CN117624208A - 一种靶向肝癌细胞的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种靶向肝癌细胞的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针具有如下所示的结构式，本发明的荧光探针能够被肝癌细胞过表达的SLC27A2转运到细胞内，可以有效地区分正常肝细胞和肝癌细胞。通过对肝癌组织进行荧光成像，该探针能够标记肝癌区域。本发明的荧光探针有助于肝癌的早期诊断，也为癌症的荧光指导手术提供了独特的诊断工具。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种靶向肝癌细胞的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
原发性肝癌是世界范围内的第5大常见肿瘤，其中90％为肝细胞癌。病毒性肝炎、肥胖和代谢综合征是肝细胞癌发病的明确危险因素。有数据表明，目前全球每年原发性肝癌患病人数高达62万人，且每年死于肝癌的患者高达58万人。肝癌早期呈隐匿发病的特点，临床表现不明显，确诊后大多数患者已处于中晚期，预后较差。因此，肝癌的早期诊断对于有效治疗和长期生存至关重要，肝癌的早期筛查十分重要。
甲胎蛋白(AFP)血清学检查和常规超声是最普及的肝癌早期筛查手段。甲胎蛋白被认为是肝细胞癌血清学标记物的金标准。大约80％的原发性肝癌患者血清中甲胎蛋白会升高。然而，通常甲胎蛋白浓度与肿瘤大小有相关，但个体差异较大，一般认为病理分化接近正常肝细胞或分化程度极低者甲胎蛋白含量较低或测不出。并且，甲胎蛋白升高也可见于活动性肝病、生殖系统肿瘤、孕妇、胰腺癌和肺癌等。因此，因其敏感性和特异性差，通过单独检测甲胎蛋白来诊断早期肝癌不足以满足目前临床需求。肝脏超声因其非侵入、无辐射和性价比高的优点，是临床上筛查肝癌的首选影像检查手段。它可以发现或排除大部分的肝脏占位性病变，目前高档的超声仪能够显示直径1cm的肝癌。然而，对于病灶＜1cm的早期肝癌，由于仪器设备的检出受限，不能实现早期的诊断。因此，目前临床上不能对肝癌进行早期诊断主要有两个原因：(1)没有特异性的生物标志物；(2)仪器的精确度不够。
利用荧光分子成像技术，科研人员开发了一系列荧光探针用于肝癌的检测。探针的设计主要基于对肿瘤标志物的检测，即利用荧光团共轭连接不同的靶向肿瘤标志物的基团，例如羧酸酯酶、氨肽酶、去唾液酸糖蛋白、组蛋白脱乙酰酶和G蛋白偶联受体等，通过对肿瘤标志物的识别从而实现对肿瘤病灶与正常组织之间的荧光甄别，完成对肝癌的检测。然而，这些荧光探针仍存在一些缺陷：(1)探针普遍没有肿瘤靶向性，必须通过瘤内注射才能实现肿瘤的成像；(2)这些肿瘤标志物并非肝癌特异性，无法精确诊断肝癌。
因此，亟需提供一种肝癌细胞靶向成像的荧光探针，以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于发展肝癌细胞特异性荧光探针，提高荧光探针检测肝癌的精确度和靶向性。
本发明的第一个方面，提供一种靶向肝癌细胞的荧光探针，结构式如下式(1)所示：
本发明的第二个方面，提供所述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
将式(4)所示5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛、式(8)所示8-(1H-吡咯-2-基)辛酸、三氯氧磷和二氯甲烷/正己烷混合溶剂以1mol：1mol：1mol：2L的摩尔体积比混合，0-5℃反应2-3小时，所述二氯甲烷/正己烷混合溶剂由二氯甲烷和正己烷按照1：1的体积比混合；
随后加入二氨基顺丁腈和三氟化硼乙醚，20-25℃反应2-3小时，所述二氨基顺丁腈、三氟化硼乙醚与所述5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛的摩尔比为1mol：4mol：5.6mol，产物经纯化得到所述荧光探针；
进一步的，所述5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛的制备包括：
将式(3)所示2-戊基-1H-吡咯、二甲基甲酰胺、三氯氧磷、二氯乙烯、乙酸钠与H2O以1mol：1.1mol：1.1mol：3.95L：4.5mol的摩尔体积比混合，0-5℃反应15-30分钟，产物经纯化得到所述5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛；
更进一步的，所述2-戊基-1H-吡咯的制备包括：
将式(2)所示1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮和NaBH4加入到异丙醇中，80-90℃加热回流10-12小时，产物经纯化得到所述2-戊基-1H-吡咯，所述1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮、NaBH4和异丙醇的摩尔体积比为1mol：7mol：2.19L；
更进一步的，所述1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮的制备包括：
将戊酰氯、吡咯和AlCl3和二氯甲烷按照1.60L：1.03L：16.08mol的摩尔体积比混合，20-25℃反应12-15小时，产物经纯化得到所述1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮。
进一步的，所述8-(1H-吡咯-2-基)辛酸的制备包括：
将式(7)所示8-氧代-8-(1H-吡咯-2-基)辛酸甲酯、NaBH4和异丙醇按照8.79mol：61.6mol：17L的摩尔体积比混合，80-90℃加热回流10-15小时，残留物经纯化得到所述8-(1H-吡咯-2-基)辛酸；
更进一步的，所述8-氧代-8-(1H-吡咯-2-基)辛酸甲酯的制备包括：
将式(6)所示8-氯-8-氧代辛酸甲酯、吡咯、AlCl3和二氯甲烷按照26.89mol：29.7mol：32.3mol：38L的摩尔体积比混合，20-25℃反应12-15小时，产物经纯化得到所述8-(1H-吡咯-2-基)辛酸；
更进一步的，所述8-氯-8-氧代辛酸甲酯的制备包括：
在0℃下，将辛二酸单甲酯、草酰氯、二甲基甲酰胺和二氯甲烷按照26.9mol：32.3mol：2.69mol：26L的摩尔体积比混合，反应2-3小时升温至24-25℃，产物经纯化得到所述8-氯-8-氧代辛酸甲酯。
本发明的第三个方面，提供所述荧光探针在制备用于肝癌诊断的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
在本发明的一实施例中，所述检测试剂是能够靶向进入肝癌组织的成像试剂，将所述荧光探针溶于DMSO中制成5mmol母溶液，然后将母溶液溶于生理盐水中制成50μmol溶液，将100μL荧光探针溶液经尾静脉注射到肝癌小鼠体内，1小时后，在激光共聚焦显微镜下进行成像。
本发明的第四个方面，提供所述荧光探针化合物在制备用于特异性标记肝癌细胞的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
在本发明的一实施例中，所述检测试剂是能够靶向进入肝癌细胞成像试剂，所述成像试剂的细胞给药量为1-10μmol。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过高通量筛选得到一种特异性识别肝癌细胞的荧光探针。所述荧光探针能够被肝癌细胞过表达的溶质载体家族27成员2(SLC27A2)转运到细胞内，可以有效地区分正常肝细胞和肝癌细胞。通过对肝癌组织进行荧光成像，该探针能够标记肝癌区域。本发明的荧光探针有助于肝癌的早期诊断，也为癌症的荧光指导手术提供了独特的诊断工具。
附图说明
图1为细胞高通量筛选流程。
图2为荧光探针I的结构。
图3为荧光探针I的荧光光谱。
图4为荧光探针I的氢谱。
图5为荧光探针I的碳谱。
图6为荧光探针I的合成路线。
图7荧光探针I对肝癌细胞的特异性选择标记。
图8为荧光探针I对肝癌组织的特异性选择标记。
图9为荧光分子库中另外五种荧光探针化合物的结构和特异性选择标记。其中，A为荧光探针II，B为荧光探针III，C为荧光探针IV，D为荧光探针V，E为荧光探针VI。
图10为荧光探针I对肝癌细胞的靶向。
图11为肝癌细胞和正常细胞中SLC27A2的mRNA表达。
图12为SLC27A2抑制剂对荧光探针I摄取的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：肝癌细胞靶向成像的荧光探针的筛选
图1为肝癌细胞靶向成像的荧光探针的细胞高通量筛选流程。将THLE-2和HepG2细胞(1×105/well)间隔种于384孔板中，孵育1天。然后将1μmol荧光分子库(申请人实验室中合成了大量的荧光分子，称为荧光分子库)加入到细胞并孵育1h。然后利用荧光显微镜(Operetta)对细胞内的荧光进行采集。筛选出一种只对HepG2细胞有响应的荧光分子，该荧光探针的结构式如图2。该荧光探针的荧光光谱、氢谱和碳谱的检测结果如图3-图5所示，所述荧光探针的吸收波长为510nm，发射波长为518nm。参照图6所示合成路线，该荧光探针合成的具体步骤如下：
(1)将1.60ml(即13.4mmol)戊酰氯、1.03ml(即14.8mmol)吡咯和2.14g(即16.08mmol)AlCl3加入到26.8ml的二氯甲烷中，室温搅拌12小时。反应后，使用乙酸乙酯:己烷＝1:10(v/v)，将粗混合物经硅胶色谱纯化，得到1.3g的粉红色晶体1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮(产率为64.1％)。
(2)将1.3g(即8.6mmol)1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮和2.28g(即60.2mmol)NaBH4加入到18.8ml异丙醇中，90℃加热回流10小时，产物经硅胶色谱纯化，使用乙酸乙酯：己烷＝1：8(v/v)，得到0.63g产物2-戊基-1H-吡咯(产率为70％)。
(3)将0.9g(即8.6mmol)2-戊基-1H-吡咯、0.73ml(即9.46mmol)二甲基甲酰胺、0.88ml(即9.46mmol)三氯氧磷、34ml二氯乙烯、3.17g(即38.7mmol)乙酸钠与20ml H2O混合在圆底烧瓶中，0℃水浴15分钟，产物经硅胶色谱纯化，使用乙酸乙酯：己烷＝1：8(v/v)，得到657mg的棕色油状物5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛(产率为46.2％)。
(4)在0℃下，将5.06g(即26.9mmol)辛二酸单甲酯、2.8ml(即32.3mmol)草酰氯、0.2ml(即2.69mmol)二甲基甲酰胺加入到含有26ml二氯甲烷的圆底烧瓶中，120转/分钟搅拌2小时升温至25℃，产物经硅胶色谱纯化，使用乙酸乙酯：己烷＝1：10(v/v)，得到3.77g的8-氯-8-氧代辛酸甲酯(产率为68％)。
(5)将5.54g(即26.89mmol)8-氯-8-氧代辛酸甲酯、2.06ml(即29.7mmol)吡咯、4.3g(即32.3mmol)AlCl3加入到38ml二氯甲烷中，室温搅拌12小时。反应后，使用乙酸乙酯:己烷＝1:10(v/v)，将粗混合物经硅胶色谱纯化，得到1.88g的白色固体8-氧代-8-(1H-吡咯-2-基)辛酸甲酯(产率为29.5％)。
(6)使用1.72g(即8.79mmol)8-氧代-8-(1H-吡咯-2-基)辛酸甲酯、2.33g(即61.6mmol)NaBH4加入到17ml异丙醇溶液中，90℃加热回流10小时，残留物经硅胶色谱纯化，使用乙酸乙酯:正己烷从1:10到1:1的体积梯度，得到1.04g的棕色固体8-(1H-吡咯-2-基)辛酸(产率为70.7％)。
(7)第一步使用24mg(即0.15mmol)5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛，21mg(即0.15mmol)8-(1H-吡咯-2-基)辛酸，14μl(即0.15mmol)三氯氧磷和3ml二氯甲烷/正己烷混合溶剂(v/v＝＝1:1)加入到圆底烧瓶，0℃搅拌2小时。随后将128mg(即0.6mmol)二氨基顺丁腈和0.1ml(即0.84mmol)三氟化硼乙醚加入到烧瓶内，室温搅拌3小时。产物经硅胶色谱纯化，使用乙酸乙酯:正己烷从1:10至1:3的体积梯度，得到7mg的橙红色固体为荧光探针，记作荧光探针I(产率为15.6％)。
上述步骤中所述室温均为20-25℃，搅拌的转速均为120转/分钟。
实施例2：肝癌小鼠中肝癌组织的识别鉴定
筛选出的荧光探针I可以靶向性地检测肝癌小鼠中的肝癌组织，且具有快速的响应性，可以有效地区分肝癌组织和正常组织。韩国浦项工科大学动物伦理委员会批准了该项实验。
荧光探针溶于DMSO中制成5mM母溶液，然后将母溶液溶于生理盐水中制成50μM溶液，将100μL荧光探针溶液经尾静脉注射到肝癌小鼠体内，1小时后，将其内脏(心，肝，脾，肺，肾)取出，最后在激光共聚焦显微镜下进行成像(图7)。对捕获的结果进行荧光分析，如图8所示，观察到荧光探针I的信号能与肝癌组织完全吻合，说明荧光探针I能够靶向肝癌组织。
作为对比，验证了荧光分子库中另外五种荧光探针化合物(荧光探针II，荧光探针III，荧光探针IV，荧光探针V，荧光探针VI)对肝癌组织的特异性选择标记，结果如图9所示，荧光探针II、荧光探针III、荧光探针IV与荧光探针I的结构相似，区别在于碳链和脂肪酸链长度不同，而肝癌组织中的荧光信号减弱(图9A-9C)，说明改变荧光探针I的碳链和脂肪酸链长度降低了其对肝癌组织的选择性。荧光探针V、荧光探针VI与荧光探针I的结构完全不同，在正常肝组织和肝癌组织中均没有荧光(图9D，9E)，即无肝癌组织选择性。
另外发现荧光探针I在肾脏也有非常强的荧光信号，这可能是因为荧光探针I被肾脏代谢的原因。为了进一步验证荧光探针I能够标记肝癌细胞，将正常肝脏组织和肝癌组织进行组织切片，切片厚度为15μm。然后将组织切片置于激光共聚焦显微镜下进行成像。对捕获的结果进行荧光分析，如图10所示，荧光探针I能够标记肝癌细胞，因此，能够区分正常肝组织和肝癌组织。上述实验结果表明，荧光探针I能够特异性标记肝癌细胞，从而区分正常肝组织和肝癌组织，有助于实现早期肝癌诊断。
实施例3：荧光探针I对肝癌细胞的染色机理的研究
SLC是一种膜转运蛋白，可以运输氨基酸、蛋白质、营养物质和神经递质的组成部分。其中，SLC27A2(FATP2)在脂质生物合成和脂肪酸转运中起着至关重要的作用。荧光探针I的结构中含有一个很长的脂肪酸链，我们推测SLC27A2转运蛋白对荧光探针的转运起着重要的作用，从而导致了荧光探针对细胞的选择性。首先对正常细胞和肝癌细胞SLC27A2的mRNA表达进行考察，如图11所示，发现相比于正常细胞，SLC27A2在肝癌细胞中高表达。接下来，在细胞中孵育荧光探针(给药量为1μmol)之前加入SLC27A2的抑制剂(给药量为1μmol)，然后采集荧光数据。如图12所示，加入SLC27A2的抑制剂Lipofemata后荧光明显降低，而加入其他脂质摄取转运体CD36的抑制剂SSO不会导致荧光降低，说明荧光探针I是通过SLC27A2进入细胞，SLC27A2控制荧光探针进入细胞。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种靶向肝癌细胞的荧光探针，其特征在于，结构式如下式(1)所示：
2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式(4)所示5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛、式(8)所示8-(1H-吡咯-2-基)辛酸、三氯氧磷和二氯甲烷/正己烷混合溶剂以1mol：1mol：1mol：2L的摩尔体积比混合，0-5℃反应2-3小时，所述二氯甲烷/正己烷混合溶剂由二氯甲烷和正己烷按照1：1的体积比混合；
随后加入二氨基顺丁腈和三氟化硼乙醚，20-25℃反应2-3小时，所述二氨基顺丁腈、三氟化硼乙醚与所述5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛的摩尔比为1mol：4mol：5.6mol，产物经纯化得到所述荧光探针；
3.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛的制备包括：
将式(3)所示2-戊基-1H-吡咯、二甲基甲酰胺、三氯氧磷、二氯乙烯、乙酸钠与H2O以1mol：1.1mol：1.1mol：3.95L：4.5mol的摩尔体积比混合，0-5℃反应15-30分钟，产物经纯化得到所述5-戊基-1H-吡咯-2-甲醛；
4.根据权利要求3所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2-戊基-1H-吡咯的制备包括：
将式(2)所示1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮和NaBH4加入到异丙醇中，80-90℃加热回流10-12小时，产物经纯化得到所述2-戊基-1H-吡咯，所述1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮、NaBH4和异丙醇的摩尔体积比为1mol：7mol：2.19L；
5.根据权利要求4所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮的制备包括：
将戊酰氯、吡咯和AlCl3和二氯甲烷按照1.60L：1.03L：16.08mol的摩尔体积比混合，20-25℃反应12-15小时，产物经纯化得到所述1-(1H-吡咯-2-基)戊-1-酮。
6.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述8-(1H-吡咯-2-基)辛酸的制备包括：
将式(7)所示8-氧代-8-(1H-吡咯-2-基)辛酸甲酯、NaBH4和异丙醇按照8.79mol：61.6mol：17L的摩尔体积比混合，80-90℃加热回流10-15小时，残留物经纯化得到所述8-(1H-吡咯-2-基)辛酸；
7.根据权利要求6所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述8-氧代-8-(1H-吡咯-2-基)辛酸甲酯的制备包括：
将式(6)所示8-氯-8-氧代辛酸甲酯、吡咯、AlCl3和二氯甲烷按照26.89mol：29.7mol：32.3mol：38L的摩尔体积比混合，20-25℃反应12-15小时，产物经纯化得到所述8-(1H-吡咯-2-基)辛酸；
8.根据权利要求7所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述8-氯-8-氧代辛酸甲酯的制备包括：
在0℃下，将辛二酸单甲酯、草酰氯、二甲基甲酰胺和二氯甲烷按照26.9mol：32.3mol：2.69mol：26L的摩尔体积比混合，反应2-3小时升温至24-25℃，产物经纯化得到所述8-氯-8-氧代辛酸甲酯。
9.权利要求1所述荧光探针在制备用于肝癌诊断的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
10.权利要求1所述荧光探针化合物在制备用于特异性标记肝癌细胞的检测试剂和/或试剂盒中的应用。
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