JPS62209098A - 抗−ヒト卵巣癌免疫毒素及びその使用方法 - Google Patents

抗−ヒト卵巣癌免疫毒素及びその使用方法

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JPS62209098A
JPS62209098A JP61289791A JP28979186A JPS62209098A JP S62209098 A JPS62209098 A JP S62209098A JP 61289791 A JP61289791 A JP 61289791A JP 28979186 A JP28979186 A JP 28979186A JP S62209098 A JPS62209098 A JP S62209098A
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human ovarian
ovarian cancer
mammal
cells
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マイケル　ジョン　ブヨルン
デイビッド　バラット　リング
アーサー　エドワード　フランケル
ジェフリー　リー　ウィンケルハイク
ウォルター　ジョージフ　レアード
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫学及び癌診断法並びに治療法の分野に関
する。さらに詳しくは、それは、ヒト卵巣癌に対して活
性のネズミモノクローナル抗体、これらの抗体を産生ず
るハイブリドマ、これらの抗体から製造される免疫化学
物質及びこれらの免疫化学物質を使用する治療方法に関
する。
以下余白 〔従来の技術〕 アメリカ人女性に存在する婦人科学的な悪性腫の中では
、卵巣癌が最っとも頻繁に死を引き起こす。その悪性腫
は、実質的にその全体の臨床経過の間、ＩＩＩ膜腔内腔
内続する。特徴として、その腫瘍は、複数のｌｌ！膜表
面上に腹水病巣又は腫瘍病巣を生みながら、腹膜腔じゆ
うに広がる。その疾患は、手術によって効果的に治癒さ
れ得づ、その結果、ますます化学療法が主要な治療とな
り得る。
卵巣の腫瘍は、一般的に、腹膜腔内に存続するので、化
学療法薬が、静脈注射又は腹膜腔中への直接的注入によ
って全身に投与され、従って化学療法薬への腫瘍の初め
の接触のためのルートとして循環系を避けることができ
る。
癌性卵巣組織に関連する抗原に対するモノクローナル抗
体の使用が、限定された範囲のみで報告されて来た。プ
ソイドモナスの外毒素に結合されるヒトトランスフェリ
ン受容体に対する抗体は、あるヒト卵巣細胞系において
細胞毒性活性を有することが報告されている（Ｐｉｒｋ
ｃｒなど０．“プソイドモナスの外毒素に結合される抗
−トランスフェリン受容体抗体；ヒト卵巣癌細胞系にお
ける典型的な免疫毒素”　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　
４５ニア５１〜７５７（１９８５））。
トランスフェリン受容体へのトランスフェリンの結合を
阻害する抗−トランスフェリンモノクローナル抗体は、
アメリカ特許第４，４３４．１５６号の主題である。本
発明の抗−トランスフェリンモノクローナル抗体は、ア
メリカ特許第４，４３４．１５６号に開示されている抗
体とは異なる。本発明の抗−トランスフェリン抗体は、
トランスフェリン受容体を結合するが、それは、トラン
スフェリン受容体へのトランスフェリンの結合を阻害し
ない。Ｓｃｈ　ｌｏｍなど、、アメリカ特許第４．５２
２，９１８号は、ヒト乳癌の可溶性抽出物を用いて、あ
るヒト乳癌腫瘍に対するモノクローナル抗体の産生方法
を開示する。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明の主な観点は、 （ａ）ヒト卵巣癌組織の冷凍断片 を結合し； （ｂ）ＩｇＧ又はＩｇＭであり； （Ｃ）細胞毒性成分に結合される場合、ＯＶＣＡＲ−２
、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、０ＶＣＡＩＩ！−
５又はＡ　１８４７から成る群から選択された、少なく
とも１つの卵巣癌細胞系に対して１０ｎＭ又はそれより
も低いＩＤＳ。を有し：又は 細胞毒性成分に結合される場合、 ヒト卵巣腫瘍を担持する哺乳類の生存時間を延ばし；又
は細胞毒性タンパク質に結合される場合、そのような哺
乳類によって担持されるヒト卵巣腫瘍の増殖の速度をお
そめるネズミのモノクローナル抗体に関する。
これらの抗体の好ましい態様は、２Ｇ３．９Ｃ６，３３
Ｆ８゜４４Ｂ２．４４Ｆ４　、１２０１１７．２００Ｆ
９．２０４１２４．２１９Ｆ３．２４５Ｅ７　、２６０
Ｉ’９゜２６６Ｂ２．２８００１１　、３１７Ｇ５．３
６９Ｆ　１０．３８８Ｄ４．４２１　［８、４５１Ｃ３
゜４５４Ａ１２．４５４Ｃ１１、６５０［ｕ２．７８８
Ｇ６．８７１Ｅ３と呼ばれる抗体及びそれらと機能的に
等しい抗体である。
上記抗体を産生ずる、ネズミ×ネズミのハイブリドーマ
及びこれらのハイブリドーマの子孫は、本発明の他の観
点である。
本発明のもう１つの観点は、 （ａ）上記モノクローナル抗体、及び （ｂ）細胞毒性成分の接合体である 免疫毒素に関する。
本発明のもう１つの観点は、ヒト卵巣腫瘍細胞を担持す
る哺乳類の生存時間を延ばすために有効な量の上記免疫
毒素をそのような哺乳類に投与することによって、その
ような哺乳類の生存時間を延ばす方法に関する。
さらに本発明のもう１つの観点は、細胞を殺すのに有効
な量の上記免疫毒素とヒト卵巣腫瘍細胞とを接触するこ
とによってそのような細胞を殺す方法に関する。
さらに本発明の観点は、上記免疫毒素の肺癌細胞増殖遅
延量をそのような哺乳類に投与することによって、その
ような哺乳類によって担持されるヒト卵巣腫瘍細胞の増
殖速度をおそめる方法に関する。
本明細書に使用される場合、用語“モノクローナル抗体
”は、均質な抗体集団を有する抗体組成物を意味する。
抗体の源又はそれが製造される方法に関して、制限され
ることは意図されていない。
本明細書に使用される場合、用語“モノクローナル抗体
の抗原結合部分”は、モノクローナル抗体が特異的であ
る抗原を結合するモノクローナル抗体の部分を意味する
。一般的に、モノクローナル抗体の抗原結合部分は、Ｆ
ａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）ｚｎＪｌ域又は免疫グ
ロブリン分子のフラグメントを含む。免疫グロブリンの
Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）ｚ領域は、当業者に
良（知られている技法を用いて、モノクローナル抗体の
酵素による消化によって生成され得る。Ｆａｂフラグメ
ントは、パパインによるそのモノクローナル抗体の消化
及びジスルフィド結合を還元的に分離するために還元剤
と前記消化物とを接触することによって生成され得る。
Ｆａｂ’フラグメントは、ペプシンによるモノクローナ
ル抗体の消化及びそのようにして生成されたフラグメン
トの還元剤による還元的分離によって得られる。還元的
分離の不在においては、ペプシンによるモノクローナル
抗体の酵素的消化がＦ（ａｂ’）ｚフラグメントを生成
する。
本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマに関し
て本明細書に使用される場合、用語“子孫（ｐｒｏｇｅ
ｎｙ）”は、世代又は核型の同一性にもかかわらず、親
によって産生されるモノクローナル抗−ヒト卵巣癌抗体
を産生ずる親ハイブリドーマのすべての誘導体、子及び
子孫を含むように思われる。
ヒト卵巣癌に対する例示されたネズミのモノクローナル
抗体に関して、本明細書に使用される場合、用語“機能
的同等物”とは辞）免疫沈殿法又はサンドウィッチアッ
セイによって決定されるように、例示されたモノクロー
ナル抗体と同じ抗原又はエピトープに結合し；　（ｂ）
ヒト卵巣癌組織の冷凍断片を結合し；　　（Ｃ）　０．
１１又はそれよりも低い選択性を有し；　　（ｄ）Ｇ又
はＭイソタイプを有し；そして（ｅ）細胞毒性成分に接
合される場合、（ｉ）ヒト卵巣癌細胞を担持する哺乳類
に投与される場合、そのような哺乳類の生存時間を延ば
し、又は（ｉｉ）そのような細胞を担持する哺乳類に投
与される場合、そのような哺乳類中にヒト卵巣癌細胞の
増殖をおさえ又は（ｉｉｉ　）そのような細胞が免疫毒
素と接触される場合、ヒト卵巣癌細胞に対して細胞毒性
である免疫毒素を形成するモノクローナル抗体を意味す
る。
本明細書に使用される場合、上記のような用語“機能的
同等物”とは、５種の基準を含む。例示されたモノクロ
ーナル抗体と同じ抗原又はエピトープに結合する、第１
番目のこれらの基準は、機能的に等しいモノクローナル
抗体によって、例示されたモノクローナル抗体のクロス
ブロックを示す実験によって実証され得る。クロスブロ
ックは、例示された抗体の１つによって結合されるのと
同じ抗原上のエピトープに結合する抗体の結果として、
又は１つのエピトープへの抗体の結合が２番目のエピト
ープへの抗体の結合を妨げる、同じ抗原上にひじょうに
接近して位置する異なったエピトープに結合する抗体の
結果として生じる。
いわゆる“サンドインチ”アッセイとは、抗体が同じ抗
原又はエピトープを結合するかいづれかを決定するため
のもう１つの方法である。これらのアッセイにおいては
、第１モノクローナル抗体が支持体、たとえば力価プレ
ートウェルの表面に結合される。非特異的な結合を妨げ
るための処置の後、ひじょうに可溶化された抗原調製物
を、その結合抗体に添加する。次に、検出可能なラベル
を有する第２抗体、たとえば螢光色素を添加する。
第２抗体がその抗原に結合する場合、異なったエピトー
プ特異性又は同じ抗原上に複数コピイの同じエピトープ
が示される。第２抗体が結合しない場合、同じエピトー
プ特異性又は異なった抗原特異性のいづれかが示される
。クロスブロッキング及びサンドイッチアッセイの両者
の結果は、両面体によって結合される抗原が同じ分子量
を存することを示すために、第２シリーズの試験、たと
えば免疫沈殿法又はウェスターン法によってさらに定義
される。
本発明の免疫毒素は、モノクローナル抗体の接合体及び
細胞毒性成分である。免疫毒素の細胞毒性成分は、細胞
毒性薬物又は細菌；カビ又は植物起源の酵素的に活性の
毒素もしくは酵素的に活性のポリペプチド鎖又はそのよ
うな毒素のフラグメン）（”Ａ鎖）である。酵素的に活
性の毒素及びそのフラグメントが好ましく、そしてジフ
テリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合活
性フラグメント、外毒素Ａ〔プソイドモナスアエルギノ
サ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ）
からの〕。
リシンＡＩＸ、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−アル
シン、あるアレウリトス　フォリン（＾１ｅｕｒｉｔｅ
ｓｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、あるジアンチン　タンパ
ク質、フィトラカ　アメリカナ（ハ■虹匹憇ａｍｅｒｉ
ｃａｎａ）　タンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＩ’　［１及び
ＰＡＰ−３）、モモルジカ　カランチア（Ｍｏｍｏｒｄ
ｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ　）阻害剤、クラシン、ク
ロチン、サボナリア　オフィシナリス（ｉ汀１桟上υ土
崩−）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシ
ン、フェノマイシン及びエノマイシンによって例示され
る。
リジンＡｌｆｆ、ブソイドモナスアエルギノサの外毒素
Ａ及びＰＡＰが好ましい。
モノクローナル抗体及びそのような細胞毒性成分の接合
体は、種々の二官能価タンパク譬カップリング剤の使用
により製造され得る。そのような試薬の例は、Ｎ−スク
シンイミディル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレーン（ＩＴ）、イミ
ドエステルの二官能価誘導体、たとえばジメチル　アシ
ビミデート・１１ＣＡ’、活性エステル、たとえばジス
クシンイミジル　スベレート、アルデヒド、たとえばグ
ルタアールデヒド、ビス−アジド化合物、たとえばビス
（旦−ジアゾニアムベンゾイル）−エチレンジアミン、
ジイソシアネート、たとえばトリレン２゜６−ジイソシ
アネート及びビス−活性弗素化合物、たとえば１．５−
ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンである。
本発明の免疫毒素の酵素的活性のポリペプチドは、組換
により生成され得る。組換的に産生されたりシン毒素Ａ
鎖（ｒＲＴＡ）は、１９８５年８月１５０に公表された
ＰＣＴ　ＷＯ３５１０３５０８に開示された方法に従っ
て産生され得る。組換的に産生されたジフテリア毒素Ａ
鎖及びその非結合性活性フラグメントもまた、１９８５
年８月１５日に公表されたＰＣＴ　ＷＯ３５１０３５０
Ｂに記載されている。
診断目的のためにイン　ビトロでヒト卵巣癌Ｈ胞を殺す
ために用いられる場合、その接合体は、典型的に、少な
くとも約１０ｎＨの濃度で細胞培養培地に添加されるで
あろう。−（７ビトロ使用のための投与の処方及び態様
は、臨界的でない。培養物又は潅流培地と相客する水性
配合物が通常、使用されるであろう。細胞毒性は、従来
技術、たとえば色素排除又はクローン遺伝アッセイにお
けるコロニイ形成の抑制によって読取られ、対象の免疫
毒素による処置に対して影響されやすい卵巣癌腫瘍の存
在を決定することができる。
治療のために４ｙｅ；Ｈに使用される場合、その免疫毒
素は、治療上有効量（すなわち、患者の腫瘍の悩みを除
去又は減じもしくは妨害する■）で患者に投与される。
それらは通常、非経口的に、好ましくは腹膜内（Ｉ　Ｐ
）に投与されるであろう。
その投与量及び投与法は、癌（原発性又は転移性）及び
その集団の性質、特定の免疫毒素の特徴、たとえばその
治療指数、患者及び患者の病歴に依存するであろう。投
与される免疫毒素のｆｆ１（ＩＰ）は、典型的には、患
者の体重当り約０．０１〜約１００■及び好ましくは０
．０１■〜１０■の範囲であろう。
非経口投与のためには、免疫毒素は、医薬的に許容可能
な非経口ビークルと共に注入可能なユニット剤形（溶液
、懸濁液、エマルジョン）で製剤されるであろう。その
ようなビークルは、本質的に非毒性且つ非治療性である
。そのようなビークルの例は、水、生理的食塩水、リン
ガ−溶液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブ
ミンである。非水性ビークル、たとえば固定油及びエチ
ルオレエートがまた使用され得る。リポソームが担体と
して使用され得る。ビークルは、少量の添加物、たとえ
ば等偏性及び化学的安定性を増強する物質、たとえば緩
衝液及び防腐剤を含むことができる。その免疫毒素は、
典型的には、約０．０１■７ｍ１２〜１００■／ｍｌの
濃度でそのようなビークル中に配合されるであろう。
卵巣癌を治療するための細胞毒性放射性薬品は、抗体に
アイソトープ（たとえばＹ、Ｐｒ）を放射する高い線エ
ネルギー付与（ＬＥＴ）を活用することによって製造さ
れ得る。本明細書に使用される用語“細胞毒性成分”は
、そのようなアイソトープを含むであろう。
本発明のハイブリドーマを製造するために使用される抗
体産生融合パートナ−は、生きているヒト乳癌細胞又は
それらから製造された内袖出物によりマウスを免疫化す
ることによって生成される。
そのマウスは、免疫原性量の細胞又は抽出物により腹膜
内に接種され、そして次に、同じ量の免疫原により追加
免疫される。最終追加免疫の後、数日後、免疫化された
マウスから肺臓を集め、そして融合に使用するために細
胞懸濁液をそれらから調製する＊　Ｂｕｃｋ、Ｄ、Ｗ、
、など、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ（１９Ｂ２）１８　：３７７
〜３８１によって変形されたようなＫｏｈｌｅｒ、８、
ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ（１９
７５）　２５６　：　　４９５〜４９７の一般的な体細
胞ハイブリダイゼーション技法を用いて、肺臓細胞及び
ネズミ腫瘍パートナ−から、ハイブリドーマを調製する
。５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。
Ｃｅ１ｌ　　Ｄｉｓｔｒｉｂａｔｉｏｎ　　Ｃｅｎｔｅ
ｒ、Ｓａｎ　　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。
ｔｌｓＡから人手できるネズミ骨ＷＪｌｌｆｆｉ系を、
このハイブリダイゼーションに使用することができる。
基本的に、この技法は、フソゲン、たとえばポリエチレ
ングリコールを用いて、その腫瘍細胞及び肺臓細胞を融
合することを含む。融合の後、細胞は、融合培地から分
離され、そして選択増殖培地、たとえばＨＡ　Ｔ培地中
で増殖され、ハイブリッド形成しなかった親細胞を除去
する。所望により、そのハイブリドーマを、拡張し、そ
して上清液を、抗原として免疫化剤（乳癌細胞又は内袖
出物）を用いて、従来のイムノアッセイ法（たとえば、
ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ又は螢光イ
ムノアッセイ）によって、抗−ヒト乳癌活性について分
析する。陽性クローンが本発明の抗体の基準に適合する
かいづれかを決定するために、さらにそれを特徴づける
。
そのような抗体を産生ずるハイブリドーマは、既知方法
を使用して、イン　ビトロ又はイン　ビ±で増殖され得
る。好ましくは、そのハイブリド−マは、マウス中の腹
水として維持される。そのモノクローナル抗体は、培養
培地又は体液から、場合によっては、従来の免疫グロブ
リン精製法、たとえば硫酸アンモニウム沈殿法、ゲル電
気泳動法、透析法、クロマトグラフィ法及び所望により
限外濾過法によって単離され得る。
モノクローナル抗体の重要な特徴は、（１）それらの免
疫グロブリンクラス、（２）ヒト卵巣癌Ｕ織を結合する
それらの能力、（３）さらに下記に定義されるようなそ
れらの選択性、すなわち（４）ヒト卵巣癌細胞に対して
細胞毒性であり、又はヒト卵巣癌細胞を担持する哺乳類
の生存時間を延ばし、もしくはそのような細胞を担持す
る動物においてヒト卵巣癌細胞の増殖を妨げる、有効な
抗−ヒト卵巣癌免疫毒素を生成することにおけるそれら
の有用性である。本発明の免疫毒素として適切なモノク
ローナル抗体は、最初に、抗−乳癌モノクローナル抗体
の群内のモノクローナル抗体として定義された。
特許請求された抗体を選択することにおいて、およそ２
２．０００の増殖性ハイプリドーマ培養物が、最初に、
免疫性乳腫腸内又は細胞系、７種の正常な組織膜のパネ
ル、繊維芽細胞系及び乳腫瘍冷凍断片に対してスクリー
ンされた。腫瘍物質と反応するが、しかし正常な物質と
は反応しないクローンを、この最初のスクリーンにおい
て同定し、そしてイソタイプについて選択し、そして選
択性及び種類についてさらにスクリーンした。この追加
のスクリーニングは、１６個の正常なＭｉ織断片、５個
の血液細胞型、１１個の非礼腫瘍断片、２１個の乳癌断
片及び１４個の乳癌細胞系を含んだ。
この追加スクリーニングにおいては、多数のモノクロー
ナル抗体が、卵巣癌の組織断片に結合するが、しかし正
常な卵巣組織断片には結合しないように思われた。
この特許の目的のためには、適用、特異性及び選択性が
、交換可能的に使用され、そしてすべての組織（ことで
、モノクローナル抗体が試験さた）において、いづれか
のモノクローナル抗体によって結合された剛構造体（ｓ
ｕｂｓ　ｔｒｕｃ　ｔｕｒ’ｅ）の合計数及び試験され
た５個の血液細胞型の数の総数によって割られた、１６
個の正常組織の冷凍断片における染色された剛構造体の
数及び結合した血液細胞型の数の総数として定義される
。１２３個の剛構造体及び５個の血液細胞型がこの試験
において計数された。抗体は、それらが０．１１か又は
それよりも低い選択性を有し、そしてヒト卵巣癌組織に
結合される場合、卵巣癌免疫毒素の目的のための適切な
候補体であると見なされた。
１つのハイブリドーマによって産生された抗体は、２０
０にドルトンの抗原を認識することが見出された。２種
のハイプリドーマからの抗体が、４２にドルトンの抗原
に結合した。４種のハイブリドーマからの抗体が１又は
？ｌの高分子量ムチン（ＩＩＭＷ）に結合し、そして２
種のハイブリドーマからの抗体が９５にドルトンの抗原
の形でのトランスフェリン受容体に結合した。２種のハ
イブリドーマからの抗体が５５にドルトンの抗原の同じ
エピトープに結合した。前記のすべての抗原の分子量は
、当業界において知られている方法を用いて、還元状態
下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって決定された。
これらの抗体のさらに詳しい特徴は、下の例に提供され
ている。
最も重要である本発明の免疫化学的誘導体は、モノクロ
ーナル抗体及び細胞毒性剤の接合体である。
手術後の新鮮なヒト乳癌組織及び種々の正常な組織を用
いて、ホモジナイゼーション及び不連続スクロースグラ
ジェント遠心分離によって内袖出物を調製した。ヒト乳
癌細胞系を、Ｂｒｅａｓｔ　ＣａｎｃｅｒＴａｓｋ　Ｆ
ｏｒｃｅ、　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）及び
Ｄｒ、Ｊｏｒｇｅｎ　Ｆｏｇｈ　ａｔ　Ｍｅｍｏｒｉａ
ｌ　ＳｌｏａｎＫｅｔｔｅｒｉｎｇから得た。その細胞
を、Ｂｒｅａｓｔ　ＣａｎｃｅｒＴａｓｋ　’Ｆｏｒｃ
ｅ、　ｔｈｅ　ＡＴＣＣ及びＯｒ、Ｆｏｇｈによって推
薦されるようにして保存し、そして運んだ。免疫化のた
めに、１００μｇのタンパク質を含む内袖出物（Ｌｏｗ
ｒｙアッセイ）又は１０００万の生きている乳癌細胞の
いづれかを、５週才のＢａ１ｔｂ／ｃマウス中の腹膜内
に接種した。そのマウスを、１力月間隔で２度同じよう
に追加免疫した。最後の追加免疫の後、３日後、細胞融
合のために肺臓を除去した。
体細胞ハイブリッドを、ネズミ骨髄腫系５ｐ−２７０ノ
八ｇ１４を用いて、Ｂｕｃｋ、　Ｄ、Ｗ、　、など、藍
、の方法によって調製した。すべてのハイブリドーマ細
胞系を、限界希釈法によってクローン化した。マウスか
らの肺臓細胞を使用した融合体の半分を、乳癌膜抽出物
により免疫化し、そしてマウスからの肺臓細胞を使用し
た半分を、生きている乳癌細胞系により免疫化した。８
３，４２４個のウェルを、これらの融合体から生成し、
そしてこのうち２２．４５９個がハイブリドーマの増殖
を示した。
ハイブリドーマ上清液を、免疫性乳癌細胞系物と共に固
相酵素結合のイムノソルベントアッセイ（［１ＬＩＳＡ
）又は免疫性乳癌細胞系と共に間接的な免疫蛍光アッセ
イのいづれかで反応性抗体について分析した。固相膜Ｅ
ＬＩＳＡのためには、Ｏ９１■／ｒｒｌ乳癌膜タンパク
質４０μｌを、４℃で１２時間、塩化ポリビニル（Ｐ　
Ｖ　Ｃ）微量力価ウェル中に置いた。抽出物を吸出し、
そしてそのウェルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）により洗浄した。次
にそのウェルを、ハイブリドーマ上清液の１＝１０希釈
溶液４５μｅと共にインキュへ−１−シた。希釈剤は、
２５ｍＭ緩衝液、１０％ウシ血清及び０．１９％アジ化
ナトリウムを含む培地であった。室温で３０分後、その
ウェルを再び洗浄し、そして３７℃で４５分間、ペルオ
キシダーゼ接合のヤギ抗−マウスＩｇＧの１：２００希
釈溶液と共にインキニベートシた。
その希釈剤はＰＢＳであった。次に、そのウェルを、Ｐ
ＢＳにより洗浄し、そして室温で３０分間、ｐＨ４，２
の０．１　Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液中１゜２−アジ
ノージ（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）２０
０μｐと共に反応せしめた。光学密度を、Ｍｉｃｒｏ　
Ｅｌｉｓａ　Ｒｅａｄｅｒにより４０５ｎｍで測定した
。
おのおのの実験のために、陽性対照、すなわち５μｇ／
ｍｌでの抗−β−２ミクログロブリンを、正常なヒト腎
臓膜と共に反応せしめた。これは、１．０±０．１（標
準偏差）の光学密度を与えた。マウスモノクローナル抗
体を含まない培地を用いてのパックグラウンドは、Ｏ±
０．１の光密度ユニット（０，０，）であった。０．７
０．０．よりも大きな乳癌膜抽出物に基づく反応を与え
るウェルを、貯蔵した。
間接的免疫蛍光細胞系アッセイのためには、免疫性細胞
系の１００，０００個の乳癌細胞を、８チヤンバースラ
イドのセットのそれぞれのチャンバー中に゛、適切な培
地と共に１晩置いた。同様に、細胞系ＣＣ９５からの１
００，０００個の繊維芽細胞を、チャンバースライドウ
ェル中に１晩、インキニーベートした。その細胞を、１
％ＢＳＡを含むＰＢＳにより洗浄した。乳癌細胞及び繊
維芽細胞の両者のウェルを、ハイブリドーマ上清液の１
：１０希釈溶液と共に４°Ｃで３０分間、インキュベー
トした。
その細胞を、再び洗浄し、そしてフルオレセインイソチ
オシアネート（ＰＩＴＣ）−接合のヤギＦ（ａｂ’）ｚ
坑−マウスＩｇの１；５０希釈溶液と共に、４℃で３０
分間、インキュベートした。その細胞を、３度洗浄し、
ＰＢＳ中１．５％ホルムアルデヒド中で５分間、固定し
、チャンバーを除去しそしてＰＢＳ中でゆすいだ。次に
、そのスライドを、ポリビニルアルコール、グリセロー
ル、緩衝液及ヒ保存剤を含む組成物中に固定し、そして
螢光顕微鏡により試験した。乳癌細胞に対して強い螢光
結合性を示すが、但し繊維芽細胞に対して螢光結合性を
示さないハイブリドーマウェルを、貯蔵した。
５．１５６個のハイブリドーマウェルが、最初のスクリ
ーンにおいて乳癌反応性を示した。
次に、５１５６個の陽性ウェルからの上清液を、７種の
正常組織の内袖出物（肝臓、肺、結腸、胃、腎臓、扁桃
腺及び肺臓）と共に固相［ＥＬＩＳＡで試験した。０．
３よりも大きなＨＬＩＳＡ　Ｏ，０，を与えるすべての
上清液を、措てた。１１０１の上清液が、正常なＭｉ織
抽出物と反応しないことが見出された。
その１１０１個のハイブリドーマ上精液を、ヒト乳癌組
織の冷凍断片に対して試験した。６ミクロンの断片をス
ライドにはり付け、４℃で１０分間、アセトン中で固定
し、室温で１０分間、乾燥せしめ、ＰＢＳにより洗浄し
、ウマ血清によりブロックしそして１００μｌのウシハ
イブリドーマ上清液と共に室温で２０分間、インキュベ
ートした。そのスライドを、ＰＢＳにより洗浄し、そし
て最後に、ペルオキシダーゼ接合のウサギ抗−マウスＩ
ｇの１：５０希釈溶液と共に３７℃で２０分間、インキ
ュベートし、再びＰＢＳにより洗浄しそして最後に、０
．０１％過酸化水素を含む、ρ１１７．２の０．０５Ｍ
　Ｔｒｉｓ　Ｉｌｌｌｌ中０．５ｍｇ／ｍｌジアミノベ
ンジジンと共に３７°Ｃで７．５分間、インキュベート
した。そのスライドを、ヘマトキシリンにより染色し、
脱水しそして３５６９％メチル／ｎ−ブチルメタクリレ
ートコポリマー、７．１％ブチルベンジルフタレート及
び０．３％２，６−ジタートゲチル−ｐ−クレゾールを
含む培地中に固定した。１２４のウェルが乳癌選択結合
性を与え、そしてクローン化された。
モノクローナル乳癌選択抗体の免疫グロブリンクラス及
びサブクランを、ＭｃＤｏｕｇａ　ｌなど、ム１＋＊ｍ
ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、　　６３　：　　２Ｂ１〜２９
０（１９８３）において記載されたものと実質的に同じ
イムノドツトアッセイによって決定した。抗体をまた、
０．２μＣｉの３ＳＳ−メチオニンを含むメチオニン不
含培地中で２〜３Ｘ１０′′個のハイブリドーマ細胞を
、４時間、増殖することによって内部的にラベルした。
ｆｆ５３−ラメルされた抗体を、固定されたブドウ球菌
Ａ細胞又はウサギ抗−マウス免疫グロブリンにより持前
に被覆された、固定されたブドウ球菌Ａ細胞により免疫
沈殿化し、そしてその免疫沈殿物を、ＳＯＳ　−ＰＡＧ
Ｅによって分析し、抗体のし及びＨ鎖の移動度、余分な
鎖の欠乏及びブドウ球菌のプロティンＡを結合するおの
おのの抗体の能力を決定した。
その抗体を、イン　ビボ中で拡張した。Ｂａｊ２　ｂ／
ｃ又はＦ　１　　（Ｃ５７Ｂ／６ｘＢａｌｂ／ｃ）マウ
スを、０．５ｍｌ１のブリスタンにより腹膜内（ｉ　ｐ
）で感作し、そして１０〜１４日後、ＰＢＳ中、百方の
対数増殖基のハイブリドーマ細胞により接種した。腹水
を一７０℃で貯蔵し、そして解凍し、そして０．８ミク
ロンのフィルターユニットを通して濾過し、そしてさら
に精製した。
ブドウ球菌のプロティンＡを結合したいくつかのＩｇＧ
抗体を、アガロース、デキストリン及び／又はアクリル
アミドを含むプロティンＡ−クロマトグラフィー樹脂上
でｐＨ段階グラジェント溶離によるアフィニテイクロマ
トグラフイーによって精製した。プロティンＡを結合し
なかったＩｇＧ抗倦は、０℃で４０％飽和状態への硫酸
アンモニウムの添加又はＤＥＡＥ又はＡｆｆｉｇｅｌ”
　（Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｓｏｎｄ。
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）に結合することによって沈殿さ
れた。
他方、ＩｇＧ抗体を、５ｅｐｔ＋ａｃｒｙｌ　Ｓ−２０
０カラム、次に記載したような口し八しセルロースを用
いてクロマトグラフィーによって精製した。その沈殿物
を、ＰＢＳ中に再を容解し、ｐＨ７，２の２０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓに透析しそして４℃で１ｒｒｌ／分の流速で１．
５１の０〜６００ｍＭのＮａＣｌグラジヱントにより溶
離するジエチルアミノエチルセルロース（０Ｅ＾Ｅ）の
１．６×５０ｃｍカラム上でクロマトグラフィー処理し
た。
おのおのの場合、カラム画分を、ＳＯ５−ＰＡＧＥによ
って調節し、そして最っとも純粋な抗体画分を、プール
し、１〜３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ＰＢＳｌｏ、０２％Ｎ
ａＮ３に対して透析しそして４℃で貯蔵した。
ＩｇＭ抗体を、室温で１ｍ１１分の流速でＰＢＳｌｏ、
０１％アジ化ナトリウムにより溶離する、５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌＳ−３００の２．６Ｘ４０ｃｅｅカラム又は他の
ゲル濾過もしくはアガロース、デキストリン及び／又は
アクリルアミドを含む樹脂上でゲル濾過材によって精製
した。
それらの選択性を評価するために、その精製された抗体
を、１６種の正常な組織の断片に対するイムノペルオキ
シダーゼ断片染色によって及び５種の血液細胞型に対す
る免疫螢光細胞選択によって精製した。イムノペルオキ
シダーゼ染色を、上記のようにして実施した。但し、１
〜４０μｇ／ｍｌの範囲で、ＰＢＳ中精製された抗体の
既知希釈溶液を、ハイブリドーマ上清液の代わりに使用
した。その純粋な抗体を、まず滴定し、乳癌断片に対し
て強いイムノペルオキシダーゼ染色を与える最少濃度を
見出し、そして次に正常な組織の試験のためにその濃度
で使用した。正常な卵巣組織は、検出できる結合性を示
さなかった。
末梢血液細胞（血小板、リンパ球、赤血球、顆粒球及び
単球）を、多形核白血球から単球を分離する培地を用い
て、遠心分離によって調製した。
その細胞を、４°Ｃで３０分間、上で決定された最適濃
度で抗体と反応せしめ、洗浄し、４℃で３０分間、フル
オレセインイソチオシアネート接合のヤギ抗−マウスＩ
ｇの１：５０希釈溶液と反応せしめ、再び洗浄しそして
細胞選別器により試験した。その洗浄緩衝液及び希釈剤
は、１％ゼラチン及び０．０２％アジ化ナトリウムを含
むＰＢＳであった。その細胞選別器は、７６ミクロンの
ノズル及び４８８ｎｍでＩＷのアルゴンイオンレーザ−
を備えている。８０ｍ−の共焦レンズを、焦点を合わす
ために光学レールアセンブリー上に使用した。使用され
る他のフィルターは、５１５ｎ論の干渉フィルター及び
５１５ｎｍの吸収フィルター（散乱されたレーザー光の
ための）並びに前方角度の光散乱（ｆｏｒｗａｒｄ　ａ
ｎｇｌｅ　１ｉｚｈｔ　５ｃａｔｔｅｒ）のためにニュ
トラルデンスイティ１．５フィルターであった。前方角
度の光散乱に対する対数フルオレセイン螢光の輪郭プロ
ットが、サンプル分析のために使用された。
本発明の免疫毒素において有用な抗体の、正常な組織断
片上での結合挙動が下の第１表に報告される。次の省略
形が抗体によって結合される構造体を示すために使用さ
れる：Ａｃ、腺房ｉ　Ｇ　ｌ腺；Ｔ、小管；Ｄ、管；Ｌ
、管腔；Ｗ、汗腺Ｉ　Ｅ　＋上皮；Ｓ、皮脂状腺；Ｇｒ
　、顆粒球；Ｍｒ　、巨核球；Ｍ、マクロファージ；Ｌ
ｙ、リンパ球ＨＢｚ、基底層；ｌ”ｅ、病巣上皮：Ａ、
アベオラ−（ａｖｅｏｌａｒ）内層細胞；Ｂ、ボーマン
ズ　カプセル；Ｍｕ、筋肉；Ｉ、島；Ｘ、ガングリア／
神経；Ｖ、血管；及びＨ１毛包。選択性は、前に記載し
たようにして定量化された。末梢血液細胞に対する抗体
の結合挙動は、第２表に報告される。そのモノクローナ
ル抗体の選択性は、第３表に示される。
以下ぢ、白 第ユ」し−表 １２Ｇ３　　　　０　　　０　　　　　　０　　　　　
　０　　　　　０２９Ｃ６０００００ ３３３Ｆ８　　　　０　　　０　　　　　　０　　　　
　　０　　　　　０４４４Ｂ２　　　　０　　　０　　
　　　　０　　　　　　０　　　　　０５４４Ｆ４　　
　　０　　　０　　　　　　０　　　　　　２　　　　
　０７２００Ｆ９０　　　０　　　　　　０　　　　　
　　０　　　　　０８２０４Ｆ４０　　　０　　　　　
　０　　　　　　０　　　　　１９２１９Ｆ３０　　　
０　　　　　　０　　　　　　０　　　　　０１０２４
５Ｅ７０　　　０　　　　　　０　　　　　　０　　　
　　０１１２６０Ｆ９０　　　０　　　　　　０　　　
　　　０　　　　０１２２６６Ｂ２０　　　０　　　　
　　０　　　　　　０　　　　　０１３２８０Ｄ１１　
　０　　０　　　　　０　　　　　２　　　０１４３１
７Ｇ５０　　　０　　　　　　０　　　　　　０　　　
　　０１５３６９Ｆ１０　　０　　　０　　　　　　０
　　　　　　０　　　　　０１７４２１［８０００００ １８４５１Ｃ３０００００ １９４５４Δ１２００　　　　　　０　　　　　　００
２０４５４Ｃ１１０００００ ２１６５０Ｅ２０　　　０　　　　　　０　　　　　　
０　　　　　０２２７Ｂ８Ｇ６０　　　０　　　　　　
０　　　　　　０　　　　　０２３８７１Ｅ３０　　　
０　　　　　　０　　　　　　０　　　　　０１　２Ｇ
３　　　　０　／　５　　　　９／１２Ｂ　　　　　　
　　　　０．０７０２９Ｃ６０／　５　　　　６／１２
８　　　　　　　　０．０４７３３３Ｆ８　　　　０　
／　５　　　　７／１２８　　　　　　　　０．０５５
４４４８２　　　　０　／　５　　　　３／１２８　　
　　　　　　　０．０２３５４４Ｆ４　　　　１　／　
５　　　１２／１２８　　　　　　　　　０．０９４６
　１２０１１７　　　０　／　５　　　　５／１２８　
　　　　　　　　０．０３９７　２００Ｆ９　　　０　
／　５　　　　３／１２８　　　　　　　　　０．０２
３８２０４Ｉ’４　　　１　／　５　　　１１／１２８
　　　　　　　　０．０８６９　２１９Ｆ３　　　０　
／　５　　　１０／１２８　　　　　　　　　０．０７
８１０２４５Ｅ７　　　０　／　５　　　　９／１２８
　　　　　　　　０．０７０１１　２６０Ｉ’９　　　
０　／　５　　　１１／１２８　　　　　　　　０．０
８６１２２６６Ｂ２　　　０　／　５　　　　９／１２
８　　　　　　　　　０．０７０１３２８００１１　　
　１　／　５　　　１２／１２８　　　　　　　　　０
．０９４１４　３１７Ｇ５　　　０　／　５　　　　６
／１２８　　　　　　　　　０．０４７１５３６９Ｆ１
０　　０　／　５　　　　２／１２８　　　　　　　　
　０．０１６１６３８８Ｄ４　　　０　／　５　　　１
３／１２８　　　　　　　　０．１０２１７４２１ｒ！
、８　、　　０　／　５　　　　６／１２８　　　　　
　　　０．０４７１８４５１Ｃ３０／　５　　　　６／
１２Ｂ　、　　　　　　　　０．０４７１９　４５４八
１２　　　０　／　５　　　　　４／１２Ｂ　　　　　
　　　　　　　　０．０３１２０４５４Ｃ１１０／　５
　　　１０／１２８　　　　　　　　０．０７８２１　
６５０１！２　　　０　／　５　　　　　Ｂ／１２８　
　　　　　　　０．０６３２２７８８Ｇ６　　　０　／
　５　　　　２／１２８　　　　　　　　　０．０１６
２３８７１Ｂ３　　　０　／　５　　　１１／１２８　
　　　　　　　０．０８６抗体を、１１種の非礼腫瘍に
対するイムノペルオキシダーゼ染色によって試験した。
その抗体についての結果は、下の第４表に報告される。
以下余白 いくつかの抗体は、ヨウ素化され、そしてＭＣＦ−７゜
ＣＡＭＡＩ、ＳにＢＲ３又はＺＲ７５３０細胞のために
試験された。
その抗体が、およそ５〜ｌＯμＣｉ／μｇの比活性を有
するように、クロラミンＴ又はＩｏｄｏｇｅｎ”を用い
て＋２Ｊによりラベル化した。免疫放射化学的純度を決
定するために、０．５ｍｆｆウシ胎児血清における１０
０．０００ｃｐｍの２種のラベルされた抗体を、０℃で
１５分間、５アリコートのターゲット細胞により連続的
に吸収しく一般的に、アリコート当り４，０００，００
０個の細胞）、そしておのおのの吸収の後、上清液中の
残存する放射能を決定した。
会合定数の測定のために、既知濃度の、ラベルされた及
びラベルされていないモノクローナル抗体を、氷上で１
５分間、ウシ胎児血清中、ターゲット細胞と共にインキ
ュベートした。次に、細胞／抗体混合物のアリコートを
、ガンマカウンターにより計数し、又はＭｉｃｒｏｆｏ
ｌｄフィルタープレート（Ｖ＆Ｐ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ）を通して濾過し、そしてそのフィルターを計数した
。液体中に保持されている結合しなかった抗体を計数す
るために、同じ濃度の抗体（但し、細胞でない）を含む
対照を、平行して行なった。会合定数及びターゲット当
りの抗原のコピイ数を、アフィニティ試験結果から計算
し、そして下の第５表に報告する。
１２Ｇ３　　　３７０００００　　９．Ｉ　Ｘ　１０６
　　　ＭＣＦ７９Ｃ６ ３３Ｆ８ ５４４Ｆ４　　　２１０００００　　５．３ｘｌＯ’　
　　ＭＣＦ７６１２０＋＋７　　　２１００００　　２
Ｘ１０？ＭＣＦ７７２００Ｆ９ ８２０４Ｆ４　　３２０００００　　８．Ｏｘ　１０６
ＭＣＦ７９２１９Ｆ３ １０　２４５１Ｅ７ １１２６０Ｆ９　　　３１００００　　５．６Ｘ１０’
　　　ＭＣＩ？７１２２６６Ｂ２　　　８００００　　
２．７　Ｘ　１０’　　　ＭＣＦ７１３２８００１１　
　　３９００００　　　８．８ｘｌＯ６ＭＣＦ７１４　
３１７Ｇ５　　　３２０００００　　　　１．６ｘｌＯ
６ＣＡＭΔ１１５　３６９Ｆ１０ １６３８８Ｄ４ １７　４２１１Ｅ８ １８４５１Ｃ３４０００００４Ｘ１０’　　　　　　Ｍ
ＣＰ７１９４５４Ａ１２　　　４７００００　　　１．
２ｘｌＯ’　　　　ＭＣＦ７２０４５４Ｃ１１３９００
００４，８ｘｌＯ’　　　　ＺＲ７５３０２１６５０Ｅ
２ ２２７８８Ｇ６ ２３　８７１Ｈ３ モノクローナル抗体によって認識された抗原を同定する
ために、抗原の免疫沈殿法を、次の方法に従って行なっ
た。８謁の直径のポリスチレンボールＣＰｒｅｃｉｓｉ
ｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ　Ｃｏ、）を、氷酢酸
中、１０％発煙硝酸により被覆し、そして５０℃の水浴
中で３時間、インキュベートした。酸処理した後、その
ボールを、蒸留水により３度すすぎ、０、　Ｉ　Ｍ　Ｎ
ａ０ｌＩ中、１％亜ジチオン酸ナトリウムにより被覆し
、そして５０℃の水浴中で３時間、インキュベートした
。そのボールを、再び蒸留水により３度すすぎ、０．１
％■−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）−
カルボジイミド（Ｅ口＾Ｃ）、０．２％スペリン酸（ジ
メチルホルム了ミド中に溶解されたスペリン酸）により
被覆し、そして室温で１晩インキユベートした。そのボ
ールを、蒸留水により３度すすぎ、そして識別のために
印を付けた。
精製されたモノクローナル抗体を、２−（Ｎ−モルホリ
ン）エタンスルホン酸緩衝液中において０．２■／　ｍ
　１に希釈し、そして前もって処理され、そして印を付
けられたポリスチレンボールを、個々のチューブ内に置
き、そして４５０μｌの希釈された抗体及び５０μｌの
新鮮な１％Ｅ０＾Ｃにより被覆した。チューブに蓋をし
、そして２５℃で２４時間、インキュベートした。この
インキューベーションの後、そのボールを、ＰＢＳによ
り２度すすぎ、そして新鮮で使用するか又は使用する前
、４℃で数日間、保存した。
新たにラベルされたターゲット細胞抽出物を、Ｍａｒｃ
ｈａｌｏｎｉｓ、Ｊ、＋”Ａｎ　　Ｅｎｚｙｍｉｃ　　
Ｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅＴｒａｃｅ　Ｉｏｄ
ｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　［ｎ＋＋ｓｕｎｏｇｌｏｂｕｌ
ｉｎｓ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒＰｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｊ、　１１３　：　２９９〜３０５（１９
６９）のラクトペルオキシダーゼ法によって１２５−１
により又は３５−Ｓメチオニン中での増殖によって３５
−８によりラベルされたヒト乳癌細胞系から調製した。
そのラベルされ細胞を、可溶化緩衝液〔１％（ｖ／　ｖ
）　　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋　　１５０ａ＋Ｍ　　
ＮａＣｆｆ１　．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ＋２５ｄ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ｃｊ？　、　ｐＨ＝　７．５　）中に？容器し
た。４部のラベルされた抽出物を、５０■／　ｍ　ｌラ
ム血清アルブミンを含む１部の可溶化緩衝液と共に容器
中で混合し、最終濃度１０曙／ｍ１のＢＳＡを得た。モ
ノクローナル抗体により被覆されたボールを、その容器
に添加し、そして振盪しながら氷上で４時間、インキュ
ベートした。ラベルされた抗原を、その容器からとベッ
トで取り、そしてそのボールを、可溶化緩衝液により４
度すすいだ。
次に、そのボールを取り出し、１００．ｃｌのＬａｅｎ
ｖ＋１ｉＳＤＳゲルサンプル緩衝液を含む個々のチュー
ブ内に置き、そして熱湯中で３分間、インキュベートし
た。そのボールを取り出し、そしてそのサンプルを、適
切な標準液と共にＳＤＳゲル上に注いだ。
その抗体に対する免疫沈殿試験は、それらのうち８種（
２Ｇ３．１２０８７．２００Ｆ９．２０４Ｆ４．２４５
１１Ｅ７，３６９Ｆ１０゜７８８０６及び８７１Ｅ３）
すべてが高分子量ムチン（ＨＭＷ）に結合することを指
摘する。２種は（２６０ｆ’９及び２６６Ｂ２）、５５
Ｋｄの糖タンパク質抗原の同じエピトープに結合する。
２種は（３１７Ｇ５及び６５０Ｅ２）、４２Ｋｄの抗原
に結合する。２つの抗体（４５１Ｃ３及び４５４＾１２
）は、９５Ｋｄの抗原の形でのトランスフェリン受容体
に結合した。４５１Ｃ３及び４５４Ａ１２のいづれも、
受容体へのトランスフェリンの結合を妨げなかった。試
験されたモノクローナル抗体の抗原結合特徴は、第６表
に要約される。
以下く：白 第−」Ｌ−聚 ＭＡＢ　　　　　抗原 １２Ｇ３　　　１１ＭＷ ２９Ｃ６７５Ｋｄ ３３３Ｆ８　　６６Ｋｄ 　４４Ｂ２ ６１２０１１７　　　ＨＭ　Ｗ ７２００１’９　　　ＨＭＷ ８２０４Ｆ４　　　ＨＭ　Ｗ ９２１９Ｆ３ １０２４５Ｅ７　　　ＨＭ　Ｗ ｌｌ　２６０Ｐ９　　５５　Ｋｄ １２　２６６０２　　　　５５Ｋｄ １４３１７Ｇ５　　４２　Ｋｄ １５３６９Ｆ１０　　ＨＭ　Ｗ １６３８８Ｄ４ １７　４２１［Ｅ８ １８４５１Ｃ３９５Ｋｄ　（１−ランスフェリン受容体
）１９４５４Ａ１２　９５　Ｋｄ　（１−ランスフェリ
ン受容体）２０４５４Ｃ１１２００Ｋｄ ２１６５０Ｅ２　　４２Ｋｄ ２２７８８Ｇ６　　　ＨＭ　Ｗ ２３８７１１Ｅ３　　　ＨＭ　Ｗ 抗体のイソタイプを、次のようにして決定した：５　ａ
ｓ平方のグリッドを、ニトロセルロースシート上に鉛筆
で薄く描き、そして抗イソタイプ血清（ＬｉｔＬｏｎ　
Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、にｅｎｓ　ｉｎｇｔｏｎ、　Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ、　マウスに、λ、α、Ｔｌ、Ｔ２ａ、γ
２ｂ、ｒ３及びμ鎮に対するウサギ抗血清）の１ｒｒｌ
小滴を適用し、その結果、おのおのの列の正方形は、お
のおののトＩ及びＬｔＭ試薬の１つのスポットを受ける
。そのシートを、湿った室内で１時間室温でインキュベ
ートし、すぐに１％（Ｗ／Ｖ）を含む−ＰＢＳ−ＢＳＡ
によりすすぎ、そして４℃でｐｕｓ　−ＢＳ＾中に１晩
放霞する。ストリップを、ハサミでばらばらに切り、そ
して０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ　−ＢＳ
＾中に４℃で保存することができる。他方、ストリップ
を、空気乾燥し、そして４℃で乾燥保存することができ
る。３ｍｌのハイブリドーマ培養上清液又はＰＢＳ　−
ＢＳＡにより希釈された上清液を含む一連の小さな管を
用意する。１：１０の希釈溶液が一般的に好結果をもた
らし；そしていくつかの上清液を、１：２００はどに希
釈することができる。ニトロセルロースのストリップを
、室温で１時間、おのおのの管内でインキュベートする
。
そのストリップを、ＰＢＳ　−ＢＳＡにより３度すすぎ
、そして室温で１時間、希釈されたウサギ抗−マウスー
ホースラティッシュペルオキシダーゼ中でインキュベー
トする。そのストリップを、Ｐｕｓ　−ＢＳＡにより２
度及びＴｒｉｓｉ衝液により２度すすぐ、そのストリッ
プを、十分な色が抗−ビッタイブスポット上に進展する
まで（９通３〜４分）、ジアミノベンジジン及び過酸化
水素を含むＴｒｉｓ緩衝液中に置く。
その抗体イソタイプが第７表に示される。
第エニし一表 ＭＡＢ　　　　　イソタイプ １２Ｇ３　　　　　　　Ｇ　１ ２９Ｃ６Ｍ ３３３Ｆ８　　　　　　Ｇ　１ ４４４１１２　　　　　　Ｇ　１ ５４４Ｆ４　　　　　　Ｇ　３ ６１２０）１７　　　　　　Ｍ ７２００Ｆ９　　　　　　Ｇ　１ ８２０４Ｆ４　　　　　　Ｍ ９２１９Ｆ３　　　　　　Ｇ　１ １０２４５Ｅ７　　　　　　Ｇ　１ １１２６０Ｆ９　　　　　　Ｇ　１ １２２６６８２　　　　　　Ｇ　１ １３２８００１１　　　　　Ｇ　１ １４３１７Ｇ５　　　　　　Ｇ　１ １５３６９Ｆ１０　　　　　Ｍ １６３８８０４　　　　　　Ｇ　１ １７４２１１！８　　　　　　Ｇ　１ ＋８　４５ＩＣ３Ｇ　１ １９　４５４八１２　　　　　　　　　　Ｇ　　１２０
　４５４ＣＩＩ　　　　　　　　　Ｃ２Ａ２１　６５０
［ｉ２　　　　　　　　　Ｇ　１２２７８８Ｇ６　　　
　　　　　　Ｇ　１２３　８７１１４３　　　　　　　
　　Ｍ抗体を、Ｂｊｏｒｎなど、、“Ｅｖａｌｕａｔｉ
ｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎＬｉｈｏｃｌｉ
ｅｓ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　
ｏｒ　　ＢｒｅａｓＬＣａｎｃｅｒ　　Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｏｘｉｎｓ＋”Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　　４５　：　
１２１４〜１２２１　（１９８５）及びＣａｒｌｓｓｏ
ｎ、Ｊ、など、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。
（１９７８）　１７３：　　７２３〜７３７によって記
載されているようにＳＰ叶により又はイミノチオレーン
（ＩＴ）により処理し、そしてリジン毒素Ａ鎖（ＲＴＡ
）に接合し、本発明の免疫毒素を製造した。
２０倍のモル過剰量の５ＰＤＰ　（エタノール中におい
て２０ｎ＋Ｍ）を抗体に添加し、そして室温で３０分間
インキュベートした後、反応しなかった５ＰＤＰを、Ｐ
ＢＳに対する透析によって除去した。誘導体化の程度は
、ジチオＩ・レイトール（ＤＴＴ）による還元の後、３
４３ｎｍでピリジン−２−千オンの放出を測定すること
によって決定された。抗体に依存して、３〜８個のりシ
ンアミノ酸基（抗体分子当り）が、ピリジル−ジスルフ
ィド誘忠体に転換された。
５ｐｏｐ処理された抗体を、ＰＴＡに接合した。接合の
すぐ前で、ＲＴＡを５０ｍＭのＤＴＴにより還元し、次
にアガロース、デキストラン及び／又はアクリルアミド
を含むクロマトグラフィー樹脂のカラム上で脱塩し、タ
ンパク質からＤＴＴを除去する。還元されたＰＴＡは、
ピリジル−ジスルフィドよりも３〜５倍のモル過剰量で
抗体に添加された。典型的な反応混合物（１ｍｌ）は、
１μＭ抗体及び３０μｍのＲＴＡから成った。その反応
を、４℃で一晩、進行せしめた。抗体へのＰＴＡの接合
の程度を、ピリジン−２−千オンの放出を測定すること
によって分光測光的に決定した。平均して、接合体は、
抗体分子当り２〜３個のＰＴＡ分子を含んだ。これは、
非還元性ＳＯ５−ＰＡＧＥゲル（７，５％）によって確
認され、そしてそれはまた、典型的な接合体調製物が１
０％〜３０％の遊離抗体を含んだことを示した。
接合体混合物を、ＩＩＰＬＣサイズ排除カラム上でクロ
マトグラフィー処理し、残存する反応しなかったＰＴＡ
から接合体を分離した。そのカラムを、０、１　Ｍの硫
酸ナトリウム１０．０２Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝
　６．８　）により平衡化した。接合体混合物（０，７
ｍｉりを、注入し、次にｌｒｒ＃ｔ／分の流速でクロマ
トグラフィー処理した（室温）、０．５ｍ／の画分を集
め、そしてピークの接合体画分をプールし、そしてフィ
ルターを細胞毒性試験の前に消毒した。
０、ｌＯＭのリン酸ナトリウム、０．００１ＭのＮａ　
ＥＤＴＡ。
ｐＨ＝８．０（この後、Ｐ−ＥＤＴＡ緩衝液として言及
する）中におけるおよそ３０■７ｍｌの抗体を、室温で
約１５分間、１ｍＭの５，５′−ジチオビス−（２−ニ
トロ安息香酸）　（［１ＴＮＢ）　と反応せしめ、そし
て次に水浴中で０℃に冷却する。十分なＩＴを、この溶
液に添加し、抗体分子当り平均２．５のＩＴ分子を得、
そしてこの得られた溶液を、０〜５℃で、３００倍過剰
体積のＰ−ＥＤＴＡ緩１！ｉ液に対して透析する。
１ａ＋ＭのＤＴＴを含むＰ−ＥＤＴＡ中に通常保存され
ているＲＴＡを、１０〜１５■／　ｍ　１の濃度に限外
濾過し、そして０〜５℃で、３００倍過剰体積のＰ−Ｅ
ＤＴＡに対して透析する。十分なＲＴＡを、誘導体化さ
れた抗体に添加し、誘４体化された抗体上の阻止された
チオール当り平均１．０〜１．２のＲＴＡ上の遊離チオ
ールを得る。この混合物を、室温で２時間、インキュベ
ートする。
その結合反応混合物を、固体支持体に共有結合されたブ
ルー色素（トリサクリルプルー）に基づくクロマトグラ
フィー樹脂のカラムに適用し、そして次にその混合物を
、室温でＰ−ＥＤＴＡにより溶離する。そのカラムは、
出発抗体の■当りおよそ２ｍｌのベッド体積を含むよう
な割合で作られる。
接合しなかった抗体の初期ピークがカラムから溶離され
た後、溶離剤がＩＭのＮａＣ１を含むＰ−Ｅ［ｌＴ＾に
変換される。免疫接合体及び反応しなかったＲＴＡを、
ひじょうに鋭いピークとしてこの緩ｆＪｉ　ン１中に’
ｔ８８（Ｌ、そしてこれをブール〜５℃で１０倍過剰体
積のＯ．１５Ｍのリン酸ナトリウム、（ｐＨ＝　７．　
１）（この後、Ｐｉ緩衝液として言及する）に対して透
析する。その透析されたタンパク質を、０〜５℃でサイ
ズ排除ゲルのカラムに適用し、そして６　ｃｍ　／時の
流速で緩衝液により溶離する。そのカラムは、適用され
たタンパク質のｍ１当り少なくとも２５ｒｌ！のベッド
体積を含むような割合で作られる。免疫接合体が、排除
体積のすぐ後に、４【−のピークとして溶離され、その
後、ベースラインまで落ち、次に二量体及び単量体のＲ
ＴＡのピークが続く。そのプールされた免疫接合体ピー
クを、３５ｐｓｉで限外濾過し、５．　０■／ｒｒｌの
最終濃度にし、そしてフィルターを消毒する。
本発明は、次の例によってより一層理解され、そしてそ
の例は例示的であり、限定するものではない。
五−土 １６〜２２ｇの重さの雌性無胸腺ヌードマウス（Ｎｕ／
Ｎｕ，Ｂａｌｂ／ｃ系）を用いた。Ｎｌｌｌ：ＯＶＣＡ
Ｒ−３腹水細胞を、キャリアーマウスから得た。
その細胞を、リン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）により２度
洗浄し、そして２体積のＰＢＳに対しておよそ１体積の
細胞でＰＢＳ中に再懸濁した。細胞の計数を、血球計数
器により計数することによって決定した。細胞生存度を
、トリパンブルー色素排除試験によって決定した。おの
おのの動物を、ロゼ口で、５Ｘ１０’個の生存細胞によ
妙腹膜内に注射した．４．７及び１０日目に免疫毒素を
注射した。
この免疫毒素は普通、Ｑ，１ｍｌのＰＢＳで投与された
．対照動物を、同じスケジュールに基づいてＱ，１ｍ１
のＰＢＳにより注射した。５匹の動物を、試験されるお
のおのの免疫毒素の個々の投与及び対照のために使用し
た。動物を毎日、観察した。
おのおのの実験において、対照と比較して生存時間の増
大により又は同じ生存時間を有する対照と比較して処理
された動物の腫瘍拡大の阻止によるほとんど少ない腹部
のはれによって、効果が決定された。
偲−」し−表 ＰＢＳ　　　　　　　　　　　−０３ ４５４＾１２−　ＩＴ−ＰＴＡ　　　　　２５　　　　
　　４　　　　　　　０　　　　　　　　＞この実験に
使用される方法は、本質的に例１と同じある。この実験
は、ＰＴＡに接合される、Ｆａｂ’２フラグメントの４
５４Ａ１２から成る免疫毒素が４５４Ａ１２−　ＩＴ−
ＰＴＡに匹敵する抗１１ｉ１瘍活性を有することを示す
。
第一１０−表 ４１　　　ＰＢＳ　　　　　　　　　　　　　３　　　
　３　　　　　＞３４次の例は、いくつかの卵巣癌細胞
系に対する免疫接合体のインビトロでの細胞毒性を示す
。
Ｎｒｌｌ　：　ＯＶＣＡＲ−２，−３，−４及び−５を
、卵巣癌を有する患者の悪性腹水から単離する。これら
の細胞系は、次の引用中で前に記載されており、そして
この開示を引用によりこの明細吉中に組み入れる。
１１ａｍｉｌｔｏｎなど、、“アンドロゲン及びエスト
ロゲン受容体を有するヒト卵巣癌細胞系（Ｎｌｌｌ　：
　ＯＶＣＡＲ−３）の特徴化（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｌｕｍａｎ　ＯｖａｒｉａｎＣａ
ｒｃｉｎｏｍａ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｌｉｎｅｓ　　ｗｉｔ
ｈ　　Ａｒｄｒｏｇｅｎ　　ａｎｄ　　［ＥｓｔｒｏＢ
ｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒｓ’Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４３
　：　５３７９〜５３８９（１９８３Ｌ１１ａｍｉｌｔ
ｏｎなど、、“卵巣癌の実験的モデルシステム：新処理
アプローチの計画及び評価への適用（［１ｘｐｅｒｉｎ
＋ｅｎｔａｌ　Ｍｏｄｅｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｏｆ　０
ｖａｒｉａｎ　Ｃａｎｃｅｒ：Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｅｖａｌｕａ
ｔｉｏｎ　ｏｆＮｅｗ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ａｐｐｒ
ｏａｃｈｅｓ″Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　０ｎｃｏｌ。
１１：２８５〜２９Ｂ　（１９８５）。卵巣癌細胞系Ａ
　１８４７を、Ｓ、Ａａｒｏｎｓｏｎ（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、ＢｅＬｈｅｓ
ｄａ。
Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得た。その卵巣細胞を、ＲＰ旧
培地１６４０．１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌの
インシュリン及びペニシリン−ストレプトマイシン中で
増殖した。ＫＢ細胞を、ダルベツコの変性イーグル培地
（口ＭＥＭ）、１０％ウシ血清、グルタミン及びペニシ
リン−ストレプトマイシン中で増殖した０組織培養培地
（血清、グルタミン及び抗生物質）を、Ｇｒａｎｄ　ｌ
５ｌａｎｄ旧ｏ１ｏｇｉｃａｌ　Ｃｏｌ、　Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ　ＮＹから購入し、そしてインシュリンを
、Ｅｌａｎｃｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、
　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ＋　ＩＮから得た。タンパ
ク質合成阻害アンセイのために、細胞を、使用する１日
前、２Ｘ１０’個の細胞／３５１ｕ皿でプレートした。
免疫毒素を添加する前、細胞を、ウシ血清アルブミン（
２■／ｍ２）を含むＤＭＥＭ　（ＤＭＥＭ−ＢＳＡ）に
より２度洗浄した。挙げられた免疫毒素は、イミノチオ
レーン誘導体化及び上記のようにしてＲＴＡへの接合に
よって製造された。
タンパク質合成の阻害法を用いて、免疫毒素の活性を測
定した。細胞を、３７℃で２４時間、種々の濃度の免疫
毒素を含むＤＭＩＥＭ　−ＢＳＡと共にインキュベート
し、そして次にＰｉｒｋｅｒなど１．“プソイドモナス
の外毒素に結合された抗−トランスフェリン受容体抗体
：ヒト卵巣癌細胞系における典型的な免疫毒素（八ｎＬ
ｉ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙＬｉｎｋｅｄ　　ｔｏ　　Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　　　Ｅｘｏｔｏｘｉｎ　　：　　八　Ｍｏｄ
ｅｌＩｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　Ｉｌｕ＋＋＋ａｎ
　０ｖａｒｉａｎ　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　Ｃｅ１ｌＬｉ
ｎｅｓ）”Ｃａｎｃｅｒ　４５：　７５１〜７５７　（
１９８５）に記載されたようにＴＣＡ−不溶性物質への
Ｍｌ（）ロイシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌ
ｅａｒ＋　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ　Ｈ比活性−１４０，
８Ｃｉ　／　ｍモル）の組込みについて分析した。重複
体の平均値は、免疫毒素を受けなかった同じ細胞系の対
照の百分率として表わされた。
１０ｎＭ又はそれよりも低い処理されなかった対照（Ｉ
Ｄ５０）と比較して、タンパク質合成の５０％阻害を与
える免疫接合体が有効であると思われた。
試験された免疫接合体のＩＤ５゜は、下の第１１表に挙
げられる。
４５４Ａ１２　　　　０．０４　０．０５　０．０５　
０．０３　　−−−　０．０１３１７Ｇ５　　　　０．
１　０．２　０．１　０．３　　　−−−　０．１−２
２６０Ｆ９　　　　０．２　０．５　０．２　０．２　
　　＞５　　１４０１１３Ｆｌ　　　　　　−−−２ ２８００１１＞３０　４　　１３　　　＞２０　　　＞
３０　１２０２Ｇ３　　　　　　−−−　８ ３６９Ｆ１０　　　　−−−　１０ ４５４Ｃ１１＞５　　＞５　　＞５　　＞５　　　＞５
　　＞５５２０Ｃ９＞５　−−−　−−−〜−−−−−
２４５Ｅ７　　　　　　＞３０　　＞３０　　＞３０　
　＞３０　　　＞３０　　＞３０例−」− 例４において記載された免疫毒素を、Ｎｕｌｌ：ＯＶＣ
ＡＲ−３細胞に対して試験した。細胞を、ＲＰＭＩ培地
１６４０．１０％ウシ胎児血清、１０ｔｔｇ／ｍｌのイ
ンシェリン及びペニシリン−ストレプトマイシン中に保
持した。細胞を、トリプシンによる軽い消化又はバーセ
ン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）の添加によって、培養フラスコか
ら取り出した。その細胞濃度を、調整した。４Ｘ１０’
個のＮＩＩＩ　：　ＯＶＣＡＲ−３細胞を、培地１ｍＪ
中に懸濁し、そして８ｍＱのガラスバイアル（ＩＣＮ）
に添加し、次に接合体希釈溶液（１００μｇ／ｍｌのウ
シ血清アルブミンを含むＰＩ３５中における）を添加し
た。３７℃で２２２時間インキュベートた後、その培地
を吸い出し、その単層をＰＢＳにより洗浄しそして０．
５μＣｉのし−（”　Ｓ　）メチオニン（八ａ＋ｅｒｓ
ｈａｍ　：　１４００Ｃｉ　／　ｍモル）により補足さ
れた、０．５ｍｉ！のメチオニン不含培地を添加した。
３７℃で２時間インキュベートした後、その培地を吸い
出し、そして細胞の単層を、メチオニン（Ｌｏｇ／ｍｇ
）を含む１０％トリクロロ酢酸により２度洗浄した。細
胞を乾燥せしめ、シンチレーション液を添加し、そして
放射能を、Ｐａｃｋａｚｏｌ　ＣＬ／Ｄ液体シンチレー
ションカウンターにより測定した。
タンパク質合成の阻害を、おのおののバイアルについて
のＴＣＡ沈殿可能な３ＳＳの組込みとして計算した。平
均値は、免疫毒素を受けなかった同じ細胞系の対照の百
分率として示された。ＩＤ５０は、例４におけるように
して決定された。その結果を、次の第１２表に報告する
。
この例は、上記のモノクローナル抗体及びプソイドモナ
スの外毒素を含む免疫接合体の細胞毒性を示す。
プソイドモナス外毒素（ＰＥ）は、Ｄｒ、Ｓ、Ｌｅｐｐ
ｌａ（Ｆｔ、Ｄｅｔｒｉｃｋ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、Ｍ
Ｏ）のギフトであった。
ＰＥをまた、５ｗ１ｓｓ　Ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　Ｖａｃ
ｃｉｎｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。
Ｂｅｒｎｅ＋ＳｗｔｔｚｅｒＬａｎｄから商業的に人手
することができる。ＰＥ接合体を構成し、そして前に引
用（１’ｉｒｋなど、　（１９８５））によって本明細
書に組込まれた方法の変法によって精製した。ＰＥ（３
０ｎモル）を、５０００　ｎモルの２−イミノチオレー
ン−１１１Ｊ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｂｃｍ１ｃａｌ　Ｃ
ｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）　　１ｍＭのＥＧＴ＾
を含む０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）　　１
ｍｌ中５００ｎモルのＮＡＤ”と３７℃で１時間、反応
せしめた。次に、そのｍ８体化されたＰＥを、その反応
体からＩＩＰＬＣを用いて分離し、そして５゜５′−ジ
チオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）の添
加によって活性化し、最終濃度を１ｍＭにした。
抗体（４０〜５０ｎ５０Ｂを、３７℃で１時間、１ｍＭ
のＥＧＴＡを含む０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋　＝
　８．０　）０．７５ｍｆｆ中１００〜２００ｎモルの
２−イミノチオレーン−１１Ｃ２と共にインキュベート
した。その抗体と、活性化されたＰＥとを反応せしめ、
そしてその接合体を、記載されたようにしてＩＩＰＬｃ
を用いて精製した。Ｐｉｒｋｅｒなど、　（１９８５）
。ＰＥと抗体との一対一の接合体を含むピークを回収し
、そして下に記載したすべての研究のために使用した。
タンパク質合成の阻害及びＩＤ、。を、上の例４に記載
したようにして決定した。但し、その細胞を、１２時間
、免疫毒素と共にインキュベートシた。代表的なタンパ
ク質阻害アッセイからの結果を示し、そしてすべての実
験の平均ＩＤ５ｏ値を、第１３表に提供する。ｒＤ５０
は、その表においてｎ　ｇ　／　ｍ　ｌ及び（ｎＭ）と
して示される。
以下余白 那−」ぢＬ−聚 ＯＶＣＡＲ−２１，６（０，０１）　　　　　３．４（
０，０２）　　　　８３５（４）ＯＶＣＡＲ−３３，６
（０，０２）　　　４１．５（０，２）　　８０５（４
）ＯＶＣＡＲ−４０，７（０，００５）　　　４．７（
０，０２）　　　　５４（０，３）ＯＶＣＡｌｌ−５１
０（０，０５）　　　２３（０，１）　　　３４５０（
＞１５）Ａ１８４７　　　２．５（０，０１５）　　　
３８５ｃ（２）　　　２２００（＞１０）ＫＢ　　　　
　１５′′　（０，０８）　　　＞６００（＞３）　　
　＞２５０（＞１）ａ：特にことわらない限り、この値
は、少なくとも２つの実験の平均値である。
ｂ；１つの実験からの結果。
Ｃ：非特異的な毒性。
本発明の免疫毒素をｆｆｌ！するモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマのサンプルを、次の寄託番号下
でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉＯｎ又はＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　
Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに
寄託した。
以下金白 ＴＣＣ ハイブリドーマ　　寄１■Ｅ号 ２Ｇ３　　　　　　　　　＋１［１８４９１２８００１
１ＪＩＢ　８４８７ ２６６８２　　　　　　　１１Ｂ　８４８６２４５１Ｅ
７　　　　　　　１１Ｂ　８４８９３１７６５　　　　
　　　　Ｈｉｔ　８４８５３６９Ｉ’ｌＯＪＩＢ　８６
８２ ４５４Ｃ１１１１Ｂ　８４８４ ７８８Ｇ６　　　　　　　　ＪＩＢ　８６９２３ｐ８ ２６０Ｆ９　　　　　　　１１Ｂ　８４８８９Ｃ６ＩＶ
Ｉ　１００５６ ４Ｂ２ ４Ｆ４ １２０＋１７　　　　　　　１ＶＩ　１００６１２００
１’９　　　　　　　１ＶＩ　１００６２０４Ｆ４ ２１９Ｆ３　　　　　　　　　１ＶＩ　　１００７２８
８Ｄ４ ４２１Ｅ８　　　　　　　　　　１ＶＩ　　１００６４
７１Ｅ３ ４５１Ｃ３１ＶＩ　　１００８１ ６５０Ｅ２　　　　　　　　　１ＶＩ　　１００８３４
５４Ａ１２　　　　　　　　１ＶＩ　　１００７５これ
らの寄託は、ブダペスト条約に基づいて行なわれ、そし
てその規定に従って保持され、そして入手可能である。
以下全山 手続補正書（方式） 昭和６２年３月ｌ−日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第２８９７９１号 ２、　発明の名称 抗−ヒト卵巣癌免疫毒素及びその使用方法３、補正をす
る者 事件との関係　　　特許出願人 名称　　シタス　コーポレイション ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番ｌＯ号５、
補正命令の日付 昭和６２年２月２４日ＰＡ ６、補正の対象 明細書 ７、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし） ８、添附書類の目録 浄書明細書　　　　　　１通

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、細胞毒性成分及びモノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆ
    ａｂ′及びＦ（ａｂ′）＿２から成る群から選択された
    抗原結合部分を含む免疫毒素であって、前記モノクロー
    ナル抗体が （ｉ）ヒト卵巣癌組織を結合し； （ｉｉ）０、１１又はそれよりも低い選択性を有し；そ
    して （ｉｉｉ）ＩｇＧ又はＩｇＭであり；そしてヒト卵巣癌
    細胞に対して１０ｎＭ又はそれよりも低い細胞毒性ＩＤ
    ＿５＿０；ヒト卵巣癌細胞を担持する哺乳類を前記免疫
    毒素により処理する場合、前記哺乳類によって担持され
    るそのような細胞から成る腫瘍の増殖速度をおそくする
    こと；又は前記哺乳類を前記免疫毒素により処理する場
    合、ヒト卵巣癌細胞から成る腫瘍を担持する哺乳類の生
    存時間を延ばすことから成る群から選択された少なくと
    も１つの能力を有する免疫毒素。 ２、前記ヒト卵巣癌細胞がＯＶＣＡＲ−２、ＯＶＣＡＲ
    −３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５及びＡ１８４７
    から成る群から選択された少なくとも１つのものである
    特許請求の範囲第１項記載の免疫毒素。 ３、前記モノクローナル抗体を、２Ｇ３、９Ｃ６、３３
    Ｆ８、４４Ｂ２、４４Ｆ４、１２０Ｈ７、２００Ｆ９、
    ２０４Ｆ４、２１９Ｆ３、２４５Ｅ７、２６０Ｆ９、２
    ６６Ｂ２、２８０Ｄ１１、３１７Ｇ５、３６９Ｆ１０、
    ３８８Ｄ４、４２１Ｅ８、４５４Ｃ１１、４５４Ａ１２
    、４５１Ｃ３、６５０Ｅ２、７８８Ｇ６、８７１Ｅ３及
    び多くの前記群に機能的に等しいモノクローナル抗体か
    ら成る群から選択する特許請求の範囲第１項記載の免疫
    毒素。 ４、前記モノクローナル抗体が、高分子量ムチン、２６
    ０Ｆ９又は２６６Ｂ２によって結合され得る５５Ｋｄ抗
    原の１つのエピトープ、２００Ｋｄ抗原及び４２Ｋｄタ
    ンパク質性抗原から成る群から選択された抗原を結合せ
    しめる特許請求の範囲第１項記載の免疫毒素。 ５、前記毒成分が、リシン毒素Ａ鎖、フィトラカアメリ
    カナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ　ａｍｅｒｉｃａｎａ）タ
    ンパク質、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア
    毒素Ａフラグメントの非結活性フラグメント及びプソイ
    ドモナスアエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ
    ｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａから成る群から選択された
    、細菌、植物又はカビ起源の酵素的に活性の毒素である
    特許請求の範囲第１項記載の免疫毒素。 ６、前記リシン毒素Ａ鎖が組換体リシン毒素Ａ鎖である
    特許請求の範囲第１項記載の免疫毒素。 ７、ヒトトランスフェリン受容体に結合するが、しかし
    そこへトランスフェリンの結合を阻止しないモノクロー
    ナル抗体の抗原結合部分を少なくとも含む特許請求の範
    囲第１又は２項記載の免疫毒素。 ８、前記モノクローナル抗体の抗原結合部分がそのＰ（
    ａｂ′）＿２部分を含む特許請求の範囲第７項記載の免
    疫毒素。 ９、ヒト卵巣腫瘍細胞から成る腫瘍を担持する哺乳類の
    生存時間を延ばす方法であって、前記哺乳類の生存時間
    を延ばすのに有効な、特許請求の範囲第１、２又は７項
    記載の免疫毒素の量を前記哺乳類に投与することから成
    る方法。 １０、哺乳類によって担持されるヒト卵巣癌細胞から成
    る腫瘍の増殖速度をおそくする方法であって、前記哺乳
    類によって担持されるヒト卵巣腫瘍の増殖速度をおそく
    するのに有効な、特許請求の範囲第１、２又は７項記載
    の免疫毒素の量を前記哺乳類に投与することから成る方
    法。 １１、ヒト卵巣癌細胞を殺す方法であって、特許請求の
    範囲第１、２又は７項記載の、細胞毒性的に有効な量の
    免疫毒素と前記細胞とを接触することから成る方法。
JP61289791A 1985-12-06 1986-12-06 抗−ヒト卵巣癌免疫毒素及びその使用方法 Pending JPS62209098A (ja)

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US80625685A 1985-12-06 1985-12-06
US806256 1985-12-06

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7083957B2 (en) 2001-02-12 2006-08-01 Reasearch Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
US7101977B2 (en) 2001-07-17 2006-09-05 Research Development Foundation Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806494A (en) * 1986-07-24 1989-02-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Monoclonal antibody against ovarian cancer cells (OVB-3)
US4921790A (en) * 1987-04-24 1990-05-01 Research Corporation Tumor specific assay for CA125 ovarian cancer antigen
JPH02504517A (ja) * 1987-08-19 1990-12-20 セントカー・インコーポレーテツド ヒト卵巣ガン腫に会合する抗原
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5024834A (en) * 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
AU6031090A (en) * 1989-07-31 1991-03-11 University Of British Columbia, The Monoclonal antibodies against a tumor-associated antigen

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5843926A (ja) * 1981-09-08 1983-03-14 Suntory Ltd 選択性制癌剤
DE3482444D1 (de) * 1983-03-30 1990-07-19 Lilly Industries Ltd Immunoglobulinkonjugate.

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7083957B2 (en) 2001-02-12 2006-08-01 Reasearch Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
US7285635B2 (en) 2001-02-12 2007-10-23 Research Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
US7741278B2 (en) 2001-02-12 2010-06-22 Research Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
US7943571B2 (en) 2001-02-12 2011-05-17 Research Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
US8138311B2 (en) 2001-02-12 2012-03-20 Research Development Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
US7101977B2 (en) 2001-07-17 2006-09-05 Research Development Foundation Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins
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