JP2660241B2 - モノクロナール抗体 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、K1と称するモノクロナール抗体、およびそ
の使用方法に関する。
の使用方法に関する。
特に、K1モノクロナール抗体は、数種の癌の治療と診
断に用いることが出来る。
断に用いることが出来る。
背景技術 人間の転移癌に対する、放射線あるいは化学療法のよ
うな現在の治療方法では、急速に成長する癌細胞を選択
的に殺す薬剤が中心となっている。残念ながら、骨髄あ
るいは消化管上皮のような正常な重要組織とは違って、
腫瘍の多くはあまり早い速度では成長しない。もう１つ
の治療アプローチとして、腫瘍細胞表面の特異な化学構
造を標的とし、最も頻繁に採用される例では、この標的
分子と選択的に結び付く抗体を用いる方法が挙げられ
る。この種の治療アプローチの１つに、抗体と植物毒素
または細菌毒素のような細胞殺傷性物質とを結合させた
ものがある。この抗体・毒素錯体、言い替えると免疫毒
素類（immunotoxins）は、組織培養及び動物実験による
腫瘍系モデルにおいて選択的な腫瘍細胞殺傷効果を示す
ことが認められている（Pastan et al.,Cell 47:641
−648（1986））。
うな現在の治療方法では、急速に成長する癌細胞を選択
的に殺す薬剤が中心となっている。残念ながら、骨髄あ
るいは消化管上皮のような正常な重要組織とは違って、
腫瘍の多くはあまり早い速度では成長しない。もう１つ
の治療アプローチとして、腫瘍細胞表面の特異な化学構
造を標的とし、最も頻繁に採用される例では、この標的
分子と選択的に結び付く抗体を用いる方法が挙げられ
る。この種の治療アプローチの１つに、抗体と植物毒素
または細菌毒素のような細胞殺傷性物質とを結合させた
ものがある。この抗体・毒素錯体、言い替えると免疫毒
素類（immunotoxins）は、組織培養及び動物実験による
腫瘍系モデルにおいて選択的な腫瘍細胞殺傷効果を示す
ことが認められている（Pastan et al.,Cell 47:641
−648（1986））。
ヒトの治療用としてこのような腫瘍特異性を持つ抗体
を遊離しようと多くの試みがなされたが、選択的に腫瘍
細胞のみに結び付いて、他の正常な重要組織には結び付
かない抗体として同定されたものは、現在でもなお極め
て小数である。従って、免疫主導の治療を行ってゆく上
で、このような腫瘍特異性を持つ抗体を遊離することは
重要である。
を遊離しようと多くの試みがなされたが、選択的に腫瘍
細胞のみに結び付いて、他の正常な重要組織には結び付
かない抗体として同定されたものは、現在でもなお極め
て小数である。従って、免疫主導の治療を行ってゆく上
で、このような腫瘍特異性を持つ抗体を遊離することは
重要である。
モノクロナール抗体方法論は、ケラー／ミルスタイン
（Kohler and Milstein）よって初めて発表され（Nat
ure 156:495−497（1975））、さらにコプロフスキー
ら（Koprowski et al）の特許（米国特許番号第4,17
2,124号）で開示されたものがあり、これにより、抗体
を純粋な形で遊離して治療薬にすることが出来るように
なった。しかしながら、二つの理由からこれまでに遊離
された多くの抗体を使用することができなかった。腫瘍
細胞に反応するモノクロナール抗体は、重要なヒトの正
常組織にも反応してしまうのが第一の理由。第二の理由
としては、多くの遊離抗体は表面成分に結び付くが、こ
の表面成分がトキシン共役系がエンドサイトーシスによ
り細胞内に入り込むのを能率的に仲介しないことが挙げ
られる。本発明は、選択的にある種のヒト腫瘍に結び付
くが、多くの正常な重要組織のには結び付かないモノク
ロナール抗体、K1に関する。このモノクロナール抗体
は、免疫毒素の標的用成分として添加されると、毒性物
質を効果的に細胞内には入り込ませることが出来ること
が認められている。
（Kohler and Milstein）よって初めて発表され（Nat
ure 156:495−497（1975））、さらにコプロフスキー
ら（Koprowski et al）の特許（米国特許番号第4,17
2,124号）で開示されたものがあり、これにより、抗体
を純粋な形で遊離して治療薬にすることが出来るように
なった。しかしながら、二つの理由からこれまでに遊離
された多くの抗体を使用することができなかった。腫瘍
細胞に反応するモノクロナール抗体は、重要なヒトの正
常組織にも反応してしまうのが第一の理由。第二の理由
としては、多くの遊離抗体は表面成分に結び付くが、こ
の表面成分がトキシン共役系がエンドサイトーシスによ
り細胞内に入り込むのを能率的に仲介しないことが挙げ
られる。本発明は、選択的にある種のヒト腫瘍に結び付
くが、多くの正常な重要組織のには結び付かないモノク
ロナール抗体、K1に関する。このモノクロナール抗体
は、免疫毒素の標的用成分として添加されると、毒性物
質を効果的に細胞内には入り込ませることが出来ること
が認められている。
従来から、卵巣癌患者の血漿に流れ込む抗原と反応す
る抗体が遊離されていた。この流入抗原CA125と反応す
る抗体OC125は、一次および再発卵巣癌の診断に用いら
れてきた（Bast et al.,J.Clin.Invest.68:1331（198
1））。しかしながら、K1モノクロナール抗体が細胞表
面上で認識するエピトープは、OC125が認識するエピト
ープとは全く異なる。さらに、K1と反応する抗原は、卵
巣癌患者の血漿に流れ込まない。血漿に流れ込まないこ
とから、血流中に注入された直後でも循環している抗原
により中和されることないので、K1は、免疫療法に好適
の抗体である。
る抗体が遊離されていた。この流入抗原CA125と反応す
る抗体OC125は、一次および再発卵巣癌の診断に用いら
れてきた（Bast et al.,J.Clin.Invest.68:1331（198
1））。しかしながら、K1モノクロナール抗体が細胞表
面上で認識するエピトープは、OC125が認識するエピト
ープとは全く異なる。さらに、K1と反応する抗原は、卵
巣癌患者の血漿に流れ込まない。血漿に流れ込まないこ
とから、血流中に注入された直後でも循環している抗原
により中和されることないので、K1は、免疫療法に好適
の抗体である。
発明の要旨 本発明は、K1と称するモノクロナール抗体およびその
使用方法に関する。
使用方法に関する。
特にこの抗体は、数種の腫瘍の治療と診断に際して、
治療力のある標的剤として用いることが出来る。
治療力のある標的剤として用いることが出来る。
さらに詳しくは、本発明は、霊長類の正常組織、培養
されているヒトの悪性細胞系およびヒトの腫瘍において
発現することを特徴とする細胞表面の抗原に対して特異
的なモノクロナール抗体を産生し、且つ該抗原が培養基
または血漿に流入しないハイブリドーマに関する。この
ハイブリドーマ細胞系は、1990年10月10日、寄託番号AT
CC HB 10570としてメリーランド州ロックビルのアメ
リカンタイプカルチャー コレクションにブタペスト条
約に基づいて国際寄託されている。
されているヒトの悪性細胞系およびヒトの腫瘍において
発現することを特徴とする細胞表面の抗原に対して特異
的なモノクロナール抗体を産生し、且つ該抗原が培養基
または血漿に流入しないハイブリドーマに関する。この
ハイブリドーマ細胞系は、1990年10月10日、寄託番号AT
CC HB 10570としてメリーランド州ロックビルのアメ
リカンタイプカルチャー コレクションにブタペスト条
約に基づいて国際寄託されている。
本発明は特に、上記の特性を持つ細胞表面の抗原に特
異的であり、且つハイブリドーマによって産生されるモ
ノクロナール抗体そのものに関する。このモノクロナー
ル抗体は、免疫グロブリンＧ（IgG）のクラスに属す
る。
異的であり、且つハイブリドーマによって産生されるモ
ノクロナール抗体そのものに関する。このモノクロナー
ル抗体は、免疫グロブリンＧ（IgG）のクラスに属す
る。
上記した培養されたヒトの細胞系は、例えば、OVCAR
−２、OVCAR−３、OVCAR−４、1847、HTB77、HeLa S
3、KB、AGSおよびHTB103よりなる群から選ばれる。抗原
を表現する霊長類の正常組織は、例えば中皮である。ヒ
トの腫瘍は、例えば卵巣癌腫、食道癌腫または頚部（ce
rvical）癌腫由来のものである。
−２、OVCAR−３、OVCAR−４、1847、HTB77、HeLa S
3、KB、AGSおよびHTB103よりなる群から選ばれる。抗原
を表現する霊長類の正常組織は、例えば中皮である。ヒ
トの腫瘍は、例えば卵巣癌腫、食道癌腫または頚部（ce
rvical）癌腫由来のものである。
さらに本発明は、治療効果を生むのに充分な量のモノ
クロナール抗体の複合体（conjugate）を治療を必要と
している患者に投与することよりなる癌の治療方法の提
供する。
クロナール抗体の複合体（conjugate）を治療を必要と
している患者に投与することよりなる癌の治療方法の提
供する。
治療対象となる癌の種類は、例えば卵巣癌である。抗
体は、例えば毒素（toxin）、放射性同位体または化学
療法剤と複合させる。抗体は細胞殺傷作用を仲介するた
め修飾してもよい。
体は、例えば毒素（toxin）、放射性同位体または化学
療法剤と複合させる。抗体は細胞殺傷作用を仲介するた
め修飾してもよい。
さらにまた本発明は、診断を行うのに充分な量のモノ
クロナール抗体を患者に投与することよりなる癌の診断
方法を提供する。モノクロナール抗体には放射能標識を
付してもよい。
クロナール抗体を患者に投与することよりなる癌の診断
方法を提供する。モノクロナール抗体には放射能標識を
付してもよい。
さらにまた本発明は、癌の成長を抑制するに充分な濃
度のモノクロナール抗体と医薬的に許容できる担体を含
有してなる医薬組成物をも提供する。
度のモノクロナール抗体と医薬的に許容できる担体を含
有してなる医薬組成物をも提供する。
さらにまた本発明は、患者から組織または体液サンプ
ルを採取する工程と、モノクロナール抗体を上記サンプ
ルに添加する工程と、上記サンプル中の抗体の存在を視
覚化する工程とから成る診断方法を提供する。
ルを採取する工程と、モノクロナール抗体を上記サンプ
ルに添加する工程と、上記サンプル中の抗体の存在を視
覚化する工程とから成る診断方法を提供する。
図面の簡単な説明 図１は、卵巣癌患者の血清サンプルを、放射能標識を
付した抗体により検査した結果を示す図である。
付した抗体により検査した結果を示す図である。
K1またはOC125をマイクロタイター・ウェル中に置
き、表８に類似の手順でもって患者の血清サンプルまた
は培養基の上澄み液をこれに添加した。K1（K1系）で前
処理をした別のウェルにヨウ素化した放射性K1を入れた
もの、あるいは標識をつけないOK125抗体（OC125系）で
前処理をしたウェルに放射性OC125を入れたものと、前
掲のウェルとを一緒にインキュベートした。表８と同じ
ように、OVCAR−３培養基の上澄み液（濃縮物を1:3で希
釈したもの、測定値は２で除す）では、OC125の結合が
標識を付けたOC125によって検出された。これとは対照
的に、結合したK1加えてインキュベートした上澄み液で
は、ヨウ素化K1を用いて検出を図ったが、検知できなか
った。精製CA125抗原の標識サンプルは、OC125系とは反
応することが認められたが、K1系とは反応しなかった。
患者の血清サンプルはOC125系とは各種強度のシグナル
を示したが、K1系とのシグナルは認められなかった。K1
系は、トリプシン処理によりOC125が破壊されたOVCAR−
３細胞のトリプシン塩（trypsinate）では弱いシグナル
を検出したが、OC125系ではシグナルは認めなかった。
これら二つの標識を付けた抗体のアリコートを作ってチ
ェックしたところ、各種水準の充分な放射能が認めら
れ、充分な感度を有することが認められた。
き、表８に類似の手順でもって患者の血清サンプルまた
は培養基の上澄み液をこれに添加した。K1（K1系）で前
処理をした別のウェルにヨウ素化した放射性K1を入れた
もの、あるいは標識をつけないOK125抗体（OC125系）で
前処理をしたウェルに放射性OC125を入れたものと、前
掲のウェルとを一緒にインキュベートした。表８と同じ
ように、OVCAR−３培養基の上澄み液（濃縮物を1:3で希
釈したもの、測定値は２で除す）では、OC125の結合が
標識を付けたOC125によって検出された。これとは対照
的に、結合したK1加えてインキュベートした上澄み液で
は、ヨウ素化K1を用いて検出を図ったが、検知できなか
った。精製CA125抗原の標識サンプルは、OC125系とは反
応することが認められたが、K1系とは反応しなかった。
患者の血清サンプルはOC125系とは各種強度のシグナル
を示したが、K1系とのシグナルは認められなかった。K1
系は、トリプシン処理によりOC125が破壊されたOVCAR−
３細胞のトリプシン塩（trypsinate）では弱いシグナル
を検出したが、OC125系ではシグナルは認めなかった。
これら二つの標識を付けた抗体のアリコートを作ってチ
ェックしたところ、各種水準の充分な放射能が認めら
れ、充分な感度を有することが認められた。
発明の詳細な説明 本発明のK1モノクロナール抗体を産生する方法として
は次が挙げられる。先ず、例えば過ヨウ素酸塩で処理し
たヒト卵巣癌細胞でマウスに免疫性を与える。次に、免
疫性卵巣癌細胞に対して反応性のあるマウスの脾臓細胞
を分離する。この反応性脾臓細胞とAG8マウス骨髄腫細
胞とを融合して、ハイブリドーマあるいはクローンを作
る。そして、免疫細胞に対する反応性を基準にクローン
を選定する。続いて、このクローンを卵巣癌と正常組織
に暴露して二次スクリーニングを行う。この方法で選ん
だクローンは、癌との反応性は高いが、ヒトの正常細胞
とは反応しない。抗体は、マウスで腹水生産したクロー
ンから作ったり、クローンの培養上澄み液を採取して、
得ることができる。そして抗体を精製することができ
る。
は次が挙げられる。先ず、例えば過ヨウ素酸塩で処理し
たヒト卵巣癌細胞でマウスに免疫性を与える。次に、免
疫性卵巣癌細胞に対して反応性のあるマウスの脾臓細胞
を分離する。この反応性脾臓細胞とAG8マウス骨髄腫細
胞とを融合して、ハイブリドーマあるいはクローンを作
る。そして、免疫細胞に対する反応性を基準にクローン
を選定する。続いて、このクローンを卵巣癌と正常組織
に暴露して二次スクリーニングを行う。この方法で選ん
だクローンは、癌との反応性は高いが、ヒトの正常細胞
とは反応しない。抗体は、マウスで腹水生産したクロー
ンから作ったり、クローンの培養上澄み液を採取して、
得ることができる。そして抗体を精製することができ
る。
この抗体に反応するエピトープの所在位置と分布によ
って、抗体が癌の治療と診断に効用があるか、否かが決
って来る。この点については、ヒトの正常組織と癌およ
びカニクイザルの正常組織を用いて試験を行う。
って、抗体が癌の治療と診断に効用があるか、否かが決
って来る。この点については、ヒトの正常組織と癌およ
びカニクイザルの正常組織を用いて試験を行う。
次の表１に、反応性の分布とK1抗体と反応するエピト
ープの位置を示す。特に表１には、K1反応性エピトープ
が腹膜、心膜、胸膜の中皮細胞の漿膜に存在しているこ
と、および限られてはいるが、気管上皮、扁桃腺上皮と
輸卵管上皮にも分布していることを示している。
ープの位置を示す。特に表１には、K1反応性エピトープ
が腹膜、心膜、胸膜の中皮細胞の漿膜に存在しているこ
と、および限られてはいるが、気管上皮、扁桃腺上皮と
輸卵管上皮にも分布していることを示している。
K1の反応性を、従来から開示されている抗体であるOC
125（Bast et al.,J.Clin.Invest. 68:1331（198
1））と比較してみよう。例えば、サルの気管では、K1
抗体は分化が進んでいない上皮の基底細胞にOC125より
も高い選択性を持って反応する。気管支と子宮内膜につ
いても、これら二つの抗体間に違いが認められる。ま
た、K1は中皮に強く反応する。
125（Bast et al.,J.Clin.Invest. 68:1331（198
1））と比較してみよう。例えば、サルの気管では、K1
抗体は分化が進んでいない上皮の基底細胞にOC125より
も高い選択性を持って反応する。気管支と子宮内膜につ
いても、これら二つの抗体間に違いが認められる。ま
た、K1は中皮に強く反応する。
K1あるいはOC125と反応する抗原エピトープが存在す
ることから、これらの抗体を免疫療法に使用すると正常
組織部位が危険であると考えられるかも知れない。しか
しながら、この抗体は健全な細胞の先端部位で反応する
ので、腫瘍部位と較べれば、同じ正常細胞の基底表面を
間接的に浸す血流がこれらの反応性部位に均づくことは
出来にくい。K1とOC125とが上記のように異なることか
ら、これらの抗体に反応するエピトープの性質、恐らく
は分子の種類が化学的に大きく異なっていると考えられ
る。
ることから、これらの抗体を免疫療法に使用すると正常
組織部位が危険であると考えられるかも知れない。しか
しながら、この抗体は健全な細胞の先端部位で反応する
ので、腫瘍部位と較べれば、同じ正常細胞の基底表面を
間接的に浸す血流がこれらの反応性部位に均づくことは
出来にくい。K1とOC125とが上記のように異なることか
ら、これらの抗体に反応するエピトープの性質、恐らく
は分子の種類が化学的に大きく異なっていると考えられ
る。
各種癌細胞がK1とどの様に反応するかを検討すること
により、K1モノクロナール抗体の性質がより詳細に明ら
かになると共に、診断薬治療薬としての効用も確立され
る。（下記表２参照）。例えば、卵巣腫瘍、子宮頚部腫
瘍および胃腫瘍由来の各種細胞系はK1エピトープを表現
していることはすでに立証されている。これらの細胞に
は、例えばOVCAR−２、OVCAR−３、OVCAR−４、1874、H
TB77、HeLa S3、KB、AGS、HTB103（例えば、Kato II
I）がある。しかしながら、これらの細胞系のあるもの
（例えば、1847、AGS、Kato III）は、OC−125と反応
しない。
により、K1モノクロナール抗体の性質がより詳細に明ら
かになると共に、診断薬治療薬としての効用も確立され
る。（下記表２参照）。例えば、卵巣腫瘍、子宮頚部腫
瘍および胃腫瘍由来の各種細胞系はK1エピトープを表現
していることはすでに立証されている。これらの細胞に
は、例えばOVCAR−２、OVCAR−３、OVCAR−４、1874、H
TB77、HeLa S3、KB、AGS、HTB103（例えば、Kato II
I）がある。しかしながら、これらの細胞系のあるもの
（例えば、1847、AGS、Kato III）は、OC−125と反応
しない。
OC125抗原を発現しないある細胞とK1が反応し、K1抗
原を発現しないある細胞とOC125が反応するところか
ら、これら二つの抗体はエピトープが異なっているばか
りでなく、分子も全く異なっているものと思われる。ま
た、ある種の細胞系がK1と均質な反応をしているので、
生体内でもある種の癌がこの抗体に対して均質な反応を
示す可能性も考えられる。一つの癌の細胞全部と均質な
反応をすることは、一区分の癌細胞ばかりではなく、一
つの癌のあらゆる細胞を撲滅して免疫療法を成功させる
大きな要因となる。
原を発現しないある細胞とOC125が反応するところか
ら、これら二つの抗体はエピトープが異なっているばか
りでなく、分子も全く異なっているものと思われる。ま
た、ある種の細胞系がK1と均質な反応をしているので、
生体内でもある種の癌がこの抗体に対して均質な反応を
示す可能性も考えられる。一つの癌の細胞全部と均質な
反応をすることは、一区分の癌細胞ばかりではなく、一
つの癌のあらゆる細胞を撲滅して免疫療法を成功させる
大きな要因となる。
癌に対してK1とOC125の反応がどのような発現度とな
るのか、従ってこれら二つの抗体と反応するのはどのよ
うな抗原、具体的にはどのようなエピトープであるのか
を検討した。（表３と表４とを参照）。
るのか、従ってこれら二つの抗体と反応するのはどのよ
うな抗原、具体的にはどのようなエピトープであるのか
を検討した。（表３と表４とを参照）。
K1は、例えば多くの卵巣癌を始め、他にも食道癌、子
宮頚部癌など数種の癌に反応する。これらの実験結果に
よれば、各種腫瘍のK1とOC125が異なる細胞、または、
異なる水準で発現したエピトープを認識できることを示
しており、従ってこれらの抗体で認識された二つのエピ
トープは、恐らくは同一のエピトープではない。
宮頚部癌など数種の癌に反応する。これらの実験結果に
よれば、各種腫瘍のK1とOC125が異なる細胞、または、
異なる水準で発現したエピトープを認識できることを示
しており、従ってこれらの抗体で認識された二つのエピ
トープは、恐らくは同一のエピトープではない。
さらに、下記の表５に蛍光抗体法による実験結果を示
す。K1とOC125に反応性を持つエピトープは、「他の」
抗体に対する反応と交差的競合をしない。さらにまた、
表６と表７（下記）に示すように、これら二つの抗体
は、細胞に結合する上で交差的に競合しない。これらの
結果は、K1とOC125とがそれぞれ全く異なるエピトープ
を認識することを明確に示している。
す。K1とOC125に反応性を持つエピトープは、「他の」
抗体に対する反応と交差的競合をしない。さらにまた、
表６と表７（下記）に示すように、これら二つの抗体
は、細胞に結合する上で交差的に競合しない。これらの
結果は、K1とOC125とがそれぞれ全く異なるエピトープ
を認識することを明確に示している。
さらに、OC125とは異なり、K1は卵巣癌（OVCAR−３）
の培養細胞の培養基に流し込んだ抗原とあまり反応しな
い（下記表８、図１）。従って、K1に反応する抗原は、
OVCAR−３細胞の培養基には流れ込んで行かないものと
考えられる。卵巣癌患者の血清サンプルの分析試験にお
いても同様の結果が観察された（図１）。これらの結果
から、K1に反応する抗原は卵巣癌細胞から流れ出すこと
がなく、免疫療法で使用する抗体としてK1がOC125より
も遥かに適していることが分かる。さらにまた、精製さ
れたCA125抗原は、K1と反応しないことも注目に値す
る。CA125はOC125に反応する標準抗原である。
の培養細胞の培養基に流し込んだ抗原とあまり反応しな
い（下記表８、図１）。従って、K1に反応する抗原は、
OVCAR−３細胞の培養基には流れ込んで行かないものと
考えられる。卵巣癌患者の血清サンプルの分析試験にお
いても同様の結果が観察された（図１）。これらの結果
から、K1に反応する抗原は卵巣癌細胞から流れ出すこと
がなく、免疫療法で使用する抗体としてK1がOC125より
も遥かに適していることが分かる。さらにまた、精製さ
れたCA125抗原は、K1と反応しないことも注目に値す
る。CA125はOC125に反応する標準抗原である。
OVCAR−３細胞に結合するK1とOC125をマイクロタイタ
ー・プレートに置き、定量的に酵素とリンクさせた（EL
ISA法）免疫吸着分析（immunosorbent assays）を行っ
た。その結果では、K1とOC125とを一緒に添加すると、
広い濃度範囲（１−50μg/ml）において、それぞれの抗
体単独の値よりも遥かに高いシグナルを出すことが分か
った（下記表９）。この事実から、エピトープはお互い
に物理的に充分に離れていて、両方がそれぞれ独立して
同時に占有されることが出来ると考えられる。
ー・プレートに置き、定量的に酵素とリンクさせた（EL
ISA法）免疫吸着分析（immunosorbent assays）を行っ
た。その結果では、K1とOC125とを一緒に添加すると、
広い濃度範囲（１−50μg/ml）において、それぞれの抗
体単独の値よりも遥かに高いシグナルを出すことが分か
った（下記表９）。この事実から、エピトープはお互い
に物理的に充分に離れていて、両方がそれぞれ独立して
同時に占有されることが出来ると考えられる。
表５から表９の結果から、K1は、OC125エピトープと
は全く異なるエピトープと、物理的に離れた部位で反応
することを示している。さらに、K1とOC125それぞれに
反応する抗原が異なっており、正常細胞と若干の癌にお
いて発現が類似してはいるが、この二つの抗体は、免疫
療法で相異なる効用を持つ全く異なった二つの分子であ
る可能性がある。CA125は患者の血清に流入する特性が
があり、このため血清による診断に効用がある。その反
面、この同じ特性のためCA125抗原が循環して、治療用
の抗体複合体を中和してしまい、免疫療法の効用を減じ
てしまっている。K1に反応する抗原は、癌細胞に結びつ
いたまま残り、免疫毒素による選択的な細胞殺傷を可能
にしうる生存細胞を標的化することを可能にするので、
K1は免疫療法に好適である。二つの抗原が全く異なる分
子に存在するのであれば、K1の方が抗原の発現を司る遺
伝子を単離して、潜在的に有用な新しい試薬を作り出し
易いかもしれない。
は全く異なるエピトープと、物理的に離れた部位で反応
することを示している。さらに、K1とOC125それぞれに
反応する抗原が異なっており、正常細胞と若干の癌にお
いて発現が類似してはいるが、この二つの抗体は、免疫
療法で相異なる効用を持つ全く異なった二つの分子であ
る可能性がある。CA125は患者の血清に流入する特性が
があり、このため血清による診断に効用がある。その反
面、この同じ特性のためCA125抗原が循環して、治療用
の抗体複合体を中和してしまい、免疫療法の効用を減じ
てしまっている。K1に反応する抗原は、癌細胞に結びつ
いたまま残り、免疫毒素による選択的な細胞殺傷を可能
にしうる生存細胞を標的化することを可能にするので、
K1は免疫療法に好適である。二つの抗原が全く異なる分
子に存在するのであれば、K1の方が抗原の発現を司る遺
伝子を単離して、潜在的に有用な新しい試薬を作り出し
易いかもしれない。
かつてCA125抗原の遺伝子の単離を試みたが、失敗に
終わった。恐らく原因は、OC125抗体に反応する抗原の
エピトープの構造の一部に多量の炭水化物があるせいで
あろうと思われる。このような炭水化物の付加物は、CA
125の発現を司る遺伝子を単離するために使わなくては
ならない細菌系中にはない。K1抗原の遺伝子は、細菌の
発現系で失われるような炭水化物の付加物またはその他
の翻訳後の変更を必要としないかもしれないので、K1抗
体は、K1に反応する抗原の構造上の遺伝子を単離するの
に効用があるかもしれない。この様な遺伝子を発現する
ことによって、純粋な抗原を作ること、抗原分子上の異
なるエピトープに対して第二世代のモノクロナール抗体
を単離すること、および異なる癌サンプル中のこの抗原
の遺伝子を遺伝学的手法でスクリーニングするために用
いる試薬を用意することが可能となる。
終わった。恐らく原因は、OC125抗体に反応する抗原の
エピトープの構造の一部に多量の炭水化物があるせいで
あろうと思われる。このような炭水化物の付加物は、CA
125の発現を司る遺伝子を単離するために使わなくては
ならない細菌系中にはない。K1抗原の遺伝子は、細菌の
発現系で失われるような炭水化物の付加物またはその他
の翻訳後の変更を必要としないかもしれないので、K1抗
体は、K1に反応する抗原の構造上の遺伝子を単離するの
に効用があるかもしれない。この様な遺伝子を発現する
ことによって、純粋な抗原を作ること、抗原分子上の異
なるエピトープに対して第二世代のモノクロナール抗体
を単離すること、および異なる癌サンプル中のこの抗原
の遺伝子を遺伝学的手法でスクリーニングするために用
いる試薬を用意することが可能となる。
K1エピトープのその他の特性を検討した結果では、ト
リプシンで処理すると細胞からK1エピトープを取り除く
ことが出来ることが分かった。また、細胞を過ヨウ素酸
塩で処理すると、OC125との反応性は低くなるが、K1と
の反応性は僅かながら高くなる。細胞抽出物にタンパク
質イムノブロット（immunoblots）をしたもの、培養し
たOVCARの上澄み液、精製したCA125抗原についてSDS・
ゲル・ブロットを行ったところ高分子量（＞200キロダ
ルトン）のOC125と反応するスミアを示すが、同じ領域
でK1とは反応しなかった。従って、K1抗原の真の化学的
性質はどんなものかの点は明らかになっていない。しか
しながら、K1抗原の化学的性質または構造は、CA125と
は明かに異なっている。
リプシンで処理すると細胞からK1エピトープを取り除く
ことが出来ることが分かった。また、細胞を過ヨウ素酸
塩で処理すると、OC125との反応性は低くなるが、K1と
の反応性は僅かながら高くなる。細胞抽出物にタンパク
質イムノブロット（immunoblots）をしたもの、培養し
たOVCARの上澄み液、精製したCA125抗原についてSDS・
ゲル・ブロットを行ったところ高分子量（＞200キロダ
ルトン）のOC125と反応するスミアを示すが、同じ領域
でK1とは反応しなかった。従って、K1抗原の真の化学的
性質はどんなものかの点は明らかになっていない。しか
しながら、K1抗原の化学的性質または構造は、CA125と
は明かに異なっている。
上記の諸点から、K1が数種の癌の治療と診断に有用で
あることは明かである。K1モノクロナール抗体は、多数
の、例えばヒトの通常タイプの卵巣癌、子宮頚部癌、食
道癌の表面に発現されたエピトープを認識する。さら
に、この抗体が正常組織と著しい反応をしめすのは、腹
膜、胸膜、心膜の漿膜表面の中皮とだけであると思われ
る。従って、K1を使用する免疫療法において毒性のある
副作用は、比較的にマイナーであると考えられる。さら
に、この抗体とサルの正常組織とは交差的に反応するの
で、前臨床試験でこれらの反応部位を評価することが出
来る。
あることは明かである。K1モノクロナール抗体は、多数
の、例えばヒトの通常タイプの卵巣癌、子宮頚部癌、食
道癌の表面に発現されたエピトープを認識する。さら
に、この抗体が正常組織と著しい反応をしめすのは、腹
膜、胸膜、心膜の漿膜表面の中皮とだけであると思われ
る。従って、K1を使用する免疫療法において毒性のある
副作用は、比較的にマイナーであると考えられる。さら
に、この抗体とサルの正常組織とは交差的に反応するの
で、前臨床試験でこれらの反応部位を評価することが出
来る。
より具体的には、K1は、管理型癌療法においてK1と毒
素類、放射性同位元素あるいは化学療法剤それぞれとの
複合体を含み、且つこれらに限定されない免疫療法剤を
つくる際の標的メカニズムとして用いることが出来る。
抗体の不変領域をヒトその他の種の不変領域に変換する
ことを含む遺伝学的手法を用いて、抗体の構造を操作す
ることが出来る。従って、免疫療法の複合体は、天然の
ままの抗体か、遺伝学的手法で変形した抗体の何れかを
含有することとなる。さらに、クローン化されたK1抗体
の可変部遺伝子を用いて融合タンパクを開発することが
出来る。
素類、放射性同位元素あるいは化学療法剤それぞれとの
複合体を含み、且つこれらに限定されない免疫療法剤を
つくる際の標的メカニズムとして用いることが出来る。
抗体の不変領域をヒトその他の種の不変領域に変換する
ことを含む遺伝学的手法を用いて、抗体の構造を操作す
ることが出来る。従って、免疫療法の複合体は、天然の
ままの抗体か、遺伝学的手法で変形した抗体の何れかを
含有することとなる。さらに、クローン化されたK1抗体
の可変部遺伝子を用いて融合タンパクを開発することが
出来る。
例えば、K1マウス抗体遺伝子においてヒト免疫グロブ
リンＧの不変領域を置換すると、免疫系が害されていな
い患者において、抗体が主導する細胞の殺傷を仲介する
上で効用が高いヒト・マウス・キメラ抗体を作ることが
出来、免疫毒素と較べて毒性の低い免疫療法となるであ
ろう。
リンＧの不変領域を置換すると、免疫系が害されていな
い患者において、抗体が主導する細胞の殺傷を仲介する
上で効用が高いヒト・マウス・キメラ抗体を作ることが
出来、免疫毒素と較べて毒性の低い免疫療法となるであ
ろう。
K1はまた、放射能イメジーング法を用いる腫瘍塊のイ
メジーングなど免疫診断検定の標的メカニズムとして使
うこともできる。また、K1と反応する抗原の発現は、癌
の病因の診断や、転位の組織分布のための免疫組織化学
的な病理診断手段として有用である。具体的には、組織
サンプル（例えば、生検）または細胞調製物（例えば、
パパニコラウ・スミア、卵巣含浸出物など）を用いて免
疫組織化学的な病理診断を行うことが出来る。この他に
も、外科診査の際にK1抗体に放射能標識をつけて腫瘍の
位置診断を行うこともできる。
メジーングなど免疫診断検定の標的メカニズムとして使
うこともできる。また、K1と反応する抗原の発現は、癌
の病因の診断や、転位の組織分布のための免疫組織化学
的な病理診断手段として有用である。具体的には、組織
サンプル（例えば、生検）または細胞調製物（例えば、
パパニコラウ・スミア、卵巣含浸出物など）を用いて免
疫組織化学的な病理診断を行うことが出来る。この他に
も、外科診査の際にK1抗体に放射能標識をつけて腫瘍の
位置診断を行うこともできる。
以下本発明を実施例により詳しく説明する。但し、こ
の実施例を理由として本発明を限定してはならない。
の実施例を理由として本発明を限定してはならない。
実施例 Ｉ K1抗体の生産 ヒトの癌細胞系OVCAR−2,3,4,5、KB、AGS、MCF−７、
HT−29、MDA−MB−469、DU145、HTB20およびHTB33は、
従来から開示されていた（Hay et al.,American Typ
e Culture Collection Catalog of Cell Lines
and Hybridomas,6th Ed.（1988））。マウスに、ヒト
の正常な腎臓の膜に対する耐性を与えた（Matthew et
al.,J.Immnunol.Methods,100:73−82（1987））。続
いて、このマウスにOVCAR−３細胞で免疫性を与えた（W
illingham et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2474−
78（1987））。但し、培養細胞は過ヨウ素酸塩で処理し
た。過ヨウ素酸塩で処理するのはアンチ・マウス免疫グ
ロブリンＧを細胞表面に結びつけて、マウス抗体を運ん
でいるリンパ球に対する免疫抗原の標的特性を向上させ
るために行うものである。免疫生を与えられたマウスか
ら脾臓を摘出懸濁し、懸濁した脾臓からOVCAR−３と反
応する細胞を選び出し、続いてパンニング法（panning
method）により融合させた。選び出された脾臓細胞
を、AG8マウス骨髄腫細胞（AG8 mouse myeloma cell
s）と融合させて、クローンを形成した。２週間後に、
生存OVCAR−３細胞にローダミンによる間接蛍光抗体法
を行うスクリーンファスト（ScreenFast）（Life Tech
nologies,Ind.,Gaithersburg,MD）大規模スクリーニン
グ室を使用してクローンのスクリーニングを行った。こ
の様にして選ばれたクローンに対して、ヒトの癌よび正
常細胞から冷温によって作ったサンプルにペルオキシダ
ーゼ免疫組織化学法を実施して、第二次スクリーニング
を行った。一つのクローン、K1が選び出されたが、この
K1は卵巣の嚢胞腺癌とは反応したが、正常な肝臓、腎
臓、結腸、小腸、骨髄、小脳、肺、心臓または大脳皮質
には反応しなかった。このクローンは、もともとは、免
疫グロブリンＭ（IgM）抗体クローンであったが、パン
ニング・イソタイプ・スウィッチ法（panning−isotype
switching method）（Changら、発表準備中）を用い
てクローン細胞継代培養をした後、免疫グロブリンＧ
（InG）変異体に転換したものである。
HT−29、MDA−MB−469、DU145、HTB20およびHTB33は、
従来から開示されていた（Hay et al.,American Typ
e Culture Collection Catalog of Cell Lines
and Hybridomas,6th Ed.（1988））。マウスに、ヒト
の正常な腎臓の膜に対する耐性を与えた（Matthew et
al.,J.Immnunol.Methods,100:73−82（1987））。続
いて、このマウスにOVCAR−３細胞で免疫性を与えた（W
illingham et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:2474−
78（1987））。但し、培養細胞は過ヨウ素酸塩で処理し
た。過ヨウ素酸塩で処理するのはアンチ・マウス免疫グ
ロブリンＧを細胞表面に結びつけて、マウス抗体を運ん
でいるリンパ球に対する免疫抗原の標的特性を向上させ
るために行うものである。免疫生を与えられたマウスか
ら脾臓を摘出懸濁し、懸濁した脾臓からOVCAR−３と反
応する細胞を選び出し、続いてパンニング法（panning
method）により融合させた。選び出された脾臓細胞
を、AG8マウス骨髄腫細胞（AG8 mouse myeloma cell
s）と融合させて、クローンを形成した。２週間後に、
生存OVCAR−３細胞にローダミンによる間接蛍光抗体法
を行うスクリーンファスト（ScreenFast）（Life Tech
nologies,Ind.,Gaithersburg,MD）大規模スクリーニン
グ室を使用してクローンのスクリーニングを行った。こ
の様にして選ばれたクローンに対して、ヒトの癌よび正
常細胞から冷温によって作ったサンプルにペルオキシダ
ーゼ免疫組織化学法を実施して、第二次スクリーニング
を行った。一つのクローン、K1が選び出されたが、この
K1は卵巣の嚢胞腺癌とは反応したが、正常な肝臓、腎
臓、結腸、小腸、骨髄、小脳、肺、心臓または大脳皮質
には反応しなかった。このクローンは、もともとは、免
疫グロブリンＭ（IgM）抗体クローンであったが、パン
ニング・イソタイプ・スウィッチ法（panning−isotype
switching method）（Changら、発表準備中）を用い
てクローン細胞継代培養をした後、免疫グロブリンＧ
（InG）変異体に転換したものである。
再クローンの後、K1ハイブリドーマの形成されたイソ
タイプを検定したところ、マウス免疫グロブリンG1k（I
gG1k）であった。免疫グロブリンＧのクローンをマウス
の腹水で生産するか、あるいは培養基の上澄み液を採取
して抗体を得て、タンパクＡ FPLCアフィニティカラム
を用いて抗体を精製した。
タイプを検定したところ、マウス免疫グロブリンG1k（I
gG1k）であった。免疫グロブリンＧのクローンをマウス
の腹水で生産するか、あるいは培養基の上澄み液を採取
して抗体を得て、タンパクＡ FPLCアフィニティカラム
を用いて抗体を精製した。
実施例 II K1抗体と反応するエピトープの分布を立証するためのペ
ルオキシダーゼ免疫組織化学法の使用 ヒトおよびカニクイサルの正常組織の新鮮凍結サンプ
ルならびにヒト腫瘍のサンプルから冷温にて切片をつく
り、カバーグラスの上に乗せ、K1を一次抗体として用い
て、前述のペルオキシダーゼ免疫組織化学法（Willingh
am,FOCUS 12:62−67（1990））を実施した。ペルオキ
シダーゼ基質とジアミノベンジジンとの反応を利用し
て、各種組織中の反応性抗原の局在を検出した。この実
施例では、反応性抗原の局在がヒトおよびサル双方の組
織のうち、腹膜、胸膜、心膜を裏打ちしている中皮にあ
ることが証明された。量は減るが、反応性抗原はまた、
気管、扁桃腺、輸卵管の上皮にも見いだされた。ヒト腫
瘍サンプルでは、卵巣、食道および子宮頚部それぞれの
腫瘍がK1と反応し、程度は低くなるが乳腫瘍と結腸腫瘍
とも反応した。
ルオキシダーゼ免疫組織化学法の使用 ヒトおよびカニクイサルの正常組織の新鮮凍結サンプ
ルならびにヒト腫瘍のサンプルから冷温にて切片をつく
り、カバーグラスの上に乗せ、K1を一次抗体として用い
て、前述のペルオキシダーゼ免疫組織化学法（Willingh
am,FOCUS 12:62−67（1990））を実施した。ペルオキ
シダーゼ基質とジアミノベンジジンとの反応を利用し
て、各種組織中の反応性抗原の局在を検出した。この実
施例では、反応性抗原の局在がヒトおよびサル双方の組
織のうち、腹膜、胸膜、心膜を裏打ちしている中皮にあ
ることが証明された。量は減るが、反応性抗原はまた、
気管、扁桃腺、輸卵管の上皮にも見いだされた。ヒト腫
瘍サンプルでは、卵巣、食道および子宮頚部それぞれの
腫瘍がK1と反応し、程度は低くなるが乳腫瘍と結腸腫瘍
とも反応した。
実施例 III 蛍光抗体法による各種癌細胞系のK1抗体と反応力の測定 ヒトの生きている癌細胞系を培養した後、培養基すべ
てを洗い流し、モノクロナール抗体K1（１μg/ml）と共
に緩衝食塩水中で４℃によりインキュベートした。洗っ
た後、細胞をローダミンと複合しているヤギのアンチマ
ウス免疫グロブリンＧ抗体中でインキュベートした後、
フォルムアルデヒドで固定し、前述した蛍光顕微鏡によ
り観察を行って（Willingham,FOCUS 12:62−67（199
0））結合している抗体を検出した。K1抗体に強い反応
を示した細胞のうちには、例えばKG、HeLa S3、OVCAR
−３、AGS、Kato IIIおよび1847細胞があった。
てを洗い流し、モノクロナール抗体K1（１μg/ml）と共
に緩衝食塩水中で４℃によりインキュベートした。洗っ
た後、細胞をローダミンと複合しているヤギのアンチマ
ウス免疫グロブリンＧ抗体中でインキュベートした後、
フォルムアルデヒドで固定し、前述した蛍光顕微鏡によ
り観察を行って（Willingham,FOCUS 12:62−67（199
0））結合している抗体を検出した。K1抗体に強い反応
を示した細胞のうちには、例えばKG、HeLa S3、OVCAR
−３、AGS、Kato IIIおよび1847細胞があった。
実施例 IV K1エピトープ反応性に関する直接競合アッセイ 余剰の無標識競合剤としてのK1またはOC125抗体（25
μg/ml）の存在下または不存在下で、生きているOVCAR
−３を、K1抗体またはOC125抗体（10μg/ml）のローダ
ミン標識の直接複合体と一緒に４℃でインキュベートし
た。このインキュベートを行う前に、この細胞を同一の
無標識の競合体である抗体と共に前インキュベートし
た。インキュベート後、細胞を洗い、フォルムアルデヒ
ドで固定して蛍光顕微鏡で観察を行った。K1−ローダミ
ンは、競合剤としての抗体の不存在下または競合剤とし
てのOC125の存在下では、強い標識を示したが、K1が競
合剤として使用された場合、標識を全く示さなかった。
反対にOC125の場合には、競合剤の不存在下、または余
剰のK1が競合抗体として存在するときに、強い標識を示
し、OC125を競合剤として使用すると標識を全く示さな
かった。この結果は、OC125とK1のエピトープの間に
は、交差反応が無いことを示している。
μg/ml）の存在下または不存在下で、生きているOVCAR
−３を、K1抗体またはOC125抗体（10μg/ml）のローダ
ミン標識の直接複合体と一緒に４℃でインキュベートし
た。このインキュベートを行う前に、この細胞を同一の
無標識の競合体である抗体と共に前インキュベートし
た。インキュベート後、細胞を洗い、フォルムアルデヒ
ドで固定して蛍光顕微鏡で観察を行った。K1−ローダミ
ンは、競合剤としての抗体の不存在下または競合剤とし
てのOC125の存在下では、強い標識を示したが、K1が競
合剤として使用された場合、標識を全く示さなかった。
反対にOC125の場合には、競合剤の不存在下、または余
剰のK1が競合抗体として存在するときに、強い標識を示
し、OC125を競合剤として使用すると標識を全く示さな
かった。この結果は、OC125とK1のエピトープの間に
は、交差反応が無いことを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 パスタン，アイラ・エイチ アメリカ合衆国、 20854 メリーラン ド、ポトマック、ビール・マウンテン・ ロード 11710 (56)参考文献 国際公開89／1629（ＷＯ，Ａ１)
Claims (21)
- 【請求項１】細胞表面の抗原に対して特異性を持つモノ
クローナル抗体を産生し、寄託番号ATCC HB 10570の
ハイブリドーマ細胞系のハイブリドーマであって、該抗
原が霊長類の正常組織、培養されたヒトの悪性細胞系、
及びヒトの腫瘍に発現することを特徴とし、該抗原が培
養基又は血漿に流れ込まない上記ハイブリドーマ。 - 【請求項２】上記培養ヒト悪性細胞系がOVCAR−２、OVC
AR−３、OVCAR−４、1847、HTB77、HeLa S3、KB、AGS
及びHTB103からなる群より選ばれることを特徴とする請
求項１に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項３】上記ヒト腫瘍が卵巣癌、食道癌又は子宮頚
部癌に由来する請求項１に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項４】上記霊長類の正常組織が中皮である請求項
１に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項５】細胞表面の抗原に特異性を持ち、かつ寄託
番号ATCC HB 10570のハイブリドーマ細胞系のハイブ
リドーマによって産生されると共に免疫グロブリンＧク
ラスであるモノクローナル抗体であって、該抗原が霊長
類の正常組織、培養されたヒトの悪性細胞系、及びヒト
の腫瘍に発現することを特徴とし、該抗原が培養基又は
血漿に流れ込まない上記モノクローナル抗体。 - 【請求項６】上記培養ヒト悪性細胞系がOVCAR−２、OVC
AR−３、OVCAR−４、1847、HTB77、HeLa S3、KB、AGS
及びHTB103からなる群より選ばれることを特徴とする請
求項５に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】上記ヒト腫瘍が卵巣癌、食道癌又は子宮頚
部癌に由来する請求項５に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項８】上記霊長類の正常組織が中皮である請求項
５に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項９】上記抗体がK1である請求項５に記載のモノ
クローナル抗体。 - 【請求項１０】請求項５に記載の癌の診断用モノクロー
ナル抗体。 - 【請求項１１】毒素、放射性同位元素又は化学療法剤と
複合している請求項５に記載のモノクローナル抗体を含
む複合体。 - 【請求項１２】癌の治療のための請求項11に記載の複合
体。 - 【請求項１３】上記癌が卵巣癌である請求項12に記載の
複合体。 - 【請求項１４】上記抗体が細胞の殺傷を仲介するように
修飾されている請求項12に記載の複合体。 - 【請求項１５】請求項11に記載の複合体と医薬的に許容
できる担体を含有する癌の治療用の医薬組成物。 - 【請求項１６】癌の成長を阻止するのに充分な濃度の請
求項５に記載のモノクローナル抗体と医薬的に許容でき
る担体とを含有する癌の治療用の医薬組成物。 - 【請求項１７】ａ）腫瘍化している疑いのある細胞を含
む組織又は体液サンプルを患者から採取し、 ｂ）該サンプルを細胞表面抗原と結合できる抗体と反応
させ、 ｃ）該患者のサンプルからの細胞の表面において該抗体
と抗原の反応による抗原抗体結合体の存在を検出する ことを含む、 寄託番号がATCC HB 10570のハイブリドーマから分泌
される免疫グロブリンＧクラスであるモノクローナル抗
体K1を用いて該細胞表面抗原を発現する患者の腫瘍細胞
を検出する方法。 - 【請求項１８】腫瘍細胞が卵巣細胞に由来する請求項17
に記載の方法。 - 【請求項１９】該患者からの組織又は体液サンプルにお
いて細胞表面抗原CA125を検出することをさらに含む請
求項18に記載の方法。 - 【請求項２０】該抗原抗体結合体の存在が細胞調製物に
おいて検出される請求項17の方法。 - 【請求項２１】該抗原抗体結合体の存在が組織サンプル
において検出される請求項17の方法。
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