DE69128543T2 - Monoklonale antikörper der maus - Google Patents

Monoklonale antikörper der maus

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Description

    TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG Technisches Gebiet
  • Der Gegenstand der Erfindung betrifft monoklonale Antikörper und deren Verwendung.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung drei monoklonale Antikörper, die als B1, B3 und B5 bezeichnet werden, welche bei der Behandlung und Diagnose von vielen Formen von Krebs nützlich sind.
    • Hintergrundinformationen
  • Gegenwärtige Therapien für metastasierende menschliche Krebserkrankungen, wie etwa Bestrahlung oder Chemotherapie, konzentrieren sich auf Wirkstoffe, die selektiv rasch wachsende Krebszellen töten. Unglücklicherweise zeigen viele Tumoren keine ungewöhnlich schnelle Wachstumsrate im Vergleich zu wichtigen normalen Geweben, wie etwa Knochenmark oder das Epithel des Magen-Darmtraktes. Eine Alternativgruppe von therapeutischen Vorgehensweisen hat einzigartige chemische Strukturen auf der Oberfläche von Tumorzellen als Ziel der Therapie, wobei meist Antikörper verwendet werden, die selektiv an diese Zielmoleküle binden. Eine dieser therapeutischen Vorgehensweisen verwendet Antikörper, die mit zelltötenden Wirkstoffen gekoppelt sind, wie etwa pflanzliche oder bakterielle Toxine. Diese Antikörper-Toxinkomplexe, Immuntoxine, sind nachweisbar in der Lage, selektiv Tumorzellen in Mustertumorsystemen in Gewebekulturen und in Labortieren zu töten. (Pastan, et al, Cell, 47:641-48 (1986)). Trotz der vielen Versuche, derartige tumorspezifische Antikörper zur menschlichen Therapie zu isolieren, gibt es immer noch sehr wenige identifizierte Antikörper, die selektiv nur an Tumorzellen und nicht an andere wichtige normale Gewebe binden. Die Isolierung derartiger tumorspezifischer Antikörper ist daher für die Anwendung derartiger auf die Immunfunktion gerichteter Therapien sehr wichtig.
  • Monoklonale Antikörpermethodik, wie ursprünglich von Kohler und Milstein (Nature 156:495-97 (1975)) beschrieben und in Koprowski, et al. (U.S. Patent Nr. 4,172,124) aufgezeigt, erlaubte die Isolation von Antikörpern in Reinform zum Aufbau von therapeutischen Wirkstoffen. Zwei Probleme haben jedoch die Anwendung von vielen früher isolierten Antikörpern verhindert. Zunächst reagieren viele monoklonale Antikörper, die mit Tumorzellen reagieren, auch mit wichtigen normalen menschlichen Geweben. Zweitens binden viele der isolierten Antikörper an Oberf lächenelemente, die den Eintritt von Toxinkonjugaten in Zellen durch Endozytose nicht effizient vermitteln. Die vorliegende Erfindung schließt drei monoklonale Antikörper, B1, B3 und B5 ein, die selektiv an einige menschliche Tumoren binden, jedoch an nicht sehr viele wichtige normale Gewebe. Es wurde gezeigt, daß diese Antikörper, wenn sie als das zielerkennende Element eines Immuntoxins inkorporiert wurden, den effizienten Eintritt dieser toxischen Wirkstoffe in Zellen erlauben.
  • Es wurden früher Antikörper, die mit dem Lewis Y Antigen reagieren, isoliert und beschrieben. In jüngerer Zeit wurden zwei Antikörper, BR64 und BR96 beschrieben (Hellstrom et al., Cancer Res., 50:2183-90 (1990)), die mit dem Lewis Y Antigen reagieren, von welchen einer (BR64) für die Immuntherapie aufgrund seiner Reaktivität mit Kapillaren im menschlichen Herzmuskel nicht nutzbar ist. BR96 zeigt jedoch Reaktivitäten, die ein mit diesem Antikörper aufgebautes Immuntoxin möglicherweise nutzbar machen könnten. Die drei neuen monoklonalen Antikörper, B1&sub1; B3 und B5, die vorstehend genannt wurden, welche unter Verwendung eines unterschiedlichen Zelltyps für Immunisierungen und unter Verwendung von morphologischen Screeningverfahren isoliert wurden, sind BR96 ähnlich, jedoch nicht mit diesem identisch. Diese Unterschiede hinsichtlich der Reaktivität gegen Tumoren, normale Gewebe und Kohlenhydratepitope machen diese drei neuen Antikörper für die Therapie und die Diagnose einiger Formen von menschlichem Krebs potentiell nützlich.
    • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Der Gegenstand der Erfindung betrifft drei monoklonale Antikörper, die als B1, B3 und B5 bezeichnet werden, sowie deren Verwendung.
  • B1, B3 und B5 zeigen eine starke Reaktivität auf verschiedene muzinproduzierende sowie nicht muzinproduzierende Primatenkarzinome. Somit werden diese Antikörper bei der Konstruktion von zielgerichteten therapeutischen Wirkstoffen nützlich sein, die bei der Diagnose und Behandlung von menschlichen Krebserkrankungen genützt werden.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Hybridoma; das einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der für ein Zelloberflächenepitop spezifisch ist, wobei das Epitop durch die Expression auf normalem Primatengewebe, malignen kultivierten Humanzellinien und Humantumoren gekennzeichnet ist.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ferner einen monoklonalen Antikörper ein, der für das Zelloberflächenepitop spezifisch ist, das die vorstehend beschriebenen Eigenschaften hat. Die Klasse des monoklonalen Antikörpers ist IgG oder IgM.
  • Die malignen kultivierten Humanzellinien, die vorstehend bezeichnet sind, sind ausgewählt aus der Gruppe, die aus A431, MCF-7, HTB 20 und HTB 33 besteht. Das normale Primatengewebe wird beispielsweise aus dem Ösophagus, der Blase oder dem Magen erhalten. Der vorstehend bezeichnete Humantumor wird aus Colon-, Magen- oder Eierstockkarzinomen erhalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner drei getrennte Hybridomas, die jeweils die Zugangsnummer ATCC HB 10572, hinterlegt am 12. Oktober 1990, HB 10573, hinterlegt am 12. Oktober 1990 und HB 10569, hinterlegt am 10. Oktober 1990 haben.
  • Der durch das Hybridoma mit der Zugangsnummer ATCC HB 10572 produzierte monoklonale Antikörper ist B1.
  • Der durch das Hybridoma der Zugangsnummer ATCC HE 10573 erzeugte monoklonale Antikörper ist B3 und der durch das Hybridoma der Zugangsnummer ATCC HB 10569 erzeugte monoklonale Antikörper ist B5.
  • Der monoklonale Antikörper kann beispielsweise mit einem Toxin, Radionuklid oder einem chemotherapeutischen Pharmazeutikum konjugiert sein. Das Toxin kann beispielsweise Pseudomonas Exotoxin sein. Das chemotherapeutische Pharmazeutikum kann beispielsweise Vinblastin oder Daunomycin sein.,
    • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Figur 1 stellt die Antitumoraktivität von BE-PeArg 57 in. Mäusen dar. Nacktmäusen (20g) wurde am Tag Null 3 x 10&sup6; Zellen subkutan injiziert. Die Behandlung mit 0,75 ug pro Dosis wurde I.P. an den Tagen 4, 6 und 8 verabreicht.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Um die monoklonalen Antikörper B1 und B3 gemäß vorliegender Erfindung zu erzeugen, können Mäuse für normale menschliche Nierenmembranen tolerant gemacht werden und mit MCF-7-Zellen immunisiert werden (May et al., American Type Culture Collection Catalog of Cell Lines and Hybridomas, (May et al., ATCC 1988) 6. Ausg. (1989), Matthew et al., J. Immunol Methods 100:73-82 (1987) und Willingham et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:2474-78 (1987)). Im Gegensatz dazu werden, um die monoklonalen BS Antikörper herzustellen, Mäuse nicht tolerant gemacht und können mit A431 Zellen immunisiert werden (May et al., siehe oben). Die Milz der immunisierten Mäuse wird dann entnommen und die suspendierten Zellen können beispielsweise mit AGB Mausmyelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol verschmolzen werden. Geeignete Klone können ausgewählt werden, nachdem die Screeningvorgänge durchgeführt wurden. Ein Screeningvorgang kann die Auswahl von Klonen einschließen, die mit menschlichem Colon- und Magenkrebs reagieren und nicht mit normalem menschlichen Leber-, Nierenoder Colongewebe. Dieser Auswahlvorgang ist für die Isolation von Klonen wichtig, die mit Tumoren eher als mit normalem Gewebe reagieren, zur Verwendung derartiger Antikörper bei der selektiven Humanimmuntherapie von Krebs.
  • Nach der Subklonierung derartiger Antikörper kann der Isotyp der Klone bestimmt werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, daß der Isotyp für den B1- und den B3-Klon IgG1k ist, wohingegen der Isotyp für den B5-Klon IgM ist. Der Antikörper kann aus dem Überstand der Klone gereinigt werden.
  • Sobald die Antikörper erzeugt sind, können ihre Eigenschaften bestimmt werden. Beispielsweise kann man exakt bestimmen, welche Primatengewebeepitope mit den B1-, B3- und B5-Antikörpern reagieren.
  • Die Reaktivität wird als erfaßbare Bindung an die Oberfläche von lebenden Zellen unter Verwendung von immunhistochemischen Verfahren definiert. Eine derartige Bestimmung ist erforderlich, so daß zielgerichtete Wirkstoffe aufgebaut werden können, die für Tumoren toxisch sind, jedoch nicht für wichtige normale Gewebe.
  • Die Verteilung der Reaktivität in normalem menschlichen Gewebe, menschlichen Tumoren und normalen cynomologen Affengeweben ist in Tabelle 1 nachstehend zusammengefaßt. TABELLE I Immunhistochemische Lokalisierung von B1, B3, B5, und BR96 in normalem Menschenund Affengewebe TABELLE 1 (Fortsetzung)
  • Die immunhistomische Analyse wurde an Cryostatschnitten von frisch gefrorenen geweben durchgeführt, die in Aceton nachfixiert wurden und mit primären Antikörpern bei 10 ug/ml soweit nicht anders angegeben inkubiert wurden. Die Markierung wurde anschließend unter unter verwendung von affinitätsgereinigtem Ziegen- Antimaus IgG ausgeführt, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, unter Verwendung von Diaminobenzidin entwickelt und anschließend mit Hematoxylin, gefolgt von Osmiumtetroxid behandelt wurde. (- = keine Lokalisierung; + = mäßig; ++ stark) (x/y = x Beispiele dieses Musters in y geprüften Proben erkannt) (het = heterogen) nb = nicht bestimmt.
  • Wie Tabelle 1 zeigt, sind die Bl-, B3- und B5-reaktiven Epitope alle in verschiedenen Mengen in den Muzinen von Magen und Dünndarm, in der differenzierten Zellschicht in dem ÖsopHägus&sub1; in dem Epithel von Mandeln&sub1; Trachea und Harnblase zu finden; Diese Epitope oder Antigene, die mit den monoklonalen Antikörpern B1, B3 und B5 reagieren, sind auch in verschiedenen anderen Epithelien in einer heterogenen Verteilung zu finden, wie etwa in Pankreas, Speicheldrüse und Milchdrüse. B3 hat die Fähigkeit, mit dem fetalen Endothel zu reagieren, was nahelegt, daß der monoklonale Antikörper B3 ein Antigen darstellt, das in der fetalen Entwicklung exprimiert wird.
  • Ferner ist, wie Tabelle 1 zeigt, das gesamte Reaktivitätsmuster der B1-, B3- und B5-Antikörper von dem Reaktivitätsmu ster eines früher isolierten Antikörpers, der als BR96 bezeichnet wurde, verschieden. (Hellstrom et al., Cancer Res. 50:2183-90 (1990)). BR96 zeigt einige derselben Reaktivitätsmuster, wie sie bei B1, B3 und B5 beobachtet werden. Beispielsweise ist die BR96-Reaktivität besonders in den dista len Tubula in der menschlichen Niere ebenso wie die B1- und B3-Reaktivität erkennbar. Es bestehen jedoch deutliche Unterschiede zwischen diesen vier Antikörpern an bestimmten Stellen, wie etwa in Nierentubula, Pneumocyten des Typs II in der Lunge, Muzin in Colon und in Pankreasgängen. Beispielsweise ist die BR96-Reaktivität in Muzin in der normalen menschlichen Colonprobe nicht vorhanden, ebenso wie die BS-Reaktivität. Diese Information kann zur Bestimmung, ob ein für therapeutische Zwecke verabreichter monoklonaler Antikörper hinsichtlich des normalen Gewebes toxisch ist, bedeutsam sein.
  • Die vorstehend genannten vier Antikörper können auch in normalen Affengeweben bewertet werden (siehe Tabelle 1). Gewebe, die denjenigen in menschlichen Proben ähnlich sind, sind reaktiv; ähnlich wie bei menschlichen Geweben bestehen jedoch deutliche Unterschiede zwischen B1-, B3-, B5- und BR96-Reaktivität in Nierentubula, Dünndarmmuzin, Blasenepithel, Pankreas, Cervixmuzin, endometrischen Drüsen und dem Epithel von Trachea und Zunge. Diese Unterschiede zeigen an, daß jeder dieser Antikörper verschiedene Epitope erkennt. Somit sind die chemischen Strukturen der Epitope unterschiedlich.
  • Verschiedene Krebszellinien können auch hinsichtlich der Reaktivität mit B1, B3, B5 und B96 unter Verwendung von Immunfluoreszenz untersucht werden. Die Resultate einer derartigen Untersuchung sind in der nachstehend aufgeführten Tabelle II gezeigt. TABELLE II Immunfluoreszenz-Lokalisierung von E1, E3, E5 und E96 an kultivierten menschlichen Zellinien
  • Het = heterogen; (-) = negativ; (+ = schwach positiv; ++ = mäßig; +++ stark; ++++ = sehr stark) nb = nicht bestimmt.
  • Wie aus Tabelle II klar ersichtlich ist, reagieren B1, B3, B5 und BR96 mit einigen Zellinien gleichförmig. Es bestehen jedoch hinsichtlich der Reaktivität Unterschiede, insbesondere für- OVCAR-3-, KB- und HT-29-Zellen. Diese Daten legen wiederum nahe, daß von vier Antikörpern erkannte Epitope hinsichtlich ihrer Struktur unterschiedlich sind. Ferner können derartige Unterschiede hinsichtlich der Epitopstruktur und daher der Reaktivität mit monoklonalen Antikörpern ein Vorteil bei der Therapie einiger Patienten sein.
  • Tumoren können auch auf die Expression von Antigenen untersucht werden, die mit den vier Antikörpern reagieren, und zwar unter Verwendung der Peroxidase-Immunhistochemie. Tabelle III (nachstehend) zeigt, daß der B1-, B3-, B5- und BR96- Antikörper mit aus dem Colon und dem Magen stammenden Karzinomen gut reagieren sowie mit muzinösen Eierstockkarzinomen. Die Reaktivität kann in einer geringeren Zahl von Brust-, Ösophagus- und anderen Karzinomen entdeckt werden. TABELLE III IMMUNHISTOCHEMISCHE REAKTIVITÄT MENSCHLICHER TUMORE MIT B1, B3, B5 UND BR96
  • Die immunhistomische Analyse wurde an Cryostatschnitten von frisch gefrorenen geweben durchgeführt, die in Aceton nachfixiert wurden und mit primären Antikörpern bei 10 ug/ml soweit nicht anders angegeben inkubiert wurden. Die Markierung wurde anschließend unter unter verwendung von affinitätsgereinigtem Ziegen- Antimaus IgG ausgeführt, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, unter Verwendung von Diaminobenzidin entwickelt und anschließend mit Hematoxylin, gefolgt von Osmiumtetroxid behandelt wurde. (- = keine Lokalisierung; + = mäßig; ++ stark) (x/y = x Beispiele dieses Musters in y geprüften Proben erkannt) (het = heterogen) nb = nicht bestimmt.
  • Die Resultate von Tabelle I, II und III geben an, daß B1, B3 und B5 mit vielen gewöhnlichen Tumoren reagieren und mit einer begrenzten Anzahl von normalen Gewebezellen zu reagieren scheinen. Zusätzlich zeigen diese Antikörper deutliche Unterschiede hinsichtlich der Reaktivität bei einigen variierenden Gewebeproben, was darauf hinweist, daß die exakten Epitope, die sie erfassen, verschieden sind.
  • Wenn MCF-7-Zellen, die die B1-, B3- und B5-Epitope tragen, metabolisch unter Verwendung von radioaktiven Aminosäuren markiert werden, anschließend extrahiert werden und die Extrakte immunprazipitiert werden, können die reaktiven Spezies von Molekülen, die durch B1, B3 und B5 präzipitiert werden, durch Gelelektrophorese und, Autoradiographie analysiert wer den. B1 und B3 immunpräzipitieren spezifisch Proteinbande eines sehr hohen Molekulargewichts 0250.000 Dalton), was mit ihrer Reaktivität mit Muzinen mit hohem Molekulargewicht übereinstimmt. Da B5 ein IgM Antikörper ist, ist aus technischen Gründen dieses Verfahren nicht in der Lage, spezifisch reaktive Proteine zu zeigen.
  • Die monoklonalen Antikörper B1, B3 und B5 können als zielgerichtete Wirkstoffe für den Aufbau von Immuntoxinen dienen, in welchen der monoklonale Antikörper mit einem Toxin verbunden ist, beispielsweise Pseudomonas Exotoxin (siehe Tabelle IV unten) . Wie in Pastan, et al. (U.S. Patent Nr. 4,545,985) aufgezeigt, zeigen Konjugate von Pseudomonas Exotoxin und monoklonalen Antikörpern Wirksamkeit beim Töten von Zellen, die durch die epitopreaktive Stelle der Antikörper als Ziel ausgewählt sind. Konstruktionen, die durch Verbinden von B1, B3 oder B5 mit einem derartigen Toxin hergestellt sind, würden dann in Patienten eingeführt, die Tumoren haben, die mit diesen monoklonalen Antikörpern reaktiv sind, und die Immuntoxine würden an die Tumorzellen innerhalb des Patienten binden und diese töten. Normale Gewebe, die ebenfalls mit diesen monoklonalen Antikörpern reaktiv wären, würden ebenfalls betroffen, wenn die Antigenstellen dem Blutkreislauf zugänglich wären. Im Fall von vielen der Expressionsstellen von Antigenen, die mit B1, B3 und B5 reaktiv sind, scheint das reaktive Epitop durch Immunhistochemie für den Kreislauf relativ unzugänglich zu sein, wie etwa die Reaktion mit Muzinen im Lumen des Magen-Darmtraktes. Somit ist es nicht möglich, mit völliger Sicherheit vorherzusagen, welche toxischen Effekte derartiger Immuntoxine in einem menschlichen Patienten auftreten würden. Tumorzellen, die diese Oberflächenantigene exprimieren, sind jedoch selten an einer Stelle, die sie für das Immuntoxin unzugänglich machen würde, und die Tumorzellen sollten daher für die zielgerichtete Tötung durch Immuntoxine, die mit B1, B3 oder B5 aufgebaut sind, empfänglich sein.
    • TABELLE IV
  • Aktivität eines Immuntoxins, das aus B3 und einem Pseudomonas Exotoxin Mutanten zusammengesetzt ist, in welchem Lysin 57 in Arginin umgewandelt ist (B3-PeArg57).
  • ID&sub5;&sub0; ist die Konzentration des Wirkstoffes, die die Proteinsynthese bei einer 16-stündigen Inkubation um 50% hemmt.
  • Zusätzlich zu bakteriellen oder pflanzlichen Toxinen, die mit monoklonalen Antikörpern konjugiert werden, können andere Effektorwirkstoffe zusammen mit zielgerichteten monoklonalen Antikörpern verwendet werden, um menschlichen Krebs zu behandeln oder zu diagnostizieren. Beispielsweise können Radionu klide, die mit Antikörpern konjugiert sind, die an Tumoren binden, eine Zelltötung auf der Basis der hohen lokalen Strahlungskonzentration erzeugen. Chemotherapeutische Pharma zeutika, beispielsweise Vinblastin oder Daunomycin, können mit Antikörpern gekoppelt werden und in hoher Konzentration Zellen zugeführt werden, die mit den Antikörpern reagieren. B1, B3 und B5 können einen Zielerfassungsmechanismus für eine solche Kombination von Effektorwirkstoffen bieten, der bei Einführung in Patienten eine erfolgreiche Regression von reaktiven menschlichen Tumoren erzeugen könnte.
  • Zusätzlich zu der Zielführung von Immuntoxinen zu Tumoren in einem Krebspatienten erkennen diese Antikörper auch Materialien, wie etwa Oberflächenmuzine auf Tumorzellen, von denen erwartet würde, daß sie in das umgebende Gewebe abgegeben, vom Blutstrom aufgenommen und in Blutproben, die an entfernten Stellen genommen werden, erfaßbar sind. Es hat sich erwiesen, daß diese abgegebenen Antigene bei der Diagnose von primären und wiederkehrenden Krebserkrankungen unter Verwendung von Antikörpern, die mit diesen abgegebenen Antigenen reagieren, nützlich sind. Ein gegenwärtig nützliches Beispiel dafür ist das CA125 Antigen, das in Seren von Patienten mit Eierstockkrebs untersucht werden kann, um das Wiederauftreten vorherzusagen oder um die Primärdiagnose des Tumors zu bestätigen. Es ist daher möglich, daß B1, B3 und B5 bei der Diagnose von Tumoren nützlich sind.
  • Auch könnte die selektive Reaktivität dieser Antikörper mit bestimmten Typen von Tumorzellen zur anatomischen pathologischen Diagnose von Tumoren, zur Klärung des Typs und des Ursprungs des Tumors, und ob eine bestimmte Gruppe von Zellen ein Wiederauftreten eines früheren Tumors oder die Entwicklung eines anderen Primärtumors an anderer Stelle darstellt, ausgenutzt werden. Eine derartige diagnostische Bestimmung kann für die nachfolgende Planung einer Antitumortherapie für jeden einzelnen Patienten nützlich sein. Insbesondere kann die immunhistochemische pathologische Diagnose in Gewebeschnitten (z.B. Biopsien) oder zytologischen Präparaten (z.B. Pap-Abstriche, Ergüsse) unter Verwendung der monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung ausgeführt werden.
  • Eine weitere mögliche Nutzung derartiger zielgerichteter Antikörper könnte in der Diagnose von makroskopischen Tumorfoci unter Verwendung der Antikörper B1, B3 oder B5 liegen, die mit Radioisotopen gekoppelt sind, welche entweder durch eine externe Körperabtastung (bildgebende Diagnose) oder durch Lokalisierung unter Verwendung von Strahlendetektorsonden im Rahmen von explorierender Chirurgie erfaßt werden könnten.
  • Zusätzlich zu den ursprünglichen Klonen von B1, B3 und B5, die als monoklonale Mausantikörper isoliert sind, könnten Variationen der konstanten Regionen dieser Antikörper, die konstante Regionen von anderen Spezies, wie etwa Mensch, einschließen, ausgeführt werden, wobei der resultierende Antikörper weniger Immunogenität als ein Fremdantigen selbst zeigen würde, wenn er in einen menschlichen Patienten eingeführt wird. Pharmazeutische Zusammensetzungen können auch unter Verwendung der monoklonalen Antikörper hergestellt werden.
  • Auch könnten die für die variablen Regionen dieser Antikörper verantwortlichen Gene isoliert werden und zielgerichtete Wirkstoffe unter Verwendung dieser Gene der variablen Regionen in Verbindung mit Genen für andere Proteine, wie etwa Toxingene, oder anderen Effektorproteinen aufgebaut werden, die die Zelltötung entweder direkt oder durch die Aktivierung von endogenen Mechanismen, wie etwa das Immunsystem, leiten könnten. Die variablen Regionen von Immunglobulingenen codieren für die Antigenbindungsstelle, die es ermöglicht, daß das chimere Antikörpertoxinprotein an Zielzellen bindet und diese tötet, die das Antigen exprimieren, das mit den Antikörpern B1, B3 und B5 reagiert.
  • --Die vorliegende Erfindung kann unter Verwendung der folgenden nicht einschränkenden Beispiele erläutert werden.
    • BEISPIEL I Herstellung der monoklonalen Antikörner B1, B3 und B5
  • Die menschlichen Tumorzellen OVCAR-3, KB, MCF-7, HT-29, MDA-- MD-468, DUI4S, HTB2O und HTB33 wurden früher beschrieben (Hay et al., American Tvoe Culture Collection Catalog of Cell Lines and Hybridomes, 6. Ausg. (1988)). Für Antikörper B1 und B3 wurden Mäuse für normale menschliche Nierenmembranen tolerant gemacht (Matthew et al., J. Immunol. Methods 100:73-82 (1978) und mit MCF-7 Zellen unter Verwendung der früher beschriebenen Verfahren (Willingham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2474-78 (1987)) immunisiert. Für den Antikörper B5 wurden Mäuse nicht tolerant gemacht und mit A431 Zellen immunisiert. Die Milz der immunisierten Mäuse wurde entnommen und die suspendierten Zellen wurden mit AG8 Mausmyelomzellen verschmolzen. Die resultierenden Klone wurden zwei Wochen später unter Verwendung der Screenfast (Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD) Großraumscreeningkammer unter Verwendung der indirekten Rhodaminimmunfluoreszenz an lebenden MCF-7- und A431-Zellen auf B1 oder B3 bzw. BS gescreent. Ausgewählte Klone wurden ein zweites Mal unter Verwendung von Peroxidase-Immunhistochemie auf Kryostatschnitten von menschlichen Tumoren und Normalgeweben gescreent. Die Klone B1, B3 und B5 wurden ausgewählt, die mit menschlichem Colon- und Magenkrebs reagierten und nicht mit normaler menschlicher Leber, Niere oder Colon. Nach der Subklonierung wurden Isotypen dieser Klone als IgG&sub1;k für die Klone B1 und B3 und IgM für den Klon B5 bestimmt. Der Antikörper wurde aus den Überständen dieser Klone unter Verwendung von serumfreien definierten Kulturmedien und Ammoniumsulfatfällung gereinigt.
    • BEISPIEL II
  • -Bestimmung der Verteilung von Antigenen, die mit den Antikörpern B1, B3 und B5 in menschlichen tumorfreien Geweben, menschlichen Tumoren und Affengeweben reagieren.
  • Proben von normalen menschlichen Geweben, cynomologen Affengeweben und menschlichen Tumoren wurden frisch gefroren und Kryostatschnitte wurden für die Peroxidase-Immunhistochemie wie früher beschrieben (Willingham, FOCUS 12:62-67 (1990)) unter Verwendung von B1, B3 und B5 als primäre Antikörper hergestellt. Die Lokalisierung der Antikörper wurde durch die Entwicklung der Peroxidase-Substratreaktion unter Verwendung von Diaminobenzidinen erfaßt. Die Gewebeschnitte zeigten größere Reaktivitäten von B1, B3 und B5 in dem Epithel von Mandeln, Magen, Ösophagus und Blase sowie in den Muzinen von Dünndarm und Colon. Eine ähnliche Lokalisierung wurde in Affengeweben in Ösophagus, Dünndarm, Magen, Elase, Speicheldrüse und Pankreas gefunden, wobei einige Unterschiede zwlschen den verschiedenen Antikörpern festgestellt wurden (siehe Tabelle 1). Menschliche Tumoren zeigten eine starke Reaktivität für B1, B3 und B5 in Colon-, Magen-, Eierstockund Ösophaguskarzinomen, wobei in Brust-, Cervix-, Prostata-, Endometrium- und Lungenkarzinomen variable Lokalisierung zu sehen war (siehe Tabelle III). Alle Lokalisierungen, mit Ausnahme der in Tabelle I angeführten, zeigten eine Antigenreaktion, die auf der Oberfläche der Zellen zu sein schien, was diese Stellen zu potentiellen Stellen für die Immuntherapie machen.
    • BEISPIEL III
  • Bestimmung der Effektivität von BE-PE als Antitumorwirkstoff.
  • B3 wurde wie vorstehend beschrieben an Pseudomonas Exotoxin gekoppelt (Willingham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2474-78 (1987)). Um dies auszuführen, wurde eine Mutantenform von PE, in der Lysin 57 von PE zu Arginin mutiert (PEArg57), verwendet. Das Immuntoxin wurde gereinigt und in einer Gewebekultur getestet, wo sich zeigte, daß es A431 und MCF-7 Zielzellen tötet (Tabelle V). Ein Kontrollantikörper (MOPC 21) wurde ebenfalls an PE 57 gekoppelt und hatte keine zelltötende Aktivität. B3PEArg57 wurde anschließend Mäusen intraperitoneal verabreicht. Den Mäusen waren 3 Millionen A431 Krebszellen am Tag 0 implantiert worden und am Tag 4 wiesen sie kleine Krebserkrankungen auf, die rasch wuchsen. Das Immuntoxin wurde IP an den Tagen 4, 6 und 8 verabreicht und, wie Figur 1 zeigt, gingen die Tumoren zurück und verschwanden offensichtlich, wohingegen bei den mit Lösungsmittel behandelten Kontrolltieren die Tumoren rasch wuchsen.
    • Mikroorganismen
  • Zusätzliches Blatt in Verbindung mit dem auf Seite 3, 4, 22, Zeile 33, 1, 1 der Beschreibung bezeichneten Mikroorganismus
  • A. Identifizierung der hinterlegten Probe weitere hinterlegte Proben werden auf einem zusätzlichen Blatt identifiziert
  • Name der Einrichtung, bei der die Hinterlegung erfolgte AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION
  • Adresse der Einrichtung, bei die Hinterlegung erfolgte (einschließlich Postleitzahl und Staat) 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852; Vereinigte Staaten von Amerika
  • Datum der Hinterlegung 12. Oktober 1990
  • 12. Oktober 1990
  • 10. Oktober 1990
  • Zugangsnummer HE 10572
  • HE 10573
  • HE 10569
  • B. Zusätzliche Angaben (nicht ausfüllen, wenn nicht zutreffend) Diese Informationen werden auf einem zusätzlichen beigefügten Blatt fortgeführt
  • C. Bezeichnete Staaten, für die die Angaben gemacht werden (wenn die Angaben nicht für alle bezeichneten Staaten sind)
  • D. Getrennte Erteilung von Angaben (nicht ausfüllen, wenn nicht anwendbar)
  • Die nachfolgend aufgelisteten Angaben werden dem internationalen Büro später eingereicht (allgemeine Art der Angaben beschreiben, z.B. "Zugangsnummer der hinterlegten Probe")
  • E. Dieses Blatt wurde mit der internationalen Anmeldung bei der Einreichung empfangen (vom Empfangsbüro abzuzeichnen) unleserliche Unterschrift Nathaniel R. Hayden PCT International Services Division (zuständiger Beamter)
  • Datum des Empfangs (von dem Anmelder) durch das internationale Büro (zuständiger Beamter) (Januar 1985)

Claims (18)

1. Hybridoma, die die Eigenschaften einer Hybridomazellinie hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe mit den Zugangsnummern ATCC HE 10572, ATCC HB 10573 und/oder ATCC HB 10569, und welche einen monoklonalen Antikorper produziert, der für ein Zelloberflächenepitop spezifisch ist, wobei das Epitop durch Expression auf normalem Primatengewebe, malignen kultivierten Humanzellinien und Humantumoren gekennzeichnet ist.
2. Monoklonaler Antikörper, der für ein Zelloberflächenepitop spezifisch ist, wobei das Epitop durch Expression auf normalem Primatengewebe, malignen kultivierten Humanzellinien und Humantumoren gekennzeichnet ist und von einer Hybridoma produziert wird, die die Eigenschaften einer Hybridomazellinie hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Hybridomazellinien mit den Zugangsnummern ATCC HB 10572, ATCC HB 10573 und/oder ATCC HB 10569, und wobei die Klasse des monoklonalen Antikörpers IgG oder IgM ist.
3. Hybridoma nach Anspruch 1, bei welcher die malignen kultivierten Humanzellinien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A431, MCF-7, HTB 20 und HTB 33.
4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, bei welchem die malignen kultivierten Humanzellinien ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A431, MCF-7, HTB 20 und HTB 33.
5. Hybridoma nach Anspruch 1, bei welcher das normale Pnmatengewebe aus Ösophagus, Blase oder Magen erhalten wird.
6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, bei welchem das normale Primatengewebe aus Ösophagus, Blase oder Magen erhalten wird.
7. Hybridoma nach Anspruch 1, bei welcher der Humantumor aus Kolon-, Magen- oder Eierstockkarzinom erhalten wird.
8. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, bei welchem der Humantumor aus Kolon-, Magen- oder Eierstockkarzinom erhalten wird.
9. Hybridomazellinie, die die Zugangsnummer ATCC 10572 hat.
10. Hybridomazellinie, die die Zugangsnummer ATCC 10573 hat.
11. Hybridomazellinie, die die zugangsnummer ATCC 10569 hat.
12. Monoklonaler Antikörper, produziert von der Hybridomazellinie von Anspruch 9.
13. Monoklonaler Antikörper, produziert von der Hybridomazellinie von Anspruch 10.
14. Monoklonaler Antikörper, produziert von der Hybridomazellinie von Anspruch 11.
15. Konjugat, umfassend einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 2, 12-14, der mit einem Toxin, Radionukhd oder chemotherapeutischen Pharmazeutikum konjugiert ist.
16. Konjugat nach Anspruch 15, bei welchem das Toxin Pseudomonas Exotoxin ist.
17. Konjugat nach Anspruch 15, bei welchem das chemotherapeutische Pharmazeutikum Vinblastin oder Daunomycin ist.
18. Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 2, 12- 14 zur Verwendung bei der Diagnose von Krebs.
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