JPS61500789A - モノクロ−ナル抗−ヒト乳癌抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗−ヒト乳癌抗体 この発明は免疫学並びに癌の診断及び治療に関する。さらに詳しくは、これはネ ズミモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体、これらの抗体を生産するノ・イブリドー マ、これらの抗体から製造される免疫化学物質、並びにこれらの免疫化学物質を 用いる診断及び治療方法に関する。

１９７０年代半ば以来、ヒト乳癌関連抗原と反応するネズミモノクローナル抗体 の多数の報告が存在する。これらの報告された研究においては、ネズミがヒトー 乳脂肪球蛋白質’（ｍｉｌｋ　ｆａｔ　ｇｌｏｂｕｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、乳 癌セルライン、又は乳癌膜抽出物で免疫感作及び追加免疫された。免疫牌細胞が マウス骨髄臘細胞と融合され、そしてハイブリドーマが、乳房又は乳癌抗原に対 する培地の幾らかの特異性に基いて選択された。Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍ ｉｔｒｉｏｕ　＋　Ｊ−等、インターナショナル・ジャーナル・オプ・キャンサ ー（Ｉｎｔ、　Ｊ。

４２５８゜これらの先行技術の抗体の正常組織反応性はこの発明の抗体の正常組 織反応性と異る。

多くの先行研究者は、”イムノトキシン”全製造するための細胞毒性剤と抗体と の連結を報告し又は示唆した。最近の関心は、細菌又は植物由来の毒素の酵素的 活性部分（Ａ鎖）にヘテロ２官能剤を介して結合したモノクローナル抗体のイム ノトキシンに集中している。Ｎｅｖｉｌｌｅ　ｒ　Ｄ、Ｍ、及びＹｏｕｌｅ　Ｉ 　Ｒ−Ｊ、。

Ｔｒｏｗｂｒｊｄｇｅ　ｒ　ＬＷ、及びＤｏｍＩｎｇｏ　＋　Ｄ、Ｊ、ｒネイチ ュア（Ｎａｔｕｒｅ）（Ｃｏｍｄ）（１９８１）２９４：１７１−１７３゜この 発明の主たる観点は、 （、）　ヒト乳癌細胞に特異的に結合し；（ｂ）　ＩｇＧ又はＩｇＭであり； （ｃ）　Ａ鎖と結合した場合に、ＭＣＦ−７、ＣＡＭＡ−１。

５ＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくとも１つに対する約１０　ｎＭ未満 の、対照（未処理）蛋白質合成の５０％をもたらす組織培養阻害投与量（ＴＣＩ Ｄ５０％）を示すネズミモノクローナル抗体に関する。

これらの抗体の好ましい態様は２６０Ｆ９．１１３Ｆ１．２Ｇ３．２８０Ｄ１１ ．２６６Ｂ２．３３Ｆ８．２４５Ｅ７．４５４Ｃ１１，３１７Ｇ５．５２０Ｃ９ ，及び３６９Ｆ１０と命名されるもの、並びにこれらの機能的同等物である。

上記の抗体を生産するネズミＸネズミ・ハイブリドーマ及びこれらのハイブリド ーマの子孫がこの発明の他の観点である。

この発明の他の観点は、 （、）　上記のモノクローナル抗体、及び（ｂ）　細胞毒性成分、 の複合体であるイムノトキシンである。

この発明の他の観点は、上記モノクローナル抗体のラベル化誘導体であって該誘 導体がヒト乳癌の診断及びモニターにおいて使用されること全可能にする検出可 能なラベルによりラベルされているものに関する。

この発明の他の観点は、細胞を殺細胞的有効量の１又は複数の上記イムノトキシ ンと接触せしめることによりヒト乳癌細胞を殺す方法に関する。

この発明の他の観点は、ヒト細胞が乳癌細胞であるか否か全決定するための直接 的及び非直接的イムクローナル抗体又はラベルされたその誘導体と共にインキュ ベートすることを含む。ラベルされた誘導体が使用される場合、細胞上のラベル された二元免疫複合体の存在が直接に読み取られる。非ラベル抗体が使用される 場合、細胞がさらに該モノクローナル抗体に対するラベルされた抗体と共にイン キュベートされ、そして細胞上のラベルされた三元免疫複合体の存在が読み取ら れる。

発明を実施するための態様 この明細書において使用する場合、“モノクローナル抗体”は均一な抗体集団を 有する抗体組成物を意味する。抗体の超厚又はそれが作られる方法に関しては限 定されないことが意図される。

例示されるネズミモノクローナル抗−ヒト乳癌抗体に関してこの明細書において 使用される゛機能的に同等”なる語は、（ａ）例示されたモノクローナル抗体を 交差ブロックし；（ｂ）ヒト乳癌細胞に選択的に結合し；　（ｃ）　Ｇ又はＭア イツタ、イブを有し；（ｄ）免疫沈澱又はサンドイッチイムノアッセイによシ決 定される場合同じ抗原に結合し；そして（ｅ）　’Ｊ　７ンＡ鎖に結合された場 合ＭＣＦ−７、ＣＡＭＡ−１，５ＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくとも １つに対して約１０　ｎＭより小さいＴＣＩＤ　５０％を示すモノクローナル抗 体を意味する。

この発明のモノクローナル抗体生産性ノ・イグリドーマに関してこの明細書にお いて使用される場合、“子孫”なる語は、世代又は核型の同一性とは無関係に、 親により生産されるモノクローナル抗−ヒト−乳癌抗体を生産する、親ハイプリ ドーマのすべての誘導体、結果物及び子を包含することが意図される。

モノクローナル抗体製造 この発明のハイブリドーマを調製するために使用される抗体生産性融合・り一ト ナーは、マウスを化ヒト乳癌細胞又はそれから調製される膜抽出物により免疫感 作することにより生じる。マウスに免疫原量の細胞又は抽出物を腹腔内接種し、 そして次に同様の量の免疫源により追加免疫する。最終追加免疫の数日後、免疫 されたクラスから牌臓を集め、そして融合において使用するため、これから細胞 忍濁液を調製する。

Ｂｕｃｋ　、　Ｄ、Ｗ、等、イン・ビトロ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）（１９８２）１ ８−３７７−３８１により改変されたＫｏ　ｈ　１　ｅ　ｒ　ｒ　Ｂ及びＭｉｌ ｓｔｅｉｎ　ｒ　Ｇ　＋ネイチュアー（Ｎａｔ、ｕｒｅ　）　（１９７５）２５ ６：４９５−４９７の一般的体細胞ハイブリダイゼーション掲吃を用いて、牌細 胞とネズミ腫瘍パートナ−とからハイブリドーマを調製する。入手可能なネズミ 骨髄腫ライン、例えばサルク・インステ（テユート、セルディビジョンセンター 、サンジエゴ、カリホルニア、ＵＳＡ’ｉハイブリダイゼーションにおいて使用 することができる。基本的には、ポリエチレングリコールのごとき融合剤を用い て腫瘍細胞と牌細胞とを融合せしめることを含む。融合の後、融合媒体から細胞 を分離し、そして選択的増殖培地、例えばＨＡＴ培地（Ｃ増殖せしめることによ シハイグリダイズしてい女い親細胞を除去する。所望によシハイプリドーマを拡 げ、そして抗原として免疫剤（乳癌ａ胞又は膜抽出物）を用いて常用のイムノア ッセイ法（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、又は蛍光イム ノアッセイ）によシ、抗−ヒト乳癌活性洸ついて上清を測定する。陽性クローン をさらに特徴付けてこれらがこの発明の抗体の基準に合致するか否かを決定する 。

このような抗体を生産する・・イブリドーマを、公知の方法を用いてイン−ビト ロ又はインービボで増殖せしめることができる。モノクローナル抗体は、所望に よシ、常用の免疫グロブリンｎ製法、例えば硫酸アンモニウム沈澱、グル電気泳 動、透析、クロマトグラフィー、及び限外−過てよシ、場合に応じモノクローナ ル抗体の重要な特徴付けは（１）これらの免疫グロブリンクラス、（２）ヒト乳 癌細胞に対するこれらの選択性及びこれらが結合するヒト乳癌細胞の範囲、及び （３）効果的な抗−ヒト乳癌イムノドキシ／を製造する場合のその有用性である 。

与えられた抗体の選択性及び範囲は、（１）ヒト乳癌組織及び細胞並びに（２） 乳房及び他の由来の正常なヒト組織又は細胞のパネルに対してそれを試験するこ と（Ｃよシ決定される。請求の範囲に記載されてｂる抗体の選択において、約２ ２０００個の増殖ハイプリドーマ培養物をまず、免疫乳癌膜又はセルライン、８ 種類の正常組織膜の・母ネル、線維芽細胞セルライン及び乳癌腫瘍凍結切片に対 してスクリーニングしだ＠新生物材料と反応するが正常な材料と反応しないクロ ーンをこの最初のスクリーニングにおいて同定し、そしてアイソタイプの決定晟 びに選択性及び範囲についての追加のスクリーニングによシ選択した。追加のス クリーニングは、１６個の正常組織切片、５種類の正常血球型、１１個の非乳房 新生物切片、２１個の乳癌切片及び１４個の乳癌セルラインを用いる〇抗体が約 １／３未満の正常組織及び血球タイプと強く結合すれば、それらが乳癌に選択的 洗結合すると認められた。１２７の抗体ヲ楕製し、そして追加のスクリーニング において試験した。

許容し得る選択性及び範囲を示す抗体を、カッブリング剤としてＮ−サクシニミ ジル−３−（２−ピリノルソチオ）ｆｏピオネ−）　（ＳＰＤＰ）又はイミノチ オラン（ＩＴ）ｔ−用いてリシンＡ鎖に複合体化した。

この複合体を２４時間ｍ壷培養測定においてＭＣＦ−７・ＣＡＭＡ−１，５ＫＢ Ｒ−３、及びＢＴ−２０細胞に対して試験した。

１６種類の抗体が、これらの乳癌系の少なくとも１つに対して許容し得るイムノ トキシン活性（１０ｎＭよシ小さいＴＣＩＤ５０％）を示した。この１６種類の 内の７種類が同じ２１０，０００ダルトンの抗原を認識し、７種類の内の６種類 が３そら〈同じエピトープを認識するが親和性において異ることが見出された。

これらの抗体の一層詳細な特徴付けが下記の例において与えられる。

免疫ｒヒ学物質 最も重要なこの発明のモノクローナル抗体の免疫ｆヒ学的誘導体はイムノトキシ ン（抗体と細胞性毒素との複合体〕及びラベルされた（例えば、放射性ラベルさ れた、酵素ラベルされた、又はフルオロクロームラベルされた）誘導体（この誘 導体中でラベルはラベルされた抗体を含有する免疫複合体を同定するための手段 を提供する）で耳孔 イムノトキシンの細胞毒成分は、細胞毒性剤、細菌もしくは植物超厚の酵素的に 活性な毒素、又はこれらの毒素の酵素的（（活性な断片（“Ａ鎖”）である。酵 素的に活性な毒素及びその断片が好ましく、そしてジフテリア毒素の非結合性活 性断片でちるジフテリアＡ鎖、エキソトキシンＡ鎖〔シュードモナス・アエルギ ノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）７５＞ら〕、リシ ンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデツシンＡ鎖、アルファーサルシン、アレウリテスー フォルディー蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−８）、モモルデイ力 Ｓカランチア　（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ　）阻害剤１クルン ン（ｅｕｒｃｌｎ　）ｓ　クロチン（ｅｒｏｔｉｎ　）　ｓサポナリア・オフィ シナリス（５ａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆＮｃｉｎａ目Ｓ）ｍ害剤、ｒ口二ン（ｇｅ ｌｏｎＩｎ　）　、ミｌ’グリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ　）、レストリフトシ ン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、及びエノマイシンによシ例 示される。リシ７Ａ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、アルピンＡ鎖、及 びＰＡＰ　Ｉ　Ｉが好ましい。モノクローナル抗体とこれらの細胞毒性成分との 複合体は種々の２官能蛋白質カツプリング剤を用いて調製することができる。こ のような試薬の例は５ＰＤＰ、ＩＴ。

イミドエステルの２官能誘導体、例えばノメチルアノピミデート・ＨＣｌ、活性 エステル、例えばノサクシニミジルスベレート、アルデヒド、クリえばグルタル デヒド、ビス−アジド化合物、例えばビス（Ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジ アミン、ビスージアゾニクム誘導体、例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムビス−活 性弗素化合物、例えば１，５−ノフルオロー２．４−　＆ニトロベンゼンでアル 。

診断Ｏ目的でヒト乳癌細胞全イン−ビトロで殺すために使用する場合、典型的１ （は複合体が約１０ｎＭ以上のＩ！に度において細胞培養培地にカロえられる。

イン−ビトロで使用するための適用の剤形及び方法は臨界的ではない。培地又は 潅流媒体とｎ相溶性剤が一般に使用されよう。細胞毒性を常用技−によシ読み取 ることによって乳癌の存在又は程度を決定することができる。

療法のためにインービボで使用される場合、イムノトキシンは療法的有効量（す なわち、患者の腫瘍負担を除去し又は軽減する量〕において患者に投与される。

これらは一般に、非経腸的に、好ましくは静脈内に投与される。投与量及び投与 方法は癌の性質（−人癌又は転移癌）及びその集団、特定のイムノドキシ／の特 徴、例えばその治療係数、患者、並びに患者の病歴に依存するであろう。投与さ れるイムノトキシンの量は典型的には約０．１〜約１０　ｒｔｒｔｖ’ｑ患者体 重であろう。

非経腸的投与のためには、イムノトキシンは医薬として許容される非経腸担体と 共に単位投与注射形（溶液、懸濁液、乳濁液）として製剤比されるであろう。こ れらの担体は本来的に非毒性でありそして非療法的である。このような担体の例 は水、塩溶液、リンゲル溶液、グルコース溶液、及び５％ヒト血清アルグミンで ある。非水性担体、例えば不揮発油及びオレイン酸エチルを使用することもでき る。担体としてリポゾームを使用することもできる。担体は微量の添加剤、例え ば等張性及び化学的安定性を増強するための物質、例えば緩衝剤及び防腐剤を含 有することができる。イムノトキシンは、典型的にはこれらの担体中に約１　ｍ ｇｙｆｎｌ〜Ｉ　Ｑ　ｗｌｎｌの遺産で製剤ｆヒされる。

乳癌を処置するための細胞毒性放射性医薬は、高線エネルギー移動（ＬＥＴ　） 放射性同位元素（例えば・Ｙ、Ｐｒ）ｔ−抗体に結合することによって調造され る。

この明細書において使用される１細胞毒性成分″なる語はこのような同位元素を 包含することが意図される。

抗体のラベルされた部分を作るために使用されるラベルは、直接検出され得る成 分、例えば蛍光色素及び放射性ラベル、並びに検出されるために誘導体化されな げればならない成分、例えば酵素を包含する。このようなラベルの的は５２Ｐ、 　＋２５１．５Ｈ，＋４Ｃ。

フルオレッセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウン ベリフェロン、レンフェロン、２，３−ノヒドロフタラジンジ万ン、ホースラデ ィツシュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、リソチーム、及びグル コース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼである。抗体を、これらのラベルに より公知の方法で標識することができる。

例えば、カップリング剤、例えばアルデヒド、カル？・ノイミド、シマレイミド 、イミデート、サクンンイミド、ビスージアゾｆヒベンデノン及びこれらに類似 するものを使用して抗体を上記の蛍光ラベル、化学発光ラベル、及び酵素ラベル により標識することができる。

抗体及びラベルされた抗体をイムノイヌ−ソング法又はイムノアッセイ法におい て使用して、患者における乳癌の存在を検出し、又はそれを有することがすでに 診断されている患者におけるそのような癌の状態をモニターすることができる。

癌の状態全モニターする場合、定量的イムノアッセイ法を用いなければならない 。このようなモニターにおいては測定は定期的に行われ、そしてその結果を比較 して患者の腫瘍負荷が増加したか減少したかが決定さｎる。

使用することができる一般的測定技法には直接測定及び間接測定が含まれる。直 接測定は患者からの組織サンプル又は細胞をラベルされた抗体と共にインキ−ベ ートすることを含む。サンプルが乳癌細胞を含むなら、ラベルされた抗体はそれ らの細胞７ｃ結合するであろ５２組織又は細胞を洗浄して未結合ラベル化抗体を 除去した後、組織サンプルをラベルされた免疫複合体の存在について読み取る。

間接測定においては、組織又は細胞サンプルをラベルされていないモノクローナ ル抗体と共沈インキュベートする０次に、該モノクローナル抗体に対するラベル 化抗体（例えば、ラベルされた抗ネズミ抗体）で処理し、洗浄し、そしてラベル された三元複合体の存在（（ついて読み取る。

診断的用途のためには、抗体は典型的にはキットの形で分配される。これらのキ ットは典型的には、適当な容器中ラベル比又は非２ベルｆヒ形の抗体、インキュ ベーション又は洗浄のための試験、キ・ノドが間接測定形であればラベルされて いない抗ネズミ抗体、並びにラベルの性質に依存して基質及び誘導体化剤を含ん で成る。ヒト乳癌抗原対照及び指示書も含めることができる。

次の例により、この発明の代表的モノクローナル抗体の調製、特徴及び使用を詳 細に記載する。これらの例は、この発明に限定を加えることをなんら意図するも のではない。

免疫感作 新しく外科摘出したヒト乳癌組織及び種々の正常組徹ヲ用いて、ホモジナイズ及 び非連続的シー−クロースグラソエ／ト遠心によシ膜抽出物ヲ調製した。

ヒト乳癌セルラインをプレスト・’ｒヤンサー・タスクφフォース（Ｂｒｅａｓ ｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔａ５ｋ　Ｆｏｒｃｅ　）％アメリカン・タイプ・カルチー アー・コレクション（ＡＴＣＣ）、Ａびメモリアル・スローン・ケッタリングの Ｊａｒｇｅｎ　Ｆｏｇｈ博士から得た。プレスト・キャ／サー・タスク・フォー ス、ＡＴＣＣ，及びＦｏｇｈ博士により推奨されるようにして細胞を維持しそし て継代した。

免疫感作のため、１００μｇ　（Ｌｏｗｒｙ測定）の蛋白質を含有する膜抽出物 又は−千万鑓の生乳癌細胞を５週令のＢａ１ｂ／ｃマウス（（腹腔内投与した。

マウス′ｆｒ：１箇月間隔で同様に２回追加免疫した。最後の追加免疫の３日後 、細胞融合のため牌、懺を摘出した。

ハイプリドーマ法 ネズミ骨髄腫系Ｓｐ−２１０−Ａｇ１４　を用いてＢｕｃｋ　ｅ　Ｄ。

Ｗｏ等の方法により体細胞バイブリド金調製した。すべてのハイツリドーマセル ラインは限界稀釈法（Ｃよりクローン化した。融合の半分は乳癌膜抽出物によ） 免疫感作したマウスからの牌細胞を用い、そして半イは乳癌セルラインにより免 疫感作したマウスか゛らの牌細胞を用いた。これらの融合から８３４２４個のウ ェルが設けられ、この内２２，４５９個がハイブリドーマの増殖を示した。

ハイプリドーマ上清を、免疫感作用乳癌膜抽出物を用いる固相エンザイムリンク ドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ　）によシ又は免疫感作用乳癌セルラ インを用いる間接イムノフルオレッセンスアッセイによシ、反応性抗体〈ついて 測定した。固相慎ＥＬＩＳＡのため、４０Ａｌｌの０．１　ｍｙ／ｍｌ乳癌膜蛋 白質をポリ塩化ビニル（ｐｖｃ　）ミクロタイターウェルに４℃にて１２時時間 −た。抽出物を吸引し、そしてｌチラシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）を含有する リン酸瑳衝ｆヒ塩溶ｉ　（ＰＢＳ　）によりウェルを洗浄した。次に、ウェル’ （Ｈｌ：１０稀釈のハイプリドーマ上清４５μｌと共知インキュベートした。稀 釈剤は、２５ｍＭの緩衝剤、１０％ウシ血清及び０．１％ナトリウムアットから 成る媒体であった。室温にて３０分分間−た後、ウェルを再度洗浄し、モして１ ：２００稀釈の・や−オキシダーゼ接合ヤギ抗−マウスＩｇＧと共にインキエヘ ートシた。稀釈剤はＰＢＳであった。次にウェル’ｉ　ＰＢＳで洗浄し、そして ０．１Ｍクエ／咳ナナトリウム緩衝液　ｐＨ４，２）中２，２−アジノージ（３ −エチルベンズチアジンンスルホン散２００１ｔｌｌと反応せしめた。ミクロエ リプリーダ−上で４０５ｎｍにおける光学濃度全測定した。各実験において、陽 性対象である抗−β２ミクログロブリン５μｇｙｍｉ　を正常ヒト腎臓膜と反応 せしめた。これは１．０±０．１（漂準偏差〕の光学！Ｉ度を与えた。パックグ ラウンドは、マウスモノクローナル抗体を含まない媒体を用いて０±０．１光学 濃度単位（０，Ｄ）であった。乳癌膜抽出物に対して０．７０．Ｄよシ大きな反 応をもたらすウェルを保持した。

間接イムノフルオレセンスセルラインアッセイのため、免疫感作用セルラインの １０万個の乳癌細胞を、１セツトの８チキンパースライドの各チャン・９に入れ た。同様にして、セルラインＣＣ９５からの１０万個の線維芽細胞をチャン・ぐ −を有するスライドウェル中で一夜インキユベートした。１％ＢＳＡを含有する ＰＢＳによう細胞を洗浄した。乳癌及び線維芽細胞の両者のウェル’ｉｉ、ｌ： １０稀釈のノ）イグリドーマ上清と共に４℃にて３０分間インキ−ベートした。

細胞を再度洗浄し、そしてｌ：５０稀釈のフルオレッセインイソチオシアナー） （ＦＩＴＣ）−接合ヤギＦ　（ａ　ｂ’　）２抗−マウスＩｇと共に４℃にて３ ０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、ＰＢＳ中１．５％ホルムアルデ ヒド中で固定し、テヤンノ４−ｔ−取り出し、そしてＰＢＳ中ですすいだ。次に 、スライドを、ポリビニルアルコール、グリセリン、緩衝剤及び防腐剤を含有す る組成物中に配置し、そして蛍光顕微鏡により試験した。乳癌細胞への強い蛍光 結合を示すが線維芽細胞への蛍光結合を示さないハイブリド９−マウエル全保持 した。５１５６個のハイブリドーマウェルが最初のスクリーニングにおいて乳癌 反応性を示した。

次に、５１５６個の陽性ウェルからの上清金、８種類の正常組織（肝臓、肺、結 腸、胃、腎臓、扁桃腺、肺臓及び膵臓）膜抽出物を用いる固相ＥＬＩＳＡにおい て試験した。０．３よシ大きなＥＬＩＳＡ　−０，Ｄ、をもたらすすべてのウェ ルを廃棄した。１１０１個の上清が正常組織抽出物と反応しないことが見出され た。

１１０１個のハイブリドーマ上清をヒト乳癌組織の凍結切断に対して試験した。

６ミクロンの切片をスライドに付着させ、４℃にてアセトン中で１０分間固定し 、室温にて１０分間乾燥し、ＰＢＳで洗浄し、ウマ血清でブロックし、そして２ ００μｌの未稀釈のハイブリドーマ上清と共に室温にて２０分間インキ−ベート した。スライドをＰＢＳで洗浄し、そして最後に３７℃にて２０分間、１：５０ 稀釈の／４’−オキシダーゼ接合ラビット抗マウスＩｇと共にインキュベートシ 、ＰＢＳで再び況浄し、そして最後に３７℃にて７．５分間０．０１％過酸化水 素を含有する０、０５ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，２）中０．５　ｍ９／ｌジア ミノベンジジンと共にインキ−ベートした。スライドをへマドキシリンで染色し 、脱水し、そして３５．９％メチル／ｎ−ブチルメタクリレートコポリマー、７ ，１％グチルベンノルフタレート及び０．３％２，６−ノｔｅｒｔブチル−ｐ− クレゾール全含有する媒体中においた。

１２４ウエルが乳癌選択的結合をもたらし、そしてモノクローナル乳癌選択的抗 体の免疫グロブリンクラス及びサブクラスを決定した。次に１さらに・２〜３× １０ハイプリドーマ細胞を０．２μＣ＋　Ｓメチオニンを含有するメチオニン不 含培地中で４時間増殖せしめることにより抗体を内部的にラベルした。

３５Ｓ−ラベル抗体全固定されたスタフィロコッカスＡ細胞と、又はラビット抗 −マウス免疫グロブリンによリフレコードされたスタフィロコッカスＡｌａ胞を 固定するために使用される組成物と免疫沈澱せしめ、そしてこの免疫沈澱ｅ　５ ＤＳ−ＰＡＧＥによシ分析して抗体ライト及びヘビー鎖の移動度、余分の鎖の欠 落、並びにスタフィロコッカスプロティンＡと結合する各抗体の能力を決定した 。

抗体全イン−ビトロで拡張した。Ｂａ１ｂ／ｃ又はＦｌ（Ｃ５７Ｂ／６　Ｘ　Ｂ ａ１ｂ／ｃ　）　？ウスに０．５　ｍｌのグリスタンを腹腔内（！ｐ）注入し、 そして１０〜１４日後ＰＢＳ中１００万個の対数期ハイブリドーマ細胞を接種し た。腹水を一７０℃に貯蔵し、そして解凍し、そしてさらに精製する前に０８ミ クロンフィルター二二ノトを通して濾過した。

スタフィロコッカスプロティンＡｔ−結合スル工ｇＧ抗体を、アガロース、デキ ストラン及び／又はアクリルアミドを含有するプロティンＡ−クロマトグラフ樹 脂上での、ＰＨ段階グラソエント溶出を用いるアフィニティークロマトグラフィ ーにより精製した。

プロティンＡを結合しなかったＩｇＧ抗体を、０℃にて４０％飽和に硫酸アンモ ニウムを加えることにより沈澱せしめた。沈澱ｔ−ＰＢＳ中に再溶解し、２０ｍ ＭＴｒｉｓ（ｐ）１７．２　）に透析し、そしてノエチルアミノエチルセルロー ス（ＤＥＡＥ　）の１．’６　Ｘ　５０　ｃｍカラム上で、１．５１のＯ〜６０ ０ｒｒＬＭＮａＣｔグラジェントにより４℃にてｌ　ｍ１７７分の流速で溶出す ることによりクロマトグラフ処理した。各場合において、カラム画分’ｉ　５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥによりモニターし、最純抗体画分を一緒にし、１〜３ｍν算に濃縮 し、ＰＢ　Ｓ　／　ｏ、　０２　％　Ｎａ　Ｎ３に透析し、そして４℃に貯蔵し た。

ＩｇＭ抗体を、アガロース、デキストラン及び／又はアクリルアミドを含有する クロマトグラフ樹脂の２．６Ｘ４Ｏｃｒｎカラム上でのグル濾過により、室温、 １　ｍｌ１分の流速にてＰＢＳｌｏ、０１％　ナトリクムアソドで溶出すること によシ精復した。

乳癌に対するこれらの選択性を評価するため、精製された抗体を、１６個の正常 組織の切片に対する免疫・ぐ−オキシダーゼ切片により、及び５個の血球型に対 する免疫蛍光細胞ソーティングにより試験した。イムノパーオキシダーゼ染色は 上記のようにして行ったが、但しハイブリドーマ上清の代りに、１〜４０μｇ／ ｍｌの範囲で、ＰＢＳ中精製抗体の既知の稀釈を用いた。純粋な抗体をまず力価 検定し、乳癌切断に対して強いイムノ・ぐ−オキシダーゼ染色ｆもたらす最小濃 度を見出し、そして次に正常組織試験のためにその濃度で使用した。末梢血細胞 （血小板、リン／千球、赤血球、顆粒球、及び単球）全、多形核白血球から半球 を分離する媒体を用いて遠心によシ調製した。細胞を、上記のようにして決定し た最適濃度において、４℃にて３０分間抗体と反応せしめ、洗浄し、１：５０稀 釈の蛍光インチオシアナート−複合ヤギ抗−マウスＩｇと４℃にて３０分間反応 せしめ、再び洗浄し、そしてセルノーター中で試験した。

洗浄緩衝液及び稀釈剤は１％ゼラチン及び０．０２％ナトリウムアジドを含むＰ ＢＳであった。セルソーターは、７６ミクロンのノズル、及び１ワツトの４８８ ｎｍアルゴンイオンレーザーを装着していた。焦点を合わせるため、光学レール 装置上に８０ｍの共焦レンズを使用した。他の使用フィルターは５１５ｎｍ干渉 フィルター及び５１５ｎｍ吸収フィルター（散乱し−デー光のため）及び前方角 光散乱のため中間ａ度１．５フィルターであった。フルオレッ七イン蛍光の対数 対前方角光散乱の概略プロノ）をサンプル分析のために使用した。

請求の範囲に記載された抗体の結合挙動を下記の第１表に報告する。

範囲決定 いかなる範囲の乳癌が各抗体によって認識されるかを決定するため、乳癌選択的 抗体を、２′７個の異る乳癌の凍結切片に対するイムノ・−一オキシダーゼ染色 によシ試験した。切片染色のために使用された乳癌はすべて浸潤腺管内癌であシ 、従って、抗体結合と乳癌の組織学的タイプの関連はなされ得なかった。さらに 、抗体結合と結節状態又はエストロゲン受容体状態との間の関連も、提供者の情 報が得られる１２の癌について見出されなかった。抗体は、転移乳癌及び原発性 乳癌のウェルと同様に反応した。

請求の範囲に記載されている抗体についてのこれらの試験の結果を下記の第２表 に報告する。

と１ 抗体をさらに、１４の乳癌セルラインに対するセルライン免疫螢光測定により、 乳癌認識の範囲について評価した。下記の第３表は、請求の範囲に記載されてい る抗体についてこれらの試験の結果を報告する。

最後に、抗体を１１の非乳房性癌に対するイムノパーオキシダーゼ染色によ・シ 試験゛した。請求の範囲に記載されている抗体についての結果を下記の第４表に 報告する。

１ＩＮｏへ００−ロロロロロロロロロロ　ゝ淋１０−〜〜ｏ−ｏローーローロロ ーロ　℃郵 細胞毒性の評価 Ｃａｒｌｓｓｏｎ＋Ｊ１等、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ 、）（１９７８）　１７３　：　７２３−７３７に記載されているようにして５ ＰＤＰにより、又はイミノチオラン（ＩＴ）により処理されたりシン毒素Ａ鎖（ ＲＴＡ）に、請求の範囲に記載されている抗体を複合体化せしめた。

５ＰＤＰ複合体形成 ５ＰＤＰ　（エタノール中２０　ｍＭ　）を２０倍モル過剰において抗体に加え 、そして室温にて３０分間インキュベートした後、未反応Ｓ　ＰＤＰをＰＢＳに 対する透析により除去した。誘導体化の程度を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ） による還元の後３４３　ｎｍにおいてビリジ／−２−チオンの放出を測定するこ とによシ決定した。抗体に依存して３〜８個のリジンアミノ酸基（抗体分子当り ）がビリジルージスルフィド誘導体に転換された。

５ＰＤＰで処理された抗体をＲＴＡ　、と複合体化した。複合体形成の直前Ｋ　 ＲＴＡを５０　ｍＭ　ＤＴＴで還元し、次にアガロース、デキストラン及び／又 はアクリルアミドを含有するクロマトグラフ樹脂のカラム上で脱塩して蛋白質か らＤＴＴを除去した。還元されたＲＴＡを３〜５倍モル過剰のピリジルジスルフ ィド抗体に加えた。典型的な反応混合物（１罰）は７μＭ抗体及び３０μＭ　Ｒ ＴＡから成る。反応を４℃にて一夜進行させた。抗体へのＲＴＡの複合体形成の 程度を、ピリノン−２−チオンの方法を測定することにより分光光度計により決 定した。平均して、複合体は抗体分子当９２〜３個のＲＴＡ分子を含有する。こ のことは非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥグル（７，５％）によシ確認され、このグルは さらに、典型的な複合体調製物が１０％〜３０チの遊離抗体を含有することを示 した。

複合体混合物をＨＰＬＣサイズ排除カラム上でクロマトグラフ処理して残留未反 応ＲＴＡから複合体を分離した。カラムを０．１Ｍ硫酸ナトリウム１０．０２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）中で平衡化した。複合体混合物（Ｑ、７＋ｎｌ ）を注入し、次に１１ｎｌ／分の流速でクロマトグラフ処理した（室＠）。Ｑ、 　５　ｍｌの画分を集め、そしてピーク複合体画分をプールし、そして細胞毒性 試験の前に濾過除菌した。

イミノチオラン複合体 ０．１Ｍリン酸ナトリウム、Ｏ，ＯＯＩ　ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）（以後Ｐ −ＥＤＴＡ緩衝液と称する）を約３０η／ｍｌの抗体を室温にて約１５分間にわ たり１　ｍＭ　５　、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ） と反応せしめ、そして次に水浴中で０℃に冷却する。この溶液に、２、５　ＩＴ 分子／抗体分子とするのに十分なＩＴを加え、そして得られた溶液を０〜５℃に て約２４時間貯蔵する。次に、これを０〜５℃にて３００倍過剰容積のＰ−ＥＤ ＴＡ緩衝液に対して透析する。

１　ｍＭＤＴＴを含有するＰ−ＥＤＴＡ中に正常に貯蔵されたＲＴＡを限外濾過 して１０〜１５ｍ９７ｍ１の濃度とし、そして０〜５℃にて３００倍過剰容積の ｐ　−ＥＤＴＡに対して透析する。十分なＲＴＡを誘導体化された抗体に加えて 、１．０〜１．２のＲＴＡ上遊離チオール／誘導体化抗体上ブロックされたチオ ールとする。この混合物を室温にて２時間インキュベートする。

カップリング反応混合物を、固体支持体に留められた青色色素を基礎とするクロ マトグラフ樹脂のカラムに適用し、次にこの混合物を室温にてＰ−ＥＤＴＡによ り溶出する。カラムの大きさを、出発抗体ｍｅ）当り約’ｌ　ｍｌのベッドボリ ウムを含むようにす゛る。未複合体化抗体の最初のピークがカラムから溶出した 後、溶離液をＩ　Ｍ　ＮａＣ１含有Ｐ−ＥＤＴＡに切り換える。この緩衝液にお いて、免疫複合体及び未反応ＲＴＡが非常にシャープなピークとして溶出する。

これをプールし、そして１０倍過剰容積の０．１５ＭＩＪン酸ナトリウム（ｐＨ ７，１）（以後、Ｐｉ緩箇液と称する）に対して０〜５℃にて透析する。透析さ れた蛋白質を０〜５℃にてグルのカラムに適用し、そして６　ｃｍ　７時の流速 にて緩衝液により溶出する。カラムの大きさを、少なくとも２５ｍ１のベッドボ リウム／　ｍｉの適用蛋白質を含むようにする。免疫複合体は単一ピークとして 排除容積のわずかに後に溶出し、これはこれに続く２量体化及び単量体ＲＴＡの ピークからベースライン分離される。−緒にした免疫複合体ピークを３５ｐｓｉ にて限外濾過し、５．　Ｏｍｔ）／ｍｌの最終濃度としそして濾過除菌する。

細胞毒性試験 この細胞毒性試験において使用された試験ヒト乳癌系はＭＣＦ−７、ＣＡＭＡ− １，５ＫＢＲ−３、及びＢＴ−２０であった。

ヒト線維芽細胞セルラインＣＣ９５及びＷＩ−３８を陰性対照として使用した。

ｌ　ｍｌの培地中４００００個の試験細胞を、１セツトの３　ｍｌガラスバイア ルに加え、そして次に複合体稀釈物（１００μｇ　／ｒｎｉのＢＳＡ含有ＰＢＳ 中）を加えた。

３７℃にて２２時間インキュベートした後、培地を吸引し、単層をＰＢＳで洗浄 し、そして３５Ｓメチオニンを補充したメチオニン不含培地を加えた。バイアル をさらに３７℃にて２時間インキ−ベートし、培地を除去し、そして細胞を、１ ｍり／　ｍｔのメチオニンを含有する１０％トリクロロ酢酸２ｍ１ｉてより２回 洗浄した。細胞を乾燥し、シンチン−ジョン溶液を加え、そしてシンチレーショ ンカウンター６中で放射能を測定した。細胞毒１を、対照（未処理）蛋白質合成 の５０％をもたらす複合体の組織培養阻害量（ＴＣＩ０５０％）として表示した 。

これらの細胞毒性試験の結果を下記の第５表中に報告する。

複合体のインービボ試験 ２４５Ｅ７．２８０Ｄ１１、及び２６０Ｆ９とＲＴＡとの複合体を１力、ｆリン グ剤としてイミノチオラン又は５ＰＤＰを用いて上記のようにして製造した。Ｘ Ｍ−１ヒト乳癌細胞に対するこれらの複合体のインービボ効果を下記のようにし て評価した。

雌性無胸腺Ｂａ１ｂ　／　ｃ−ｎｕ　／　ｎｕ　？ウス（２０〜２４９）を用い た。中心壊死の兆候を有しない６００〜８００ｍＡの懇濁液を中外側穿刺によシ 腋領域にｓ、ｃ移植した。移植の７日又は１４日後、マウスの重量を測定し、そ してその腫瘍負荷をキャリ・マスを用いて移植片を測定することによシ評価した 。

対照マウスＱ２Ｄ　ｘ　６の尾静脈に複合体をｉｖ、注射して特定の複合体の最 大許容投与量を決定した０これらの結果に基いて、腫瘍担持マウスに複合体を投 与するだめの投与量方法を選択した。腫瘍担持マウス群及び対照マウス群に、前 記選択された投与量・方法に従って複合体を注射した。動物反応、副作用、及び 死亡率を、腫瘍体積及び動物体重の測定と共に毎日モニターした。試、験期間の 終９における腫瘍体積の変化を、試験期間にわたる測定の全体の平均に基いて算 出した。これらの試験の結果を下記の第６表に報告する。

抗体親和性及び抗原濃度 請求の範囲に記載されている抗体の幾つかをヨード化し、そしてＭＣＦ−７又は ＢＴ−２０細胞への結合について試験した。抗体をクロラミンＴを用いて　Ｉに より約１０μＣ４／μｇの比活性にラベルした。免疫放射化学的純度を決定する ため、０．５　ｆｒｄ！のウシ胎児血清中１００，０００　ｃ　ｐｍの２種類の ラベル化抗体を標的細胞の５つのアリコートに０℃にて１５分間順次吸着せしめ （一般にアリコート当り４，０００，０００　ＭＣＦ−７乳癌細胞）、そして各 吸着後の上溝液中の残りの放射能を測定した。

会合定数を測定するため、既知濃度のラベル化及び非ラベル化モノクローナル抗 体をウシ胎児血清中標的細胞と共に水中で１５分間インキュベートした。

次に、細胞／抗体混合物のアリコートをガンマ−カウンター中で計数し、又はミ クロ７オルドフイルタープレー）（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック）を通して炉遇 しそしてそのフィルターをカウントした。フィルター上の液中に残留する未結合 抗体を考慮するため、同じ濃度の抗体を含有するがしかし細胞を含゛有しない対 照を並行して処理した。会合定数及び標的当たりの抗原コピー数を、親和性試験 結果から計算し、そして下記の第７表に報告する。

第７表 ２Ｇ３　３．７ｅ６　９．１ｅ６　３．４ｅ１３１１３Ｆ１　２．３ｅ６　１． １ｇ９　２．５ｅ１５２６０Ｆ９　３．１ｅ５　５．６ｅ７　１．７ｅ１３２６ ６Ｂ２　８．Ｏｅ４　２．７ｅ８　２．２ｅ１３２８０Ｄ１１　３．９ｅ５　８ ．８ｅ６　３．４ｅ１２３１７Ｇ５　３．２ｅ６　１．６ｅ６　５．１ｅ１２４ ５２Ｆ２　２．５ｅ５　６．８ｅ６　１．７ｅ１２４５４Ｃ１１３，９ｅ５　４ ．８ｅ７　１．９ｅ１３５２０Ｃ９５，Ｏｅ５　８．２ｇ６　４．１ｅ１２ｎ　 ＝　ＭＣＦ−７細胞当シ抗原コピー数；Ｋａ　＝　ＭＣＦ−７に対する会合定数 、。

ｎＫａはｎとＫａとの積であシ、そして細胞当シ結合抗体に対する抗体濃度に関 連する。

抗体に対する免疫沈澱試験は、それらの内の７つ（４５４Ｃ１１，４５２Ｆ２． ５２０Ｃ９，７３６Ｇ９．７４１Ｆ８．７５８Ｇ５　、及び７６１Ｂ１０　）は 癌性乳房組織に見出される共通の単量体の約２１０，０００ダルトン蛋白質に結 合することを示した。７種類の内の６種類（４５２Ｆ２．５２０Ｃ９，７３６Ｇ ９．７４１Ｆ８．７５８Ｇ５、及び７６１Ｂ１０）は２１０，０００グルトン蛋 白質上の同じエピトープを認識すると信じられる。相対的アフィニティー研究は 、これら６種類の内５２０Ｃ９が最高の会合定数を示すことを示した。

請求の範囲に記載されているモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのサ ンプルはアメリカン・タイプ・カルチエアー・コレク７ヨン（ＡＴＣＣ）　、　 １２３０１パークラウイドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２−１７ ７６　、米国に寄託された。２１０，０００グルトン蛋白質上の同じエビドーグ を認識する抗体を生産する６種のハイブリドーマの内５２０Ｃ９のみが寄託され た。寄託されなかった５種類は５２０Ｃ９と機能的に同等でちると考えられる。

これらのＡＴＣＣ受託番号及び寄託臼は次の通りである。

ハイブリドー−／４５’Ｃ体名称　寄託臼　受託番号２６０Ｆ９　１９８４年１ 月２７日　Ｈ８８４８８１１３Ｆ１　１９８４年１月２７日　）ＩＢ　８４９０ ２Ｇ３　１９８４年１月２７日　ＨＢ　８４９１２８０Ｄ１１　１９８４年１月 ２７日　ＨＢ　８４８７２６６Ｂ２　１９８４年１月２７日　ＨＢ　８４８６２ ４５Ｅ７　１９８４年１月２７日　ＨＢ　８４８９４５４Ｃ１１１９８４年１月 ２７日　ＨＢ　８４８４３３Ｆ８　１９８５年１月９日 ３１７Ｇ５　１９８４年１月２７日　ＨＢ　８４８５５２０Ｃ９１９８５年１月 ８日 ３６９Ｆ１０　１９８４年１２月１３日　ＨＢ　８６８２＊２６０Ｆ９−ＩＣ９ １９８４年１１月７日　ＨＢ　８６６２３１７Ｇ５　（ＣＴＣＣ００５５）　１ ．９８’４年１２月２８日　ＨＢ　８６９１７８８Ｇ６　（ＣＴＣＣ００５６） 　１９８４年１２月２８日　ＨＢ　８６９２＊このクローンは２６０Ｆ９の子孫 であり、そして２６０Ｆ９よシ良好な抗体生産株であることが見出された。

これらの寄託はブタ被スト条約のもとで行われたものであり、そしてその規定に 従って維持され他人に対して接近可能にされる。

手　続　補　正　書 唱和６１年２月ＩＳ日 特許庁長官　宇　負　這　部　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８５１００１１４号 ２、発明の名称 モノクローナル抗−ヒト乳癌抗体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都曖区虎ノ門−丁目８査１０号５、補正の対象 ｉｌｌ明細書 １２）請求の範囲 ６、補正の内容 （１）■　明糺書第３９頁下から２行目の受託番号の空欄（３３Ｆ８の受託番号 ）にｒＨＢ８６９７Ｊを加入する。

■　明細書第４０頁第１行目の受託番号の空欄（５２０Ｃ９の受託番号）にｒＨ Ｂ８６９６Ｊを加入する。

（２）請求の範囲を別紙の通りに補正する。

７、添付書類の目録 （１１補正請求の範囲　１通 （２１ＡＴ　ＣＣ受託証の写し及びその抄訳　各６通請求の範囲 １、（ａ）　ヒト乳癌細胞に選択的に結合し；（ｂ）　Ｇ又はＭアイソタイプを 有し；そして（ｃ）　’）シンへ顔と複合蓮を形成した場合、ＭＣＦ−７、ＣＡ ＰｖＪＡ−１，５ＫＢＲ−３、又はＢ’ｒ−２０細胞の少なくとも１つに対して 約］　ＯｎＭ未満のＴＣＩＤ　５０チを示す； ことを特徴とするネズミモノクローナル抗体。

２、次の抗体： （ａ）　２６０　Ｆ　９　：　（ｇ）　２４５　Ｅ　７　：（ｂ）　１１３　Ｆ 　１　；　（ｈ）　４５４　Ｃ１１：（ｃ）　２　Ｇ　３　：　（ｉ）　３１７ 　Ｇ　５　：（ｄ）　２８０　Ｄ　１１　；　（ｊ）　５２０　Ｃ９：又は（ｅ ）　２６６　Ｂ　２　：　（ｋ）　３６９　Ｆ　１０（ｆ）３３Ｆ８： の】つであることを幇叡とする謂氷の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。

３、＠Ｊ性乳房組織中に存在する約２１０，０００ダルトンの蛋白質に結合する ことを特徴とする請Ｘ（７）範囲第１項記妓のモノクローナル？ｉＪＥ。

４、検出可能なラベルによりラベルされていることを特徴とする請求の範囲第１ 項〜第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。

５−（ａ）　ヒト乳癌ａ１胞に選択的に結合し；（ｂ）　Ｇ又はＭアイソタイプ を有し；そして（ｃ）　ＩＪシンＡ鎖と複合体を形成した場合、ＭＣＦ−７、Ｃ ＡＭＡ−１，５ＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくとも１つに対して約１ ０　ｎＭ未満のＴＣＩＤ５０％を示す： ことを特徴とするネズミモノクローナル抗体を生産するネズミ×ネズミハイプリ ドーマ及びその子孫。

６、次の記号： （ａ）　２６０　Ｆ　９　：　（ｇ）　２４５　Ｅ　７　：（ｂＪ　１１３Ｆ１ ；　（ｈ）　４５４Ｃ１］：（ｃ）　２　Ｇ　３　：　（ｉＪ　３１７　Ｇ　５ 　：（ｄ）　２８０Ｄ］　１　：　（ｊ）　５２０Ｃ９：又は（ｅ）　２　６　 ６　Ｂ　２　：　（ｋ）　３　６　９　Ｆ　１　０（ｆ）３３Ｆ８： によりｓ４黴付けられる請求の遣巳囲第５項記載のノ１イプリドーマ及びその子 孫。

不の範囲稟５項記載のハイブリドーマ及びその子孫。

８、（ａ）　ヒト乳癌細胞に選択的に茫合し：（ｂ）　Ｇ又はＭアイソタイプを 有し；そして（ｃ）　ＩＪシンＡｎと複合体を形成した場合、ＭＣＦ　−７、Ｃ ＡＭＡ−１，５ＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくとも１つに対して約１ ０　ｎＭ禾満のＴＣＩＤ５０％を示す； ことを：Ｐ！ｆｅとするネズミモノクローナル抗体と、軸胞毒性成分との複合体 であるイムノトキシン。

９、（ａ＞　ヒト乳癌細胞に選択的に枯合し；（ｂ）　Ｇ又はＭアイソタイプを 有し：そして（（り　ｌｊシンＡｇと複合体を形成した場合、ＭＣＦ−７、ＣＡ ＭＡ−１，５ＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくとも１つに対して約］　 ＯｎＭ未満のＴＣＩＤ５０カを示す： ことを特徴とするネズミモノクローナル５．体と細竹表昭６１−５００７８９　 （１３） 胞貴性成分との複合体であるイムノトキシンの殺１０、（ａ）　ヒト乳遁細胞に 選択的に切合し；Ｃｂ）　Ｇ又はＭアイソタイプを有し；そして（ｅ）　１，１ シンＡ鉗と複合体を形成した場合、ＭＣＦ−７、ＣＡＭＡ−１，５ＫＢＲ−３、 又はＢＴ−２０細胞の少なくとも１つに対して約１０　ｎＭ未満のＴＣＩＤ　５ ０％を示す； ことをＷｅとするネズミモノクローナル抗体であって、検出可能な欅識によりラ ベルされているものと共にヒトーｋＢ胞をインキユベートシ、次にヒトａ胞上の ラベルされた二元免疫複合体の存在を検出することを特徴とする、ヒト細胞が乳 癌細胞であるか否かを診断する方法。

国　際　！ＩＩ　存　鰯　牛 一−＾−１１１ｓ、ｐ（τ／ＵＳ　８５１００１１４−２−１１１神！”ＩＩＩ ＩＩＲＩ−嗜ムｍＮｒａ電Ｉ嘲−−１旬Ｐｅ／ｌｌｓ！ｌ５１００！１４Ａ、Ｎ ＮＥＸ　Ｔｏ　ＴｈＥＩＮＴＥＲ）ＩＡτ工０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣ：（：ｔＥ？ ＯＲτＯＮ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）ヒト乳癌細胞に選択的に結合し；（ｂ）Ｇ又はＭアイソタイプを有し ；そして（ｃ）リシンＡ鎖と複合体を形成した場合、ＭＣＦ−７、ＣＡＭＡ−１ 、ＳＫＢＲ−３、又はＢＴ−２０細胞の少なくとも１つに対して約１０ｎＭ未満 のＴＣＩＤ５０％を示す；ことを特徴とするネズミモノクローナル抗体。
2. ２．次の抗体： （ａ）２６０Ｆ９； （ｂ）１１３Ｆ１； （ｃ）２Ｇ３； （ｄ）２８０Ｄ１１； （ｅ）２６６Ｂ２； （ｆ）３３Ｆ８； （ｇ）２４５Ｅ７； （ｈ）４５４Ｃ１１； （ｉ）３１７Ｇ５： （ｊ）５２０Ｃ９；又は （ｋ）３６９Ｆｌ０ の１つであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
3. ３．癌性乳房組織中に存在する約２１０，０００ダルトンの蛋白質に結合するこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
4. ４．請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体を生産することを特徴とする ネズミ×ネズミ・ハイプリドーマ、及びこのハイプリドーマの子孫。
5. ５．次の同定： （ａ）２６０Ｆ９； （ｂ）１１３Ｆ１； （ｃ）２Ｇ３； （ｄ）２８０Ｄ１１； （ｅ）２６６Ｂ２； （ｆ）３３Ｆ８； （ｇ）２４５Ｅ７； （ｈ）４５４Ｃ１１； （ｉ）３１７Ｇ５； （ｊ）５２０Ｃ９；又は （ｋ）３６９Ｆｌ０ により特徴付けられるハイプリド−マ及びその子孫。
6. ６．請求の範囲第３項に記載のモノクローナル抗体を生産するネズミＸネズミ・ ハイプリドーマ、又は該ハイプリドーマの子孫。
7. ７．請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体と細胞毒性成分との複合体であ ることを特徴とするイムノトキシン。
8. ８．検出可能なラペルによりラペルされていることを特徴とする請求の範囲第１ 項〜第３項のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
9. ９．細胞を請求の範囲第７項に記載のイムノトキシンの殺細胞的有効量と接触せ しめることを特徴とするヒト乳癌細胞を殺す方法。
10. １０．（ａ）ヒト細胞を請求の範囲第８項に記載の抗体と共にインキュベートし ；そして （ｂ）ヒト細胞上のラベルされた二元免疫複合体の存在を検出する； ことを特徴とする、ヒト細胞が乳癌細胞であるか否かを診断する方法。