DE3854581T2

DE3854581T2 - Antigen sf-25 des darm-adenokarzinoms sowie antikörper, die dieses antigen erkennen.

Info

Publication number: DE3854581T2
Application number: DE3854581T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Takahashi; Jack Wands
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1987-12-09
Filing date: 1988-12-09
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2008-12-10
Also published as: EP0397700A4; ATE128986T1; CA1339853C; DE3854581D1; JPH03504491A; NZ227280A; AU2829889A; EP0397700A1; AU629808B2; WO1989005307A1; EP0397700B1; US5212085A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das SF-25-Antigen von Colon-Adenokarzinomzellen und Antikörper und insbesondere monoklonale Antikörper, die gegenüber diesem Antigen reaktiv sind. Die Erfindung betrifft weiterhin kontinuierliche Hybridomzellinien, die solche monoklonalen Antikörper absondern können, und Verfahren zur Verwendung dieser Antikörper.

Hintergrund der Erfindung

Die Fähigkeit, monoklonale Antikörper zu erzeugen, hat die Identifizierung von tumorassoziierten Antikörpern ermöglicht. Monoklonale Antikörper relevanter Spezifizitäten können wertvolle Reagentien nicht nur für die Immunodiagnose und Immunotherapie, sondern auch bei der Erforschung von Tumorzellen im allgemeinen sein. Beispiele verschiedener Neoplasmen, an denen monoklonale Antikörper erzeugt worden sind, umfassen Leukämie (Seon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 845 (1983), Aota et al., Cancer Res., 43, 1093 (1983), Royston et al., Transplan. Proc., 13, 761 (1981)), Gliom (Bourdin et al., Canc. Res., 43, 2796 (1983), Schnegg et al., Canc. Res., 41,1209 (1981)), Melanom (Dippold et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 6114 (1980), Carrel et al., Canc. Res., 40, 2523 (1980)), Brustkarzinom (Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3199 (1981), Schlom et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77, 6841 (1980)), Lungenkarzinom (Cuttitta et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 4591 (1981)), Gebärmutterhalskrebs (Handley et al., PCT Publication No. WO 83/04313 (1983)), Blasenkarzinom (Masuko et al., J. Natl. Cancer Instit., 72, 523 (1984), Messing et al., J. Urol., 132, 167 (1984), Grossman, J. Urol., 130, 610 (1983), Stramignoni et al., Intl. J. Cancer, 31, 543 (1983), Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 1438 (1979), Kasai et al., J. Surg. Res., 30, 403-408 (1981)) und Prostatakarzonom (Ware et al., Canc. Res., 42, 1215 (1982), Starling et al., Canc. Res., 42, 3714 (1982)). Die Feststellung und Charakterisierung von menschlichen Tumorantigenen unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern wurden von Lloyds "Human Tumor Antigens: Detection and Characterization with Monoclonal Antibodies" in Herberman, Herausgeber, Basic and Clinical Tumor Immunology I, 159-214, N&ijlig;off, Boston (1983) berichtet. Lloyds Bericht umfaßt eine Erörterung der Verwendung monoklonaler Antikörper zur Feststellung von colorektalem Krebs. Lloyd, siehe oben, Seiten 181 bis 182.
Colon- und Mastdarmkrebs sind für etwa 20% aller Todesfälle aufgrund dieser bösartigen Krankheit in den Vereinigten Staaten verantwortlich. Die Ursache für colorektalen Krebs, der Männer und Frauen in etwa gleich befällt, ist unbekannt. Trotz Fortschritten bei der Behandlung von colorektalem Krebs ist die Todesfallquote für diese Krankheit heutzutage die gleiche wie vor 40 Jahren. Der wichtigste Faktor bei der schlechten Prognose für das colorektale Karzinom ist die Verzögerung bei der Diagnose der Krankheit. Da die Symptome von colorektalem Krebs häufig in dem frühen Stadium der Krankheit vage und unspezifisch sind, wird die Erkennung oft verzögert. Folglich ist der Krebs zum Zeitpunkt der Erstellung einer positiven Diagnose oft so weit fortgeschritten, daß eine Heilung schwierig oder unmöglich ist. So haben beispielsweise Patienten, deren Tumor auf die Darmwand beschränkt ist, im allgemeinen eine ausgezeichnete Heilungschance nach einer chirurgischen Resektion (fünfjährige Überlebensrate > 95%). In den Fällen, in denen sich der Tumor auf die Serosa und das mesenterische Fett ausgedehnt hat, sinkt die fünfjährige Überlebensrate nach der Resektion auf 80%. Lymphknotenmetastasen verringern die fünfjährige Überlebensrate auf 40%, während Fernmetastasen (beispielsweise Leber, Lunge, Knochen, Gehirn) die fünfjährige Überlebensrate auf Null verringern.
Üblicherweise verwendete Untersuchungstests nach colorektalem Karzinom tragen zu der verspäteten Feststellung der Krankheit bei. Der Gujak-Test, der verborgenes Blut im Stuhl entdeckt, erfordert beispielsweise, daß ein bösartiger Colontumor bis zum Blutungsstadium fortgeschritten ist, bevor er entdeckt werden kann. Dieser Test leidet außerdem an geringer und unterschiedlicher Empfindlichkeit aufgrund von Farbstoffinstabilität. Die Sigmoidoskopie erfordert, daß jedes colorektale Karzinom sichtbar ist, und die Diagnose kann durch das Vorhandensein von anderen Läsionen wie Hämorrhoiden, Polypen und Proktitis kompliziert werden. Die Coloskopie hat ähnliche Nachteile.
Die Unzulänglichkeiten der gegenwärtig verfügbaren Untersuchungsmethoden ist vielleicht ein Grund dafür, daß viele colorektale Karzinome zuerst als Ergebnis einer Komplikation der ursprünglichen Läsion diagnostiziert werden. Beispielsweise kann eine Darmwand durch den Tumor perforiert sein, wodurch eine akute Bauchfellentzündung hervorgerufen wird. Offensichtlich ist in einem solchen Fall der Krebs zum Zeitpunkt der Erstellung einer Diagnose sehr fortgeschritten.
Eine verzögerte Feststellung ist demnach ein Hauptfaktor, der zu einer ins gesamten fünfjährigen Überlebensrate von nur etwa 50% für maligne colorektale Tumore beiträgt. Die Diagnose und die Behandlung von colorektalem Krebs ist in LaMont et al., "Disease of the Small and Large Intestine", in: Petersdorf et al., Herausgeber, Harrison's Principles of Internal Medicine, 10. Auflage, McGraw Hill Verlag, New York, Seiten 1762-1765 (1983) beschrieben.
Colorektale Karzinome sprechen im allgemeinen schlecht auf Chemotherapie an. Obgleich eine Linderung erzielt werden kann, hat es sich nicht gezeigt, daß die Chemotherapie das Leben von Patienten mit der Diagnose eines colorektalen Krebses verlängert, insbesondere, wenn sich die Krankheit weit ausgebreitet hat. DeVinta "Principles of Cancer Therapy", in: Harrison's Principles of Internal Medicine, siehe oben, Seite 783 und Tabelle 125-7.
Die potentielle Spezifizität monoklonaler Antikörper bezüglich antigener Determinanten, die mit menschlichen Tumorzellen assoziiert sind, hat Forscher und Kliniker dazu gebracht, monoklonale Antikörper bezüglich ihrer diagnostischen und therapeutischen Verwendung bei der Behandlung von colorektalem Krebs zu erforschen. Die potentielle klinische Nützlichkeit monoklonaler Antikörper umfaßt die Feststellung von menschlichen Krebserkrankungen mittels Immunohistochemie (Gatter et al., Semin. Oncol., IX, 517-525 (1982), Herlyn et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA, 76, 1438-1442 (1979)), Autoradiographieabbildung (Neville et al., Hum. Pathol., 13, 1076-1081 (1982)) und die Verwendung monoklonaler Antikörper als therapeutische Mittel (Levy et al., Ann. Rev. Med., 34, 107-110 (1983)).
Sakamoto et al. (Europäische Patentveröffentlichung 0 119 556 A2) offenbaren beispielsweise die Verwendung eines Satzes von monoklonalen Antikörpern, die in Mäusen, die mit menschlichen gastrointestinalen Tumoren immunisiert worden sind, gezüchtet wurden, um die Existenz eines Colonkarzinoms zu diagnostizieren. Diese monoklonalen Antikörper erkennen antigene Determinanten, die sowohl an normalen als auch an kanzerösen, gastrointestinalen Zellen vorhanden sind. Obgleich angegeben wird, daß diese monoklonalen Antikörper zur Behandlung von gastrointestinalen Tumoren verwendet werden können, setzt die beträchtliche Kreuzreaktivität dieser monoklonalen Antikörper mit normalem Gewebe ihre therapeutische Nützlichkeit auf ein Minimum herab. Die durch diesen Satz monoklonaler Antikörper erkannten Antigene waren entweder Glycoproteine oder Glycolipide mit Molekulargewichten von 25 Kd, 29 Kd, 52 Kd oder 95 Kd. Vier der 12 monoklonalen Antikörper hatten die IgM Klasse. Der monoklonale IgM Antikörper, der die beste Reaktivität mit Colonkarzinomzellen (12/17) zeigte, kreuzreagierte mit Pankreaskrebs-, Brustkrebs-, Eierstockkrebs- und Lungenkrebszellen. Außerdem kreuzreagierte er mit normalem Erwachsenengewebe aus Lunge, Leber, Gallenblase, Speiseröhre, Kolon, Pankreas, Harnleiter, Brust, Prostata, Schweißdrüse und Sekretionen.
Lindholm et al., Intl. Arch. Allergy Appl. Immunol. 71, 178 (1983), immunisierte Mäuse mit einer colorektalen Adenokarzinomzellinie für Lebermetastasenmembrane von einem Patienten mit einem Colonadenokarzinom, um monoklonale Antikörper zu erzeugen. Drei monoklonale Antikörper der IgM Klasse wurden identifiziert, die mit colorektalen Adenokarzinomzellinien, Extrakten von gepoolten Adenokarzinomen und einzelnen gastrointestinalen Tumoren, aber nicht mit anderen Zelltypen reagierten. Der Antigenkomplex wurde als Monosiaiogangliosid identifiziert, aber das Antigen wurde nicht weiter charakterisiert.
Koprowski et al., US Patent 4 349 528, beschreiben die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der für das kommerzielle karzinoembryonale Antigen (CEA) mit einem Molekulargewicht von etwa 180 Kd spezifisch ist. Der monoklonale Antikörper band sich nicht an Antigene der colorektalen Karzinomzellen mit anderen Molekulargewichten als 180 Kd.
Sakamoto et al., Fed. Proc. 44(3), 792 (Abstrakt 2222) (1985) beschreiben Antigene aus dem menschlichen Kolonkarzinom, die mit monoklonalen Antikörpern reagierten, die durch die Immunisierung mit gezüchteten, menschlichen Colon- und Pankreaskarzinomen oder mit Lysaten von Colonkrebszellen erhalten wurden. Zwei der Antigene K-314 (gp170) und V-215 (gp140) wurden nur in Colon- und einigen Lungenkrebszellinien festgestellt. Weder die Klasse der betreffenden monoklonalen Antikörper noch die individuellen Spezifizitäten dieser monoklonalen Antikörper mit Bezug auf die Antigene ist offenbart.
Herlyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76(3), 1438 (1979) beschreiben die Feststellung eines Antigens, das für colorektales Karzinom spezifisch ist unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern (1083-17 und 1116-56), die 8/9 menschliche kolorektale Karzinome feststellten. Keine Daten sind enthalten, die die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des betreffenden Antigens charakterisieren. Beide monoklonale Antikörper hatten die Klasse IgM.
Magnani et al, Science 212, 55 (1981) beschreiben die teilweise Charakterisierung eines Antigens, das in Colonkarzinomzellen vorhanden ist und das mit einem monoklonalen Antikörper reagiert. Das Molekulargewicht des Antigens, das nicht auf Homogenität gereinigt wurde, wurde nicht bestimmt, obgleich aufgrund seiner chemischen Reaktivität und Empfänglichkeit für bestimmte Enzyme der Schluß gezogen wurde, daß das Antigen ein Monosialogangliosid war. Das Antigen wurde auch in menschlichem Mekonium, einer reichen Quelle von normalen fötalen Glycolipiden, gefunden.
Steplewski et al., Canc. Res. 41, 2723 (1981) beschreiben die Freisetzung von durch monoklonale Antikörper definierte Antigene durch menschliche colorektale Karzinom- und Melanomzellen. Einige der festgestellten Antigene wurden in die Gewebekultur freigesetzt, während andere nicht in den Gewebekulturüberständen festgestellt werden konnten. Es wird festgestellt, daß ein Monosialogangliosidantigen durch Tumorzellen freigesetzt wurde, aber nicht durch normales Colongewebe und daß dieses Antigen nicht in dem Serum normaler Personen gefunden wurde. Dieses Antigen ist jedoch nicht weiter charakterisiert worden. Drei andere monoklonale Antikörper (NS-3a- 22, NS-10 und NS-33a) reagierten mit einem Glycolipidantigen, das von den meisten colorektalen Karzinomzellen freigesetzt wird. Zwei davon (NS-33a und NS-10) waren von dem Isotyp IgM.
Herlyn et al., Intl. J. Cancer, 27, 769 (1981) untersuchten die complementabhängige Cytotoxizität der vier Hybridomzellinien (NS-10, NS-33a, NS-38a und NS-38c), die colonkarzinomspezifische Antikörper des Isotyps IgM erzeugten. Diese monoklonalen Antikörper wiesen eine complementabhängige Cytotoxizität gegen Colonkarzinomzellen auf.
Chang et al., Hybridoma, 1, 27 (1981) beschreiben die Feststellung eines monoklonalen, antikörperdefinierten colorektalen Karzinomantigens unter Verwendung eines Festphasenbindungsinhibierungsradioimmunoassays. Es wurde berichtet, daß zwei der monoklonalen Antikörper für das an dem colorektalen Karzinom vorhandene Antigen spezifisch waren. Dieses Antigen konnte unter Verwendung von 3M KCl extrahiert werden und war ein Glycolipid.
Die diagnostische Verwendung von monoklonalen Antikörpern in colorektalen Karzinomen wird von Lloyd, siehe oben und von Davis et al., in: Prasad et al., Herausgeber., Novel Approaches to Cancer Chemotherapy, Academic Press, New York (1984) (siehe beispielsweise Tabelle II auf Seite 43, in der die mit Tumoren assoziierten Antigene von gastrointestinalen und colorektalen Tumoren (unter anderem), die durch verschiedene Forscher identifiziert wurden, dargelegt sind.
Wie die vorstehend angegebenen Erörterungen zeigen, besteht trotz dem seit langer Zeit bestehenden, wissenschaftlichen Interesse an der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern für menschliche colorektale Karzinomantigene weiterhin ein Bedarf an einem monoklonalen Antikörper, der einen hohen Grad an Spezifizität für colorektale Karzinome aufweist. Ein solcher monoklonaler Antikörper sollte keine beträchtliche Kreuzreaktivität weder mit normalen menschlichen Geweben noch mit anderen malignen Zelltypen aufweisen. Wilson et al. (Hepatology, 7 (5), Abstract 416) erwähnt einen monoklonalen Antikörper, der ein 120 kD Zelloberflächenprotein erkennt. Es ist jedoch keine Hybridomablagerung, die diesen Antikörper erzeugt, erwähnt, und das Zelloberflächenantigen, an den sich der Antikörper bindet, ist auch nicht eindeutig definiert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft den monoklonalen Antikörper SF-25 und seine Verwendungen bei der Diagnose und Behandlung von Colonadedenokarzinomen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Molekül, das sich an das SF-25-Antigen einer Kolonadenokarzinomzelle binden kann, wobei das Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
(a) einem Antikörper, der im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist,
(b) einem monoklonalen Antikörper,
(c) einem Fragment von (a) oder (b).
Die Erfindung umfaßt auch eine Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Antikörper absondern kann, wobei der Antikörper sich an das SF-25-Antigen einer Colonadenokarzinomzelle binden kann.
Die Erfindung betrifft auch ein Hapten, das sich an den Antikörper binden kann, wobei der Antikörper das SF-25-Antigen einer Colonadenokarzinomzelle binden kann.
Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Festellung, ob ein Tier eine Colonadenokarzinomzelle enthält, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Kontaktieren des Gewebes des Tiers, von dem vermutet wird, daß es diese Zelle enthält, mit einem feststellbar markierten Molekül, das sich an ein SF-25-Antigen einer Colonadenokarzinomzelle binden kann, und
(b) Feststellen von jedem an das Antigen gebundenen Molekül.
Die Erfindung umfaßt außerdem ein Verfahren zum Unterdrücken des Wachstums einer Colonadenokarzinomzelle in einem Tier, welches umfaßt, das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Moleküls an ein Tier, das das SF-25-Antigen einer Colonadenokarzinomzelle binden kann.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Darstellung einer ¹²&sup5;I-SF-25-Bindung an Antigene exprimiert, an verschiedenen Tumorzellinien (Tabelle 1).
Fig. 2 zeigt die Vergleichsbindung von ¹²&sup5;I-SF-25 an Membranen, die aus normalen Gewebe, einem Colonadenokarzinom (LS-180) und Herdzellen (immunisierender Zelltyp) hergestellt wurden. ¹²&sup5;I-SF-55 ist ein weiterer, gegen Herdzellen gerichteter, monoklonaler Antikörper, der jedoch ein Antigen erkennt, das aufallem menschlichen Gewebe und Tumorzellinien vorhanden ist.
Fig. 3 zeigt ein Darstellung einer ¹²&sup5;I-SF-25 Bindungspezifität an LS-180-Zellen durch den nichtradioaktiven SF-25-Antikörper.
Fig. 4 zeigt die direkte Bindung von ¹²&sup5;I-SF-25 an Membranzubereitungen, die von Adenokarzinomen des Colon und des benachbarten normalen Colon abgeleitet sind. Die spezifische normale Bindung bezieht sich auf CPM-gebunden, d. h. von kaltem SF-25, aber nicht SF-55, inhibiert (monoklonale Antikörperkontrolle). Die Proteinkonzentration aller Membranzubereitungen, die auf den Filter verbracht wurden, war die gleiche.
Fig. 5 zeigt die Bioverteilung von ¹²&sup5;I-SF-25 in nackten Mäusen, die LS-180 erzeugte Adenokarzinome des Colon tragen. Jeder Zeitpunkt stellt die durchschnittlichen Werte von drei Mäusen dar.
Fig. 6 zeigt die spezifische Lokalisierung von ¹²&sup5;I-SF-25 an Tumoren im Vergleich zu einem ¹³¹I-markierten, monoklonalen Kontrollantikörper. Der Lokalisierungsindex ist ein Verhältnis zwischen diesen beiden Werten.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung eines neuen, mit "SF-25" bezeichneten Antigens, das auf der Oberfläche menschlicher Adenokarzinomzellen des Colon exprimiert ist. Die Identifizierung dieses neuen Antigens und die Fähigkeit, das Antigen an Antikörper oder Fragmente von Antikörpern zu binden, schafft ein Verfahren zur Diagnose des Vorhandenseins von Adenokarzinomen des Colon. Außerdem schaffen das SF-25-Antigen und Antikörper, die das SF-25-Antigen binden können, ein Verfahren zur Unterdrückung des Wachstums der Adenokarzinomzellen des Colons.

I. Allgemeine Eigenschaften des SF-25-Antigens

Das durch MAb SF-25 identifizierte Antigen scheint neu und nicht vorbeschrieben zu sein. Einige der interessanteren Merkmale sind: 1) Seine konstitutive Expression an Colonadenoakarzinomen in vivo und seine relativ einheitliche Verteilung in den meisten, falls nicht allen Tumorzellen. 2) Das Epitop, an das SF-25 bindet, scheint ziemlich instabil zu sein und einer leichten Fixierung, Denaturierungsgels und Detergensextraktion gegenüber empfindlich zu sein. 3) Das Epitop ist auf der Zelloberfläche resident und ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 125 kd wie durch ¹²&sup5;I-Markierungsexperimente und anschließender Immunoausfällung mit dem SF-25 Mab, gefolgt von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gezeigt. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu den meisten zuvor beschriebenen Antigenen, die mit malignen gastrointestinalen Tumoren assoziiert sind, bei denen die weitere Charakterisierung eine Muzinglycoprotein- oder Glycolipidstruktur gezeigt hat (Johnson, U.G., et al., Canc. Res., 56, 850-857 (1986), Lun, M., et al., Canc. Res. 45, 305-310 (1985), Pant, K.D., et al., Immunol. Commun, 6, 411-421 (1977), Magnani, J.L., et al., J. Biol. Chem., 257, 14 365- 14 369 (1982), Shi, Z.A., et al., Canc. Res., 44, 1142-1147 (1984), Fukushima, K., et al., Canc. Res., 44, 5279-5285 (1984)). In dieser Hinsicht können einige der Eigenschaften des SF-25-Antigens teilweise auf den immunisierenden Zelltyp zurückzuführen sein. Die FOCUS-Zellinie wurde aus einem menschlichen Leberzellenkarzinom abgeleitet, und es wurde nicht erwartet, daß sie eine große Menge an Muzinglycoproteinen absondern würde (Lun, H., et al., In Vitro, 20, 493-504 (1984)). 4) Das Antigen ist sehr eng mit dem bösartigen Phänotyp verbunden und scheint nicht auf einem benachbarten, normalen Colongewebe oder anderen normalen Geweben mit der Ausnahme einer Subpopulation der distalen röhrenförmigen Zellen der Niere exprimiert zu sein. SF-25 bindet an 6/6-Colon- und Hepatomzellinien sowie an mehrere andere (Fig. 1). So ist das Epitop nicht auf einen spezifischen Tumorzelltyp beschränkt und spiegelt ein Antigen wider, das sehr eng mit der bösartigen Transformation verbunden ist.
Das SF-25-Antigen unterscheidet sich von vorstehend beschriebenen, mit Adenokarzinomen des Colons verbundenen Antigenen. Das gut charakterisierte, karzinoembryonische Antigen (CEA) ist ein Glycoprotein mit einem höheren Molekulargewicht (MG = 180 kd) (Westwood, J. H., et al., Immunochem. 11, 811-818 (1974)). CA19-9 erkennt eine Kohlehydratdeterminante, die sowohl auf Muzinglycoproteinen als auch Lipiden gefunden wird (Magnani, J.L., et al., Science, 212, 55-56 (1981), Magnani, J.L., et al., Canc. Res., 43, 5489-5492 (1983)). CO29.11 erkennt ein sialyliertes Lewis a (Lea) Antigen, aber ist auf ein unterschiedliches Epitop gerichtet und weist eine höhere Bindungsaffinität als CA19-9 auf (Herlyn, M., et al., J. Immunol. Met., 80, 107-116 (1985)). In ähnlicher Weise erkennt DU-PAN-2 ein muzinartiges Antigen, das aus einem menschlichen Pankreasadenokarzinom (1b) isoliert wurde. Monoklonale Antikörper, die gegen solche Antigene gerichtet sind, reagieren nicht gleichförmig mit allen Adenokarzinomen des Colon durch Immunoperoxidaseanfärbung (Atkinson, B.F., et al., Canc.
Res., 42, 4820-4823 (1982) oder durch direkte Bindungsassays. Die Erkenntnis kann teilweise auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß viele der MAbs an Epitope binden, die eine posttranslationelle Modifikation der "normalen Zell " -Proteine darstellen und nicht an primäre Genprodukte, die mit bösartiger Transformation assoziiert sind. Diese großen "tumorassoziierten" Antigene sind im allgemeinen nach einer Formaldehydfixierung und Einbettung in Paraffin stabil. Außerdem stellen CEA, CA 19-9, DU-PAN-2 und CO 29.11 Zellprodukte dar, die in Zellkulturüberstände aus dem immunisierenden Zelltyp abgesondert oder abgestoßen werden. Sie befinden sich oft in dem Serum von Patienten mit einer Vielzahl von bösartigen, gastrointestinalen Tumoren (Herlyn, M., et al., J. Immunol. Met., 80, 107-116 (1985), Atkinson, B.F., et al., Canc. Res., 42, 4820-4823 (1982), Del Villano, B.C., et al., Clin. Chem., 29, 549-552 (1983), Metzger, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5242-5246 (1984)). Im Gegensatz dazu wurde das SF-25-Antigen nicht in Zellkulturüberständen aus Hepatom- und Colonadenokarzinomzellnien oder in dem Serum von Patienten mit bösartigen, gastrointestinalen Tumoren durch einen homologen, immunoradiometrischen "Simultansandwich"-Assay identifiziert (Wands, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 1214-1218 (1981)).
Ein weiterer gut charakterisierter, monoklonaler Antikörper, der als B72.3 bezeichnet wird, wurde-gegen eine membranreiche Fraktion einer aus einem Brustkarzinom abgeleiteten Metastase erzeugt (Colcher, D.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 3199-3203 (1981)). Dieser Antikörper erkennt eine großes Muzinglycoprotein TAG-72 (tumorassoziiertes Glycoprotein) mit einem Molekulargewicht > 1000 kd (Johnson, U.G., et al., Canc. Res., 56, 850-587 (1986)). Das Antigen wurde in nur 1 von 18 Colonkrebszellinien exprimiert (Horan Hand, P., et al., Canc. Res., 45, 833-840 (1985)), aber es wurde in vivo in 80 bis 85% der Colonadenokarzinome und ihren Metatasen festgestellt (Stramignoni, D., et al., Int. J. Canc., 31, 543-552 (1983)). Es wurde gefunden, daß die in vivo Verteilung, wie durch Immunoperoxidaseanfärbung von mit Formaldehyd fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben gezeigt, ziemlich heterogen war. Die Bindung von B72.3 an sein Epitop an TAG-72 wurde wesentlich durch Neuraminidaseverdauung verringert, und dies legt nahe, daß Sialsäure eine wichtige Strukturkomponente des Epitops ist (Johnson, U.G., et al., Canc. Res., 56, 850-587 (1986)). TAG-72 Antigen wurde auch in dem Serum von Patienten mit bösartigen, gastrointestinalen Tumoren gefunden (Paterson, A.J., et al., Int. J. Canc. 37, 659-666 (1986)). Ein weiterer Antikörper, der gegen ein 200 kd Antigen erzeugt wird, das auf einer Membranfraktion resident ist, die aus einer primären Colonadenokarzinomzellinie abgeleitet ist, wurde auch beschrieben (Muraro, R., et al., Int. J. Canc. 39, 34-44 (1987)). Die Antigenexpression scheint jedoch mit einem differentierteren Zustand zu korrelieren und deshalb wird es sehr auf normalen Colon und weniger auf dem transformierten Phänotyp exprimiert.
Es gibt jedoch ein vorbeschriebenes MAb mit einigen dem SF-25 ähnlichen Merkmalen. Der 17.1A Antikörper wurde gegen eine colorektale Adenokarzinomzellinie erzeugt (Herlyn, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 1438-1442 (1979)) und erkennt ein labiles Antigen, das der Methanol-, Ethanol- und Formaldehydfixierung und Paraffineinbettung gegenüber empfindlich ist (Shen, J., et al., Int. J. Canc., 33, 465-468 (1984)). Außerdem ist das Antigen einer Neuraminidasebehandlung gegenüber resistent, und die Bindungsaktivität wird durch Proteasebehandlung aufgehoben, was eine Nichtmuzin- Nichtsialsäure-Struktur mit Bezug auf die 17.1A Bindungsdomäne nahelegt. Außerdem ist das Antigen an den distalen, gewundenen, röhrenförmigen Zellen der Niere wie SF-25 vorhanden und wird auf den meisten Adenokarzinonem des Colon in situ durch Immunoperoxidaseanfärbung frisch gefrorener Gewebeabschnitte exprimiert; das Molekulargewicht beträgt jedoch etwa 40.000 Dalton. MAb 17.1A scheint vom SF-25-Antigen unterschiedlich zu sein, da es auf normalem Colon und Dünndarm wie auch Pankreas, Gallenblase, Ductus cysticus und Schweißdrüsen sehr exprimiert wird (Shen, J., et al., Int. J. Canc., 33, 463-468 (1984)). Der 17.1A IgG2a Antikörper ist von besonderem Interesse, weil er anscheinend ein Potential für die in vivo Immunotherapie des Colonadenokarzinoms hat (Herlyn, D.M., et al., Canc. Res., 40, 717-721 (1980), Herlyn, D.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 4761-4765 (1982), Sears, H.F., et al., Lancet 1, 762-765 (1982), Koprowski, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81, 216-219 (1984)). Vor kurzem wurde ein Chimären-Maus-Mensch-Konstrukt mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt, und der Hybrid zeigte die gleichen biologischen und Antigen-Bindungseigenschaften wie das native Molekül (Shaw, D. R., et al., J. Immunol., 138, 4534-4538 (1987)).
Schließlich wird eine Reihe anderer monoklonaler Antikörper beschrieben, die mit Adenokarzinomen des Colon sowohl in vitro als auch in vivo reagieren (Bleday, R., et al., Cancer, 57, 433-440 (1986), Finan, P.J., et al., Br. J. Canc., 46, 9- 17 (1982), Thomson, C.H., et al., Br. J. Canc., 57, 595-605 (1983), Lindholm L., et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 71, 178-181 (1983), Koszubowski, P.A., et al., Canc. Res., 44, 1194-1199 (1984), Drewinko, B., et al., Canc. Res., 46, 5137-5143 (1986)). Einige von ihnen sind gegen Glycoproteindeterminanten gerichtet (Bleday, R., et al., Cancer 57, 433-440 (1986), Koszubowski, P.A., et al., Canc. Res., 44, 1194-1199 (1984)) und beschränktes Spezifizitätstesten bis heute legt nahe, daß sie sich von dem hier beschriebenen SF- 25-Antigen ziemlich unterscheiden. Solche Antikörper wurden in einem Versuch erzeugt, um zwischen den antigenen Eigenschaften der normalen Colonepithelzelle und ihrem transformierten Phänotyp zu unterscheiden. In dieser Hinsicht wurde vor kurzem ein Muzinglycoproteinantigen, als "großes äußeres Antigen" (LEA) bezeichnet, beschrieben (Bleday, R., et al., Cancer 57, 433-440 (1986); es scheint konstitutiv an 17/17 Colonkrebs durch Immunoperoxidaseanfärbung von frischem Gewebe exprimiert zu werden, aber wurde nicht an normalem Colongewebe gefunden. Diese antigene Determinante, die von Mab ND-1 identifiziert wurde, war Neuraminidase gegenüber empfindlich und wird an fötalem Colon und Gallenepithel sowie normalem Gebärmutterhals und Uterus exprimiert. Die Autoren spekulieren, daß LEA ein mit dem bösartigen Phänotyp assoziiertes Muzinglycoprotein ist.
Das SF-25-Antigen ist wahrscheinlich ein primäres Genprodukt, da es in allen (17/17) Adenokarzinomen des Colon, die bis jetzt untersucht wurden, und nicht auf benachbartem, normalen Colon konstitutiv exprimiert wird. Das Antigen zeigte sich an der Zelloberfläche, wie durch direkte Bindungsuntersuchungen mit lebenden Zellen (Fig. 2 und 3) gezeigt. ¹²&sup5;I-Zellmarkierungsexperimente liefern einen weiteren Beweis für seinen Standort auf der Oberfläche maligner Zellen. So wäre das Epitop für die Bindung mit ¹²&sup5;I-markiertem SF-25 in vivo verfügbar. Und, was wesentlicher ist, scheint es wenig Heterogenität der Antigenverteilung unter Tumorzellen innerhalb des Colontumors oder zwischen unterschiedlichen Tumoren zu geben. Das Antigen wird nicht aus Colonadenokarzinomzellinien in das Kulturmedium abgestoßen oder ist in dem Serum von Patienten mit colorektalem Krebs zumindest nicht in Mengen vorhanden, die durch einen radioimmunometrischen Assay feststellbar sind. So kann der radioaktiv markierte Antikörper die Tumorzellfläche erreichen, ohne in Immunkomplexen eingeschlossen zu werden. Es ist möglich, daß SF-25 sich an ein konformationsbezogenes oder diskontinuierliches Epitop auf dem 125 kd Protein bindet. Dieses Epitop scheint nicht ein Produkt posttranslationaler Modifikationen zu sein, was teilweise seine konstitutive und homogene Begrenzung auf den malignen Colonphänotyp erklären kann.

II. Das SF-25-Antigen

Das neue Antigen, SF-25, kann durch die Verwendung einer Vielzahl von Methoden so gereinigt werden, daß es im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist. Wie hier verwendet bedeutet, wenn gesagt wird, daß eine Verbindung (wie ein Antikörper, ein Antigen, ein Hapten oder Fragmente solcher Moleküle) "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen" ist, daß sie im wesentlichen von Materialien gereinigt wurde, mit denen sie normalerweise und in der Natur gefunden wird. Das SF-25-Antigen kann durch die Anwendung der chromatographischen Standardtrennungstechnologie gereinigt werden. Alternativ und mehr bevorzugt kann das SF-25-Antigen unter Verwendung von Immuno-Affinitätschromatographie (Rotman, A., et al., Biochim. Biophys. Acta, 641, 114-121 (1981), Sairam, M.R., J. Chromatog., 215, 143-152 (1981), Nielsen, L.S., et al., Biochemistry, 21, 6410-6415 (1982), Vockley, J., et al., Biochem. J. 217, 535-542 (1984), Paucha, E., et al., J. Virol., 51, 670-681 (1984), Chong, P., et al., J. Virol. Meth., 10, 261-268 (1985).
Wie für Fachleute leicht ersichtlich ist, kann das gereinigte SF-25 Protein fragmentiert werden, um "funktionelle Derivate" zu erzeugen, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar sind. Außerdem kann gereinigtes SF-25 (oder dessen Fragmente) zur Bestimmung seiner Aminosäuresequenz analysiert werden. Die Verfügbarkeit einer solchen Sequenzinformation gestattet die Erzeugung des SF-25-Antigens (oder seiner Fragmente) durch synthetische chemische Techniken.
Wie hier verwendet ist ein "funktionelles Derivat" des SF-25- Antigens eine Verbindung, die eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) besitzt, die im wesentlichen gleich einer biologischen Aktivität von SF-25 ist. Es wird gesagt, daß ein Molekül "im wesentlichen" einem anderen Molekül gleich ist, wenn beide Moleküle im wesentlichen gleiche Strukturen besitzen oder wenn beide Moleküle eine gleiche biologische Aktivität besitzen. Die "funktionellen Derivate" von SF-25 umfassen sowohl "Fragmente" als auch "Varianten" des SF-25. Der Ausdruck "Fragment des SF-25" soll sich aufirgendeine Polpeptiduntergruppe des Moleküls beziehen. Der Ausdruck "Variante des SF-25" soll sich auf ein Molekül beziehen, das im wesentlichen von gleicher Struktur mit Bezug auf entweder das ganze Molekül oder einem Fragment davon ist, vorausgesetzt, daß die "Variante" mindestens eine biologische Aktivität aufweist, die entweder einer Aktivität des SF-25 ähnlich ist oder eine Aktivität des SF-25 inhibiert. Somit wird, vorausgesetzt, daß ein Molekül mindestens eine biologische Aktivität besitzt, die entweder einer Aktivität des SF-25 gleich ist oder eine solche Aktivität inhibiert, dieses als "Variante" des SF-25 betrachtet, wie dieser Ausdruck hier verwendet wird, selbst wenn eines der Moleküle eine oder mehr Aminosäuren enthält, das in dem anderen nicht vorhanden ist, oder wenn die Sequenzen der Aminosäurereste in den beiden Molekülen nicht identisch sind.

III. SF-25-Antikörper und -Antikörperfragmente

In der nachfolgenden Beschreibung wird auf verschiedene, Fachleuten auf dem Gebiet der Immunologie wohlbekannte Methodologien Bezug genommen. Standardnachschlagewerke, die die allgemeinen Prinzipien der Immunologie darlegen umfassen das Buch von Klein, J. (Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982)), Kennett, R., et al., (Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980)), Campbell, A. ("Monoclonal Antibody Technology" in: "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 13 (Burdon, R., et al., Herausgeber),- Elsevier, Amsterdam (1984)) und Eisen, H.N., (in "Microbiology, 3. Auflage (Davis, B.D., et al., Harper & Row, Philadelphia (1980)).
Es wird gesagt, daß ein Antikörper "imstande ist, ein Molekül zu binden", wenn er imstande ist, mit dem Molekül spezifisch zu reagieren, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Wie hier verwendet soll der Ausdruck "Hapten" sich auf irgendein Molekül beziehen, daß durch einen Antikörper gebunden werden kann. Der Ausdruck "Epitop" soll sich auf den Bereich eines Haptens beziehen, der durch einen Antikörper erkannt und gebunden werden kann. Ein Hapten oder Antigen kann ein oder mehr als ein Epitop aufweisen. Ein "Antigen" ist ein Hapten, das zusätzlich imstande ist, ein Tier dazu zu veranlassen, einen Antikörper zu erzeugen, der imstande ist, sich an ein Epitop dieses Antigens zu binden. Die vorstehend erwähnte, spezifische Reaktion soll bedeuten, daß das Hapten sehr selektiv mit seinem entsprechenden Antikörper reagiert und nicht mit der großen Zahl anderer Antikörper, die durch andere Antigene hervorgerufen werden können.
Der Ausdruck "Antikörper" (Ab) oder "monoklonaler Antikörper" (Mab) wie hier verwendet, soll intakte Moleküle sowie deren Fragmente umfassen (wie beispielsweise Fab und F(ab') Fragmente), die imstande sind, ein Hapten zu binden. Fab und F(ab') Fragmenten fehlt das Fc Fragment eines intakten Antikörpers, sie entfernen sich schneller aus dem Kreislauf und können eine weniger nichtspezifische Gewebebindung eines intakten Antikörpers haben (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24; 316-325 (1983)).
Die erfindungsgemäßen Antikörper können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können das SF-25-Antigen exprimierende Zellen einem Tier verabreicht werden, um die Erzeugung von Seren auszulösen, die polyklonale Antikörper enthalten, die imstande sind, das SF-25-Antigen zu binden. Bei einem bevorzugten Verfahren wird eine Zubereitung von SF-25-Antigen zubereitet und gereinigt, um sie im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen zu machen. Eine solche Zubereitung wird dann einem Tier einververleibt, um polyklonale Antiseren von größerer spezifischer Aktivität zu erzeugen.
Bei dem am meisten bevorzugten Verfahren sind die erfindungsgemäßen Antikörper monoklonale Antikörper (oder deren Bindungsfragmente). Solche monoklonalen Antikörper können unter Verwendung der Hybridomtechnologie hergestellt werden (Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975), Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6, 511 (1976), Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6, 292 (1976), Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., Seiten 563-681 (1981)). Im allgemeinen umfassen solche Verfahren die Immunisierung eines Tiers (vorzugsweise einer Maus) mit SF-25-Antigen, oder mehr bevorzugt mit einer SF-25 exprimierenden Zelle. Obgleich jede solche Zelle erfindungsgemäß verwendet werden kann, wird bevorzugt, die hepatozelluläre Karzinomzellinie, FOCUS, zu verwenden (Lun, H., et al., In Vitro, 20, 493-504 (1984)). Geeignete Zellen können durch ihre Fähigkeit, anti-SF-25-Antikörper zu binden, erkannt werden. Solche Zellen können in irgendeinem geeigneten Gewebekulturmedium gezüchtet werden. Es wird jedoch bevorzugt, die Zellen in dem von Earle modifizierten Eagle-Medium, angereichert mit 10%-igem foetalen Rinderserum (bei 56ºC inaktiviert und angereichert mit 10 µg/l nichtessentieller Aminosäuren, 1000 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, zu züchten. Die Splenozyten solcher Mäuse werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelomzellinie verschmolzen. Jede geeignete Myelomzellinie kann erfindungsgemäß verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt, die Stamm- Myelomzellinie (SPO), erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, zu verwenden. Nach der Verschmelzung werden die sich ergebenden Hybridomzellen selektiv in einem HAT-Medium gehalten und dann durch begrenztes Verdünnen wie von Wands, J.R., et al. beschrieben (Gastroenterology, 80, 225-232 (1981), das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird) kloniert. Die durch eine solche Selektion erhaltenen Hybridomzellen werden dann analysiert, um Klone, die Antikörper absondern,, zu identifizieren, die imstande sind, das SF-25-Antigen zu binden. Eine durch dieses Verfahren erhaltene, bevorzugte Hybridomzellinie ist die monoklonale Antikörper erzeugende Zellinie "SF-25". Diese Zellinie erzeugt den monoklonalen Antikörper "SF-25", der imstande ist, sich an das SF-25-Antigen zu binden. Die Zellinie "SF-25" wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 8. Dezember 1987 hinterlegt und erhielt die ATCC Bezeichnung: HB 9599.
Durch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren können zusätzliche Zellinien, die imstande sind, Antikörper zu erzeugen, die Epitope des SF-25-Antigens erkennen, erhalten werden.
Alternativ können zusätzliche Antikörper, die imstande sind, das SF-25-Antigen zu binden in einem Zweistufenverfahren unter Verwendung von anti-idiotypischen Antikörper erzeugt werden. Ein solches Verfahren benutzt die Tatsache, daß Antikörper selbst Antigene sind und daß es deshalb möglich ist, einen Antikörper zu erhalten, der sich an einen zweiten Antikörper bindet. Gemäß diesem Verfahren werden Antikörper, die imstande sind, das SF-25-Antigen zu binden, zur Immunisierung eines Tiers verwendet. Die Splenozyten eines solchen Tiers werden dann zur Erzeugung von Hybridomzellen verwendet, und die Hybridomzellen werden untersucht, um Klone zu identifizieren, die Antikörper erzeugen, deren Fähigkeit, sich an Anti-SF-25-Antikörper zu binden, spezifisch durch das SF-25- Antigen blockiert werden kann. Solche Antikörper umfassen anti-idiotypische Antikörper zu dem Anti-SF-25-Antikörper. Solche Antikörper können verwendet werden, um ein Tier zu immunisieren und dadurch die Bildung von Anti-SF-25-Antikörpern zu bewirken. Da anti-idiotypische Antikörper zur Immunisierung eines Tiers verwendet werden können und so die Erzeugung von Anti-SF-25-Antikörpern provozieren, liefern sie ein Verfahren zum Bewirken oder Vergrößern der Immunantwort auf Colonkrebs eines Tiers.
Es ist ersichtlich, daß Fab und F(ab') und andere Fragmente des erfindungsgemäßen Antikörpers gemäß den hier offenbarten Verfahren für die Feststellung und Behandlung von Colonadenokarzinom auf die gleiche Weise wie der intakte Antikörper verwendet werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung unter Verwendung von Enzymen wie Papain (zur Erzeugung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Erzeugung von F(ab')-Fragmenten) erzeugt. Alternativ können Hapten bindende Fragmente durch die Anwendung der Rekombinations-DNA-Technologie oder durch synthetische Chemie erzeugt werden.

IIV. Erzeugung von SF-25-Antigen durch Rekombinationstechnologie

Die Identifizierung der Aminosäuresequenz des SF-25-Antigens (oder seiner funktionellen Derivate) gestattet, daß diese Moleküle durch die Anwendung von Rekombinations-DNA-Techniken erzeugt werden. Beispielsweise kann ein Oligonukleotid hergestellt werden, das imstande ist, für das SF-25-Antigen (oder seine funktionellen Derivate) zu kodieren. Ein solches Oligonukleotid kann funktionsmäßig in einen Expressionsvektor gekoppelt werden und in eine Wirtszelle eingeführt werden, um die Expression des SF-25-Antigens (oder der funktionellen Derivate dieses Antigens) durch diese Zelle zu ermöglichen. Techniken für das Synthetisieren solcher Oligonukleotide sind beispielsweise offenbart durch Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol., 21, 101-141 (1978)). Verfahren zum Herstellen rekombinanter Moleküle gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren sind offenbart durch Maniatis, T., et al., in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1984), das hier ausdrücklich durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die Identifizierung der Aminosäuresequenz des SF-25-Antigens oder von Fragmenten dieses Antigens gestattet auch das Klonieren des Gens, das für das SF-25-Antigen kodiert.
Jedes einer Vielzahl von Verfahren kann zum Klonieren des SF- 25-Antigens verwendet werden. Ein solches Verfahren erfordert das Analysieren einer Shuttle-Vektorbibliothek von cDNA-Insertionen (abgeleitet von einer SF-25 exprimierenden Zelle) mit Bezug auf die Gegenwart einer das SF-25-Gen enthaltenden Insertion. Eine solche Analyse kann durch Transfizieren von Zellen mit dem Vektor und dann dem Untersuchen mit Bezug auf eine SF-25 Expression durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Klonieren des SF-25 Gens erfordert die Bestimmung der Aminosäuresequenz des SF-25-Moleküls. Obgleich es möglich ist, die gesamte Aminosäuresequenz des SF-25-Moleküls zu bestimmen, wird bevorzugt, die Sequenz der Peptidfragmente des Moleküls zu bestimmen. Obgleich es möglich ist, die gesamte Aminosäuresequenz des SF-25-Moleküls zu bestimmen, wird bevorzugt, die Sequenz der Peptidfragmente des Moleküls zu bestimmen. Falls die Peptide größer sind als die Länge von 10 Aminosäuren, reicht diese Sequenzinformation im allgemeinen aus, um es zu gestatten, ein Gen wie das Gen für das SF-25- Molekül zu klonieren. Um diese Aufgabe durchzuführen, werden die SF-25-Moleküle vorzugsweise aus Erzeugerzellen mittels monoklonaler Antikörperaffinitätschromatographie gereinigt und durch präparative Natriumdodecylsulfat-Polylacylamidgelelektrophorese ("SDS-PAGE") und Elektroelution isoliert. Die SF-25-Moleküle sind beispielsweise mit Cyanbromid oder mit Proteasen wie Papain, Chymotrapsin, Trypsin usw. fragmentiert (Oike, Y., et al., J. Biol. Chem., 257, 9751-9758 (1982), Liu, C., et al., Int. J. Pept. Protein Res., 21, 209-215 (1983)). Die sich ergebenden Peptide werden vorzugsweise mittels Umkehrphasen-HPCL abgetrennt und einer Aminsäuresequenzierung unterzogen. Um diese Aufgabe zu durchzuführen, wird das Protein vorzugsweise durch automatisierte Sequenzierer analysiert.
Wenn ein oder mehr geeignete Peptidfragmente sequenziert worden sind, werden die DNA-Sequenzen, die für sie kodieren können, untersucht. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon verwendet werden, um für eine bestimmte Aminosäure zu kodieren (Watson, J.D., in: Molecular Biology of the Gene, 3. Auflage, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), Seiten 356-357. Unter Verwendung des genetischen Codes können ein oder mehrere unterschiedliche Oligonukleotide identifiziert werden, von denen jedes imstande ist, für die SF-25-Peptide zu kodieren. Die Wahrscheinlichkeit, daß ein bestimmtes Oligonukleotid tatsächlich die tatsächliche für SF-25 kodierende Sequenz darstellt, kann abgeschätzt werden, indem anomale Basenpaarungsbeziehungen und die Häufigkeit, in der ein bestimmtes Codon in eukaryontischen Zellen tatsächlich verwendet wird (um für eine bestimmte Aminosäure zu kodieren), in Erwägung gezogen werden. Solche "Codonverwendungsregeln" sind offenbart von Lathe, R., et al., J. Molec. Biol., 183, 1-12 (1985). Unter Verwendung der "Codonverwendungsregeln" von Lathe wird ein einziges Oligonukleotid oder ein Satz von Oligonukleotiden, das eine theoretische "wahrscheinlichste" Nukleotidsequenz enthält, die imstande ist, für die SF-25-Peptidsequenzen zu kodieren, identifiziert.
Obgleich eine Aminosäuresequenz gelegentlich nur durch ein einziges Oligonukleotid kodiert werden kann, kann die Aminosäuresequenz häufig durch irgendeines eines Satzes von gleichen Oligonukleotiden kodiert werden. Es ist wichtig festzustellen, daß, obgleich alle Mitglieder dieses Satzes Oligonukleotide enthalten, die imstande sind, für das Peptidfragment zu kodieren und so potentiell die gleiche Oligonukleotidsequenz wie das Gen enthalten, das für das Peptidfragment kodiert, nur ein Mitglied des Satzes die Nukleotidsequenz enthält, die identisch zu der Nukleotidsequenz des Gens ist. Weil dieses Mitglied in dem Satz vorhanden ist, und imstande ist, selbst in Anwesenheit von anderen Mitgliedern des Satzes gegen DNA zu hybridisieren, ist es möglich, den unfraktionierten Satz von Oligonukleotiden auf die gleiche Weise zu verwenden, in der man ein einziges Oligonukleotid zum Klonieren des Gens, das für das Peptid kodiert, verwenden würde.
Das Oligonukleotid oder der Satz von Oligonukleotiden, das bzw. die die theoretisch "wahrscheinlichste Sequenz enthält bzw. enthalten, die für das SF-25-Fragment kodieren kann, wird bzw. werden zur Identifizierung der Sequenz eines komplementären Oligonukleotids oder Satzes von Oligonukleotiden verwendet, das bzw. die imstande ist bzw. sind, gegen die "wahrscheinlichste" Sequenz oder Satz von Sequenzen zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid das eine solche komplementäre Sequenz enthält, kann als Sonde zur Identifizierung und Isolierung des SF-25-Gens verwendet werden (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Ein geeignetes Oligonukleotid oder ein geeigneter Satz von Oligonukleotiden, das bzw. der imstande ist, für ein Fragment des SF-25-Gens zu kodieren (oder komplementär zu einem solchen Oligonukleotid oder Satz von Oligonukleotiden ist) wird (unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens) identifiziert, synthetisiert und durch in der Technik wohlbekannte Mittel gegen eine DNA- oder weiter bevorzugt eine cDNA-Zubereitung hybridisiert, die aus Zellen abgeleitet ist, die imstande, sind das SF-25-Gen zu exprimieren. Einzelstrang-Oligonukleotidimoleküle, die zu den "am wahrscheinlichsten" für das SF-25-Peptid kodierenden Sequenzen komplementär sind, können unter Verwendung von Verfahren synthetisiert werden, die Durchschnittsfachleuten wohlbekannt sind (Belagaje, R., et al., J. Biol. Chem., 254, 5765-5780 (1979), Maniatis, T., et al., in: Molecular Mechanismus in the Control of Gene Expression, Nierlich, D.P. et al., Herausgeber, Acad. Press (NY 1976), Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol., 21, 101-141 (1978), Khorana, R.G., Science, 203, 614-625 (1979)). Außerdem kann die DNA-Synthese durch die Verwendung von automatisierten Synthetisierern erzielt werden. Techniken der Nucleinsäurehybridisierung sind offenbart von Maniatis, T., et al., (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)) und von Haymes, B.D., et al., (in: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)), die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Quelle der verwendeten DNA oder cDNA ist vorzugsweise mit Bezug auf SF-25-Sequenzen angereichert worden. Eine solche Anreicherung ist sehr leicht von cDNA zu erzielen, das durch Extrahieren von RNA aus Zellen, wie Hepatomzellen erhalten wird, die einen hohen Gehalt an SF-25 erzeugen. Ein Beispiel einer solchen Zelle ist eine FOCUS-Zelle (Lun, H., et al., In Vitro 20, 493-504 (1984)).
Zur Identifizierung und Klonierung des Gens, das für das SF- 25-Protein kodiert, wird eine DNA- oder mehr bevorzugt eine cDNA-Bibliothek mit Bezug auf seine Fähigkeit untersucht, mit den vorstehend beschriebenen Oligonukleotidsonden zu hybridisieren. Geeignete DNA-Zubereitungen (wie die menschliche Genom-DNA) werden enzymatisch gespalten oder zufällig zerkleinert und in rekombinante Vektoren ligasiert. Die Fähigkeit dieser rekombinanten Vektoren, die vorstehend erwähnten Oligonukleotidsonden zu hybridisieren, wird dann gemessen. Vektoren, von denen festgestellt wurde, daß sie zu einer solchen Hybridisierung fähig sind, werden dann analysiert, um das Ausmaß und die Natur der SF-25-Sequenzen, die sie enthalten, zu bestimmen. Nur auf der Grundlage von statistischen Erwägungen könnte ein Gen wie dasjenige, das für das SF-25- Molekül kodiert, eindeutig (über Hybridisierungsuntersuchung) unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde mit nur 18 Nukleotiden identifiziert werden.
Zusammenfassend gestattet die tatsächliche Identifizierung der SF-25-Peptidsequenzen die Identifizierung einer theoretischen "wahrscheinlichsten" DNA-Sequenz oder eines Satzes solcher Sequenzen, die imstande ist bzw. sind, für ein solches Peptid zu kodieren. Durch Konstruieren eines Oligonukleotids, das zu dieser theoretischen Sequenz komplementär ist (oder durch Konstruieren eines Satzes vom Oligonukleotiden, der dem Satz der "wahrscheinlichsten" Oligonukleotide komplementär ist), erhält man ein DNA-Molekül (oder Satz von DNA-Molekülen) das imstande ist, als Sande zur Identifizierung und Isolierung des SF-25-Gens zu fungieren.
Techniken wie die vorstehend beschriebenen Techniken oder diesen ähnliche Techniken haben das Klonieren von Genen für menschliche Aldehyddehydrogenasen erfolgreich ermöglicht (Hsu, L.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 3771- 3775 (1985)), Fibronektin (Suzuki, S., et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J., 4, 2519-2524 (1985)), das menschliche Östrogenrezeptorgen (Walter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7889-7893 (1985)), Gewebetyp-Plasminogenaktivator (Pennica, D., et al., Nature, 301, 214-221 (1983)) und menschliche plazentare, alkalische Phosphatase-Komplementär-DNA (Kam, W., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 8715-8719 (1985)).
Bei einer alternativen Weise des Klonierens des SF-25-Gens wird eine Bibliothek von Expressionsvektoren durch Klonieren von DNA oder mehr bevorzugt cDNA (aus einer Zelle, die imstande ist, SF-25 zu exprimieren) in einen Expressionsvektor hergestellt. Die Bibliothek wird dann nach Mitgliedern untersucht, die imstande sind, ein Protein zu exprimieren, das sich an Anti-SF-25-Antikörper bindet und das eine Nukleotidsequenz aufweist, die imstande ist, für Polypeptide zu kodieren, die die gleiche Aminosäuresequenz wie SF-25 oder Fragmente davon haben. Bei dieser Ausführungsform wird DNA oder mehr bevorzugt cDNA aus einer Zelle, die imstande ist, SF-25- Antigen zu exprimieren, extrahiert und gereinigt. Die gereinigte cDNA wird fragmentisiert (durch Zerkleinern, Endonukleaseverdauung usw.) zur Erzeugung eines Pools von DNA- oder cDNA-Fragmenten. DNA- oder cDNA-Fragmente aus diesem Pool werden dann in einen Expressionsvektor kloniert, um eine genomische Bibliothek von Expressionsvektoren zu erzeugen, deren Mitglieder jeweils ein kloniertes Einzel-DNA- oder cDNA- Fragment enthalten.
Ein "Expressionsvektor" ist ein Vektor, der (aufgrund der Gegenwart von geeigneten Transcriptions- und/oder Translationskontrollsequenzen) imstande ist, ein DNA- (oder cDNA-) Molekül zu exprimieren, das in den Vektor kloniert worden ist, und dadurch ein Polypeptid oder Protein zu erzeugen. Die Expression der klonierten Sequenzen findet statt, wenn der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Falls ein prokaryontischer Expressionsvektor verwendet wird, dann wäre eine geeignete Wirtszelle jede prokaryontische Zelle, die imstande ist, die klonierten Sequenzen zu exprimieren. In ähnlicher Weise wäre, falls ein eukaryontischer Expressionsvektor verwendet wird, die geeignete Wirtszelle jede eukaryontische Zelle, die imstande ist, die klonierten Sequenzen zu exprimieren. Es ist wichtig, daß, da eukaryontische DNA intervenierende Sequenzen haben kann und da solche Sequenzen nicht korrekt in prokaryontischen Zellen weiter verarbeitet werden können, es bevorzugt wird, cDNA aus einer Zelle zu verwenden, die imstande ist, SF-25 zu exprimieren, um eine prokaryontische genomische Expressionsvektorbibliothek zu erzeugen. Verfahren zur Herstellung von cDNA und zur Erstellung einer genomischen Bibliothek sind offenbart von Maniatis, T., et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Die vorstehend erwähnte, genomische Expressionsvektorbibliothek wird zur Schaffung einer Bank von Wirtszellen (von denen jede ein Mitglied der Bibliothek enthält) verwendet. Der Expressionsvektor kann in die Wirtszelle durch eine Vielzahl von Mitteln eingeführt werden (d. h. Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation usw.). Die Bank der den Expressionsvektor enthaltenden Zellen wird klonal fortgepflanzt und ihre Mitglieder werden individuell (unter Verwendung eines Immunoassays analysiert, um zu bestimmen, ob sie ein Protein erzeugen, das imstande ist, an Anti-SF-25-Antikörper zu binden.
Die Expressionsvektoren jener Zellen, die ein Protein erzeugen, das imstande ist, an SF-25-Antikörper zu binden werden dann weiter analysiert, um zu bestimmen, ob sie das ganze SF- 25 exprimieren (und somit enthalten), ob sie nur ein Fragment des SF-25-Gens exprimieren (und enthalten) oder ob sie ein Gen exprimieren (und enthalten) dessen Produkt, obgleich immunologisch SF-25 ähnlich, nicht SF-25 ist. Obgleich eine solche Analyse durch irgendein geeignetes Mittel durchgeführt werden kann, wird bevorzugt, die Nukleotidsequenz des DNA- oder cDNA-Fragments zu bestimmen, das in den Expressionsvektor kloniert worden ist. Solche Nukleotidsequenzen werden dann untersucht, um zu bestimmen, ob sie imstande sind, für Polypeptide mit der gleichen Aminosäuresequenz wie Verdauungsfragmente von SF-25 zu kodieren.
Ein Expressionsvektor, der ein DNA- oder cDNA-Molekül enthält, das für das SF-25-Gen kodiert, kann so erkannt werden durch: (i) die Fähigkeit, die Expression eines Proteins zu dirigieren, das imstande ist, an den Anti-SF-25-Antikörper zu binden, und (ii) das Vorhandensein einer Nukleotidsequenz, die imstande ist, für jedes der Fragmente von SF-25 zu kodieren. Das klonierte DNA-Molekül eines solchen Expressionsvektors kann aus dem Expressionsvektor entfernt und in reiner Form isoliert werden.

IV. Expression des klonierten SF-25-Gens

Die vorliegende Erfindung schafft deshalb ein Mittel zum Erhalten eines DNA-Moleküls, das für das SF-25-Molekül kodiert. Indem dieses DNA-Molekül (oder ein Fragment oder eine mutierte Form dieses DNA-Moleküls) funktionsmäßig an einen funktionellen Promotor gekoppelt wird, ist es möglich, die Expression des SF-25-Gens (oder eines funktionellen Derivats davon) in eine Zelle oder einen Organismus zu dirigieren.
Die Expression einer DNA-Sequenz erfordert, daß die DNA-Sequenz "funktionsmäßig" an DNA-Sequenzen "gekoppelt" wird, die transcriptionale und translationale,, regulierbare Informationen enthalten. Eine funktionsmäßige Kopplung ist eine Kopplung, bei der die regulierbaren DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, deren Expression erstrebt wird, derart verbunden werden, daß sie eine Genexpression gestatten. Die genaue Natur der regulierbaren Bereiche, die für die Genexpression erforderlich sind, können sich von Organismus zu Organismus unterscheiden, aber umfassen im allgemeinen einen Promotorbereich, der in Prokaryonten sowohl den Promotor (der die Initiation der RNA-Transkription dirigiert) als auch die DNA- Sequenzen, die, wenn sie in RNA transcribiert sind, die Initiation der Proteinsynthese signalisieren. Regulierbare Bereiche in eukaryontischen Zellen umfassen im allgemeinen einen Promotorbereich, der ausreicht, um die Initiation der RNA-Synthese zu dirigieren.
Es wird gesagt, daß zwei DNA-Sequenzen (wie eine Promotorbereichsequenz und eine für SF-25 kodierende Sequenz) funktionsmäßig gekoppelt sind, falls die Natur der Kopplung zwischen den zwei DNA-Sequenzen (1) nicht zu der Einführung einer Leserastermutation führt, (2) nicht die Fähigkeit der Promotorbereichsequenz stört, die Transcription der für SF-25 kodierenden Sequenz zu dirigieren oder (3) nicht die Fähigkeit der für SF-25 kodierenden Sequenz stört, durch die Promotorbereichsequenz transcribiert zu werden. So wäre ein Promotorbereich funktionsmäßig mit einer DNA-Sequenz gekoppelt, falls der Promotor imstande wäre, diese DNA-Sequenz zu transcribieren.
Um das SF-25-Molekül (oder ein funktionelles Derivat davon) in eine prokaryontische Zelle (wie beispielsweise E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, usw.) zu exprimieren, ist es notwendig, die für SF-25 kodierende Sequenz funktionsmäßig zu einem funktionellen prokaryontischen Promotor zu koppeln. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder mehr bevorzugt regulierbar (d. h. induzierbar oder derepressionsfähig) sein. Beispiele von konstitutiven Promotoren umfassen den int Promotor des Bakteriophagen µ, den bla Promotor des β-Lactamasegens von pBR322 und den CAT-Promotor des Chloramphenicolacetyltransferasegens von pPR325 usw. Beispiele von induzierbaren prokaryontischen Promotoren umfassen die rechten und linken Hauptpromotoren des Bakteriophagen µ (PL und PR), die trp, recA, lacZ, lacI und gal Promotoren des E. coli, und die α-Amylase (Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol., 162, 176-182 (1985)) und die τ-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman, M.Z., et al., Gene, 32, 11-20 (1984)), die Promotoren der Bacteriophagen des Bacillus (Gryczan, T.J., in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)) und Streptomyces Promotoren (Ward, J.M., et al., Mol. Gen. Genet., 203, 468-478 (1986)). Prokaryontische Promotoren wurden von Glick, B.R. (J. Ind. Microbiol., 1, 277-282 (1987)), Cenatiempo, Y. (Biochimie, 68, 505-516 (1986)) und Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet., 18, 415-442 (1984)) untersucht.
Die geeignete Expression in einer prokaryontischen Zelle erfordert die Gegenwart einer Ribosomen-Bindungsstelle stromaufwärts von der für das Gen kodierenden Sequenz. Solche Ribosomen-Bindungsstellen werden beispielsweise von Gold, L., et al. (Ann. Rev. Microbiol., 35, 365-404 (1981)) offenbart.
Falls eine Expression in einer eukaryontischen Zelle wie Hefe, Pilze, Säugerzellen oder Pflanzenzellen gewünscht ist, dann ist es notwendig, einen Promotor zu verwenden, der imstande ist, die Transcription in einen solchen eukaryontischen Wirt zu dirigieren. Bevorzugte eukaryontische Promotoren umfassen den Promotor des Mausmetallothionein-I-Gens (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen., 1, 273-288 (1982)), den TK Promotor des Herpesvirus (McKnight, S., Cell, 31, 355- 365 (1982)), den frühen SV40 Promotor (Benoist, C., et al., Nature (London), 290, 304-310 (1981) und den Hefe-gal4-Genpromotor (Johnston, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), 79, 6971-6975 (1982), Silver, P.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 5951-5955 (1984)).
Wie allgemein bekannt ist, wird die Translation von eukaryontischer mRNA an dem Codon initiiert, das für das erste Methionin eines Oligonukleotids kodiert. Aus diesem Grund wird bevorzugt, sicherzustellen, daß die Kopplung zwischen einem eukaryontischen Promotor und einem Oligonukleotid, das für das SF-25-Molekül (oder ein funktionelles Derivat davon) kodiert, nicht irgendwelche intervenierenden Codone enthält, die imstande sind, für ein Methionin (d. h. AUG) zu kodieren. Das Vorhandensein solcher Codone führt entweder zu der Bildung eines Fusionsproteins (falls das AUG-Codon sich in dem gleichen Leseraster wie das für SF-25 kodierende Oligonukleotid befindet) oder eine Leserastermutation (falls sich das AUG-Codon nicht in dem gleichen Leseraster wie die SF-25-Gensequenz befindet).
Ein Oligonukleotid, das für das SF-25-Protein (oder ein funktionelles Derivat davon) kodiert, wenn es funktionsmäßig mit einem funktionellen Promotor gekoppelt ist, wird vorzugsweise in eine Empfängerzelle durch irgendeines einer Vielzahl von geeigneten Mitteln eingeführt: Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation usw . .
Die für SF-25 kodierende Sequenz und ein funktionsmäßig gekoppelter Promotor können entweder als ein nichtreplizierendes DNA- (oder RNA-) Molekül, das entweder ein lineares Molekül oder mehr bevorzugt ein geschlossenes covalentes kreisförmiges Molekül sein kann, in eine Empfängerzelle eingeführt werden. Da solche Moleküle nicht zu einer autonomen Replikation fähig sind, kann die Expression des SF-25-Polypetids durch die vorübergehende Expression der eingeführten Gensequenz stattfinden. Alternativ kann eine permanente Expression durch die Integration der eingeführten Gensequenz in das Wirtchromosom stattfinden.
Vorzugsweise wird die eingeführte Gensequenz in ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingebaut, der zu einer autonomen Replikation in einem Empfängerwirt fähig ist. Jeder von einer großen Vielzahl von Vektoren kann für diesen Zweck verwendet werden. Wichtige Faktoren bei der Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors umfassen: die Leichtigkeit, mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und aus den Empfängerzellen ausgewählt werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Anzahl der Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirt gewünscht sind, und ob es wünschenswert ist, imstande zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher Spezies "hin- und her zu übertragen". Bevorzugte prokaryontische Vektoren umfassen Plasmide wie jene, die zur Replikation in E. coli imstande sind (wie beispielsweise pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, πVX. Solche Plasmide sind beispielsweise offenbart von Maniatis, T., et al., (in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). Bacillus-Plasmide umfassen pC194, pC221, pT127 usw. Solche Plasmide sind offenbart von Gryczan, T. (in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), Seiten 307-329). Geeignete Streptomyces Plasmide umfassen pIJ101 (Kendall, K.J., et al., J. Bacteriol., 169, 4177-4183 (1987)) und Streptomyces-Bacteriophagen wie ξC31 (Chater, K.F., et al., in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), Seiten 45-54). Pseudomonas- Plasmide werden von John, J.F., et al. (Rev. Infect. Dis., 8, 693-704 (1986)) und Izaki, K. (Jap. J. Bacteriol., 33, 729- 742 (1978)) untersucht.
Bevorzugte eukaryontische Plasmide umfassen BPV, Vaccinia, SV40, 2-Mikronkreis usw. Solche Plasmide sind in der Technik wohlbekannt (Botstein, D., et al., Miami Wntr. Symp., 19, 265-274 (1982), Broach, J.R., in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, Seiten 445- 470 (1981), Broach, J.R., Gell, 28, 203-204 (1982), Bollon, D.P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol., 10, 39-48 (1980), Maniatis, T., in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Band 3, Gene Expression, Academic Press, NY, Seiten 563-608 (1980)).

VI. Diagnostische Verwendungen von SF-25 Antikörpern und Antikörperfragmenten

Die erfindungsgemäßen Antikörper (oder deren Fragmente) sind besonders zur Verwendung bei Immunoassays geeignet, wobei sie in der Flüssigphase oder an eine Festphase gebunden verwendet werden.
Antikörper (oder deren Fragmente) können unter Verwendung von irgendeinem einer Vielzahl von Markierungen und Markierungsverfahren markiert werden. Beispiele von Arten von Markierungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Enzymarkierungen, radioisotopische Markierungen, nichtradioaktive, isotopische Markierungen, fluoreszierende Markierungen, Toxinmarkierungen und chemilumineszierende Markierungen.
Beispiele geeigneter Enzymmarkierungen umfassen Malatdehydrogenase, Staphylokokkenuclease, Delta-5-steroidisomerase, Hefealkoholdehydrogenase, Alpha-Glycerolphosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Catalase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase usw.
Beispiele von geeigneten radioisotopischen Markierungen umfassen ³H, ¹¹¹In, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³²p, ³&sup5;S, ¹&sup4;C, &sup5;¹Cr, &sup5;&sup7;To, &sup5;&sup8;Co, &sup5;&sup9;Fe, &sup7;&sup5;Se, ¹&sup5;²Eu, &sup9;&sup0;Y, &sup6;&sup7;Cu, ²¹&sup7;Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, &sup4;&sup7;Sc, ¹&sup0;&sup9;Pd usw. ¹¹¹In ist ein bevorzugtes Isotop. Seine Verwendung hat wesentliche Vorteile, da es das Problem der Dehalogenierung des ¹²&sup5;I- oder ¹³¹I-markierten, monoklonalen Antikörpers durch die Leber vermeidet. Außerdem hat dieses Radionukleotid eine günstigere Gammaemissionsenergie für das Abbilden (Perkins, A.G., et al., Eur. J. Nucl. Med., 10, 296- 301 (1985), Carasquillo, H.A., et al., J. Nucl. Med., 28, 281-287 (1987)). Beispielsweise haben an monoklonale Antikörper mit 1-(P-Isothiocyanatbenzyl)-DPTA gekoppelte ¹¹¹In wenig Aufnahme in Nichttumorgeweben, insbesondere der Leber, gezeigt und fördern deshalb die Spezifität der Tumorlokalisierung (Esteban, J.M., et al., J. Nucl. Med., 28, 861-870 (1987)).
Beispiele von geeigneten nichtradioaktiven isotopischen Markierungen umfassen ¹&sup5;&sup7;Gd, &sup5;&sup5;Mn,¹&sup6;²Dy, &sup5;²Tr, &sup5;&sup6;Fe, usw.
Beispiele geeigneter fluoreszierender Markierungen umfassen eine ¹&sup5;²Eu-Markierung, eine Fluorescin-Markierung, eine Isothiocyanatmarkierung, eine Rhodaminmarkierung, eine Phycoerythrinmarkierung, eine Phycocyaninmarkierung, eine Allophycocyaninmarkierung, eine o-Phthaldehydmarkierung, eine Fluorescamimnarkierung usw.
Beispiele geeigneter Toxinmarkierungen umfassen Diphtherietoxin, Ricin und Choleratoxin. Beispiele von chemilumineszierenden Markierungen umfassen eine Luminalmarkierung, eine Isoluminalmarkierung, eine aromatische Acridiniumestermarkierung, eine Imidazolmarkierung, eine Acridiniumsalzmarkierung, eine Oxalatestermarkierung, eine Luciferinmarkierung, eine Luciferasemarkierung, eine Aequorinmarkierung usw.
Durchschnittliche Fachleute kennen andere geeignete Markierungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können. Das Binden dieser Markierungen an Antikörper oder deren Fragmente kann durch die Verwendung von durchschnittlichen Fachleuten allgemein bekannten Techniken durchgeführt werden. Typische Techniken sind von Kennedy, J.H., et. al., (Clin. Chim. Acta, 70, 1-31 (1976)) und Schurs, A.H.W.M., et al., (Clin Chim. Acta, 81, 1-40 (1977) beschrieben. Die in letzterem beschriebenen Kopplungstechniken sind das Glutaraldehydverfahren, das Periodatverfahren, das Dimaleimidverfahren und das m-Maleimidbenzyl-N-hydroxysuccinbnidesterverfahren, wobei alle diese Verfahren durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Die Feststellung von Antikörpern (oder Fragmenten von Antikörpern) der vorliegenden Erfindung kann durch die Verwendung von Trägern verbessert werden. Wohlbekannte Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacryamide, Agarosen und Magnetit. Die Art des Trägers kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder in einem gewissen Ausmaß löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, so lange das gekoppelte Molekül imstande ist, sich an SF-25 zu binden. So kann die Trägerkonfiguration kugelförmig wie bei einer Perle oder zylindrisch wie die Innenfläche eines Reagenzglases oder die Außenfläche einer Stange sein. Alternativ kann die Oberfläche flach sein wie ein Blatt, ein Teststreifen usw. Fachleute werden viele andere geeignete Träger für das Binden des monoklonalen Antikörpers kennen oder sind imstande, diese mit Hilfe von Routineversuchen festzustellen.
Die Antikörper oder Fragmente von Antikörpern der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um das Vorhandensein von Zellen, die das SF-25-Antigen exprimieren, quantitativ oder qualitativ festzustellen. Eine solche Feststellung kann mittels der Verwendung einer Vielzahl von Immunoassays durchgeführt werden. Es ist beispielsweise durch die radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, das SF-25-Antigen mittels der Verwendung von Radioimmunassays festzustellen. Eine gute Beschreibung eines Radioimmunassays (RIA) ist in Laboratory Techniques und Biochemistry in Molecular Biology von Work, T.S., et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) unter besonderer Bezugnahme auf das Kapitel mit dem Titel "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" von Chard, T., zu finden, das durch Bezugnahme hier aufgenommen ist.
Die erfindungsgemäßen Bindungsmoleküle können auch für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "doppelter" oder "Sandwich"-Assay, angepaßt werden. Bei einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge des nichtmarkierten Antikörpers (oder Fragments des Antikörpers) an einem festen Träger gebunden, der in der zu testenden Flüssigkeit unlöslich ist (d. h. Blut, Lymphe, verflüssigter Stuhl, Gewebehomogenat usw.), und eine Menge des feststellbar markierten, löslichen Antikörpers wird zugegeben, um die Feststellung und/oder Quantisierung des zwischen dem Festphasenantikörper, Antigen und markierten Antikörper gebildeten, ternären Komplexes zuzulassen.
Typische immunometrische Assays umfassen "Hin"-Assays, bei denen der an die Festphase gebundene Antikörper zuerst mit der zu testenden Probe kontaktiert wird, um das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasenantikörper-Antigen-Komplexes zu extrahieren. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe, einschließlich nichtumgesetztes Antigen, falls vorhanden, zu entfernen und dann mit der eine unbekannte Menge des markierten Antikörpers enthaltenden Lösung (die als "Reportermolekül" fungiert) kontaktiert. Nach einer zweiten Inkubationszeit, um es dem markieren Antikörper zu gestatten, mit dem an den festen Träger durch den nichtmarkierten Antikörper gebundenen Antigen zu komplexieren, wird der feste Träger ein zweites Mal gewaschen, um nichtumgesetzten, markierten Antikörper zu entfernen. Diese Art von Hin- Sandwichassay kann ein einfaches "Ja/Nein"-Assay sein, um zu bestimmen, ob Antikörper vorhanden ist, oder kann quantitativ gemacht werden, indem das Maß des markierten Antikörpers mit demjenigen verglichen wird, der für eine Standardprobe erhalten wird, die bekannte Mengen des Antigens enthält. Solche "doppelten" oder "Sandwich"-Assays werden von Wide auf den Seiten 199-206 des Radioimmune Assay Method, herausgegeben von Kirkham and Hunter, E. & S. Livingston, Edinburgh, 1970, beschrieben.
Bei einem weiteren Typ des "Sandwich"-Assays, das bei den erfindungsgemäßen Antigenen auch brauchbar sein kann, werden die sogenannten "gleichzeitigen" und "Rück-"Assays verwendet. Ein gleichzeitiges Assay umfaßt einen einzigen Inkubationsschritt, da der an dem festen Träger gebundene Antikörper und der markierte Antikörper der zu testenden Probe beide gleichzeitig zugegeben werden. Nach Beendigung der Inkubation wird der feste Träger gewaschen, um den Rest der flüssigen Probe und den unkomplexen markierten Antikörper zu entfernen. Das Vorhandensein des mit dem festen Träger gekoppelten, markierten Antikörpers wird dann bestimmt wie bei einem herkömmlichen "Hin"-Sandwichassay.
Bei dem "Rück"-Assay wird die schrittweise Zugabe von zuerst einer Lösung des markierten Antikörpers zu der flüssigen Probe, gefolgt von der Zugabe des nichtmarkierten Antikörpers, der an einen festen Träger gebunden ist, nach einer geeigneten Inkubationszeit verwendet. Nach einer zweiten Inkubation wird die Festphase auf herkömmliche Weise gewaschen, um sie von dem Rest der zu testenden Probe und der Lösung des nichtumgesetzten, markierten Antikörper zu befreien. Die Bestimmung des mit einem festen Träger gekoppelten, markierten Antikörpers wird dann wie bei den "gleichzeitigen" und "Hin"- Assays bestimmt.
Wie vorstehend erklärt, erfordern die immunometrischen Assays für Antigen, daß das bestimmte Bindungsmolekül mit einem "Reportermolekül" markiert wird. Diese Reportermoleküle oder -markierungen sind, wie vorstehend identifiziert, herkömmlich und in der Technik wohlbekannt. In der Praxis der vorstehenden Erfindung sind Enzymmarkierungen eine bevorzugte Ausführungsform. Kein einziges Enzym ist ideal für die Verwendung als Markierung bei jedem denkbaren immunometrischen Assay. Statt dessen muß man bestimmen, welches Enzym für ein bestimmtes Assaysystem geeignet ist. Für die Wahl der Enzyme wichtige Kriterien sind die Umsatzzahl des reinen Enzyms (die Zahl der Substratmoleküle die in Produkt pro Enzym pro Zeiteinheit umgewandelt werden), die Reinheit der Enzymzubereitung, die Empfindlichkeit der Feststellung seines Produkts, die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Feststellung der Enzymreaktion, das Fehlen von störenden Faktoren oder enzymartiger Aktivität in der Testflüssigkeit, die Stabilität des Enzyms und seines Konjugats, die Verfügbarkeit und die Kosten des Enzyms und seines Konjugats und dergleichen. Zu den als bevorzugte Markierungen in den immunometrischen Assays der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzymen gehören Peroxidase, alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase, Glycoamylase, Malatdehydrogenase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase. Urease ist eine der bevorzugteren Enzymmarkierungen, insbesondere aufgrund von chromogenen pH-Indikatoren, die ihre Aktivität für das bloße Auge ohne weiteres sichtbar machen.

VII. Diagnostische Verwendung des SF-25-Antigens und seiner funktionellen Derivate

Die vorliegende Erfindung schafft auch ein Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins von Antikörpern, die gegenüber dem SF-25-Antigen spezifisch sind. Das Vorhandensein solcher Antikörper in den Seren eines Tiers wäre ein Hinweis für die vorherige oder gegenwärtige Aussetzung an Zellen, die das SF- 25-Antigen exprimieren. So schafft dieses Verfahren einen alternativen Diagnosetest für Colonkrebs. Ein solcher Diagnosetest könnte durchgeführt werden, indem entweder ein gereinigtes SF-25-Antigen, ein funktionelles Derivat des SF-25 oder ein Antikörper, der zu Anti-SF-25-Antikörper anti-idiotypisch ist, verwendet wird. Fragmente eines solchen idiotypischen Antikörpers könnten auch verwendet werden. Solche Moleküle sind vorzugsweise markiert (unter Verwendung von einer der vorstehend erwähnten Enzym-, radioisotopischen, nichtradioaktiven isotopischen, fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Markierungen). Ein solcher Immunoassay kann durch Anpassung der Methode von Fridlender, B.R. (US Patent 4 313 927) durchgeführt werden. So wird das gereinigte Antigen oder Hapten (oder der anti-idiotypische Antikörper oder Fragmente eines solchen Antikörpers) an eine feste Oberfläche gekoppelt oder gebunden. Jede einer Vielzahl von bekannten Techniken kann zur Erreichung dieses Ziels modifiziert werden. Die immobilisierte Oberfläche, an der diese Moleküle gebunden werden, kann ausgewählt werden aus einer großen Vielzahl von möglichen Oberflächen wie Nylon, Latex, Glas, Siliciumoxid, Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polycarbonat. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration haben, so lange das gekoppelte Molekül imstande ist, jeden Anti-SF-25-Antikörper, der vorgesehen wird, zu binden. So kann die Trägerkonfiguration kugelförmig wie bei einer Perle oder zylindrisch wie bei der Innenfläche eines Reagenzglases oder der Außenfläche einer Stange sein. Alternativ kann die Oberfläche flach sein wie ein Blatt, ein Teststreifen usw.
Bei einer Ausführungsform wird eine biologische Probe (wie beispielsweise Blut, Lymphe usw.) auf die vorstehend beschriebene Weise analysiert, um zu bestimmen, ob Anti-SF-25- Antikörper vorhanden sind. Bei einer alternativen Ausführungsform wird eine biologische Probe (wie eine Biopsie eines Colongewebes) einem Testtier (wie beispielsweise einer Maus) einverleibt, und die Seren der Maus werden analysiert, um zu bestimmen, ob das SF-25-Antigen erkennende Antikörper festgestellt worden sind. Alternativ könnte die biologische Probe bei Splenocytenzellen, die in Gewebekulturen gewachsen sind, zugeführt werden, und sich ergebenden Antikörper werden mit Bezug auf ihre Fähigkeit, SF-25-Antigen zu binden, analysiert. Jede der vielen bekannten Immunoassaytechniken kann entsprechend diesen Ausführungsformen modifiziert werden.
Wie hier verwendet, ist eine wirksame Menge eines diagnostischen Reagens (wie eines Antikörpers, Antikörperfragments oder Haptens) eine, die imstande ist, die gewünschte diagnostische Unterscheidung zu erzielen. Die Menge solcher Materialien, die typischerweise bei einem diagnostischen Test verwendet werden, betragen im allgemeinen 0,01 bis 1 µg und vorzugsweise 0,1 bis 1 µg.

VIII. Therapeutische Verwendungen der vorliegenden Erfindung

Abgesehen davon, daß die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren von Colonkrebs schafft, schafft sie auch ein Mittel, um den Ausbruch von Colonkrebs zu verhindern und um infizierte Tiere zu behandeln. Die Entdeckung, daß das SF- 25-Antigen an Colonkrebszellen exprimiert wird, und die Identifizierung von Antikörpern, die imstande sind, an dieses Antigen zu binden, schafft ein Mittel zur Verhinderung und Behandlung von Colonkrebs. Bei einer Ausführungsform wird das SF-25-Antigen, ein immunologisch aktives Fragment dieses Antigens oder ein anti-idiotypischer Antikörper oder dessen Fragment einem Tier einverleibt, um dadurch die Erzeugung von Antikörpern auszulösen, die imstande sind, SF-25 exprimierende Zellen zu erkennen.
Die Fähigkeit, Antikörper oder Fragmente von Antikörpern mit Toxinmarkierungen zu markieren, schafft ein zusätzliches Verfahren zur Behandlung von Colonkrebs. Bei dieser Ausführungsform werden Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, die imstande sind, das SF-25-Antigen zu erkennen mit Toxinmolekülen markiert und einem Patienten verabreicht, von dem vermutet wird, daß er Colonkrebs hat. Wenn ein solches von einem Molekül abgeleitetes Toxin an eine Colonkrebszelle bindet, bewirkt die Toxinkomponente den Tod der Krebszelle.
Jedes einer Vielzahl von Toxinmolekülen kann zur Erzeugung solcher markierten Antikörper oder markierter Antikörperfraginente verwendet werden. Beispiele geeigneter Toxinmarkierungen umfassen Diphtherietoxin, Ricin und Choleratoxin usw. Ein bevorzugter Typ eines Toxinmoleküls ist ein "photoaktivierbares Toxinmolekül". Beispiele solcher "photoaktivierbarer Toxinmoleküle umfassen Photofrin II (Williams, R.D., et al., Photochem. Photobiol., 46, 733-738 (1987), Hattielli, J., et al., Photochem. Photobiol., 46, 873-880 (1987)), Hämatoporphyrinderivate (Benson, R.C., Urology, 31, 13-17 (1988), Hämoglobin und seine Derivate (Polla, L.L., et al., Ann. Dermatol. Venereol., 114, 497-505 (1987), Procion Blau (Macklis, J. D., et al., Brain Res. 359, 158-165 (1985)), fluoreszierende und andere Farbstoffe (Miller J.P. et al., Science 206, 702-704 (1979), Manyak, M.J., et al., J. Clin. Oncol., 6, 380-391 (1988)) usw. Das kritische Attribut solcher Moleküle ist, daß sie imstande sind, Licht (bei bestimmten Wellenlängen) mehr zu absorbieren als das sie umgebende Gewebe.
Bei dieser Therapie, "Photothermolyse" genannt, wird die Photoaktivierung des Toxins durch eine sorgfältige Auswahl der Wellenlänge, des Impulses und der Intensität des Lichts erzielt. Die von solchen Molekülen absorbierte Lichtenergie wird entweder als Wärme freigesetzt oder als Licht mit einer unterschiedlichen Wellenlänge abgegeben. Falls geeignetes Licht (wie vorzugsweise ein Laserlicht) verwendet wird, tritt der Tod der Zellen und des Gewebes, die das photoaktivierbare Toxin enthalten, auf, entweder aufgrund der Menge an durch dieses Verfahren freigesetzter Wärme oder aufgrund der Photooxidation der wesentlichen biologischen Moleküle in den Zellen oder dem Gewebe durch das abgegebene Licht. Die Physik der Lasertherapie und der Photothermolyse sind von Hobbs, E.R., et al., (J. Dermatolog. Surg. Oncol., 13, 955-964 (1987)), Anderson, R.R., et al. (Science, 220, 524-527 (1983)), Macklis, J.D., et al. (Brain Res., 359, 158-165 (1985)), Wilson, B.C. (Phys. Med. Biol., 31, 327-360 (1986)) und insbesondere von Manyak, M.J., et al. (J. Clin. Oncol., 6, 380-391 (1988)) behandelt, die alle durch Bezugnahme hier aufgenommen werden.
Durch Konjugieren der Antikörper der vorliegenden Erfindung mit einem photoaktivierbaren Toxin ist es möglich, das Toxinmolekül nur zu solchen Zellen zu dirigieren, die ein entsprechendes tumorassoziertes Antigen exprimieren. Dieses Verfahren wurde verwendet, um ein selektives Mittel zur Behandlung eines Tumors ohne Beschädigung normaler (d. h. Nichtantigen exprimierender) Zellen zu schaffen. Beispiele der Verwendung dieses Verfahrens werden durch Mew, D., et al. (Cancer Res., 45, 4380-4386 (1985), J. Immunol., 130, 1473-1477 (1983)), von Wat, C.-K., et al. (in: Prog. Clin. Biol. Res., Band 170 (Doiron, D.R., et al., Herausgeber), Alan R. Liss, NY, Seiten 351-360 (1984)), und von Oseroff, A.R., et al. (Photochem. Photobiol., 46, 83-96 (1987), Photochem. Photobiol., 43, Suppl., 105s (1986), Photochem. Photobiol., 41 Suppl., 75s (1985), Photochem. Photobiol., 41, Suppl., 355 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 83, 8744-8748 (1986), Clin. Res., 33, 674a (1985), J. Invest. Dermatolog., 84, 335 (1985), die alle hier durch Bezugnahme aufgenommen sind) angegeben.
Die vorstehend beschriebene Photothermolysetherapie kann unter Verwendung irgendeiner Lichtquelle erreicht werden, die imstande ist, das Toxin zu photoaktivieren. Die Photoaktivierung solcher Toxine kann so unter Verwendung anderer Lichtquellen als Lasern durchgeführt werden. Eine solche Photoaktivierung kann beispielsweise unter Verwendung von Licht einer gewöhnlichen Glühbirne durchgeführt werden (Dougherty, T.J., et al., J. Natl. Canc. Inst., 55, 115-129 (1979), Wilson, B.C., Phys. Med. Biol., 31, 327-360 (1986)). Die Photoaktivierung des Toxins kann alternativ durch die Verabreichung eines chemilumineszierenden Mittels (d. h. eines lichtabgebenden Moleküls) an eine Person, die ein photoaktivierbares Toxin erhalten hat, durchgeführt werden. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft bei der in situ Behandlung von Magenkarzinomen, Darmpolypen und Barrett-Ösephagus. Die Ausführungsform kann auch für metastatischen Krebs verwendet werden (Phillip, M.J., et al., in: Phorphyrin Localization and Treatment of Tumors (Doiron, D.R., et al., Herausgeber), Alan R. Liss, NY, Seiten 563-569 (1985)).
Wie von Durchschnittsfachleuten verstanden wird, können solche Zusammensetzungen Salze, Puffer, Adjuvantien oder andere Substanzen enthalten, die wünschenswert sind, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu verbessern. Adjuvantien sind Substanzen, die verwendet werden können, um eine spezifische Immunantwort spezifisch zu erhöhen. Normalerweise werden das Adjuvantien und die Zusammensetzung vor dem Verabreichen an das Immunsystem gemischt oder getrennt verabreicht, aber in die gleiche Stelle des zu immunisierenden Tiers. Adjuvantien können locker in mehrere Gruppen aufgrund ihrer Zusammensetzung unterteilt werden. Diese Gruppen umfassen Öladjuvantien (beispielsweise Freundsche vollständige und unvollständige), Mineralsalze (beispielsweise AlK(SO&sub4;), AlNa(SO&sub4;) AlNH&sub4;(SO&sub4;), Siliciumoxid, Kaolin und Kohlenstoff), Polynucleotide (beispielsweise Poly-IC- und Poly-AU-Säuren) und bestimmte natürliche Substanzen (beispielsweise Wachs D von Myobacterium tuberculosis wie auch Substanzen, die in Corynebacterium parvum oder Bordetella pertussis gefunden werden, und Mitglieder der Gattung Brucella). Unter diesen Substanzen als Adjuvantien besonders nützlich sind Saponine wie beispielsweise Quil A. (Superfos A/S, Dänemark). Beispiele von Materialien, die für die Verwendung bei Impfstoffzusammensetzungen geeignet sind, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A., Herausgeber, Mack Publishing Co., Easton, PA, Seiten 1324-1341 (1980)) zu finden.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können parenteral durch Injektion, Schnellinfusion, nasopharyngeale Absorption (intranasopharyngeal), Hautabsorption oder oral verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können alternativ intramuskulär oder intravenös verabreicht werden. Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung umfassen sterile, wässerige oder nichtwässerige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele nichtwässeriger Lösungen sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare, organische Ester wie Ethyloleat. Träger oder okklusive Kompressen können verwendet werden, um die Hautpermeabilität zu erhöhen und die Antigenabsorption zu verbessern. Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können im allgemeinen eine die flüssige Dosierungsform enthaltende Liposomlösung umfassen. Geeignete Formen zur Suspendierung von Liposomen umfassen Emulsionen, Suspensionen, Lösungen, Sirups und Elixiere, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die in der Technik allgemein verwendet werden, wie gereinigtes Wasser. Abgesehen von den inerten Verdünnungsmitteln können solche Zusammensetzungen auch Adjuvantien, Benetzungsmittel, Emulgiermittel und Suspensionsmittel oder Süßungsmittel, Aromastoffe oder Parfümierungsmittel enthalten.
Es gibt viele unterschiedliche Techniken für den Zeitpunkt der Immunisierung, wenn eine Mehrfachverabreichung verwendet wird. Es ist möglich, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mehr als einmal zu verwenden, um die Stärken und Diversitäten der Expression des Immunglobulinrepertoires, die durch das immunisierte Tier exprimiert wird, zu erhöhen. Typischerweise werden, falls Mehrfachimmunisierungen verwendet werden, diese in einem Abstand von ein bis zwei Monaten verabreicht.
Erfindungsgemäß ist eine "wirksame Menge" einer therapeutischen Zusammensetzung eine, die ausreicht, um eine-gewünschte biologische Wirkung zu erzielen. Im allgemeinen variiert die Dosis, die erforderlich ist, um eine wirksame Menge der Zusammensetzung zu verabreichen in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter, dem Zustand, dem Geschlecht des Tiers und dem Ausmaß der Krankheit, falls vorhanden, und anderen Variablen, die durch einen Durchschnittsfachmann angepaßt werden können.
Die antigenen Zubereitungen der Erfindung können entweder als Einzeldosis oder Mehrfachdosierungen einer wirksamen Menge verabreicht werden. Wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung können von 0,01 bis 1.000 µg/ml pro Dosis, mehr bevorzugt von 0,1 bis 500 µg/ml pro Dosis, und am meisten bevorzugt von 10 bis 300 µg/ml pro Dosis variieren.
Nachdem die Erfindung im allgemeinen beschrieben worden ist, ist diese leichter unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele verständlich, die nur zur Veranschaulichung dienen und die vorliegende Erfindung nicht einschränken sollen, es sei denn dieses ist spezifiert.

Beispiel 1

Herstellung von monoklonale Antikörper erzeugenden Hybridomzellen

Die hepatozelluläre Karzinomzellinie FOCUS wurde zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Die Zellen wurden in dem von Earle modifizierten Eagle Medium (M.A. Bioproducts, Walkerville, MD), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum (inaktiviert bei 56ºC), 10 µg/ml nichtessentiellen Aminosäuren, 1000 E/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin gezüchtet. Eine frühe Passage der FOCUS-Zellen aus dem ursprünglichen Tumor wurde in flüssigem Stickstoff gehalten. Diese Kultur wurde dann erneut gezüchtet und aus der Einzelzellschichtkultur geerntet. Zellen wurden von aus den Einzelzellschichtkulturen geerntet, indem sie dreimal mit mit 20 mM Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS), pH-Wert 7,2, gewaschen wurden, gefolgt von der Behandlung mit Versen-Puffer in Abwesenheit von Trypsin. Die so erhaltenen Einzelzellsuspensionen wurden für die Immunisierung von Balb/c Mäusen verwendet. Primäre Immunisierungen wurden intraperitoneal mit 4,0 · 10&sup6; intakten ganzen Zellen/ml in 50% vollständigem Freundschem Adjuvans durchgeführt. Nach 6 bis 10 Wochen wurden sekundäre Immunisierungen durch eine intravenöse Impfung von 4,0 · 10&sup6; Zellen in 200 µl PBS durchgeführt. 3 Tage nach der sekundären Immunisierung wurden die Mäuse getötet und Splenocyten wurden erkannt. Die Splenocyten wurden mit der Stamm-Myelomzellinie (SPO) geschmolzen, die selektiv in dem HAT-Medium gehalten wurden, und dann durch begrenzte Verdünnung kloniert, wie von Wands, J.R., et al. (Gastroenterology, 80, 225-232 (1981)) beschrieben.
Die Hybridome, die mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens erhalten wurden, wurden mit Bezug auf Antikörperaktivität an einer Satz der in Tabelle 1 aufgeführten Zellinien untersucht. Danach wurde ein Spezifizitätstesten der klonierten Hybridome gegen verschiedene Zellinien sowohl durch indirekte als auch direkte Bindungsradioimmunoassays (RIAs) durchgeführt.
Der indirekte Radioimmunoassay wurde in Platten mit 96 Vertiefungen in den Filterböden durchgeführt (U & P Scientific Inc., San Diego, CA). Diese Platten wurden zuerst mit 100 µl Rinderserum während 30 Minuten bei Raumtemperatur gefüllt, um die nichtspezifischen Proteinbindungsstellen zu blockieren. Dann wurden 1 · 10&sup5; Zielzellen (in 100 µl von Earle modifiziertem Eagle Medium suspendiert und 20%-iges fötales Rinderserum enthaltend) mit 100 µl frischem Kulturüberstand von 70% konfluentem Hybridom während 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Zellen wurden auf Filter in den Vertiefungen durch Saugen gezogen, dann dreimal mit 0,2 ml PBS enthaltendem, 20%-igen fötalen Rinderserum gewaschen. Dann wurden 1 · 10&sup5; cpm ¹²&sup5;I-markiertem Schaf-Antimaus IgG/F(ab') (New England Nuclear, Boston, MA), verdünnt in 100 µl PBS mit 20%-igem fötalen Rinderserum, zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren gelassen. Die Zellen wurden wieder dreimal mit PBS/20%-igem fötalen Rinderserum gewaschen und die Filter wurden getrocknet und unter Verwendung eines Gamma-Vertiefungszählers gezählt.
Der direkte RIA wurde unter Verwendung von ¹²&sup5;I-markierten, monoklonalen Antikörper durchgeführt. Monoklonale Antikörper wurden mit ¹²&sup5;I oder ¹³¹I unter Verwendung der Iodogen-Methode (Fraker, P.J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 80, 849-857 (1978) auf eine spezifische Aktivität zwischen 5 und 15 µCi/µg markiert. Kurz gesagt, wurden 50 µl Teilmengen Iodogen (1,3,4,6-Tetrachlor-3α,6α-diphenylglycoluril, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) mit 50 µg/ml in Chlorform zur Trockene unter Stickstoffgas in 10 · 75 mm Glasröhren verdampft. Na¹²&sup5;I oder Na¹³¹I (Amersham Corp., Searle Div., Arlington Heights, IL) und 100 µg monoklonaler Antikörper wurden den Röhren zugegeben, die dann während 6 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Dieser radioaktiv markierte, monoklonale Antikörper wurde dann aus freiem Iod an einer PD- 10 Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) abgetrennt, die vorher mit 0,9%-iger NaCl ins Gleichgewicht gebracht worden war. Iodierte, monoklonale Antikörper wurden immer getestet, um sicherzustellen, daß durch direkte Bindung an FOCUS- und andere Zellinien kein Verlust ihrer Spezifizität oder Immunoreaktivität auftritt. Markierte monoklonale Antikörper (1 · 10&sup5; cpm) wurden mit 1 · 10&sup5; Zellen in 100 µl PBS/20%-igem fötalem Rinderserum während 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal wie vorstehend beschrieben gewaschen und die Radioaktivität der getrockneten Filter wurde bestimmt. ¹²&sup5;I-markierter, nichtrelevanter, monoklonaler Antikörper (als BTT (ein Antitetanustoxoid IgG&sub1; und IgGb)) wurde als Negativkontrolle verwendet. Nur wenn die Menge der Radioaktivität, die an den Anti-SF-25- Antikörper gebunden war, größer als das 2,5-fache derjenigen war, die durch den Kontrollantikörper gebunden war, wurden die Ergebnisse als Angabe für positive Bindungswerte erachtet.
Insgesamt führte das vorstehend erwähnte Verfahren zu der Isolierung von 90 Klonen, die imstande waren, Antikörper gegen Antigene, die an den FOCUS-Zellen vorhanden waren, unter Verwendung des vorstehend beschriebenen indirekten Bindungsassay abzusondern. Unter den 90 Klonen reagierten 18 mit menschlichen Colonkarzinomzellinien. Einer der 18 Antikörper absondernden Klone wurde als "SF-25" bezeichnet und wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt. Der durch diese Hybridomlinie erzeugte Antikörper war von einem IgGb Isotyp.
Monoklonale SF-25-Antikörper (von doppeltklonierten Zellinien) wurden zur weiteren Untersuchung unter Verwendung einer Sepharose-4B-Staphylokokkenprotein-A-Affinitätssäule (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) gereinigt. 1 bis 2 ml Bauchwasserflüssigkeit wurde auf die Säule verbracht (die vorher mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war). Die Bauchwasserflüssigkeit wurde auf der Säule während 60 Minuten bei 4ºC belassen und dann wurde nichtgebundenes Material ausgiebig mit dem gleichen Phosphatpuffer gewaschen. Gebundene Maus-IgG-Isotypen wurden mit 0,05 M Citratbuffer durch einen pH-Wert-Stufengradienten unter Verwendung von mehreren Hohlraumvolumen, jeweils mit unterschiedlichem pH-Wert (pH 6,0, pH 5,5 und pH 3,5) gemäß dem Verfahren von Ey, P.L., et al., (Immunochem., 15, 429-436 (1978)) eluiert. Die so erhaltenen, gereinigten Antikörper wurden über Nacht bei 4ºC gegen eine zweimal normal konzentrierte Salzlösung (0,3 M NaCl) dialysiert, und die Proteinkonzentration wurde mittels des Verfahrens von Lowry, O.H., et al. (J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)) bestimmt.

Tabelle 1

Ursprung der Zellinien

Zellinie Gewebeursprung
LS 180 menschlich, Colon, Adenokarzinom
COLO 320 menschlich, Colon, Adenokarzinom
SW 403 menschlich, Colon, Adenokarzinom
WiDr menschlich, Colon, Adenokarzinom
CaCo-2 menschlich, Colon, Adenokarzinom
SK-Co-I menschlich, Bauchwasser, Colonadenokarzinom
FOCUS menschlich, Leber, Hepatom
PLC/PRF/5 menschlich, Leber, Hepatom
MAHLAVU menschlich, Leber, Hepatom
Hep G2 menschlich, Leber, Hepatom
Hep 3B menschlich, Leber, Hepatom
SK-HEP-1 menschlich, Bauchwasser, Hepatom
Chang Leber menschlich, Leber, epithelähnliche Morphologie
A-427 menschlich, Lunge, Adenokarzinom
SK-LU-1 menschlich, Lunge, Adenokarzinom
Calu-3 menschlich, Pleuraerguß, Lungenadenokarzinom
BT-20 menschlich, Brust, Adenokarzinom
A-498 menschlich, Niere, Karzinom
Caov-3 menschlich, Eierstock, Adenokarzinom
C-33A menschlich, Gebärmutterhals, undifferenziertes Karzinom
HeLa menschlich, Gebärmutterhals, Adenokarzinom
SK-UT-1 menschlich, Gebärmutter, mesodermaler Tumor
AN3 CA menschlich, Endometrium, Adenokarzinom
JEG-3 menschlich, Choriokarzinom
SK-MEL-5 menschlich, Lymphknoten, malignes Melanom
Vero Affe, Niere, fibroblastenähnliche Morphologie

Beispiel 2

SF-25-Zellbindungsuntersuchungen

Die Bindungsspezifizität des monoklonalen Antikörpers SF-25 wurde durch direkten Radioimmunoassay (beschrieben in Beispiel 1) unter Verwendung, eines Satzes von Zellinien untersucht. Wie in Fig. 1 gezeigt, reagierten die monoklonalen SF- 25-Antikörper mit allen getesteten Hepatomzellinien (FOCUS, PCL/PRF/5, MAHLAVU, SK-HEP-1, HepG2 und HEP3B) sowie mit Chang-Leberzellen. Was wichtiger ist, 6 von 6 Colonadenokarzinom-Colonzellinien exprimierten das SF-25-Antigen auf ihren Zelloberflächen. Ein zusätzliches Spezifizitätstesten zeigte, daß SF-25 sich nicht an normale menschliche Lymphozyten oder Verozellen (Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze) band. Eine schwache Bindung wurde bei Zellinien BT-20, C-33A und AN3CA beobachtet. Eine stärkere Bindung wurde bei SK-MEL- 5 und A-498 beobachtet (siehe Fig. 1).

Beispiel 3

Membranbindungsuntersuchungen

Membranfraktionen wurden aus normalen menschlichen Geweben sowie aus Colonadenokarzinomen und benachbartem, normalen Colon, die aus normalen chirurgischen Proben erhalten wurden, hergestellt. Die menschliche Colonadenokarzinomzellinie (LS180) oder Hepatomzellinie (FOCUS), die als feste Tumoren in nackten Mäusen gezüchtet wurden, dienten als positive Kontrolle. Solche Fremdtransplantationen wurden wie folgt durchgeführt: 4 bis 6 Wochen alten, männlichen Balb/c nu/nu Mäusen wurden subkutan in die linke Schulter 1 · 10&sup8; LS-180 Zellen oder FOCUS-Zellen in 0,2 ml PBS zur Feststellung fester-Tumoren injiziert. Diese festen Tumoren werden von Tier zu Tier durch Transplantation mit einem 2 mm³ Stück eines explantieren LS-180 Tumors übertragen, der von einer einen existenten Tumor tragenden Maus erhalten wurde. Tumoren wurden Membranzubreitungen unterworfen und SF-25-Bioverteilungs-Kernresonanzabbildungsuntersuchungen unterzogen, wenn sie auf eine Größe von etwa 10 · 10 mm angewachsen waren. Die Gewebe wurden mit einem Polytron-Homogenisator in 10 Volumen 20 mM BPS, pH-Wert 7,2, die 0,1%-ige NaN3 enthielt homogenisiert und wurden bei 20.000 g während 20 Minuten zentrifugiert. Das Homogenisieren und Zentrifugieren wurde drei Mal wiederholt. Danach wurden die Pellets erneut in PBS suspendiert, die 20% Glycerol enthielt und bei -80ºC bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Für den Bindungsassay wurden Membranzubereitungen auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml mit 20%-iger Kalbserum-PBS verdünnt. Direkte Bindungsassays wurden in Filterplatten mit 96 Vertiefungen, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von 100 µl Membranzubereitung durchgeführt. Die Bindungsspezifität wurde immer durch kompetitive Inhibition mit dem gleichen "kalten" Antikörper und nicht durch ein nichtrelevantes Mab, das gegen eine unterschiedliche Zelloberflächenantigendeterminante (SF-55) gerichtet war, bestätigt.
Die Fähigkeit des ¹²&sup5;I-SF-25 monoklonalen Antikörpers, an Membranzubereitungen von FOCUS- und LS-180-Tumoren sowie anderem normalen menschlichen Gewebe zu binden, ist in Fig. 2 gezeigt.
Spezifisches Binden (als in Gegenwart und Abwesenheit von "kaltem" SF-25-Antikörper cpm-gebunden) wurde sowohl bei FO- CUS als auch bei LS-180 Membranen, aber nicht an an Membranen beobachtet, die von anderen normalen menschlichen Geweben abgeleitet sind, mit der bemerkenswerten Ausnahme der Niere. Die Bindung wurde durch "kaltes" SF-25, aber nicht durch "kaltes" SF-55 inhibiert. SF-55 ist ein Antikörper, der gegen ein stark exprimiertes, übliches Zelloberflächenmembranantigen reaktiv ist. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 3 gezeigt. Dieses Experiment zeigte, daß ¹²&sup5;I-SF-55 imstande war, an FOCUS und LS-180 sowie an anderen normalen Geweben zu binden, und so als gute positive Kontrolle für den Vergleich mit SF-25 dienen konnte (Fig. 2). Unter Verwendung dieser zwei monoklonalen Antikörper wurden Membranbindungsstudien bei chirurgischen Proben von menschlichen Colonadenokarzinomen durchgeführt und die Ergebnisse mit dem benachbarten normalen Gegenstück verglichen. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in Fig. 4 gezeigt. Eine spezifische Bindung von SF-25 an die Membranzubereitung wurde bei LS-180 Tumoren und menschlichen Colonadenokarzinomen beobachtet. Im Gegensatz hierzu zeigte SF-25 keine Bindung an Membranzubereitungen des normalen Colonschleimhautgegenstücks. Diese Ergebnisse zeigen, daß das SF-25 spezifisch an Antigene bindet, die an Tumoren in vivo vorhanden sind, und daß diese Antigene nicht an Membranen, die von benachbarten normalem Colon abgeleitet waren, feststellbar sind.

Beispiel 4

Immunoperoxidaseanfärbungsuntersuchungen

Die Gewebeexpression der Antigendeterminanten, die von SF-25 in vivo erkannt wurden, wurde weiterhin mittels der Avidin- Biotin-Komplex-Immunoperoxidaseanfärbungsreaktion untersucht. Die Färbung von Gewebeabschnitten von 17 Colonadenokarzinomen zusammen mit normalen Schleimhautgegenstücken wurde getestet.
Tumoren, benachbarte normale Gegenstücke und normale Gewebe wurden frisch von der Chirugie oder so schnell wie möglich von Autopsien erhalten und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC gelagert. Bei einigen Experimenten wurden Abschnitte aus diesen schnellgefrorenen Geweben, eingebettet in OCT-Verbindung (Miles Scientific, Naperville, IL), abgeschnitten, auf Glasobjektträgern getrocknet, in kaltem Aceton während 5 Minuten fixiert und mit 10 mM BPS, pH- Wert 7,5, ins Gleichgewicht gebracht. Bei anderen Experimenten wurden Gewebe in 2%-igem Paraformaldehyd während 2 Stunden fixiert und in OCT-Verbindung oder Paraffin eingebettet. Wenn in Paraffin eingebettete Gewebe verwendet wurden, wurden Objektträger mit Xylol entparaffiniert und durch Hindurchleiten durch Alkohole mit unterschiedlichem Reinheitsgrad rehydriert zum endgültigen Waschen in 10 mM PBS, pH-Wert 7,5. Die Gewebeabschnitte wurden mit dem Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) wie folgt angefärbt:
verdünntes normales Pferdeserum (2% in 10 mM PBS, pH-Wert 7,5) wurde dem Objektträger zugegeben und bei Raumtemperatur während 20 Minuten inkubiert, um die nichtspezifische Bindung von Antikörpern zu eliminieren. Das Pferdeserum wurde durch Abtupfen entfernt und MAb enthaltende Bauchwasserflüssigkeit, verdünnt auf 1 : 500 mit 1%-igem normalem Pferdeserum/10 mM PBS, pH-Wert 7,5, wurde den Objektträgern zugegeben. Nach Inkubieren über Nacht bei 4ºC wurden die Objektträger in 10 mM PBS, pH-Wert 7,5, während 20 Minuten gewaschen. Biotinylierte Antimaus-IgG (0,01 mg/ml in 10 mM PBS, pH-Wert 7,5, das 1 %iges normales Pferdeserum enthielt) wurde jedem Objektträger zugegeben und während 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit PBS während 20 Minuten wurden die Gewebeabschnitte in 0,3%-igem HO in Methanol während 20 Minuten inkubiert, um endogene Peroxidase zu blockieren, und dann während 30 Minuten in PBS gewaschen. Die Objektträger wurden mit 0,5 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidin in 0,05 M Trisphosphatpuffer, pH-Wert 7,5, mit 0,01%-igem Wasserstoffperoxid inkubiert, bis die positiven Kontrollen Anzeichen einer Reaktion zeigten. Nach Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Gewebe mit Methylgrün oder Hämatoxylin kontrastgefärbt. Anti- HBs IgGb (BTT) wurden als negative Kontroll-MAbs verwendet (Wands, J.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 2237- 2241 (1984), Zurawski, U.R., et al., Fed. Proc., 39, 1204 (1980)).
Typische Färbungsmuster der Colonadenokarzinome und LS-180, erhalten von einem fremdtransplantierten Tumor in einer nackten Maus wurden mit einem normalen Schleimhautgegenstück verglichen. Alle Tumoren zeigten ein diffuses Zellfärbungsmuster. Tatsächlich exprimierten 17 von 17 Fällen (100%) der Colonadenokarzinome, die aus chirurgischen Proben erhalten wurden und als frisch gefrorene Abschnitte untersucht wurden, SF-25-Antigen in dem Primärtumor. Die meisten, falls nicht alle Tumorzellen waren gefärbt, die benachbarte, normale Schleimhaut war nicht gefärbt, was weiter die Membranbindungsuntersuchungen, die in Fig. 2 dargestellt sind, bestätigt. Es wurde auch mittels Immunoperoxidaseanfärbung gefunden, daß eine Reihe von normalen Geweben negativ waren, einschließlich Speiseröhre, Magen, Dünn- und Dickdarm, Schilddrüse, Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse, Nebenniere, Skelettmuskel und Myokard. Die Niere wurde detailliert untersucht. In dem Glomerulus, den proximalen Kanälchen oder dem Bindegewebe wurde keine Färbung beobachtet. In einer Subpopulation der distalen röhrenförmigen Zellen war eine Färbung vorhanden, und das Muster war diffus und zytoplasmatisch. Abschnitte der LS-180 Tumoren, die in nackten Mäusen gezüchtet wurden, und von menschlichen Adenokarzinomen des Colon, die mit Paraformaldehyd fixiert und dann in Paraffin eingebettet wurden, färbten sich nicht, was angibt, daß das durch SF-25 erkannte Antigen labil ist.

Beispiel 5

In vivo Feststellung von Colonadenokarzinomen

Für Kernresonanzabbildungsuntersuchungen wurden 150 bis 250 Ci von ¹²&sup5;I-markierten, intakten Antikörpern nackten Mäusen i.v. über die Schwanzvene injiziert, wenn die LS-180 Tumoren eine Größe von etwa 10 mM Durchmesser erreichten. Die gleiche Menge der ¹²&sup5;I-markierten, intakten BTT wurden in die tumortragende Maus als Kontrolle injiziert. Nackte Mäuse wurden mit 0,1 ml 4%-igem Chloralhydrat pro 10 g Körpergewicht mittels einer intraperitonealen Injektion anästhetisiert. Jede nackte Maus wurde dann in einem Abstand von 4 cm von dem Rücken mit einer Gammakamera abgebildet, die mit einem 3 mm Lochblendenkollimator ausgestattet und an einen Computer angeschlossen war.
Die Kernresonanzabbildung der LS-180 Tumore wurde durchgeführt. Bilder wurden nach 6, 24, 48, 72 und 120 Stunden erhalten. Bei diesen Experimenten wurden 150 bis 250 Ci des ¹²&sup5;I-markierten, intakten SF-25 oder äquivalente Konzentrationen des intakten ¹²&sup5;I-markierten, nichtspezifischen BTT nackten Mäusen i.v. injiziert, wenn die Tumoren eine Größe von 1,0 cm Durchmesser erreichten. Radioaktiv markierte SF-25 machten den fremdtransplantierten, menschlichen Colonkrebs in nackten Mäuse klar sichtbar, und Blutansammlungsbilder aus der Lunge, dem Herz oder der Leber waren im Vergleich zu der Hochintensitätsabbildung der Tumoren nicht auffallend. Im Gegenteil, bei ¹²&sup5;I-BTT wurde keine spezifische Lokalisierung beobachtet, und der Tumor war nicht sichtbar gemacht.

Beispiel 6

Identifizierung des SF-25-Antigens

Das Vorhandensein von SF-25-Antigen an der Oberfläche von FO- CUS-Zellen wurde durch Immunoausfällung von ¹²&sup5;I-markierten Zelloberflächenproteinen untersucht. Die Zelloberflächenmarkierung wurde durch die Lactoperoxidasemethode durchgeführt (Soule, H. R., et al., Int. J. Canc., 29, 337-344 (1982)). Kurz gesagt, wurde eine konfluente 75 cm² Einzelzellschichtkultur durch Inkubieren mit einem EDTA/Versen-Puffer während 5 bis 10 Minuten gewonnen. Das Zellpellet wurde zweimal mit 20 mM PBS, pH-Wert 7,2, gewaschen und auf 0,5 ml gebracht. Der Zellsuspension wurden 1 mCi Na¹²&sup5;I und 40 g Lactoperoxidase zugegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe vom 15 Ml 0,04%-igem Wassserstoffperoxid begonnen und 20 Minuten durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid alle 5 Minuten fortgesetzt.
Um die Reaktion zu stoppen, wurde 0,02 M Kaliumiodid zugegeben, und die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen:. Dann wurde das Zellpellet durch Inkubieren während 45 Minuten in 0,1 M PBS, pH-Wert 7,2, die 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 1% Triton X 100, 10 mM NaF und 0,1% Deoxycholat enthielt, lysiert.
Für die Immunoausfällung wurden kovalent gekoppelte Mabs an Protein-A-Sepahrose-Perlen wie beschrieben verwendet (Schneider C., et al., J. Biol. Chem., 257, 10 766-10 769 (1982)). Bauchwasserflüssigkeit wurde über Nacht gegen 0,1 M Natriumboratpuffer, pH-Wert 8,2, dialysiert, und ein Volumen der dialysierten Flüssigkeit wurde mit einem Volumen Perlen in dem gleichen Puffer während 16 Stunden bei 4ºC inkubiert. Die Perlen wurden dann mit 0,2 M Triethanolaminpuffer, pH-Wert 8,2, gewaschen und dann in dem gleichen Puffer, der 30 mM Dimethylpimilimidat enthielt, während 45 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Perlen wurden schließlich in 30 mM Ethanolamin/0,2 M Triethanolamin-Puffer, pH-Wert 8,2, gewaschen und in 20 mM PBS, pH-Wert 7,2 bei 4ºC gelagert. Nach dem Inkubieren der Zell-Lysate mit mit Formal in fixierten Staphylokokken-A-Zellen während 1 Stunde bei 4ºC und mit den nichtspezifischen Mab-gekoppelten Perlen während zwei Stunden bei 4ºC, wurde die Immunoausfällung über Nacht bei 4ºC unter Verwendung spezifischer Mab-gekoppelter Perlen durchgeführt. Die Perlen wurden dann gewaschen und in 100 g SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese-(PAGE)-Puffer (0,025 M Tris-HCl Puffer, pH-Wert 8,8, der 0,1% SDS und 20% Glycerol enthält) erneut suspendiert, bei 95ºC während 5 Minuten erhitzt und auf einem 10 %igen Polyacrylamidplattengel (Laemmli, U.K., et al., Nature, 227, 680-685 (1970)) der Elektrophorese unterworfen. Die Gels wurden fixiert, gefärbt, entfärbt, getrocknet und während 12 Stunden bis 2 Tagen unter Verwendung des Kodak Röntgenfilms XOMAT-AR (Eastman Kodak Co., Rochester, NY) einer Autoradiographie unterzogen.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Techniken wurden die Membranproteine der lebenden Zellen radioiodiert, durch Detergens extrahiert und mit SF-25-gekoppelten Sepharose-Perlen immunoausgefällt. Ein Protein von etwa 125 kd wurde aus FOCUS-Zellmembranen isoliert.

Beispiel 7

In vivo Bioverteilung von SF-25

Zehn µCi ¹²&sup5;I-SF-25 wurden nackten Mäusen mit menschlichen (LS-180) Colontumoren über die Schwanzvene i.v. injiziert. Für die Zwecke von doppelten Isotopenindikatoruntersuchungen (Pressman, D., et al., Can. Res., 17, 845-850 (1958) wurden den Mäusen gleichzeitige Injektionen von 10 µCi ¹²&sup5;I-SF-25 und 1 µCi ¹³¹I-B²TT, einem nichtspezifischen Antikörper, gegeben. Die Mäuse wurden getötet und 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion seziert. Tumoren, Blut, Schilddrüse, Herz, Lunge, Niere, Magen, Darm, Leber und Milz wurden auf einer Analysenwaage gewogen und mit Bezug auf Radioaktivität unter Verwendung eines Mehrkanal-Gammazählers (ein Fenster von 15 bis 50 Kev für ¹²&sup5;I und ein Fenster von 50 bis 330 Kev für ¹³¹II) analysiert.
Die spezifische Aktivität im Tumor wurde mit anderen normalen Mausgeweben verglichen (Fig. 5), Colontumoren zeigten eine hohe Aufnahme. Es ist bemerkenswert, daß die Tumoraktivität nach 48 Stunden zunahm, während bei normalen Geweben die Antikörperbindung allmählich in Abhängigkeit von der Zeit nach der Injizierung des radioaktiv markierten Antikörpers abnahm. Wie in Tabelle 2 gezeigt waren die Tumor/Gewebe-Verhältnisse nach 48 Stunden maximal, und es wurde gefunden, daß sie 32,4 ± 5,1 Darm, 20,6 ± 6,2 Magen, 9,5 ± 3,4 Leber, 12,6 ± 2,2 Milz, 7,9 ± 2,0 Niere, 6,3 ± 1,8 Lunge, 9,7 ± 1,0 Schilddrüse und 9,8 ± 1,8 Herz betrugen.
Ein weiterer Nachweis für die spezifische Lokalisierung von Mab SF-25 wurde durch den Vergleich von ¹²&sup5;I-markiertem SF-25 und ¹³¹I-markiertem, nichtspezifischen Mab (BTT) geführt, die gleichzeitig tumortragenden Mäusen injiziert wurden (Fig. 6). Die Lokalisierungsindizes, die aus dem Verhältnis von spezifischer zu nichtspezifischer Aktivität im Tumor, geteilt durch das gleiche Verhältnis im Blut, abgeleitet wurden,, betrugen 1,81 ± 0,46 (24 Stunden), 3,07 ± 0,34 (48 Stunden) und 2,75 ± 0,33 (72 Stunden), was eine spezifische Lokalisierung im Colonkrebs nach 48 Stunden zeigt (P < 0,001). Die Lokalisierungsindizes aller getesteten, normalen Gewebe variierten zwischen 0,97 und 1,19, was eine selektive und spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-SF-25 an menschliche Colontumoren im Vergleich zu einem ¹³¹I-BTT nichtspezifischen Mab widerspiegelt. Tabelle 2 Aufnahme von SF-25 im Adenokarzinom des Colon im Vergleich zu normalen Geweben Organ Tumor/Gewebe Tumor Herz Hals Lunge Niere Milz Leber Magen Darm 24 Std. 48 Std. 72 Std.

Beispiel 8

Western Blotting Analyse

Antigenextrakte wurden aus gezüchteten Zellinien und menschlichen Geweben wie folgt hergestellt. Normales menschliches Gewebe wurde von einem Leichnam innerhalb von 6 Stunden nach dem Eintreten des Todes erhalten. Menschliche Tumorgewebe wurden von chirurgischen Proben, die schnell gefroren und bei -80ºC bis zur Verwendung gehalten wurden, erhalten. Konfluente Zellen wurden aus Kulturkolben unter Verwendung von EDTA/Versen-Puffer ohne proteolytische Enzyme geerntet, zweimal in PBS gewaschen und in eiskaltem 0,1 M Tris-HCl Puffer, pH-Wert 8, suspendiert, der 0,5% NP40, 0,1 M NaCl und 0,1% Aprotinin enthielt. Nach einem Inkubieren von 10 Minuten auf Eis wurden Lysate während 15 Minuten bei 1500 g bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde geerntet, auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml eingestellt und bei -80ºC bis zur Verwendung gefroren. Gewebeproben wurden unter Verwendung einer Potter-Vorrichtung in 10 Volumen eiskaltem 0,1 M Tris- HCl-Puffer, pH-Wert 8, homogenisiert, der 0,1 M NaCl und 0,1% Aprotinin enthielt. NP 40 (0,5%) wurde dann zugegeben, und Proben wurden während 15 Minuten auf Eis inkubiert und bei 10.000 g während 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde geerntet, auf eine Proteinkonzentration von l mg/ml eingestellt, und bei -80ºC bis zur Verwendung gelagert. Für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurden die Proteinzubereitungen während 5 Minuten bei 90ºC in einem SDS-PAGE-Puffer inkubiert, und 50 µg Protein wurde auf ein 10%-iges SDS-Polyacrylamidgel geladen und gemäß Laemmli (12) abgetrennt. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulosepapier übertragen. Das Papier wurde dann mit einer 1 : 100 Verdünnung von SF-25 Bauchwasserflüssigkeit und dann mit ¹²&sup5;I-markiertem Schaf-Antimaus-Immunglobulin F( ab) inkubiert und einer Autoradiographie unterzogen.
Diese Experimente identifizierten das SF-25-Antigen nicht, eine Entdeckung, die nahelegt, daß SF-25 entweder ein labiles Epitop ist, unzureichend aus der Membran extrahiert ist oder mit einher extrem niedrigen Stärke exprimiert ist.

Claims

1. Antikörper oder ein Fragment hiervon, der bzw. das das Adenokarzinomzell-SF25-Antigen bindet, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder dessen Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) Antikörper, die im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind und die die Antigen- Bindungsspezifität der durch die Hybridomzellen erzeugten Antikörper haben, denen die Bezeichnung ATCC HB 9599 gegeben wurde,

(b) monoklonale Antikörper, die die Antigen-Bindungsspezifität der durch die Hybridomzellen erzeugten Antikörper haben, denen die Bezeichnung ATCC HB 9599 gegeben wurde, und

(c) Fragmente von (a) oder (b).

2. Antikörperfragmente nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragmente ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus F(ab)-Fragmenten und F(ab)-Fragmenten.

3. Antikörper oder Fragmente hiervon nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper oder Fragmente feststellbar markiert sind.

4. Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Antikörper (MAb) absondert, der das SF-25 Antigen einer Adenokarzinomzelle spezifisch bindet, dadurch gekennzeichnet, daß die MAbs die Bindungsspezifität der MAbs haben, die durch die Hybridomzellen erzeugt werden, denen die Bezeichnung ATCC HB 9599 gegeben wurde.

5. Hybridomzellinie nach Anspruch 4, welche die Hinterlegungsnummer ATCC HB 9599 hat.

6. Monoklonale Antikörper (MAbs) nach Anspruch l, die die Bindungsspezifität der MAbs haben, die durch die Hybridomzellen erzeugt werden, denen die Bezeichnung ATCC HB 9599 gegeben wurde.

7. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 1, die durch die Hybridomzellen erzeugt werden, denen die Bezeichnung ATCC HB 9599 gegeben wurde.

8. Hapten, das spezifisch von einem Antikörper oder einem Fragment hiervon gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder ein Fragment hiervon die Bindungsspezifität der in Anspruch 7 beanspruchten monoklonalen Antikörper aufweist.

9. Hapten nach Anspruch 8, das ein anti-idiotypischer Antikörper oder dessen Fragment ist.

10. Ein in vitro Verfahren zur Feststellung, ob ein Tier eine Colon-Adenokarzinomzelle, eine Hepatomzelle oder eine Lungen-Adenokarzinomzelle aufweist, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Kontaktieren des Gewebes des Tiers, von dem vermutet wird, das es diese Zelle enthält, mit dem feststellbar markierten Antikörper oder einem Fragment hiervon nach Anspruch 3, und

(b) Feststellen von jedem markierten Antikörper oder einem Fragment hiervon, das spezifisch an die Zelle gebunden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder dessen Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) Antikörper, die im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind und die die Bindungsspezifität der durch die Hybridomzellen erzeugten monoklonalen Antikörper haben, denen die Bezeichnung ATCC HB 9599 gegeben wurde,

(b) monoklonale Antikörper, die die Bindungsspezifität der durch die Hybridomzellen erzeugten monoklonalen Antikörper haben, denen die Bezeichnung ATCC HB 9599 gegeben wurde, und

(c) Fragmente von (a) oder (b).

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe dem feststellbar markierten Antikörper oder dessen Fragment unter Bedingungen ausgesetzt wird, die ausreichen, um das Vorhandensein und die Verteilung der Zelle zu bestimmen.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Antikörper oder Fragmenten hiervon wie in einem der Ansprüche 1 bis 3, 6 oder 7 beansprucht und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger aufweist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper oder Fragmenten hiervon mit einem Toxin markiert sind.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin ein photoaktivierbares Toxin ist.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung wie durch subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injizierung oder zur Verabreichung durch Perfusion wie durch intravenöse oder peristaltische Mittel geeignet ist.

17. Verwendung eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 6 oder 7 bei der Herstellung eines Mittels zur Diagnose des Vorhandenseins oder zur Unterdrückung des Wachstums einer Colon-Adenokarzinornzelle, einer Hepatomzelle oder einer Lungen-Adenokarzinomzelle

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenokarzinomzelle mit einem Magenkarzinom, Darmpolypen oder Barrett-Ösophagus verbunden ist.

19. Verwendung nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder ein Fragment hiervon feststellbar markiert wird und das Medikament dem Tier verabreicht wird.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Feststellung irgendeines markierten Antikörper oder eines Fragments hiervon, der bzw. das spezifisch an die Zelle gebunden ist, durch in vivo Abbildung durchgeführt wird.

21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Feststellung eines feststellbar markierten Antikörpers oder eines Fragments hiervon, der bzw. das spezifisch an die Zelle gebunden ist, durch in situ oder in vitro Abbildung durchgeführt wird.

22. pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Hapten nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.