DE69130224T2 - Monoklonaler antikörper - Google Patents

Monoklonaler antikörper

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG TECHNISCHES GEBIET
  • Der Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper, welcher als K1 bezeichnet wird, und auf Verwendungen davon.
  • Insbesondere kann der K1 monoklonale Antikörper bei der Behandlung und Diagnose von verschiedenen Formen von Krebs verwendet werden.
    • HINTERGRUNDINFORMATION
  • Gegenwärtige Therapien für Humanmetastasekrebse wie beispielsweise Bestrahlung oder Chemotherapie zentrieren sich auf Mittel, die selektiv schnell wachsende Krebszellen töten. Unglücklicherweise zeigen viele Tumore keine ungewöhnlich schnelle Wachstumsrate im Vergleich zu wichtigen normalen Geweben, wie beispielsweise Knochenmark oder das Epithelium des Magen-Darmtrakts. Eine alternative Gruppe von therapeutischen Annäherungen zielt auf einzigartige chemische Strukturen auf der Oberfläche von Tumorzellen für die Therapie, wobei am häufigsten Antikörper verwendet werden, die selektiv an diese Zielmoleküle binden. Eine dieser therapeutischen Annäherungen verwendet Antikörper, die an zelltötende Mittel gekoppelt sind, wie beispielsweise Pflanzen- oder Bakterientoxine. Es hat sich gezeigt. daß diese Antikörper-Toxinkomplexe oder Immuntoxine sich dazu eignen, selektiv Tumorzellen in Modelltumorsystemen in Gewebekultur und in Labortieren zu töten (Pastan et al., Cell 47: 641-648 (1986)).
  • Trotz vieler Versuche, derartige tumorspezifische Antikörper für Humantherapie zu isolieren, sind noch sehr wenige Antikörper identifiziert, die selektiv nur an Tumorzellen und nicht an andere wichtige normale Gewebe binden. Die Isolierung derartiger tumorspezifischer Antikörper ist deshalb von Bedeutung für die Anwendung derartiger immungerichteter Therapien.
  • Monoklonale Antikörpermethodologie, wie ursprünglich von Kohler und Milstein (Nature 156: 495-497 (1975) beschrieben und in Koprowski et al. (U. S. Pat. Nr. 4 172 124) offenbart, hat die Isolierung von Antikörpern in reiner Form für die Konstruktion therapeutischer Mittel erlaubt. Es haben jedoch zwei Probleme die Anwendung von vielen zuvor isolierten Antikörpern verhindert. Zuerst reagieren viele monoklonale Antikörper, die mit Tumorzellen reaktiv sind, auch mit wichtigen normalen Humangeweben. Zweitens binden viele der isolierten Antikörper an Oberflächenelemente, die nicht wirksam den Eintritt von Toxinkonjugaten in Zellen durch Endozytose vermitteln. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper, K1, der selektiv an einige Humantumore bindet, aber nicht an viele wichtige normale Gewebe. Es ist auch gezeigt worden, daß dieser Antikörper, wenn als das Zielelement eines Immuntoxins eingefügt, wirksamen Eintritt dieser Toxinmittel in Zellen erlaubt.
  • Ein Antikörper, welcher mit einem Antigen reaktiv ist, das im Plasma von Patienten mit Eierstockkrebs verbreitet ist, ist zuvor isoliert worden. Dieser Antikörper OC125, welcher reaktiv mit diesem verbreiteten Antigen CA12S ist, ist bei der Diagnose von primärem und wiederkehrendem Eierstockkrebs verwendet worden (Bast et al., J. Clin. Invest. 68: 1331 (1981)). Jedoch zeigt der Beweis, daß der K1 monoklonale Antikörper ein Epitop auf der Zelloberfläche erkennt, welches gänzlich unterschiedlich von dem einen ist, das durch OC125 erkannt wird. Ferner ist das Antigen, welches mit K1 reagiert, nicht in das Plasma von Patienten mit Eierstockkrebs verbreitet. Das Fehlen von Verbreiten in das Plasma macht K1 zu einem sehr viel besseren Kandidatenantikörper für Immuntherapie, weil er nicht durch zirkulierendes Antigen unmittelbar bei Injektion in den Blutstrom neutralisiert würde.
  • Kurrasch et al., J. Histochem., 37: 57-67 (1989) offenbart OVB1 Antikörper. Jedoch reagiert OVB1 stark mit allen Eierstockkarzinomen, aber, was wichtiger ist, hat eine starke Reaktivität mit normalem Gewebe aus der Schilddrüse und Speiseröhre. Der K1 Antikörper der vorliegenden Erfindung reagiert im Unterschied dazu nicht mit normalem Gewebe.
  • Mattes et al., US 4 666 845 offenbart monoklonale Antikörper, erhalten nach Immunisierung mit einer Eierstockkarzinomzelllinie oder nach Immunisierung mit einer Endometriumkarzinomzelllinie. Die einzige restliche Gewebereaktivität von K1 ist mit Mesothel von Serosaoberflächen von Peritoneum. Pleura und Pericardium, wohingegen die normale Gewebereaktivität der monoklonalen Antikörper von Mattes et al. mit Uterusepithelzellen und Schilddrüse. Bauchspeicheldrüse. Harnleiter, Brust, Prostata. Cervix, Blase, Epithelzellen. Sudor und Talgdrüsen von Haut ist.
  • Colnaghi et al.. Nuclear Medicine and Biology, 16(6): 633-636 (1989) offenbart den monoklonalen Antikörper Mov18, und die Eigenschaften dieses Antikörpers sind vom Isotyp IgG1k. Reaktivität besteht mit normalen Geweben aller größeren Organe, beispielsweise Niere, Lunge. Magen-Darmtrakt, Leber, Hematolymphsystem.
  • Pastan et al.. WO-A-88 00703 richtet sich auf den monoklonalen Antikörper OVB- 3, welcher hochspezifisch für Humaneierstockkrebs ist und verwendet wird, das Pseudomonasexotoxinkonjugat zu konstruieren. OVB-3 ist IgG2bk und erkennt ein unbekanntes Antigen, welches in Eierstockkrebsen verschiedener Typen vorhanden ist, während K1 IgG1k ist. Ferner hat OVB-3 Kreuzreaktivität mit der molekularen Schicht von Hypothalamus, wohingegen K1 keine Reaktivität mit dem gleichen Gewebe hat.
  • Zurawski et al., WO 89/01629 richtet sich auf ein Zelloberflächenantigen, welches als CA-TL3 bezeichnet wird, welches nicht empfindlich gegenüber proteolytischer Verdauung ist, aber welches wichtigerweise von Eierstockkrebszellen verbreitet wird. Das von K1 erkannte Antigen ist nicht verbreitet.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Der Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper. welcher als K1 bezeichnet wird, und auf die Verwendungen davon.
  • Insbesondere kann der Antikörper als ein therapeutisches Zielmittel bei der Behandlung und Diagnose von verschiedenen Formen von Krebsen verwendet werden.
  • Genauer ausgedrückt, die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Hybridom. welches einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der spezifisch für ein Zelloberflächenantigen ist, wobei das Antigen durch Expression auf normalem Primatengewebe, malignen kultivierten Humanzelllinien und Humantumor gekennzeichnet ist und nicht in Kulturmedien oder Plasma verbreitet wird. Die Hybridomzelllinie hat die Hinterlegungsnummer ATCC HB 10570, hinterlegt am 10. Oktober 1990.
  • Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf den monoklonalen Antikörper selbst, welcher spezifisch für ein Zelloberflächenantigen mit den zuvor genannten Eigenschaften ist, und welcher durch das Hybridom hergestellt wird. Der monoklonale Antikörper ist von der IgG Klasse.
  • Die zuvor angegebene kultivierte Humanzelllinie ist ausgewählt aus der Gruppe aus beispielsweise OVCAR-2, OVCAR-3, OVCAR-4, 1847, HTB77, HeLa S3, KB, AGS und HTB103. Das normale Primatengewebe, welches das Antigen exprimiert, ist beispielsweise Mesothel. Der Humantumor stammt beispielsweise von einem Eierstockkrebs, einem Speiseröhrenkrebs oder einem Cervixkrebs ab.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch den monoklonalen Antikörper für die Verwendung bei der Behandlung von Krebs, umfassend Verabreichen einer Menge eines Konjugats des monoklonalen Antikörpers, die ausreichend ist, die Behandlung zu bewirken, einem Patienten, der die Behandlung benötigt.
  • Die Art von behandeltem Krebs kann beispielsweise Eierstockkrebs sein. Der Antikörper ist beispielsweise mit einem Toxin, Radionuklid oder Chemotherapeutikum konjugiert. Der Antikörper kann auch modifiziert werden, um Zelltöten zu vermitteln.
  • Darüberhinaus umfaßt die vorliegende Erfindung auch den monoklonalen Antikörper für die Verwendung bei der Diagnose von Krebs in einem Patienten, umfassend Verabreichen einer Menge des moklonalen Antikörpers, die ausreichend ist, die Diagnose zu erzeugen, an den Patienten. Der monoklonale Antikörper kann radioaktiv markiert sein. Die Diagnose kann durch Sichtbarmachen des Vorhandenseins der Radiomarkierung gestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den monoklonalen Antikörper in einer Konzentration, die ausreichend ist, Tumorwachstum zu inhibieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 stellt die Ergebnisse eines radioaktiv markierten Antikörperassays von Serumproben von Patienten mit Eierstockkrebs dar.
  • K1 oder OC125 wurden an Mikrotitervertiefungen angefügt, und Proben von Patientenseren oder Kulturüberstand wurden unter Verwenden eines Verfahrens, das ähnlich zu dem in Tabelle VIII gezeigten war, hinzugegeben. Die Vertiefungen wurden dann mit entweder jodiertem radioaktiven K1 in Vertiefungen, vorbehandelt mit K1 (K1 System), oder radioaktivem OC125 in Vertiefungen, vorbehandelt mit OC125 nicht markiertem Antikörper (OC125 System), inkubiert. Analog zu Tabelle VIII zeigte der Überstand von OVCAR-3 Kulturen (Konzentrat verdünnt 1 : 3. Wert dividiert durch 2) Binden von OC125, nachgewiesen durch markierten OC125 Antikörper, Im Unterschied dazu zeigen derartige mit gebundenem K1 inkubierte Überstände, anschließend mit jodiertem K1 Antikörper nachgewiesen, kein nachweisbares Signal. Eine CA125 gereinigte Antigenstandardprobe zeigt Reaktion mit dem OC125 System, aber nicht mit dem K1 System. Proben von Patientenseren zeigen variable Signalspiegel mit dem OC125 System aber kein Signal mit dem K1 System. Das K1 System weist ein schwaches Signal in dem Trypsinat von OVCAR-3 Zellen nach, wo das OC125 Antigen durch Trypsinbehandlung zerstört wird, und zeigt kein Signal mit dem 0C125 System. Ein Aliquot von beiden markierten Antikörpern zeigt Radioaktivitätsspiegel, die ausreichend sind, adäquate Empfindlichkeit zu erlauben.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Art, den K1 monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, umfaßt Immunisieren einer Maus beispielsweise mit Perjodat behandelten Humaneierstockkarzinomzellen und anschließendes Isolieren der Milzzellen der Maus, welche reaktiv mit den immunisierenden Eierstockkrebszellen sind. Derartige reaktive Milzzellen werden dann mit AG8 Mausmyelomzellen fusioniert, um Hybridome oder Klone zu erzeugen. Klone werden dann basierend auf ihrer Fähigkeit, mit den immunisierenden Zellen zu reagieren, ausgewählt. Ein sekundäres Screeningverfahren kann dann durchgeführt werden, bei dem die Klone Eierstocktumoren und normalen Geweben ausgesetzt werden. In dem vorliegenden Fall sollten die Klone hoch reaktiv mit den Karzinomen und nicht reaktiv mit normalen Humangeweben sein. Antikörper kann dann aus den Klonen durch Ascitesproduktion in Mäusen oder durch Ernten von Kulturüberständen der Klone erhalten werden. Der Antikörper kann dann gereinigt werden.
  • Um die potentielle Geeignetheit des Antikörpers im Hinblick auf Krebsbehandlung und Diagnose zu bestimmen, muß man die Lage (n) und Verteilung des Epitops, welches mit dem Antikörper reagiert, festlegen. Normale Humangewebe und Tumore wie auch normale zynomologe Affengewebe können für diesen Zweck verwendet werden.
  • Die Verteilung der Reaktivität oder Lage des Epitops, welches mit dem K1 Antikörper reaktiv ist, ist in der Tabelle I im nachfolgenden dargestellt. Insbesondere legt Tabelle I fest, daß das K1-reaktive Epitop in der Serosa in den Mesothelzellen des Peritoneums, Pericardiums und der Pleura wie auch in einer begrenzten Verteilung in dem Trachealepithelium, Tonsillenepithelium und Epithelium des Eileiters vorhanden ist.
  • TABELLE I IMMUNHISTOCHEMISCHE LOKALISIERUNG VON K1 UND OC125 IN NORMALEN HUMAN- UND AFFENGEWEBEN TABELLE 1 FORTSETZUNG
  • Um diese Ergebnisse zu erhalten, wurde immunhistochemische Analyse auf Kryostatabschnitten von frisch gefrorenen Geweben, welche in Aceton nachfixiert und mit primären Antikörpern bei 10 ug/ml, ausgenommen, wenn angegeben, inkubiert waren, durchgeführt. Markieren wurde dann unter Verwenden von affinitätsgereinigtem, an Meerettichperoxidase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus IgG durchgeführt, unter Verwenden von Diaminobenzidin entwickelt, anschließend mit Hematoxylin, gefolgt von Osmiumtetroxid behandelt. (- = keine Lokalisierung; + = mäßig: ++ stark)(x/y) = X Beispiele dieses Musters gesehen in Y untersuchten Proben)(het = heterogen)
  • Die Reaktivität von K1 kann auch mit derjenigen von OC125, einem zuvor beschriebenen Antikörper, verglichen werden (Bast et al., J. Clin. Invest. 68: 1331 (1981). In Affenluftröhren beispielsweise reagiert der K1 Antikörper selektiver als OC125 mit den weniger differenzierten Basalepithelzellen. Andere Unterschide zwischen den zwei Antikörpern können auch im Hinblick auf den Bronchus und das Endometrium beobachtet werden. Es sollte auch bemerkt werden, daß K1 stark mit Mesothel reagiert.
  • Das Vorhandensein von Antigenepitopen, die mit K1 oder OC125 reaktiv sind, bedeutet, daß, wenn diese Antikörper bei der Immuntherapie verwendet werden, diese normalen Gewebestellen einem Risiko unterliegen könnten. Jedoch schlägt die Apikallage derartiger reaktiver Stellen in intakten Epitheln vor, daß diese Stellen dem Blutstrom, welcher indirekt die Basaloberflächen dieser gleichen Zellen badet, im Vergleich zu Tumorstellen nicht so zugänglich sein würden. Das Differential mit K1 gegen OC125 schlägt auch einen großen chemischen Unterschied in der Natur der Epitope und vielleicht molekularen Spezies, die mit diesen Antikörpern reaktiv sind, vor.
  • Um weiter die Eigenschaft des monoklonalen K1 Antikörpers und deshalb seine potentielle Geeignetheit als ein Diagnostikum und Therapeutikum zu bestimmen, können unterschiedliche Krebszelllinien in Bezug auf Reaktivität mit K1 untersucht werden (siehe Tabelle II im nachfolgenden). Beispielsweise ist festgelegt worden, daß verschiedene Zelllinien, die von Eierstock-, Zervix- und Magentumoren abstammen, das K1 Epitop exprimieren. Diese Zelllinien umfassen beispielsweise OVCAR-2, OVCAR-3, OVCAR-4, 1847, HTB77, HeLa S3, KB, AGS und HTB103 (d. h. Kato III). Jedoch reagieren einige dieser Zelllinien (beispielsweise 1847, AGS, Kato III) nicht mit OC125.
  • Die Reaktion von K1 mit einigen Zellen, die nicht das OC125 Antigen exprimieren, und die Expression des OC125 Antigens auf einigen Zellen, die nicht das K1 Antigen exprimieren, schlägt vor, daß die zwei Antigene vollständig unterschiedliche Moleküle darstellen könnten neben dem Darstellen von unterschiedlichen Epitopen. Die Existenz von Zelllinien, die homogene Reaktion mit K1 zeigen, schlägt vor, daß einige Tumore in vivo auch eine homogene Reaktion mit diesem Antikörper zeigen können. Eine homogene Reaktion mit allen Zellen in einem Tumor würde ein großer Vorteil für den Erfolg von Immuntherapie sein, welches eher jede Zelle in einem Tumor als gerade eine Unterpopulation von Tumorzellen töten könnte. TABELLE II IMMUNFLUORESZENZLOKALISIERUNG VON K1 UND OC125 AUF KULTIVIERTEN HUMANZELLLINIEN
  • Het = heterogen; (-) = negativ; (+ = schwach positiv; ++ = mäßig: +++ = stark; ++++ = sehr stark).
  • Tumore können auch in Bezug auf die Expression der K1 und OC125 Reaktivität und somit in Bezug auf das Vorhandensein von Antigenen und genauer Epitopen, welche mit diesen zwei Antikörpern reagieren (siehe Tabellen III und IU unten), untersucht werden. K1 reagiert beispielsweise mit vielen Eierstockkrebsen und verschiedenen anderen Krebsen wie beispielsweise Karzinomen der Speiseröhre und Cervix. Somit geben diese Ergebnisse auch an, daß K1 und OC125 Epitope erkennen, die in unterschiedlichen Zellen und bei unterschiedlichen Spiegeln in verschiedenen Tumoren exprimiert werden; somit sind die zwei Epitope, die von diesen Antikörpern erkannt werden, wahrscheinlich nicht die gleichen. TABELLE III REAKTIVITÄT VON HUMANTUMOREN MIT K1 UND OC125 ZAHLEN VON TUMOREN. DIE LOKALISIERUNG VON ENTWEDER K1 ODER OC125 ZEIGEN ANDERE UNTERSUCHTE TUMOREN
  • In einigen Tumoren wurde ein einzelnes Muster in > 95% der Zellen gesehen, aber es war wegen der beschränkten Konservierung in Kryostatabschnitten nicht möglich, einen geringen %Satz von Zellen auszuschließen, der eine unterschiedliche Intensität zeigen könnte. TABELLE IV VERGLEICH DES PROZENTSATZES UND DER INTENSITÄT VON REAKTIVEN ZELLEN IN EINZELNEN TUMOREN FÜR K1 UND OC125 ANNÄHERNDER PROZENTSATZ VON ZELLEN IN JEDER INTENSITÄTSKATEGORIE
  • In einigen Tumoren wurde ein einzelnes Muster in > 95% der Zellen gesehen, aber wegen der begrenzten Konservierung in Kryostatabschnitten war es nicht möglich, einen kleinen %Satz an Zellen auszuschließen, der eine unterschiedliche Intensität zeigen könnte.
  • Weiterhin, wie durch die Ergebnisse unter Verwenden von Immunfluoreszenz, dargestellt in Tabelle U unten, gezeigt, kreuzkonkurrieren die K1 und OC125 reaktiven Epitope nicht um die Reaktivität mit dem "anderen" Antikörper. Zusätzlich, wie in Tabellen VI und VII (unten) gezeigt, kreuzkonkurrieren die zwei Antikörper nicht um das Binden an Zellen. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß K1 und OC125 gänzlich unterschiedliche Epitope erkennen. Tabelle v IMMUNFLUORESZENZNACHWEIS DES WETTBEWERBS DES BINDENS ZWISCHEN K1 UND OC125
  • Lebende OUCAR-3 Zellen wurden bei 4ºC mit Rhodamin-markierten direkten Konjugaten von K1 oder OC125 Antikörper bei 10 ug/ml allein inkubiert oder im Anschluß an 45 minütige Präinkubation als Coinkubation mit nicht markierten K1 oder OC125 Antikörper bei 25 ug/ml. TABELLE VI RADIOAKTIVMARKIERTER-ANTIKÖRPER-WETTBEWERBS-MICROTITERPLATTEN-ASSAY AUF ZELLEN
  • An Mikrotiterplatten angefügte OVCAR-3 Zellen wurden mit oder ohne verschiedene Konzentrationen von Konkurrentenantikörpern inkubiert, dann mit ¹²&sup5;J-markiertem K1 Antikörper inkubiert, gewaschen und gezählt. Beachte, daß der K1 Antikörper in Bezug auf '251-K1 Binden konkurriert, wohingegen der OC125 Antikörper das nicht tut. TABELLE VII ELISA ASSAY DES WETTBEWERBS IION LEBENDZELLBINDEN ZWISCHEN K1 UND OC125
  • OVCAR-3 Zellen in Mikrotiterplatten wurden mit verschiedenen Konzentrationen von nicht markierten Konkurrentenantikörpern inkubiert, dann wurde kovalent an PE (Pseudomonas exotoxin) gekoppelter K1 Antikörper hinzugefügt. Nach Waschen wurde das PE Hapten nachgewiesen, wobei Kaninchen-Anti-PE-Antikörper verwendet wurde, gefolgt von Ziegen- Anti-Kaninchen IgG, konjugiert an Meerettichperoxidase. Die Platte wurde dann unter Verwenden von ABTS Substratlösung entwickelt, und die optische Dichte wurde als ein Prozentsatz der Inhibierung von maximalem Binden pro Vertiefung berechnet. Beachte, daß K1 in Bezug auf das Binden von K1-PE an Zellen konkurriert, wohingegen OC125 das nicht tut.
  • Ferner, unähnlich zu OC125, reagiert K1 nicht gut mit dem Antigen, das in das Medium von kultivierten Eierstockkarzinomzellen (OVCAR-3) verbreitet ist (Tabelle VIII unten, Fig. 1). Somit erscheint das K1-reaktive Antigen nicht in das Kulturmedium von OVCAR-3 Zellen verbreitet zu sein. Ähnliche Ergebnisse wurden in Assays von Serenproben von Patienten mit Eierstockkrebs festgestellt (Fig. 1). Somit bedeuten diese Ergebnisse, daß K1-reaktives Antigen nicht von Eierstockkrebszellen verbreitet wird, und macht K1 zu einem sehr viel besseren Kandidatenantikörper für die Verwendung bei der Immuntherapie als OC125. Es sollte auch beachtet werden, daß gereinigtes CA125 Antigen nicht mit Kl reagiert. CA125 ist das Standardantigen, welches mit OC125 reagiert. TABELLE VIII RADIOAKTIVMARKIERTER-ANTIKÖRPER. ASSAY VON KULTURÜBERSTAND
  • Nicht markierter Antikörper (entweder K1 oder OC125) wurde an Mikrotitervertiefungen gefügt. Unabhängige ELISA Assays unter Verwenden von Anti-Maus IgG-Peroxidase bestätigten, daß die gleichen Mengen der zwei Antikörper an die Ver tiefungen gefügt waren. OVCAR-3 Kulturüberstand wurde dann bei verschiedenen Verdünnungen zu diesen Vertiefungen gegeben, inkubiert, gewaschen, und anschließend wurde ¹²&sup5;J-markierter OC125 Antikörper hinzugefügt, inkubiert und gewaschen. Die Radioaktivität in jeder Vertiefung wurde dann gemessen. Beachte, daß (CA125) Antigen in dem Kulturüberstand an den OC125 Antikörper auf der Platte bindet, und dieses wird mit dem radioaktiv markierten OC125 Antikörper nachgewiesen, wohingegen an die Platte gefügter K1 Antikörper nicht irgendein Antigen von dem Überstand bindet, das durch anschließende Inkubation mit markiertem OC125 nachgewiesen werden kann.
  • Zusätzlich zeigen quantitative enzymgebundene (ELISA) Immunsorbensassays von K1 und OC125 Binden an OVCAR-3 Zellen, angefügt an Mikrotiterplatten, daß die Zugabe von K1 und OC125 zusammen ein Signal erzeugt, das größer als der Wert von jedem Antikörper allein über einen breiten Konzentrationsbereich (1-50 pg/ml) (Tabelle IX unten) ist. Diese Tatsache schlägt vor, daß die Epitope physisch ausreichend genug getrennt sind, so daß beide Epitope unabhängig gleichzeitig besetzt werden können. TABELLE IX ELISA ASSAY VON ADDITIVBINDEN SOWOHL VON K1 WIE AUCH OC125 OPTISCHE DICHTE/VERTIEFUNG · 10²
  • OVCAR-3 Zellen werden in Mikrotitervertiefungen gepflanzt, dann mit entweder K1, OC125 oder einer Kombination von beiden bei den gleichen gezeigten individuellen Antikörperkonzentrationen inkubiert. Die Menge von an Zellen gebundenem Mausantikörper wurde dann bestimmt, indem mit Ziegen-Anti-Maus-IgG-Peroxidase inkubiert wurde, und die Peroxidase wurde unter Verwenden von ABTS Substrat nachgewiesen. Die dargestellten optischen Dichten wurden bei 405 nm gemessen und wurden auf den linearen Nachweisbereich für dieses System eingestellt. Beachte, daß die quantitative Menge von pro Zelle gebundenem Antikörper mit erwarteten Werten übereinstimmt, wenn beide Antikörper vollständig physisch getrennte Stellen binden.
  • Somit zeigen die Ergebnisse der Tabellen V-IX, daß K1 mit einem Epitop reagiert, das vollständig unterschiedlich und physisch getrennt von dem OC125 Epitop ist.
  • Ferner zeigen die Unterschiede in dem reaktiven Antigen zwischen K1 und OC125, daß trotz der Ähnlichkeit bei ihrer Expression in normalen Geweben und einigen Tumoren die zwei Antigene zwei gänzlich unterschiedliche Moleküle darstellen können, welche unterschiedliche Verwendbarkeit bei der Immuntherapie haben würden. CA125 eignet sich aufgrund seiner Eigenschaft, in die Seren von Patienten verbreitet zu sein, für serumdiagnostische Zwecke, aber diese gleiche Eigenschaft macht es wegen der Neutralisation von therapeutischen Antikörperkonjugaten durch dieses zirkulierende Antigen für Immuntherapie weniger geeignet. K1 stellt deshalb einen sehr viel besseren Kandidaten für Immuntherapie dar, weil sein reaktives Antigen mit der Tumorzelle assoziiert bleibt, und ermöglicht Zielen auf die lebende Zelle, was selektives Zelltöten durch ein Immuntoxin vermitteln könnte. Wenn die zwei Antigene auf vollständig unterschiedlichen Molekülen angeordnet sind, dann kann K1 der Isolierung des Gens mehr zugänglich sein, welches für Antigenexpression verantworlich ist, was einen neuen Satz von potentiell geeigneten Reagenzien ergibt.
  • Vorherige Versuche bei der Isolierung des Gens für das CA125 Antigen sind nicht erfolgreich gewesen, möglicherweise deshalb, weil das antigene Epitop, welches reaktiv mit dem OC125 Antikörper ist, eine große Menge von Carbohydrat als Te il seiner Struktur hat. Derartige Carbohydratzusätze würden in bakteriellen Systemen fehlen, die versendet werden müßten, das für CA125 Expression verantwortliche Gen zu isolieren. Das für K1 Antigen verantwortliche Gen muß nicht zusätzliche Carbohydrat- oder andere Post- Translationsmodifikationen, die in bakteriellen Expressionssystemen fehlen, benötigen, und somit kann der K1 Antikörper geeignet für die Isolierung des Strukturgens für das K1-reaktive Antigen sein. Die Expression eines derartigen Gens könnte die Herstellung von reinem Antigen, die Isolierung monoklonaler Antikörper zweiter Generation zu unterschiedlichen Epitopen auf dem Antigenmolekül und die Verfügbarkeit von Reagenzien für genetisches Screenen für dieses Antigengen in den unterschiedlichen Tumorproben erlauben.
  • Andere Ergebnisse, die die Eigenschaften des K1 Epitops untersuchen, haben gezeigt, daß es von Zellen durch Trypsinbehandlung entfernt werden kann. Perjodatbehandlung von Zellen reduziert die Reaktivität mit OC125, erhöht aber leicht Reaktivität mit K1. Proteinimmunblots von Zellextrakten. OYCAR Kulturüberständen und gereinigtem CA125 Antigen zeigen einen Hochmolekulargewichtsfleck (> 200 kDaltons) auf SDS-Gelblots, der mit OC125 reagiert, aber diese gleiche Region zeigt keine Reaktion mit K1. Somit ist es noch nicht klar, was die genaue chemische Natur des K1 Antigens ist. Jedoch ist die chemische Natur oder Struktur des K1 Antigens deutlich unterschiedlich von CA125.
  • Im Hinblick auf die vorangegangene Diskussion ist es klar, daß K1 geeignet bei der Behandlung und Diagnose von verschiedenen Krebsarten sein wird. Der monoklonale K1 Antikörper erkennt ein Epitop, das auf der Oberfläche einer signifikanten Zahl von gewöhnlichen Humaneierstock-, Cervix- und Speiseröhrentumoren beispielsweise exprimiert wird. Ferner scheint die einzige bedeutsame normale Gewebereaktivität dieses Antikörpers mit dem Mesothel der Serosaoberflächen des Peritoneums, der Pleura und dem Pericardium zu sein. Dieses schlägt vor, daß toxische Nebenwirkungen der Immuntherapie unter Verwenden von K1 relativ gering sein können. Ferner können diese Stellen bei vorklinischem Testen wegen der Kreuzreaktivität dieses Antikörpers mit normalen Affengeweben untersucht werden.
  • Genauer ausgedrückt. K1 kann als Zielmechanismus für gerichtete Krebstherapie bei der Konstruktion immuntherapeutischer Mittel einschließlich, aber nicht darauf beschränkt. Konjugaten von K1 mit Toxinen, Radionukliden oder chemotherapeutischen Arzneimitteln verwendet werden. Genetische Manipulationen der Antikörperstruktur können auch durchgeführt werden, einschließlich Ändern der konstanten Regionen des Antikörpers zu konstanten Humanregionen oder konstanten Regionen anderer Spezies. Somit könnten die immuntherapeutischen Konjugate deshalb entweder die natürliche Form des Antikörpers oder die genetisch geänderte Form davon enthalten. Zusätzlich können Fusionsproteine unter Verwenden von klonierten variablen Regionsgenen für den K1 Antikörper verwendet werden.
  • Substitution der konstanten Human IgG Regionen in dem K1 Mausantikörpergen beispielsweise würde einen chimären Human-Maus-Antikörper erzeugen, der geeigneter beim Vermitteln des antikörpergerichteten Zelltötens bei menschlichen Patienten mit einem intakten Immunsystem sein würde, eine potentiell weniger toxische Form der Immuntherapie im Vergleich zu Immuntoxinen. In Bakteriensystemen erzeugte Fusionsproteine würden weniger teuer in großen Mengen herzustellen sein.
  • K1 kann auch als ein Zielmechanismus für immundiagnostische Assays so wie beispielsweise Darstellen von Tumormassen unter Verwenden von radioaktiven Darstellungstechniken verwendet werden. Zusätzlich könnte sich die Expression des mit K1 reaktiven Antigens geeignet als ein diagnostisches Mittel bei der Immunhistopathologie für die Diagnose von Tumorursprüngen und Gewebeverteilungen von Metastasen erweisen. Genauer ausgedrückt, immunhistochemische pathologische Diagnose kann in oder unter Verwenden von Gewebeabschnitten (beispielsweise Biopsien) oder zytologischen Präparationen (beispielsweise Pap Abstriche, Eierstockkrebsergüsse, etc.) gemacht werden. Andere Diagnoseanwendungen könnten Lokalisieren von Tumoren unter Verwenden von radioaktivem Markieren des K1 Antikörpers auf einem makroskopischen Maßstab zum Zeitpunkt der chirurgischen Erforschung einschließen.
  • Die vorliegende Erfindung kann durch die Verwendung der folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulicht werden.
    • BEISPIEL I HERSTELLUNG DES K1 ANTIKÖRPERS
  • Die Humantumorzelllinien OVCAR-2, 3. 4 und 5. KB, AGS. MCF-7, HT-29, MDA-MB-469, DU145, HTB20 und HTB33 sind zuvor beschrieben worden (Hey et al., American Type Culture Collection Catalog of Cell Lines and Hybridomas, 6th Ed. (1988)). Mäuse wurden gegenüber normalen Humannierenmembranen tolerant gemacht (Matthew et al.. J. Immunol. Methods. 100: 73-82 (1987)). Sie wurden dann mit OVCAR-3 Zellen immunisiert (Willingham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2474-78 (1987)). Die kultivierten Zellen wurden jedoch mit Perjodat behandelt. Diese Perjodatbehandlung wurde durchgeführt, Anti-Maus IgG an die Oberfläche dieser Zellen in einer Strategie zu binden. Zielen von immunisierenden Antigenen an Mausantikörper tragende Lymphozyten zu verbessern. Milzen von immunisierten Mäusen wurden entfernt, und die suspendierten Milzzellen wurden im Hinblick auf ihre Reaktivität gegenüber OVCAR-3 Zellen vor Fusion mittels eines Panningverfahrens ausgewählt. Die ausgewählten Milzzellen wurden mit AG8 Mausmyelomzellen fusioniert, und die sich ergebenden Klone wurden zwei Wochen später unter Verwenden der ScreenFast-(Life Technologies. Ind., Gaithersburg, MD)Screenkammer von großem Umfang gescreent, wobei Rhodaminindirektimmunfluoreszenz auf lebenden OVCAR-3 Zellen verwendet wurde. Ausgewählte Klone wurden sekundär gescreent, wobei Peroxidaseimmunhistochemie auf Kryostatabschnitten von Humantumoren und normalen Geweben verwendet wurde. Ein Klon K1 wurde ausgewählt, der mit Eierstockzystadenkarzinomen reagierte, aber nicht mit normaler Leber. Niere, Kolon. Dünndarm, Knochenmark. Cerebellum. Lunge, Herz oder Großhirnrinde reagierte. Dieser Klon war ursprünglich ein IgM Antikörperklon, der in eine IgG Variante im Anschluß an Subklonieren unter Verwenden eines Panning-Isotypen-Schaltverfahrens (Chang et al. (bei Herstellung)) umgewandelt wurde.
  • Nach Wiederklonieren wurde der sich ergebende Isotyp des K1 Hybridoms als Maus IgG1k bestimmt. Antikörper wurde aus dem IgG Klon unter Verwenden von entweder Ascitesproduktion in Mäusen oder Ernten von Kulturüberständen hergestellt und gereinigt. wobei eine Protein A FPLC Affinitätssäule verwendet wurde.
    • BEISPIEL II VERWENDUNG VON PEROXIDASEIMMUNHISTOCHEMIE, UM DIE VERTEILUNG DES MIT OEM K1 ANTIKÖRPER REAKTIVEN EPITOPS ZU ZEIGEN
  • Proben von frisch gefrorenen normalen Human- und normalen zynomologen Affengeweben wie auch Humantumorproben wurden kryostatgeschnitten, auf Glasdeckstreifen montiert und im Hinblick auf Peroxidaseimmunhistochemie, wie zuvor beschrieben.
  • (Willingham, FOCUS 12: 62-67 (1990))bearbeitet, wobei K1 als der primäre Antikörper verwendet wurde. Die Lokalisierung des reaktiven Antigens in verschiedenen Geweben wurde nachgewiesen. wobei die Peroxidasesubstratreaktion mit Diaminobenzidin verwendet wurde. Dieses Beispiel zeigte die Lokalisierung von reaktivem Antigen in dem Linienmesothelium (lining mesothelium) des Peritoneums, der Pleura und des Pericardiums sowohl in Humanwie auch Affengeweben. Reaktives Antigen wurde auch in geringeren Mengen in den Epithelien der Luftröhre. Tonsille und des Eileiters gefunden. In Humantumorproben wurde Reaktion mit K1 in Tumoren gefunden, die von Eierstock. Speiseröhre und Cervix abstammen, und zu einem geringeren Ausmaß in Tumoren, die von Brust und Kolon abstammen.
    • BEISPIEL III UNTERSUCHUNG VON UNTERSCHIEDLICHEN KREBSZELLLINIEN IN BEZUG AUF REAKTIVITÄT MIT DEM K1 ANTIKÖRPER UNTER VERWENDEN VON IMMUNFLUORESZENZ
  • Kulltivierte lebende Humantumorzelllinien wurden frei von Kulturmedium gewaschen und bei 4ºC mit monoklonalem Antikörper K1 (1 ug/ml) in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung inkubiert. Nach Waschen wurde der gebundene Antikörper durch Inkubieren von Zellen in rhodamin-konjugiertem Ziegen-Antimaus IgG Antikörper nachgewiesen, anschließend in Formaldehyd fixiert und unter Verwenden eines Epifluoreszenzmikroskops, wie zuvor beschrieben (Willingham, FOCUS 12: 62-67 (1990)), betrachtet. Zellen, die starke Reaktivität mit K1 Antikörper zeigen, umfaßten beispielsweise KB. HeLa S3, OVCAR- 3. AGS, Kato III und 1847 Zellen.
    • BEISPIEL IV DIREKTE KONKURRENZASSAYS IN BEZUG AUF K1 EPITOP REAKTIVITÄT
  • Lebende OVCAR-3 Zellen wurden bei 4ºC mit rhodamin-markierten direkten Konjugaten des Antikörpers K1 oder Antikörpers OC125 (10 pg/ml) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von überschüssigem nicht markiertem Konkurrenz K1 oder OC125 Antikörper (25 pg/ml) inkubiert, wobei die gleichen Zellen mit dem gleichen nicht markierten Konkurrenzantikörper vor dieser Inkubation vorinkubiert worden waren. Nach dieser Stufe wurden die Zellen gewaschen, in Formaldehyd fixiert und unter Verwenden von Epifluoreszenzmikroskopie betrachtet. K1-Rhodamin zeigte starkes Markieren in der Abwesenheit von Konkurrenzantikörper oder in der Anwesenheit von OC125 als ein Konkurrent, aber kein Markieren, als K1 als ein Konkurrent verwendet wurde. Umgekehrt zeigte OC125 starkes Markieren in der Abwesenheit von Konkurrent oder in der Anwesenheit von überschüssigem K1 Konkurrentantikörper, aber kein Markieren, als OC125 als ein Konkurrent verwendet wurde. Dieses Ergebnis zeigt ein Beispiel des Fehlens von Kreuzreaktivität zwischen den OC125 und K1 Epitopen. International Application No: PCt/

Claims (15)

1. Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der spezifisch für ein Zelloberflächenantigen ist, welches auf normalem Primatengewebe, malignen kultivierten Humanzelllinien und Humantumoren exprimiert wird, und welches nicht in Kulturmedien oder Plasma verbreitet wird, wobei der durch das Hybridom erzeugte monoklonale Antikörper die Bindungseigenschaften eines monokonalen Antikörpers hat, der durch die Hybridomzelllinie ATCC HB 10570 erzeugt wurde.
2. Durch ein Hybridom ausgeschiedener monoklonaler Antikörper der Klasse IgG, wobei der Antikörper spezifisch für ein Zelloberflächenantigen ist, welches auf normalem Primatengewebe, malignen kultivierten Humanzelllinien und Humantumoren exprimiert wird, und welches nicht in Kulturmedien oder Plasma verbreitet wird, wobei der monoklonale Antikörper die Bindungseigenschaften eines monoklonalen Antikörpers hat, der durch die Hybridomzelllinie ATCC HB 10570 erzeugt wurde.
3. Hybridom nach Anspruch 1, wobei die kultivierte maligne Humanzelllinie ausgewählt ist aus OVCAR-2, OVCAR-3, OVCAR-4, 1847, HTB77, HeLa S3, KB, AGS und HTB103.
4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei die maligne kultivierte Humanzelllinie ausgewählt ist aus OVCAR-2, OVCAR-3, OVCAR-4, 1847. HTB77, HeLa S3, KB, AGS und HTB103.
5. Hybridom nach Anspruch 1 oder 3, wobei der Humantumor von einem Ovarialkarzinom einem Ösophaguskarzinom oder einem Zervixkarzinom abstammt.
6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2 oder 4, wobei der Humantumor von einem Ovarialkarzinom, einem Ösophaguskarzinom oder einem Zervixkarzinom abstammt.
7. Hybridom nach Anspruch 1. 3 oder 5, wobei das normale Primatengewebe Mesothel ist.
8. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, 4 oder 6, wobei das normale Primatengewebe Mesothel ist.
9. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei der Antikörper K1 ist, wobei der monoklonale Antikörper durch eine Hybridomzelllinie mit einer Hinterlegungsnummer ATCC HB 10570 ausgeschieden ist.
10. Konjugat, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 2, 4, 6, 8 oder 9, konjugiert an ein Toxin, Radionuklid oder chemotherapeutisches Arzneimittel.
11. Konjugat nach Anspruch 10, für die Verwendung bei der Behandlung von Krebs.
12. Konjugat nach Anspruch 10, für die Venrwendung bei der Behandlung von Ovarialkrebs.
13. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 2, 4, 6, 8 oder 9, vorzugsweise radiomarkiert, für die Verwendung bei der Diagnose von Krebs.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise für die Behandlung von Krebs, umfassend ein Konjugat nach Anspruch 10, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger dafür.
15. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 10, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.
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