FI111267B - Tie-reseptoria tunnistavat vasta-aineet ja niiden käyttö - Google Patents

Description

111267 TIE-RESEPTORIA TUNNISTAVAT VASTA-AINEET JA NIIDEN KÄYTTÖ

Keksintö koskee yleisesti vasta-aineita, jotka reagoivat Tie-tyrosiinikinaasireseptorin kanssa, joka löytyy erilaisissa endoteelisoluissa ja joissakin tuumorisolupolulaatioissa. Lisäksi esillä oleva keksintö koskee 5 menetelmiä tämänkaltaisten vasta-aineiden tuottamiseksi ja näiden käyttöä. Erityisesti esillä oleva keksintö koskee anti-Tie monoklonaalisia vasta-aineita diagnostisina välineinä eräiden hematopoieettisten solujen ja hematologisten ja angiogeneettisten tautien tunnistamiseksi, sekä verisuonten kuvantamiseksi ja terapeuttisena aineena.

10 TEKNIIKAN TAUSTA

Kardiovaskulaariset taudit ja syöpä ovat hyvin tavallisia läntisissä maissa, ja nämä tautiryhmät ovat taloudellisesti tärkeitä, koska näitä tauteja sairastavat potilaat ovat yleensä työkyvyttömiä ja tarvitsevat hoitoa pitkinä ajanjaksoina. Verisuonilla on tärkeä rooli kardiovaskulaaristen tautien 15 kehittymisessä, kuten myös syövän patogeneesissä. Verisuonitautien kehittymisessä verisuonten sisäpintojen endoteelisoiut ovat keskeisessä asemassa. Traumat ja endoteelisolujen metaboliset häiriöt aiheuttavat ns. ateromaplakkeja ja lopuksi arterioskleroosia. Tuumorisolujen kasvutekijöiden kautta endoteelisolujen stimulaatiolla indusoima verisuonien 20 uudismuodostus, neovaskularisaatio, on tärkeä tekijä erilaisissa syövissä. Kokeellisten tutkimusten kautta tiedetään, että jotta solut voisivat kehittyä ja kasvattaa syöpäpesäkkeitä, ne tarvitsevat neovaskularisaatiota ravinteiden ja hapen saannin varmistamiseksi kasvavaan kudokseen.

Erilaistuneiden solujen ja kudosten kehityksestä, ylläpidosta ja 25 korjauksesta vastaava solukäyttäytyminen säädellään pääosin solunvälisillä signaaleilla kasvutekijöiden ja vastaavien ligandien ja niiden reseptoreiden avulla. Reseptorit sijaitsevat vastaanottavan solun pinnalla ja ne sitovat peptidi- tai polypeptidikasvutekijöitä ja muita hormoninkaltaisia ligandeja. Tämän interaktion tuloksena vastaanottavassa solussa tapahtuu nopeita 30 biokemiallisia muutoksia, jotka johtaavat sekä nopeaan että pitkäaikaiseen solun geeniekspression säätelyyn. Erilaisten solupintojen monet reseptorit voivat sitoa spesifisiä kasvutekijöitä.

2 111267

Tyrosiinin fosforylaatio muodostaa erään avainmuodon plasmamembraanien signaalinvälityksessä. Tällä hetkellä tunnetaan useita polypeptidikasvutekijöiden ja -hormonien transmembraanisia reseptoreita koodittavia tyrosiinikinaasigeenejä, kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF), 5 insuliini, insuliininkaltainen kasvutekijä, (IGF-I), verihiutalekasvutekijät (PDGF-AA, AB ja BB) ja fibroblastikasvutekijöitä (FGFs). Katso esim. Heidin ja Westermark, Cell Reg., 1:555-556 (1990); Ullrich ja Schlessinger, Cell, 61:2243-354, (1990). Endoteelisolujen kasvutekijäreseptorit ovat erityisen kiinnostavia, johtuen kasvutekijöiden kuten FGF:n mahdollisesta liittymisestä ίο useisiin fysiologisesti ja patologisesti tärkeisiin tapahtumiin: angiogeneesiin, arterioskleroosiin ja tulehduksellisiin tauteihin (Folkman ja Klagsbrun,

Science, 235:442-447, 1987). Useiden hematopoieettisten kasvutekijöiden reseptorit ovat myös tyrosiinikinaaseja. Näihin lukeutuvat pesäkestimuloivan tekijän 1 reseptori j(Sherr et ai., Cell, 41:665-676, 1985) ja c-kit, 15 kantasolutekijäreseptori (Huang et ai., Cell, 63:225-233, 1990).

Reseptorityrosiinikinaasit voidaan jakaa kehitysbiologisesti alaperheisiin rakenteellisten yhtäläisyyksiensä ja eroavaisuuksiensa perusteella. Nämä proteiinit eroavat toisistaan spesifisyytensä ja affiniteettinsä suhteen (Ullrich and Schlessinger, supra). Yleisesti ottaen, 20 reseptorityrosiinikinaasit ovat glykoproteiineja, jotka muodostuvat solunulkoisesta osasta, joka pystyy sitomaan kasvutekijän, transmembraanisesta osasta, joka yleensä on proteiinin alfa-kierteinen osa, membraaninläheisestä osasta, joka saattaa säädellä reseptoria, esim. proteiinifosforylaation avulla, tyrosiinikinaasiosasta, joka muodostaa : 25 reseptorin entsymaattisen osan, sekä karboksiterminaalipäästä, joka monessa reseptorissa liittyy spesifisten substraatien tunnistamiseen ja sitomiseen.

Hiljattain on kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 93/14124 kuvattu uusi endoteelisolureseptorityrosiinikinaasi nimeltään Tie. Tie on akronyymi, 30 joka on johdettu sanoista Tyrosine kinase containing Immunoglobulin- and EGF-like domains (tyrosiinikinaasi jossa on immuunoglobuliini- ja EGF-kaltaisia osia). Tie on hyödyllinen endoteelisoluihin ja niiden Tie-reseptoreihin liittyvien tautien diagnostiikassa ja hoidossa, kuten tuumoriangiogeneesiin liittyvissä neoplastisissa taudeissa, haavan 35 paranemisessa, tromboembolisissa taudeissa, ateroskleroosissa ja tulehduksellisissa taudeissa.

111267 3

Keksijät ovat nyt tuottaneet monoklonaalisia vasta-aineita Tie endoteelisolureseptorityrosiinikinaasin solun ulkoista osaa vastaan. Näitä vasta-aineita on käytetty Tie:n tunnistamiseksi soluviljelmistä ja in vivo immunohistologisissa testeissä. Tulokset osoittavat, että vasta-aineita, jotka 5 spefisesti tunnistavat Tie:n solunulkoisia osia, voidaan käyttää hematopoieettisten ja endoteelisten solujen monitoroimiseksi kudosnäytteissä ja organismissa, sekä erilaisten syöpätuumoreiden diagnosoinnissa.

LYHYT SELOSTUS KUVISTA

Kuva 1 edustaa MOLT-4 ja HEL solujen analyosintia Tie:n suhteen ίο immunofluoresenssin ja flovv-sytometrian avulla.

Kuva 2 osoittaa Tie:n immunoperoksidaasivärjäystä ihmisen verisoluissa.

Kuvassa 3 esitetään 125l-leimatun monoklonaalisen vasta-aineen, 3C4C7G6, 15 jakautuminen ja sitoutuminen valikoituihin kohdekudoksiin hiiressä, jossa on 8 vuorokautinen paraneva haava.

Kuva 4. Tie:n immunohistokemiallinen värjäys aivokudoksessa: normaali, glioblastoma multiforme ja melanoman etäispesäke. Mittapylväs: 0.05 mm.

20

Kuva 5. Hemangioblastoman ja hemangioperisytoman immunohistokemiallinen värjäys käyttäen Tie, vWF tai CD44 endoteelisolu-spesifisinä markkereina (40x).

Kuva 6. Anti-TIE vasta-aineen 10F 11 jakaantumisen (%ID/g) tärkeisiin 25 elimiin 48, 72, 96 ja 120 tunnin jälkeen (N= 3, 3, 3 ja 4)

Kuva 7. Anti-TIE vasta-aineen 3c4 jakaantuminen (%ID/g) tärkeisiin elimiin 48, 72, 96 ja 120 tunnin jälkeen (N= 3, 3, 7, 2 ja 4)

Kuva 8. Radioaktiivisuuden kerääntyminen 48, 96 ja 120 tunnissa 10F11 vasta-aineella, ja 6, 24, 48, 96 ja 120 tunnissa 3c4 vasta-aineella. 1

Kuva 9. Standardikäyrä neljälle eri vasta-aineparille (kiinnitetty / leimattu vasta-aine) 111267 4

Kuva 10. Yksilölliset Tie-antigeenikonsentraatiot ^g/l) rintasyöpä- (N=2), munasarjasyöpä- (N=5) ja piensolukeuhkosyöpäpotilaiden (N=6) seeruminäytteessä. Referenssinäytteet (N=20) ovat ei-syöpäpotilaista.

KEKSINNÖN KUVAUS

5 Esillä olevan keksinnön eräässä käyttömuodossa kuvataan diagnostisia menetelmiä joilla voidaan monitoroida hematopoieettisia soluja ja endoteelisoluja kudosnäytteistä ja koko organismeista. Toisessa käyttömuodossa esillä oleva keksintö koskee kliinisiä detektiomenetelmiä, joilla kuvataan endoteelisolujen tilaa (trauma, kasvu, jne.) sekä menetelmiä io endoteelisolujen, ja siten vaskulaarisen kasvun, tunnistamiseksi organismissa. Esillä oleva keksintö koskee vasta-aineita, jotka tunnistavat Tie:n. Edullisessa käyttömuodossa keksinnön mukaiset vasta-aineet tunnistavat Tie:n solunulkoisia osia.

Toisessa edullisessa käyttömuodossa keksintö koskee 15 monoklonaalisia vasta-aineita, jotka spesifisesti tunnistavat Tie-reseptorin solunulkoisen osan eri epitooppeja. Esillä oleva keksintö koskee erityisesti monoklonaalisia vasta-aineita 3C4C7G6 ja 10F11G6. Monoklonaalisia vasta-ainetta 3C4C7G6 tuottava hybridomasolulinja on Budapestin sopimuksen mukaisesti talletettu deponointilaitokseen Deutsche Sammlung von 20 Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) (DSM deponointinumero ACC2159).

: : Tunnistettavalla merkkiaineella leimatut vasta-aineet on myös kuvattu.

Tässä käytetään käsitettä tunnistettava merkkiaine tarkoittaen mitä tahansa alan ammattimiehelle tunnettua tunnistettavaa merkkiainetta. Edullisessa 25 keksinnön mukaisessa käyttömuodossa tosin tunnistettava merkkiaine on valittu ryhmästä, johon kuuluu radioisotoopit, fluorokromit, väriaineet, entsyymit ja biotiini. Keksinnölle sopivia radioisotooppeja ovat esim. 125l ja 1311, rajoittumatta kuitenkaan vain nähin.

Esillä oleva keksintö koskee myös monoklonaalisia vasta-aineita, jotka 30 on konjugoitu kuvannettavissa olevaan aineeseen. Tässä yhteydessä käsite kuvannettavissa oleva aine kattaa radioisotoopit, rajoittumatta silti nähin. Edullinen radioisotooppi on 99m-teknetium.

111267 5

Esillä oleva keksintö koskee lisäksi menetelmää, jolla detektoidaan ja identifioidaan niitä ihmisen kudoksia, joissa tapahtuu neovaskularisaatiota, joka menetelmä koostuu vaiheista (a) otetaan kudos- ja/tai kehonestenäyte, jossa epäillään 5 neovaskularisaatiota tapahtuvan, ja (b) saatetaan tämä näyte yhteyteen Tie-spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa monoklonaalisen vasta-aineen ja antigeenin kompleksoitumiselle sopivissa olosuhteissa, ja (c) detektoidaan muodostunut kompleksi.

ίο Tämän menetelmän avulla detektoitavissa oleva kudos on normaalikudos, syövän esiaste tai kiinteä syöpätuumori, jossa on Tie-sisältäviä endoteelisoluja tai leukemiasoluja, jotka ilmentävät Tie-reseptoria. Eräässä keksinnön mukaisessa käyttömuodossa monoklonaalinen vasta-aine on leimattu tunnistettavissa olevalla merkkiaineella, kuten edellä kuvataan.

15 Keksinnön mukaiset menetelmät ovat hyödyllisiä eri syöpätyyppien detektoimisessa ja tunnistamisessa.

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää, jonka avulla voidaan diagnosoida ja seurata erityyppisten syöpätautien taudinvaihetta, määrittämällä ihmisen seerumissa kiertävää Tie-antigeeniä.

20 Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös käyttää Tie-reseptoreiden tunnistamiseksi solunäytteestä, jossa :. menetelmässä solunäyte saatetaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa yhteen ja detektoidaan monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen Tie-reseptoriin.

25 Keksinnön eräässä edullisessa käyttömuodossa monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää määrättyjen hematopoieettisten solujen, erityisesti B-solulinjan solujen, tunnistamiseksi ja seuraamiseksi.

Soluseoksen saattaminen kosketukseen keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa voi tapahtua liuoksessa, kuten 30 fluoresenssiaktivoidussa soluseulonnassa, tai se voidaan suorittaa käyttäen kiinteitä kudosnäytteitä, kuten biopsiamateriaalia, tai se voidaan suorittaa käyttäen kiinteään kantajaan sidottuja monoklonaalisia vasta-aineita, kuten 6 11126/ pylväskromatografiassa, tai suoraa immunoadherenssia. Monoklonaalisen vasta-aineen kanssa reagoiva soiuseos voi olla mikä tahansa verisoluja tai kudossoluja sisältävä liuos. Edullisesti soiuseos on peräisin nisäkkään normaalisoluista, nisäkkään luuytimestä tai verenkierrosta, tai kudoksesta jota 5 epäillään tuumoriksi, erityisesti normaalisoluista, leukemiasoluista ja kiinteistä tuumorisoluista. Kun soiuseos on saatettu yhteyteen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, ne solut joissa on Tie-reseptoreita sitoutuvat monoklonaaliseen vasta-aineeseen muodostaen vasta-aine-Tie-reseptorikompleksin. Tämän vasta-aine-Tie-reseptorikompleksin, ja siten Tie-10 reseptorin, tunnistaminen voidaan suorittaa käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä. Nämä menetelmät ovat mm. ELISA, IRMA (sandwich-tyyppinen immunokemiallinen menetelmä), immunohistokemia, 125l-leimattu RIA ja autoradiografia.

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää verisuonten 15 uudismuodostuksen kuvantamiseksi ihmispotilaalla haavan paranemisessa, tulehdustilassa tai tuumorissa. Tässä menetelmässä annetaan leimattuja vasta-aineita ja tunnistetaan kuvantamisen avulla ne kohteet, joissa esiintyy uusien suonten muodostumiseen liittyviä endoteelisoluja, tai detektoidaan leukemiasoluja veressä, luuytimessä tai kudoksessa.

20 Keksinnön mukaiset humanisoidut monoklonaaliset vasta-aineet ovat hyödyllisiä hoidettaessa neoplastisia tauteja, joihin liittyy Tie-reseptoreita omaavia endoteelisoluja, antamalla terapauttisesti tehokas määrä anti-neoplastista terapeuttista ainetta liitettynä sellaiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen tällaista tautia potevalle potilaalle. Terapeuttisesti tehokas määrä 25 terapeuttista ainetta tarkoittaa sellaista määrää aineita, joka estää tuumorin kasvua, edullisesti aiheuttaen neoplastisten solujen kuolemaa ja neoplastisten solujen kokonaismäärän laskua elimistössä. Esimerkkejä tällaisista terapeuttisista aineista ovat esim. 90Y-radioisotooppiin tai toksiinikonjugaattiin, kuten risiiniin, tai erilaisiin mikrobitoksiineihin sidotut 30 vasta-aineet

Leukemian hoitoon tarkoitetun aineen konjugointi monoklonaaliseen vasta-aineeseen voidaan suorittaa käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä, kuten esim. julkaisussa Press et ai, J. Clin.Oncol. 7:1027-1038 (1989) kuvataan. Edullisesti monoklonaalisen vasta-aineen konjugointikohta 35 sijaitsee kohdassa, joka ei ole lähellä monoklonaalisen vasta-aineen Tie- 111267 7 reseptoriin sitoutumiskohta. On myös edullista, että terapeuttisen aineen konjugointikohta on eri toiminnallinen ryhmä kuin terapeuttisen aineen aktiivikohta. Edullisemmin konjugointikohta on myös sellaisessa kohdassa että rakenteelliset muutokset monoklonaalisessa vasta-aineessa tai 5 terapeuttisessa aineessa pysyvät minimissä.

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää hoitaa neoplastisia tauteja, jossa annetaan terapeuttisesti tehokas määrä terapeuttista ainetta konjugoituna keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen sitovaan fragmenttiin, jossa on vasta-aineen spesifisen sitoutumisen aikaansaavat ίο osat. Sopivia ovat sellaiset sitovat fragmentit joiden koko ja rakenne on riittävä mahdollistaakseen Tie-reseptoriin sitoutumista. Tällaisia fragmentteja voidaan valmistaa käyttäen lukuisia menetelmiä, jotka ovat sinällään tunnettuja. Tuotetut sitoutumisfragmentit voidaan seuloa Tie-reseptoriin sitoutumiskykynsä perusteella, käyttäen Esimerkissä 5 kuvattua 15 sitoutumistestiä.

Esillä olevan keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden annolla tarkoitetaan monoklonaalista vasta-ainetta aktiivisena aineena sisältävän farmaseuttisen komposition sopivan määrän antoa. Aktiivisen aineen lisäksi farmaseuttinen kompositio voi sisältää sopivia puskureita, 20 laimennus- ja lisäaineita. Sopivia puskureita ovat mm. Tris-HCI, astaatti, glysiini ja fosfaatti, edullisesti pH:n 6.5 - 7.5 omaava fosfaattipuskuri. Sopivia laimennusaineita ovat steriilit NaCklla, laktoosilla tai mannitolilla, edullisesti NaCUla, isotonisiksi säädetyt vesiliuokset. Sopivia lisäaineita ovat albumiini tai helartiini, jotka estävät pinta-absorption, detergentit (kuten TWEEN 20™, 25 TWEEN 80™), solubilisointiaineet (esim. glyseroli, polyetyleeniglykoli), antioksidantit (esim. askorbiinihappo, natriummetabisulfiitti) ja säilöntäaineet (esim. THIMERSOL™, bentsyylialkoholi, parabeeni).

Anto voi tapahtua tavanomaisella tavalla, kuten suonensisäisesti, ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti. Suonensisäinen antotapa on edullinen.

30 Antotapa voi olla kerta-annos tai se voidaan suorittaa sopivan määräisinä jaettuina annoksina.

Edullisesti farmaseuttinen valmiste on yksikköannosmuodossa. Tällöin valmiste on jaettu yksikköannoksiin, joissa on sopiva määrä aktiivista ainetta, esim. halutun tuloksen saavuttava tehokas määrä.

111267 8

Varsinainen käytetty annos voi vaihdella riippuen potilaan tarpeista ja hoidettavan tilan vakavuudesta. Oikean annoksen määrittäminen määrätyssä tilanteessa on alan ammatti-ihmisen määritettävissä. Yleisesti hoito aloitetaan pienemmällä annoksella, annoksella joka on optimiannosta 5 pienempi. Tästä annostusta lisätään vähitellen kunnes saavutetaan tilanteeseen nähden optimaalinen teho. Käytännössä päivittäinen kokonaisannos voidaan jakaa osiin ja antaa haluttaessa joko jatkuvana tai erillisinä annoksina päivän aikana. Annoksen määrä ja antokertojen toistuvuus säädetään hoitavan lääkärin arvion mukaisesti, huomioiden io sellaiset tekijät kuten potilaan ikä, yleiskunto ja paino, sekä myös hoidettavan taudin vakavuus.

Tavanomainen esillä olevan keksinnön mukainen edullinen annostus on noin 0.1 - 10 mg vaikuttavaa ainetta vuorokaudessa.

Hiiren vasta-aineiden kehittäminen ja käyttö terapeuttisina aineina is kärsii siitä, että niiden puoliintumisaika ihmisessä on alhainen koska muodostuu ihmisen anti-hiiri-vasta-ainereaktio (HAMA). Tästä syystä hiiren vasta-aineiden teho potilailla on alhaisempi (Adair et ai., 1990). Vieraiden proteiinien toistuva anto aiheuttaa myös haitallisia sivuvaikutuksia. Monet näistä ongelmista voidaan ratkaista käyttämällä ihmisen monoklonaalisia 20 vasta-aineita. Tällä hetkellä näitä vasta-aineita voidaan tuottaa hiiren monoklonaalisista vasta-aineista käyttäen molekyylibiologisia menetelmiä, joissa hiiren vasta-aineen sitoutumisvuorovaikutuksista vastaava alue (CDR) liitetään ihmisen monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Nämä humanisoidut vasta-aineet sopivat ihmiselle annettavaan immunoterapiaan. Voidaan myös * 25 rakentaa yksiketjuisia vasta-aineita (scFv). Näiden rakentamisessa käytetään eri pituisia linkkerisekvenssejä, kuten Whitlow et ai. on kuvannut julkaisussa Protein Eng., 6(8):989-95, (1993), jolloin optimoidaan vasta-aineen sitoutuminen antigeeniin.

Kuten ylläolevasta ilmenee, esillä olevan keksinnön mukaiset vasta-30 aineet ovat hyödyllisiä tautitilojen (esim. erityyppisten syöpätautien), diagnosoinnissa ja tunnistamisessa, haavan parantumisen tunnistamisessa ja seuraamisessa, erilaisten neoplastisten tautien hoidossa ja ennaltaehkäisyssä. Muut tässä kuvatun aineen käytöt ovat alan ammatti-ihmiselle ilmeiset.

111267 9

ESIMERKIT

Seuraavat esimerkit annetaan tarkoituksena valaista esillä olevan keksinnön spesifisiä käyttömuotoja rajoittamatta sen suojapiiriä. Alan ammatti-ihminen ymmärtää täysin muiden käyttötapojen ja sovellutusten 5 ilmeisen arvon.

ESIMERKKI 1

Tie-reseptorin solunulkoisen osan tuottaminen bakuloviruksen avulla

Tie-proteiinin cDNA-sekvenssi on kuvattu julkaisussa Partanen J. et ai., Mol. Cell Biol. 12: 1698-1707, (1992), joka täten sisällytetään tähän. Solun ίο ulkoista Tie-osaa koodittava cDNA-sekvenssi monistettiin PCR-menetelmällä ja kloonattiin pVT-Bac-vektorin BamHI-kohtaan (Tessier et ai., Gene, 98:177-183, 1991) käyttäen PCR alukkeina 5'-CGTAGATCTGGCGGTGGACCTGAC-3' ja 5'-GGCCATGATCACTAGTGATGGTGATGGTGATGCTGCTGATCCAGGCC 15 CTCTTCAGC-3'.

X-tekijän pilkkoutumiskohtaa (IEGR) koodittava sekvenssi, jota seuraa kuusi perättäistä histidiinijäännöstä, liitettiin cDNAn 3'-päähän. Täten saatu vektori, pVT-Tie, transfektoitiin hyönteissoluihin Tie:n solun ulkoisen osan ilmentämiseksi.

20 pVT-Tie transfektoitiin Baculo Gold bakulovirus-DNA:n kanssa (Pharmingen Cat. 21100D) SF-9 hyönteissoluihin. Virus isolaatit puhdistettiin pesäkemenetelmällä agaroosissa transfektoitujen solujen kasvatusliemestä (TNMFH + 5%FCS) ja seulottiin rekombinanttiproteiinin parhaimman ilmentymisen suhteen High Five hyönteissoluissa (Invitrogen). Yksi isolaatti 25 (BG-3 virus) valittiin suuren skaalan proteiinituotantoon.

High Five solut infektoitiin BG-3-viruksella ja infektoitujen solujen kasvatusliemi (EX-CELL 400, HRH Scientific) otettiin talteen kahden päivän jälkeen. Rekombinantti BG-3-proteiini puhdistettiin kasvatusliemestä ConA-affiniteettikromatografian avulla.

ESIMERKKI 2 111267 1 o

Anti-Tie monoklonaalisen vasta-aineiden tuottaminen Balb/C-hiiressä

Kolmen kuukauden ikäiset Balb/C naarashiiret immunisoitiin injisoimalla intraperitoneaalisesti BG-3 (50 pg/hiiri) emulgoituna Freund 's 5 complete adjuvant- apuliuokseen. Kolmen-neljän viikon välein annettiin 50pg täydennysinjektioita ja lopullinen booster-injektio (20 pg BG-3 PBS:ssä suonensisäisesti) vielä kolmen viikon jälkeen. Hiiret lopetettiin neljän päivän kuluttua viimeisen annoksen jälkeen, ja hiiren pernan lymfoidisolut liitetiin SP 2/0 plasmasytoomasoluihin suhteessa 2:1. Fuusiosolut otettiin talteen 96-10 kuopan viljelylevylle (Nunc) Ex-Cell 320 kasvuliemessä (Seralab), jossa oli fetaalivasikanseerumia (FCS, 20%) ja HAT-supplementti (hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini, Gibco, 043-01060H, 50x laimennettuna). Solut viljeltiin +37°C:ssa, 5% C02 - ilmassa. Kymmenen päivän jälkeen HAT-supplementoitu liemi vaihdettiin HT-supplementoituun soluviljelyliemeen 15 (Gibco, 043-0106H, 50x laimennettuna). HT-kasvatusliemi oli identtinen HAT-liemeen verrattuna paitsi että aminopteriini puuttui.

Kaksi - kolme viikkoa fuusion jälkeen tarkistettiin vasta-ainetuotanto esimerkissä 5. kuvatulla antigeenispesifisellä immunofluorometrisellä menetelmällä, IFMA. Pääkloonit kloonattiin rajoittavan laimennoksen avulla 20 (Staszewski, 1984). Positiiviset kloonit laajennettiin 24-kuoppaiseen kudosviljelylevyyn (Nunc), kloonattiin uudelleen ja testattiin uudestaan samalla menetelmällä. Positiiviset kloonit testattiin vielä fluoresenssiaktivoidulla soluerostuksella (FACS). Stabiilit kloonit erittivät IgG-luokkaan kuuluvia immunoglobuliineja.

25 Yksi klooni, 3C4C7G6, eritti stabiilisti monoklonaalista vasta-ainetta, jonka IFMAn avulla todettiin kuuluvan immunoglobuliiniluokkaan IgG 1. Hybridoma 3C4C7G6 tallennettiin tallennuslaitokseen German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Department of Human and Animal Cell Cultures and Viruses, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Germany, 30 joulukuun 2. päivänä, 1993 ja sille annetiin deponointinumero ACC2159.

Vastaavilla menetelmillä tuotettiin muitakin klooneja, jotka tuottivat Tie-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita samaa tai toista epitooppia vastaan. Eräs sellainen klooni, 10F11G6, valittiin jatkokokeisiin yhdessä ylläkuvatun 3C4C7G6-vasta-aineen kanssa.

111267 1 1 Käytettiin Balb/C-hiiriä tuottamaan monoklonaalisia vasta-aineita askitesnesteessä. Hybridomat injisoitiin intraperitoneaalisesti (i.p.) hiiriin pristaani-käsittelyn jälkeen (2,6,10,14-tetramethyl-pentadecan 98%, Aldrich-Chemie D-7924 Steinheim, cat.no T 2,280-2). Injisoitiin 0.5 ml pristaania (i.p.) 5 noin kaksi viikkoa ennen kuin hybridomasolut injisoitiin. Injisoitujen solujen määrä oli 7.5 - 9 x 10® hiirtä kohden. Saatu askites otetiin talteen 10-14 päivän kuluttua hybridomainjektion jälkeen, ja siinä oli keskimäärin 0.3 mg/ml vasta-ainetta Esimerkissä 6 kuvatulla antigeenispesifisellä IFMA-testillä määritettynä.

10 ESIMERKKI 3

Anti-Tie monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto Hollow Fiber bioreaktorissa

Tuotettiin monoklonaalisia vasta-aineita Tiedä vastaan in vitro käyttäen Technomouse System (Cellex Inc.)- bioreaktoria. Kasvatuspullot korkkeineen 15 ja suodattimineen autoklavoitiin ensin 121°C:ssa ja 1.1 bar paineessa puolen tunnin ajan. Tämän jälkeen niihin täytettiin 1L Dulbeccon MEM (Gibco, 042-02501, glukoosia 6.4 g/L, glutamiinia 2 mmoI/L 066-1051 H, Na-pyruvaattia 1 mmol/L 066-1840E). Bioreaktorin pidike siirrettiin aseptisesti Techomouse tarjottimelle. Pumppu ladattiin, ja kasvatusliemiletkut ja tyhjät jätepullot 20 (outflow-letku) kytkettiin aseptisesti.

Täyttö- ja huuhteluohjelma suoritettiin kuten valmistaja suosittelee kaiken jäännösmateriaalin poistamiseksi bioreaktorin intrakapillaarisesta tilasta (IC). Ohjelma käynnistettiin 150 ml/h virtausnopeudella 4 tunnin ajan. Tämän jälkeen pesua suoritettiin 50 ml/h virtausnopeudella 20 tuntia, jonka 25 aikana myös pestiin ekstrakapillarinen (EC) tila 5% FCSillä rikastetulla Dulbeccon MEM:llä (DMEM). EC-tilan kasvatusliemi vaihdettiin aseptisesti uuteen liemeen. Vuorokausi tämän jälkeen bioreaktori oli valmis ladattavaksi hybridomasoluilla.

Hybridomasolut kasvatettiin soluviljelypulloissa 10% FCS-DMEM:ssä ja 30 72 x 106 solua otettiin talteen ja ladattiin reaktoriin 5 rnhssa DMEM:ä jossa oli 5% FCS. Intrakapillaarisen tilan virtausnopeus oli 100 ml/h. Kierrätysmenetelmää käytettiin monoklonaalisten vasta-aineiden talteenottamiseksi seuraavasti: kasvatusliemiletku kytkettiin kasvatuspulloon 1 2 111267 "out", jolloin ottettiin kasvatuslientä pullosta bioreaktorin intrakapillaariseen tilaan; outflow-letku kytkettiin kasvatuspulloon "in", jolloin liemi palautettiin pulloon. Monoklonaaliset vasta-aineet otettiin talteen kolme kertaa viikossa, maantaisin, keskiviikkoisin ja perjantaisin, ja joka kerta lisättiin 10 ml uutta 5 2.5% FCS-DMEM:iä.

Anti-BG-3 solulinja, 3C4C7G6, tuotti vasta-ainetta keskimääräisesti 152 pg/ml soluviljelyliemeen. Soluinokuloinnin jälkeen Technomouse System bioreaktoriin (72 x 106 solua) vasta-aineet otettiin talteen 2-3 päivän jaksoina. Keskimääräinen tuotanto oli 4.5 mg/viikko ja kumulatiivinen tuotanto kahden ίο kuukauden aikana oli 37 mg.

Askitesnesteessä tai Technomouse systeemissä tuotetut vasta-aineet puhdistettiin Affigel™ Protein A MAPS II Kitillä (BioRad) noudattaen valmistajan ohjeita. Pylväs tasapainotettiin puhdistusta varten sitoutumispuskurilla (pH 9.0). Vasta-aine sitoutui proteiini-A-matriisiin 15 sitoutumispuskurissa ja pylväs pestiin sitoutumispuskurilla kunnes saavutettiin perustaso (detektoitiin 280 nm UV-spektrofotometrialla). Spesifisesti sitoutunut materiaali eluoitiin proteiini-Aista eluutiopuskurilla pH 3.0 ja fraktiot kerättiin putkiin, joissa oli 1 mol/L Tris-HCI, pH 9.0, jota tarvittiin neutralisoimaan fraktiot välittömästi. Pylväs regeneroitiin regenerointi-20 puskurilla ja säilytettiin seuraavaa käyttöä varten 50 mmol/L Na-fosfaattipuskurissa, jossa oli 0.05% NaN3 säilöntäaineena.

ESIMERKKI 4

Vasta-aineita bakteerien ilmentämää Tieltä vastaan

Tie cDNAn Bam Hl fragmentti (nukleotidit 520-1087) subkloonattiin 25 pGEXIT vektorin (Pharmacia) Bam Hl kohtaan, jolloin saatiin avoin lukuvaihe, joka koodittaa glutationi-S-transferaasia joka on liitetty Tie-proteiinin aminohappoja 162-350 koodittavaan alueeseen (GST-Tie2). Konstruktio transformoitiin E.coli DH5a-kantaan ja fuusioproteiinin ilmentyminen indusoitiin IPTGin avulla. Saatu 40 kD fuusioproteiini puhdistettiin 30 denaturoivassa agaroosigeelissä (FMC) ja käytettiin immunisaatioissa.

Tuotettiin monoklonaalisia vasta-aineita kuten yllä kuvattiin BG-3 Tie-proteiinia vastaan. Kahden subkloonauksen jälkeen saatiin kahdeksan kloonia, jotka tuottivat vasta-aineita GST-Tie2-proteiinia vastaan. Nämä 1 3 111267 reagoivat suurinpiirtein yhtä hyvin Tie:n kanssa Western immunoblottauksessa. Anti-GST-Tie2-kloonien askites puhdistettiin käyttäen proteiini-A-pylvästä ja käytettiin Western blottauksessa.

ESIMERKKI 5 5 Tie-proteiinin leimaus Europium:lla

Esimerkissä 1 tuotettu Tie:n solunulkoinen osa, BG-3, leimattiin testikäyttöä varten. Leimaus suoritettiin kuten julkaisussa Mukkala et ai., Anal.Biochem. 176 (2):319-325, (1989) on kuvattu, seuraavin muunnoksin: BG-3-liuokseen (0.5 mg/ml 50 mmol/L boraattipuskurissa, pH 8.6) lisättiin 125 ίο molaarinen ylimäärä isotiosyanaatti-DTTA-Eu (N1-kelaatti, Wallac, Suomi) ja pH säädettiin 9.8:ksi lisäämällä kymmenesosa 0.5 mol/L natriumkarbonaattipuskuria (Merck), pH 9.8. Leimaus suoritettiin yli yön +4°C.ssa. Sitoutumaton leima poistettiin PD-10:llä (Pharmacia, Ruotsi) käyttäen TSA-puskuria (50 mmol/L Tris-HCI, pH 7,8, 0.15 mol/L NaCI) 15 eluointipuskurina.

Puhdistuksen jälkeen lisättiin 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia (BSA) leimattuun BG-3:een ja leimaa säilytettiin +4°C:ssa.

Sitoutuneen europiumin määrä per BG-3-molekyyli oli 2.9, määritettynä fluoresenssimittauksella ja verrattuna tunnettuihin EUCI3-20 standardeihin (Hemmilä et ai., Anal.Biochem. 137: 335-343, 1984).

: ESIMERKKI 6

Immunofluorometrinen seulontamenetelmä (IFMA1

Tie-reseptoria vastaan tuotetut vasta-aineet seulottiin käyttäen sandvvich-tyyppistä immunofluorometristä menetelmää mikrotitrauslevyn ’ 25 kuopissa (Nunc, polysorb), jotka oli päällystetty kanin anti-hiiren-lg:llä (Z 259,

Dakopatts, Lövgren et ai., Talanta 1984; 31 (10B): 909-916). Esipäällystetyt kuopat pestiin kerran Platewash:lla (1296-024, Wallac) käyttäen DELFIA-pesunestettä. DELFIA-testipuskuria käytettiin laimennuspuskurina soluviljely-supernatanteille ja pernan poistoon käytettyjen hiirien seerumille 30 (laimennokset 1:1000 - 1:100,000), joita käytettiin positiivisena kontrollina : alustavissa seulontakokeissa.

1 4 111267

Anti-BG-3 / 3C4C7G6 - vasta-ainetta tuotettuna askitesnesteessä ja puhdistettuna Affigel™ Proteiini-A-MAPS:lla käytettiin standardina myöhäisemmissä kokeissa 0.25 ng/ml - 60 ng/ml konsentraatioissa testipuskurissa (1 ΟΟμΙ, DELFIA).

5 Aloitettiin inkubointi 2 tuntia huoneenlämmössä (tai vaihtoehtoisesti yli yön inkubaatio +4°C:ssa) ravistelemalla Plateshaker-laitteessa (1296-001, Wallac) 5 minuutin ajan, jonka jälkeen pestiin neljä kertaa pesuliuoksella kuten yllä kuvattiin.

Eu-leimattua BG-3:a , joka tuotettiin kuten Esimerkissä 4 on kuvattu, ίο lisättiin 10 ng/kuoppa 100 piissä testipuskuria. Viiden minuutin jälkeen

Plateshaker-laitteessa ja tunnin inkubaation jälkeen huoneenlämmössä levyt pestiin kuten yllä kuvattiin.

DELFIA-enhancement-liuosta lisättiin 200 μΙ/kuoppa. Levyt ravisteltiin 5 min Plateshaker-laitteessa ja fluoresenssin intensiteetti mitattiin ARCUS-15 1230-laitteella (Wallac) 10-15 min ((Lövgren et ai., In: Collins W.P. (ed), Alternative Immunoassays. John Wiley & Sons Ltd, 1985; 203-216).

Sandwich-tyyppinen DELFIA-menetelmä on hyvin herkkä, teoreettinen herkkyys on alle 0.25 ng/ml tällä anti-Tie monoklonaaliselle vasta-aineelle. Vaikka herkkyys oli sopiva soluviljelyssä tuotettujen Mab:ien kvantitointia 20 ajatellen, menetelmä oli käytännöllinen myös in vitro tuotettujen Mab:ien kvantitoinnissa. Lineaarinen alue oli 0.25 ng/ml - 60 ng/ml (Kuva 2). Testin sisäinen vaihtelu todettiin hyvin alhaiseksi.

ESIMERKKI 7

Radioleimatut monoklonaaliset vasta-aineet Tie-reseptorin in vivo detektiota 25 varten

Monoklonaalinen vasta-aine 3C4C7G6 leimattiin 125l:lla käyttäen kloramiini-T-menetelmää (Greenwood et ai., Biochem J. 89:114-123, 1963). Käytettiin 1 mCi Na125l :a leimaamaan 40 pg vasta-ainetta. Leimatut vasta-aineet puhdistettiin eluoimalla Sephadex-G25™:llä, jolloin saatiin pääosa 30 leimatusta vasta-aineesta 1.8 ml:ssä.

15 111267 l-125-leimattu anti-BG-3 (3C4C7G6) annettiin i.v. kahdessa eri annoksena, 1.2 l-125-leimattu anti-BG-3 (3C4C7G6) annettiin i.v. kahdella eri annostasolla, 1.2 pg ja 2.4 pg Lewis-keuhkokarsinoomaa kantaville hiirille. Leimatun vasta-aineen biodistribuutio hiiressä mitattiin viidessä 5 aikapisteessä: 1)6h (N=4), 2) 24h (N=7), 3) 47h (N=5), 4) 70h (N=3) ja 5) 117h (N=2).

Taulukko 1. Biodistribuutio kudoksiin aikapisteissä 1 - 5 ίο _1. 2. 3. 4._5.

% ID/g % ID/g % ID/g % ID/g % ID/g 6 h 24 h 47 h 70 h 117 h blood 36,22871 11,26086 9,343041 7,87285 2,749225 hearth 7,828641 2,842418 1,932395 1,391288 0,548053 aortha 16,07039 5,553582 3,707159 3,166192 0,798207 lung 9,091084 3,823566 3,087934 2,555693 0,987308 liver 6,940821 2,355467 1,770392 1,568976 0,685282 kidney 9,331627 3,490624 2,556933 1,829169 0,802883 brain 0,548253 0,228239 0,149502 0,146163 0,042287 blood vess 22,64432 4,712374 2,435758 2,65011 0,485038 tumour 7,151142 3,620555 3,155919 2,179194 0,901169 spleen 5,840843 2,004754 1,396837 1,195612 0,622342 bladder 6,889924 4,36051 3,628196 3,523912 0,899099 ovarias 8,445497 3,617958 2,622101 2,387713 0,662774

Tulokset osoittavat, että anti-BG-3 aktiivisuutta oli pääasiallisesti veressä, tuumorissa ja verisuonissa, sekä jossain määrin keuhkoissa ja 15 munasarjoissa. Veressä aktiivisuus oli korkea 48 ja 70 tunnin pisteissä: 9.3% ID/g ja 7.9% ID/g (ilmaistuna prosentteina injisoidusta annoksesta per grammaa kudosta ja normalisoituna 20 g hiireen). Anti-Bg-3 aktiivisuus veressä oli 11.3% 24 tunnin ja 36,2% 6 tunnin mittauspisteissä. 1 l-leimattua anti-BG-3 (3C4C7G6) annettiin myös hiirille, joilla oli 8 20 päiväinen paraneva haava ihon epiteelissä . Näille hiirille annettu annos oli 0.03pg eläintä kohden. Aktiivisen vasta-aineen biodistribuutio näytetään Kuvassa 3. Tässä kuvassa Y-akseli edustaa annoksen määrää %:na (% ID/g) ja X-akseli edustaa injisoinnin aikapisteitä: 4h (N=2); 24h (N=6); 48h (N=6); 72h (N=4) ja 120h (N=4). Kohdekudoksen ja plasman välillä on 25 tasapainotila, joka esitetään myös Kuvassa 3.

1 6 111267 ESIMERKKI 8

Anti-Tie monoklonaalisten vasta-aineiden Tc-99m-leimaus kuvantamiskoetta varten

Vasta-aine leimattiin 99m-teknetium:lla julkaisuissa Schwarz et ai., 5 J.NucI.Med., 1987, 28:721, ja Mather et ai., J.NucI.Med., 1990, 31: 692-697 kuvatun menetelmän avulla. Käytettiin 2-merkaptoetanolia (ME) immunobglobuliinin raskaan ketjun liittymäalueen disulfidisidosten avaamiseksi. Vasta-aine konsentroitiin noin 10 mg/L ja liuokseen lisättiin riittävä määrä ME:ia jotta saatiin molaarinen suhde 1000:1 (0.47 μΙ ME /1 mg ίο vasta-ainetta). Seos inkuboitiin huoneen lämmössä 30 min ja pelkistetty vasta-aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla 20 ml Sephadex-G-50 pylväässä ja eluoitiin käyttäen fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta liikuvana faasina. Vasta-ainefraktiot yhdistettiin optisen densiteetin mittauksen jälkeen (280 nm) ja säilytettiin -20°C:ssa 0.5 mg:n erinä 99m-Tc 15 leimausta varten.

99m-Tc-leimausta varten vasta-aine-erät sulatettiin ja rekonstituoitiin käyttäen metyleenidifosfonaatti (MDP) luukuvantamiskitissä (Amerscan Medronate II Technetium Bone Agent, N.165) 5 ml 0.9% steriiliä suolaliuosta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vasta-aine-erään lisättiin 35 μΙ MDP-liuosta, 20 jossa oli 35 pg MDP:tä ja 2.4 pg SnF2 ja sekoitettiin hyvin. Seokseen lisättiin 99m-Tc-perteknaattia ja ravisteltiin varovaisesti. Reaktio päättyi 10 min:ssa. Radiokemiallinen puhtaus mitattiin HPLC:llä.

Pelkistetyn vasta-aineen leimaus tuottaa stabiilin 99m-Tc-leimatun immunoglobuliinin koska leiman epäspesifinen sitoutuminen on minimissä.

25 Leimaustehokkuus määritetään ohutlevykromatografialla 0.9% fysiologisessa suolaliuoksessa. Immuunoreaktiivisuus säilyy yli 85%:ssa. In vivo stabiilisuus analysoidaan in vitro - kysteiinitestillä.

99mTc-leimatut anti-Tie-vasta-aineet voidaan detektoida * tavanomaisella gamma-kameralla tai SPECT-laitteella (Single Photon 30 Emission Computerized Tomography) jolloin saadaan kuva vasta-aineen kiertonopeudesta ihmisen kehossa.

1 7 111267 ESIMERKKI 9

Tie-positiivisten solulinjojen detektion FACS:n avulla

Esimerkeissä 2, 3 ja 4 valmistetuja anti-Tie vasta-aineita käytettiin Tie-proteiinin detektoimiseksi ihmisen leukemia-solulinjoista.

5 Hematopoieettiset solulinjat HEL (humaani erytroleukemia) ja MOLT-4 (T-lymfoblastinen leukemia) saattiin ATCCistä. HEL-soluja, jotka myös ilmentävät erytroidi- ja megakariosyyttimarkkereita, käytettiin Tie:n epäsuorassa immunotfluoresenssivärjäyksessä käyttäen tehtyjä monoklonaalisia vasta-aineita ja FACS-analyysiä (fluorecence activated cell ίο sorting). Solut laskettiin, pestiin ja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa useissa laimennuksissa (1:1 - 1:200), pestiin ja inkuboitiin FITC-konjugoitujen hiiren anti-immunoglobuliini vasta-aineiden kanssa (sekundaariset vasta-aineet). Anlysointi tehtiin käyttäen FACS IV-laitteistoa. Negatiivisena kontrollina käytettiin ei-spesifisellä hiiren immunoglobuliinissa värjättyjä soluja, jonka 15 jälkeen käytettiin samoja sekundaari-vasta-aineita. Negatiivisena solukontrollina käytimme MOLT-4 T-soluleukemiasolulinjaa, joka ei ilmennä Tie mRNAta.

Tulokset osoittavat että anti-Tie-vasta-aineet värjäävät keskimäärin 85% HEL soluista, kun vastaavasti alle 1% MOLT-soluista värjäytyvät 20 positiiviseksi Tie:n suhteen. Kun näiden kahden solulinjan solut sekoitetaan , vasta-aineet erottavat positiiviset HEL-solut negatiivisesta MOLT-soluista (Kuva 1). Ihmisen luuydinnäytteessä alle 1% soluista värjäytyy myös positiivisesti näillä vasta-aineilla.

Ihmisen leukemiasolulinjan MOLT4 solut (maligni T-solulinja, joka on 25 Tie mRNA-negatiivinen) ja HEL-solut (ihmisen erytroleukemiasolulinja, joka on Tie mRNA-positiivinen) sekoitettiin suspensiossa noin 1:1 suhteessa.

Solut värjättiin tämän jälkeen suspensiossa käyttäen Esimerkin 2 mukaisia .· monoklonaalisia Tie-vasta-aineita laimennettuna 1:10 ja FITC-konjugoitua anti-hiiren IgG sekundaarisena vasta-aineena. Negatiivisena kontrollina 30 vasta-aine korvattiin normaalilla hiiren seerumilla. Analysointi tehtiin FACS IV:llä. Tulokseksi saadaan kaksi erillistä solupopulaatiota, yksi Tie-positiivinen ja yksi Tie-negatiivinen, kummankin ollen noin 50% koko analysoidusta solupopulaatiosta (Kuva 1).

1 8 111267

Jotkut Tie-positiiviset luuydinsolut olivat myös CD19B-solumarkkerille positiivisa ja kaikki olivat CD38-negatiivisia. Tämä osoittaa, että Tie ilmenee B-solulinjassa.

ESIMERKKI 10 5 Monoklonaalisten vasta-aineiden analvosointi

Monoklonaaliset soluviljelysupernatantien kyky tunnistaa Tie-reseptoria solujen pinnalta testattiin käyttäen FACS analyysiä. Tie-ilmentämisvektorilla (kokopitkä Tie-cDNA pLTRpoly-vektorissa, Mäkelä et ai., 1991) tranfektoidut NIH3T3 solut, kontrollivektorilla transfektoidut NIH3T3 solut, sekä HEL solut io (ihmisen erytroleukemiasolulinja joka endogeenisesti ilmentää Tie-reseptoria) että MOLT-4 solut (ihmisen T-soluleukemiasolulinja, joka ei ilmennä Tiedä) inkuboitiin eri solukloonien kasvatusliemissä ja sen jälkeen FITC-leimatuilla kanin anti-hiiri-vasta-aineilla (Dako). Leimatut solut analysoitiin fluoresenssi-aktivoidulla solulaskijalla (Becton Dickinson).

15 Tuotettiin myös askites seuraavista klooneista: 1H3H7, 3C4C7, 5C12H9. 3C4D7 klooni subloonattiin ja saatiin subkloonit 3C4C7G6, 3C4C7B11, 3C4C7E7, 3C4C7F9, jotka olivat samankaltaisia.

1 9 111267

Taulukko 2.

Solun ulkoista osaa tunnistavien anti-Tie monoklonaalisten vasta-aineiden tuloksia

Klooni delfia slot blot Western FACS

5 BG-3 _media denat._ 1H3F10 +++ +++ +++ (+) H6 +++ +++ +++ (+) ίο H7 +++ +++ +++ (+) 3C4C7 +++ +++ + - ++ E4 +++ ++ (+) - + G4 +++ ++ (+) - + 5C12G11 +++ +++ +++ 15 H9 +++ +++ +++ (+) 6A11A11 ++ ++ + + H6 ++ ++ (+) - + H9 ++ ++ + - + 9B10E6 + ++ +++ 20 G7 + ++ +++ 9E7E9 +++ +++ +++ (+) E10 +++ ++ ++ (+) _H6_+++_++_++_(+)_^_ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ESIMERKKI 11 2

Tie:n immunoperoksidaasivärjäys ihmisen veren soluissa

Potilaalle annettiin syklofosfamidia, jotta hematopoieettiset kantasolut 3 : ; mobilisoituisivat perifeeriseen vereen, ja seitsemän päivän jälkeen kerättiin 4 • < 5 perifeerisestä verestä kuultavan kerroksen solut. Punasolut hemolysoitiin 6 solususpensiosta ja tehtiin sytosentrifuugiliuskoja. Näitä käytettiin 7 immunovärjäyksessä puhdistetulla Tie monoklonaalista vasta-aineella 8 3C4C7G6 immunoperoksidaasimenetelmällä. Luuydinsolujen 9 kaksinkertaisella immunofluoresenssivärjäyksellä Tie-positiivisia soluja (alle 10 '·' 1%) ei voitu määrittää selvästi johonkin hematopoieettiseen linjaan kuuluviksi.

11

Tunnistettiin 5 positiivisesti värjäytynyttä solua yhden liuskan noin 70.000 solusta. Immunoperoksidaasivärjäyksessä Tie-positiiviset solut olivat pieniä ja pyöreitä, ja niillä oli suuri tuma ja niukasti solulimaa (Kuva 2). (Kuvan yhden positiivisen solun tumma väri johtuu peroksidaasivärjäyksestä ja ilmaisee Tie-positiivisen solun). Täten anti-Tie monoklonaaliset vasta-aineet 20 111267 tunnistavat spesifisiä hematopoieettisia soluja luuytimestä ja niitä voidaan käyttää hematopoieettisten solujen tiettyjen alaryhmien tunnistamiseksi.

ESIMERKKI 12

Monklonaalisen vasta-aineen 3C4C7G6 humanisointi 5 3C4C7G6 voidaan humaniosoida käyttäen aikaisemmin kuvattuja menetelmiä (Kolbinger et ai., 1993; Kettleborough et ai., 1991). Humanisointimenetelmä käsittää hiiren kappa kevytketjun (L) ja raskaan ketjun (H) determinanttialueiden (CDR) liittämisen ihmisen muuttuviin alueisiin (V) sekä pistemutaatioiden aikaansaamisen ihmisen vasta-aineen ίο reunaalueilla, siten että alkuperäinen CDR-konformaatio säilyy.

Uudelleenmuokatut VL ja VH ketjut liitetään vastaavasti ihmisen kappa ja gamma-1 muuttumattomia alueita koodittavaan DNA: hän sopivien ilmentämisvektorien avulla.

scFv tuotetaan kuten aikaisemmin on kuvattu julkaisussa Whitlow et ai., 15 supra, (1993).

Humanisoitujen monoklonaalisten vasta-aineiden affiniteetit ja scFv:t testataan käyttäen tässä hakemuksessa aikaisemmin kuvattuja menetelmiä.

ESIMERKKI 13

Tie-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden konjugointi terapeuttiseen '· 20 aineeseen

Monoklonaalinen vasta-aine 3C4C7G6, tai esimerkissä 12 kuvatut humaniosoidut vasta-aineet, voidaan liittää tai konjugoida erilaisiin aineisiin diagnostista käyttöä varten, kuten muissa esimerkeissä tässä kuvataan, tai tuotettujen konjugaattien terapeuttista käyttöä varten. 1

Esimerkiksi tuumoriterapiassa tai disperssin maligniteetin kuten leukemian hoidossa, vasta-aineet voidaan liittää radioisotooppeihin kuten, 32P,1311,125l, 90Y, 188Re, 212Pb, 212Bi tai 10B (Katso esim. Scheinberg et ai., Oncology, 1:31-37, 1987). Radioisotooppien konjugointi vasta-aineeseen aikaansaadaan liittämällä isotooppi suoraan vasta-aineeseen aikaisemmin j 30 kuvattuja menetelmiä käyttäen (See e.g., Schwartz J., Nuclear Medicine 2 1 111267 28:721, 1987) tai kelaattilinkkereiden avulla, jotka sitovat radioisotoopin vasta-aineeseen, tai sekundaarisen vasta-aineen avulla joka sitoutuu spesifiseen vasta-aineeseen . Erinäisiä muita aineita voidaan myös liittää vasta-aineisiin. Tällaisia aineita ovat antituumorilääkkeet ja antibiootit, jotka 5 ovat toksisia koska sitoutuvat DNAhan interkalatoinnin avulla (esim. daunomysiini, adriamysiini, aklasinomysiini) tai pilkkovat DNAta (esim. esperamysiini, kalikeamysiini, neokasinstatiini) sekä muut toksiset sytostaattilääkkeet kuten cis-platinum, vinblastiini ja metotreksaatti (katso esim. Greenfield et ai., Antibody, Immunoconjucates and ίο Radiopharmaceuticals, 4:107-119, 1991). Nämä aineet liitetään kovalenttisesti käyttäen aineiden sopivia johdannaisia.

Monia proteiineja ja glykoproteiineja voidaan myös käyttää vasta-aineiden terapeuttisina konjugaatteina. Näitä ovat esimerkiksi bakteeritoksiinit, kuten Difteriatoksiini, Shigellatoksiini ja Pseudomonaan 15 eksotoksiini; kasvitoksiinit, kuten risiini, abriini, modekkiini, viskumiini, kermesmarjasta eristetty antivirusproteiini, saporiini, momordiini ja geloniini. Nämä toksiinit sisältävät katalyyttisen fragmentin, ja joissakin tapauksissa fragmentteja tai osia jotka tunnistavat solun pintarakenteita tai helpottavat solumembraanin läpi kulkeutumista. Käytetään sopivasti modifioituja 20 toksiineja, jotka antavat parannettua spesifisyyttä ilman alentunutta tehoa. Toksiinien konjugointi vasta-aineisiin tehdään heterobifunktionaalisten linkkereiden avulla, kuten N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)-propionaatti (SPDP) tai 2-iminotiolaani.

Ennen terapeuttista käyttöä konjugoidut vasta-aineet testataan toksisen 25 tehon suhteen, kohdespesifisyyden suhteen, in vitro ja in vivo stabiilisuuden suhteen ja muiden ominaisuutensa suhteen (katso esim. Immunotoxins, Ed. Frankel, Kluwer Academic Publishers, Boston, 1988). On toivottavaa, että konjugoidun aineen toksisuus ja vasta-aineen sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys muuttuvat mahdollisimman vähän käytetyn sitoutumismenetelmän 30 myötä. Siksi konjugaattien sitoutuminen Tie-reseptoriin testataan (katso Esimerkki 10). In vitro toksisuus kohdesoluissa kuten Dami leukemiasolulinjassa testataan mittaamalla sitoutunut leimattu yhdiste verrattuna kontrollikonjugaatilla hoidettuun soluviljelmään, ja vielä suoremmin määrittämällä ne viljelmät jotka pystyvät kasvamaan kloonaustesteissä ja 35 solun kasvunopeuden ekstrapolaatio testissä. In vivo stabiilisuus, poistonopeus ja spesifinen toksisuus määritetään antamalla konjugaatteja 22 111267 sopivalle kohde eläimelle, kuten hiirelle, rotalle, kanille tai apinalle. Muita kohteita ovat normaalihiiret ja in vivo tuumori- ja leukemia mallit, kuten ihmisen syöpäsolut annettuina immunopuutteisille hiirikannoille, kuten nude-hiiri tai SCID-hiiri.

5 ESIMERKKI 14

Monoklonaalista vasta-ainetta 3C4C7G6 sisältävän farmaseuttisen komposition valmistaminen

Esillä olevan keksinnön mukaiset farmaseuttiset kompositiot sisältävät tehokkaan määrän aktiivista ainetta, Tie-spesifistä monoklonaalista vasta-10 ainetta, erityisesti monoklonaalista vasta-ainetta 3C4C7G6, yksin tai yhdistettynä sopivaan puskuriin, laimennusaineeseen ja/tai lisäaineeseen. Tällaiset kompositiot tuotetaan steriileinä vesiluoksina tai lyofilisoituina tai muuten kuivattuina formulaatioina. Edullisesti vasta-aineet formuloidaan sellaiseen kantajaan konsentraatiossa 1 mg/ml - 10 mg/ml.

15 Yksi esimerkki injisoitavaksi soveltuvasta farmaseuttisesta kompositiosta sisältää monoklonaalista vasta-ainetta 3C4C7G6 (1 mg/ml) puskuroidussa vesiliuoksessa jossa on monoemäksistä natriumfosfaattiliuosta (0.45 mg/ml; pH 7.0 ±0.5) ja Tween 80™ (0.2 mg/ml). Keksinnön mukaisia kompositioita annetaan sellaisina annoksina, jotka alan ammatti-ihminen 20 määrittää huomioiden kohteena olevan taudin, oireiden vakavuuden ja potilaan ominaisuudet. Esimerkkinä mainittakoon, että keksinnön mukaisia farmaseuttisia kompositioita voidaan antaa paikallisesti jotta saadaan maksimaalisen vaikutus tuumorin kasvun ja neovaskularisaation pysähdyttämisessä tai haavan parantumisessa. Toisenlaiset annokset ovat 25 kuitenkin tarpeen systeemisessä käytössä, riippuen potilaan ominaisuuksista, kuten painosta, iästä, taudin progressiosta, metaboliasta, jne.

Alan ammatti-ihmiselle voi avautua muita käyttömuotoja kun hän ottaa : huomioon tämän kuvauksen. Siten esillä oleva keksintöä rajoittaa vain alla olevat vaatimukset.

23 111267 ESIMERKKI 15

Tie:n immunohistokemiallinen värjäytyminen normaali aivossa, glioblastoma multifore:ssa ia melanoman etäispesäkkeissä

Tuoreet hoitamattomat aivogliomanäytteet ja kallonsisäisen 5 meningeomanäytteet saattin avoleikkauksesta neurologiselta leikkausosastolta Helsingin Yliopistollisesta Sairaalasta. Kaikki tuumoripotilaat saivat kortikosteroidihoitoa. Ei-neoplastinen kontrolli-aivokudosnäyte saatiin vaikean epilepsian leikkauksesta. Useat tuumorinäytteet sisälsivät myös ympäröivää aivokudosta. Kaikki näytteet ίο pakastettiin nestetyppeen mahdollisimman pian leikkauksen jälkeen ja säilytettiin -70°C:ssa. Histopatologinen diagnoosi perustui hematoksyliini/eosiini värjättyihin jääleikkeisiin ja rutiininomaisesti värjättyihin formaldehydifiksattujen rinnakkaisten tuumorinäytteiden paraffiinileikkeisiin. Taulukossa 3 on täydellinen luettelo näytteistä.

15 Taulukko 3. Ihmisen kudosnäytteet

No kudosnäyte__Age (y) Sex_ 1 kontrolliako__66__M_ 2 kontrolliako__Y\__F_ 3 II asteen oligoastrosytoma__34__F_ 4 II asteen oligoastrosytoma__66__M_ 5 III asteen astrosytoma__36__M_ 6 _ GBM__53__M_ _7_ GBM__63__M_ 8 _ GBM__56_JM_ 9 GBM:n viereinen kudos__69__F_ 10 I asteen meningeoma__52__M_ 11 II asteen meningeoma__35__F_ 12 II asteen meningeoma__55__M_ 13 melanoma etäispesäke__54__M_ 14 m e:nn ympäröivä kudos__67__M_ 15 III asteen glioma__44__M_ 16 |gbm 65 |m GBM = glioblastoma multiforme 24 111267

Steriloidut levyt kastettiin 2% aminopropyylitrietoksisilaaniin (TESPA) asetonissa jotta varmistetaan kudoksen kiinnittyminen. Leikattiin 5-μιτι jääleikkeitä -20°C:ssa esikäsitellyille levyille, kiinnitettiin 4% paraformaldehydissä ja säilytettiin -70°C:ssa.

5 In situ-hybridisaatio-analyysissä käytettyjen näytteiden 5-pm jääleikkeet ja kaksi ylimääräistä malignia gliomanäytettä leikattiin TESPA-levyille kuten yllä on kuvattu. Leikkeet kuivattiin vakuumissa 37°C:ssa yli yön ja värjättiin immunohistokemiallisesti käyttäen hiiren monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen Tie:ta vastaan (Tie:n solunulkoista osaa tunnistavien muutamien ίο monoklonaalisten vasta-aineiden seos) ja ihmisen von VVillebrand-tekijän (vWF) vastaan tehtyjä kanin vasta-aineita (Dakopatts) endoteelisolu-spesifisenä markkerina.

Värjääminen suoritettiin käyttäen hiiren lgG:lle tarkoitettua Vectastain ABC Elite biotin/avidin systeemiä (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

15 Kuivatun, fiksoimattoman kudosleikkeen endogeeninen peroksidaasi- aktiivisuus vaimennettiin käsittelemällä 0.5% H202;:lla metanolissa 30 min. Pestiin PBS:llä jonka jälkeen leikkeet inkuboitiin laimennetulla Vectastain blokkausseerumilia 20 min ja sen jälkeen laimentamattomalla Tie-vasta-aineella (1:1) yli yön 4°C:ssa tai von VVillebrandtekijä-vasta-aineella (1:50) 1 20 tunti huoneen lämmössä. Biotinyloitu sekundaarinen vasta-aine lisättiin 45 min:ksi., jonka jälkeen lisättiin Vectastain ABC-reagenssia 30 min. Reaktio visualisoitiin 0.2 mg/ml 3-amino-9-etyylikarbatsolilla (AEC), 0.03% H202, 14 mM etikkahapolla ja 33 mM natriumasetaalilla. Normaaliseerumia ja . antigeeniblokattuja primaarivasta-aineita käytettiin kontrolleina. Leikkeet 25 vastavärjättiin kevyesti hematoksyliinillä ja peitattiin Aquoamount'ssa.

Aivon kuorikerroksen normaalikudoksen verisuonet olivat Tie-proteiini-negatiiviset (Kuva 4), kun sitä vastoin glioblastoman suonistossa (B) ja GBM:n läheisyydessä olevassa endoteelikudoksessa (B, sisennys) todettiin voimakasta värjäytymistä. Tie-proteiinia detektoitiin myös melanoman :. 30 etäpesäkkeiden suonia peittävissä endoteelisoluissa (C) sekä tuumorin rajalla (ei näytetä). Kun leikkeet inkuboitiin antigeeniä blokkaavalla vasta-aineella tai normaaliseerumilla Tie-vasta-aineiden tilalla, mitään spesifistä värjäystä ei esiintynyt. Tie-värjäytymisen määrän ja spesifisyyden edelleen arviointia varten värjättiin lähileikkeitä Vlll-tekijällä. Taulukossa 4 esitetään 35 yhteenvetona Tie-värjäystulokset.

25 111267

Taulukko 4. Tie:n immunohistoloainen värjäys

No Kudos__Tie ab 2 normaaliaivo__:_ 15 III asteen glioma__++_ 7_GBM*_+++ 16 GBM_ I +++ 11 I asteen meningeoma__++_ 13 melanoman etäispesäke__++_ Nämä tulokset osoittavat että TIE:llä on tärkeä rooli tuumorin progressioon liittyvässä angiogeneesissä.

5 ESIMERKKI 16

Tie-proteiinin immunohistokemiallinen detektio hemanaioblastomassa ja hemanaioperisvtomassa Tässä tutkimuksessa me analysoimme endoteelisten kasvutekijöiden ja ίο niiden reseptoreiden ilmentymistä kahdessa voimakkaasti vaskulaarisessa keskushermoston tuumorissa, joiden alkuperä oli kiistanalainen; kapillaarisessa hemagioblasomassa ja hemangioperisytomassa.

Tuoreet hemangioblastoma- ja hemangioperisytomanäytteet saatin avoleikkauksesta neurologiselta leikkausosastolta Helsingin Yliopistollisesta 15 Sairaalasta. (Kaikki tuumoripotilaat saivat kortikosteroidihoitoa). Näytteet pikapakastettiin heti leikkauksen jälkeen ja säilytettiin -70°C:ssa. Histopatologinen diagnoosi perustui hematoksyliini/eosiini värjättyihin jääleikkeisiin ja rutiininomaisesti värjättyihin formaldehydifiksattujen tuumorinäytteiden paraffiinileikkeisiin.

20 Steriloidut levyt käsiteltiin 2% aminopropyylitrietoksisilaanilla (TESPA) asetonissa jotta varmistutaan kudoksen kiinnittymistä. Leikattiin 5-μιτι jääleikkeitä levyille, kiinnitettiin 4% paraformaldehydissä PBS:ssä ja säilytettiin -70°C:ssa.

In situ-hybridisaatio-analyysissä käytettyjen näytteiden 5-μητι jääleikkeet : 25 leikattiin TESPA-levyille kuten yllä on kuvattu. Leikkeet kuivattiin vakuumissa 26 111267 37°C:ssa yli yön ja värjättiin immunohistokemiallisesti käyttäen hiiren monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen Tie:ta vastaan (Tie:n solunulkoista osaa tunnistavat monoklonaaliset vasta-aineet saatiin lahjana Tri. Juha Partaselta) ja käyttäen ihmisen von VVillebrand-tekijää (vWF) vastaan tehtyjä 5 kanin vasta-aineita (Dakopatts) sekä CD34 vasta-aineita endoteelisolu-spesifisenä markkerina (36).

Värjääminen suoritettiin käyttäen hiiren lgG:lle tarkoitettua Vectastain ABC Elite biotin/avidin systeemiä (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Kuivatun, fiksoimattoman kudosleikkeen endogeeninen peroksidaasi-10 aktiivisuus blokattiin käsittelemällä 0.5% H202;:lla metanolissa 30 min.

Pestiin PBS:llä jonka jälkeen leikkeet inkuboitiin laimennetulla Vectastain blokkausseerumilla 20 min ja sen jälkeen laimentamattomalla Tie-vasta-aineella (1:1) yli yön 4°C:ssa tai CD34/von Willebrandtekijä-vasta-aineella (1:50) 1 tunti huoneen lämmössä. Biotinyloitu sekundaarinen vasta-aine 15 lisättiin 45 min. jonka jälkeen lisättiin Vectastain ABC-reagenssia 30 min. Reaktio visualisoitiin 0.2 mg/ml 3-amino-9-etyylikarbatsolilla (AEC), 0.03% H202, 14 mM etikkahapolla ja 33 mM natriumasetaatilla. Normaaliseerumia ja antigeeniblokattuja primaarivasta-aineita käytettiin kontrolleina. Leikkeet vastavärjättiin kevyesti hematoksyliinillä ja peitattiin Aquoamount'ssa.

20 Todettiin Tie-proteiinin voimakasta värjäytymistä sekä hemagioblastoman (Kuva 4, A,B) verisuonien sisäpinnalla, ja vähemmässä määrin hemangioperisytomassa (C-F). Tie-proteiinin määrä vaihteli huomattavasti tuumorikudoksissa, esimerkiksi siten että se oli suurempi , vähemmän selvässä hemangioperisytoma-alueessa (E, F), ja matalampi 25 tavanomaisemmassa tuumorinäytteessä (C, D). Kokonaisuutena ilmentyminen oli kuitenkin selvästi korkeampi kuin normaaleissa aivon kuorikerroksen näytteissä joita on aikaisemmin analysoitu (23). Verrattuna vWF-immunovärjäykseen (B, D, F) Tie ei ilmentynyt hemangioperisytoma-tuumorisoluissa (C-F).

:. 30 Nämä tulokset tukevat sitä hypoteesiä että Tie saattaa vaikuttaa näiden kahden vaskulaarisen tuumorin angiogeneesiin.

27 111267 ESIMERKKI 17

Anti-Tie vasta-aineiden käyttöin vivo hiiren Lewis keuhkokarsionoma-mallissa

Olemme tutkineet radioleimattujen (I125) anti-TIE monoklonaalisten 5 vasta-aineiden (10F11G6 ja 3C4C7G6) sitoutumista tärkeimpiin elimiin hiiressä sekä myös keuhkometastaaseihin määrittääksemme mahdollisuutta käyttää anti-TIE monoklonaalisia vasta-aineita pahanlaatuisen kasvun detektoimiseksi.

Vasta-aineiden radioleimaus suoritettiin seuraavasti: 40 μ9 vasta-io ainetta leimattiin Chloramin-T-menetelmällä käyttäen 37 MBq Na-125l kuten julkaisussa Greenwood et ai., supra, 1963 kuvataan. Leimattu vasta-aine puhdistettiin Sephadex-G25:llä ja saattiin pääfraktioon 1.8 ml. Ennen in vivo biodistribuutiotutkimusten aloittamista kolmen radioleimatun vasta-aineen (3c4, 10F11, 7E8) affiniteettejä verrattiin solutestissä (Lindmo, Nucl Med 21: 15 807-810, 1984). Kaikki vasta-aineet sitoutuivat spesifisesti LE GD 14-2 soluihin, jotka ovat TIE-reseptoria ulkopinnallaan imentäviä transfektoituja hiiren endoteelisoluja, mutta 10F11 sitoutui oli kolmin kertaisesti verrattuna kuin muihin (21 pMoolia / 100 000 solua vs. 6-7 pMoolia / 100 000 solua).

Keuhkokarsinomaeksperimenteissä käytimme 6 - 8 viikon ikäisiä 20 naarashiiriä (C57BI/6, Bomholtgaard, Tanska), joilla oli Lewis keuhkokarsinoma (LLC1/2) kasvaimia, jotka oli kasvatettu injisoimalla 1-10 M soluja 0.25 ml eläintä kohden lihaksensisäisesti oikeanpuoliseen takaraajaan.

Hiirten kilpirauhaset kyllästettiin jodilla aloittamalla Kl-liuoksen anto 25 vuorokautta ennen radioleimattujen vasta-aineiden injisointia ja sitä jatkettiin koko eksperimentin ajan antaen Kl-liuosta 400mg/100ml ad libidum.

I125-leimattujen anti-TIE-vasta-aineiden jakaantuminen elimistöön tutkittiin 24, 48, 72,96 ja 120 tunnin kohdalla suonensisäisen vasta-aine-injektion jälkeen (30 ng 20 mM PBS:ssä). Todettiin 14 Lewis 30 keuhkokarsinoma koe-eläintä, joissa oli keuhko metastaaseja, vasta-aineella 10F11: yksi 24 tunnin, kolme 48 tunnin, kolme 72 tunnin, kolme 96 tunnin ja neljä 7 vuorokauden jälkeen (katso Kuva 6). Keuhkometastaaseja todettiin 111267 28 vasta-aineella 3C4 kolmessa eläimessä, 24, 48 ja 120 tunnin jälkeen (katso Kuva 7).

3C4 ei osoita sitoutumista keuhkometastaaseihin 48 tunnin kohdalla (kudos/veri- suhde 0.07), mutta molemmat vasta-aineet sitoutuvat 96 tunnin 5 kohdalla Lewis keuhkokarsinomamallissa metastaaseihin, kudos-veri-suhteiden ollessa 2.4 (3C4C7G6) ja 2.8 (10F11G6).

Vasta-aineiden 3C4 ja 10F11 hakeutuminen keuhkometastaaseihin on samankaltaista, molemmat vasta-aineet sitoutuvat metastaaseihin in vivo, mutta 10F11 sitoutuu voimakkaammin seerumiin, 20%ID/g 10F11 :n kohdalla 10 verrattuna 10%ID/g 3C4:n kohdalla 48 tunnin jälkeen.

ESIMERKKI 18

Seeruminäytteiden analysointi IRMA-menetelmässä

Normaalien ja syöpää sairastavien henkilöiden seeruminäytteitä on seulottu sandwich-tyyppisella immunoradiometrisellä menetelmällä (IRMA) 15 (Miles L. et ai., Nature 219:186-189(1968), jossa sieppaavat anti-TIE-vasta-aineet on kiinnitetty polystyreeniputkiin ja sekundaariset anti-TIE-vasta-aineet on leimattu 125l:lla käyttäen aikaisemmin mainittua Cloramin-T-menetelmää. Rekombinantti-TIE-proteiinia käytettiin standardinäytteenä antigeenin konsentraation määrittämiseksi seeruminäytteestä. Käytetyn 20 laimentamattoman standardi-näytteen konsentraatio määritettiin 280 nm:ssä. Standardikäyrän tekemiseksi käytettiin antigeenin laimennussarjaa, jossa tie-antigeenin konsentraatio oli 0. 18, 36, 72, 144, 720 ja 3600 pg/L. Kuvassa 9 esitetään neljän vasta-aineparin standardikäyrät, parina kiinnitetty ja leimattu vasta-aine.

25 Tällä menetelmällä seulottiin rintasyöpä-, munasarja- ja eri keuhkosyöpiä sarastavien potilaiden sekä ei syöpää sairastavien potilaiden seeruminäytteitä. Ne potilaat joilla oli uusia kasvavia etäpesäkkeitä keuhkoissaan osoittivat kohonneita arvoja tässä testissä. Ne potilaat joiden tauti oli stabiili osoittivat arvoja jotka ovat verrattavissa ei syöpää sairastavien 30 potilaiden arvoihin. Kuvassa 10 esitetään määritetyt antigeenin seerumpitoisuudet 20 ei syöpää sairastavan potilaan ja kolmen tuoreen etäpesäkkeen omaavan syöpäpotilaan näytteissä. Pienisoluista keuhkosyöpää (SCLC) sairastava potilas luovutti 6 näytettä, kuukauden t 29 111267 väliajoin, ja munasarjasyöpäpotilas jolla oli alavatsassa metastaaseja luovutti 5 näytettä. Rintasyöpäpotilas jolla oli uusia keuhkometastaaseja luovutti kaksi näytettä. Kuvassa 10 käytetty vasta-ainepari oli 3C4C7G6 /10F11G6, jolla oli standardikäyrän mukaan parempi herkkyys (>5pg/L).

5 « > - .

30 111267

Applicant*oragent*fiic „ International applies -raNo.

referencenumber .Ia-MAB/SN__PCT/F1 9 5 / 0 0 1 7 Π

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM

(PCTRule 13iii) A. The indication* made below relate to the microorganism referred to in the description on page 4 , line 15~20 .

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet | ] Name of depositary institution

DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND 2ELLKULTUREN GmbH

Address of depositary institution (including postal code and country)

Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig DEUTSCHLAND

Date of deposit Accession Number 1993-12-02 DSM ACC2159

C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable) This information is continued on an additional sheet JJ

As regards the respective Patent Offices of the respective designated states, the applicant requests that a sample of the deposited microorganisms only be made available to an expert nominated by the requester until the date on which the patent is granted or the date on which the application has been refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (tflhr irnlinuiimr nrr nrtfrrtll dnignastd Stein) E> SEPARA IF. FURNISHING OF INDICATIONS (leone blank if not applicable)

The indications listed below will be submitted to tbe international Bureau isicr (specify dicgaurainaiurc of ti%eindicationse.g^ 'Accession Humber of Deposit')

For receiving Office use only For international Bureau use only

This sheet was received with the international application □ This sheet was received by tbe International Bureau on: I

___ 21 APRIL 1995 ,UJJft.95)

Authorized officer , , ΉΓ; υ . Authorized officer e. MOyse \y

Fonn PCT/RQ/134 (July 1992)

Claims (21)

111267

1. Monoklonaalinen vasta-aine, joka tunnistaa Tie-reseptorityrosiinikinaasin solunulkoista osaa, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on anti-Tie monoklonaalinen vasta-aine 5 3C4C7G6 ja se on DSM deponointinumerolla ACC2159 deponoidun hybridoomasolulinjan tuottamaa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta tuottava hybridoomasolulinja, tunnettu siitä, että mainittu hybridoomasolulinja on deponoitu DSM deponointinumerolla ACC2159.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on detektoitavasti leimattu.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen detektoitavasti leimattu vasta-aine, tunnettu siitä, että mainittu tunnistettava merkkiaine on radioisotooppi, fluorokromi, väriaine, entsyymi tai biotiini.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen humanisoitu vasta-aine, tunnettu siitä, että hiiren kevyen ja raskaan ketjun komplementaarinen alue mainitussa monoklonaalisessa vasta-aineessa on liitetty ihmisen vaihtelevaan alueeseen, ja jossa mainitun hiiren komplementaarisen alueen konformaatio on säilynyt.

6. Jonkun patenttivaatimuksen 1 tai 5 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, 20 että siihen on konjugoitu sytotoksinen aine, sytostaattinen lääkeaine tai glykoproteiini.

7. Menetelmä Tie:n tunnistamiseksi biologisesta näytteestä, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet a) saatetaan näyte, jonka epäillään sisältävän Tie:tä, yhteyteen detektoitavasti leimatun Tie:n solunulkoista osaa tunnistavan, patenttivaatimuksen 3 tai 4 25 mukaisen vasta-aineen kanssa, b) pestään näyte, ja c) tunnistetaan mainitun detektoitavasti leimatun vasta-aineen läsnäolo kyseisessä näytteessä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen näyte on 30 kiinteä kudosnäyte tai liuos, joka sisältää verisoluja tai kudossoluja.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut ovat leukemiasoluja tai luuydinsoluja.

10. Menetelmä tautien, joille on tyypillistä endoteelisolujen proliferaatio, diagnostisoimiseksi tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet 111267 a) otetaan kudosnäyte potilaasta, jolla epäillään olevan tauti jolle on tyypillistä endoteelisolujen proliferaatio b) saatetaan mainittu kudosnäyte kosketukseen detektoitavasti leimatun Tie:n solunulkoista osaa tunnistavan, patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen vasta-aineen 5 kanssa, c) pestään mainittu kudosnäyte ja d) tunnistetaan mainitun detektoitavasti leimatun anti-Tie vasta-aineen läsnäolo mainitussa kudosnäytteessä.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tauti on neoplastinen 10 tauti, kuten leukemia, tai tauti, johon liittyy tuumoriangiogeneesi, haavan parantuminen, tromboembolinen tauti, ateroskleroosi tai tulehdukselliset tauti.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tauti on megakaryoplastinen leukemia, gliooma, meningiooma, metastaattinen melanooma, hemangioblastooma tai hemangioperisytooma.

13. Jonkun patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen solunulkoista osaa tunnistavan detektoitavasti leimatun vasta-aineen käyttö valmistettaessa neovaskularisaation kuvantamiseksi organismissa tarkoitettua valmistetta.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu leimattu vasta-aine on leimattu 99m-technetiumilla.

15. Jonkun patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että detektio suoritetaan käyttäen gammakameraa tai Single Photon Emission Computerized Tomographiaa, SPECT.

16. Menetelmä diagnostisoida ja/tai monitoroida syövän tautivaihetta, tunnettu siitä, että se * * käsittää vaiheet 25 a) otetaan seeruminäyte potilaalta, jonka epäillään sairastavan tautia, jolle on tyypillistä endoteelisolujen proliferaatio b) saatetaan mainittu seeruminäyte kosketukseen detektoitavasti leimatun Tie:n solunulkoista osaa tunnistavan, patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisen vasta-aineen kanssa, 30 c) tunnistetaan mainitun detektoitavasti leimatun anti-Tie vasta-aineen läsnäolo mainitussa seeruminäytteessä.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että taudin vaiheeseen liittyy etäpesäkkeitä. 111267

18. Jonkun patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että detektiovaihe suoritetaan sandwich-tyyppisellä testillä.

19. Farmaseuttinen kompositio, tunnettu siitä, että se sisältää terapeuttisesti tehokkaan määrän Tie:n solunulkoista osaa tunnistavaa, patenttivaatimuksen 1 mukaista vasta-ainetta 5 farmaseuttisesti hyväksyttävässä laimennusaineessa, adjuvantissa tai kantajassa.

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen farmaseuttinen kompositio, tunnettu siitä, että anti-Tie vasta-aineen tehokas määrä on noin 1 mg/ml - 10 mg/ml.

21. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen Tie:n solunulkoista osaa tunnistavan vasta-aineen käyttö valmistettaessa taudin, jolle on tyypillistä endoteelisolujen epänormaalia kasvu, oireiden 10 lievittämiseksi tarkoitettua valmistetta. 111267