FI111267B - Antibody against a Tie-receptor tyrosine kinase - used to diagnose and treat neoplastic diseases and for radiological imaging - Google Patents
Antibody against a Tie-receptor tyrosine kinase - used to diagnose and treat neoplastic diseases and for radiological imaging Download PDFInfo
- Publication number
- FI111267B FI111267B FI963901A FI963901A FI111267B FI 111267 B FI111267 B FI 111267B FI 963901 A FI963901 A FI 963901A FI 963901 A FI963901 A FI 963901A FI 111267 B FI111267 B FI 111267B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- tie
- antibody
- cells
- disease
- antibodies
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
111267 TIE-RESEPTORIA TUNNISTAVAT VASTA-AINEET JA NIIDEN KÄYTTÖ111267 ANTIBODIES RECOGNIZING THE ROAD RECEPTOR AND THEIR USE
Keksintö koskee yleisesti vasta-aineita, jotka reagoivat Tie-tyrosiinikinaasireseptorin kanssa, joka löytyy erilaisissa endoteelisoluissa ja joissakin tuumorisolupolulaatioissa. Lisäksi esillä oleva keksintö koskee 5 menetelmiä tämänkaltaisten vasta-aineiden tuottamiseksi ja näiden käyttöä. Erityisesti esillä oleva keksintö koskee anti-Tie monoklonaalisia vasta-aineita diagnostisina välineinä eräiden hematopoieettisten solujen ja hematologisten ja angiogeneettisten tautien tunnistamiseksi, sekä verisuonten kuvantamiseksi ja terapeuttisena aineena.The invention generally relates to antibodies that react with the Tie tyrosine kinase receptor found in various endothelial cells and in some tumor cell populations. Furthermore, the present invention relates to methods for producing and using such antibodies. In particular, the present invention relates to anti-Tie monoclonal antibodies as diagnostic tools for the identification of certain hematopoietic cells and hematological and angiogenic diseases, as well as for vascular imaging and as a therapeutic agent.
10 TEKNIIKAN TAUSTA10 TECHNICAL BACKGROUND
Kardiovaskulaariset taudit ja syöpä ovat hyvin tavallisia läntisissä maissa, ja nämä tautiryhmät ovat taloudellisesti tärkeitä, koska näitä tauteja sairastavat potilaat ovat yleensä työkyvyttömiä ja tarvitsevat hoitoa pitkinä ajanjaksoina. Verisuonilla on tärkeä rooli kardiovaskulaaristen tautien 15 kehittymisessä, kuten myös syövän patogeneesissä. Verisuonitautien kehittymisessä verisuonten sisäpintojen endoteelisoiut ovat keskeisessä asemassa. Traumat ja endoteelisolujen metaboliset häiriöt aiheuttavat ns. ateromaplakkeja ja lopuksi arterioskleroosia. Tuumorisolujen kasvutekijöiden kautta endoteelisolujen stimulaatiolla indusoima verisuonien 20 uudismuodostus, neovaskularisaatio, on tärkeä tekijä erilaisissa syövissä. Kokeellisten tutkimusten kautta tiedetään, että jotta solut voisivat kehittyä ja kasvattaa syöpäpesäkkeitä, ne tarvitsevat neovaskularisaatiota ravinteiden ja hapen saannin varmistamiseksi kasvavaan kudokseen.Cardiovascular disease and cancer are very common in Western countries and these groups of diseases are economically important because patients with these diseases are usually incapacitated and need treatment for long periods. Blood vessels play an important role in the development of cardiovascular diseases, as well as in the pathogenesis of cancer. Endothelial cells in the blood vessels play a central role in the development of vascular diseases. Traumas and endothelial cell metabolic disorders cause so-called. atheroma plaques and finally arteriosclerosis. Through tumor cell growth factors, neovascularization, induced by stimulation of endothelial cells, is an important factor in various cancers. It is known from experimental studies that in order for cells to develop and grow cancerous colonies, they need neovascularization to ensure the supply of nutrients and oxygen to the growing tissue.
Erilaistuneiden solujen ja kudosten kehityksestä, ylläpidosta ja 25 korjauksesta vastaava solukäyttäytyminen säädellään pääosin solunvälisillä signaaleilla kasvutekijöiden ja vastaavien ligandien ja niiden reseptoreiden avulla. Reseptorit sijaitsevat vastaanottavan solun pinnalla ja ne sitovat peptidi- tai polypeptidikasvutekijöitä ja muita hormoninkaltaisia ligandeja. Tämän interaktion tuloksena vastaanottavassa solussa tapahtuu nopeita 30 biokemiallisia muutoksia, jotka johtaavat sekä nopeaan että pitkäaikaiseen solun geeniekspression säätelyyn. Erilaisten solupintojen monet reseptorit voivat sitoa spesifisiä kasvutekijöitä.The cellular behavior responsible for the development, maintenance and repair of differentiated cells and tissues is mainly regulated by intracellular signals through growth factors and related ligands and their receptors. The receptors are located on the surface of the receiving cell and bind peptide or polypeptide growth factors and other hormone-like ligands. As a result of this interaction, the receiving cell undergoes rapid biochemical changes, leading to both rapid and long-term regulation of cellular gene expression. Many receptors on different cell surfaces can bind specific growth factors.
2 1112672, 111267
Tyrosiinin fosforylaatio muodostaa erään avainmuodon plasmamembraanien signaalinvälityksessä. Tällä hetkellä tunnetaan useita polypeptidikasvutekijöiden ja -hormonien transmembraanisia reseptoreita koodittavia tyrosiinikinaasigeenejä, kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF), 5 insuliini, insuliininkaltainen kasvutekijä, (IGF-I), verihiutalekasvutekijät (PDGF-AA, AB ja BB) ja fibroblastikasvutekijöitä (FGFs). Katso esim. Heidin ja Westermark, Cell Reg., 1:555-556 (1990); Ullrich ja Schlessinger, Cell, 61:2243-354, (1990). Endoteelisolujen kasvutekijäreseptorit ovat erityisen kiinnostavia, johtuen kasvutekijöiden kuten FGF:n mahdollisesta liittymisestä ίο useisiin fysiologisesti ja patologisesti tärkeisiin tapahtumiin: angiogeneesiin, arterioskleroosiin ja tulehduksellisiin tauteihin (Folkman ja Klagsbrun,Tyrosine phosphorylation forms a key form of signaling in plasma membranes. Several tyrosine kinase genes encoding transmembrane receptors for polypeptide growth factors and hormones are currently known, such as epidermal growth factor (EGF), insulin, insulin-like growth factor, (IGF-I), platelet-derived growth factors (PDGF-AA, ABb) and BB. See, e.g., Heidin and Westermark, Cell Reg., 1: 555-556 (1990); Ullrich and Schlessinger, Cell, 61: 2243-354, (1990). Growth factor receptors on endothelial cells are of particular interest due to the potential association of growth factors such as FGF with a number of physiologically and pathologically important events: angiogenesis, arteriosclerosis and inflammatory diseases (Folkman and Klagsbrun,
Science, 235:442-447, 1987). Useiden hematopoieettisten kasvutekijöiden reseptorit ovat myös tyrosiinikinaaseja. Näihin lukeutuvat pesäkestimuloivan tekijän 1 reseptori j(Sherr et ai., Cell, 41:665-676, 1985) ja c-kit, 15 kantasolutekijäreseptori (Huang et ai., Cell, 63:225-233, 1990).Science, 235: 442-447, 1987). A number of hematopoietic growth factor receptors are also tyrosine kinases. These include the colony stimulating factor 1 receptor j (Sherr et al., Cell, 41: 665-676, 1985) and the c-kit, 15 stem cell factor receptor (Huang et al., Cell, 63: 225-233, 1990).
Reseptorityrosiinikinaasit voidaan jakaa kehitysbiologisesti alaperheisiin rakenteellisten yhtäläisyyksiensä ja eroavaisuuksiensa perusteella. Nämä proteiinit eroavat toisistaan spesifisyytensä ja affiniteettinsä suhteen (Ullrich and Schlessinger, supra). Yleisesti ottaen, 20 reseptorityrosiinikinaasit ovat glykoproteiineja, jotka muodostuvat solunulkoisesta osasta, joka pystyy sitomaan kasvutekijän, transmembraanisesta osasta, joka yleensä on proteiinin alfa-kierteinen osa, membraaninläheisestä osasta, joka saattaa säädellä reseptoria, esim. proteiinifosforylaation avulla, tyrosiinikinaasiosasta, joka muodostaa : 25 reseptorin entsymaattisen osan, sekä karboksiterminaalipäästä, joka monessa reseptorissa liittyy spesifisten substraatien tunnistamiseen ja sitomiseen.Receptor tyrosine kinases can be subdivided into developmental biologics based on their structural similarities and differences. These proteins differ in their specificity and affinity (Ullrich and Schlessinger, supra). Generally speaking, receptor tyrosine kinases are glycoproteins composed of an extracellular portion capable of binding a growth factor, a transmembrane portion, which is generally an alpha helical portion of a protein, a membrane proximal portion that may regulate a receptor, e.g. the enzymatic moiety, as well as the carboxy-terminal end involved in the identification and binding of specific substrates at many receptors.
Hiljattain on kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 93/14124 kuvattu uusi endoteelisolureseptorityrosiinikinaasi nimeltään Tie. Tie on akronyymi, 30 joka on johdettu sanoista Tyrosine kinase containing Immunoglobulin- and EGF-like domains (tyrosiinikinaasi jossa on immuunoglobuliini- ja EGF-kaltaisia osia). Tie on hyödyllinen endoteelisoluihin ja niiden Tie-reseptoreihin liittyvien tautien diagnostiikassa ja hoidossa, kuten tuumoriangiogeneesiin liittyvissä neoplastisissa taudeissa, haavan 35 paranemisessa, tromboembolisissa taudeissa, ateroskleroosissa ja tulehduksellisissa taudeissa.Recently, International Patent Publication No. WO 93/14124 describes a novel endothelial cell receptor tyrosine kinase called Tie. The pathway is an acronym derived from Tyrosine kinase containing Immunoglobulin and EGF-like domains (tyrosine kinase with immunoglobulin and EGF-like domains). The pathway is useful in the diagnosis and treatment of diseases associated with endothelial cells and their Tie receptors, such as neoplastic diseases associated with tumor angiogenesis, wound healing, thromboembolic diseases, atherosclerosis, and inflammatory diseases.
111267 3111267 3
Keksijät ovat nyt tuottaneet monoklonaalisia vasta-aineita Tie endoteelisolureseptorityrosiinikinaasin solun ulkoista osaa vastaan. Näitä vasta-aineita on käytetty Tie:n tunnistamiseksi soluviljelmistä ja in vivo immunohistologisissa testeissä. Tulokset osoittavat, että vasta-aineita, jotka 5 spefisesti tunnistavat Tie:n solunulkoisia osia, voidaan käyttää hematopoieettisten ja endoteelisten solujen monitoroimiseksi kudosnäytteissä ja organismissa, sekä erilaisten syöpätuumoreiden diagnosoinnissa.The inventors have now produced monoclonal antibodies to the outer part of the cell endothelial cell receptor tyrosine kinase. These antibodies have been used to identify Tie in cell cultures and in vivo immunohistological assays. The results show that antibodies that specifically recognize the extracellular portions of Tie can be used to monitor hematopoietic and endothelial cells in tissue samples and in the body, and in the diagnosis of various cancers.
LYHYT SELOSTUS KUVISTABRIEF DESCRIPTION OF THE PICTURES
Kuva 1 edustaa MOLT-4 ja HEL solujen analyosintia Tie:n suhteen ίο immunofluoresenssin ja flovv-sytometrian avulla.Figure 1 represents an analysis of Tie for MOLT-4 and HEL cells by immunofluorescence and flovv cytometry.
Kuva 2 osoittaa Tie:n immunoperoksidaasivärjäystä ihmisen verisoluissa.Figure 2 shows immunoperoxidase staining of Tie in human blood cells.
Kuvassa 3 esitetään 125l-leimatun monoklonaalisen vasta-aineen, 3C4C7G6, 15 jakautuminen ja sitoutuminen valikoituihin kohdekudoksiin hiiressä, jossa on 8 vuorokautinen paraneva haava.Figure 3 shows the distribution and binding of 125 I-labeled monoclonal antibody, 3C4C7G6, to selected target tissues in a mouse with an 8-day healing wound.
Kuva 4. Tie:n immunohistokemiallinen värjäys aivokudoksessa: normaali, glioblastoma multiforme ja melanoman etäispesäke. Mittapylväs: 0.05 mm.Figure 4. Immunohistochemical staining of Tie in brain tissue: normal, glioblastoma multiforme and metastatic melanoma. Measuring column: 0.05 mm.
2020
Kuva 5. Hemangioblastoman ja hemangioperisytoman immunohistokemiallinen värjäys käyttäen Tie, vWF tai CD44 endoteelisolu-spesifisinä markkereina (40x).Figure 5. Immunohistochemical staining of hemangioblastoma and hemangioperytoma using Tie, vWF or CD44 as endothelial cell specific markers (40x).
Kuva 6. Anti-TIE vasta-aineen 10F 11 jakaantumisen (%ID/g) tärkeisiin 25 elimiin 48, 72, 96 ja 120 tunnin jälkeen (N= 3, 3, 3 ja 4)Figure 6. Distribution (% ID / g) of anti-TIE antibody 10F11 to important organs after 48, 72, 96 and 120 hours (N = 3, 3, 3 and 4)
Kuva 7. Anti-TIE vasta-aineen 3c4 jakaantuminen (%ID/g) tärkeisiin elimiin 48, 72, 96 ja 120 tunnin jälkeen (N= 3, 3, 7, 2 ja 4)Figure 7. Distribution (% ID / g) of 3c4 anti-TIE antibody to important organs after 48, 72, 96 and 120 hours (N = 3, 3, 7, 2 and 4)
Kuva 8. Radioaktiivisuuden kerääntyminen 48, 96 ja 120 tunnissa 10F11 vasta-aineella, ja 6, 24, 48, 96 ja 120 tunnissa 3c4 vasta-aineella. 1Figure 8. Radioactivity accumulation at 48, 96, and 120 hours with 10F11 antibody, and at 6, 24, 48, 96, and 120 hours with 3c4 antibody. 1
Kuva 9. Standardikäyrä neljälle eri vasta-aineparille (kiinnitetty / leimattu vasta-aine) 111267 4Figure 9. Standard curve for four different pairs of antibodies (fixed / labeled antibody) 111267 4
Kuva 10. Yksilölliset Tie-antigeenikonsentraatiot ^g/l) rintasyöpä- (N=2), munasarjasyöpä- (N=5) ja piensolukeuhkosyöpäpotilaiden (N=6) seeruminäytteessä. Referenssinäytteet (N=20) ovat ei-syöpäpotilaista.Figure 10. Individual Tie antigen concentrations (g / l) in a serum sample of patients with breast cancer (N = 2), ovarian cancer (N = 5), and small cell lung cancer (N = 6). Reference samples (N = 20) are from non-cancer patients.
KEKSINNÖN KUVAUSDESCRIPTION OF THE INVENTION
5 Esillä olevan keksinnön eräässä käyttömuodossa kuvataan diagnostisia menetelmiä joilla voidaan monitoroida hematopoieettisia soluja ja endoteelisoluja kudosnäytteistä ja koko organismeista. Toisessa käyttömuodossa esillä oleva keksintö koskee kliinisiä detektiomenetelmiä, joilla kuvataan endoteelisolujen tilaa (trauma, kasvu, jne.) sekä menetelmiä io endoteelisolujen, ja siten vaskulaarisen kasvun, tunnistamiseksi organismissa. Esillä oleva keksintö koskee vasta-aineita, jotka tunnistavat Tie:n. Edullisessa käyttömuodossa keksinnön mukaiset vasta-aineet tunnistavat Tie:n solunulkoisia osia.One embodiment of the present invention describes diagnostic methods for monitoring hematopoietic cells and endothelial cells in tissue samples and in whole organisms. In another embodiment, the present invention relates to clinical detection methods which describe the condition of the endothelial cells (trauma, growth, etc.) and methods for detecting endothelial cells, and thus vascular growth, in the body. The present invention relates to antibodies that recognize Tie. In a preferred embodiment, the antibodies of the invention recognize extracellular portions of Tie.
Toisessa edullisessa käyttömuodossa keksintö koskee 15 monoklonaalisia vasta-aineita, jotka spesifisesti tunnistavat Tie-reseptorin solunulkoisen osan eri epitooppeja. Esillä oleva keksintö koskee erityisesti monoklonaalisia vasta-aineita 3C4C7G6 ja 10F11G6. Monoklonaalisia vasta-ainetta 3C4C7G6 tuottava hybridomasolulinja on Budapestin sopimuksen mukaisesti talletettu deponointilaitokseen Deutsche Sammlung von 20 Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) (DSM deponointinumero ACC2159).In another preferred embodiment, the invention relates to monoclonal antibodies that specifically recognize various epitopes on the extracellular part of the Tie receptor. The present invention relates in particular to the monoclonal antibodies 3C4C7G6 and 10F11G6. The hybridoma cell line producing the monoclonal antibody 3C4C7G6 has been deposited with the Depository Deutsche Sammlung von 20 Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) (DSM Accession Number ACC2159) pursuant to the Budapest Treaty.
: : Tunnistettavalla merkkiaineella leimatut vasta-aineet on myös kuvattu.:: Antibodies labeled with a recognizable marker have also been described.
Tässä käytetään käsitettä tunnistettava merkkiaine tarkoittaen mitä tahansa alan ammattimiehelle tunnettua tunnistettavaa merkkiainetta. Edullisessa 25 keksinnön mukaisessa käyttömuodossa tosin tunnistettava merkkiaine on valittu ryhmästä, johon kuuluu radioisotoopit, fluorokromit, väriaineet, entsyymit ja biotiini. Keksinnölle sopivia radioisotooppeja ovat esim. 125l ja 1311, rajoittumatta kuitenkaan vain nähin.As used herein, the term recognizable marker means any recognizable marker known to those skilled in the art. In a preferred embodiment of the invention, however, the detectable marker is selected from the group consisting of radioisotopes, fluorochromes, dyes, enzymes, and biotin. Suitable radioisotopes for the invention include, but are not limited to, 125I and 1311.
Esillä oleva keksintö koskee myös monoklonaalisia vasta-aineita, jotka 30 on konjugoitu kuvannettavissa olevaan aineeseen. Tässä yhteydessä käsite kuvannettavissa oleva aine kattaa radioisotoopit, rajoittumatta silti nähin. Edullinen radioisotooppi on 99m-teknetium.The present invention also relates to monoclonal antibodies conjugated to an imaging agent. In this context, the term imaginable substance encompasses radioisotopes, but is not limited to what I see. A preferred radioisotope is 99m technetium.
111267 5111267 5
Esillä oleva keksintö koskee lisäksi menetelmää, jolla detektoidaan ja identifioidaan niitä ihmisen kudoksia, joissa tapahtuu neovaskularisaatiota, joka menetelmä koostuu vaiheista (a) otetaan kudos- ja/tai kehonestenäyte, jossa epäillään 5 neovaskularisaatiota tapahtuvan, ja (b) saatetaan tämä näyte yhteyteen Tie-spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa monoklonaalisen vasta-aineen ja antigeenin kompleksoitumiselle sopivissa olosuhteissa, ja (c) detektoidaan muodostunut kompleksi.The present invention further relates to a method of detecting and identifying human tissues undergoing neovascularization, comprising the steps of (a) obtaining a tissue and / or body fluid sample suspected of having neovascularization, and (b) contacting the sample with with a specific monoclonal antibody under conditions suitable for complexing the monoclonal antibody and antigen; and (c) detecting the resulting complex.
ίο Tämän menetelmän avulla detektoitavissa oleva kudos on normaalikudos, syövän esiaste tai kiinteä syöpätuumori, jossa on Tie-sisältäviä endoteelisoluja tai leukemiasoluja, jotka ilmentävät Tie-reseptoria. Eräässä keksinnön mukaisessa käyttömuodossa monoklonaalinen vasta-aine on leimattu tunnistettavissa olevalla merkkiaineella, kuten edellä kuvataan.The tissue detectable by this method is normal tissue, a precursor of cancer, or a solid tumor containing Tie-containing endothelial cells or leukemia cells expressing the Tie receptor. In one embodiment of the invention, the monoclonal antibody is labeled with a recognizable marker as described above.
15 Keksinnön mukaiset menetelmät ovat hyödyllisiä eri syöpätyyppien detektoimisessa ja tunnistamisessa.The methods of the invention are useful in the detection and identification of various types of cancer.
Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää, jonka avulla voidaan diagnosoida ja seurata erityyppisten syöpätautien taudinvaihetta, määrittämällä ihmisen seerumissa kiertävää Tie-antigeeniä.The present invention also relates to a method for diagnosing and monitoring the disease state of various types of cancers by determining a circulating Tie antigen in human serum.
20 Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös käyttää Tie-reseptoreiden tunnistamiseksi solunäytteestä, jossa :. menetelmässä solunäyte saatetaan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa yhteen ja detektoidaan monoklonaalisen vasta-aineen sitoutuminen Tie-reseptoriin.The monoclonal antibodies of the invention may also be used to identify Tie receptors in a cell sample in which:. the method comprises contacting a cell sample with a monoclonal antibody and detecting the binding of the monoclonal antibody to the Tie receptor.
25 Keksinnön eräässä edullisessa käyttömuodossa monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää määrättyjen hematopoieettisten solujen, erityisesti B-solulinjan solujen, tunnistamiseksi ja seuraamiseksi.In a preferred embodiment of the invention, the monoclonal antibodies can be used to identify and track specific hematopoietic cells, especially B cell line cells.
Soluseoksen saattaminen kosketukseen keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa voi tapahtua liuoksessa, kuten 30 fluoresenssiaktivoidussa soluseulonnassa, tai se voidaan suorittaa käyttäen kiinteitä kudosnäytteitä, kuten biopsiamateriaalia, tai se voidaan suorittaa käyttäen kiinteään kantajaan sidottuja monoklonaalisia vasta-aineita, kuten 6 11126/ pylväskromatografiassa, tai suoraa immunoadherenssia. Monoklonaalisen vasta-aineen kanssa reagoiva soiuseos voi olla mikä tahansa verisoluja tai kudossoluja sisältävä liuos. Edullisesti soiuseos on peräisin nisäkkään normaalisoluista, nisäkkään luuytimestä tai verenkierrosta, tai kudoksesta jota 5 epäillään tuumoriksi, erityisesti normaalisoluista, leukemiasoluista ja kiinteistä tuumorisoluista. Kun soiuseos on saatettu yhteyteen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, ne solut joissa on Tie-reseptoreita sitoutuvat monoklonaaliseen vasta-aineeseen muodostaen vasta-aine-Tie-reseptorikompleksin. Tämän vasta-aine-Tie-reseptorikompleksin, ja siten Tie-10 reseptorin, tunnistaminen voidaan suorittaa käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä. Nämä menetelmät ovat mm. ELISA, IRMA (sandwich-tyyppinen immunokemiallinen menetelmä), immunohistokemia, 125l-leimattu RIA ja autoradiografia.Contacting the cell mixture with the monoclonal antibodies of the invention may be in solution, such as in fluorescence-activated cell screening, or may be accomplished using solid tissue samples such as biopsy material, or may be performed using solid support-bound monoclonal antibodies such as direct immunoadherence. The cell mixture that reacts with the monoclonal antibody may be any solution containing blood cells or tissue cells. Preferably, the cell mixture is derived from mammalian normal cells, mammalian bone marrow or circulation, or tissue suspected of being a tumor, especially normal cells, leukemia cells, and solid tumor cells. When the cell mixture is contacted with the monoclonal antibody, the cells having the Tie receptors bind to the monoclonal antibody to form the antibody-Tie receptor complex. Identification of this antibody-Tie receptor complex, and thus the Tie-10 receptor, can be accomplished using methods known in the art. These methods include e.g. ELISA, IRMA (sandwich-type immunochemical method), immunohistochemistry, 125 I-labeled RIA and autoradiography.
Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää verisuonten 15 uudismuodostuksen kuvantamiseksi ihmispotilaalla haavan paranemisessa, tulehdustilassa tai tuumorissa. Tässä menetelmässä annetaan leimattuja vasta-aineita ja tunnistetaan kuvantamisen avulla ne kohteet, joissa esiintyy uusien suonten muodostumiseen liittyviä endoteelisoluja, tai detektoidaan leukemiasoluja veressä, luuytimessä tai kudoksessa.The present invention also relates to a method of imaging neovascularization in a human patient in wound healing, inflammatory condition, or tumor. This method involves the administration of labeled antibodies and imaging to identify targets that present endothelial cells involved in the formation of new vessels, or to detect leukemia cells in the blood, bone marrow, or tissue.
20 Keksinnön mukaiset humanisoidut monoklonaaliset vasta-aineet ovat hyödyllisiä hoidettaessa neoplastisia tauteja, joihin liittyy Tie-reseptoreita omaavia endoteelisoluja, antamalla terapauttisesti tehokas määrä anti-neoplastista terapeuttista ainetta liitettynä sellaiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen tällaista tautia potevalle potilaalle. Terapeuttisesti tehokas määrä 25 terapeuttista ainetta tarkoittaa sellaista määrää aineita, joka estää tuumorin kasvua, edullisesti aiheuttaen neoplastisten solujen kuolemaa ja neoplastisten solujen kokonaismäärän laskua elimistössä. Esimerkkejä tällaisista terapeuttisista aineista ovat esim. 90Y-radioisotooppiin tai toksiinikonjugaattiin, kuten risiiniin, tai erilaisiin mikrobitoksiineihin sidotut 30 vasta-aineetThe humanized monoclonal antibodies of the invention are useful in treating neoplastic diseases involving Tie receptor endothelial cells by administering a therapeutically effective amount of an anti-neoplastic therapeutic agent coupled to such a monoclonal antibody to a patient with such a disease. A therapeutically effective amount of a therapeutic agent is an amount that inhibits tumor growth, preferably causing neoplastic cell death and a decrease in the total number of neoplastic cells in the body. Examples of such therapeutic agents are, for example, antibodies bound to a 90Y radioisotope or a toxin conjugate such as ricin or various microbitoxins.
Leukemian hoitoon tarkoitetun aineen konjugointi monoklonaaliseen vasta-aineeseen voidaan suorittaa käyttäen sinänsä tunnettuja menetelmiä, kuten esim. julkaisussa Press et ai, J. Clin.Oncol. 7:1027-1038 (1989) kuvataan. Edullisesti monoklonaalisen vasta-aineen konjugointikohta 35 sijaitsee kohdassa, joka ei ole lähellä monoklonaalisen vasta-aineen Tie- 111267 7 reseptoriin sitoutumiskohta. On myös edullista, että terapeuttisen aineen konjugointikohta on eri toiminnallinen ryhmä kuin terapeuttisen aineen aktiivikohta. Edullisemmin konjugointikohta on myös sellaisessa kohdassa että rakenteelliset muutokset monoklonaalisessa vasta-aineessa tai 5 terapeuttisessa aineessa pysyvät minimissä.Conjugation of a substance for the treatment of leukemia to a monoclonal antibody may be performed using methods known per se, such as, for example, in Press et al., J. Clin.Oncol. 7: 1027-1038 (1989). Preferably, the monoclonal antibody conjugation site 35 is located at a site which is not close to the monoclonal antibody Tie111267 7 receptor binding site. It is also preferred that the conjugation site of the therapeutic agent is a different functional group than the active site of the therapeutic agent. More preferably, the conjugation site is also at a point where structural changes in the monoclonal antibody or therapeutic agent are kept to a minimum.
Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää hoitaa neoplastisia tauteja, jossa annetaan terapeuttisesti tehokas määrä terapeuttista ainetta konjugoituna keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen sitovaan fragmenttiin, jossa on vasta-aineen spesifisen sitoutumisen aikaansaavat ίο osat. Sopivia ovat sellaiset sitovat fragmentit joiden koko ja rakenne on riittävä mahdollistaakseen Tie-reseptoriin sitoutumista. Tällaisia fragmentteja voidaan valmistaa käyttäen lukuisia menetelmiä, jotka ovat sinällään tunnettuja. Tuotetut sitoutumisfragmentit voidaan seuloa Tie-reseptoriin sitoutumiskykynsä perusteella, käyttäen Esimerkissä 5 kuvattua 15 sitoutumistestiä.The present invention also relates to a method of treating neoplastic diseases comprising administering a therapeutically effective amount of a therapeutic agent conjugated to a binding moiety of the monoclonal antibody of the invention having the specific portions of the antibody that bind the antibody. Suitable binding fragments are of sufficient size and structure to allow binding to the Tie receptor. Such fragments can be prepared using a variety of methods known per se. The resulting binding fragments can be screened for Tie receptor binding ability using the 15 binding assays described in Example 5.
Esillä olevan keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden annolla tarkoitetaan monoklonaalista vasta-ainetta aktiivisena aineena sisältävän farmaseuttisen komposition sopivan määrän antoa. Aktiivisen aineen lisäksi farmaseuttinen kompositio voi sisältää sopivia puskureita, 20 laimennus- ja lisäaineita. Sopivia puskureita ovat mm. Tris-HCI, astaatti, glysiini ja fosfaatti, edullisesti pH:n 6.5 - 7.5 omaava fosfaattipuskuri. Sopivia laimennusaineita ovat steriilit NaCklla, laktoosilla tai mannitolilla, edullisesti NaCUla, isotonisiksi säädetyt vesiliuokset. Sopivia lisäaineita ovat albumiini tai helartiini, jotka estävät pinta-absorption, detergentit (kuten TWEEN 20™, 25 TWEEN 80™), solubilisointiaineet (esim. glyseroli, polyetyleeniglykoli), antioksidantit (esim. askorbiinihappo, natriummetabisulfiitti) ja säilöntäaineet (esim. THIMERSOL™, bentsyylialkoholi, parabeeni).Administration of the monoclonal antibodies of the present invention means the administration of an appropriate amount of a pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody as an active agent. In addition to the active ingredient, the pharmaceutical composition may contain suitable buffers, diluents, and additives. Suitable buffers include e.g. Tris-HCl, acetate, glycine and phosphate, preferably a phosphate buffer having a pH of 6.5 to 7.5. Suitable diluents include sterile aqueous solutions of NaCl, lactose or mannitol, preferably NaCl. Suitable additives include albumin or helartin which inhibit surface absorption, detergents (such as TWEEN 20 ™, 25 TWEEN 80 ™), solubilizers (e.g., glycerol, polyethylene glycol), antioxidants (e.g., ascorbic acid, sodium metabisulfite) and preservatives (e.g. , benzyl alcohol, paraben).
Anto voi tapahtua tavanomaisella tavalla, kuten suonensisäisesti, ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti. Suonensisäinen antotapa on edullinen.Administration may be by conventional means such as intravenous, subcutaneous or intramuscular administration. Intravenous administration is preferred.
30 Antotapa voi olla kerta-annos tai se voidaan suorittaa sopivan määräisinä jaettuina annoksina.The mode of administration may be a single dose or may be administered in appropriate amounts in divided doses.
Edullisesti farmaseuttinen valmiste on yksikköannosmuodossa. Tällöin valmiste on jaettu yksikköannoksiin, joissa on sopiva määrä aktiivista ainetta, esim. halutun tuloksen saavuttava tehokas määrä.Preferably, the pharmaceutical preparation is in unit dosage form. The preparation is then subdivided into unit doses containing a suitable amount of the active ingredient, e.g., an effective amount to achieve the desired effect.
111267 8111267 8
Varsinainen käytetty annos voi vaihdella riippuen potilaan tarpeista ja hoidettavan tilan vakavuudesta. Oikean annoksen määrittäminen määrätyssä tilanteessa on alan ammatti-ihmisen määritettävissä. Yleisesti hoito aloitetaan pienemmällä annoksella, annoksella joka on optimiannosta 5 pienempi. Tästä annostusta lisätään vähitellen kunnes saavutetaan tilanteeseen nähden optimaalinen teho. Käytännössä päivittäinen kokonaisannos voidaan jakaa osiin ja antaa haluttaessa joko jatkuvana tai erillisinä annoksina päivän aikana. Annoksen määrä ja antokertojen toistuvuus säädetään hoitavan lääkärin arvion mukaisesti, huomioiden io sellaiset tekijät kuten potilaan ikä, yleiskunto ja paino, sekä myös hoidettavan taudin vakavuus.The actual dose used may vary depending on the needs of the patient and the severity of the condition being treated. Determination of the correct dosage for a given situation is within the skill of the art. Generally, treatment is initiated at a lower dose, less than the optimal dose. This dosage is gradually increased until optimum efficacy is achieved. In practice, the total daily dose may be divided and administered as desired, either continuously or in separate portions throughout the day. The dosage and frequency of administration are adjusted according to the judgment of the attending physician, taking into account factors such as age, general condition and weight of the patient, as well as the severity of the disease being treated.
Tavanomainen esillä olevan keksinnön mukainen edullinen annostus on noin 0.1 - 10 mg vaikuttavaa ainetta vuorokaudessa.The usual preferred dosage according to the present invention is about 0.1 to 10 mg of active ingredient per day.
Hiiren vasta-aineiden kehittäminen ja käyttö terapeuttisina aineina is kärsii siitä, että niiden puoliintumisaika ihmisessä on alhainen koska muodostuu ihmisen anti-hiiri-vasta-ainereaktio (HAMA). Tästä syystä hiiren vasta-aineiden teho potilailla on alhaisempi (Adair et ai., 1990). Vieraiden proteiinien toistuva anto aiheuttaa myös haitallisia sivuvaikutuksia. Monet näistä ongelmista voidaan ratkaista käyttämällä ihmisen monoklonaalisia 20 vasta-aineita. Tällä hetkellä näitä vasta-aineita voidaan tuottaa hiiren monoklonaalisista vasta-aineista käyttäen molekyylibiologisia menetelmiä, joissa hiiren vasta-aineen sitoutumisvuorovaikutuksista vastaava alue (CDR) liitetään ihmisen monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Nämä humanisoidut vasta-aineet sopivat ihmiselle annettavaan immunoterapiaan. Voidaan myös * 25 rakentaa yksiketjuisia vasta-aineita (scFv). Näiden rakentamisessa käytetään eri pituisia linkkerisekvenssejä, kuten Whitlow et ai. on kuvannut julkaisussa Protein Eng., 6(8):989-95, (1993), jolloin optimoidaan vasta-aineen sitoutuminen antigeeniin.The development and use of mouse antibodies as therapeutic agents suffers from the fact that their half-life in humans is low due to the formation of the human anti-mouse antibody response (HAMA). Therefore, the potency of mouse antibodies in patients is lower (Adair et al., 1990). Repeated administration of foreign proteins also causes adverse side effects. Many of these problems can be solved using human monoclonal antibodies. Currently, these antibodies can be produced from murine monoclonal antibodies using molecular biology methods, which associate the murine antibody binding interaction region (CDR) with a human monoclonal antibody. These humanized antibodies are suitable for human immunotherapy. One can also * 25 construct single chain antibodies (scFv). These are constructed using linker sequences of various lengths, such as Whitlow et al. in Protein Eng., 6 (8): 989-95, (1993), whereby the binding of the antibody to the antigen is optimized.
Kuten ylläolevasta ilmenee, esillä olevan keksinnön mukaiset vasta-30 aineet ovat hyödyllisiä tautitilojen (esim. erityyppisten syöpätautien), diagnosoinnissa ja tunnistamisessa, haavan parantumisen tunnistamisessa ja seuraamisessa, erilaisten neoplastisten tautien hoidossa ja ennaltaehkäisyssä. Muut tässä kuvatun aineen käytöt ovat alan ammatti-ihmiselle ilmeiset.As stated above, the antibodies of the present invention are useful in the diagnosis and recognition of disease states (e.g., various types of cancers), in the detection and monitoring of wound healing, in the treatment and prevention of various neoplastic diseases. Other uses of the agent described herein will be apparent to those skilled in the art.
111267 9111267 9
ESIMERKITEXAMPLES
Seuraavat esimerkit annetaan tarkoituksena valaista esillä olevan keksinnön spesifisiä käyttömuotoja rajoittamatta sen suojapiiriä. Alan ammatti-ihminen ymmärtää täysin muiden käyttötapojen ja sovellutusten 5 ilmeisen arvon.The following examples are provided to illustrate specific uses of the present invention without limiting its scope. The obvious value of other uses and applications 5 will be fully understood by those skilled in the art.
ESIMERKKI 1EXAMPLE 1
Tie-reseptorin solunulkoisen osan tuottaminen bakuloviruksen avullaProduction of the extracellular part of the Tie receptor by the baculovirus
Tie-proteiinin cDNA-sekvenssi on kuvattu julkaisussa Partanen J. et ai., Mol. Cell Biol. 12: 1698-1707, (1992), joka täten sisällytetään tähän. Solun ίο ulkoista Tie-osaa koodittava cDNA-sekvenssi monistettiin PCR-menetelmällä ja kloonattiin pVT-Bac-vektorin BamHI-kohtaan (Tessier et ai., Gene, 98:177-183, 1991) käyttäen PCR alukkeina 5'-CGTAGATCTGGCGGTGGACCTGAC-3' ja 5'-GGCCATGATCACTAGTGATGGTGATGGTGATGCTGCTGATCCAGGCC 15 CTCTTCAGC-3'.The cDNA sequence of the Tie protein is described in Partanen J. et al., Mol. Cell Biol. 12: 1698-1707, (1992), which is hereby incorporated herein by reference. The cDNA sequence encoding the outer Tie portion of the cell ηο was amplified by PCR and cloned into the BamHI site of the PVT-Bac vector (Tessier et al., Gene, 98: 177-183, 1991) using 5'-CGTAGATCTGGCGGTGGACCTGAC as PCR primers. and 5'-GGCCATGATCACTAGTGATGGTGATGGTGATGCTGCTGATCCAGGCC CTCTTCAGC-3 '.
X-tekijän pilkkoutumiskohtaa (IEGR) koodittava sekvenssi, jota seuraa kuusi perättäistä histidiinijäännöstä, liitettiin cDNAn 3'-päähän. Täten saatu vektori, pVT-Tie, transfektoitiin hyönteissoluihin Tie:n solun ulkoisen osan ilmentämiseksi.The sequence encoding the Factor X cleavage site (IEGR) followed by six consecutive histidine residues was inserted at the 3 'end of the cDNA. The vector thus obtained, PVT-Tie, was transfected into insect cells to express the outer portion of the Tie cell.
20 pVT-Tie transfektoitiin Baculo Gold bakulovirus-DNA:n kanssa (Pharmingen Cat. 21100D) SF-9 hyönteissoluihin. Virus isolaatit puhdistettiin pesäkemenetelmällä agaroosissa transfektoitujen solujen kasvatusliemestä (TNMFH + 5%FCS) ja seulottiin rekombinanttiproteiinin parhaimman ilmentymisen suhteen High Five hyönteissoluissa (Invitrogen). Yksi isolaatti 25 (BG-3 virus) valittiin suuren skaalan proteiinituotantoon.20 PVT-Road was transfected with Baculo Gold baculovirus DNA (Pharmingen Cat. 21100D) into SF-9 insect cells. Virus isolates were purified from the culture broth (TNMFH + 5% FCS) of cells transfected with agarose and screened for the best expression of recombinant protein in High Five insect cells (Invitrogen). One isolate 25 (BG-3 virus) was selected for large-scale protein production.
High Five solut infektoitiin BG-3-viruksella ja infektoitujen solujen kasvatusliemi (EX-CELL 400, HRH Scientific) otettiin talteen kahden päivän jälkeen. Rekombinantti BG-3-proteiini puhdistettiin kasvatusliemestä ConA-affiniteettikromatografian avulla.High Five cells were infected with BG-3 virus and the infected cells broth (EX-CELL 400, HRH Scientific) was harvested after two days. The recombinant BG-3 protein was purified from the culture broth by ConA affinity chromatography.
ESIMERKKI 2 111267 1 oEXAMPLE 2 111267 1 o
Anti-Tie monoklonaalisen vasta-aineiden tuottaminen Balb/C-hiiressäProduction of Anti-Tie Monoclonal Antibodies in Balb / C Mouse
Kolmen kuukauden ikäiset Balb/C naarashiiret immunisoitiin injisoimalla intraperitoneaalisesti BG-3 (50 pg/hiiri) emulgoituna Freund 's 5 complete adjuvant- apuliuokseen. Kolmen-neljän viikon välein annettiin 50pg täydennysinjektioita ja lopullinen booster-injektio (20 pg BG-3 PBS:ssä suonensisäisesti) vielä kolmen viikon jälkeen. Hiiret lopetettiin neljän päivän kuluttua viimeisen annoksen jälkeen, ja hiiren pernan lymfoidisolut liitetiin SP 2/0 plasmasytoomasoluihin suhteessa 2:1. Fuusiosolut otettiin talteen 96-10 kuopan viljelylevylle (Nunc) Ex-Cell 320 kasvuliemessä (Seralab), jossa oli fetaalivasikanseerumia (FCS, 20%) ja HAT-supplementti (hypoksantiini-aminopteriini-tymidiini, Gibco, 043-01060H, 50x laimennettuna). Solut viljeltiin +37°C:ssa, 5% C02 - ilmassa. Kymmenen päivän jälkeen HAT-supplementoitu liemi vaihdettiin HT-supplementoituun soluviljelyliemeen 15 (Gibco, 043-0106H, 50x laimennettuna). HT-kasvatusliemi oli identtinen HAT-liemeen verrattuna paitsi että aminopteriini puuttui.Three-month-old Balb / C female mice were immunized by intraperitoneal injection of BG-3 (50 pg / mouse) emulsified in Freund's 5 complete adjuvant solution. Every three to four weeks, 50 µg of supplemental injections and a final booster injection (20 µg of BG-3 in PBS intravenously) were given after three weeks. Mice were sacrificed four days after the last dose and mouse spleen lymphoid cells were attached to SP 2/0 plasma cytoma cells in a ratio of 2: 1. Fusion cells were harvested in a 96-10 well culture plate (Nunc) in Ex-Cell 320 growth broth (Seralab) containing fetal calf serum (FCS, 20%) and HAT supplement (hypoxanthine-aminopterin-thymidine, Gibco, 043-01060H, 50x diluted). Cells were cultured at + 37 ° C, 5% CO 2. After 10 days, HAT-supplemented broth was switched to HT-supplemented cell culture broth 15 (Gibco, 043-0106H, 50x diluted). The HT broth was identical to the HAT broth except that aminopterin was absent.
Kaksi - kolme viikkoa fuusion jälkeen tarkistettiin vasta-ainetuotanto esimerkissä 5. kuvatulla antigeenispesifisellä immunofluorometrisellä menetelmällä, IFMA. Pääkloonit kloonattiin rajoittavan laimennoksen avulla 20 (Staszewski, 1984). Positiiviset kloonit laajennettiin 24-kuoppaiseen kudosviljelylevyyn (Nunc), kloonattiin uudelleen ja testattiin uudestaan samalla menetelmällä. Positiiviset kloonit testattiin vielä fluoresenssiaktivoidulla soluerostuksella (FACS). Stabiilit kloonit erittivät IgG-luokkaan kuuluvia immunoglobuliineja.Two to three weeks after the fusion, antibody production was checked by the antigen-specific immunofluorometric method described in Example 5, IFMA. The main clones were cloned by limiting dilution (Staszewski, 1984). Positive clones were expanded into a 24-well tissue culture plate (Nunc), cloned again and retested by the same method. Positive clones were further tested by fluorescence-activated cell isolation (FACS). Stable clones secrete IgG immunoglobulins.
25 Yksi klooni, 3C4C7G6, eritti stabiilisti monoklonaalista vasta-ainetta, jonka IFMAn avulla todettiin kuuluvan immunoglobuliiniluokkaan IgG 1. Hybridoma 3C4C7G6 tallennettiin tallennuslaitokseen German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Department of Human and Animal Cell Cultures and Viruses, Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Germany, 30 joulukuun 2. päivänä, 1993 ja sille annetiin deponointinumero ACC2159.One clone, 3C4C7G6, stably secreted the monoclonal antibody found to be of IgG 1 immunoglobulin class by IFMA. Hybridoma 3C4C7G6 was deposited in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Department of Human and Animal Cell Cultures, Mascheroder Weg 1b. , Germany, December 30, 1993, and was assigned the accession number ACC2159.
Vastaavilla menetelmillä tuotettiin muitakin klooneja, jotka tuottivat Tie-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita samaa tai toista epitooppia vastaan. Eräs sellainen klooni, 10F11G6, valittiin jatkokokeisiin yhdessä ylläkuvatun 3C4C7G6-vasta-aineen kanssa.Other clones were produced by similar methods which produced Tie-specific monoclonal antibodies against the same or another epitope. One such clone, 10F11G6, was selected for further experiments in combination with the 3C4C7G6 antibody described above.
111267 1 1 Käytettiin Balb/C-hiiriä tuottamaan monoklonaalisia vasta-aineita askitesnesteessä. Hybridomat injisoitiin intraperitoneaalisesti (i.p.) hiiriin pristaani-käsittelyn jälkeen (2,6,10,14-tetramethyl-pentadecan 98%, Aldrich-Chemie D-7924 Steinheim, cat.no T 2,280-2). Injisoitiin 0.5 ml pristaania (i.p.) 5 noin kaksi viikkoa ennen kuin hybridomasolut injisoitiin. Injisoitujen solujen määrä oli 7.5 - 9 x 10® hiirtä kohden. Saatu askites otetiin talteen 10-14 päivän kuluttua hybridomainjektion jälkeen, ja siinä oli keskimäärin 0.3 mg/ml vasta-ainetta Esimerkissä 6 kuvatulla antigeenispesifisellä IFMA-testillä määritettynä.11126711 Balb / C mice were used to produce monoclonal antibodies in ascites fluid. The hybridomas were injected intraperitoneally (i.p.) into mice after pristane treatment (98%, 2,6,10,14-tetramethylpentadecan, Aldrich-Chemie D-7924 Steinheim, cat.no T 2,280-2). 0.5 ml of pristane (i.p.) was injected 5 approximately two weeks before the hybridoma cells were injected. The number of cells injected was 7.5-9 x 10® per mouse. The resulting ascites were harvested 10-14 days after the hybrid injection and contained an average of 0.3 mg / ml antibody as determined by the antigen-specific IFMA assay described in Example 6.
10 ESIMERKKI 310 EXAMPLE 3
Anti-Tie monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto Hollow Fiber bioreaktorissaProduction of Anti-Tie Monoclonal Antibodies in Hollow Fiber Bioreactor
Tuotettiin monoklonaalisia vasta-aineita Tiedä vastaan in vitro käyttäen Technomouse System (Cellex Inc.)- bioreaktoria. Kasvatuspullot korkkeineen 15 ja suodattimineen autoklavoitiin ensin 121°C:ssa ja 1.1 bar paineessa puolen tunnin ajan. Tämän jälkeen niihin täytettiin 1L Dulbeccon MEM (Gibco, 042-02501, glukoosia 6.4 g/L, glutamiinia 2 mmoI/L 066-1051 H, Na-pyruvaattia 1 mmol/L 066-1840E). Bioreaktorin pidike siirrettiin aseptisesti Techomouse tarjottimelle. Pumppu ladattiin, ja kasvatusliemiletkut ja tyhjät jätepullot 20 (outflow-letku) kytkettiin aseptisesti.Monoclonal antibodies were produced against Know in vitro using a Technomouse System (Cellex Inc.) bioreactor. Korkkeineen the roller bottles with filter 15 and the first autoclaved at 121 ° C and 1.1 bar pressure for half an hour. They were then filled with 1L Dulbeccon MEM (Gibco, 042-02501, glucose 6.4 g / L, glutamine 2 mmol / L 066-1051 H, Na-pyruvate 1 mmol / L 066-1840E). The bioreactor holder was aseptically transferred to the Techomouse tray. The pump was charged and the culture broth hoses and empty waste bottles 20 (outflow hose) were aseptically connected.
Täyttö- ja huuhteluohjelma suoritettiin kuten valmistaja suosittelee kaiken jäännösmateriaalin poistamiseksi bioreaktorin intrakapillaarisesta tilasta (IC). Ohjelma käynnistettiin 150 ml/h virtausnopeudella 4 tunnin ajan. Tämän jälkeen pesua suoritettiin 50 ml/h virtausnopeudella 20 tuntia, jonka 25 aikana myös pestiin ekstrakapillarinen (EC) tila 5% FCSillä rikastetulla Dulbeccon MEM:llä (DMEM). EC-tilan kasvatusliemi vaihdettiin aseptisesti uuteen liemeen. Vuorokausi tämän jälkeen bioreaktori oli valmis ladattavaksi hybridomasoluilla.The filling and rinsing program was performed as recommended by the manufacturer to remove any residual material from the bioreactor's intracapillary space (IC). The program was started at a flow rate of 150 ml / h for 4 hours. Thereafter, washing was carried out at a flow rate of 50 ml / h for 20 hours, during which the extracapillary (EC) state was also washed with 5% FCS-enriched Dulbecco MEM (DMEM). The EC broth was replaced aseptically with a new broth. One day after that, the bioreactor was ready to be charged with hybridoma cells.
Hybridomasolut kasvatettiin soluviljelypulloissa 10% FCS-DMEM:ssä ja 30 72 x 106 solua otettiin talteen ja ladattiin reaktoriin 5 rnhssa DMEM:ä jossa oli 5% FCS. Intrakapillaarisen tilan virtausnopeus oli 100 ml/h. Kierrätysmenetelmää käytettiin monoklonaalisten vasta-aineiden talteenottamiseksi seuraavasti: kasvatusliemiletku kytkettiin kasvatuspulloon 1 2 111267 "out", jolloin ottettiin kasvatuslientä pullosta bioreaktorin intrakapillaariseen tilaan; outflow-letku kytkettiin kasvatuspulloon "in", jolloin liemi palautettiin pulloon. Monoklonaaliset vasta-aineet otettiin talteen kolme kertaa viikossa, maantaisin, keskiviikkoisin ja perjantaisin, ja joka kerta lisättiin 10 ml uutta 5 2.5% FCS-DMEM:iä.Hybridoma cells were grown in cell culture flasks in 10% FCS-DMEM and 30 72 x 10 6 cells were harvested and loaded into a reactor in 5 µl of DMEM with 5% FCS. The flow rate of the intracapillary space was 100 ml / h. The recycling method was used to recover the monoclonal antibodies as follows: the culture broth tube was connected to the culture flask 1 2 111267 "out" to remove the culture broth from the bottle into the intracapillary space of the bioreactor; The outflow hose was connected to a growth bottle "in", whereupon the broth was returned to the bottle. Monoclonal antibodies were harvested three times a week, on Mondays, Wednesdays, and Fridays, and each time 10 ml of new 5% FCS-DMEM was added.
Anti-BG-3 solulinja, 3C4C7G6, tuotti vasta-ainetta keskimääräisesti 152 pg/ml soluviljelyliemeen. Soluinokuloinnin jälkeen Technomouse System bioreaktoriin (72 x 106 solua) vasta-aineet otettiin talteen 2-3 päivän jaksoina. Keskimääräinen tuotanto oli 4.5 mg/viikko ja kumulatiivinen tuotanto kahden ίο kuukauden aikana oli 37 mg.The anti-BG-3 cell line, 3C4C7G6, produced an average antibody of 152 pg / ml in the cell culture broth. After cell inoculation into the Technomouse System Bioreactor (72 x 10 6 cells), antibodies were harvested in 2-3 day intervals. The average production was 4.5 mg / week and the cumulative production over the two months was 37 mg.
Askitesnesteessä tai Technomouse systeemissä tuotetut vasta-aineet puhdistettiin Affigel™ Protein A MAPS II Kitillä (BioRad) noudattaen valmistajan ohjeita. Pylväs tasapainotettiin puhdistusta varten sitoutumispuskurilla (pH 9.0). Vasta-aine sitoutui proteiini-A-matriisiin 15 sitoutumispuskurissa ja pylväs pestiin sitoutumispuskurilla kunnes saavutettiin perustaso (detektoitiin 280 nm UV-spektrofotometrialla). Spesifisesti sitoutunut materiaali eluoitiin proteiini-Aista eluutiopuskurilla pH 3.0 ja fraktiot kerättiin putkiin, joissa oli 1 mol/L Tris-HCI, pH 9.0, jota tarvittiin neutralisoimaan fraktiot välittömästi. Pylväs regeneroitiin regenerointi-20 puskurilla ja säilytettiin seuraavaa käyttöä varten 50 mmol/L Na-fosfaattipuskurissa, jossa oli 0.05% NaN3 säilöntäaineena.Antibodies produced in ascites fluid or Technomouse system were purified using Affigel ™ Protein A MAPS II Kit (BioRad) according to the manufacturer's instructions. The column was equilibrated for purification with binding buffer (pH 9.0). Antibody bound to protein A matrix in binding buffer and the column was washed with binding buffer until baseline (detected at 280 nm by UV spectrophotometry). The specifically bound material was eluted from the protein A in elution buffer pH 3.0 and the fractions were collected in tubes containing 1 mol / L Tris-HCl, pH 9.0, which was required to immediately neutralize the fractions. The column was regenerated with regeneration buffer 20 and stored for subsequent use in 50 mM Na phosphate buffer containing 0.05% NaN 3 as a preservative.
ESIMERKKI 4EXAMPLE 4
Vasta-aineita bakteerien ilmentämää Tieltä vastaanAntibodies against the pathway expressed by bacteria
Tie cDNAn Bam Hl fragmentti (nukleotidit 520-1087) subkloonattiin 25 pGEXIT vektorin (Pharmacia) Bam Hl kohtaan, jolloin saatiin avoin lukuvaihe, joka koodittaa glutationi-S-transferaasia joka on liitetty Tie-proteiinin aminohappoja 162-350 koodittavaan alueeseen (GST-Tie2). Konstruktio transformoitiin E.coli DH5a-kantaan ja fuusioproteiinin ilmentyminen indusoitiin IPTGin avulla. Saatu 40 kD fuusioproteiini puhdistettiin 30 denaturoivassa agaroosigeelissä (FMC) ja käytettiin immunisaatioissa.The Bam HI fragment of the Tie cDNA (nucleotides 520-1087) was subcloned into the Bam HI site of 25 pGEXIT vector (Pharmacia) to give an open reading sequence encoding glutathione S-transferase fused to the amino acid 162-350 coding region of Tie (GST-Tie2). ). The construct was transformed into E.coli strain DH5a and expression of the fusion protein was induced by IPTG. The resulting 40 kD fusion protein was purified on 30 denaturing agarose gels (FMC) and used for immunizations.
Tuotettiin monoklonaalisia vasta-aineita kuten yllä kuvattiin BG-3 Tie-proteiinia vastaan. Kahden subkloonauksen jälkeen saatiin kahdeksan kloonia, jotka tuottivat vasta-aineita GST-Tie2-proteiinia vastaan. Nämä 1 3 111267 reagoivat suurinpiirtein yhtä hyvin Tie:n kanssa Western immunoblottauksessa. Anti-GST-Tie2-kloonien askites puhdistettiin käyttäen proteiini-A-pylvästä ja käytettiin Western blottauksessa.Monoclonal antibodies were produced as described above against BG-3 Tie protein. After two subcloning, eight clones were obtained which produced antibodies against the GST-Tie2 protein. These 13111267 reacted approximately equally to Tie in Western immunoblotting. The ascites of the anti-GST-Tie2 clones were purified using a protein A column and used for Western blotting.
ESIMERKKI 5 5 Tie-proteiinin leimaus Europium:llaEXAMPLE 5 5 Europium Labeling of Tie Protein
Esimerkissä 1 tuotettu Tie:n solunulkoinen osa, BG-3, leimattiin testikäyttöä varten. Leimaus suoritettiin kuten julkaisussa Mukkala et ai., Anal.Biochem. 176 (2):319-325, (1989) on kuvattu, seuraavin muunnoksin: BG-3-liuokseen (0.5 mg/ml 50 mmol/L boraattipuskurissa, pH 8.6) lisättiin 125 ίο molaarinen ylimäärä isotiosyanaatti-DTTA-Eu (N1-kelaatti, Wallac, Suomi) ja pH säädettiin 9.8:ksi lisäämällä kymmenesosa 0.5 mol/L natriumkarbonaattipuskuria (Merck), pH 9.8. Leimaus suoritettiin yli yön +4°C.ssa. Sitoutumaton leima poistettiin PD-10:llä (Pharmacia, Ruotsi) käyttäen TSA-puskuria (50 mmol/L Tris-HCI, pH 7,8, 0.15 mol/L NaCI) 15 eluointipuskurina.The extracellular portion of Tie produced in Example 1, BG-3, was labeled for test use. Labeling was performed as described in Mukkala et al., Anal.Biochem. 176 (2): 319-325, (1989), with the following modifications: To a BG-3 solution (0.5 mg / ml in 50 mmol / L borate buffer, pH 8.6) was added 125 ul molar excess of isothiocyanate-DTTA-Eu (N chelate, Wallac, Finland) and the pH was adjusted to 9.8 by the addition of a tenth of 0.5 mol / L sodium carbonate buffer (Merck), pH 9.8. The labeling was performed overnight at + 4 ° C. Unbound label was removed with PD-10 (Pharmacia, Sweden) using TSA buffer (50 mmol / L Tris-HCl, pH 7.8, 0.15 mol / L NaCl) as the elution buffer.
Puhdistuksen jälkeen lisättiin 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia (BSA) leimattuun BG-3:een ja leimaa säilytettiin +4°C:ssa.After purification, 1 mg / ml bovine serum albumin (BSA) was added to labeled BG-3 and the label was stored at + 4 ° C.
Sitoutuneen europiumin määrä per BG-3-molekyyli oli 2.9, määritettynä fluoresenssimittauksella ja verrattuna tunnettuihin EUCI3-20 standardeihin (Hemmilä et ai., Anal.Biochem. 137: 335-343, 1984).The amount of bound europium per BG-3 molecule was 2.9 as determined by fluorescence measurement and compared to known EUCI3-20 standards (Hemmilä et al., Anal.Biochem. 137: 335-343, 1984).
: ESIMERKKI 6Example 6
Immunofluorometrinen seulontamenetelmä (IFMA1Immunofluorometric screening method (IFMA1
Tie-reseptoria vastaan tuotetut vasta-aineet seulottiin käyttäen sandvvich-tyyppistä immunofluorometristä menetelmää mikrotitrauslevyn ’ 25 kuopissa (Nunc, polysorb), jotka oli päällystetty kanin anti-hiiren-lg:llä (Z 259,Antibodies raised against the Tie receptor were screened using a sandwich type immunofluorometric assay in '25 wells of a microtiter plate (Nunc, polysorb) coated with rabbit anti-mouse Ig (Z 259,
Dakopatts, Lövgren et ai., Talanta 1984; 31 (10B): 909-916). Esipäällystetyt kuopat pestiin kerran Platewash:lla (1296-024, Wallac) käyttäen DELFIA-pesunestettä. DELFIA-testipuskuria käytettiin laimennuspuskurina soluviljely-supernatanteille ja pernan poistoon käytettyjen hiirien seerumille 30 (laimennokset 1:1000 - 1:100,000), joita käytettiin positiivisena kontrollina : alustavissa seulontakokeissa.Dakopatts, Lövgren et al., Talanta 1984; 31 (10B): 909-916). The pre-coated wells were washed once with Platewash (1296-024, Wallac) using DELFIA wash. The DELFIA assay buffer was used as a dilution buffer for cell culture supernatants and serum from mouse splenectomy 30 (dilutions 1: 1000-1: 100,000) used as a positive control: in preliminary screening experiments.
1 4 1112671 4 111267
Anti-BG-3 / 3C4C7G6 - vasta-ainetta tuotettuna askitesnesteessä ja puhdistettuna Affigel™ Proteiini-A-MAPS:lla käytettiin standardina myöhäisemmissä kokeissa 0.25 ng/ml - 60 ng/ml konsentraatioissa testipuskurissa (1 ΟΟμΙ, DELFIA).Anti-BG-3 / 3C4C7G6 antibody produced in ascites fluid and purified with Affigel ™ Protein A-MAPS was used as a standard in subsequent experiments at concentrations of 0.25 ng / ml to 60 ng / ml in assay buffer (1 µmΙ, DELFIA).
5 Aloitettiin inkubointi 2 tuntia huoneenlämmössä (tai vaihtoehtoisesti yli yön inkubaatio +4°C:ssa) ravistelemalla Plateshaker-laitteessa (1296-001, Wallac) 5 minuutin ajan, jonka jälkeen pestiin neljä kertaa pesuliuoksella kuten yllä kuvattiin.Incubation was started for 2 hours at room temperature (or alternatively overnight incubation at + 4 ° C) by shaking on a Plateshaker (1296-001, Wallac) for 5 minutes, followed by four washes with wash solution as described above.
Eu-leimattua BG-3:a , joka tuotettiin kuten Esimerkissä 4 on kuvattu, ίο lisättiin 10 ng/kuoppa 100 piissä testipuskuria. Viiden minuutin jälkeenEu-labeled BG-3 produced as described in Example 4 was added at 10 ng / well in 100 silicon test buffer. After five minutes
Plateshaker-laitteessa ja tunnin inkubaation jälkeen huoneenlämmössä levyt pestiin kuten yllä kuvattiin.In a Plateshaker and after incubation for 1 hour at room temperature, the plates were washed as described above.
DELFIA-enhancement-liuosta lisättiin 200 μΙ/kuoppa. Levyt ravisteltiin 5 min Plateshaker-laitteessa ja fluoresenssin intensiteetti mitattiin ARCUS-15 1230-laitteella (Wallac) 10-15 min ((Lövgren et ai., In: Collins W.P. (ed), Alternative Immunoassays. John Wiley & Sons Ltd, 1985; 203-216).DELFIA enhancement solution was added at 200 μΙ / well. Plates were shaken for 5 min on a Plateshaker and fluorescence intensity was measured on an ARCUS-15 1230 (Wallac) for 10-15 min ((Lövgren et al., In: Collins WP (ed), Alternative Immunoassays. John Wiley & Sons Ltd, 1985; 203-216).
Sandwich-tyyppinen DELFIA-menetelmä on hyvin herkkä, teoreettinen herkkyys on alle 0.25 ng/ml tällä anti-Tie monoklonaaliselle vasta-aineelle. Vaikka herkkyys oli sopiva soluviljelyssä tuotettujen Mab:ien kvantitointia 20 ajatellen, menetelmä oli käytännöllinen myös in vitro tuotettujen Mab:ien kvantitoinnissa. Lineaarinen alue oli 0.25 ng/ml - 60 ng/ml (Kuva 2). Testin sisäinen vaihtelu todettiin hyvin alhaiseksi.The sandwich type DELFIA method is very sensitive, with a theoretical sensitivity of less than 0.25 ng / ml for this anti-Tie monoclonal antibody. Although the sensitivity was appropriate for quantification of Mabs produced in cell culture, the method was also practical for quantifying in vitro produced Mabs. The linear range was 0.25 ng / ml to 60 ng / ml (Figure 2). The intra-test variability was found to be very low.
ESIMERKKI 7EXAMPLE 7
Radioleimatut monoklonaaliset vasta-aineet Tie-reseptorin in vivo detektiota 25 vartenRadiolabeled monoclonal antibodies for in vivo detection of Tie receptor
Monoklonaalinen vasta-aine 3C4C7G6 leimattiin 125l:lla käyttäen kloramiini-T-menetelmää (Greenwood et ai., Biochem J. 89:114-123, 1963). Käytettiin 1 mCi Na125l :a leimaamaan 40 pg vasta-ainetta. Leimatut vasta-aineet puhdistettiin eluoimalla Sephadex-G25™:llä, jolloin saatiin pääosa 30 leimatusta vasta-aineesta 1.8 ml:ssä.Monoclonal antibody 3C4C7G6 was labeled with 125 I using the chloramine T method (Greenwood et al., Biochem J. 89: 114-123, 1963). 1 mCi of Na125I was used to label 40 pg of antibody. Labeled antibodies were purified by elution with Sephadex-G25 ™ to give the bulk of the 30 labeled antibodies in 1.8ml.
15 111267 l-125-leimattu anti-BG-3 (3C4C7G6) annettiin i.v. kahdessa eri annoksena, 1.2 l-125-leimattu anti-BG-3 (3C4C7G6) annettiin i.v. kahdella eri annostasolla, 1.2 pg ja 2.4 pg Lewis-keuhkokarsinoomaa kantaville hiirille. Leimatun vasta-aineen biodistribuutio hiiressä mitattiin viidessä 5 aikapisteessä: 1)6h (N=4), 2) 24h (N=7), 3) 47h (N=5), 4) 70h (N=3) ja 5) 117h (N=2).1112671-125-labeled anti-BG-3 (3C4C7G6) was administered i.v. in two different doses, 1.2 l-125-labeled anti-BG-3 (3C4C7G6) was administered i.v. at two different dose levels, 1.2 pg and 2.4 pg Lewis lung carcinoma mice. The biodistribution of labeled antibody in the mouse was measured at five 5 time points: 1) 6h (N = 4), 2) 24h (N = 7), 3) 47h (N = 5), 4) 70h (N = 3) and 5) 117h. (n = 2).
Taulukko 1. Biodistribuutio kudoksiin aikapisteissä 1 - 5 ίο _1. 2. 3. 4._5.Table 1. Biodistribution to tissues at time points 1 - 5 ίο _1. 2. 3. 4._5.
% ID/g % ID/g % ID/g % ID/g % ID/g 6 h 24 h 47 h 70 h 117 h blood 36,22871 11,26086 9,343041 7,87285 2,749225 hearth 7,828641 2,842418 1,932395 1,391288 0,548053 aortha 16,07039 5,553582 3,707159 3,166192 0,798207 lung 9,091084 3,823566 3,087934 2,555693 0,987308 liver 6,940821 2,355467 1,770392 1,568976 0,685282 kidney 9,331627 3,490624 2,556933 1,829169 0,802883 brain 0,548253 0,228239 0,149502 0,146163 0,042287 blood vess 22,64432 4,712374 2,435758 2,65011 0,485038 tumour 7,151142 3,620555 3,155919 2,179194 0,901169 spleen 5,840843 2,004754 1,396837 1,195612 0,622342 bladder 6,889924 4,36051 3,628196 3,523912 0,899099 ovarias 8,445497 3,617958 2,622101 2,387713 0,662774% ID / g% ID / g% ID / g% ID / g% ID / g 6h 24h 47h 70h 117h blood 36,22871 11,26086 9,343041 7,87285 2,749225 hearth 7,828641 2.842418 1.932395 1.391288 0.548053 aortha 16.07039 5.553582 3.707159 3.166192 0.798207 lung 9.091084 3.823566 3.087934 2.555693 0.987308 liver 6,940821 2, 355467 1.770392 1.568976 0.685282 kidney 9.331627 3,490624 2,556933 1,829169 0.802883 brain 0.548253 0.2228239 0.149502 0.146163 0.042287 blood Vess 22.64432 4.712374 2,435758 2,65011 0,485038 tumour 7,151142 3,620,555 3,155919 2,179194 0,901169 spleen 5,840843 2,004754 1,396837 1,195612 0,622342 bladder 6,889924 4,36051 3, 628196 3,523912 0,899099 ovarias 8,445497 3,617,958 2,622101 2,387713 0,662774
Tulokset osoittavat, että anti-BG-3 aktiivisuutta oli pääasiallisesti veressä, tuumorissa ja verisuonissa, sekä jossain määrin keuhkoissa ja 15 munasarjoissa. Veressä aktiivisuus oli korkea 48 ja 70 tunnin pisteissä: 9.3% ID/g ja 7.9% ID/g (ilmaistuna prosentteina injisoidusta annoksesta per grammaa kudosta ja normalisoituna 20 g hiireen). Anti-Bg-3 aktiivisuus veressä oli 11.3% 24 tunnin ja 36,2% 6 tunnin mittauspisteissä. 1 l-leimattua anti-BG-3 (3C4C7G6) annettiin myös hiirille, joilla oli 8 20 päiväinen paraneva haava ihon epiteelissä . Näille hiirille annettu annos oli 0.03pg eläintä kohden. Aktiivisen vasta-aineen biodistribuutio näytetään Kuvassa 3. Tässä kuvassa Y-akseli edustaa annoksen määrää %:na (% ID/g) ja X-akseli edustaa injisoinnin aikapisteitä: 4h (N=2); 24h (N=6); 48h (N=6); 72h (N=4) ja 120h (N=4). Kohdekudoksen ja plasman välillä on 25 tasapainotila, joka esitetään myös Kuvassa 3.The results indicate that anti-BG-3 activity was predominantly in the blood, tumor and blood vessels, and to some extent in the lungs and ovaries. Blood activity was high at 48 and 70 hour points: 9.3% ID / g and 7.9% ID / g (expressed as a percentage of the injected dose per gram of tissue and normalized to 20 g in the mouse). Anti-Bg-3 activity in the blood was 11.3% at the 24-hour and 36.2% at the 6-hour measuring points. 11 L-labeled anti-BG-3 (3C4C7G6) was also administered to mice with 8 to 20 days of healing wound in the epithelium of the skin. The dose given to these mice was 0.03 µg / animal. The biodistribution of the active antibody is shown in Figure 3. In this figure, the Y-axis represents the dose rate in% (% ID / g) and the X-axis represents injection time points: 4h (N = 2); 24h (N = 6); 48h (N = 6); 72h (N = 4) and 120h (N = 4). There is a steady state between target tissue and plasma, which is also shown in Figure 3.
1 6 111267 ESIMERKKI 81 6 111267 EXAMPLE 8
Anti-Tie monoklonaalisten vasta-aineiden Tc-99m-leimaus kuvantamiskoetta vartenTc-99m Labeling of Anti-Tie Monoclonal Antibodies for Imaging Assay
Vasta-aine leimattiin 99m-teknetium:lla julkaisuissa Schwarz et ai., 5 J.NucI.Med., 1987, 28:721, ja Mather et ai., J.NucI.Med., 1990, 31: 692-697 kuvatun menetelmän avulla. Käytettiin 2-merkaptoetanolia (ME) immunobglobuliinin raskaan ketjun liittymäalueen disulfidisidosten avaamiseksi. Vasta-aine konsentroitiin noin 10 mg/L ja liuokseen lisättiin riittävä määrä ME:ia jotta saatiin molaarinen suhde 1000:1 (0.47 μΙ ME /1 mg ίο vasta-ainetta). Seos inkuboitiin huoneen lämmössä 30 min ja pelkistetty vasta-aine puhdistettiin geelisuodatuksen avulla 20 ml Sephadex-G-50 pylväässä ja eluoitiin käyttäen fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta liikuvana faasina. Vasta-ainefraktiot yhdistettiin optisen densiteetin mittauksen jälkeen (280 nm) ja säilytettiin -20°C:ssa 0.5 mg:n erinä 99m-Tc 15 leimausta varten.The antibody was labeled with 99m technetium as described in Schwarz et al., 5 J.NucI.Med., 1987, 28: 721, and Mather et al., J.NucI.Med., 1990, 31: 692-697. method. 2-Mercaptoethanol (ME) was used to open the disulfide bonds of the immunoglobulin heavy chain junction. The antibody was concentrated to about 10 mg / L and enough ME was added to the solution to give a molar ratio of 1000: 1 (0.47 μΙ ME / 1 mg of antibody). The mixture was incubated at room temperature for 30 min and the reduced antibody was purified by gel filtration on a 20 mL Sephadex-G-50 column and eluted using phosphate buffered saline as the mobile phase. Antibody fractions were pooled after optical density measurement (280 nm) and stored at -20 ° C in 0.5 mg aliquots for 99m-Tc 15 labeling.
99m-Tc-leimausta varten vasta-aine-erät sulatettiin ja rekonstituoitiin käyttäen metyleenidifosfonaatti (MDP) luukuvantamiskitissä (Amerscan Medronate II Technetium Bone Agent, N.165) 5 ml 0.9% steriiliä suolaliuosta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vasta-aine-erään lisättiin 35 μΙ MDP-liuosta, 20 jossa oli 35 pg MDP:tä ja 2.4 pg SnF2 ja sekoitettiin hyvin. Seokseen lisättiin 99m-Tc-perteknaattia ja ravisteltiin varovaisesti. Reaktio päättyi 10 min:ssa. Radiokemiallinen puhtaus mitattiin HPLC:llä.For 99m Tc labeling, batches of antibody were thawed and reconstituted using methylene diphosphonate (MDP) in a bone imaging kit (Amerscan Medronate II Technetium Bone Agent, N.165) with 5 ml of 0.9% sterile saline according to the manufacturer's instructions. To the antibody batch was added 35 μΙ MDP solution containing 35 pg MDP and 2.4 pg SnF2 and mixed well. 99m-Tc pertechnetate was added to the mixture and shaken gently. The reaction was completed in 10 min. Radiochemical purity was measured by HPLC.
Pelkistetyn vasta-aineen leimaus tuottaa stabiilin 99m-Tc-leimatun immunoglobuliinin koska leiman epäspesifinen sitoutuminen on minimissä.Labeling of the reduced antibody produces a stable 99m-Tc-labeled immunoglobulin because of the minimal non-specific binding of the label.
25 Leimaustehokkuus määritetään ohutlevykromatografialla 0.9% fysiologisessa suolaliuoksessa. Immuunoreaktiivisuus säilyy yli 85%:ssa. In vivo stabiilisuus analysoidaan in vitro - kysteiinitestillä.Labeling efficiency is determined by thin layer chromatography in 0.9% saline. Immunoreactivity remains above 85%. In vivo stability is analyzed by an in vitro cysteine assay.
99mTc-leimatut anti-Tie-vasta-aineet voidaan detektoida * tavanomaisella gamma-kameralla tai SPECT-laitteella (Single Photon 30 Emission Computerized Tomography) jolloin saadaan kuva vasta-aineen kiertonopeudesta ihmisen kehossa.99mTc-labeled anti-Tie antibodies can be detected with a * conventional gamma camera or SPECT (Single Photon 30 Emission Computerized Tomography) to provide a picture of antibody turnover in the human body.
1 7 111267 ESIMERKKI 91 7 111267 EXAMPLE 9
Tie-positiivisten solulinjojen detektion FACS:n avullaDetection of path positive cell lines by FACS
Esimerkeissä 2, 3 ja 4 valmistetuja anti-Tie vasta-aineita käytettiin Tie-proteiinin detektoimiseksi ihmisen leukemia-solulinjoista.The anti-Tie antibodies prepared in Examples 2, 3 and 4 were used to detect Tie protein from human leukemia cell lines.
5 Hematopoieettiset solulinjat HEL (humaani erytroleukemia) ja MOLT-4 (T-lymfoblastinen leukemia) saattiin ATCCistä. HEL-soluja, jotka myös ilmentävät erytroidi- ja megakariosyyttimarkkereita, käytettiin Tie:n epäsuorassa immunotfluoresenssivärjäyksessä käyttäen tehtyjä monoklonaalisia vasta-aineita ja FACS-analyysiä (fluorecence activated cell ίο sorting). Solut laskettiin, pestiin ja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa useissa laimennuksissa (1:1 - 1:200), pestiin ja inkuboitiin FITC-konjugoitujen hiiren anti-immunoglobuliini vasta-aineiden kanssa (sekundaariset vasta-aineet). Anlysointi tehtiin käyttäen FACS IV-laitteistoa. Negatiivisena kontrollina käytettiin ei-spesifisellä hiiren immunoglobuliinissa värjättyjä soluja, jonka 15 jälkeen käytettiin samoja sekundaari-vasta-aineita. Negatiivisena solukontrollina käytimme MOLT-4 T-soluleukemiasolulinjaa, joka ei ilmennä Tie mRNAta.Hematopoietic cell lines HEL (human erythroleukemia) and MOLT-4 (T-lymphoblastic leukemia) were obtained from ATCC. HEL cells also expressing erythroid and megakaryocyte markers were used for indirect immuno-fluorescence staining of Tie using monoclonal antibodies and fluorescence activated cell (sorting) assay. Cells were counted, washed and incubated with antibodies in multiple dilutions (1: 1 to 1: 200), washed and incubated with FITC-conjugated mouse anti-immunoglobulin antibodies (secondary antibodies). Analyzes were performed using FACS IV equipment. As a negative control, cells stained with non-specific mouse immunoglobulin were used, followed by the same secondary antibodies. As a negative cell control, we used the MOLT-4 T cell leukemia cell line, which does not express Tie mRNA.
Tulokset osoittavat että anti-Tie-vasta-aineet värjäävät keskimäärin 85% HEL soluista, kun vastaavasti alle 1% MOLT-soluista värjäytyvät 20 positiiviseksi Tie:n suhteen. Kun näiden kahden solulinjan solut sekoitetaan , vasta-aineet erottavat positiiviset HEL-solut negatiivisesta MOLT-soluista (Kuva 1). Ihmisen luuydinnäytteessä alle 1% soluista värjäytyy myös positiivisesti näillä vasta-aineilla.The results show that on average 85% of HEL cells stained anti-Tie antibodies, whereas less than 1% of MOLT cells stained 20 positive for Tie, respectively. When the cells of these two cell lines are mixed, the antibodies separate positive HEL cells from negative MOLT cells (Figure 1). In a human bone marrow specimen, less than 1% of the cells also show positive staining with these antibodies.
Ihmisen leukemiasolulinjan MOLT4 solut (maligni T-solulinja, joka on 25 Tie mRNA-negatiivinen) ja HEL-solut (ihmisen erytroleukemiasolulinja, joka on Tie mRNA-positiivinen) sekoitettiin suspensiossa noin 1:1 suhteessa.Cells of the human leukemia cell line MOLT4 (malignant T cell line that is Tie mRNA negative) and HEL cells (human erythroleukemia cell line which are Tie mRNA positive) were mixed in a ratio of about 1: 1.
Solut värjättiin tämän jälkeen suspensiossa käyttäen Esimerkin 2 mukaisia .· monoklonaalisia Tie-vasta-aineita laimennettuna 1:10 ja FITC-konjugoitua anti-hiiren IgG sekundaarisena vasta-aineena. Negatiivisena kontrollina 30 vasta-aine korvattiin normaalilla hiiren seerumilla. Analysointi tehtiin FACS IV:llä. Tulokseksi saadaan kaksi erillistä solupopulaatiota, yksi Tie-positiivinen ja yksi Tie-negatiivinen, kummankin ollen noin 50% koko analysoidusta solupopulaatiosta (Kuva 1).The cells were then stained in suspension using the monoclonal Tie antibodies of Example 2 diluted 1:10 and FITC-conjugated anti-mouse IgG secondary antibody. As a negative control, the antibody was replaced with normal mouse serum. Analysis was performed on FACS IV. The result is two separate cell populations, one Tie-positive and one Tie-negative, each representing approximately 50% of the total cell population analyzed (Figure 1).
1 8 1112671 8 111267
Jotkut Tie-positiiviset luuydinsolut olivat myös CD19B-solumarkkerille positiivisa ja kaikki olivat CD38-negatiivisia. Tämä osoittaa, että Tie ilmenee B-solulinjassa.Some Tie positive bone marrow cells were also positive for the CD19B cell marker and all were CD38 negative. This indicates that the Tie is expressed in the B cell line.
ESIMERKKI 10 5 Monoklonaalisten vasta-aineiden analvosointiEXAMPLE 10 5 Analyzing Monoclonal Antibodies
Monoklonaaliset soluviljelysupernatantien kyky tunnistaa Tie-reseptoria solujen pinnalta testattiin käyttäen FACS analyysiä. Tie-ilmentämisvektorilla (kokopitkä Tie-cDNA pLTRpoly-vektorissa, Mäkelä et ai., 1991) tranfektoidut NIH3T3 solut, kontrollivektorilla transfektoidut NIH3T3 solut, sekä HEL solut io (ihmisen erytroleukemiasolulinja joka endogeenisesti ilmentää Tie-reseptoria) että MOLT-4 solut (ihmisen T-soluleukemiasolulinja, joka ei ilmennä Tiedä) inkuboitiin eri solukloonien kasvatusliemissä ja sen jälkeen FITC-leimatuilla kanin anti-hiiri-vasta-aineilla (Dako). Leimatut solut analysoitiin fluoresenssi-aktivoidulla solulaskijalla (Becton Dickinson).The ability of monoclonal cell culture supernatants to recognize the Tie receptor on the surface of cells was tested using FACS analysis. NIH3T3 cells transfected with the Tie expression vector (full length Tie cDNA in the pLTRpoly vector, Mäkelä et al., 1991), NIH3T3 cells transfected with the control vector, and both HEL cells io (human erythroleukemia cell line, which endogenously expresses TOL). non-expressing cell line) was incubated in culture broths of different cell clones followed by FITC-labeled rabbit anti-mouse antibodies (Dako). Labeled cells were analyzed with a fluorescence-activated cell counter (Becton Dickinson).
15 Tuotettiin myös askites seuraavista klooneista: 1H3H7, 3C4C7, 5C12H9. 3C4D7 klooni subloonattiin ja saatiin subkloonit 3C4C7G6, 3C4C7B11, 3C4C7E7, 3C4C7F9, jotka olivat samankaltaisia.Ascites were also produced from the following clones: 1H3H7, 3C4C7, 5C12H9. The 3C4D7 clone was subcloned and 3C4C7G6, 3C4C7B11, 3C4C7E7, 3C4C7F9 subclones were obtained which were similar.
1 9 1112671 9 111267
Taulukko 2.Table 2.
Solun ulkoista osaa tunnistavien anti-Tie monoklonaalisten vasta-aineiden tuloksiaResults of anti-Tie monoclonal antibodies recognizing the outer part of the cell
Klooni delfia slot blot Western FACSClone dolphin slot blot Western FACS
5 BG-3 _media denat._ 1H3F10 +++ +++ +++ (+) H6 +++ +++ +++ (+) ίο H7 +++ +++ +++ (+) 3C4C7 +++ +++ + - ++ E4 +++ ++ (+) - + G4 +++ ++ (+) - + 5C12G11 +++ +++ +++ 15 H9 +++ +++ +++ (+) 6A11A11 ++ ++ + + H6 ++ ++ (+) - + H9 ++ ++ + - + 9B10E6 + ++ +++ 20 G7 + ++ +++ 9E7E9 +++ +++ +++ (+) E10 +++ ++ ++ (+) _H6_+++_++_++_(+)_^_ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ESIMERKKI 11 25 BG-3 _media denat._ 1H3F10 +++ +++ +++ (+) H6 +++ +++ +++ (+) ίο H7 +++ +++ +++ (+) 3C4C7 + ++ +++ + - ++ E4 +++ ++ (+) - + G4 +++ ++ (+) - + 5C12G11 +++ +++ +++ 15 H9 +++ +++ + ++ (+) 6A11A11 ++ ++ + + H6 ++ ++ (+) - + H9 ++ ++ + - + 9B10E6 + ++ +++ 20 G7 + ++ +++ 9E7E9 +++ + ++ +++ (+) E10 +++ ++ ++ (+) _H6 _ +++ _ ++ _ ++ _ (+) _ ^ _ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 EXAMPLE 11 2
Tie:n immunoperoksidaasivärjäys ihmisen veren soluissaTie's immunoperoxidase staining in human blood cells
Potilaalle annettiin syklofosfamidia, jotta hematopoieettiset kantasolut 3 : ; mobilisoituisivat perifeeriseen vereen, ja seitsemän päivän jälkeen kerättiin 4 • < 5 perifeerisestä verestä kuultavan kerroksen solut. Punasolut hemolysoitiin 6 solususpensiosta ja tehtiin sytosentrifuugiliuskoja. Näitä käytettiin 7 immunovärjäyksessä puhdistetulla Tie monoklonaalista vasta-aineella 8 3C4C7G6 immunoperoksidaasimenetelmällä. Luuydinsolujen 9 kaksinkertaisella immunofluoresenssivärjäyksellä Tie-positiivisia soluja (alle 10 '·' 1%) ei voitu määrittää selvästi johonkin hematopoieettiseen linjaan kuuluviksi.The patient was given cyclophosphamide to hematopoietic stem cells 3:; mobilized to peripheral blood, and after 7 days, 4 x 5 peripheral blood auditory layer cells were harvested. The red cells were hemolysed from 6 cell suspensions and cytocentrifuge strips were made. These were used in 7 immunostained purified Tie monoclonal antibody 8 by the 3C4C7G6 immunoperoxidase method. By double immunofluorescence staining of bone marrow cells 9, Tie positive cells (less than 10 '· 1%) could not be clearly identified as belonging to any hematopoietic lineage.
1111
Tunnistettiin 5 positiivisesti värjäytynyttä solua yhden liuskan noin 70.000 solusta. Immunoperoksidaasivärjäyksessä Tie-positiiviset solut olivat pieniä ja pyöreitä, ja niillä oli suuri tuma ja niukasti solulimaa (Kuva 2). (Kuvan yhden positiivisen solun tumma väri johtuu peroksidaasivärjäyksestä ja ilmaisee Tie-positiivisen solun). Täten anti-Tie monoklonaaliset vasta-aineet 20 111267 tunnistavat spesifisiä hematopoieettisia soluja luuytimestä ja niitä voidaan käyttää hematopoieettisten solujen tiettyjen alaryhmien tunnistamiseksi.5 positively stained cells were identified from about 70,000 cells per strip. In immunoperoxidase staining, Tie-positive cells were small and round and had a large nucleus and scarce cytoplasm (Figure 2). (The dark color of one positive cell in the image is due to peroxidase staining and indicates a Tie positive cell). Thus, anti-Tie monoclonal antibodies recognize specific hematopoietic cells from the bone marrow and can be used to identify specific subsets of hematopoietic cells.
ESIMERKKI 12EXAMPLE 12
Monklonaalisen vasta-aineen 3C4C7G6 humanisointi 5 3C4C7G6 voidaan humaniosoida käyttäen aikaisemmin kuvattuja menetelmiä (Kolbinger et ai., 1993; Kettleborough et ai., 1991). Humanisointimenetelmä käsittää hiiren kappa kevytketjun (L) ja raskaan ketjun (H) determinanttialueiden (CDR) liittämisen ihmisen muuttuviin alueisiin (V) sekä pistemutaatioiden aikaansaamisen ihmisen vasta-aineen ίο reunaalueilla, siten että alkuperäinen CDR-konformaatio säilyy.Humanization of 3C4C7G6 Monoclonal Antibody 3C4C7G6 can be humanized using methods previously described (Kolbinger et al., 1993; Kettleborough et al., 1991). The humanization method involves incorporating the mouse kappa light chain (L) and heavy chain (H) determinant regions (CDRs) into human variable regions (V) and providing point mutations in the ίο peripheral regions of the human antibody, while maintaining the original CDR conformation.
Uudelleenmuokatut VL ja VH ketjut liitetään vastaavasti ihmisen kappa ja gamma-1 muuttumattomia alueita koodittavaan DNA: hän sopivien ilmentämisvektorien avulla.The reconstituted VL and VH chains are inserted into DNA encoding the human kappa and gamma-1 constant regions, respectively, by means of suitable expression vectors.
scFv tuotetaan kuten aikaisemmin on kuvattu julkaisussa Whitlow et ai., 15 supra, (1993).scFv is produced as previously described in Whitlow et al., 15 supra, (1993).
Humanisoitujen monoklonaalisten vasta-aineiden affiniteetit ja scFv:t testataan käyttäen tässä hakemuksessa aikaisemmin kuvattuja menetelmiä.The affinities and scFvs of the humanized monoclonal antibodies are tested using the methods previously described in this application.
ESIMERKKI 13EXAMPLE 13
Tie-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden konjugointi terapeuttiseen '· 20 aineeseenConjugation of Tie-Specific Monoclonal Antibodies to a Therapeutic Substance
Monoklonaalinen vasta-aine 3C4C7G6, tai esimerkissä 12 kuvatut humaniosoidut vasta-aineet, voidaan liittää tai konjugoida erilaisiin aineisiin diagnostista käyttöä varten, kuten muissa esimerkeissä tässä kuvataan, tai tuotettujen konjugaattien terapeuttista käyttöä varten. 1Monoclonal antibody 3C4C7G6, or the humanized antibodies described in Example 12, can be coupled or conjugated to various agents for diagnostic use, as described in the other examples herein, or for therapeutic use of the conjugates produced. 1
Esimerkiksi tuumoriterapiassa tai disperssin maligniteetin kuten leukemian hoidossa, vasta-aineet voidaan liittää radioisotooppeihin kuten, 32P,1311,125l, 90Y, 188Re, 212Pb, 212Bi tai 10B (Katso esim. Scheinberg et ai., Oncology, 1:31-37, 1987). Radioisotooppien konjugointi vasta-aineeseen aikaansaadaan liittämällä isotooppi suoraan vasta-aineeseen aikaisemmin j 30 kuvattuja menetelmiä käyttäen (See e.g., Schwartz J., Nuclear Medicine 2 1 111267 28:721, 1987) tai kelaattilinkkereiden avulla, jotka sitovat radioisotoopin vasta-aineeseen, tai sekundaarisen vasta-aineen avulla joka sitoutuu spesifiseen vasta-aineeseen . Erinäisiä muita aineita voidaan myös liittää vasta-aineisiin. Tällaisia aineita ovat antituumorilääkkeet ja antibiootit, jotka 5 ovat toksisia koska sitoutuvat DNAhan interkalatoinnin avulla (esim. daunomysiini, adriamysiini, aklasinomysiini) tai pilkkovat DNAta (esim. esperamysiini, kalikeamysiini, neokasinstatiini) sekä muut toksiset sytostaattilääkkeet kuten cis-platinum, vinblastiini ja metotreksaatti (katso esim. Greenfield et ai., Antibody, Immunoconjucates and ίο Radiopharmaceuticals, 4:107-119, 1991). Nämä aineet liitetään kovalenttisesti käyttäen aineiden sopivia johdannaisia.For example, in tumor therapy or in the treatment of dispersion malignancy such as leukemia, antibodies can be coupled to radioisotopes such as, 32P, 1311, 125I, 90Y, 188Re, 212Pb, 212Bi or 10B (See, e.g., Scheinberg et al., Oncology, 1: 31-37, 1987) ). Conjugation of radioisotopes to the antibody is accomplished by directly attaching the isotope to the antibody using the methods described previously (See eg, Schwartz J., Nuclear Medicine 21111267 28: 721, 1987) or by chelating linkers that bind the radioisotope to the antibody, or with an antibody that binds to a specific antibody. Various other agents may also be linked to antibodies. Such agents include antitumor drugs and antibiotics that are toxic because they bind to DNA by intercalation (eg daunomycin, adriamycin, aclasinomycin) or cleave DNA (eg esperamycin, calikeamycin, neocasstatin) and other toxic cytostatic drugs such as see, e.g., Greenfield et al., Antibody, Immunoconjucates and Radiopharmaceuticals, 4: 107-119, 1991). These agents are covalently linked using appropriate derivatives of the agents.
Monia proteiineja ja glykoproteiineja voidaan myös käyttää vasta-aineiden terapeuttisina konjugaatteina. Näitä ovat esimerkiksi bakteeritoksiinit, kuten Difteriatoksiini, Shigellatoksiini ja Pseudomonaan 15 eksotoksiini; kasvitoksiinit, kuten risiini, abriini, modekkiini, viskumiini, kermesmarjasta eristetty antivirusproteiini, saporiini, momordiini ja geloniini. Nämä toksiinit sisältävät katalyyttisen fragmentin, ja joissakin tapauksissa fragmentteja tai osia jotka tunnistavat solun pintarakenteita tai helpottavat solumembraanin läpi kulkeutumista. Käytetään sopivasti modifioituja 20 toksiineja, jotka antavat parannettua spesifisyyttä ilman alentunutta tehoa. Toksiinien konjugointi vasta-aineisiin tehdään heterobifunktionaalisten linkkereiden avulla, kuten N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)-propionaatti (SPDP) tai 2-iminotiolaani.Many proteins and glycoproteins can also be used as therapeutic conjugates of antibodies. These include, for example, bacterial toxins such as Diphtheria toxin, Shigelloxin, and Pseudomonan exotoxin; plant toxins such as ricin, abrin, modeckin, viscumin, antiviral protein isolated from sour cherry, saporin, momordine and gelonin. These toxins contain a catalytic fragment and, in some cases, fragments or portions which recognize cell surface structures or facilitate passage through the cell membrane. Suitably modified toxins are used that provide improved specificity without reduced efficacy. Conjugation of toxins to antibodies is accomplished by heterobifunctional linkers such as N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) or 2-iminothiolane.
Ennen terapeuttista käyttöä konjugoidut vasta-aineet testataan toksisen 25 tehon suhteen, kohdespesifisyyden suhteen, in vitro ja in vivo stabiilisuuden suhteen ja muiden ominaisuutensa suhteen (katso esim. Immunotoxins, Ed. Frankel, Kluwer Academic Publishers, Boston, 1988). On toivottavaa, että konjugoidun aineen toksisuus ja vasta-aineen sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys muuttuvat mahdollisimman vähän käytetyn sitoutumismenetelmän 30 myötä. Siksi konjugaattien sitoutuminen Tie-reseptoriin testataan (katso Esimerkki 10). In vitro toksisuus kohdesoluissa kuten Dami leukemiasolulinjassa testataan mittaamalla sitoutunut leimattu yhdiste verrattuna kontrollikonjugaatilla hoidettuun soluviljelmään, ja vielä suoremmin määrittämällä ne viljelmät jotka pystyvät kasvamaan kloonaustesteissä ja 35 solun kasvunopeuden ekstrapolaatio testissä. In vivo stabiilisuus, poistonopeus ja spesifinen toksisuus määritetään antamalla konjugaatteja 22 111267 sopivalle kohde eläimelle, kuten hiirelle, rotalle, kanille tai apinalle. Muita kohteita ovat normaalihiiret ja in vivo tuumori- ja leukemia mallit, kuten ihmisen syöpäsolut annettuina immunopuutteisille hiirikannoille, kuten nude-hiiri tai SCID-hiiri.Prior to therapeutic use, conjugated antibodies are tested for toxic activity, target specificity, in vitro and in vivo stability, and other properties (see, e.g., Immunotoxins, Ed. Frankel, Kluwer Academic Publishers, Boston, 1988). It is desirable that the toxicity of the conjugated agent and the binding affinity and specificity of the antibody be minimized with the binding method used. Therefore, the binding of conjugates to the Tie receptor is tested (see Example 10). In vitro toxicity in target cells, such as the Dami leukemia cell line, is assayed by measuring bound labeled compound relative to control conjugate treated cell culture, and more directly, by assaying cultures capable of growing in cloning assays and extrapolation of 35 cell growth rate in the assay. In vivo stability, elimination rate and specific toxicity are determined by administering conjugates 22111267 to a suitable target animal such as a mouse, rat, rabbit or monkey. Other targets include normal mice and in vivo tumor and leukemia models, such as human cancer cells administered to immuno-deficient mouse strains, such as a nude mouse or an SCID mouse.
5 ESIMERKKI 145 EXAMPLE 14
Monoklonaalista vasta-ainetta 3C4C7G6 sisältävän farmaseuttisen komposition valmistaminenPreparation of a pharmaceutical composition containing the monoclonal antibody 3C4C7G6
Esillä olevan keksinnön mukaiset farmaseuttiset kompositiot sisältävät tehokkaan määrän aktiivista ainetta, Tie-spesifistä monoklonaalista vasta-10 ainetta, erityisesti monoklonaalista vasta-ainetta 3C4C7G6, yksin tai yhdistettynä sopivaan puskuriin, laimennusaineeseen ja/tai lisäaineeseen. Tällaiset kompositiot tuotetaan steriileinä vesiluoksina tai lyofilisoituina tai muuten kuivattuina formulaatioina. Edullisesti vasta-aineet formuloidaan sellaiseen kantajaan konsentraatiossa 1 mg/ml - 10 mg/ml.The pharmaceutical compositions of the present invention contain an effective amount of an active agent, a Tie-specific monoclonal antibody, in particular monoclonal antibody 3C4C7G6, alone or in combination with a suitable buffer, diluent and / or excipient. Such compositions are prepared as sterile aqueous solutions or as lyophilized or otherwise dried formulations. Preferably, the antibodies are formulated in such a carrier at a concentration of 1 mg / ml to 10 mg / ml.
15 Yksi esimerkki injisoitavaksi soveltuvasta farmaseuttisesta kompositiosta sisältää monoklonaalista vasta-ainetta 3C4C7G6 (1 mg/ml) puskuroidussa vesiliuoksessa jossa on monoemäksistä natriumfosfaattiliuosta (0.45 mg/ml; pH 7.0 ±0.5) ja Tween 80™ (0.2 mg/ml). Keksinnön mukaisia kompositioita annetaan sellaisina annoksina, jotka alan ammatti-ihminen 20 määrittää huomioiden kohteena olevan taudin, oireiden vakavuuden ja potilaan ominaisuudet. Esimerkkinä mainittakoon, että keksinnön mukaisia farmaseuttisia kompositioita voidaan antaa paikallisesti jotta saadaan maksimaalisen vaikutus tuumorin kasvun ja neovaskularisaation pysähdyttämisessä tai haavan parantumisessa. Toisenlaiset annokset ovat 25 kuitenkin tarpeen systeemisessä käytössä, riippuen potilaan ominaisuuksista, kuten painosta, iästä, taudin progressiosta, metaboliasta, jne.One example of an injectable pharmaceutical composition contains 3C4C7G6 monoclonal antibody (1 mg / ml) in an aqueous buffered solution of monobasic sodium phosphate solution (0.45 mg / ml; pH 7.0 ± 0.5) and Tween 80 ™ (0.2 mg / ml). The compositions of the invention are administered in dosages determined by one of ordinary skill in the art, taking into account the disease, the severity of the symptoms and the characteristics of the patient. As an example, the pharmaceutical compositions of the invention may be administered topically to achieve maximal effect in arresting tumor growth and neovascularization or wound healing. However, different doses are required for systemic use, depending on the characteristics of the patient, such as weight, age, disease progression, metabolism, etc.
Alan ammatti-ihmiselle voi avautua muita käyttömuotoja kun hän ottaa : huomioon tämän kuvauksen. Siten esillä oleva keksintöä rajoittaa vain alla olevat vaatimukset.Other uses may be apparent to one skilled in the art upon consideration of this description. Thus, the present invention is limited only by the requirements below.
23 111267 ESIMERKKI 1523 111267 EXAMPLE 15
Tie:n immunohistokemiallinen värjäytyminen normaali aivossa, glioblastoma multifore:ssa ia melanoman etäispesäkkeissäImmunohistochemical staining of Tie in normal brain, glioblastoma multifore, and melanoma metastases
Tuoreet hoitamattomat aivogliomanäytteet ja kallonsisäisen 5 meningeomanäytteet saattin avoleikkauksesta neurologiselta leikkausosastolta Helsingin Yliopistollisesta Sairaalasta. Kaikki tuumoripotilaat saivat kortikosteroidihoitoa. Ei-neoplastinen kontrolli-aivokudosnäyte saatiin vaikean epilepsian leikkauksesta. Useat tuumorinäytteet sisälsivät myös ympäröivää aivokudosta. Kaikki näytteet ίο pakastettiin nestetyppeen mahdollisimman pian leikkauksen jälkeen ja säilytettiin -70°C:ssa. Histopatologinen diagnoosi perustui hematoksyliini/eosiini värjättyihin jääleikkeisiin ja rutiininomaisesti värjättyihin formaldehydifiksattujen rinnakkaisten tuumorinäytteiden paraffiinileikkeisiin. Taulukossa 3 on täydellinen luettelo näytteistä.Recent untreated cerebellar specimens and intracranial meningeal specimens were obtained from an open-air neurological surgery unit at Helsinki University Hospital. All tumor patients received corticosteroid treatment. A non-neoplastic control brain tissue sample was obtained from surgery for severe epilepsy. Several tumor specimens also contained the surrounding brain tissue. All samples were frozen in liquid nitrogen as soon as possible after surgery and stored at -70 ° C. The histopathological diagnosis was based on hematoxylin / eosin-stained ice cubes and routinely stained paraffin sections of formaldehyde-fixed parallel tumor specimens. Table 3 provides a complete list of samples.
15 Taulukko 3. Ihmisen kudosnäytteet15 Table 3. Human tissue samples
No kudosnäyte__Age (y) Sex_ 1 kontrolliako__66__M_ 2 kontrolliako__Y\__F_ 3 II asteen oligoastrosytoma__34__F_ 4 II asteen oligoastrosytoma__66__M_ 5 III asteen astrosytoma__36__M_ 6 _ GBM__53__M_ _7_ GBM__63__M_ 8 _ GBM__56_JM_ 9 GBM:n viereinen kudos__69__F_ 10 I asteen meningeoma__52__M_ 11 II asteen meningeoma__35__F_ 12 II asteen meningeoma__55__M_ 13 melanoma etäispesäke__54__M_ 14 m e:nn ympäröivä kudos__67__M_ 15 III asteen glioma__44__M_ 16 |gbm 65 |m GBM = glioblastoma multiforme 24 111267Well kudosnäyte__Age (y) Sex_ 1 kontrolliako__66__M_ 2 kontrolliako__Y \ __ F_ 3 grade II oligoastrosytoma__34__F_ 4 grade II oligoastrosytoma__66__M_ 5 grade III astrosytoma__36__M_ 6 _ GBM__53__M_ _7_ GBM__63__M_ 8 _ GBM__56_JM_ 9 GBM adjacent kudos__69__F_ 10 grade I meningeoma__52__M_ 11 grade II meningeoma__35__F_ 12 grade II meningeoma__55__M_ 13 melanoma metastasis__54__M_ 14 me surrounding tissue__67__M_ 15 Stage III glioma__44__M_ 16 | gbm 65 | m GBM = glioblastoma multiforme 24 111267
Steriloidut levyt kastettiin 2% aminopropyylitrietoksisilaaniin (TESPA) asetonissa jotta varmistetaan kudoksen kiinnittyminen. Leikattiin 5-μιτι jääleikkeitä -20°C:ssa esikäsitellyille levyille, kiinnitettiin 4% paraformaldehydissä ja säilytettiin -70°C:ssa.Sterilized plates were dipped in 2% aminopropyltriethoxysilane (TESPA) in acetone to ensure tissue adhesion. 5-μιτι ice cutters were cut on pre-treated plates at -20 ° C, fixed in 4% paraformaldehyde and stored at -70 ° C.
5 In situ-hybridisaatio-analyysissä käytettyjen näytteiden 5-pm jääleikkeet ja kaksi ylimääräistä malignia gliomanäytettä leikattiin TESPA-levyille kuten yllä on kuvattu. Leikkeet kuivattiin vakuumissa 37°C:ssa yli yön ja värjättiin immunohistokemiallisesti käyttäen hiiren monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen Tie:ta vastaan (Tie:n solunulkoista osaa tunnistavien muutamien ίο monoklonaalisten vasta-aineiden seos) ja ihmisen von VVillebrand-tekijän (vWF) vastaan tehtyjä kanin vasta-aineita (Dakopatts) endoteelisolu-spesifisenä markkerina.5-pm ice sections of the samples used in the in situ hybridization assay and two additional malignant glioma samples were cut on TESPA plates as described above. The sections were dried in vacuo at 37 ° C overnight and stained immunohistochemically using murine monoclonal antibodies against human Tie (a mixture of a few β1 monoclonal antibodies recognizing the extracellular portion of Tie) and human von Willebrand factor (vWF). rabbit antibodies (Dakopatts) as an endothelial cell-specific marker.
Värjääminen suoritettiin käyttäen hiiren lgG:lle tarkoitettua Vectastain ABC Elite biotin/avidin systeemiä (Vector Laboratories, Burlingame, CA).Staining was performed using the Vectastain ABC Elite Biotin / Avid system (Vector Laboratories, Burlingame, CA) for mouse IgG.
15 Kuivatun, fiksoimattoman kudosleikkeen endogeeninen peroksidaasi- aktiivisuus vaimennettiin käsittelemällä 0.5% H202;:lla metanolissa 30 min. Pestiin PBS:llä jonka jälkeen leikkeet inkuboitiin laimennetulla Vectastain blokkausseerumilia 20 min ja sen jälkeen laimentamattomalla Tie-vasta-aineella (1:1) yli yön 4°C:ssa tai von VVillebrandtekijä-vasta-aineella (1:50) 1 20 tunti huoneen lämmössä. Biotinyloitu sekundaarinen vasta-aine lisättiin 45 min:ksi., jonka jälkeen lisättiin Vectastain ABC-reagenssia 30 min. Reaktio visualisoitiin 0.2 mg/ml 3-amino-9-etyylikarbatsolilla (AEC), 0.03% H202, 14 mM etikkahapolla ja 33 mM natriumasetaalilla. Normaaliseerumia ja . antigeeniblokattuja primaarivasta-aineita käytettiin kontrolleina. Leikkeet 25 vastavärjättiin kevyesti hematoksyliinillä ja peitattiin Aquoamount'ssa.The endogenous peroxidase activity of the dried, non-fixed tissue section was attenuated by treatment with 0.5% H2O2 in methanol for 30 min. Washed with PBS followed by incubation of the sections with diluted Vectasta blocking serum for 20 min and then with undiluted Tie antibody (1: 1) overnight at 4 ° C or von Willebrand factor antibody (1:50) for 1 20 hours at room temperature. temperature. The biotinylated secondary antibody was added for 45 min, followed by the addition of Vectastain ABC reagent for 30 min. The reaction was visualized with 0.2 mg / ml 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), 0.03% H 2 O 2, 14 mM acetic acid and 33 mM sodium acetal. Normal serum and. antigen-blocked primary antibodies were used as controls. Slices 25 were counterstained lightly with hematoxylin and stained in Aquoamount.
Aivon kuorikerroksen normaalikudoksen verisuonet olivat Tie-proteiini-negatiiviset (Kuva 4), kun sitä vastoin glioblastoman suonistossa (B) ja GBM:n läheisyydessä olevassa endoteelikudoksessa (B, sisennys) todettiin voimakasta värjäytymistä. Tie-proteiinia detektoitiin myös melanoman :. 30 etäpesäkkeiden suonia peittävissä endoteelisoluissa (C) sekä tuumorin rajalla (ei näytetä). Kun leikkeet inkuboitiin antigeeniä blokkaavalla vasta-aineella tai normaaliseerumilla Tie-vasta-aineiden tilalla, mitään spesifistä värjäystä ei esiintynyt. Tie-värjäytymisen määrän ja spesifisyyden edelleen arviointia varten värjättiin lähileikkeitä Vlll-tekijällä. Taulukossa 4 esitetään 35 yhteenvetona Tie-värjäystulokset.The vasculature of normal cortex tissue was Tie protein-negative (Figure 4), whereas in the glioblastoma vasculature (B) and endothelial tissue close to GBM (B, indentation), strong staining was observed. Tie protein was also detected in melanoma:. 30 metastases in vascular endothelial cells (C) and at the border of the tumor (not shown). When the sections were incubated with antigen-blocking antibody or normal serum in place of Tie antibodies, no specific staining was observed. For further evaluation of the amount and specificity of the tie staining, close sections were stained with the VIII factor. Table 4 summarizes 35 Tie staining results.
25 11126725 111267
Taulukko 4. Tie:n immunohistoloainen värjäysTable 4. Tie immunohistological staining
No Kudos__Tie ab 2 normaaliaivo__:_ 15 III asteen glioma__++_ 7_GBM*_+++ 16 GBM_ I +++ 11 I asteen meningeoma__++_ 13 melanoman etäispesäke__++_ Nämä tulokset osoittavat että TIE:llä on tärkeä rooli tuumorin progressioon liittyvässä angiogeneesissä.No Tissue__Tie ab 2 Normal Brain __: _ 15 Stage III glioma __ ++ _ 7_GBM * _ +++ 16 GBM_ I +++ 11 Stage I meningoma __ ++ _ 13 melanoma metastasis __ ++ _ These results indicate that TIE plays an important role in tumor progression-related angiogenesis.
5 ESIMERKKI 165 EXAMPLE 16
Tie-proteiinin immunohistokemiallinen detektio hemanaioblastomassa ja hemanaioperisvtomassa Tässä tutkimuksessa me analysoimme endoteelisten kasvutekijöiden ja ίο niiden reseptoreiden ilmentymistä kahdessa voimakkaasti vaskulaarisessa keskushermoston tuumorissa, joiden alkuperä oli kiistanalainen; kapillaarisessa hemagioblasomassa ja hemangioperisytomassa.Immunohistochemical Detection of Tie Protein in Hemanioblastoma and Hemorrhoidal Nonoperative In this study, we analyzed the expression of endothelial growth factors and ßο receptors in two highly vascular CNS tumors of controversial origin; capillary hemagioblasoma and hemangioperic cytoma.
Tuoreet hemangioblastoma- ja hemangioperisytomanäytteet saatin avoleikkauksesta neurologiselta leikkausosastolta Helsingin Yliopistollisesta 15 Sairaalasta. (Kaikki tuumoripotilaat saivat kortikosteroidihoitoa). Näytteet pikapakastettiin heti leikkauksen jälkeen ja säilytettiin -70°C:ssa. Histopatologinen diagnoosi perustui hematoksyliini/eosiini värjättyihin jääleikkeisiin ja rutiininomaisesti värjättyihin formaldehydifiksattujen tuumorinäytteiden paraffiinileikkeisiin.Recent samples of hemangioblastoma and hemangioperoma cytoplasm were obtained from an open surgery at the Neurological Surgery Unit at University of Helsinki 15 Hospital. (All tumor patients received corticosteroid treatment). The samples were immediately frozen immediately after surgery and stored at -70 ° C. The histopathological diagnosis was based on hematoxylin / eosin-stained ice cubes and routinely stained paraffin sections of formaldehyde-fixed tumor specimens.
20 Steriloidut levyt käsiteltiin 2% aminopropyylitrietoksisilaanilla (TESPA) asetonissa jotta varmistutaan kudoksen kiinnittymistä. Leikattiin 5-μιτι jääleikkeitä levyille, kiinnitettiin 4% paraformaldehydissä PBS:ssä ja säilytettiin -70°C:ssa.Sterilized plates were treated with 2% aminopropyltriethoxysilane (TESPA) in acetone to ensure tissue adhesion. 5-μιτι icicles were cut on the plates, fixed in 4% paraformaldehyde in PBS and stored at -70 ° C.
In situ-hybridisaatio-analyysissä käytettyjen näytteiden 5-μητι jääleikkeet : 25 leikattiin TESPA-levyille kuten yllä on kuvattu. Leikkeet kuivattiin vakuumissa 26 111267 37°C:ssa yli yön ja värjättiin immunohistokemiallisesti käyttäen hiiren monoklonaalista vasta-ainetta ihmisen Tie:ta vastaan (Tie:n solunulkoista osaa tunnistavat monoklonaaliset vasta-aineet saatiin lahjana Tri. Juha Partaselta) ja käyttäen ihmisen von VVillebrand-tekijää (vWF) vastaan tehtyjä 5 kanin vasta-aineita (Dakopatts) sekä CD34 vasta-aineita endoteelisolu-spesifisenä markkerina (36).The 5-μητι ice sections of the samples used in the in situ hybridization assay: 25 were cut on TESPA plates as described above. The sections were dried in vacuo at 26111267 at 37 ° C overnight and stained immunohistochemically using a mouse monoclonal antibody against human Tie (monoclonal antibodies recognizing the extracellular portion of Tie were obtained from Dr. Juha Partanen) and using human von Willebrand. 5 rabbit antibodies (Dakopatts) against factor (vWF) and CD34 as an endothelial cell specific marker (36).
Värjääminen suoritettiin käyttäen hiiren lgG:lle tarkoitettua Vectastain ABC Elite biotin/avidin systeemiä (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Kuivatun, fiksoimattoman kudosleikkeen endogeeninen peroksidaasi-10 aktiivisuus blokattiin käsittelemällä 0.5% H202;:lla metanolissa 30 min.Staining was performed using the Vectastain ABC Elite Biotin / Avid system (Vector Laboratories, Burlingame, CA) for mouse IgG. The endogenous peroxidase-10 activity of the dried, non-fixed tissue section was blocked by treatment with 0.5% H2O2 in methanol for 30 min.
Pestiin PBS:llä jonka jälkeen leikkeet inkuboitiin laimennetulla Vectastain blokkausseerumilla 20 min ja sen jälkeen laimentamattomalla Tie-vasta-aineella (1:1) yli yön 4°C:ssa tai CD34/von Willebrandtekijä-vasta-aineella (1:50) 1 tunti huoneen lämmössä. Biotinyloitu sekundaarinen vasta-aine 15 lisättiin 45 min. jonka jälkeen lisättiin Vectastain ABC-reagenssia 30 min. Reaktio visualisoitiin 0.2 mg/ml 3-amino-9-etyylikarbatsolilla (AEC), 0.03% H202, 14 mM etikkahapolla ja 33 mM natriumasetaatilla. Normaaliseerumia ja antigeeniblokattuja primaarivasta-aineita käytettiin kontrolleina. Leikkeet vastavärjättiin kevyesti hematoksyliinillä ja peitattiin Aquoamount'ssa.Washed with PBS followed by incubation with diluted Vectastai blocking serum for 20 min followed by undiluted Tie antibody (1: 1) overnight at 4 ° C or CD34 / von Willebrand factor (1:50) for 1 h. at room temperature. Biotinylated secondary antibody 15 was added for 45 min. followed by the addition of Vectastain ABC reagent for 30 min. The reaction was visualized with 0.2 mg / ml 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), 0.03% H 2 O 2, 14 mM acetic acid and 33 mM sodium acetate. Normal serum and antigen-blocked primary antibodies were used as controls. Sections were counterstained lightly with hematoxylin and stained in Aquoamount.
20 Todettiin Tie-proteiinin voimakasta värjäytymistä sekä hemagioblastoman (Kuva 4, A,B) verisuonien sisäpinnalla, ja vähemmässä määrin hemangioperisytomassa (C-F). Tie-proteiinin määrä vaihteli huomattavasti tuumorikudoksissa, esimerkiksi siten että se oli suurempi , vähemmän selvässä hemangioperisytoma-alueessa (E, F), ja matalampi 25 tavanomaisemmassa tuumorinäytteessä (C, D). Kokonaisuutena ilmentyminen oli kuitenkin selvästi korkeampi kuin normaaleissa aivon kuorikerroksen näytteissä joita on aikaisemmin analysoitu (23). Verrattuna vWF-immunovärjäykseen (B, D, F) Tie ei ilmentynyt hemangioperisytoma-tuumorisoluissa (C-F).Heavy staining of Tie protein was found both on the inner surface of the hemagioblastoma (Figure 4, A, B) and to a lesser extent on the hemangioperic cytoma (C-F). The amount of Tie protein varied significantly in tumor tissues, for example, being higher in the less obvious hemangioperic cytoma area (E, F), and lower in the more common tumor specimen (C, D). Overall, however, expression was significantly higher than in normal cortex samples previously analyzed (23). Compared to vWF immunostaining (B, D, F), the pathway was not expressed in hemangiopericytoma tumor cells (C-F).
:. 30 Nämä tulokset tukevat sitä hypoteesiä että Tie saattaa vaikuttaa näiden kahden vaskulaarisen tuumorin angiogeneesiin.:. These results support the hypothesis that Tie may influence the angiogenesis of these two vascular tumors.
27 111267 ESIMERKKI 1727 111267 EXAMPLE 17
Anti-Tie vasta-aineiden käyttöin vivo hiiren Lewis keuhkokarsionoma-mallissaUse of anti-Tie antibodies in vivo in a mouse Lewis pulmonary carcinoma model
Olemme tutkineet radioleimattujen (I125) anti-TIE monoklonaalisten 5 vasta-aineiden (10F11G6 ja 3C4C7G6) sitoutumista tärkeimpiin elimiin hiiressä sekä myös keuhkometastaaseihin määrittääksemme mahdollisuutta käyttää anti-TIE monoklonaalisia vasta-aineita pahanlaatuisen kasvun detektoimiseksi.We have investigated the binding of radiolabeled (I125) anti-TIE monoclonal antibodies (10F11G6 and 3C4C7G6) to major organs in the mouse as well as lung metastases to determine the possibility of using anti-TIE monoclonal antibodies to detect malignant growth.
Vasta-aineiden radioleimaus suoritettiin seuraavasti: 40 μ9 vasta-io ainetta leimattiin Chloramin-T-menetelmällä käyttäen 37 MBq Na-125l kuten julkaisussa Greenwood et ai., supra, 1963 kuvataan. Leimattu vasta-aine puhdistettiin Sephadex-G25:llä ja saattiin pääfraktioon 1.8 ml. Ennen in vivo biodistribuutiotutkimusten aloittamista kolmen radioleimatun vasta-aineen (3c4, 10F11, 7E8) affiniteettejä verrattiin solutestissä (Lindmo, Nucl Med 21: 15 807-810, 1984). Kaikki vasta-aineet sitoutuivat spesifisesti LE GD 14-2 soluihin, jotka ovat TIE-reseptoria ulkopinnallaan imentäviä transfektoituja hiiren endoteelisoluja, mutta 10F11 sitoutui oli kolmin kertaisesti verrattuna kuin muihin (21 pMoolia / 100 000 solua vs. 6-7 pMoolia / 100 000 solua).Radiolabelling of the antibodies was performed as follows: 40 μ9 antibodies were labeled by the Chloramin-T method using 37 MBq Na-125 I as described in Greenwood et al., Supra, 1963. The labeled antibody was purified with Sephadex-G25 and brought to a main fraction of 1.8 ml. Prior to initiating in vivo biodistribution studies, the affinities of three radiolabeled antibodies (3c4, 10F11, 7E8) were compared in a cell assay (Lindmo, Nucl Med 21: 15807-810, 1984). All antibodies bound specifically to LE GD 14-2 cells, which were transfected mouse endothelial cells that absorbed the TIE receptor on the outer surface, but 10F11 bound three-fold compared to the others (21 pMol / 100,000 cells vs. 6-7 pMol / 100,000 cells). ).
Keuhkokarsinomaeksperimenteissä käytimme 6 - 8 viikon ikäisiä 20 naarashiiriä (C57BI/6, Bomholtgaard, Tanska), joilla oli Lewis keuhkokarsinoma (LLC1/2) kasvaimia, jotka oli kasvatettu injisoimalla 1-10 M soluja 0.25 ml eläintä kohden lihaksensisäisesti oikeanpuoliseen takaraajaan.For lung carcinoma experiments, we used 20 female mice 6-8 weeks old (C57BI / 6, Bomholtgaard, Denmark) with Lewis lung carcinoma (LLC1 / 2) tumors grown by injection of 1-10 M cells per animal into the right hindlimb.
Hiirten kilpirauhaset kyllästettiin jodilla aloittamalla Kl-liuoksen anto 25 vuorokautta ennen radioleimattujen vasta-aineiden injisointia ja sitä jatkettiin koko eksperimentin ajan antaen Kl-liuosta 400mg/100ml ad libidum.The thyroid glands of mice were saturated with iodine by initiating administration of KI solution 25 days prior to injection of radiolabeled antibodies and continued throughout the experiment, giving KI solution 400 mg / 100ml ad libidum.
I125-leimattujen anti-TIE-vasta-aineiden jakaantuminen elimistöön tutkittiin 24, 48, 72,96 ja 120 tunnin kohdalla suonensisäisen vasta-aine-injektion jälkeen (30 ng 20 mM PBS:ssä). Todettiin 14 Lewis 30 keuhkokarsinoma koe-eläintä, joissa oli keuhko metastaaseja, vasta-aineella 10F11: yksi 24 tunnin, kolme 48 tunnin, kolme 72 tunnin, kolme 96 tunnin ja neljä 7 vuorokauden jälkeen (katso Kuva 6). Keuhkometastaaseja todettiin 111267 28 vasta-aineella 3C4 kolmessa eläimessä, 24, 48 ja 120 tunnin jälkeen (katso Kuva 7).The distribution of I125-labeled anti-TIE antibodies in the body was examined at 24, 48, 72.96 and 120 hours after intravenous antibody injection (30 ng in 20 mM PBS). 14 Lewis 30 lung carcinoma test animals with lung metastases were detected with 10F11 antibody: one after 24 hours, three after 48 hours, three after 72 hours, three after 96 hours and four after 7 days (see Figure 6). Lung metastases were detected with 111267 with 28 antibodies 3C4 in three animals after 24, 48 and 120 hours (see Figure 7).
3C4 ei osoita sitoutumista keuhkometastaaseihin 48 tunnin kohdalla (kudos/veri- suhde 0.07), mutta molemmat vasta-aineet sitoutuvat 96 tunnin 5 kohdalla Lewis keuhkokarsinomamallissa metastaaseihin, kudos-veri-suhteiden ollessa 2.4 (3C4C7G6) ja 2.8 (10F11G6).3C4 shows no binding to lung metastases at 48 hours (tissue / blood ratio 0.07), but both antibodies bind to metastases at 96 hours 5 in the Lewis lung carcinoma model, with tissue-to-blood ratios of 2.4 (3C4C7G6) and 2.8 (10F11G6).
Vasta-aineiden 3C4 ja 10F11 hakeutuminen keuhkometastaaseihin on samankaltaista, molemmat vasta-aineet sitoutuvat metastaaseihin in vivo, mutta 10F11 sitoutuu voimakkaammin seerumiin, 20%ID/g 10F11 :n kohdalla 10 verrattuna 10%ID/g 3C4:n kohdalla 48 tunnin jälkeen.The application of antibodies 3C4 and 10F11 to lung metastases is similar, both antibodies bind to metastases in vivo, but 10F11 binds more strongly to serum, 20% ID / g at 10F11 compared to 10% ID / g at 3C4 after 48 hours.
ESIMERKKI 18EXAMPLE 18
Seeruminäytteiden analysointi IRMA-menetelmässäAnalysis of serum samples in the IRMA method
Normaalien ja syöpää sairastavien henkilöiden seeruminäytteitä on seulottu sandwich-tyyppisella immunoradiometrisellä menetelmällä (IRMA) 15 (Miles L. et ai., Nature 219:186-189(1968), jossa sieppaavat anti-TIE-vasta-aineet on kiinnitetty polystyreeniputkiin ja sekundaariset anti-TIE-vasta-aineet on leimattu 125l:lla käyttäen aikaisemmin mainittua Cloramin-T-menetelmää. Rekombinantti-TIE-proteiinia käytettiin standardinäytteenä antigeenin konsentraation määrittämiseksi seeruminäytteestä. Käytetyn 20 laimentamattoman standardi-näytteen konsentraatio määritettiin 280 nm:ssä. Standardikäyrän tekemiseksi käytettiin antigeenin laimennussarjaa, jossa tie-antigeenin konsentraatio oli 0. 18, 36, 72, 144, 720 ja 3600 pg/L. Kuvassa 9 esitetään neljän vasta-aineparin standardikäyrät, parina kiinnitetty ja leimattu vasta-aine.Serum samples from normal and cancer patients have been screened by sandwich-type immunoradiometry (IRMA) 15 (Miles L. et al., Nature 219: 186-189 (1968), in which anti-TIE capture antibodies are attached to polystyrene tubes and secondary anti-TIE -TIE antibodies are labeled with 125 I using the Cloramin-T method previously mentioned Recombinant TIE protein was used as a standard sample to determine antigen concentration in a serum sample The concentration of the 20 undiluted standard samples used was determined at 280 nm and diluted in a standard curve. , with tie antigen concentration of 0. 18, 36, 72, 144, 720 and 3600 pg / L. Figure 9 shows standard curves of four pairs of antibodies, paired and labeled antibody.
25 Tällä menetelmällä seulottiin rintasyöpä-, munasarja- ja eri keuhkosyöpiä sarastavien potilaiden sekä ei syöpää sairastavien potilaiden seeruminäytteitä. Ne potilaat joilla oli uusia kasvavia etäpesäkkeitä keuhkoissaan osoittivat kohonneita arvoja tässä testissä. Ne potilaat joiden tauti oli stabiili osoittivat arvoja jotka ovat verrattavissa ei syöpää sairastavien 30 potilaiden arvoihin. Kuvassa 10 esitetään määritetyt antigeenin seerumpitoisuudet 20 ei syöpää sairastavan potilaan ja kolmen tuoreen etäpesäkkeen omaavan syöpäpotilaan näytteissä. Pienisoluista keuhkosyöpää (SCLC) sairastava potilas luovutti 6 näytettä, kuukauden t 29 111267 väliajoin, ja munasarjasyöpäpotilas jolla oli alavatsassa metastaaseja luovutti 5 näytettä. Rintasyöpäpotilas jolla oli uusia keuhkometastaaseja luovutti kaksi näytettä. Kuvassa 10 käytetty vasta-ainepari oli 3C4C7G6 /10F11G6, jolla oli standardikäyrän mukaan parempi herkkyys (>5pg/L).25 This method screened serum samples from patients with breast cancer, ovarian and various lung cancers, and from non-cancer patients. Patients with new growing metastases in their lungs showed elevated values in this test. Patients with stable disease showed values comparable to those of non-cancer patients. Figure 10 shows the determined antigen serum concentrations in samples of 20 non-cancer patients and three recent metastatic cancer patients. A small cell lung cancer patient (SCLC) donated 6 samples, with monthly intervals of 29 to 111267, and an ovarian cancer patient with abdominal metastases donated 5 samples. A breast cancer patient with new lung metastases donated two samples. The antibody pair used in Figure 10 was 3C4C7G6 / 10F11G6, which had a higher sensitivity (> 5 µg / L) according to the standard curve.
5 « > - .5 «> -.
30 11126730, 111267
Applicant*oragent*fiic „ International applies -raNo.Applicant * oragent * fiic International applies -raNo.
referencenumber .Ia-MAB/SN__PCT/F1 9 5 / 0 0 1 7 Πreference number .Ia-MAB / SN__PCT / F1 9 5/0 0 1 7 Π
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISMINDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM
(PCTRule 13iii) A. The indication* made below relate to the microorganism referred to in the description on page 4 , line 15~20 .(PCTRule 13iii) A. The indication * made below relate to the microorganism referred to in the description on page 4, line 15 ~ 20.
B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet | ] Name of depositary institutionB. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet | ] Name of Depositary institution
DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND 2ELLKULTUREN GmbHDSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MICROORGANISMEN UND 2ELLKULTUREN GmbH
Address of depositary institution (including postal code and country)Address of Depositary institution (including postal code and country)
Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig DEUTSCHLANDMascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig DEUTSCHLAND
Date of deposit Accession Number 1993-12-02 DSM ACC2159Date Deposit Accession Number 1993-12-02 DSM ACC2159
C. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable) This information is continued on an additional sheet JJC. ADDITIONAL INDICATIONS (leave blank if not applicable) JJ
As regards the respective Patent Offices of the respective designated states, the applicant requests that a sample of the deposited microorganisms only be made available to an expert nominated by the requester until the date on which the patent is granted or the date on which the application has been refused or withdrawn or is deemed to be withdrawn D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (tflhr irnlinuiimr nrr nrtfrrtll dnignastd Stein) E> SEPARA IF. FURNISHING OF INDICATIONS (leone blank if not applicable)As regards the corresponding Patent Offices of the respective designated States, the Applicant requests that a sample of the deposited microorganisms be made available to an expert. been refused or withdrawn or is withdrawn to be withdrawn D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (tflhr irnlinuiimr nrr nrtfrrtll dnignastd Stein) E> SEPARA IF. FURNISHING OF INDICATIONS (Leone blank if not applicable)
The indications listed below will be submitted to tbe international Bureau isicr (specify dicgaurainaiurc of ti%eindicationse.g^ 'Accession Humber of Deposit')The indications listed below will be submitted to tbe International Bureau isicr (specify dicgaurainaiurc of ti% eindicationse.g ^ 'Accession Humber of Deposit')
For receiving Office use only For international Bureau use onlyFor receiving Office use only For International Bureau use only
This sheet was received with the international application □ This sheet was received by tbe International Bureau on: I□ This sheet was received by tbe International Bureau on: I
___ 21 APRIL 1995 ,UJJft.95)___ 21 APRIL 1995, UJJft.95)
Authorized officer , , ΉΓ; υ . Authorized officer e. MOyse \yAuthorized Officer,, ΉΓ; υ. Authorized Officer e. MOyse \ y
Fonn PCT/RQ/134 (July 1992)Fonn PCT / RQ / 134 (July 1992)
Claims (21)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI963901A FI111267B (en) | 1994-03-29 | 1996-09-27 | Antibody against a Tie-receptor tyrosine kinase - used to diagnose and treat neoplastic diseases and for radiological imaging |
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US22024094 | 1994-03-29 | ||
US08/220,240 US5955291A (en) | 1992-01-09 | 1994-03-29 | Antibodies recognizing tie receptor tyrosine kinase and uses thereof |
FI9500170 | 1995-03-29 | ||
PCT/FI1995/000170 WO1995026364A1 (en) | 1994-03-29 | 1995-03-29 | Monoclonal antibodies recognizing tie-receptor and their use |
FI963901A FI111267B (en) | 1994-03-29 | 1996-09-27 | Antibody against a Tie-receptor tyrosine kinase - used to diagnose and treat neoplastic diseases and for radiological imaging |
FI963901 | 1996-09-27 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI963901A0 FI963901A0 (en) | 1996-09-27 |
FI963901A FI963901A (en) | 1996-11-28 |
FI111267B true FI111267B (en) | 2003-06-30 |
Family
ID=26160225
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI963901A FI111267B (en) | 1994-03-29 | 1996-09-27 | Antibody against a Tie-receptor tyrosine kinase - used to diagnose and treat neoplastic diseases and for radiological imaging |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI111267B (en) |
-
1996
- 1996-09-27 FI FI963901A patent/FI111267B/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI963901A0 (en) | 1996-09-27 |
FI963901A (en) | 1996-11-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0753015B1 (en) | Monoclonal antibodies recognizing tie-receptor and their use | |
AU725238B2 (en) | Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers | |
ES2341625T3 (en) | ANTI-CD71 MONOCLONAL ANTIBODIES AND THEIR USES FOR THE TREATMENT OF MALIGNAL TUMOR CELLS. | |
US7183384B2 (en) | Monoclonal antibody 7H11 reactive with human cancer | |
US6024955A (en) | Peptides and monoclonal antibodies | |
JP2001521520A (en) | Anti-α-low v ▼ β-low 3 ▼ Integrin antibody antagonist | |
Sharifi et al. | Characterization of a phage display-derived human monoclonal antibody (NHS76) counterpart to chimeric TNT-1 directed against necrotic regions of solid tumors | |
JP7007758B2 (en) | Application of Radiolabeled Anti-PD-L1 Nanobodies in Cancer Prognosis and Diagnosis | |
US20220389113A1 (en) | Binding proteins to cub domain-containing protein (cdcp1) | |
JP5191036B2 (en) | Anti-human tenascin monoclonal antibody | |
Öhman et al. | A new antibody recognizing the vIII mutation of human epidermal growth factor receptor | |
KR100473824B1 (en) | Method of diagnosing and treating epithelioma | |
Ferrone et al. | Selection and utilization of monoclonal antibody defined melanoma associated antigens for immunoscintigraphy in patients with melanoma | |
US7074613B1 (en) | Monoclonal antibody directed against cells of human renal cell carcinoma | |
FI111267B (en) | Antibody against a Tie-receptor tyrosine kinase - used to diagnose and treat neoplastic diseases and for radiological imaging | |
CA2255540C (en) | Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers | |
CN117659203A (en) | anti-MET/EGFR bispecific antibody and drug conjugate thereof | |
WO1990012885A1 (en) | Monoclonal antibody for differentiation of squamous cell carcinoma antigens and method of use for same | |
CN116925220A (en) | IL20RB neutralizing antibody and medical application thereof | |
AU7243200A (en) | Antigen binding fragments that specifically detect cancer cells, nucleotides encoding the fragments, and use thereof for the prophylaxis and detection of cancers | |
Ważyńska et al. | Development of 89Zr and 68Ga-anti-CD103 Fab fragment based PET imaging for non-invasive assessment of cancer reactive T cell infiltration | |
NZ505305A (en) | Antigen binding fragments that inhibit an antibody comprising amino acid sequences of H and L chain V regions of a scFv from binding to the surface of a cancer cell |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |