子、分析产物、将其注射于患者、允许产物定位、从非靶组织中清除和然后成像。如果半衰期太长，则比活性可能不够高到获得足够的光子来得到清晰的图像，而如果半衰期太短，则生产、商业分配和生物分配(biodistribution)需要的时间可能不够。F-18(β+635keV97％，t1/2 110分钟)由于它的低正电子发射能、无侧向发射和合适的半衰期，而成为最广泛使用的PET发射同位素之一。产生的F-18具有高比活性。如果将F-18连接至具有非常高吸收的分子(诸如2-氟-2-脱氧葡萄糖(FDG))，则比活性就不是那么重要了。不过，如果技术人员用标记肽靶向受体或进行免疫PET预靶向研究，则比活性仍是重要的。
肽的常规F-18标记包括标记具有高比活性的试剂，然后将F-18标记的试剂与肽轭合。一个实例是Poethko等人的标记方法(J.Nucl.Med.2004；45：892-902)，其中首先合成和纯化了4-[18F]氟苯甲醛(Wilson等人，J.Labeled Compounds and Radiopharm.1990；XXVIII：1189-1199)，然后将其与肽轭合。然后通过HPLC纯化肽轭合物，以除去用来驱动轭合完成的多余的肽。如果F-18具有长的半衰期，所述两个反应和纯化不会成问题。但是，F-18的半衰期只有2小时，因此将F-18连接至肽需要的所有操作是显著的负担。
这些方法进行时间长，并且需要使用特殊设计的设备来产生标记的产物，和/或专业化学家的努力。这些方法不是可以在临床环境中常规使用的试剂盒制剂。
概述
氟化物与事实上所有其他元素结合，并且这些键中的一些相对稳定。已知携带金属结合配体的肽稳定地且以非常高的比活性结合放射性金属。本方法采用的途径是首先使F-18与金属结合，然后用肽上的配体螯合F-18金属络合物。那么问题就是选择哪种金属(或其他元素，例如硼)。根据对文献的快速检索，IIIA族的元素(硼、铝、镓、铟、铊)成为首选。
可选地，技术人员可首先将原子连接至肽，然后加入F-18。对于氟化硼连接，第二个途径可能更加有效。
已报道氟化铝络合物在体外稳定(Martinez等人，Inorg.Chem.1999；38：4765-4660；Antonny等人J.Biol.Chem.1992；267：6710-6718)。将氟化铝掺入骨和牙齿的釉质，因此所述络合物在体内也是稳定的(Li，Crit.Rev.Oral Biol.Med.2003；14：100-114)。
熟练的技术人员将理解，几乎任何递送分子都可用于连接F-18用于成像目的，只要其含有可被修饰而不影响递送分子与细胞或组织靶受体之间的配体-受体结合相互作用的可衍生基团。虽然下面的实施例涉及F-18标记的肽部分，但是许多其他类型的递送分子均可被F-18标记并用于成像目的，其他类型的递送分子诸如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、血管生成因子、抗血管生成因子、免疫调谐剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片段、药物、白细胞介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质等。相似地，可被成像的疾病或疾患的类型仅受适合靶向与疾病或疾患相关的细胞或组织的递送分子有效性的限制。例如，在成像肿瘤的情况中，与肿瘤相关抗原结合的任何抗体片段均可被F-18标记并用于肿瘤成像。
在下面的某些实施例中，示例性的F-18标记的肽可作为使用双特异性或多特异性抗体或抗体片段的预靶向方法中的可靶向的构建体而用于成像目的。这种情况下，抗体或片段将包含针对与疾病或疾患相关的靶的一个或多个结合位点，所述靶诸如肿瘤相关抗原或由病原生物(诸如病毒、细菌、真菌或其他微生物)产生或展示的抗原。第二个结合位点将特异性结合可靶向的构建体。使用双特异性或多特异性抗体的预靶向方法是本领域公知的(参见，例如美国专利第6,962,702号，其完整内容通过引用并入本文)。相似地，与可靶向的构建体结合的抗体或其片段也是本领域公知的(同上)，诸如与HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)结合的679单克隆抗体。一般而言，在预靶向方法中，首先施用双特异性或多特异性抗体，并让其与细胞或组织靶抗原结合。经过合适量的时间让未结合的抗体从循环中清除后，例如F-18标记的可靶向的构建体被施用于患者并与定位至靶细胞或组织的抗体结合，然后例如通过PET扫描拍摄图像。
在示例性实施方案中，诸如抗坏血酸的非肽受体靶向剂可与DOTA轭合，然后用例如与DOTA结合的F-18金属络合物标记。此类非肽受体靶向剂可包括，例如TA138(整联蛋白αvβ3受体的一种非肽拮抗物)(Liu等人，2003，Bioconj.Chem.14：1052-56)。本领域已知的可与DOTA、NOTA或F-18金属络合物的另一螯合剂轭合的相似的非肽靶向剂可用于要求保护的方法。其他受体靶向剂是本领域已知的，诸如促生长素抑制素受体靶向剂In-DTPA抑生长肽如下文所述，F-18-铟络合物可潜在地使用DTPA螯合并用于成像目的。使用金属螯合物的受体靶向成像的其他方法是本领域已知的，并可用于要求保护的方法的实施(参见，例如Andre等人，2002，J.Inorg.Biochem.88：1-6；Pearson等人，1996，J.Med.Chem.39：1361-71)。
用于通过PET扫描的F-18成像的成像技术和装置也是本领域公知的(参见，例如美国专利第6，358，489；6，953，567号；Page等人，Nuclear Medicine AndBiology，21：911-919，1994；Choi等人，Cancer Research，55：5323-5329，1995；Zalutsky等人，J.NuclearMed.，33：575-582，1992)，并且可使用任何此类已知的PET成像技术或装置。
本发明的第一个方面提供了一种用F-18标记分子的方法，其包括：a)通过添加金属形成F-18金属络合物来活化所述F-18；b)将F-18金属络合物连接至分子。
在本发明的用F-18标记分子的方法中，络合物可连接至分子上的螯合基团。其中螯合剂可以是NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N′，N″-三乙酸)基团。
在本发明的用F-18标记分子的方法中，分子可以是蛋白质或肽。其中肽可以是IMP449(NOTA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。
在本发明的用F-18标记分子的方法中，金属可选自由铝、镓、铟、镥或铊组成的组。
在本发明的用F-18标记分子的方法中，F-18标记的分子可以是在水溶液中稳定的。
本发明的第二个方面提供了一种用F-18标记分子的方法，其包括：a)通过添加硼形成F-18硼络合物来活化所述F-18；b)将F-18硼络合物连接至分子。
本发明的第三个方面提供了一种F-18标记的蛋白质或肽，其包含连接至蛋白质或肽的F-18金属络合物或F-18硼络合物。
本发明的第四个方面提供了一种通过正电子成像术(PET)的F-18成像方法，其包括：a)通过添加IIIA族元素形成F-18IIIA族元素络合物来活化F-18；b)将络合物连接至分子以形成F-18标记的分子；c)在其中标记的分子被定位至一种或多种细胞、组织或器官的条件下，将分子施用于受治疗者；和d)通过PET扫描对F-18标记的分子的分布进行成像。
在本发明的通过PET的F-18成像方法中，F-18标记的分子可被施用于受治疗者而无需从未标记的分子中纯化F-18标记的分子。其中，可将络合物连接至分子而无需从未络合的F-18中纯化含有F-18的络合物。
在本发明的通过PET的F-18成像方法中，F-18标记的分子可用于成像受体。
在本发明的通过PET的F-18成像方法中，F-18标记的分子可用于成像肿瘤。
在本发明的通过PET的F-18成像方法中，可使用抗体、抗体片段或抗体构建体将F-18标记的分子靶向感兴趣的部位。
在本发明的通过PET的F-18成像方法中，可使用双特异性抗体将F-18标记的分子靶向感兴趣的部位。本发明的通过PET的F-18成像方法还可包括：i)将双特异性抗体施用于受治疗者，双特异性抗体具有至少一个针对可靶向构建体的结合位点和至少一个针对被靶向抗原的结合位点，其中被靶向抗原的存在指示疾病或疾患；ii)允许足量的时间，以使未与被靶向抗原结合的双特异性抗体从循环中清除；和iii)将F-18标记的可靶向的构建体施用于受治疗者。
被靶向的抗原可以是肿瘤相关抗原。
被靶向的抗原可以存在于病原生物上。其中，病原体可以是病毒、细菌、真菌、酵母或微生物。其中，病毒可选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳癌病毒、水痘带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃巴病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒；或所述细菌选自由以下组成的组：无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌和破伤风梭菌。
被靶向的抗原可选自由以下组成的组：结肠特异性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD80、HLA-DR、Ia、Ii、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA、EGFR、HER2/neu受体、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、生腱蛋白、叶酸受体、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、PlGF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、T101、MAGE或这些抗原的组合。
本发明的第五方面提供一种用F-18标记分子的方法，其包括在允许F-18与硼结合的条件下将F-18添加至硼标记的分子。
本发明的第六方面提供一种用F-18标记分子的方法，其包括在允许F-18与金属结合的条件下将F-18添加至金属标记的分子。
附图简述
包括下列图以说明本发明的特定实施方案，但其并不意味着限制要求保护的主题的范围。
图1.F-18+IMP272+AlCl3在110℃加热15分钟，然后通过反相HPLC分析。
图2.F-18+过量IMP272+AlCl3在110℃加热15分钟，然后通过反相HPLC分析。
图3.于室温下在PBS中磷酸盐激发90分钟。小份F-18+过量IMP272+AlCl3在110℃加热15分钟，并通过反相HPLC分析。
图4.Al-18F IMP272在H2O中的稳定性，反相HPLC。就在HLB柱纯化后F-18标记IMP272。
图5.在25℃下于水中稀释40分钟后纯化的F-18标记IMP272。
图6.Al-18F IMP272粗反应混合物，反相HPLC，用于免疫反应性研究。
图7.Al-18F IMP272的免疫反应性，尺寸排阻HPLC，F-18Al IMP272粗反应混合物SEC，79％回收率。
图8.F-18Al IMP272粗反应混合物SEC+hMN-14x73481％回收率。
图9.F-18Al IMP272粗反应混合物SEC+hMN-14x67978％回收率。
图10.用与其他金属结合的F-18标记IMP 272，反相HPLC。使用冷铟的IMP272的F-18标记。
图11.使用冷镓的IMP272的F-18标记。
图12.使用冷锆的IMP272的F-18标记。
图13.使用冷镥的IMP272的F-18标记。
图14.使用冷钇的IMP272的F-18标记。
图15.Al-18F IMP375在水中的稳定性，反相HPLC。在水中的F-18IMP375，粗标记的肽(97.5％)。
图16.在水中的F-18IMP 375，在25℃下5小时后(95.4％)
图17.Al-18F IMP375在人血清(25℃)中的稳定性，反相HPLC。在人血清中的F-18IMP375，～4.5分钟(83.5％)。
图18.在人血清中的F-18IMP375，1.5小时(0％)
图19A-19D.F-18标记的IMP 449在人血清中孵育零时(A)和1小时(B)、2小时(C)和4小时(D)后的稳定性。
详述
在下面的描述中，使用了大量术语，提供以下定义以便于理解本文的公开内容。未明确定义的术语根据其明显的和普通含义使用。
如本文所用，“一个(a)”或“一种(an)”可指一个或多于一个的条目。
如本文所用，术语“和”和“或”可用于指合取的或析取的。即除非另外声明，两个术语均应理解为等同于“和/或”。
如本文所用，“约”指数字的加或减10％的范围内。例如，“约100”将指90和110之间的任何数字。
如本文所用，“肽”指长度介于2个和100个氨基酸残基之间、更优选地长度介于2个和10个氨基酸之间、更优选地长度介于2个和6个氨基酸之间的天然存在或非天然存在的氨基酸的任何序列。“氨基酸”可以是L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸类似物、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。
如本文所用，术语“病原体”包括但不限于真菌、病毒(例如，人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒(human serum parvo-like virus)、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳癌病毒、水痘带状疱疹病毒、登革病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃巴病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒)、寄生虫和细菌(例如，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、乙型流感嗜血杆菌(Hemophilis influenzae B)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)、莱姆病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、麻风杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和破伤风梭菌(Clostridium tetani))。
可靶向的构建体肽
在某些实施方案中，F-18标记的部分可包含肽或其他可靶向的构建体。此类可靶向的构建体可以是多种结构，并被选择为不仅要引起充分的免疫应答而且当用于预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或多特异性抗体时还要快速在体内清除。疏水剂在引起强免疫应答方面最好，而亲水剂是快速体内清除所优选的。因此，建立了疏水和亲水特性之间的平衡。这可部分地通过使用亲水螯合剂以抵消许多有机部分固有的疏水性来实现。另外，可选择具有相反溶解性质的可靶向构建体的亚基，例如，含有其中一些为疏水的和其中一些为亲水的氨基酸的肽。除了肽之外，还可使用碳水化合物。
可使用具有少至两个氨基酸残基的肽，优选地为2至10个残基，也可将肽与诸如螯合剂的其他部分偶联。连接体应是低分子量轭合物，优选地具有低于50,000道尔顿的分子量，并且有利地低于约20,000道尔顿、10,000道尔顿或5,000道尔顿的分子量(包括螯合物中的金属离子)。更常见地，抗原性肽将具有四个或更多残基，诸如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQ ID NO：1)，其中DOTA是1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙酸，而HSG是组胺琥珀酰甘氨酰基团。可选地，DOTA可被NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N′，N″-三乙酸)或TETA(对-溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)部分取代。
可靶向的构建体还可在主链结构中包含非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)以增加肽在体内的稳定性。在可选的实施方案中，其他主链结构，诸如从非天然氨基酸和拟肽构建的那些。
使用固相支持体和重复正交脱保护和偶联的标准技术在自动肽合成仪上方便地合成用作免疫原的肽。肽中以后用于螯合物轭合的游离氨基用标准的保护基团(诸如Boc基团)有利地封闭，而N-末端残基可被乙酰化以增加血清稳定性。此类保护基团是熟练的技术人员已知的。参见Greene和Wuts Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，1999(John Wiley and Sons，N.Y.)。当肽准备以后用于bsAb系统时，它们被有利地从树脂解离，以产生相应的C-末端酰胺，以便抑制体内羧肽酶的活性。
免疫原的半抗原包含免疫原识别部分，例如化学半抗原。使用化学半抗原，优选地HSG半抗原，连接体显示对抗体的高特异性。出现这种情况的原因是针对HSG半抗原产生的抗体是已知的，并可轻松地掺入适当的双特异性抗体。因此，连接体与连接的半抗原的结合是抗体或抗体片段高度特异的。
螯合部分
在一些实施方案中，F-18标记的分子可包含一个或多个亲水螯合部分，其可结合金属离子并且还有助于确保快速的体内清除。螯合剂可根据其特定的金属结合性质进行选择，并且可容易地被交换。
特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA和其单甲基和环己基类似物。诸如NOTA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N′，N″-三乙酸)、DOTA和TETA(对-溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)的大环螯合剂也可与可潜在地用作F-18轭合配体的多种金属一起使用。
其中配体包括硬碱螯合功能诸如羧酸或胺基的DTPA和DOTA-型螯合剂对于螯合硬酸阳离子、尤其是IIa族和IIIa族金属阳离子最为有效。通过调整感兴趣的金属的环的大小，可使此类金属-螯合物络合物非常稳定。诸如大环聚醚的其他环型螯合剂由于稳定结合核素而受到关注。卟啉螯合剂可与许多金属络合物一起使用。可将不止一种类型的螯合剂与载体轭合以结合多种金属离子。诸如美国专利第5,753,206号中公开的那些螯合剂，尤其是缩氨基硫脲基乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和缩氨基硫脲基乙酰半胱氨酸(thiosemicarbazonyl-acetylcysteine，Tsca-Cys)螯合剂有利地用于结合Tc、Re、Bi和其他过渡金属元素、镧系元素和锕系元素的软酸阳离子，所述软酸阳离子紧密地结合软碱配体。将不止一种类型的螯合剂与肽连接是有用的。由于双-DTPA半抗原的抗体是已知的(Barbet等人，美国专利第5,256,395号)并且容易偶联至靶向抗体形成bsAb，因此，在预靶向实验方案中使用带有冷双DTPA螯合剂和用于结合F-18络合物的另一螯合剂的肽半抗原是可能的。此类肽的一个实例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQID NO：2)。其他硬酸螯合剂(诸如DOTA、TETA和类似硬酸螯合剂)可取代DTPA和/或Tscg-Cys基团，并且可使用与用来产生抗-双-DTPA Mab的技术类似的技术来生产特异于这些硬酸螯合剂的Mab。
另一种有用的螯合剂可包含NOTA-型部分，例如，如Chong等人(Rational designand generation of a bimodal bifunctional ligand for antibody-targetedradiation cancer therapy(用于抗体靶向的放射癌症疗法的双模态双功能配体的合理设计和产生，J.Med.Chem.，电子出版于12-7-07，通过引用并入本文)中所公开的。Chong等人公开了基于NOTA结构的双功能C-NETA配体的生产和用途，所述配体在与177Lu或205/206Bi络合时显示在血清中高达14天的稳定性。
应理解，可将两种不同的硬酸或软酸螯合剂(例如具有不同的螯合环大小)掺入可靶向的构建体，以优先结合两种不同的硬酸或软酸阳离子(根据阳离子的不同大小、螯合环的几何学和阳离子的优选络合物离子结构)。这将允许两种不同的金属(其中一种或两种可与F-18连接)掺入可靶向的构建体，以被预靶向的bsAb最终捕获。
施用方法
在不同的实施方案中，双特异性抗体和可靶向的构建体可用于成像正常或病态组织和器官(参见，例如美国专利第6,126,916；6,077,499；6,010,680；5,776,095；5,776,094；5,776,093；5,772,981；5,753,206；5,746,996；5,697,902；5,328,679；5,128,119；5,101,827；和4,735,210号)。
bsAb和F-18标记的可靶向构建体的施用可通过在施用可靶向的构建体之前某一时间施用bsAb来执行。试剂的剂量和施用时间可由熟练的技术人员容易地设计，并依赖于所用试剂的具体性质。如果首先施予bsAb-F(ab′)2衍生物，则施用可靶向构建体之前24-72小时的等待时间将是适当的。如果IgG-Fab′bsAb轭合物是最初的靶向载体，则施用可靶向的构建体之前将需要3-10天范围内的更长的等待时间。经过充分的时间让bsAb靶向病态组织之后，施用F-18标记的可靶向的构建体。施用可靶向的构建体之后，即可进行成像。
某些实施方案涉及具有至少三个不同的靶结合位点的多价靶结合蛋白质的使用，如序号为60/220,782的美国临时专利申请所述。已通过经由化学连接体交联几个Fab-样片段制备了多价靶结合蛋白质。参见美国专利第5,262,524；5,091,542号和Landsdorp等人，Euro.J.Immunol.，16：679-83(1986)。也已通过共价连接几个单链Fv分子(scFv)以形成单个多肽制备了多价靶结合蛋白质。参见美国专利第5,892,020号。基本上是scFv分子的聚集体的多价靶结合蛋白质已公开于美国专利第6,025,165和5,837,242号。包含三个scFv分子的三价靶结合蛋白质已公开于Krott等人Protein Engineering，10(4)：423-433(1997)。
可使用可在bsAb和可靶向构建体的给药之间施予的清除剂。可使用具有新机制作用的清除剂，即被靶向bsAb的疾病靶向臂的糖基化的抗独特型Fab′片段。在一个实例中，施予抗CEA(MN14Ab)x抗肽bsAb，并允许其最大程度地附着于疾病靶。为了清除残留的bsAb，施予MN-14的抗独特型Ab(称为WI2)，优选地作为糖基化的Fab′片段。清除剂以单价方式与bsAb结合，而其附着的糖残基将整个复合物引向肝脏，在肝脏中发生快速的代谢。然后将F-18标记的可靶向构建体施予受治疗者。bsAb的MN-14臂的WI2Ab具有高亲和力，并且其清除机制不同于其他公开的机制(参见Goodwin等人，同上)，原因是其不涉及交联，因为WI2-Fab是单价部分。
产生抗体的方法
肽主链的Ab可通过公知的Ab生产方法产生。例如，向免疫活性动物中注射于完全弗氏佐剂中的免疫原，诸如(肽)n-KLH(其中KLH是匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)，并且n＝1-30)，接下来再两次注射悬于不完全弗氏佐剂中的同一免疫原，i.v.抗原加强后三天后收获脾细胞。然后将收获的脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，并使用直接结合ELISA分析得到的克隆的培养上清液的抗肽反应性。产生的Ab的特异性可通过使用原始免疫原的肽片段进行分析。这些片段可使用自动肽合成仪容易地制备。对于Ab生产，分离酶缺陷的杂交瘤以便能够选择融合的细胞系。此技术也可用于产生针对包含可靶向构建体的一种或多种螯合物(例如，In(III)-DTPA螯合物)的抗体。In(III)-双-DTPA的单克隆小鼠抗体是已知的(Barbet′395，见上)。
使用的靶向抗体可以对作为标志物质的多种细胞表面或细胞内肿瘤相关抗原具有特异性。这些标志物可以是肿瘤产生的物质，或可以是在肿瘤部位、在肿瘤细胞表面上或在肿瘤细胞内(无论是在细胞质、核还是在各种细胞器或亚细胞结构中)积累的物质。此类肿瘤相关标志物包括由Herberman，“Immunodiagnosis of Cancer”(癌症的免疫诊断)，Fleisher编，“The Clinical Biochemistry of Cancer”(癌症的临床生物化学)，第347页(American Association of Clinical Chemists，1979)和在美国专利第4,150,149；4,361,544；和4,444,744号中公开的那些。
Herberman(见上)已将肿瘤相关标志物分为许多类别，包括胎瘤抗原、胎盘抗原、致癌或肿瘤病毒相关抗原、组织相关抗原、器官相关抗原、异位激素和正常抗原或其变体。有时，肿瘤相关标志物的亚基有利地用于产生具有更高肿瘤特异性的抗体，例如，人绒毛膜促性腺激素(HCG)的β亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区，其刺激对非肿瘤物质具有大大降低的交叉反应性的抗体的产生，如美国专利第4,361,644和4,444,744号所公开。
感兴趣的另一种标志物是跨膜激活剂及CAML-相互作用分子。参见，Yu等人Nat.Immunol.，1：252-256(2000)。简单地说，TACI是B细胞恶性肿瘤(例如，淋巴瘤)的标志物。进一步，已知TACI和B细胞成熟抗原(BCMA)被肿瘤坏死因子同系物(一种增殖诱导配体(APRIL))结合。APRIL刺激原B细胞和T细胞的体外增殖，并由于B细胞在体内的积累而增加脾的重量。APRIL还与TALL-I(也称为BLyS或BAFF)竞争受体的结合。可溶性BCMA和TACI特异性防止APRIL的结合，并阻止APRIL-刺激的原B细胞的增殖。BCMA-Fc还抑制小鼠中针对匙孔戚血蓝蛋白和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗体的产生，表明经由BCMA和/或TACI的APRIL和/或TALL-I信号转导是产生体液免疫必需的。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成参与B细胞和T细胞功能刺激的双配体-双受体途径。
用于成像各种疾病或疾患(诸如恶性疾病、心血管疾病、传染病、炎性疾病自身免疫病或神经疾病)的示例性靶抗原可包括结肠特异性抗原-p(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD80、HLA-DR、Ia、Ii、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA、EGFR、HER2/neu、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、生腱蛋白、叶酸受体、VEGFR、PlGF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、T101、MAGE或这些抗原的组合。尤其是，抗原可包括癌胚抗原(CEA)、生腱蛋白、表皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、血管内皮生长因子受体、神经节苷脂、HER/2neu受体和这些抗原的组合。
最初产生针对免疫原的抗体后，可对抗体进行测序，并随后通过重组技术制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员公知的。例如，通过以下制备人源化单克隆抗体：将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变链的小鼠互补决定区转移到人可变区，然后在框架区内用鼠对应残基置换人残基。使用衍生自人源化单克隆抗体的抗体组分消除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术描述于例如以下出版物：Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，86：3833(1989)，其通过引用整体并入本文。生产人源化Mab的技术描述于例如Jones等人，Nature，321：522(1986)，Riechmann等人，Nature，332：323(1988)，Verhoeyen等人，Science，239：1534(1988)，Carter等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12：437(1992)和Singer等人，J.Immun.，150：2844(1993)，其每个通过引用整体并入本文。
可选地，完全人抗体可从转基因非人的动物获得。参见，例如，Mendez等人，NatureGenetics，15：146-156(1997)；美国专利第5,633,425号。例如，可从具有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中回收人抗体。小鼠体液免疫系统通过灭活内源免疫球蛋白基因并引入人免疫球蛋白基因座而被人源化。人免疫球蛋白基因座极其复杂，并包含总共占人类基因组近0.2％的大量离散区段。为了确保转基因小鼠能够产生足够的抗体谱，必须将人重链和轻链基因座的大部分引入小鼠基因组。这是以逐步过程实现的，开始于形成含有胚系构型的人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)。由于每个插入物的大小是大约1Mb，YAC的构建要求免疫球蛋白基因座的重叠片段的同源重组。经由含有YAC的酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合，将两个YAC(一个含有重链基因座而一个含有轻链基因座)分别引入小鼠。然后将胚胎干细胞克隆微注射于小鼠胚泡。得到的嵌合雄性小鼠根据其通过其种系传递YAC的能力进行筛选，并将其与具有鼠抗体产生缺陷的小鼠杂交。繁殖两个转基因品系(一个含有人重链基因座而另一个含有人轻链基因座)产生响应于免疫接种而产生人抗体的子代。
未重排的人免疫球蛋白基因也可经由微细胞介导的染色体转移(MMCT)被引入小鼠胚胎干细胞。参见，例如，Tomizuka等人，Nature Genetics，16：133(1997)。在此方法中，含有人染色体的微细胞与小鼠胚胎干细胞融合。转移的染色体被稳定地保持，并且成年嵌合体显示适当的组织特异性表达。
作为替代方案，抗体或抗体片段可从分离自组合免疫球蛋白文库的人抗体片段衍生。参见，例如，Barbas等人，METHODS：A Companion to Methods in Enzymology2(方法：与酶学方法的比较)：119(1991)，和Winter等人，Ann.Rev.Immunol，12：433(1994)，其通过引用并入本文。与通过B细胞永生产生单克隆抗体相关的许多困难可通过使用噬菌体展示在大肠杆菌中改造和表达抗体片段来克服。
可采用相似的策略获得高亲和力scFv。参见，例如，Vaughn等人，Nat.Biotechnol，14：309-314(1996)。通过使用对应于所有已知VH、VK和V80基因家族的PCR引物从未免疫的人供体分离V基因，可构建广谱的scFv文库。扩增之后，VK和Vλ库被合并形成一个库。将这些片段连接入噬菌粒载体。然后将scFv连接体(Gly4，Ser)3连接于噬菌粒中VL片段的上游。扩增VH和连接体-VL片段并在JH区上装配。将得到的VH-连接体-VL片段连接于噬菌粒载体。可使用如上所述的过滤器或使用免疫管 淘选噬菌粒文库。相似的结果可通过从免疫的兔的淋巴细胞或脾细胞构建组合免疫球蛋白文库和通过在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达scFv构建体来实现。参见，例如，Ridder等人，Biotechnology，13：255-260(1995)。另外，分离适当的scFv后，具有更高的结合亲和力和更慢的解离速率的抗体片段可通过亲和力成熟过程(诸如CDR3诱变和链改组)获得。参见，例如，Jackson等人，Br.J.Cancer，78：181-188(1998)；Osbourn等人，Immunotechnology，2：181-196(1996)。
抗体片段的另一形式是编码单个CDR的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因来获得。此类基因例如通过使用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区来制备。参见，例如、Larrick等人，Methods：A Companion to Methodsin Enzymology(方法：与酶学方法的比较)2：106(1991)；Courtenay-Luck，“GenencManipulation of Monoclonal Antibodies”(单克隆抗体的遗传操作)，选自单克隆抗体：产生、改造和临床应用(MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION)，Ritter等人(编)，第166-179页(Cambridge University Press1995)；和Ward等人，“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”(抗体的遗传操作和表达)，选自MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS(单克隆抗体：原理和应用)，Birch等人(编)，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)。
bsAb可通过本领域已知的技术制备，例如，抗CEA肿瘤Ab和抗肽Ab二者分别用胃蛋白酶消化为它们各自的F(ab′)2片段。用半胱氨酸还原抗CEA-Ab-F(ab′)2以产生Fab′单体单元，其进一步与交联剂双(马来酰亚胺基)己烷反应以产生Fab′-马来酰亚胺部分。用半胱氨酸还原抗肽Ab-F(ab′)2，并且纯化的、回收的抗肽Fab′-SH与抗CEA-Fab′-马来酰亚胺反应以产生Fab′x Fab′双特异性Ab。可选地，抗肽Fab′-SH片段可与抗CEA F(ab′)2偶联以产生F(ab′)2x Fab′构建体，或与抗CEA IgG偶联以产生IgG x Fab′双特异性构建体。在一个实施方案中，IgG x Fab′构建体可通过以下以位点特异性的方式制备：将抗肽Fab′巯基与已用高碘酸盐氧化的抗CEAIgG重链碳水化合物连接，然后通过与可商业获得的酰肼-马来酰亚胺交联剂反应而活化。使用的组分Ab可通过已知技术被嵌合或人源化。嵌合抗体是含有来自啮齿类动物抗体的可变区和互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的剩余部分衍生自人抗体。人源化抗体是其中单克隆抗体的鼠互补决定区被从鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移至人可变区的重组蛋白。
嵌合Ab是通过连接编码小鼠轻链可变区和重链可变区的cDNA片段与编码人抗体C结构域的片段而构建的。由于C结构域不参与抗原结合，因此嵌合抗体将保留与原始小鼠Ab相同的抗原特异性，但在序列上将更接近人抗体。不过，嵌合Ab仍含有一些小鼠序列，并且仍可以是免疫原性的。人源化Ab仅含有识别抗原必需的那些小鼠氨基酸。此产物是通过将小鼠互补决定区的氨基酸构于人抗体框架构建的。
产生bsAb的其他最近方法包括具有额外的半胱氨酸残基以便它们比更普通的免疫球蛋白同种型更强地交联的改造的重组Ab。参见，例如，FitzGerald等人，Protein Eng.，10：1221-1225，1997。另一途径是改造重组融合蛋白质，连接具有需要的双特异性的两个或多个不同的单链抗体或抗体片段区段。参见，例如，Coloma等人，Nature Biotech.，5：159-163，1997。使用分子工程可产生多种双特异性融合蛋白质。在一种形式中，双特异性融合蛋白质是单价的，由例如具有一个抗原的单个结合位点的scFv和具有第二个抗原的单个结合位点的Fab片段组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白质是二价的，由例如具有一个抗原的两个结合位点的IgG和具有第二个抗原的两个结合位点的两个scFv组成。
功能性双特异性单链抗体(bscAb)(也称为双抗体)可使用重组方法在哺乳动物细胞中产生。参见，例如，Mack等人，Proc.Natl.Acad.Sci，92：7021-7025，1995。
优选的双特异性抗体是包括MAb Mu9的Fv和MAb679的Fv、或MAb MN14的Fv和MAb679的Fv及其人、嵌合化或人源化对应物的那些抗体。MN14以及其嵌合化和人源化对应物公开于美国专利第5,874,540号。另外优选的是包括Mu9或679的一个或多个CDR的双特异性抗体。抗体还可以是包括III类抗CEA抗体和679的Fv的融合蛋白质或双特异性抗体。包括III类抗CEA的III类抗体在美国专利第4,818,709号中详细讨论。
在某些实施方案中，上面讨论的bsAb F-18标记的可靶向的构建体可用于手术中、血管内和内窥镜肿瘤以及损伤检测、活组织检查和治疗，如美国专利第6,096,289号所述。
实施例
实施例1.肽IMP272的F-18标记
使用的第一个肽是IMP272：
DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2MH+1512
乙酸盐缓冲溶液-乙酸1.509g于～160mL水中稀释，并通过加入1M NaOH调节pH然后稀释至250mL以获得pH4.03的0.1M溶液。
乙酸铝缓冲溶液-铝溶液通过将0.1028g的AlCl3六水合物溶解于42.6mL DI水中来制备。4mL小份的铝溶液与16mL的0.1M NaOAc溶液(pH4)混合，以提供2mM Al贮液。
IMP272乙酸盐缓冲溶液-肽0.0011g(7.28x10-7mol IMP272)溶解于364μL的0.1MpH4的乙酸盐缓冲溶液，以获得肽的2mM的贮液。
F-18标记IMP272-3μL小份的铝贮液置于REACTI-VIALTM并与50μL F-18(原始样品)和3μL的IMP272溶液混合。溶液在加热器中于110℃加热15分钟，并通过反相HPLC分析。HPLC谱图(图1)显示93％的游离F-18和7％与肽结合的F-18。向所述反应中加入另外10μL的IMP272溶液，并再次加热和通过反相HPLC分析(图2)。HPLC谱图显示8％的F-18处于空隙体积，而92％的活性连接至肽。剩余的肽溶液在室温下与150μL PBS孵育～1小时，然后通过反相HPLC分析。HPLC(图3)显示58％的F-18未结合，而42％的F-18仍连接至肽。数据表明F-18-AL-DTPA络合物在与磷酸盐混合时可能不稳定。
反相HPLC-反相HPLC分析在下列条件下进行：
柱：WATERS XTERRATM MS C18 5μm，4.6x250mm
流速：1mL/分钟
梯度缓冲液：缓冲液C，于DI水中的0.1％NH4OAc，缓冲液D，90％乙腈、10％水和0.1％NH4OAc
梯度：100％缓冲液C至100％缓冲液D，使用30分钟的线性梯度。
运行时间：30分钟
尺寸排阻HPLC-尺寸排阻HPLC在下列条件下进行：
柱：BIO-SILTM SEC250，300x7.8mm
梯度：等度
洗脱缓冲液：0.2M磷酸盐pH6.8
流速：1mL/分钟
运行时间：30分钟
本文附图中显示的所有谱图都是使用PERKIN610Tr监测F-18的发射的放射谱图。表1-3分别以表格呈现了图1-3中显示的数据。
表1
表2
表3
标记的肽通过以下纯化：将标记的肽溶液应用到1cc(30mg)HLB柱(部件#186001879)并用300μL水洗涤以除去未结合的F-18。通过用2x100μL1∶1MeOH/H2O洗涤柱来洗脱肽。纯化的肽在水中于25℃孵育并通过反相HPLC分析(图4、图5)。HPLC分析显示F-18标记的IMP 272在水中不稳定(图4、图5)。图4和图5的比较显示在水中孵育40分钟后约17％的F-18从所述肽释放。
实施例2.F-18IMP 272的免疫反应性
肽(16μL2mM IMP272，48μg)用F-18标记并通过尺寸排阻HPLC分析抗体结合(放射谱图，图6至图9)。尺寸排阻HPLC显示所述肽结合hMN-14x679，但不与无关的双特异性抗体hMN-14x734结合(图8对比图9)。
实施例3.用其他金属的IMP 272的F-18标记
～3μL小份的金属贮液(6x10-9mol)置于聚丙烯锥形管，并与75μL F-18(原始样品)混合，在室温下孵育～2分钟，然后与20μL的于0.1M NaOAc pH4缓冲液中的2mM(4x10-8mol)IMP272溶液混合。溶液在加热器中于100℃加热15分钟，并通过反相HPLC分析。显示了用铟(图10)、镓(图11)、锆(图12)、镥(图13)和钇(图14)标记IMP272的结果。
实施例4.用于筛选Al-18F结合的其他肽的标准F-18肽标记条件
3μL小份的2mM铝贮液置于聚丙烯锥形管，并与50μL F-18(原始样品)混合，在室温下孵育～2分钟，然后与16μL至20μL的于0.1M NaOAc pH4缓冲液中的2mM肽溶液混合。溶液在加热器中于100℃加热15分钟，并通过反相HPLC(PHENOMENEXTM，5μ，C-18，HOA，250x4.6mm HPLC柱)分析。
测试的肽
IMP272DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2MH+1512
IMP288DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1453
IMP326DTPA-ITC-NH-NH-Phe-CO-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1477
IMP329去铁胺-NH-CS-NH-NH-Ph-CO-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1804
IMP331NTA-iAsp-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1240
IMP332EDTADpr-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lsy(HSG)-NH2MH+1327
IMP333DTPA-Dpr(DTPA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1845
IMP334(H2O3P)2-C(OH)-(CH2)3-NH-Gly-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+1192
IMP337Ac-D-Ser(PO3H2)-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1291
IMP338Ac-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1126
IMP345DTPA-D-Ser(PO3H2)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1459
IMP349DTPA-D-Cys((H2O3P)2-CH-CH2-S)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1583
IMP361DTPA-Dpr(BrCH2CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1498
IMP366DTPA-Dpr(Ph-S-CH2CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1528
IMP368Sym-DTPA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1292
IMP369Sym-DTPA-NH-CH(2-Br-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1517
IMP370Sym-DTPA-NH-CH(2-O2N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1484
IMP371DTPA-NH-CH(2-O2N-Phe-)-CH2-CO-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1484
IMP372DTPA-Dpr(Ser)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1465
IMP373DTPA-Dpr(Sym-DTPA)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1753
IMP374DTPA-Dpr(Cl-CH2CO-Cys(Et)-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1585
IMP375DTPA-Dpr(2-Br-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1603
IMP376DTPA-Cys(HO3S-S)-D-Tyr-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1558
IMP379DTPA-Dpr(2-H2N-Phe-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1497
IMP382DTPA-Dpr(H)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1378
IMP383DTPA-Dpr(Gla-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1507
IMP384DTPA-Dpr(2-HO-Phe-CHNH2-CH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1541
IMP385DTPA-Dpr(Dpr)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1464
IMP386DTPA-Dpr(2-吡啶基-CH2-CHNH2-CO-)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1526
IMP387DTPA-Dpr(D-9-蒽基丙氨酸)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1625
IMP389DTPA-Dpr(2-羧基哌嗪基)-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Ala-D-Lys(HSG)-NH2MH+1490
肽标记筛选研究的结果
大多数DTPA衍生物显示与IMP272的标记相当的标记。例外的是，在半胱氨酸侧链上携带双膦酸盐基团的IMP349标记非常差。DOTA配体未结合Al-18F。IMP326的ITC DTPA配体未结合Al-18F以及DTPA。IMP331的NTA配体未结合Al-18F。IMP332的EDTA配体结合Al-18F但不如DTPA。对称DTPA配体未结合Al-18F。测试的膦酸盐和磷酸盐基团在测试的条件下与Al-18F结合的不好。筛选确实显示连接于DTPA附近的基团可影响Al-18F-DTPA络合物的稳定性。筛选显示IMP375标记得更好并形成比IMP272显著更加稳定的络合物。IMP375标记得良好并且在水中稳定(图15、图16)，但是血清稳定性应进行改进，以用于体内用途(图17、图18)。
肽标记筛选研究仅考察了Al-18F的结合。一些用Al-18F标记得不好的肽可用另一种结合F-18的金属更好地标记。
肽合成
通过使用Fmoc策略的固相肽合成来合成肽。通过使用Fmoc/Aloc保护基团以允许差异的脱保护而将基团加至二氨基氨基酸的侧链。通过Dangles等人(J.Org.Chem.1987，52：4984-4993)的方法除去Aloc基团，不同的是哌啶以1∶1的比例加入使用的乙酸。不对称四叔丁基DTPA的制备如McBride等人所述(美国专利申请公布第US 2005/0002945Al号，申请第10/776,470号，公布日期2005年1月6日)。三叔丁基DOTA、对称四叔丁基DTPA和ITC-苄基DTPA获自Aloc/Fmoc赖氨酸和Dap(二氨基丙酸衍生物(也称为Dpr))获自或Sieber酰胺树脂获自其余的Fmoc氨基酸获自
IMP272根据描述合成(McBride等人，美国专利申请公布第20040241158 Al号，申请第10/768,707号，2004年12月2日)。IMP288根据描述制备(McBride等人，J.NuclMed.，2006，47：1678-1688)。
IMP326肼肽(IMP319)使用Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Glu(OBut)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和4-(Boc-NH-NH-)C6H4-CO2H以所述顺序在Sieber酰胺树脂上制备。4-(Boc-NH-NH-)C6H4-CO2H通过将Boc二碳酸盐加入于二噁烷氢氧化钠溶液中的4-肼基苯甲酸来制备。
添加Boc-酰肼后，除去侧链Aloc基团，并将三苯甲基-HSG-OH基团加到赖氨酸的侧链上。然后用TFA从树脂解离肽，并通过HPLC纯化，以获得需要的肼二-HSG肽IMP319(MH+1201)。然后将酰肼肽(0.0914g)与于3mL0.1M磷酸钠pH8.2中的0.0650gITC-苄基DTPA混合。用1M NaOH调节所述溶液的pH，以使pH保持在pH8.2。肽和ITC-苄基DTPA之间的反应完成后，通过HPLC纯化肽轭合物。
IMP329通过将1.0422g的去铁胺甲磺酸酯(1.59x10-3 mol)和于10mL 1∶1甲醇/水中的0.2835g(1.59x10-3mol)的硫羰基二咪唑混合来制备去铁胺异硫氰酸酯。加入三乙胺0.23mL，2.5小时后通过反相HPLC纯化反应，以获得去铁胺异硫氰酸酯MNa+625。
肼肽IMP319(0.0533g、4.4x10-5mol，MH+1201)与于磷酸钠缓冲液pH8.1中的0.0291g去铁胺异硫氰酸酯混合两小时，然后通过HPLC纯化以获得需要的产物MH+1804。
IMP331下列氨基酸以所示顺序连接至Sieber酰胺树脂(0.58mmol/g)：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH和Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH。除去Aloc基团，并将Trt-HSG-OH加至赖氨酸的侧链。除去Fmoc，然后以所述顺序添加Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Asp-OBut(0.5g树脂)。除去Fmoc，并用3mL叔丁基溴乙酸酯和3.6mL二异丙基乙胺在3.4mL NMP中使Asp的氮烷基化过夜。用TFA从树脂解离肽，并通过反相HPLC纯化，以获得需要的肽MH+1240。
IMP332肽在3g Sieber酰胺树脂(0.58mmol/g)上制备。下列氨基酸以所示顺序添加至树脂：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH和Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH。树脂分成几部分以用于后续合成。取出一克树脂，并除去二氨基丙酸上的Fmoc基团。用3mL叔丁基溴乙酸酯、3.6mL二异丙基乙胺和3.4mL NMP使肽烷基化过夜。然后除去侧链Aloc基团并添加Trt-HSG-OH基团。然后将肽从树脂解离，并通过HPLC纯化以获得产物MH+1327。
IMP333肽使用1g与用于制备IMP332相同的树脂制备。将DTPA四叔丁基酯(美国专利公布第20050002945号)添加至Dpr基团的两个胺上。然后除去Aloc基团，并添加Trt-HSG-OH。然后将肽解离，并通过HPLC纯化以获得需要的产物MH+1845。
IMP334肽在1g Rink酰胺树脂(0.7mmol/g)上制备，并以所示顺序添加下列氨基酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Glu(But)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Boc-Ser(But)-OH。除去Aloc基团，并添加三苯甲基-HSG-OH。用TFA从树脂解离肽。通过从醚中沉淀收集粗肽并干燥。高碘酸钠0.33g溶于15mL水。粗肽溶于1mL0.5M磷酸钠pH7.6、3mL水和1mL高碘酸盐溶液。在～2小时内以一毫升的增量另外添加3mL高碘酸盐。然后通过反相HPLC纯化所述混合物，并冻干以获得醛IMP289HCO-CO-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2MH+959。阿伦膦酸钠(Alendronate，0.0295g，)溶于150μL0.1M NaOAc pH4。肽IMP289(0.0500g)溶于100μL13％于水中的异丙醇。添加氰基硼氢化钠，并通过HPLC纯化所述混合物以获得需要的产物MH+1192。
IMP337&IMP338肽在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨基酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Ac2O。除去Aloc基团，并向赖氨酸的侧链添加Trt-HSG-OH基团。将肽从树脂解离，并通过HPLC纯化以获得需要的产物：IMP337MH+1291和IMP338MH+1126。
IMP345肽在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨基酸：Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和四叔丁基DTPA。除去Aloc基团，并向赖氨酸的侧链添加Trt-HSG-OH基团。将肽从树脂解离，并通过HPLC纯化以获得需要的产物：IMP345MH+1459。
IMP349肽IMP347DTPA-D-Cys-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH和四叔丁基DTPA。将肽从树脂解离，并通过HPLC纯化以获得需要的产物：IMP347MH+1395。肽IMP3470.0446g(3.2x10-5mol)与于3mL水中的0.4605g(2.4x10-3mol)亚乙烯基双(膦酸)(Degenhardt等人，J.Org.Chem.1986，51：3488-3490)混合，并用逐滴添加的1M NaOH将所述溶液调节至pH6.5。反应搅拌过夜，并通过添加过量的亚乙烯基双(膦酸)将反应溶液调节至pH1.49。混合物在室温下搅拌过夜，然后通过HPLC纯化以获得需要的肽IMP349MH+1583。
IMP361肽在Sieber酰胺树脂上制备，使用以所示顺序添加的下列氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH，切割aloc，添加Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Dap(Aloc)-OH和四叔丁基DTPA。除去Dap侧链上的Aloc，并用溴乙酸酐添加溴乙酰基。粗产物通过HPLC纯化以获得需要的肽IMP361(MH+1498)。
IMP366肽通过与IMP361相同的方法制备，最后添加苯硫乙酸。粗产物通过HPLC纯化以获得产物IMP366MH+1528。
IMP368肽的制备参见IMP349，除了未添加半胱氨酸残基，并且使用对称四叔丁基DTPA替代非对称DTPA，以在纯化后获得需要的产物IMP368MH+1292。
IMP369肽的制备参见IMP349，但是添加Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸替代D-Cys和添加对称四叔丁基DTPA替代DTPA四叔丁基酯的非对称形式。纯化粗肽以获得需要的产物MH+1517。
IMP370肽的制备参见IMP369，除了使用Fmoc-R-3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸替代溴。通过HPLC纯化后获得需要的产物MH+1484。
IMP371肽的制备参见IMP370，除了使用非对称四叔丁基DTPA替代对称形式。通过HPLC纯化后获得需要的产物MH+1484。
IMP372肽的制备参见IMP361，但是使用Fmoc-Ser(But)-OH将Ser连接至Dap侧链。除去Fmoc，将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1465。
IMP373肽的制备参见IMP361，但是使用对称四叔丁基酯DTPA将Sym-DTPA连接至Dap侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1753。
IMP374肽的制备参见IMP361，但是将Fmoc-S-乙基半胱氨酸添加至Dap侧链，然后经由氯乙酸酐添加氯乙酰基(于半胱氨酸氮上)。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1585。
IMP375肽的制备参见IMP361，但是将Fmoc-R-3-氨基-3-(2-溴苯基)丙酸添加至Dap侧链，然后切割Fmoc基团。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1603。
IMP376肽的制备参见IMP361，但是在第二个丙氨酸后添加Fmoc-D-Tyr(But)-OH，然后是Fmoc-Cys(SO3H)和四叔丁基DTPA。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1558。
IMP379肽的制备参见IMP361，但是将Boc-2-Abz-OH添加至Dap的侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1497。
IMP382肽的制备参见IMP361，但是从Dap的侧链除去Aloc。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1378。
IMP383肽的制备参见IMP361，但是将Fmoc-Gla(OBut)2-OH添加至Dap的侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+-CO21507。
IMP384肽的制备参见IMP361，但是将Fmoc-Boc-S-3-氨基-3-(2-羟基苯基)丙酸添加至Dap的侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1541。
IMP385肽的制备参见IMP361，但是将Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH添加至Dap的侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1464。
IMP386肽的制备参见IMP361，但是将Boc-D-2-吡啶基丙氨酸-OH添加至Dap的侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1526。
IMP387肽的制备参见IMP361，但是将Fmoc-D-9-蒽基丙氨酸-OH添加至Dap的侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1625。
IMP389肽的制备参见IMP361，但是将双-Boc-哌嗪-2-羧酸盐添加至Dap的侧链。将肽从树脂解离，并纯化以获得需要的产物MH+1664。
实施例5.体内研究
向携带GW-39人结肠异种移植肿瘤(100-500mg)的裸鼠注射双特异性抗体hMN-14xm679(1.5x10-10mol)。在注射F-18标记的肽(8.8μCi，1.5x10-11mol)之前，允许抗体清除24小时。在注射后3、24和48小时对所述动物成像。异种移植肿瘤通过PET扫描检测与双特异性hMN-14x m679结合的F-18标记的肽而被清晰成像，双特异性hMN-14x m679通过hMN-14与肿瘤抗原的结合而定位于肿瘤。
实施例6.血清稳定的F-18标记肽的制备和用途
IMP449NOTA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1459
肽IMP448D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2MH+1009在Sieber酰胺树脂上制备，通过以所示的顺序向树脂添加下列氨基酸：Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、切割Aloc、Fmoc-D-Tyr(But)-OH、Aloc-D-Lys(Fmoc)-OH、Trt-HSG-OH、切割Aloc、Fmoc-D-Ala-OH，最后切割Fmoc以制备需要的肽。然后将肽从树脂解离，并通过HPLC纯化以制备IMP448，其然后与ITC-苄基NOTA偶联。肽IMP4480.0757g(7.5x10-5mol)与0.0509g(9.09x10-5m0l)ITC苄基NOTA混合，并溶于1mL水。然后向搅拌的肽/NOTA溶液缓慢加入无水碳酸钾0.2171g。在加入所有碳酸盐后反应溶液为pH10.6。允许反应在室温搅拌过夜。14小时后用1M HCl小心猝灭反应，并通过HPLC纯化以获得48mg需要的产物IMP 449。
IMP449的F-18标记
肽0.002g(1.37x10-6mol)溶于686μL(2mM肽溶液)0.1M NaOAc pH4.02。三微升于pH4乙酸盐缓冲液中的2mM Al溶液与15μL、1.3mCi的F-18混合。所述溶液然后与20μL的2mMIMP449溶液混合，并在105℃加热15分钟。反相HPLC分析显示35％(RT～10分钟)的活性连接至肽，而65％的活性在柱的空隙体积洗脱(3.1分钟)，表明活性与所述肽无关。粗标记的混合物(5μL)与收集的人血清混合，并在37℃孵育。15分钟后取出小份并通过HPLC分析。HPLC显示9.8％的活性仍连接至肽(从35％下降)。1小时后取出另一小份并通过HPLC分析。HPLC显示7.6％的活性仍连接至肽(从35％下降)，这基本上与15分钟的谱图相同。
高剂量F-18标记
使用纯化的IMP449的进一步研究证明，F-18标记的肽在人血清中于37℃下高度稳定至少一小时(91％，图19B)，并且在人血清中于37℃下部分稳定至少四小时(76％，图19D)。这些结果证明，本文公开的F-18标记的肽在接近体内的条件下显示充分的稳定性以用于F-18成像研究。
于～400μL水中的F-18～21mCi与于0.1M pH4NaOAc中的9μL2mM AlCl3混合。加入肽IMP44960μL(0.01M，6x10-7mol，于0.5N NaOH中，pH4.13)，并将溶液加热至110℃，15分钟。然后通过以下纯化粗标记的肽：将反应溶液置于1cc Waters HLB柱的桶中，并用水洗脱以除去未结合的F-18，然后用1∶1EtOH/H2O以洗脱F-18标记的肽。粗反应溶液通过所述柱进入废液瓶，并用三个1毫升水的级分(18.97mCi)洗涤柱。然后将HLB柱置于新瓶上，并用2x200μL1∶1EtOH/H2O洗脱来收集标记的肽(1.83mCi)。在所有的洗脱完成后柱保留0.1mCi的活性。小份的纯化的F-18标记肽(20μL)与200μL收集的人血清混合，并在37℃加热。小份通过反相HPLC分析(如上所述)。结果显示在37℃下在人血清中孵育零时(图19A)、1小时(图19B，91％标记的肽)、2小时(图19C，77％标记的肽)和4小时(图19D，76％标记的肽)的F-18标记的纯化IMP449的相对稳定性。还观察到F-18标记的IMP449在TFA溶液中稳定，其有时用于反相HPLC色谱。观察到的本文所述示例性F-18标记的分子在TFA中的稳定性与在人血清中的稳定性之间显示广义相关性。
序列表
<110> 免疫医学股份有限公司 威廉.J.麦克布莱德 大卫.M.高德宝
<120> 用于蛋白质、肽和其他分子的改进的F-18标记的方法和组合物
<130> 78258-361491
<140> PCTUS0788064
<141> 2007-12-19
<150> 60/884,521
<151> 2007-01-11
<160> 2
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 修饰的肽: DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2
<400> 1
Phe Lys Tyr Lys
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 修饰的肽: Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2
<400> 2
Lys Tyr Lys Lys
1

Claims (19)

1.F-18在制备用于利用正电子成像术PET成像的制剂中的用途，其包括：
a) 通过添加IIIA族金属形成F-18 IIIA族金属络合物来活化F-18；
b) 将所述络合物连接至蛋白质或肽以形成F-18标记的蛋白质或肽，其中将所述F-18IIIA族络合物连接至所述蛋白质或肽上的螯合基团；
c) 在其中标记的分子被定位至一种或多种细胞、组织或器官的条件下将所述分子施用于受治疗者；和
d) 通过PET扫描对所述F-18标记的蛋白质或肽的分布进行成像，
其中所述IIIA族金属为铝，
其中所述螯合基团共价连接至所述蛋白质或肽，
其中所述螯合基团为对-溴乙酰胺基-苄基-四乙胺四乙酸或1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述F-18标记的蛋白质或肽被施用于所述受治疗者而无需从未标记的蛋白质或肽中纯化所述F-18标记的蛋白质或肽。
3.如权利要求2所述的用途，其中将所述络合物连接至所述蛋白质或肽而无需从未络合的F-18中纯化含有F-18的络合物。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述F-18标记的蛋白质或肽用于成像受体。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述F-18标记的蛋白质或肽用于成像肿瘤。
6.如权利要求1所述的用途，其中使用抗体、抗体片段或抗体构建体将所述F-18标记的蛋白质或肽靶向。
7.如权利要求1所述的用途，其中使用双特异性抗体将所述F-18标记的蛋白质或肽靶向。
8.如权利要求7所述的用途，其进一步包括：
i) 将双特异性抗体施用于受治疗者，所述双特异性抗体具有至少一个针对可靶向构建体的结合位点和至少一个针对被靶向抗原的结合位点，其中所述被靶向抗原的存在指示疾病或疾患；
ii) 允许足量的时间，以使未与被靶向抗原结合的双特异性抗体从循环中清除；和
iii) 将F-18标记的可靶向的构建体施用于所述受治疗者，
其中所述可靶向构建体是被靶向的蛋白质或肽。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述被靶向的抗原是肿瘤相关抗原。
10.如权利要求8所述的用途，其中所述被靶向的抗原存在于病原生物上。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述病原体是微生物。
12.如权利要求10所述的用途，其中所述病原体是病毒、细菌或酵母。
13.如权利要求10所述的用途，其中所述病原体是真菌。
14.如权利要求8所述的用途，其中所述被靶向的抗原选自由以下组成的组：结肠特异性抗原-p、癌胚抗原、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD80、HLA-DR、Ia、Ii、MUC 1、MUC 2、MUC 3、MUC 4、NCA、EGFR、HER 2/neu受体、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le-y、5100、PSMA、PSA、生腱蛋白、叶酸受体、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、PlGF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、T101、MAGE或这些抗原的组合。
15.如权利要求1所述的用途，所述F-18标记的分子为肽。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述肽选自由以下组成的组：IMP 272、IMP 332、IMP 333、IMP 361、IMP 366、IMP 371、IMP 372、IMP 373、IMP 374、IMP 375、IMP 376、IMP379、IMP 382、IMP 383、IMP 384、IMP 385、IMP 386、IMP 387、IMP 389和IMP 449。
17.如权利要求15所述的用途，其中所述肽是IMP 449。
18.如权利要求15所述的用途，其中所述F-18标记的分子于37℃在人血清中稳定至少一个小时。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述F-18标记的分子于37℃在人血清中稳定至少四个小时。
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