DE60034330T2

DE60034330T2 - Monoklonaler antikörper gegen menschliche nierenkarzinomzellen

Info

Publication number: DE60034330T2
Application number: DE60034330T
Authority: DE
Inventors: Francois Hirsch; Eric Angevin
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: EP1175227B1; FR2793497B1; WO2000067792A1; AU4415100A; DK1175227T3; IL146396A; CA2373631A1; DE60034330D1; US7074613B1; WO2000067792A9; CY1107060T1; ATE359091T1; ES2284493T3; EP1175227A1; IL146396A0; PT1175227E; AU781426B2; FR2793497A1; JP2002543811A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper produziert, welcher spezifisch gegen ein Antigen eines humanen hypernephroiden Nierenkarzinoms („renal cell carcinoma", RCC) gerichtet ist; die Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung von diesem monoklonalen Antikörper insbesondere für die Diagnose, Bildgebung und Behandlung der RCC.
Die RCC sind in den disseminierten Formen besonders schwierig zu diagnostizierende Krebserkrankungen (Oberling et al. (1960) Nature 186, 402-403; Holthafer et al. (1983) Lab. Invest. 49, 319-326), die jedes Jahr etwa 5% der neuen Fälle von Krebserkrankungen ausmachen. Außer dem chirurgischen Eingriff in erster Linie gibt es gegenwärtig keinerlei wirksame Behandlung im Falle eines Rezidivs.
Ein monoklonaler Antikörper (mAb), welcher für ein Antigen spezifisch ist, das überwiegend einzig auf den Zellen eines humanen Nierenkarzinoms vorkommt, wäre für die Diagnostik, die Lokalisierung und die Behandlung von dieser Erkrankung extrem nützlich. In der Literatur ist über eine begrenzte Anzahl von mAks, die gegen die humanen RCC gerichtet sind, berichtet worden (Oosterwijk, E., et al. (1986) Int. J. Cancer 38: 489-494; Kinouchi, T., et al. (1995) J. Urol. 154: 288-292; Kaufmann, O., et al. (1997) Histopathology 31: 31-37) oder sie haben den Gegenstand von Patenten oder von Patentanmeldungen ( EP 119 528 , EP 160 250 , EP 210 970 , WO 88/08854, WO 90/14595) gebildet.
Unter den gegenwärtig verfügbaren Antikörpern hat beispielsweise der Antikörper G250 nicht die Qualitäten, die für die Diagnostik, die Bildgebung und/oder die Therapie benötigt werden. So erkennt der Antikörper G250 (WO 88/08854, Erfinder Oosterwijk, E., und Warnaar, S.O.), der am besten untersuchte und am häufigsten verwendete der mAks, die gegen die RCC gerichtet sind, da er ja in zwei klinischen Immunradiolokalisierungsstudien von ursprünglichen oder metastasierten Tumoren eingesetzt worden ist (Oosterwijk, E., et al. (1993) J. Clin. Oncol. 11: 738-750; Steffens, M.G., et al. (1997) J. Clin. Oncol. 15: 1529-1537), lediglich 70 bis 80% der Tumore. Indessen wurde bis zum heutigen Tag keinerlei therapeutische Wirkung mit dem Antikörper G250 erzielt. Eine andere Limitierung für die Ausnutzung dieses Antikörpers liegt in der Tatsache, dass die humanen Tumoren, die das G250-Antigen exprimieren, sich bei der Maus lediglich sehr schwierig entwickeln können, was die Herstellung eines guten Tiermodells für das in vivo-Targeting über den mAk G250 schwierig macht.
Diese Ergebnisse unterstreichen folglich die Notwendigkeit, andere monoklonale Antikörper zu erhalten, die für ein Antigen spezifisch sind, das unterschiedlich ist und hochspezifisch die RCC erkennt, ohne eine substantielle Reaktivität mit den normalen Zellen aufzuweisen.
Die Erfinder haben die Technik der Hybridome, die ursprünglich von Köhler und Milstein entwickelt worden ist (Nature (1975) 256: 495-497) eingesetzt, um ein neues Hybridom zu erhalten, welches einen neuen monoklonalen Antikörper produziert, welcher hochspezifisch für die humanen Nierenkarzinome ist und ein spezifisches Antigen, das von dem G250-Antigen verschieden ist, erkennt. Die Erfindung hat folglich ein als 5C5 bezeichnetes Hybridom, wie es bei der CNCM unter der Nummer I-2184 hinterlegt worden ist, welches durch die Fusion von Zellen einer Sp2O-Balb/C-Mäuse-Myelomlinie und von Zellen von inguinalen und abdominalen Ganglions von Balb/C-Mäusen, die vorab mit der humanen Nierenkarzinomlinie BIZ immunisiert worden sind, gebildet worden ist, zum Gegenstand.
Die Erfindung betrifft gleichfalls einen als 5C5 bezeichneten monoklonalen Antikörper, der für den Hauptteil der Zellen von humanen Nierenkarzinomen spezifisch ist, der sich nicht an das Antigen G250 bindet und durch das Hybridom der Erfindung erhalten werden kann. Der so hergestellte monoklonale Antikörper ist isoliert, dann charakterisiert worden. Die Unterklasse und der Isotyp des monoklonalen Antikörpers wurden durch die Immunpräzipitationstechnik von Ouchterlony, die gegen Unterklassen von Immunglobulinen von der Maus gerichtete Kaninchen-Antikörper einsetzt, bestimmt.
Die Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 5C5 der Erfindung erfolgte an RCC-Zelllinien wie auch an Gewebefragmenten von an RCC leidenden Patienten. Die Analyse des Vorhandenseins des Antigens von Nierenkarzinomzellen, das spezifisch durch den Antikörper der Erfindung erkannt wird, kann durch immunhistochemische Techniken, welche beispielsweise Peroxidase-Färbungen einsetzen, oder durch Immumfluoreszenztechniken ausgeführt werden. Gemäß einem Standardprotokoll werden die Platten, auf welche die mittels des Kryostat erhaltenen gefrorenen Schnitte der nicht-fixierten Biopsieproben gelegt werden, an der Luft getrocknet, dann mit dem monoklonalen Antikörper 5C5 in einer feuchten Kammer bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Platten werden dann mit einem Antikörper-Präparat, welches gegen den Antikörper oder das Antikörperfragment der Erfindung gerichtet ist, bedeckt. Wenn beispielsweise der monoklonale Antikörper 5C5 eingesetzt wird, kann der zweite Antikörper ein Anti-Maus-Antikörper sein. Der zweite Antikörper kann mit einer fluoreszierenden Verbindung (Fluorescein, Texas-red, DAPI) markiert sein. Die Natur der Markierung der Probe wie auch ihre Intensität werden dann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops bestimmt. In Immunfluoreszenzexperimenten ist der erfindungsgemäße Antikörper dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment sich auf spezifische Weise an ein Antigen bindet, welches gleichermaßen bei den Zellen der humanen Nierenkarzinomlinien BIZ, HIEG, QUIE, BENA, PIUZ, GUIL, GUER, ROB, DURI, JOUS, GUIS, LEFR, MEGR, BLAN, DOBS, MOJ vorkommt; der monoklonale Antikörper 5C5 bindet sich nicht an ein Antigen von Zellen der humanen Nierenkarzinomlinie LAWR und bindet nicht an das G250-Antigen.
Die große Reaktionsspezifität des Antikörpers 5C5 wurde durch das Fehlen einer Reaktivität des Antikörpers gegenüber Zellen von anderen humanen Tumorlinien als den RCC-Zelllinien gezeigt. So bindet sich der monoklonale Antikörper 5C5 nicht an ein Antigen von Zellen der humanen Colontumorlinien: HRT18, HTL8R, LS174T, SW48, SW620, bindet sich nicht an ein Antigen von Zellen der humanen Lungentumorlinie: LX2, bindet sich nicht an ein Antigen von Zellen der humanen Magentumorlinie: Kato, bindet sich nicht an ein Antigen von Zellen der humanen Brusttumorlinien: McF7 und ZR75, bindet sich nicht an ein Antigen von Zellen der humanen Ovarialtumorlinie: OVCAR. Bezüglich der Reaktivität des Antikörpers gegenüber den normalen Zellen haben Immunhistochemieexperimente eine Markierung des monoklonalen Antikörpers 5C5 im Zytoplasma der proximalen Nierentubuli wie auch in dem apikalen Pol und den Seitenflächen der Colonepithelzellen, welche von normalen humanen Gewebefragmenten stammten, nachgewiesen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls den einzelkettigen Antikörper, der ausgehend von dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper hergestellt worden ist, den chimären Antikörper, der ausgehend von dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper hergestellt worden ist, und gleichfalls den humanisierten Antikörper, der ausgehend von dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper hergestellt worden ist.
Der Antikörper oder das Antikörperfragment, der bzw. das gegen das Antigen eines Karzinoms von humanen Nierenzellen (humanes hypernephroides Nierenkarzinom) gerichtet ist, kann verabreicht werden, um eine anti-idiotypische oder anti-antiidiotypische Immunantwort hervorzurufen. Ein anti-idiotypischer Antikörper, der gegen den Antikörper, welcher mit einem Antigen eines Karzinoms von humanen Nierenzellen reagiert, gerichtet ist, kann tatsächlich Epitope exprimieren, die ähnlich zu jenen des Antigen sind, und kann so in ähnlicher Weise für die Immunisierung eingesetzt werden und so, um eine gegen die Krebserkrankung gerichtete Immunantwort zu entwickeln. Ein anti-antiidiotypischer Antikörper kann auf ähnliche Weisen wie jene, die für den primären anti-Tumor-Antikörper der Erfindung beschrieben worden sind, eingesetzt werden. Folglich liegt es gleichfalls im Umfang der Erfindung, einen anti-idiotypischen Antikörper einzusetzen, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er gegen den erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet ist, und einen anti-antiidiotypischen Antikörper einzusetzen, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er gegen den vorangegangenen anti-idiotypischen Antikörper gerichtet ist.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Fragment des erfindungsgemäßen Antikörpers, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es anstelle des vollständigen Antikörpers eingesetzt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsweise ist dieses Antikörperfragment ein F(ab')2-Fragment, ein Fab'-Fragment oder ein Fv-Fragment.
Eine andere Ausführungsweise der Erfindung betrifft ein Mittel zur Diagnose eines Karzinoms von humanen Nierenzellen oder eines humanen hypernephroiden Nierenkarzinoms, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß der Erfindung, wie zuvor beschrieben, umfasst. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist das Mittel zur Diagnose dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment direkt oder indirekt durch einen Marker, welcher ein Signal erzeugt, markiert ist; dieser Marker wird unter den radioaktiven Isotopen und den nicht-isotopischen Entitäten ausgewählt. Die nicht-isotopischen Entitäten werden unter den Enzymen, den Färbemitteln, den Haptenen, den lumineszierenden Mitteln, wie den radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden Mitteln, den Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin, ausgewählt.
Gemäß einer Ausführungsweise ist das erfindungsgemäße Mittel zur Diagnose dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment direkt oder indirekt durch das Zwischenglied eines Spacer-Arms an einen festen Träger gekoppelt ist. Das Mittel zur Diagnose der Erfindung kann in einem Verfahren zur Diagnose der humanen RCC in vitro eingesetzt werden, welches das Inkontaktbringen einer Probe von Körperfluid und/oder von Körpergewebe, welche von einem Patienten stammt, bei welchem man das Vorliegen einer Krebserkrankung vermutet, mit einem Mittel zur Diagnose, wie zuvor beschrieben, und die Bestimmung des Vorhandenseins eines Antigens oder eines anti-idiotypischen Antikörpers oder eines Antikörpers gemäß der Erfindung umfasst. Die Erfindung betrifft gleichfalls einen diagnostischen Kit, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er das zuvor beschriebene Mittel zur Diagnose enthält.
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine Zusammensetzung für den Nachweis, die Lokalisierung und die Bildgebung eines Karzinoms von Nierenzellen, umfassend einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß der Erfindung; die Vorteile der Verwendung von F(ab)- oder F(ab)2'-Antikörperfragmenten für den Nachweis, die Lokalisierung und die Bildgebung wurden von Goldenberg, D.M. (U.S.-Patent 4 331 647) beschrieben. Der Antikörper oder das Antikörperfragment gemäß der Erfindung ist direkt oder indirekt mit einem Marker, welcher ein Signal erzeugt, welcher unter den radioaktiven Isotopen und den nicht-isotopischen Entitäten ausgewählt wird, markiert. Die Radioisotope, welche Röntgenstrahlen, γ-Strahlen, Positronen und Fluoreszenz aussenden, sind für die Markierung der Mittel zur Diagnose gemäß der Erfindung am besten geeignet; als Radioisotope, die für die Markierung des Mittels zur Diagnose einsetzbar sind, kann man folglich aufführen: Iod¹²³, Iod¹²⁵, Iod¹²⁶, Iod¹³¹, Iod¹³³, Brom⁷⁷, Technetium^99m, Indium¹¹¹, Indium^113m, Gallium⁶⁷, Gallium⁶⁸, Ruthenium⁹⁵, Ruthenium⁹⁷, Ruthenium¹⁰³, Ruthenium¹⁰⁵, Quecksilber¹⁰⁷, Quecksilber²⁰³, Rhenium^99m, Rhenium¹⁰¹, Rhenium¹⁰⁵, Scandium⁴⁷, Tellur^121m, Tellur^122m, Tellur^125m, Thulium¹⁶⁵, Thulium¹⁶⁷, Thulium¹⁶⁸, Kupfer⁶⁷, Fluor¹⁸, Yttrium⁹⁰, Yttrium¹⁹⁹, Palladium¹⁰⁰, Bismuth²¹⁷, Antimon²¹¹. Es existieren verschiedene Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, um Radioisotope an Proteine entweder direkt oder über ein chelatbildendes Mittel, wie DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), anzuheften. Alle diese Verfahren können eingesetzt werden, um die Antikörper oder Antikörperfragmente der Erfindung zu markieren. Der monoklonale Antikörper kann beispielsweise mit Na[I¹²⁵] durch die Chloramin T-Methode markiert werden [Hunter, W.M., und Greenwood, F.C. (1962) Nature 194: 495]. Der Antikörper oder das Antikörperfragment kann direkt durch Technetium^99m durch die Technik von Crockford und Koll. (U.S.-Patent 4 424 200) markiert oder über DTPA angeheftet werden, wie von Hnatowich (U.S.-Patent 4 479 930) beschrieben. Die nicht-isotopischen Entitäten werden unter den Enzymen, den Färbemitteln, den Haptenen, den lumineszierenden Mitteln, wie den radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden Mitteln, den Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin, ausgewählt.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zum Nachweis, zur Lokalisierung und zur Bildgebung eines Nierenzellkarzinoms, welches die folgenden Schritte umfasst: (i) parenterale Injektion eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments gemäß der Erfindung oder einer Zusammensetzung, wie oben beschrieben, bei einem Menschen; (ii) Anhäufung des markierten Antikörpers oder des markierten Antikörperfragments nach einer ausreichenden Zeitspanne im Bereich der Stelle des Nierenzellkarzinoms, ohne dass sich der Antikörper oder das Antikörperfragment auf substantielle Weise an die normalen Zellen bindet; und (iii) Nachweis des Signals mittels eines Signaldetektors, dann (iv) Umwandlung des detektierten Signals in ein Bild des Nierenzellkarzinoms. Im Rahmen einer Markierung mit einem Radioisotop ist der eingesetzte Signaldetektor vorzugsweise eine herkömmliche Ausrüstung, wie eine γ-Kamera.
Die Erfindung umfasst gleichfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche für die Behandlung des humanen Nierenkarzinoms bestimmt ist, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Der pharmazeutisch annehmbare Träger kann eine jegliche Art von Träger sein, welche gewöhnlich bei der Herstellung von injizierbaren Zusammensetzungen eingesetzt wird, d.h. ein Verdünnungsmittel, ein Suspendierungsmittel, wie eine isotonische oder gepufferte Kochsalzlösung. Der Antikörper und/oder das Antikörperfragment gemäß der Erfindung können als Arzneimittel eingesetzt werden; gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise werden der Antikörper und/oder das Antikörperfragment gemäß der Erfindung als Arzneimittel für die Behandlung des Karzinoms von humanen Nierenzellen eingesetzt; dafür werden der Antikörper oder das Antikörperfragment der pharmazeutischen Zusammensetzung mit wenigstens einem Mittel, welches aus der Gruppe der antiproliferativen, antineoplastischen oder zytotoxischen Mittel ausgewählt wird, konjugiert. Diese Mittel sind Radioisotope oder nicht-isotopische Entitäten.
In einer bevorzugten Ausführungsweise ist das nicht-isotopische (keine Isotopen enthaltende) antiproliferative und/oder antineoplastische und/oder zytotoxische Mittel ein Nukleinsäuremolekül. Dieses Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, einzelsträngige RNA, doppelsträngige RNA, ein DNA/RNA-Hybrid sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist das Nukleinsäuremolekül doppelsträngige DNA oder einzelsträngige RNA, welche ein Proteinprodukt von Interesse kodiert, das in der Zelle wirksam exprimiert wird. Die Proteinprodukte von Interesse werden in einer Gruppe, welche aus Interleukinen, Zytokinen, Lymphokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren, Killerproteinen, Proteinen, die erlauben, die Chemoresistenz aufzuheben, und Restriktionsenzymen gebildet wird, ausgewählt; die Interleukine, Zytokine, Lymphokine und Chemokine werden ausgewählt in einer Gruppe, welche vorzugsweise aus den Interleukinen II-1, II-2, II-3, II-4, II-5, II-6, II-7, II-8, II-9, II-10, II-11, II-12, II-13, II-14, II-15, II-16, II-17 und II-18, den Interferonen α-IFN, β-IFN und γ-IFN gebildet wird; das Proteinprodukt von Interesse ist vorzugsweise Interleukin 2.
Gemäß einer anderen Ausführungsweise der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül eine Antisense-RNA.
Die Konjugation des Antikörpers oder Antikörperfragments der Erfindung mit einem antiproliferativen, antineoplastischen oder zytotoxischen Mittel, wie oben beschrieben, kann im Rahmen einer Gentherapie eingesetzt werden. Gemäß einer anderen Ausführungsweise kann die Konjugation des Antikörpers oder des Antikörperfragments der Erfindung mit einem antiproliferativen, antineoplastischen und zytotoxischen Mittel eingesetzt werden, um die Entwicklung der RCC anzuhalten und um eine Regression und/oder eine Eliminierung der Tumormasse zu induzieren. Der so konjugierte Antikörper oder das so konjugierte Antikörperfragment wird in den an RCC leidenden Patienten bevorzugt eingeführt und an die Tumorstellen abgegeben auf oralem oder parenteralem Wege in einer pharmazeutisch annehmbaren Transportflüssigkeit, wie einer physiologischen Salzlösung. Alternativ kann eine Lösung oder eine Suspension von mit einem Mittel konjugiertem Antikörper oder Antikörperfragment direkt in das bösartige Epithelgewebe perfundiert werden, wobei diese Methode vorzugsweise in dem Falle eingesetzt wird, wo das RCC noch keine Metastasen gebildet hat.
Die bevorzugten Radioisotope, die mit den für die Therapie eingesetzten monoklonalen Antikörpern konjugiert werden, sind Radioisotope, welche γ-Strahlen aussenden, und vorzugsweise Iod¹³¹, Yttrium⁹⁰, Gold¹⁹⁹, Palladium¹⁰⁰, Kupfer⁶⁷, Bismut²¹⁷ und Antimon²¹¹. Die Radioisotope, welche β- und α-Strahlen aussenden, können gleichfalls für die Therapie verwendet werden. Die nicht-isotopischen Entitäten, die mit den für die Therapie eingesetzten monoklonalen Antikörpern konjugiert werden, sind zahlreich und vielgestaltig; man kann (i) die Antimetabolite, wie die Anti-Folat-Mittel, Methotrexat, (ii) die Analoga der Purine und der Pyrimidine (Mercaptopurin, Fluoruracil, 5-Azacytidin), (iii) die Antibiotika, (iv) die Lectine (Ricin, Abrin) und (iv) die bakterielle Toxine (Diphtherietoxin) aufführen.
Der Antikörper oder das Antikörperfragment gemäß der Erfindung wird gleichfalls als Targeting-Mittel eingesetzt. Er bzw. es erlaubt so, zytotoxische Zellen, wie die humanen T-Zellen, die Monozyten oder die NK-Zellen, an den Ort des metastasierten oder nicht metastasierten Tumors zu dirigieren. Die zytotoxischen Zellen können an den Antikörper über den Fc- Rezeptor, welcher sich an der Oberfläche dieser Zellen befindet, oder beispielsweise über einen intermediären Antikörper, welcher eine doppelte Spezifität aufweist, gebunden werden; solche bispezifischen Antikörper für das Targeting der Nierenzellkarzinome können hergestellt werden, indem eine Immunzelle, welche den Antikörper der Erfindung produziert, oder das Hybridom der Erfindung mit einer Zelle, welche einen Antikörper, welcher gegen die zielgerichtet anzusteuernde zytotoxische Zelle gerichtet ist, produziert, fusioniert wird. Bispezifische Antikörper können gleichfalls durch chemische Kopplung von zwei Antikörpern mit der gewünschten Spezifität hergestellt werden. Der Antikörper oder das Antikörperfragment gemäß der Erfindung erlaubt gleichfalls, Abgabevehikel von antiproliferativen, antineoplastischen oder zytotoxischen Mitteln zielgerichtet an den Ort des metastasierten oder nicht metastasierten Tumors zu dirigieren. Mit Abgabevehikel sollen die Liposome und die viralen Partikel bezeichnet werden.
Schließlich kann gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsweise der anti-idiotypische Antikörper gemäß der Erfindung eingesetzt werden für die Bereitstellung einer prophylaktischen Behandlung, welche für die Behandlung des humanen Karzinoms bestimmt ist. Da der anti-idiotypische Antikörper spezifisch durch den Antikörper oder das Antikörperfragment gemäß der Erfindung erkannt wird, können diese tatsächlich für die Immunisierung eingesetzt werden, um in dem Organismus eine anti-Krebs-Immunantwort hervorzurufen.
LEGENDE DER FIGUREN
1: Typisierung der RCC-Zelllinien in indirekter Immunfluoreszenz durch Durchflusszytometrie. 1A: Typisierung der Linien PIUZ und LAWR; 1B: Typisierung der Linien DOBS und GUIL.
2: Nachweis der Internalisierung des Antikörpers 5C5 in eine RCC-Linie.
Die ROB-Nierenkarzinomzellen wurden mit mit Fluorescein (FITC) konjugiertem 5C5 (A, C, E) und mit mit Texas-red konjugiertem Transferrin (TRIC) (B, D, F) inkubiert. Bei 4°C markiert 5C5 die Zelloberfläche (A). Nach 10 min (C, D) und 30 min (E, F) Internalisierung sind 5C5 (C, E) und Transferrin (D, F) internalisiert und sind teilweise in der perinukleären Region, wo das Kompartiment für die späte Transferrin-Rezyklierung lokalisiert ist, coverteilt.
3: Produktion von Interleukin 2 (II-2) von der Maus durch ROB-Zellen nach Transfektion.
4: Expression der β-Galactosidase in den RCC in vivo nach intravenöser Antifection eines 5C5-Benzochinon-DNA-Konjugats.
Ein Nierenkarzinomtumor (HIEG) wurde unter die Haut von bestrahlten Nacktmäusen transplantiert. Die Mäuse erhielten als zweites auf intravenösem Wege komplementäre DNA, welche bakterielle β-Galactosidase allein kodierte, (Kontrolle) oder die gleiche DNA konjugiert mit 5C5 über eine Kopplung, an welcher Benzochinon beteiligt war. Die Produktion von β-Galactosidase wurde durch eine Immunfluoreszenzmarkierung mit Hilfe eines biotinylierten Antikörpers, der gegen die β-Galactosidase gerichtet war (Labor Sigma), nachgewiesen, dann mit Hilfe von Streptavidin-FITC (b-Gal) sichtbar gemacht. Die Kerne der Zellen des Tumors werden mit Hilfe von DAPI sichtbar gemacht und die Zellen werden durch Phasenkontrast (C-Phase) nachgewiesen. Die β-Galactosidase wird in den Tumorzellen lediglich dann nachgewiesen, wenn die Mäuse die mit 5C5 konjugierte DNA erhalten haben.
5: Expression der β-Galactosidase in den RCC in vivo nach intravenöser Antifection eines 5C5-Avidin-Polylysin-Toxin-DNA-Konjugats.
Ein Nierenkarzinomtumor (HIEG) wurde unter die Haut von bestrahlten Nacktmäusen transplantiert. Die Mäuse erhielten als zweites auf intravenösem Wege komplementäre DNA, welche bakterielle β-Galactosidase allein kodierte, (Kontrolle) oder die gleiche DNA konjugiert mit einem Avidin-Polylysin-Komplex (über Benzochinon), an welchen biotinyliertes 5C5 gebunden ist (mAkAv-PI), oder den gleichen Komplex, welcher zusätzlich biotinyliertes bakterielles Hämagglutinin-Toxin umfasst, was erlaubt, die Effizienz des Gentransfers zu erhöhen (id + Tox). Die Produktion von β-Galactosidase wurde durch eine Immunfluoreszenzmarkierung mit Hilfe eines biotinylierten Antikörpers, der gegen die β-Galactosidase gerichtet war (Labor Sigma), bestimmt, dann mit Hilfe von Streptavidin-FITC (β-Galactosidase) sichtbar gemacht. Die Zellen werden durch Phasenkontrast (Phasenkontrast) nachgewiesen. Die β-Galactosidase wird in den Tumorzellen lediglich dann nachgewiesen, wenn die Mäuse die mit 5C5 konjugierte DNA erhalten haben.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der nachfolgenden Beispiele ersichtlich.
BEISPIELE
1. Protokoll der Herstellung des Hybridoms 5C5
Zwei Balb/C-Mäuse haben eine intraplantare Injektion von 4,5 × 10⁶ Zellen des humanen Nierenkarzinoms BIZ, welche von Dr. Jean Gogusev (Hopital Necker-Enfants Malades, Paris, Frankreich) bereitgestellt worden sind, in 100 μl 0,9% NaCl erhalten.
Achtzehn Tage später erfolgt eine Wiederholung mit 5 × 10⁶ Zellen des humanen Nierenkarzinoms BIZ, in 50 μl 0,9% NaCl. Drei Tage später wird eine Zellsuspension ausgehend von inguinalen und abdominalen Ganglions der Mäuse hergestellt.
23 × 10⁶ Zellen der Zellsuspension werden mit 11,5 × 10⁶ Zellen des Balb/C-Maus-Myeloms Sp2O in Gegenwart von PEG4000 fusioniert. Die Zellmischung wird dann in drei Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, die zwei Tage zuvor mit peritonealen Zellen von der Maus gefüllt worden waren, um lediglich die hybriden Zellen zu selektieren, die in der Lage waren, sich zu entwickeln.
Eine erste Analyse durch Durchflusszytometrie an BIZ-Zellen hat positive Ergebnisse für den Klon 5C5 ergeben.
Eine zweite Analyse hat erlaubt, dieses positive Ergebnis zu bestätigen. So konnten Ampullen mit nicht-kloniertem 5C5 eingefroren werden.
Eine Grenzwert-Verdünnung ausgehend von einer aufgetauten Ampulle des Klons 5C5 hat erlaubt, nach einer durchflusszytometrischen Analyse an BIZ-Zellen einen 5C5-Subklon zu erhalten. Das 5C5-Hybridom konnte so eingefroren werden. Die Bestimmung der Klasse und der Unterklasse des monoklonalen Antikörpers 5C5 erfolgte mit Hilfe von spezifischen Immunseren vom Kaninchen gemäß der Technik von Ouchterlony im Laboratoire d'Immunologie Expérimentale (Mitarbeit Professor H. BAZIN).
Der monoklonale Antikörper 5C5 gehört zu der Klasse der Immunglobuline IgG1k.
2. Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 5C5:
2.1. An den RCC
Siebzehn Linien von humanen RCC wurden in indirekter Immunfluoreszenz durch Durchflusszytometrie mit Hilfe des mAk 5C5 entweder ausgehend von Kulturüberständen oder ausgehend von einem an einer Protein A-Sepharose^®-Säule immungereinigten mAk getestet. Die 17 humanen RCC-Linien, die getestet wurden, sind die folgenden: BIZ, HIEG, QUIE, BENA, PIUZ, GUIL, GUER, ROB, DURI, JOUS, GUIS, LEFR, MEGR, BLAN, DOBS, MOJ, LAWR. Nur LAWR wird durch den monoklonalen Antikörper 5C5 nicht erkannt (1).
Eine parallele Untersuchung, die in Gegenwart des Antikörpers G250 an der Gesamtheit dieser Tumore ausgeführt worden ist, hat gezeigt, dass die Linien BIZ und HIEG den Antikörper G250 nicht exprimieren, wohingegen die Linien ROB und QUIE diesen exprimieren (Ergebnisse nicht gezeigt).
2. An anderen Linien
Der monoklonale Antikörper 5C5 wurde an verschiedenen humanen Tumorlinien durch indirekte Immunfluoreszenz mittels Mikroskopie getestet (Zusammenarbeit mit Doktor J. LEPENDU, INSERM U 419, NANTES, FRANKREICH). Die getesteten Linien sind die folgenden: HRT18, HLT8R, LS174T, SW48 und SW620, die von Colontumoren abgeleitet sind, LX2, welche von einem Lungentumor abgeleitet ist, KATO, welche von Magenkrebs abgeleitet ist, MCF7 und ZR75, die von Brustkrebs abgeleitet sind, und OVCAR, welche von einem Ovarialtumor abgeleitet ist. Alle indirekten Immunfluoreszenzexperimente an diesen humanen Tumorlinien unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 5C5 haben ein negatives Ergebnis ergeben (Ergebnisse nicht gezeigt).
3. Verwendung des monoklonalen Antikörpers 5C5 im Rahmen einer Gentherapie in vitro:
Die Immunfluoreszenzexperimente haben gezeigt, dass der monoklonale Antikörper 5C5 sich perfekt in die RCC internalisiert (2). Dieses positive Ergebnis bildet eine unabdingba re Voraussetzung für eine vektorielle Strategie, wie die Antifection [Poncet et al. (1996) Gene Ther. 3: 731-738].
Die Antifectionsexperimente haben erlaubt, zu zeigen, dass der monoklonale Antikörper 5C5 in der Lage ist, als Träger ein Gen, welches Interleukin-2 von der Maus (II-2) kodiert, in die Zellen zu transportieren; das II-2-Gen von der Maus, das so mittels Träger transportiert worden ist, wird transkribiert und exprimiert, wie dies das Vorhandensein von II-2 in den Kulturüberständen belegt (3).
4. Verwendung des mAk 5C5 im Rahmen einer Gentherapie in vivo
Diese Experimente wurden in Zusammenarbeit mit E. Angevin (I.G.R.) ausgeführt.
4.1. 1. Experiment
Nacktmäuse, die vorab bestrahlt worden waren, haben ein Transplantat eines HIEG-Tumors in subkutaner Position erhalten. Wenn die Tumore eine Größe von ungefähr 10 × 10 mm erreichen, werden die Mäuse in drei Gruppen aufgeteilt:

– 1 naive Mäuse
– 2 Mäuse haben auf intravenösem retroorbitalem Wege eine Injektion einer Mischung von 10 μg mAk 5C5, gekoppelt mit 100 μg Plasmid, welches die β-Galactosidase kodiert, über das Zwischenglied von Benzochinon, gemäß der zuvor beschriebenen Technik [Poncet et al. (1996) Gene Ther. 3: 731-738] erhalten.

Wohingegen durch histochemische Analyse keinerlei enzymatische Aktivität in dem Tumor der naiven Maus gefunden wurde, zeigen 2 Mäuse von den 3, die das Konjugat erhalten hatten, ein ausgeprägtes positives Ergebnis (4). Eine umfassendere Untersuchung, die sich auf die Untersuchung von enzymatischer Aktivität bezog, hat bei den 2 positiven Mäuse deren Fehlen in den anderen getesteten Organen und eine bedeutende Positivität in der Leber der negatien Maus gezeigt.
4.2. 2. Experiment
Nacktmäuse, die vorab bestrahlt worden waren, haben ein Transplantat eines HIEG-Tumors in subkutaner Position erhalten. Der vorab biotinylierte monoklonale Antikörper 5C5 wird mit einem mehrere Komponenten umfassenden Komplex, DNA=Poly-L-Iysine=Benzochinon=Biotin, über ein Avidinmolekül gekoppelt. Schließlich wird ein biotinyliertes Molekül von Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa hinzugefügt. Durch das Messen der Expression der β-Galactosidase in den Tumoren wird eine Reporteraktivität untersucht. Eine starke β-Galactosidaseaktivität wurde in der Gruppe von Mäusen, die das vollständige Konjugat erhalten haben, nachgewiesen (5).
REFERENZEN

Holthafer et al. (1983) Lab. Invest. 49, 319-326.
Hunter W.M. et Greenwood F.C. (1962) Nature 194: 495.
Kaufmann O. et al. (1997) Histopathology 31: 31-37.
Kinouchi T. et al. (1995) J. Urol. 154: 288-292.
Köhler et Milstein Nature (1975) 256: 495-497.
Oberling et al. (1960) Nature 186, 402-403.
Oosterwijk E. et et al. (1993) J. Clin. Oncol. 11: 738-754.
Oosterwijk E et al. (1986) Int. J. Cancer 38: 489-494.
Poncet et al. (1996) Gene Therapy 3: 731-738.
Sieffens M. G. et al. (1997) J. Clin. Oncol. 15: 1529-1537.

Claims

Als 5C5 bezeichnetes Hybridom, wie es bei der CNCM unter der Nr. I-2184 hinterlegt worden ist, welches durch die Fusion von Zellen einer Balb/C Sp20-Mäuse-Myelomlinie und von Zellen von inguinalen und abdominalen Ganglions von Balb/C-Mäusen, die vorab mit der humanen Nierenkarzinomlinie BIZ immunisiert worden sind, gebildet wird.
Monoklonaler 5C5-Antikörper, der für den Hauptteil der Zellen von humanen Nierenkarzinomen spezifisch ist, der sich nicht an das Antigen G250 bindet und durch das Hybridom des Anspruchs 1 erhalten werden kann.
Einzelkettiger Antikörper, welcher ausgehend von dem monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 hergestellt wird.
Chimärer Antikörper, der ausgehend von dem Antikörper nach Anspruch 2 oder 3 hergestellt wird.
Humanisierter Antikörper, der ausgehend von dem Antikörper nach Anspruch 2 oder 3 hergestellt wird.
Anti-idiotypischer Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen den Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 5 gerichtet ist.
Anti-anti-idiotypischer Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er gegen den anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 6 gerichtet ist.
Fragment eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass er die Spezifität des Antikörpers bewahrt.
Fragment nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein F(ab')2-Fragment, ein Fab'-Fragment oder ein Fv-Fragment handelt.
Mittel zur Diagnose eines Karzinoms von humanen Nierenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 7 oder ein Fragment eines Antikörpers nach den Ansprüche 8 und 9 umfasst.
Mittel zur Diagnose nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment direkt oder indirekt durch einen Marker, welcher ein Signal erzeugt, markiert ist.
Mittel zur Diagnose nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker unter den radioaktiven Isotopen und den nicht-isotopischen Entitäten ausgewählt wird.
Mittel zur Diagnose nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht-isotopischen Entitäten unter den Enzymen, den Färbemitteln, den Haptenen, den lumineszierenden Mitteln, wie den radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden Mitteln, den Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin, ausgewählt werden.
Mittel zur Diagnose nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment direkt oder indirekt durch das Zwischenglied eines Spacer-Arms an einen festen Träger gekoppelt ist.
In vitro-Verfahren zur Diagnose des humanen Nierenkarzinoms, umfassend: – (i) das Inkontaktbringen einer Probe von Körperfluid und/oder von Körpergewebe, welches von einem Patienten stammt, bei welchem man das Vorliegen einer Krebserkrankung vermutet, mit einem Mittel zur Diagnose nach einem der Ansprüche 10 bis 14; und – (ii) die Bestimmung des Vorhandenseins eines Antigens von Zellen eines humanen Nierenkarzinoms, welches durch einen Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder 7 oder durch eines von dessen Fragmenten nach den Ansprüchen 8 und 9 erkannt werden kann, oder eines anti-idiotypischen Antikörpers nach Anspruch 6 oder des Vorhandenseins eines Antikörpers nach den Ansprüchen 2 bis 5 oder 7.
Diagnostischer Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Mittel zur Diagnose nach einem der Ansprüche 10 bis 14 enthält.
Zusammensetzung für den Nachweis, die Lokalisierung und die Bildgebung eines Karzinoms von Nierenzellen, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder 7 oder ein Antikörperfragment nach den Ansprüchen 8 oder 9 derart, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment direkt oder indirekt mit einem Marker, welcher ein Signal erzeugt, markiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker, welcher ein Signal erzeugt, unter den radioaktiven Isotopen und den nicht-isotopischen Entitäten ausgewählt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die radioaktiven Isotope insbesondere aus der aus Iod¹²³, Iod¹²⁵, Iod¹³¹, Indium¹¹¹, Ruthenium⁹⁷, Kupfer⁶⁷ oder Technetium^99m bestehenden Gruppe ausgewählt werden und dass die nicht-isotopischen Entitäten unter den Enzymen, den Färbemitteln, den Haptenen, den lumineszierenden Mitteln, wie den radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden Mitteln, den Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxigenin, ausgewählt werden.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder 7 oder eines Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 8 oder 9 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 19 für die Herstellung einer Zusammensetzung, die für den Nachweis, die Lokalisierung und die Bildgebung eines Karzinoms von Nierenzellen bestimmt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche für die Behandlung des humanen Nierenkarzinoms bestimmt ist, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 2 bis 7 oder von einem Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 8 bis 9 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 7 und/oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 8 bis 9 als Arzneimittel.
Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 7 und/oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 8 bis 9 als Arzneimittel für die Behandlung des humanen Nierenzellkarzinoms.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment mit wenigstens einem Mittel, welches aus der Gruppe der antiproliferativen, antineoplastischen oder zytotoxischen Mittel ausgewählt wird, konjugiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ein radioaktives Isotop ist, welches aus der Gruppe: Iod¹³¹, Yttrium⁹⁰, Gold¹⁹⁹, Palladium¹⁰⁰, Kupfer⁶⁷, Bismut²¹⁷ und Antimon²¹¹ ausgewählt wird.
Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder 7 oder Antikörperfragment nach Anspruch 8 oder 9 als Targeting-Mittel.
Verwendung eines anti-idiotypischen Antikörpers nach Anspruch 6 für die Herstellung einer prophylaktischen Zusammensetzung, welche für die Behandlung von Karzinomen beim Menschen bestimmt ist.