JPH08154671A - ハイブリドーマ２８ｋ２９ - Google Patents
ハイブリドーマ２８ｋ２９Info
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- JPH08154671A JPH08154671A JP6301836A JP30183694A JPH08154671A JP H08154671 A JPH08154671 A JP H08154671A JP 6301836 A JP6301836 A JP 6301836A JP 30183694 A JP30183694 A JP 30183694A JP H08154671 A JPH08154671 A JP H08154671A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- human
- lung cancer
- antigen
- hybridoma
- Prior art date
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 肺癌に対して特異性の高く、かつ肺癌細胞の
細胞膜抗原と反応するヒト型モノクローナル抗体を提供
することにある。 【構成】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２８Ｋ２９、当該ハイブリドーマ２
８Ｋ２９が産生するヒト型モノクローナル抗体、そのヒ
ト型モノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナ
ル抗体断片を主成分とする癌検査薬およびそのヒト型モ
ノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体
断片を成分とする癌治療薬である。
細胞膜抗原と反応するヒト型モノクローナル抗体を提供
することにある。 【構成】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２８Ｋ２９、当該ハイブリドーマ２
８Ｋ２９が産生するヒト型モノクローナル抗体、そのヒ
ト型モノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナ
ル抗体断片を主成分とする癌検査薬およびそのヒト型モ
ノクローナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体
断片を成分とする癌治療薬である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特に肺癌に対し特異的
に反応し、かつ肺癌細胞株の細胞膜抗原と反応するヒト
型モノクローナル抗体に関するものであり、詳しくは、
工業技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１４１１９号で寄託された細胞の特性を有するハイブ
リドーマ２８Ｋ２９、工業技術院生命工学工業研究所に
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞
の特性を有するハイブリドーマ２８Ｋ２９が産生するヒ
ト型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体
若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を主成分とす
る癌検査薬、該ヒト型モノクローナル抗体若しくは該ヒ
ト型モノクローナル抗体断片を成分とする癌治療薬に関
する。
に反応し、かつ肺癌細胞株の細胞膜抗原と反応するヒト
型モノクローナル抗体に関するものであり、詳しくは、
工業技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１４１１９号で寄託された細胞の特性を有するハイブ
リドーマ２８Ｋ２９、工業技術院生命工学工業研究所に
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞
の特性を有するハイブリドーマ２８Ｋ２９が産生するヒ
ト型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体
若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を主成分とす
る癌検査薬、該ヒト型モノクローナル抗体若しくは該ヒ
ト型モノクローナル抗体断片を成分とする癌治療薬に関
する。
【０００２】
【従来の技術】抗体を用いた免疫学的診断・治療・予防
法は、臨床的に非常に望まれており、特に、自己免疫疾
患、癌、感染症などの疾患領域での臨床的価値は高い。
厚生省の人口動態統計資料によれば、日本における死因
の第１位は癌であり、癌による死亡者数は年々増加の傾
向にある。その中でも、肺癌・大腸癌による死亡者数は
著しい増加傾向にあり、それらに対する癌診断薬・癌治
療薬の開発が臨床の現場で強く望まれている。
法は、臨床的に非常に望まれており、特に、自己免疫疾
患、癌、感染症などの疾患領域での臨床的価値は高い。
厚生省の人口動態統計資料によれば、日本における死因
の第１位は癌であり、癌による死亡者数は年々増加の傾
向にある。その中でも、肺癌・大腸癌による死亡者数は
著しい増加傾向にあり、それらに対する癌診断薬・癌治
療薬の開発が臨床の現場で強く望まれている。
【０００３】癌に対する免疫学的治療薬として、マウス
型モノクローナル抗体（Ｄｉｐｐｏｌｄ、Ｗ．Ｇ他、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７
７、６１１４−６１１８，１９８０；Ｋｏｐｒｏｗｓｋ
ｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．，８１，２１６−２１９，１９８４；Ｈｅｌｌｓ
ｔｒｏｍ，Ｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，８２，１４９９−１５０２，１９８５）
あるいはヒト−マウス型キメラ抗体（Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒ，Ｍ．Ｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１２，６０４−６０
８，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２２９，１２０２−１２０７，１９８５）などを
用いた開発が行われている。
型モノクローナル抗体（Ｄｉｐｐｏｌｄ、Ｗ．Ｇ他、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７
７、６１１４−６１１８，１９８０；Ｋｏｐｒｏｗｓｋ
ｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ．，８１，２１６−２１９，１９８４；Ｈｅｌｌｓ
ｔｒｏｍ，Ｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，８２，１４９９−１５０２，１９８５）
あるいはヒト−マウス型キメラ抗体（Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒ，Ｍ．Ｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１２，６０４−６０
８，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２２９，１２０２−１２０７，１９８５）などを
用いた開発が行われている。
【０００４】しかしながら、マウス型モノクローナル抗
体あるいはヒト−マウス型キメラ抗体など異種の抗体あ
るいは該抗体断片を含む体内診断薬あるいは治療薬はヒ
トに対して異物でありアナフィラキシ−ショックなどの
副作用を引き起こす可能性が高く（本田光世他、Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ，４，８４４−８４７，１９９０）、臨
床的実用性は非常に低い。
体あるいはヒト−マウス型キメラ抗体など異種の抗体あ
るいは該抗体断片を含む体内診断薬あるいは治療薬はヒ
トに対して異物でありアナフィラキシ−ショックなどの
副作用を引き起こす可能性が高く（本田光世他、Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ，４，８４４−８４７，１９９０）、臨
床的実用性は非常に低い。
【０００５】それらに対して、ヒト型モノクローナル抗
体を用いれば、ヒトに対する安全性は格段に向上し、体
内診断薬あるいは治療薬としては理想的な薬剤である。
しかしながら、ヒト型モノクローナル抗体を作製する技
術は非常に難しく、癌と反応するヒト型モノクローナル
抗体を安定的にかつ大量に取得する試みは種々行われて
いるが（Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７９，５６６６−５６７
０，１９８２；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４，２４１
６−２４２０，１９８７；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．Ｃｏｔ
ｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８０、２０２６−２０３０、１９８３；Ｓｕｓａｎ
・Ｐ．Ｃ．Ｃｏｌｅ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４
４、２７５０−２７５３、１９８４；Ｍａｒｔｉｎ・
Ｖ．Ｈａｓｐｅｌ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４５、
３９５１−３９６１、１９８５；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．
Ｃｏｔｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８３、２９５９−２９６３、１９８６；Ｌｌｏ
ｙｄ・Ｈ．Ｓｍｉｔｈ他、Ｈｕｍａｎ・Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ（Ａｎｔｈｏｎｙ・Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕｓｋａｓ
編、ｐ１２１−１５８、１９８７、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋａｒｏｌ
・Ｓｉｋｏｒａ、Ｈｕｍａｎ・Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ａ
ｎｔｈｏｎｙ・Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕｓｋａｓ編、ｐ１
５９−１８１、１９８７、Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ
−Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ）；Ａｎｔｈｏｎｙ・
Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕｓｋａｓ他、Ｈｕｍａｎ・Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ（Ａｎｔｈｏｎｙ・Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕ
ｓｋａｓ編、ｐ２２７−２５１、１９８７、Ｍａｒｃｅ
ｌ−Ｄｅｋｋｅｒ−Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ）；Ｔ
ｈｏｍａｓ・Ｂ．Ｋｊｅｌｄｓｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ・
Ｒｅｓ．、４８、３２０８−３２１４、１９８８）、臨
床的に実用化できた例はまだない。
体を用いれば、ヒトに対する安全性は格段に向上し、体
内診断薬あるいは治療薬としては理想的な薬剤である。
しかしながら、ヒト型モノクローナル抗体を作製する技
術は非常に難しく、癌と反応するヒト型モノクローナル
抗体を安定的にかつ大量に取得する試みは種々行われて
いるが（Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７９，５６６６−５６７
０，１９８２；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ他、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４，２４１
６−２４２０，１９８７；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．Ｃｏｔ
ｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、８０、２０２６−２０３０、１９８３；Ｓｕｓａｎ
・Ｐ．Ｃ．Ｃｏｌｅ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４
４、２７５０−２７５３、１９８４；Ｍａｒｔｉｎ・
Ｖ．Ｈａｓｐｅｌ他、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４５、
３９５１−３９６１、１９８５；Ｒｉｃｈａｒｄ・Ｊ．
Ｃｏｔｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８３、２９５９−２９６３、１９８６；Ｌｌｏ
ｙｄ・Ｈ．Ｓｍｉｔｈ他、Ｈｕｍａｎ・Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ（Ａｎｔｈｏｎｙ・Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕｓｋａｓ
編、ｐ１２１−１５８、１９８７、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋａｒｏｌ
・Ｓｉｋｏｒａ、Ｈｕｍａｎ・Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ａ
ｎｔｈｏｎｙ・Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕｓｋａｓ編、ｐ１
５９−１８１、１９８７、Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ
−Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ）；Ａｎｔｈｏｎｙ・
Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕｓｋａｓ他、Ｈｕｍａｎ・Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ（Ａｎｔｈｏｎｙ・Ｊ．Ｓｔｒｅｌｋａｕ
ｓｋａｓ編、ｐ２２７−２５１、１９８７、Ｍａｒｃｅ
ｌ−Ｄｅｋｋｅｒ−Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ）；Ｔ
ｈｏｍａｓ・Ｂ．Ｋｊｅｌｄｓｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ・
Ｒｅｓ．、４８、３２０８−３２１４、１９８８）、臨
床的に実用化できた例はまだない。
【０００６】また、癌の中でも肺癌による死亡者数が急
激に増加しており、かつ手術後の５年生存率も非常に低
く、肺癌の診断・治療法が臨床の現場で強く望まれてい
る。肺癌の癌マーカーとして、肺腺癌の場合はシアリル
ルイスＸ（ｓｉａｌｙｌ・Ｌｅｗｉｓ・Ｘ；ＳＬＸ）、
肺扁平上皮癌の場合はスクワマスセルカルシノーマ抗原
（ｓｑｕａｍｏｕｓ・ｃｅｌｌ・ｃａｒｃｉｎｏｍａ・
ａｎｔｉｇｅｎ；ＳＣＣ）、肺小細胞癌の場合はニュー
ロン特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ・ｅｎｏｌａｓｅ；ＮＳＥ）、肺癌全体としては癌胎
児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ・ａｎｔ
ｉｇｅｎ；ＣＥＡ）などが多く用いられているが（有吉
寛、モダン・フィジシャン、１２、９８１−９８５、１
９９２）、必ずしも満足のいくものではなく、しかもそ
れらの診断薬で用いられる抗体は、すべてマウス型モノ
クローナル抗体であり、体内診断薬や治療薬に使用する
ことは副作用の危険性から考えて好ましくはない。
激に増加しており、かつ手術後の５年生存率も非常に低
く、肺癌の診断・治療法が臨床の現場で強く望まれてい
る。肺癌の癌マーカーとして、肺腺癌の場合はシアリル
ルイスＸ（ｓｉａｌｙｌ・Ｌｅｗｉｓ・Ｘ；ＳＬＸ）、
肺扁平上皮癌の場合はスクワマスセルカルシノーマ抗原
（ｓｑｕａｍｏｕｓ・ｃｅｌｌ・ｃａｒｃｉｎｏｍａ・
ａｎｔｉｇｅｎ；ＳＣＣ）、肺小細胞癌の場合はニュー
ロン特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ・ｓｐｅｃｉｆｉ
ｃ・ｅｎｏｌａｓｅ；ＮＳＥ）、肺癌全体としては癌胎
児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ・ａｎｔ
ｉｇｅｎ；ＣＥＡ）などが多く用いられているが（有吉
寛、モダン・フィジシャン、１２、９８１−９８５、１
９９２）、必ずしも満足のいくものではなく、しかもそ
れらの診断薬で用いられる抗体は、すべてマウス型モノ
クローナル抗体であり、体内診断薬や治療薬に使用する
ことは副作用の危険性から考えて好ましくはない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、肺癌に対して
特異性の高く、かつ肺癌細胞の細胞膜抗原と反応するヒ
ト型モノクローナル抗体を開発し、肺癌の診断・治療に
用いることが本発明の目的である。
特異性の高く、かつ肺癌細胞の細胞膜抗原と反応するヒ
ト型モノクローナル抗体を開発し、肺癌の診断・治療に
用いることが本発明の目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、肺癌細胞株の細胞膜抗原と反応し、免疫組織染
色において肺癌組織と反応し、肺癌患者体液中成分と反
応し、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を示し、か
つ、担癌マウスを用いた、癌部への集積性実験で陽性か
つ癌部の縮退を引き起こすことを特徴とするヒト型モノ
クローナル抗体を見いだし、本発明を完成した。
の結果、肺癌細胞株の細胞膜抗原と反応し、免疫組織染
色において肺癌組織と反応し、肺癌患者体液中成分と反
応し、補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を示し、か
つ、担癌マウスを用いた、癌部への集積性実験で陽性か
つ癌部の縮退を引き起こすことを特徴とするヒト型モノ
クローナル抗体を見いだし、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明によるヒト型モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマは、試験管内刺激したヒト
リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合により作成され
たものであり、このヒト型モノクローナル抗体は、肺腺
癌細胞株Ａ５４９の細胞膜抗原と反応し、肺腺癌・肺扁
平上皮癌組織切片と反応し、肺癌（肺腺癌、肺扁平上皮
癌および肺小細胞癌）患者血漿検体と反応し、肺腺癌細
胞株Ａ５４９に対する補体依存性細胞障害活性を示し、
さらにインビボ（ｉｎ・ｖｉｖｏ）実験で、すなわち肺
癌細胞株Ａ５４９を移植して、腫瘍を形成せしめた重症
複合免疫不全マウス（ｓｅｖｅｒｅ・ｃｏｍｂｉｎｅｄ
・ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ・ｍｏｕｓｅ；Ｓ
ＣＩＤ）を用いた体内動態実験で、抗体の集積性が陽性
かつ腫瘍の縮退を引き起こす性質を有し、抗体クラスお
よび軽鎖はＩｇＭでλ鎖であるヒト型モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ２８Ｋ２９および当該ヒト型モノ
クローナル抗体を見出した。
ナル抗体産生ハイブリドーマは、試験管内刺激したヒト
リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合により作成され
たものであり、このヒト型モノクローナル抗体は、肺腺
癌細胞株Ａ５４９の細胞膜抗原と反応し、肺腺癌・肺扁
平上皮癌組織切片と反応し、肺癌（肺腺癌、肺扁平上皮
癌および肺小細胞癌）患者血漿検体と反応し、肺腺癌細
胞株Ａ５４９に対する補体依存性細胞障害活性を示し、
さらにインビボ（ｉｎ・ｖｉｖｏ）実験で、すなわち肺
癌細胞株Ａ５４９を移植して、腫瘍を形成せしめた重症
複合免疫不全マウス（ｓｅｖｅｒｅ・ｃｏｍｂｉｎｅｄ
・ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ・ｍｏｕｓｅ；Ｓ
ＣＩＤ）を用いた体内動態実験で、抗体の集積性が陽性
かつ腫瘍の縮退を引き起こす性質を有し、抗体クラスお
よび軽鎖はＩｇＭでλ鎖であるヒト型モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ２８Ｋ２９および当該ヒト型モノ
クローナル抗体を見出した。
【００１０】本発明のヒト型モノクローナル抗体は該ヒ
ト型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体
断片、または該ヒト型モノクローナル抗体あるいは該ヒ
ト型モノクローナル抗体断片に、例えば放射性同位元素
（ＲＩ）、常磁性物質、光感受性物質、毒素または抗癌
物質などを結合させた免疫複合体などを有効成分とする
肺癌治療法・肺癌診断法に用いることが可能となり、ヒ
トに対してより安全な治療薬・診断薬を提供し得るもの
であることを見出した。
ト型モノクローナル抗体、該ヒト型モノクローナル抗体
断片、または該ヒト型モノクローナル抗体あるいは該ヒ
ト型モノクローナル抗体断片に、例えば放射性同位元素
（ＲＩ）、常磁性物質、光感受性物質、毒素または抗癌
物質などを結合させた免疫複合体などを有効成分とする
肺癌治療法・肺癌診断法に用いることが可能となり、ヒ
トに対してより安全な治療薬・診断薬を提供し得るもの
であることを見出した。
【００１１】本発明は、上記の知見に基づいて完成され
たもので、工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２８Ｋ２９、工業技術院生命工学工
業研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４１１９号で寄託さ
れた細胞の特性を有するハイブリドーマ２８Ｋ２９が産
生するヒト型モノクローナル抗体、当該ヒト型モノクロ
ーナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を
主成分とする癌検査薬、および当該ヒト型モノクローナ
ル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を成分
とする癌治療薬である。
たもので、工業技術院生命工学工業研究所に受託番号Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞の特性を有
するハイブリドーマ２８Ｋ２９、工業技術院生命工学工
業研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１４１１９号で寄託さ
れた細胞の特性を有するハイブリドーマ２８Ｋ２９が産
生するヒト型モノクローナル抗体、当該ヒト型モノクロ
ーナル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を
主成分とする癌検査薬、および当該ヒト型モノクローナ
ル抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を成分
とする癌治療薬である。
【００１２】特に好適には、以下の特性を有する抗原： （１）該抗原は上記ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産生す
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺小細胞癌株ＰＣ−６株の細胞抽出物中
に含まれ、かつ還元および非還元下でのＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動上で主要なバンドとして、分子量
が約５０万〜約８０万の位置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞膜上に存
在し： （４）該抗原が肺癌患者体液中に存在する： （５）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する：を認識し
てなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体および当該Ｉｇ
Ｍヒト型モノクローナル抗体産生能を有するハイブリド
ーマ２８Ｋ２９である。
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺小細胞癌株ＰＣ−６株の細胞抽出物中
に含まれ、かつ還元および非還元下でのＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動上で主要なバンドとして、分子量
が約５０万〜約８０万の位置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞膜上に存
在し： （４）該抗原が肺癌患者体液中に存在する： （５）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する：を認識し
てなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体および当該Ｉｇ
Ｍヒト型モノクローナル抗体産生能を有するハイブリド
ーマ２８Ｋ２９である。
【００１３】以下に、本発明について詳しく説明する
が、特に限定されるものではない。本発明は、肺癌と反
応する新規なヒト型モノクローナル抗体を作製すること
にあり、たとえば、次のようにして得ることができる。
すなわち、肺癌患者所属リンパ節をハサミで細切し、ガ
ーゼで不溶部分を除去し、低速遠心することにより、患
者の体内で癌細胞に感作された抗体産生細胞（Ｂ細胞）
を含むリンパ球を集める。これらの回収されたリンパ球
を細胞活性化因子、たとえばリポ多糖、レクチンあるい
は黄色ブドウ球菌死菌を含む培養液中で、５％炭酸ガス
存在下、３７℃で約３日〜約８日間培養を継続する。
が、特に限定されるものではない。本発明は、肺癌と反
応する新規なヒト型モノクローナル抗体を作製すること
にあり、たとえば、次のようにして得ることができる。
すなわち、肺癌患者所属リンパ節をハサミで細切し、ガ
ーゼで不溶部分を除去し、低速遠心することにより、患
者の体内で癌細胞に感作された抗体産生細胞（Ｂ細胞）
を含むリンパ球を集める。これらの回収されたリンパ球
を細胞活性化因子、たとえばリポ多糖、レクチンあるい
は黄色ブドウ球菌死菌を含む培養液中で、５％炭酸ガス
存在下、３７℃で約３日〜約８日間培養を継続する。
【００１４】その後、活性化されたリンパ球と融合親
株、たとえばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ・Ｃ
ＲＬ・１５８０）やＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ・
ＣＲＬ・１５８１）などのマウスミエローマ細胞親株あ
るいはＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１６６８）
やＳＨＭ−Ｄ３６などのヒトーマウスヘテロミエローマ
細胞親株との細胞融合、たとえば電気的細胞融合法、ポ
リエチレングリコール法あるいはセイダイウィルス法に
より、融合細胞すなわちハイブリドーマを作製する。即
ち、該リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合を行う。
株、たとえばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ・Ｃ
ＲＬ・１５８０）やＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ・
ＣＲＬ・１５８１）などのマウスミエローマ細胞親株あ
るいはＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１６６８）
やＳＨＭ−Ｄ３６などのヒトーマウスヘテロミエローマ
細胞親株との細胞融合、たとえば電気的細胞融合法、ポ
リエチレングリコール法あるいはセイダイウィルス法に
より、融合細胞すなわちハイブリドーマを作製する。即
ち、該リンパ球とミエローマ細胞との細胞融合を行う。
【００１５】例えば、該リンパ球とミエローマ細胞を、
１０：１〜１：１０、好ましくは、２：１〜１：１の比
率で混合し、等張液のソルビトール溶液（２８０ｍＭソ
ルビトール、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢
酸マグネシウム、０．１％牛血清アルブミン）で１回洗
浄した後、低張ソルビトール溶液（７０ｍＭソルビトー
ル、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネ
シウム、０．１％牛血清アルブミン）に混合した細胞を
再浮遊させ、５分後に、１．０ＫＶ／ｃｍ、１５マイク
ロ秒の電気パルスを印加することにより、電気的細胞融
合（Ｆｏｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、１３４、３５−４２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒ
ｍａｎｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、１３４、４３−５０、１９９０）を行えばよい。
１０：１〜１：１０、好ましくは、２：１〜１：１の比
率で混合し、等張液のソルビトール溶液（２８０ｍＭソ
ルビトール、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢
酸マグネシウム、０．１％牛血清アルブミン）で１回洗
浄した後、低張ソルビトール溶液（７０ｍＭソルビトー
ル、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネ
シウム、０．１％牛血清アルブミン）に混合した細胞を
再浮遊させ、５分後に、１．０ＫＶ／ｃｍ、１５マイク
ロ秒の電気パルスを印加することにより、電気的細胞融
合（Ｆｏｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、１３４、３５−４２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒ
ｍａｎｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、１３４、４３−５０、１９９０）を行えばよい。
【００１６】電気パルス印加後、５分後に、低速遠心に
より低張ソルビトール液を除去し、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地に１０5 ｃ
ｅｌｌ〜１０ｘ１０5 ｃｅｌｌ／ｍｌになるように再浮
遊させ、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注
する。当該９６穴プレートを３７℃、ＣＯ2 インキュベ
ーターで、適宜培養状態を観察して２〜６週間培養を継
続し（例えば、富山朔二・安東民衛編；単クローン抗体
実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、１９８
７年）、この培養の間に、光学顕微鏡的あるいは肉眼的
に細胞の集落（コロニー）が観察できたウェルに関し
て、それらの培養上清液を採取し、培養上清液中のヒト
型抗体の活性の検定および癌細胞株、たとえば肺癌腺癌
株Ａ５４９（ＡＴＣＣ・ＣＣＬ・１８５）との反応性の
検定を、たとえば酵素免疫測定法により行い、さらに肺
癌細胞株を用いた蛍光抗体法および肺癌組織を用いた免
疫組織化学法により、陽性ウェルの選別をする。
より低張ソルビトール液を除去し、ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）選択培地に１０5 ｃ
ｅｌｌ〜１０ｘ１０5 ｃｅｌｌ／ｍｌになるように再浮
遊させ、９６穴プレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注
する。当該９６穴プレートを３７℃、ＣＯ2 インキュベ
ーターで、適宜培養状態を観察して２〜６週間培養を継
続し（例えば、富山朔二・安東民衛編；単クローン抗体
実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、１９８
７年）、この培養の間に、光学顕微鏡的あるいは肉眼的
に細胞の集落（コロニー）が観察できたウェルに関し
て、それらの培養上清液を採取し、培養上清液中のヒト
型抗体の活性の検定および癌細胞株、たとえば肺癌腺癌
株Ａ５４９（ＡＴＣＣ・ＣＣＬ・１８５）との反応性の
検定を、たとえば酵素免疫測定法により行い、さらに肺
癌細胞株を用いた蛍光抗体法および肺癌組織を用いた免
疫組織化学法により、陽性ウェルの選別をする。
【００１７】具体的には、増殖したウェルから再度培養
上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性
の検討を行う（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８２）。すなわ
ち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４
０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハムＦ１２培地を２：
１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａｉｈａｒａ他、Ｉ
ｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，９５９−９６２，
１９８８）中で、９６穴の細胞培養用マイクロプレート
でサブコンフルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５
４９細胞をリン酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ・ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ緩衝液）
で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒド添加ＰＢ
Ｓ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１５分間静置
する。
上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性
の検討を行う（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８２）。すなわ
ち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４
０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハムＦ１２培地を２：
１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａｉｈａｒａ他、Ｉ
ｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，９５９−９６２，
１９８８）中で、９６穴の細胞培養用マイクロプレート
でサブコンフルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５
４９細胞をリン酸緩衝液生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ・ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ緩衝液）
で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒド添加ＰＢ
Ｓ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１５分間静置
する。
【００１８】１５分後、０．０５％ツイーン２０（Ｔｗ
ｅｅｎ２０）添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血
清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加え
て、室温、一時間ブロッキングする。ブロッキング後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄
し、培養上清液を５０μｌずつ分注する。室温、３時間
反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢ
Ｓ緩衝液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファタ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
（タゴ社）を１００μｌずつ分注し、室温、一時間反応
させる。
ｅｅｎ２０）添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血
清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加え
て、室温、一時間ブロッキングする。ブロッキング後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄
し、培養上清液を５０μｌずつ分注する。室温、３時間
反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢ
Ｓ緩衝液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファタ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
（タゴ社）を１００μｌずつ分注し、室温、一時間反応
させる。
【００１９】反応後、三回洗浄し、アルカリフォスファ
ターゼ発色基質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注
し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ・水酸化
ナトリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸光
度を測定し、肺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性を調べ
る。
ターゼ発色基質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフ
ォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩
化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注
し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ・水酸化
ナトリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止さ
せ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸光
度を測定し、肺癌細胞株Ａ５４９細胞との反応性を調べ
る。
【００２０】また、肺癌組織を用いて、免疫組織化学的
検定をあわせて行う。すなわち、フォルマリン固定法、
アメックス（ＡＭｅＸ）包埋法（Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａ
ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２５、４３１−４３５、１
９８６；Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、
１４０、７７５−７７９、１９９２）および新鮮凍結切
片法の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫
組織化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行う。
検定をあわせて行う。すなわち、フォルマリン固定法、
アメックス（ＡＭｅＸ）包埋法（Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａ
ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２５、４３１−４３５、１
９８６；Ｓａｔｏ、Ｙ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、
１４０、７７５−７７９、１９９２）および新鮮凍結切
片法の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫
組織化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行う。
【００２１】脱パラフィンは、フォルマリン固定組織切
片の場合はキシレン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋
法組織切片の場合はキシレン、アセトン系列で行った。
新鮮凍結組織切片および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織
切片は、ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄後、４％パラフォルム
アルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室
温２０分間固定をする。脱パラフィンしたフォルマリン
固定スライドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新
鮮凍結切片スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライド
はＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室
温１５分間ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山
信彦他、日消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａ
ｍａ、Ｎ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、
２４、５８１、１９８９）により行う。
片の場合はキシレン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋
法組織切片の場合はキシレン、アセトン系列で行った。
新鮮凍結組織切片および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織
切片は、ＰＢＳ緩衝液で一回洗浄後、４％パラフォルム
アルデヒド（０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室
温２０分間固定をする。脱パラフィンしたフォルマリン
固定スライドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新
鮮凍結切片スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライド
はＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室
温１５分間ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山
信彦他、日消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａ
ｍａ、Ｎ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、
２４、５８１、１９８９）により行う。
【００２２】すなわち、予めヒト型抗体を含む培養上清
液サンプルと４００分の一量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の一量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温一時間さらに反応させる。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％ジアミノベンジジン、０．００５％
過酸化水素水、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．６）で
５分間発色させる。
液サンプルと４００分の一量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の一量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温一時間さらに反応させる。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％ジアミノベンジジン、０．００５％
過酸化水素水、５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．６）で
５分間発色させる。
【００２３】発色後、水で洗浄し、３倍希釈のハリスヘ
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行う。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノール（２
回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キシレ
ン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会社）
で封入する。封入した組織切片スライドを光学顕微鏡的
な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と特異
的に反応するヒト型抗体の選別をする。
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行う。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％エ
タノール、９０％エタノール、１００％エタノール（２
回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キシレ
ン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会社）
で封入する。封入した組織切片スライドを光学顕微鏡的
な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と特異
的に反応するヒト型抗体の選別をする。
【００２４】また、蛍光抗体法による選別は下記の如く
行えばよい。即ち、細胞培養用フラスコ（Ｆ７５）を用
いて、１０％牛胎児血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中
で、サブコンフルエント状態まで増殖させた肺腺癌細胞
株Ａ５４９細胞を０．０２％エチレンジアミン４酢酸２
ナトリウム（ＥＤＴＡ）添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、
付着細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠
心にて細胞を回収する。
行えばよい。即ち、細胞培養用フラスコ（Ｆ７５）を用
いて、１０％牛胎児血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中
で、サブコンフルエント状態まで増殖させた肺腺癌細胞
株Ａ５４９細胞を０．０２％エチレンジアミン４酢酸２
ナトリウム（ＥＤＴＡ）添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、
付着細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠
心にて細胞を回収する。
【００２５】回収したＡ５４９細胞２ｘ１０5 個に対し
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させる。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させる。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行えばよい。
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させる。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させる。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行えばよい。
【００２６】このようにして肺癌と反応するヒト型モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを容易に得る
ことができ、該ハイブリドーマは限界希釈法によるクロ
ーニングを２ないし３回繰り返すことにより、ヒト型モ
ノクローナル抗体を安定的に生産するハイブリドーマの
株として樹立できる。この際、ヒト型モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを選択するに当たって、用いる培
地としてはハイブリドーマが生育し、増殖し得る培地で
あれば特に限定されるものではなく、例えばＲＰＭＩ１
６４０培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、
イスコフ培地、ＧＩＴ培地（日本製薬）やＲＤＦ培地
（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハム
Ｆ１２培地を２：１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａ
ｉｈａｒａ他、Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，
９５９−９６２，１９８８）などに牛胎児血清を１〜２
０％添加した培地あるいは無血清培地、例えばＨＹＢＲ
ＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、ノンセラム培
地（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などが
挙げられる。
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを容易に得る
ことができ、該ハイブリドーマは限界希釈法によるクロ
ーニングを２ないし３回繰り返すことにより、ヒト型モ
ノクローナル抗体を安定的に生産するハイブリドーマの
株として樹立できる。この際、ヒト型モノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを選択するに当たって、用いる培
地としてはハイブリドーマが生育し、増殖し得る培地で
あれば特に限定されるものではなく、例えばＲＰＭＩ１
６４０培地、ダルベッコＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、
イスコフ培地、ＧＩＴ培地（日本製薬）やＲＤＦ培地
（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培地：ハム
Ｆ１２培地を２：１：１の割合で混合した培地；Ｋ．Ａ
ｉｈａｒａ他、Ｉｎ・Ｖｉｔｒｏ・Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４，
９５９−９６２，１９８８）などに牛胎児血清を１〜２
０％添加した培地あるいは無血清培地、例えばＨＹＢＲ
ＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）、ノンセラム培
地（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などが
挙げられる。
【００２７】最終的には、工業的な抗体生産法に結び付
けるため、これらのハイブリドーマを無血清培地、例え
ば上記ハイブリドーマ−ＳＦＭ（商標名：ＨＹＢＲＩＤ
ＯＭＡ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ社）培地、ノンセラム培地
（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などの無
血清培地に順化し、無血清培養が可能なハイブリドーマ
株とする。以上のような方法により、肺癌と反応するヒ
ト型モノクローナル抗体を取得することができる。
けるため、これらのハイブリドーマを無血清培地、例え
ば上記ハイブリドーマ−ＳＦＭ（商標名：ＨＹＢＲＩＤ
ＯＭＡ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ社）培地、ノンセラム培地
（国際試薬）やＳＦＭ１０１培地（日水製薬）などの無
血清培地に順化し、無血清培養が可能なハイブリドーマ
株とする。以上のような方法により、肺癌と反応するヒ
ト型モノクローナル抗体を取得することができる。
【００２８】上記の種々の選別法により選別したヒト型
モノクローナル抗体の中から、肺癌とより良く反応する
ヒト型モノクローナルを選び出し、該ヒト型モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを２８Ｋ２９（工業
技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４１１９号として寄託した）と命名した。該ハイブリド
ーマが産生するヒト型モノクローナル抗体の調製は以下
の手順に従って行えば良い。
モノクローナル抗体の中から、肺癌とより良く反応する
ヒト型モノクローナルを選び出し、該ヒト型モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを２８Ｋ２９（工業
技術院生命工学工業研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
４１１９号として寄託した）と命名した。該ハイブリド
ーマが産生するヒト型モノクローナル抗体の調製は以下
の手順に従って行えば良い。
【００２９】即ち、ヒト型モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを移植し上記した如くの常法の培地を用いて
培養するもので、例えば３７℃、５％ＣＯ2 インキュベ
ーターにいれて、１週間〜６週間培養する。次いで培養
物を回収し、適宜の吸着カラム、例えばハイドロキシア
パタイトカラムを用いて吸着、溶出して単離、回収し、
適宜、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトにて精製す
れば良い。
ブリドーマを移植し上記した如くの常法の培地を用いて
培養するもので、例えば３７℃、５％ＣＯ2 インキュベ
ーターにいれて、１週間〜６週間培養する。次いで培養
物を回収し、適宜の吸着カラム、例えばハイドロキシア
パタイトカラムを用いて吸着、溶出して単離、回収し、
適宜、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトにて精製す
れば良い。
【００３０】例えば、培養上清液をハイドロキシアパタ
イトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０Ｃ−直径２
１．５ｍｍｘ１００ｍｍ、旭光学工業株式会社）に直接
負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラムに吸着さ
せ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で十分に洗浄
した後、４０ｍＭ〜４００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗体部分を約
３００ｍＭ付近で溶出させればよく、適宜安定化剤、例
えばグリセリンや糖類を添加して凍結乾燥品としてもよ
い。
イトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０Ｃ−直径２
１．５ｍｍｘ１００ｍｍ、旭光学工業株式会社）に直接
負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラムに吸着さ
せ、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で十分に洗浄
した後、４０ｍＭ〜４００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗体部分を約
３００ｍＭ付近で溶出させればよく、適宜安定化剤、例
えばグリセリンや糖類を添加して凍結乾燥品としてもよ
い。
【００３１】本発明によるヒト型モノクローナル抗体を
用いた癌検査薬としては、ＲＩＡ，ＥＩＡなどの免疫化
学的癌検査薬、病理組織標本を使用する病理診断薬など
の体外診断薬とともに、ＲＩ（放射性同位元素）や常磁
性物質などを結合標識させ患者の体内に投与し、例えば
γ−カメラあるいはＭＲＩ（核磁気共鳴イメージング）
装置などにて腫瘍部を描出する体内診断薬が含まれる。
用いた癌検査薬としては、ＲＩＡ，ＥＩＡなどの免疫化
学的癌検査薬、病理組織標本を使用する病理診断薬など
の体外診断薬とともに、ＲＩ（放射性同位元素）や常磁
性物質などを結合標識させ患者の体内に投与し、例えば
γ−カメラあるいはＭＲＩ（核磁気共鳴イメージング）
装置などにて腫瘍部を描出する体内診断薬が含まれる。
【００３２】ヒト型モノクローナル抗体は、例えばペプ
シン処理などにより抗体断片としたものでも良く、例え
ば以下の如く行えば容易に得ることができる。即ち、精
製したヒト型モノクローナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．０）に対して４℃、１６時間透析し、最終的に５０
μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃度に調製する。当該緩衝液に
溶解したペプシン（シグマ社）を重量比で抗体に対して
２５分の１の量比で添加し、３２℃、６０分間反応さ
せ、６０分後、酵素反応は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．２）を体積比で反応液に対して５分の１量を
添加して停止させる。
シン処理などにより抗体断片としたものでも良く、例え
ば以下の如く行えば容易に得ることができる。即ち、精
製したヒト型モノクローナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．０２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４．０）に対して４℃、１６時間透析し、最終的に５０
μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃度に調製する。当該緩衝液に
溶解したペプシン（シグマ社）を重量比で抗体に対して
２５分の１の量比で添加し、３２℃、６０分間反応さ
せ、６０分後、酵素反応は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．２）を体積比で反応液に対して５分の１量を
添加して停止させる。
【００３３】ペプシン消化検体を５００μｌづつ、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）にてゲル濾過分離を行う。カラ
ムの平衡緩衝液及び溶出緩衝液は例えば０．１５Ｍ塩化
ナトリウム添加０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、２８
０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出をする。
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）にてゲル濾過分離を行う。カラ
ムの平衡緩衝液及び溶出緩衝液は例えば０．１５Ｍ塩化
ナトリウム添加０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、２８
０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出をする。
【００３４】ゲル濾過的分子量が約１３万付近のピーク
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認し、ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドを確認する。このゲル濾過的な分子量
で約１３万のピーク部分をプールして、精製Ｆ（ａ
ｂ’）２として用いれば良い。
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認し、ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドを確認する。このゲル濾過的な分子量
で約１３万のピーク部分をプールして、精製Ｆ（ａ
ｂ’）２として用いれば良い。
【００３５】例えば、ＥＩＡによる癌検査薬としては、
以下の如く行えば良い。精製したヒト型モノクローナル
抗体または抗体断片を５０ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に懸濁し、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（１ｍｇ／
ｍｌ水、ピアース社）を加えて、氷中で、２時間反応さ
せる。反応後、未反応ビオチンを除去するため、セント
リコン−３０（ミリポア社、アメリカ）で１０００ｇ、
３０分間遠心し、１５０ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％
アジ化ナトリウム添加１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、
同様に遠心操作をする。この操作を３度行い、最終的に
１５０ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％アジ化ナトリウム
添加１０ｍＭリン酸緩衝液に置換し、ビオチン化標識抗
体を容易に得ることができる。
以下の如く行えば良い。精製したヒト型モノクローナル
抗体または抗体断片を５０ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に懸濁し、ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（１ｍｇ／
ｍｌ水、ピアース社）を加えて、氷中で、２時間反応さ
せる。反応後、未反応ビオチンを除去するため、セント
リコン−３０（ミリポア社、アメリカ）で１０００ｇ、
３０分間遠心し、１５０ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％
アジ化ナトリウム添加１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、
同様に遠心操作をする。この操作を３度行い、最終的に
１５０ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％アジ化ナトリウム
添加１０ｍＭリン酸緩衝液に置換し、ビオチン化標識抗
体を容易に得ることができる。
【００３６】他方、固相化用抗体として、未標識ヒト型
モノクローナル抗体または抗体断片を３０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ８．８）で１μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルあ
たり５０μｌづつ分注する。４℃、１８時間静置した
後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回
洗浄し、５％スキムミルク添加ＰＢＳ緩衝液で室温、３
時間ブロッキングする。 ブロッキング後、０．０２％
Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、例えば
血漿検体などを０．２％牛血清アルブミンと０．０２％
Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ緩衝液で１０倍に希釈
し、５０μｌづつ分注する。室温で２時間後、０．０２
％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．
５％スキムミルクと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢ
Ｓ緩衝液で５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識ヒト型
モノクローナル抗体液を５０μｌづつ分注する。
モノクローナル抗体または抗体断片を３０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ８．８）で１μｇ／ｍｌに希釈し、ウェルあ
たり５０μｌづつ分注する。４℃、１８時間静置した
後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回
洗浄し、５％スキムミルク添加ＰＢＳ緩衝液で室温、３
時間ブロッキングする。 ブロッキング後、０．０２％
Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、例えば
血漿検体などを０．２％牛血清アルブミンと０．０２％
Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ緩衝液で１０倍に希釈
し、５０μｌづつ分注する。室温で２時間後、０．０２
％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．
５％スキムミルクと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢ
Ｓ緩衝液で５μｇ／ｍｌに希釈したビオチン標識ヒト型
モノクローナル抗体液を５０μｌづつ分注する。
【００３７】室温で２時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５０
０倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプト
アビジン（ジャクソン社）を５０μｌづつ分注した。室
温で１時間後、アルカリフォスファターゼ発色基質液
（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１
Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、
ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間
発色させる。
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５０
０倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプト
アビジン（ジャクソン社）を５０μｌづつ分注した。室
温で１時間後、アルカリフォスファターゼ発色基質液
（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１
Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、
ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間
発色させる。
【００３８】発色後、１Ｎ水酸化ナトリウム液を１００
μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレート
リーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、肺癌患者
血漿中の抗原量を定量測定すれば良い。また、例えばＲ
Ｉ標識ヒト型抗体を用いた体内検査薬としては以下の如
く行えば良い。ＲＩとしては、例えばＩｎ−１１１、Ｔ
ｃ−９９ｍ、Ｉ−１３１やＩ−１２３等が挙げられる。
ＲＩによる抗体標識法としてはジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅ
ｎｔａａｃｅｔｉｃ・ａｃｉｄ；ＤＴＰＡ）等のキレー
ト化合物を用いるキレート法やシュヴァルツ（Ｓｃｈｗ
ａｒｔｚ）法（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３１，６９２
−６９７，１９９０）などがあるが特に限定されるもの
ではなく、当業者にとり容易で有れば何等問題はない。
投与するＲＩ標識ヒト型モノクローナル抗体の量は、患
者の年齢、症状、体重等によって異なるが、ヒトを含む
哺乳動物に対し、標識抗体約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、
好ましくは非標識抗体０ｍｇ〜１００ｍｇとともに、例
えば静注投与すれば良い。投与後、約１日〜約１０日目
にγ−カメラにて、撮像し、癌部を描出すれば良い。
μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレート
リーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、肺癌患者
血漿中の抗原量を定量測定すれば良い。また、例えばＲ
Ｉ標識ヒト型抗体を用いた体内検査薬としては以下の如
く行えば良い。ＲＩとしては、例えばＩｎ−１１１、Ｔ
ｃ−９９ｍ、Ｉ−１３１やＩ−１２３等が挙げられる。
ＲＩによる抗体標識法としてはジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅ
ｎｔａａｃｅｔｉｃ・ａｃｉｄ；ＤＴＰＡ）等のキレー
ト化合物を用いるキレート法やシュヴァルツ（Ｓｃｈｗ
ａｒｔｚ）法（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３１，６９２
−６９７，１９９０）などがあるが特に限定されるもの
ではなく、当業者にとり容易で有れば何等問題はない。
投与するＲＩ標識ヒト型モノクローナル抗体の量は、患
者の年齢、症状、体重等によって異なるが、ヒトを含む
哺乳動物に対し、標識抗体約０．１ｍｇ〜約４０ｍｇ、
好ましくは非標識抗体０ｍｇ〜１００ｍｇとともに、例
えば静注投与すれば良い。投与後、約１日〜約１０日目
にγ−カメラにて、撮像し、癌部を描出すれば良い。
【００３９】本発明によるヒト型モノクローナル抗体を
用いた癌治療薬としては、ヒト癌細胞に対して補体依存
性細胞障害（ＣＤＣ）活性を示すため、単独投与で良
い。それ以外に、ヒト型モノクローナル抗体またはその
抗体断片を用いる場合、毒性物質、例えば、毒素蛋白
質、ＲＩ、抗癌剤等を結合させた免疫複合体とした形態
でも十分に有効である。毒素蛋白質としては、例えばリ
シン、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子等が挙げられ、Ｒ
Ｉとしては、例えばＩ−１３１、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８
６等が挙げられ、抗癌剤としては、例えばアドリアマイ
シン、ビンクリスチン、ドクソルーブシン等がそれぞれ
挙げられる。
用いた癌治療薬としては、ヒト癌細胞に対して補体依存
性細胞障害（ＣＤＣ）活性を示すため、単独投与で良
い。それ以外に、ヒト型モノクローナル抗体またはその
抗体断片を用いる場合、毒性物質、例えば、毒素蛋白
質、ＲＩ、抗癌剤等を結合させた免疫複合体とした形態
でも十分に有効である。毒素蛋白質としては、例えばリ
シン、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子等が挙げられ、Ｒ
Ｉとしては、例えばＩ−１３１、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８
６等が挙げられ、抗癌剤としては、例えばアドリアマイ
シン、ビンクリスチン、ドクソルーブシン等がそれぞれ
挙げられる。
【００４０】ヒト型モノクローナル抗体単独投与による
癌の治療は以下の如くにすれば良い。本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体は、単独でまたは一種以上の製剤上許
容される補助剤とともに抗腫瘍剤として用いることがで
きる。例えば、ヒト型モノクローナル抗体を、生理食塩
水やマンニトール等の糖類等の水溶液に溶解して適当な
癌治療薬とすれば良い。または、ヒト型モノクローナル
抗体を常法により粉末注射剤としても良い。
癌の治療は以下の如くにすれば良い。本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体は、単独でまたは一種以上の製剤上許
容される補助剤とともに抗腫瘍剤として用いることがで
きる。例えば、ヒト型モノクローナル抗体を、生理食塩
水やマンニトール等の糖類等の水溶液に溶解して適当な
癌治療薬とすれば良い。または、ヒト型モノクローナル
抗体を常法により粉末注射剤としても良い。
【００４１】投与するヒト型モノクローナル抗体の量
は、患者の年齢、症状、体重等によって異なるが、ヒト
を含む哺乳動物に対し、癌治療薬としてのヒト型モノク
ローナル抗体を約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日投
与する。投与は、常法に従って、一日一回（単回投与ま
たは連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、
３週間に一回静注や腫瘍内注射などにより行う。本癌治
療薬は、肺癌などの癌の治療に効果が期待される。
は、患者の年齢、症状、体重等によって異なるが、ヒト
を含む哺乳動物に対し、癌治療薬としてのヒト型モノク
ローナル抗体を約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日投
与する。投与は、常法に従って、一日一回（単回投与ま
たは連日投与）または間歇的に１週間に１〜３回、２、
３週間に一回静注や腫瘍内注射などにより行う。本癌治
療薬は、肺癌などの癌の治療に効果が期待される。
【００４２】
【実施例】つぎに実施例にもとづいて本発明を説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４３】
【実施例１】 肺癌組織と特異的に反応するヒト型モノクローナル抗体 （１）ヒトリンパ球の調製及び細胞融合 肺癌患者所属リンパ節を外科的手術により無菌的に摘出
し、冷ＲＰＭＩ１６４０培地中に浸し、ハサミでリンパ
節を細切し、二重のガーゼで不溶部分を除き、低速遠心
機で１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、リンパ球部分
を沈澱として集める。集めたリンパ球をＰＢＳ緩衝液に
再懸濁し、再度低速遠心機で１２００ＲＰＭ、１０分間
遠心して、リンパ球部分を沈澱として集め、リンパ球を
洗浄する。洗浄したリンパ球を１５％牛胎児血清添加Ｒ
ＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培
地：ＨａｍＦ１２培地＝２：１：１の割合で混合した培
地）に再懸濁し、細胞密度を４．２ｘ１０6細胞／ｍｌ
として、Ｂ細胞活性化因子である黄色フドウ球菌コウワ
ンＩ株死菌（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、アメリカ）を一
万分の一の濃度で添加したリンパ球液２ｍｌを６穴プレ
ートに分注した。
し、冷ＲＰＭＩ１６４０培地中に浸し、ハサミでリンパ
節を細切し、二重のガーゼで不溶部分を除き、低速遠心
機で１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、リンパ球部分
を沈澱として集める。集めたリンパ球をＰＢＳ緩衝液に
再懸濁し、再度低速遠心機で１２００ＲＰＭ、１０分間
遠心して、リンパ球部分を沈澱として集め、リンパ球を
洗浄する。洗浄したリンパ球を１５％牛胎児血清添加Ｒ
ＤＦ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地：ダルベッコＭＥＭ培
地：ＨａｍＦ１２培地＝２：１：１の割合で混合した培
地）に再懸濁し、細胞密度を４．２ｘ１０6細胞／ｍｌ
として、Ｂ細胞活性化因子である黄色フドウ球菌コウワ
ンＩ株死菌（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、アメリカ）を一
万分の一の濃度で添加したリンパ球液２ｍｌを６穴プレ
ートに分注した。
【００４４】このプレートを３７℃、５％炭酸ガス培養
器で、５日間培養した後、１２００ＲＰＭ、１０分間の
低速遠心によりリンパ球細胞を回収した。また、１０％
牛胎児血清添加ＲＤＦ培地で培養し、増殖フェーズにあ
る融合親株ＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１６６
８）も同様に遠心操作により、細胞を回収した。それぞ
れ回収したリンパ球細胞と融合親株細胞を１：１の割合
で混合し、電気的細胞融合法（Ｆｏｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３４、３５−４
２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３４、４３−５０、１
９９０）により細胞融合を行った。すなわち、混合した
細胞を３００Ｌ３液（２８０ｍＭｓｏｒｂｉｔｏｌ、
０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウ
ム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン）で一度洗浄した
後、細胞を遠心回収し、７５Ｌ３液（７０ｍＭｓｏｒｂ
ｉｔｏｌ、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸
マグネシウム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン）２．
５ｍｌに再懸濁した。
器で、５日間培養した後、１２００ＲＰＭ、１０分間の
低速遠心によりリンパ球細胞を回収した。また、１０％
牛胎児血清添加ＲＤＦ培地で培養し、増殖フェーズにあ
る融合親株ＳＨＭ−Ｄ３３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ・１６６
８）も同様に遠心操作により、細胞を回収した。それぞ
れ回収したリンパ球細胞と融合親株細胞を１：１の割合
で混合し、電気的細胞融合法（Ｆｏｕｎｇ，Ｓ他、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３４、３５−４
２、１９９０；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｕ他、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３４、４３−５０、１
９９０）により細胞融合を行った。すなわち、混合した
細胞を３００Ｌ３液（２８０ｍＭｓｏｒｂｉｔｏｌ、
０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウ
ム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン）で一度洗浄した
後、細胞を遠心回収し、７５Ｌ３液（７０ｍＭｓｏｒｂ
ｉｔｏｌ、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸
マグネシウム及び１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン）２．
５ｍｌに再懸濁した。
【００４５】５分後、島津製作所の電気的細胞融合装置
ＳＳＨ−１を用いて、１ＭＨｚ、１．００ｋＶ／ｃｍ、
１５μｓの条件下、０．８３ｍｌ／チェインバーづつ、
電気的パルスを加えた。パルス後、５分間静置し、細胞
浮遊液を３０ｍｌのハイブリドーマ選択培地（１００μ
Ｍヒポキサンチン、１６μＭチミジン、０．４μＭアミ
ノプテリン、５μｇ／ｍｌ牛インシュリン、５μｇ／ｍ
ｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナト
リウム、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２０Ｕ
／ｍｌリコンビナントヒトインターロイキン−６、４０
％のバルブ／ｃマウス脾臓細胞培養上清液、１０％牛胎
児血清を含むＲＤＦ培地）に懸濁し、細胞懸濁液を０．
１ｍｌづつ９６穴細胞培養用マイクロプレートに分注し
た。マイクロプレートを３７℃、５％炭酸ガス培養器に
いれて、２週間〜４週間培養を継続した。 （２）肺癌細胞反応性ハイブリドーマの選択 ２週間から４週間培養を継続した９６穴マイクロープレ
ートを光学顕微鏡的な観察により、コロニーが認められ
たウェルに関して、培養上清液２５μｌを採取しヒト型
抗体の産生能を検定した。すなわち、抗ヒトイミュノグ
ロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）を０．１Ｍ重炭
酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希釈し、ＥＬＩＳ
Ａ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１００μｌずつ分
注し、４℃、一夜（１６時間）静置した後、ＰＢＳ緩衝
液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ緩衝
液でプレートを室温、一時間ブロッキンングした。
ＳＳＨ−１を用いて、１ＭＨｚ、１．００ｋＶ／ｃｍ、
１５μｓの条件下、０．８３ｍｌ／チェインバーづつ、
電気的パルスを加えた。パルス後、５分間静置し、細胞
浮遊液を３０ｍｌのハイブリドーマ選択培地（１００μ
Ｍヒポキサンチン、１６μＭチミジン、０．４μＭアミ
ノプテリン、５μｇ／ｍｌ牛インシュリン、５μｇ／ｍ
ｌヒトトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナト
リウム、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２０Ｕ
／ｍｌリコンビナントヒトインターロイキン−６、４０
％のバルブ／ｃマウス脾臓細胞培養上清液、１０％牛胎
児血清を含むＲＤＦ培地）に懸濁し、細胞懸濁液を０．
１ｍｌづつ９６穴細胞培養用マイクロプレートに分注し
た。マイクロプレートを３７℃、５％炭酸ガス培養器に
いれて、２週間〜４週間培養を継続した。 （２）肺癌細胞反応性ハイブリドーマの選択 ２週間から４週間培養を継続した９６穴マイクロープレ
ートを光学顕微鏡的な観察により、コロニーが認められ
たウェルに関して、培養上清液２５μｌを採取しヒト型
抗体の産生能を検定した。すなわち、抗ヒトイミュノグ
ロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）を０．１Ｍ重炭
酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希釈し、ＥＬＩＳ
Ａ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１００μｌずつ分
注し、４℃、一夜（１６時間）静置した後、ＰＢＳ緩衝
液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ緩衝
液でプレートを室温、一時間ブロッキンングした。
【００４６】ブロッキング後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で２０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2抗ヒトイミュノグロブリン（カペル社、ア
メリカ）を１００μｌずつ分注し、３７℃、３０分間反
応させた。反応後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、パーオ
キシダーゼ発色基質液（０．１Ｍクエン酸：０．２ＭＮ
ａ2ＨＰＯ4：水＝５ｍｌ：５ｍｌ：１０ｍｌの緩衝液に
１０ｍｇオルトフェニレンジアミン／２０ｍｌと１０μ
ｌ・過酸化水素水／２０ｍｌ３０％を添加した液）を１
００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色させた。
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で２０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2抗ヒトイミュノグロブリン（カペル社、ア
メリカ）を１００μｌずつ分注し、３７℃、３０分間反
応させた。反応後、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、パーオ
キシダーゼ発色基質液（０．１Ｍクエン酸：０．２ＭＮ
ａ2ＨＰＯ4：水＝５ｍｌ：５ｍｌ：１０ｍｌの緩衝液に
１０ｍｇオルトフェニレンジアミン／２０ｍｌと１０μ
ｌ・過酸化水素水／２０ｍｌ３０％を添加した液）を１
００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色させた。
【００４７】発色後、１Ｎ塩酸を１００μｌずつ加え、
反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレー
トリーダーにて測定し、抗体産生能の検定評価を行っ
た。また、抗体のクラスおよび軽鎖は、免疫酵素測定法
により行った。すなわち、一次抗体として、抗ヒトイミ
ュノグロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）を０．１
Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希釈し、Ｅ
ＬＩＳＡ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１００μｌ
ずつ分注し、４℃、一夜（１６時間）静置した後、ＰＢ
Ｓ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン含有ＰＢ
Ｓ緩衝液でプレートを室温、一時間ブロッキンングし
た。
反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレー
トリーダーにて測定し、抗体産生能の検定評価を行っ
た。また、抗体のクラスおよび軽鎖は、免疫酵素測定法
により行った。すなわち、一次抗体として、抗ヒトイミ
ュノグロブリンヤギ抗体（タゴ社、アメリカ）を０．１
Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）で１０００倍希釈し、Ｅ
ＬＩＳＡ（酵素免疫法）用９６穴プレートに１００μｌ
ずつ分注し、４℃、一夜（１６時間）静置した後、ＰＢ
Ｓ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン含有ＰＢ
Ｓ緩衝液でプレートを室温、一時間ブロッキンングし
た。
【００４８】ブロッキング後、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標
識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＭ（タゴ社、アメリ
カ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社、アメリカ）、アルカリフォス
ファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＡ（タゴ
社、アメリカ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇλ鎖（タゴ社、アメリカ）ある
いはアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2
抗ヒトＩｇκ鎖（タゴ社、アメリカ）を１００μｌずつ
分注し、３７℃、３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳ
緩衝液で３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基
質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェー
ト、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１
０分間発色させた。
し、２５μｌの培養上清液と２５μｌのＰＢＳ緩衝液を
分注した。３７℃、一時間反応させた後、ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄し、０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩
衝液で１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標
識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＭ（タゴ社、アメリ
カ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社、アメリカ）、アルカリフォス
ファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＡ（タゴ
社、アメリカ）、アルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ
（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇλ鎖（タゴ社、アメリカ）ある
いはアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2
抗ヒトＩｇκ鎖（タゴ社、アメリカ）を１００μｌずつ
分注し、３７℃、３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳ
緩衝液で３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基
質液（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェー
ト、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１
０分間発色させた。
【００４９】発色後、１Ｎ・水酸化ナトリウム液を１０
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、抗体の
クラスおよびＬ鎖を調べた。抗体産生能陽性のウェルに
関して、培養を拡大し、２４穴プレートを用いて、０．
５ｍｌのスケールで培養を継続した。増殖したウェルか
ら再度培養上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞
との反応性の検討をした（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８
２）。すなわち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地中
で、９６穴の細胞培養用マイクロプレートでサブコンフ
ルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞をＰ
ＢＳ緩衝液で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒ
ド添加ＰＢＳ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１
５分間静置した。１５分後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン
添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加えて、室温、一時
間ブロッキングした。
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、抗体の
クラスおよびＬ鎖を調べた。抗体産生能陽性のウェルに
関して、培養を拡大し、２４穴プレートを用いて、０．
５ｍｌのスケールで培養を継続した。増殖したウェルか
ら再度培養上清液を採取し、肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞
との反応性の検討をした（Ｄｏｒｒｅｎの方法、Ｂｒ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４５、４９１−４９７、１９８
２）。すなわち、１０％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地中
で、９６穴の細胞培養用マイクロプレートでサブコンフ
ルエント状態に増殖した肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞をＰ
ＢＳ緩衝液で一回洗浄後、０．０５％グルタルアルデヒ
ド添加ＰＢＳ緩衝液を１００μｌずつ分注し、室温、１
５分間静置した。１５分後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、３％牛血清アルブミン
添加ＰＢＳ緩衝液を２００μｌずつ加えて、室温、一時
間ブロッキングした。
【００５０】ブロッキング後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、培養上清液を５０μ
ｌずつ分注した。室温、３時間反応させた後、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、０．
２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液で１０００倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａ
ｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（タゴ社）を１００
μｌずつ分注し、室温、一時間反応させた。反応後、三
回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基質液（０．
６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１Ｍジエ
タノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ
９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色
させた。
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、培養上清液を５０μ
ｌずつ分注した。室温、３時間反応させた後、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、０．
２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液で１０００倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識ヤギＦ（ａ
ｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（タゴ社）を１００
μｌずつ分注し、室温、一時間反応させた。反応後、三
回洗浄し、アルカリフォスファターゼ発色基質液（０．
６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１Ｍジエ
タノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ
９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間発色
させた。
【００５１】発色後、１Ｎ・水酸化ナトリウム液を１０
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Ａ５４
９細胞との反応性を調べた。また、肺癌組織を用いて、
免疫組織化学的検定をあわせて行った。すなわち、フォ
ルマリン固定法、ＡＭｅＸ包埋法および新鮮凍結切片法
の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫組織
化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行った。脱パ
ラフィンは、フォルマリン固定組織切片の場合はキシレ
ン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋法組織切片の場合
はキシレン、アセトン系列で行った。新鮮凍結組織切片
および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織切片は、ＰＢＳ緩
衝液で一回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド（０．
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室温２０分間固定を
した。
０μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレー
トリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、Ａ５４
９細胞との反応性を調べた。また、肺癌組織を用いて、
免疫組織化学的検定をあわせて行った。すなわち、フォ
ルマリン固定法、ＡＭｅＸ包埋法および新鮮凍結切片法
の３種の方法で作製した肺癌組織切片を用いた免疫組織
化学法でヒト型抗体の肺癌特異性の検討を行った。脱パ
ラフィンは、フォルマリン固定組織切片の場合はキシレ
ン、エタノール系列で、ＡＭｅＸ包埋法組織切片の場合
はキシレン、アセトン系列で行った。新鮮凍結組織切片
および脱パラフィンしたＡＭｅＸ組織切片は、ＰＢＳ緩
衝液で一回洗浄後、４％パラフォルムアルデヒド（０．
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で室温２０分間固定を
した。
【００５２】脱パラフィンしたフォルマリン固定スライ
ドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片
スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライドはＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室温１５分間
ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山信彦他、日
消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａｍａ，Ｎ
他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、２４、５
８１、１９８９）により行った。
ドおよびパラフォルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片
スライドあるいはＡＭｅＸ組織切片スライドはＰＢＳ緩
衝液で３回洗浄後、１０％ヤギ正常血清で室温１５分間
ブロッキング操作を行い、間接法変法（曽山信彦他、日
消誌、８７、２６３５−２６４１；Ｓｏｙａｍａ，Ｎ
他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｊｐｎ．、２４、５
８１、１９８９）により行った。
【００５３】すなわち、予めヒト型抗体を含む培養上清
液サンプルと４００分の一量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の一量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温一時間さらに反応させた。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％のジアミノベンジジン、０．００５
％過酸化水素水、５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．
６）で５分間発色させた。
液サンプルと４００分の一量のパーオキシダーゼ標識ヤ
ギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン（カペル
社）を室温３時間反応させた後、フリーのパーオキシダ
ーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトイミュノグロブリン
をブロッキングするため、７５分の一量のヒト正常血清
（カペル社）を加え、室温一時間さらに反応させた。こ
のヒト型抗体とパーオキシダーゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
2 抗ヒトイミュノグロブリンの結合体を含む反応液０．
２ｍｌを、脱パラフィンしたスライドあるいはパラフォ
ルムアルデヒド固定した新鮮凍結切片スライドにのせ、
４℃、１８時間静置し、ＰＢＳ緩衝液３回洗浄後、発色
基質液（０．０２％のジアミノベンジジン、０．００５
％過酸化水素水、５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．
６）で５分間発色させた。
【００５４】発色後、水で洗浄し、３倍希釈のハリスヘ
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行った。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％
エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール
（２回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キ
シレン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会
社）で封入した。封入した組織切片スライドを光学顕微
鏡的な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と
特異的に反応するヒト型抗体の選別をした。このように
して選別したヒト型抗体を産生するハイブリドーマを３
回サブクローニングして、安定的に抗体を産生するハイ
ブリドーマを得た。
マトキシレンで対染色を行い、さらに水で十分に洗浄を
行った。その後、脱水反応を７０％エタノール、８０％
エタノール、９０％エタノール、１００％エタノール
（２回）、１００％キシレン（２回）の順序で行い、キ
シレン系標本封入剤マウントクイック（大道産業株式会
社）で封入した。封入した組織切片スライドを光学顕微
鏡的な観察により、正常部位とは反応せず、肺癌組織と
特異的に反応するヒト型抗体の選別をした。このように
して選別したヒト型抗体を産生するハイブリドーマを３
回サブクローニングして、安定的に抗体を産生するハイ
ブリドーマを得た。
【００５５】最終的には、このハイブリドーマをヒポキ
サンチン（１００μＭ）とチミジン（１６μＭ）を添加
した無血清培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ（ギブコ
社、アメリカ）に順化させ、ヒト型モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ２８Ｋ２９を得た。このハイ
ブリドーマ２８Ｋ２９の培養上清液を用いて、再度上記
に示した肺癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討および免
疫組織化学的検討を行った。検討を行うにあたって、本
発明のヒト型モノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反
応しないヒト型抗体（カペル社）を用いて比較を行っ
た。
サンチン（１００μＭ）とチミジン（１６μＭ）を添加
した無血清培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭ（ギブコ
社、アメリカ）に順化させ、ヒト型モノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ２８Ｋ２９を得た。このハイ
ブリドーマ２８Ｋ２９の培養上清液を用いて、再度上記
に示した肺癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討および免
疫組織化学的検討を行った。検討を行うにあたって、本
発明のヒト型モノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反
応しないヒト型抗体（カペル社）を用いて比較を行っ
た。
【００５６】下記の表１は免疫組織学的検討結果であ
り、図１は肺癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討結果で
ある。図１は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４９との
反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。Ｎ＝３
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。ｈＩｇＭ
（カペル社）は陰性対照としてのヒト型抗体である。ま
た、表１中、Ｆｒｏｚｅｎは凍結肺癌組織切片を、ＡＭ
ｅＸはＡＭｅＸ固定肺癌組織切片を、Ｆｏｒｍａｌｉｎ
はＦｏｒｍａｌｉｎ固定肺癌組織切片を、Ａｄは肺腺癌
組織切片を、Ｓｑは肺扁平上皮癌組織切片を、それぞれ
表し、数値は陽性数／測定数を示した。
り、図１は肺癌細胞株Ａ５４９との反応性の検討結果で
ある。図１は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４９との
反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。Ｎ＝３
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。ｈＩｇＭ
（カペル社）は陰性対照としてのヒト型抗体である。ま
た、表１中、Ｆｒｏｚｅｎは凍結肺癌組織切片を、ＡＭ
ｅＸはＡＭｅＸ固定肺癌組織切片を、Ｆｏｒｍａｌｉｎ
はＦｏｒｍａｌｉｎ固定肺癌組織切片を、Ａｄは肺腺癌
組織切片を、Ｓｑは肺扁平上皮癌組織切片を、それぞれ
表し、数値は陽性数／測定数を示した。
【００５７】
【表１】
【００５８】この結果、ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産
生するヒト型モノクローナル抗体は図１により肺癌細胞
株と反応することが明かとなり、表１により３種の、い
ずれの方法で固定した肺癌組織切片を用いても良好に反
応することが判明した。また、抗体のクラスおよび軽鎖
は、免疫酵素測定法により、ＩｇＭでλ鎖であった。
生するヒト型モノクローナル抗体は図１により肺癌細胞
株と反応することが明かとなり、表１により３種の、い
ずれの方法で固定した肺癌組織切片を用いても良好に反
応することが判明した。また、抗体のクラスおよび軽鎖
は、免疫酵素測定法により、ＩｇＭでλ鎖であった。
【００５９】
【実施例２】 精製ヒト型モノクローナル抗体を用いた担癌マウスへの
抗体集積性 （１）ヒト型モノクローナル抗体の精製 無血清培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭに順化したハイ
ブリドーマを２Ｌのスケールのスピナーフラスコ培養
（２５ＲＰＭ）により、３７℃、ＣＯ2 インキュベータ
ーで、１０日間培養して、ハイブリドーマの無血清培養
上清液を得た。培養上清液には、防腐剤として、０．０
５％アジ化ナトリウムを添加し、ヒト型モノクローナル
抗体の精製を行った。すなわち、培養上清液をハイドロ
キシアパタイトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０
Ｃ−直径２１．５ｍｍｘ１００ｍｍ、旭光学工業株式会
社）に直接負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラム
に吸着させた。４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で
十分に洗浄した後、４０ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗
体部分を約３００ｍＭ付近で溶出させた。
抗体集積性 （１）ヒト型モノクローナル抗体の精製 無血清培地ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ−ＳＦＭに順化したハイ
ブリドーマを２Ｌのスケールのスピナーフラスコ培養
（２５ＲＰＭ）により、３７℃、ＣＯ2 インキュベータ
ーで、１０日間培養して、ハイブリドーマの無血清培養
上清液を得た。培養上清液には、防腐剤として、０．０
５％アジ化ナトリウムを添加し、ヒト型モノクローナル
抗体の精製を行った。すなわち、培養上清液をハイドロ
キシアパタイトカラム（ＰＥＮＴＡＸ−ＳＨ−２０１０
Ｃ−直径２１．５ｍｍｘ１００ｍｍ、旭光学工業株式会
社）に直接負荷し、ヒト型モノクローナル抗体をカラム
に吸着させた。４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で
十分に洗浄した後、４０ｍＭから４００ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ６．８）の直線的濃度勾配溶出法により、抗
体部分を約３００ｍＭ付近で溶出させた。
【００６０】肺癌細胞株Ａ５４９と反応し、かつヒト型
抗体活性がある分画（約３００ｍＭリン酸緩衝液付近）
を集めて、精製ヒト型モノクローナル抗体画分（２ｍｇ
蛋白／ｍｌ）１６ｍｌを得た。ＳＤＳ−電気泳動的に
は、シングルバンドとして確認できた。 （２）担癌マウスを用いたヒト型モノクローナル抗体の
体内集積性 重症複合免疫不全マウスＳＣＩＤ（６週令、♀、日本ク
レア社）に、対数増殖期にあるヒト肺癌腺癌細胞株Ａ５
４９細胞を１０7 個背側皮下注射し、８日後に、ヒト型
モノクローナル抗体を１００μｇを尾静注した。抗体投
与後７日目に血液、脳、心臓、肺、肝、胃、脾、腎およ
び腫瘍を摘出した。
抗体活性がある分画（約３００ｍＭリン酸緩衝液付近）
を集めて、精製ヒト型モノクローナル抗体画分（２ｍｇ
蛋白／ｍｌ）１６ｍｌを得た。ＳＤＳ−電気泳動的に
は、シングルバンドとして確認できた。 （２）担癌マウスを用いたヒト型モノクローナル抗体の
体内集積性 重症複合免疫不全マウスＳＣＩＤ（６週令、♀、日本ク
レア社）に、対数増殖期にあるヒト肺癌腺癌細胞株Ａ５
４９細胞を１０7 個背側皮下注射し、８日後に、ヒト型
モノクローナル抗体を１００μｇを尾静注した。抗体投
与後７日目に血液、脳、心臓、肺、肝、胃、脾、腎およ
び腫瘍を摘出した。
【００６１】摘出した各臓器は、ＰＢＳ緩衝液中に浸し
て脱血させ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液
中で、ホモジェナイズした後、４℃、２０時間放置し、
蛋白を抽出した。ホモジネートを１０，０００ＲＰＭ、
３０分間遠心し、上清を蛋白抽出試料とした。血液は室
温に３０分放置した後、２５００ＲＰＭ、２０分間遠心
し、上清を血清検体とした。
て脱血させ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液
中で、ホモジェナイズした後、４℃、２０時間放置し、
蛋白を抽出した。ホモジネートを１０，０００ＲＰＭ、
３０分間遠心し、上清を蛋白抽出試料とした。血液は室
温に３０分放置した後、２５００ＲＰＭ、２０分間遠心
し、上清を血清検体とした。
【００６２】血清および蛋白抽出試料中のヒト型モノク
ローナル抗体の量は酵素免疫測定法により算出した。す
なわち、３０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）に
て１０００倍に希釈したヤギ抗ヒト免疫グロブリン（カ
ペル社）を５０μｌづつウェルに分注した９６穴マイク
ロプレートを室温、２時間静置し、０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ緩衝液
１００μｌを分注して、ウェルのブロッキングを行っ
た。
ローナル抗体の量は酵素免疫測定法により算出した。す
なわち、３０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）に
て１０００倍に希釈したヤギ抗ヒト免疫グロブリン（カ
ペル社）を５０μｌづつウェルに分注した９６穴マイク
ロプレートを室温、２時間静置し、０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ緩衝液
１００μｌを分注して、ウェルのブロッキングを行っ
た。
【００６３】室温、２時間経過後、０．０２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μｌの２倍
づつ希釈した血清検体あるいは蛋白抽出試料を分注し
た。室温、３時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で５回洗浄し、５０μｌの０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０と０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液
で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識
ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＭ抗体を分注した。
ｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μｌの２倍
づつ希釈した血清検体あるいは蛋白抽出試料を分注し
た。室温、３時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で５回洗浄し、５０μｌの０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０と０．２％牛血清アルブミン添加ＰＢＳ緩衝液
で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識
ヤギＦ（ａｂ’）2 抗ヒトＩｇＭ抗体を分注した。
【００６４】室温、２時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２
０添加ＰＢＳ緩衝液 で５回洗浄し、アルカリフォスフ
ァターゼ発色基質液（（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニ
ルフォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分
注し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ・水酸
化ナトリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止
させ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸
光度を測定し、ＩｇＭ抗体量の定量を行った。
０添加ＰＢＳ緩衝液 で５回洗浄し、アルカリフォスフ
ァターゼ発色基質液（（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニ
ルフォスフェート、１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分
注し、室温、１０分間発色させた。発色後、１Ｎ・水酸
化ナトリウム液を１００μｌずつ添加して、反応を停止
させ、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸
光度を測定し、ＩｇＭ抗体量の定量を行った。
【００６５】検討を行うにあたって、本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。ヒト
型抗体を用いて、担癌マウスの腫瘍部への抗体集積性の
結果を図２に示した。図２は、ヒト型抗体の担癌ＳＣＩ
Ｄマウス腫瘍部への集積性を腫瘍部への単位重量当たり
の集積量（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量
（Ｂ）に対する比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。Ｎ＝２
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。ヒト
型抗体を用いて、担癌マウスの腫瘍部への抗体集積性の
結果を図２に示した。図２は、ヒト型抗体の担癌ＳＣＩ
Ｄマウス腫瘍部への集積性を腫瘍部への単位重量当たり
の集積量（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量
（Ｂ）に対する比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。Ｎ＝２
で測定を行い、平均値と標準偏差を表した。
【００６６】その結果、ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産
生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、陰性対照
（カペル社ＩｇＭ）の抗体に比較しても腫瘍部への顕著
な抗体集積性が認められ、さらに、ハイブリドーマ２８
Ｋ２９が産生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、
腫瘍の縮退が肉眼的に観察された。
生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、陰性対照
（カペル社ＩｇＭ）の抗体に比較しても腫瘍部への顕著
な抗体集積性が認められ、さらに、ハイブリドーマ２８
Ｋ２９が産生するヒト型モノクローナル抗体の場合は、
腫瘍の縮退が肉眼的に観察された。
【００６７】
【実施例３】 補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ活性） 細胞培養用フラスコ（Ｆ７５）を用いて、１０％牛胎児
血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中で、サブコンフルエン
ト状態まで増殖させた肺癌腺癌細胞株Ａ５４９細胞を
０．０２％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、付着
細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠心に
て細胞を回収した。
血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中で、サブコンフルエン
ト状態まで増殖させた肺癌腺癌細胞株Ａ５４９細胞を
０．０２％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、付着
細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠心に
て細胞を回収した。
【００６８】回収した細胞を、フェノールレッド不含血
清無添加ダルベッコＭＥＭ培地に懸濁し、１ｘ１０6個
細胞／ｍｌとした。９６穴プレートに細胞懸濁液を１０
０μｌづつ分注し、ヒト型モノクローナル抗体あるいは
陰性対照としてヒト型抗体ｈＩｇＭ（ＩｇＭ、カペル
社）を１０μｇ／ｍｌづつ、さらに補体として１０％低
毒性ウサギ補体（セダレーン社、アメリカ）を添加し
て、３７℃、５％炭酸ガス培養器で２時間反応させた。
清無添加ダルベッコＭＥＭ培地に懸濁し、１ｘ１０6個
細胞／ｍｌとした。９６穴プレートに細胞懸濁液を１０
０μｌづつ分注し、ヒト型モノクローナル抗体あるいは
陰性対照としてヒト型抗体ｈＩｇＭ（ＩｇＭ、カペル
社）を１０μｇ／ｍｌづつ、さらに補体として１０％低
毒性ウサギ補体（セダレーン社、アメリカ）を添加し
て、３７℃、５％炭酸ガス培養器で２時間反応させた。
【００６９】生細胞数の測定は、ＸＴＴ法で求めた（Ｐ
ａｕｌｌ，Ｋ．Ｄ他、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２５、９１１−９１４、１９８８；Ｓｔｅｖｅ
ｎｓ，Ｍ．Ｇ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、１５７、２２５−２３１、１９９３）。すなわち、
反応後、ＸＴＴ試薬（ベーリンガーマンハイム社、ドイ
ツ）を５０μｌづつ添加して、さらに４時間反応させ
た。反応終了後、マイクロプレートリーダーにて、４５
０ｎｍの吸光度を測定して、抗体無添加の系を１００％
として、それぞれの抗体のＣＤＣ活性を算出した。検討
を行うにあたって、本発明のヒト型モノクローナル抗体
の他に、肺癌組織と反応しないヒト型抗体（ＩｇＭ、カ
ペル社）を用いて比較を行った。結果は、図３に示し
た。
ａｕｌｌ，Ｋ．Ｄ他、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈ
ｅｍ．、２５、９１１−９１４、１９８８；Ｓｔｅｖｅ
ｎｓ，Ｍ．Ｇ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、１５７、２２５−２３１、１９９３）。すなわち、
反応後、ＸＴＴ試薬（ベーリンガーマンハイム社、ドイ
ツ）を５０μｌづつ添加して、さらに４時間反応させ
た。反応終了後、マイクロプレートリーダーにて、４５
０ｎｍの吸光度を測定して、抗体無添加の系を１００％
として、それぞれの抗体のＣＤＣ活性を算出した。検討
を行うにあたって、本発明のヒト型モノクローナル抗体
の他に、肺癌組織と反応しないヒト型抗体（ＩｇＭ、カ
ペル社）を用いて比較を行った。結果は、図３に示し
た。
【００７０】図３は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４
９に対するＣＤＣ活性を示した図である。ＣＤＣ活性は
抗体無添加の系を０％として表した。Ｎ＝３で測定を行
い、平均値と標準偏差を表した。ｈＩｇＭは陰性対照と
してのヒト型抗体である。その結果、ハイブリドーマ２
８Ｋ２９が産生するヒト型モノクローナル抗体は陰性対
照に比較して、顕著なＣＤＣ活性があることがわかり、
該抗体単独でも治療薬として有効であることがわかっ
た。
９に対するＣＤＣ活性を示した図である。ＣＤＣ活性は
抗体無添加の系を０％として表した。Ｎ＝３で測定を行
い、平均値と標準偏差を表した。ｈＩｇＭは陰性対照と
してのヒト型抗体である。その結果、ハイブリドーマ２
８Ｋ２９が産生するヒト型モノクローナル抗体は陰性対
照に比較して、顕著なＣＤＣ活性があることがわかり、
該抗体単独でも治療薬として有効であることがわかっ
た。
【００７１】
【実施例４】 蛍光抗体法による抗原局在の検討 細胞培養用フラスコ（Ｆ７５）を用いて、１０％牛胎児
血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中で、サブコンフルエン
ト状態まで増殖させた肺癌腺癌細胞株Ａ５４９細胞を
０．０２％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、付着
細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠心に
て細胞を回収した。
血清添加ダルベッコＭＥＭ培地中で、サブコンフルエン
ト状態まで増殖させた肺癌腺癌細胞株Ａ５４９細胞を
０．０２％ＥＤＴＡ添加ＰＢＳ緩衝液で処理して、付着
細胞を遊離させて、１２００ＲＰＭ、１０分間の遠心に
て細胞を回収した。
【００７２】回収したＡ５４９細胞２ｘ１０5 個に対し
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させる。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させる。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行った。
てハイブリドーマ培養上清液１５０μｌを４℃、２時間
反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心して、細
胞を沈澱させる。細胞を、ＰＢＳ緩衝液で２０倍に希釈
したＦＩＴＣ標識ヤギＦ（ａｂ’）2抗ヒト免疫グロブ
リン抗体（カペル社）１００μｌに再懸濁し、４℃、１
時間反応させた後、１２００ＲＰＭ、１０分間遠心し
て、細胞を沈澱させる。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄
後、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁し、蛍光顕微鏡的な
観察を行った。
【００７３】その結果、ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産
生するヒト型モノクローナル抗体は肺癌腺癌細胞Ａ５４
９の細胞膜抗原と反応することが蛍光顕微鏡的に観察で
きた。
生するヒト型モノクローナル抗体は肺癌腺癌細胞Ａ５４
９の細胞膜抗原と反応することが蛍光顕微鏡的に観察で
きた。
【００７４】
【実施例５】 肺癌患者血漿検体を用いた酵素免疫測定 （１）ヒト型モノクローナル抗体のビオチン化 ５０ｍＭ重炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて緩衝液置換し
た前記実施例２で得た精製したヒト型モノクローナル抗
体含有液１ｍｌ（蛋白２ｍｇ／ｍｌ）に、７４μｌのＮ
ＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ水、ピアース
社）を加えて、氷中で、２時間反応させた。反応後、未
反応ビオチンを除去するため、セントリコン−３０（ミ
リポア社、アメリカ）で１０００ｇ、３０分間遠心し、
１５０ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％アジ化ナトリウム
添加１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、同様に遠心操作を
した。この操作を３度行い、最終的に１５０ｍＭ塩化ナ
トリウムと０．１％アジ化ナトリウム添加１０ｍＭリン
酸緩衝液に置換した。 （２）血漿検体を用いた酵素免疫測定 固相化用抗体として、未標識ヒト型モノクローナル抗体
を３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）で１μｇ／ｍｌ
に希釈し、ウェルあたり５０μｌづつ分注した。４℃、
１８時間静置した後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５％スキムミルク添加ＰＢＳ
緩衝液で室温、３時間ブロッキングした。
た前記実施例２で得た精製したヒト型モノクローナル抗
体含有液１ｍｌ（蛋白２ｍｇ／ｍｌ）に、７４μｌのＮ
ＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（１ｍｇ／ｍｌ水、ピアース
社）を加えて、氷中で、２時間反応させた。反応後、未
反応ビオチンを除去するため、セントリコン−３０（ミ
リポア社、アメリカ）で１０００ｇ、３０分間遠心し、
１５０ｍＭ塩化ナトリウムと０．１％アジ化ナトリウム
添加１０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、同様に遠心操作を
した。この操作を３度行い、最終的に１５０ｍＭ塩化ナ
トリウムと０．１％アジ化ナトリウム添加１０ｍＭリン
酸緩衝液に置換した。 （２）血漿検体を用いた酵素免疫測定 固相化用抗体として、未標識ヒト型モノクローナル抗体
を３０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．８）で１μｇ／ｍｌ
に希釈し、ウェルあたり５０μｌづつ分注した。４℃、
１８時間静置した後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で２回洗浄し、５％スキムミルク添加ＰＢＳ
緩衝液で室温、３時間ブロッキングした。
【００７５】ブロッキング後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２
０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、血漿検体を０．２％
牛血清アルブミンと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加し
たＰＢＳ緩衝液で１０倍に希釈し、５０μｌづつ分注し
た。室温で２時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．５％スキムミルクと０．
０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍｌ
に希釈したビオチン標識ヒト型モノクローナル抗体液を
５０μｌづつ分注した。
０添加ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、血漿検体を０．２％
牛血清アルブミンと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を添加し
たＰＢＳ緩衝液で１０倍に希釈し、５０μｌづつ分注し
た。室温で２時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．５％スキムミルクと０．
０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍｌ
に希釈したビオチン標識ヒト型モノクローナル抗体液を
５０μｌづつ分注した。
【００７６】室温で２時間後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５０
０倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプト
アビジン（ジャクソン社）を５０μｌづつ分注した。室
温で１時間後、アルカリフォスファターゼ発色基質液
（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１
Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、
ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間
発色させた。
０添加ＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、０．５％スキムミル
クと０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で５０
０倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプト
アビジン（ジャクソン社）を５０μｌづつ分注した。室
温で１時間後、アルカリフォスファターゼ発色基質液
（０．６７Ｍのｐ−ニトロフェニルフォスフェート、１
Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、
ｐＨ９．６）を１００μｌずつ分注し、室温、１０分間
発色させた。
【００７７】発色後、１Ｎ水酸化ナトリウム液を１００
μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレート
リーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果
は、図４に示した。図４は、肺癌血漿検体を用いた酵素
免疫測定結果を４０５ｎｍの吸光度表示した図である。
Ａｄは肺腺癌患者血漿を示し、Ｓｑは肺扁平上皮癌患者
血漿を示し、ＳＣＬＣは肺小細胞癌を示し、そしてＮｏ
ｒｍａｌは正常血漿を示した。
μｌずつ添加して、反応を停止させ、マイクロプレート
リーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果
は、図４に示した。図４は、肺癌血漿検体を用いた酵素
免疫測定結果を４０５ｎｍの吸光度表示した図である。
Ａｄは肺腺癌患者血漿を示し、Ｓｑは肺扁平上皮癌患者
血漿を示し、ＳＣＬＣは肺小細胞癌を示し、そしてＮｏ
ｒｍａｌは正常血漿を示した。
【００７８】その結果、ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産
生するヒト型モノクローナル抗体は該抗体と反応する抗
原が多くの肺癌患者血漿中に存在することが判明し、肺
癌の体外診断薬としての有効性を示した。
生するヒト型モノクローナル抗体は該抗体と反応する抗
原が多くの肺癌患者血漿中に存在することが判明し、肺
癌の体外診断薬としての有効性を示した。
【００７９】
【実施例６】 Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用いた担癌マウスへの抗体集
積性及びＥＩＡ （１）ペプシン処理によるＦ（ａｂ’）2 抗体断片の作
製 実施例２で示した方法により精製したヒト型モノクロー
ナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に対して４℃、１
６時間透析し、最終的に５０μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃
度に調製した。当該緩衝液に溶解したペプシン（シグマ
社）を重量比で抗体に対して２５分の１の量比で添加
し、３２℃、６０分間反応させた。６０分後、酵素反応
は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を体積比
で反応液に対して５分の１量を添加して停止した。
積性及びＥＩＡ （１）ペプシン処理によるＦ（ａｂ’）2 抗体断片の作
製 実施例２で示した方法により精製したヒト型モノクロー
ナル抗体液を０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０２Ｍ
酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に対して４℃、１
６時間透析し、最終的に５０μｇ／ｍｌ（５ｍｌ）の濃
度に調製した。当該緩衝液に溶解したペプシン（シグマ
社）を重量比で抗体に対して２５分の１の量比で添加
し、３２℃、６０分間反応させた。６０分後、酵素反応
は０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）を体積比
で反応液に対して５分の１量を添加して停止した。
【００８０】ペプシン消化検体を５００μｌづつ、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、ゲル濾過分離を行
った。高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣは、島津Ｌ
Ｃ−６Ａを用いた。カラムの平衡緩衝液及び溶出緩衝液
は０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉｎの
条件で行い、２８０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出をし
た。
ｏｔｅｉｎ−ＫＷ２００３−ＧＦＣカラム（昭和電工、
２０ｍｍｘ３００ｍｍ）に負荷して、ゲル濾過分離を行
った。高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣは、島津Ｌ
Ｃ−６Ａを用いた。カラムの平衡緩衝液及び溶出緩衝液
は０．１５Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて、２．５ｍｌ／ｍｉｎの
条件で行い、２８０ｎｍの吸光度にて蛋白の検出をし
た。
【００８１】ゲル濾過的分子量が約１３万付近のピーク
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認した。ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドが確認できた。従って、このゲル濾過
的な分子量で約１３万のピーク部分をプールして、精製
Ｆ（ａｂ’）2 として、以下の実験に用いた。 （２）精製Ｆ（ａｂ’）2 を用いた担癌ＳＣＩＤマウス
への抗体集積性 実施例２の（２）の実験と同様に、ヒト肺癌腺癌細胞株
Ａ５４９をＳＣＩＤマウスに背側皮下注射し、腫瘍を形
成させ、８日後に、精製Ｆ（ａｂ’）2 をそれぞれ５０
μｇづつ尾静注した。抗体投与後４日目に各種臓器を摘
出し、ＥＩＡ法にて各種臓器に集積したヒト型モノクロ
ーナル抗体Ｆ（ａｂ’）2 断片を定量した。
部分を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動的に
非還元条件下で約１３．４万であることを確認した。ま
た、還元条件下では、約２．５万及び約４．２万の分子
量の２つのバンドが確認できた。従って、このゲル濾過
的な分子量で約１３万のピーク部分をプールして、精製
Ｆ（ａｂ’）2 として、以下の実験に用いた。 （２）精製Ｆ（ａｂ’）2 を用いた担癌ＳＣＩＤマウス
への抗体集積性 実施例２の（２）の実験と同様に、ヒト肺癌腺癌細胞株
Ａ５４９をＳＣＩＤマウスに背側皮下注射し、腫瘍を形
成させ、８日後に、精製Ｆ（ａｂ’）2 をそれぞれ５０
μｇづつ尾静注した。抗体投与後４日目に各種臓器を摘
出し、ＥＩＡ法にて各種臓器に集積したヒト型モノクロ
ーナル抗体Ｆ（ａｂ’）2 断片を定量した。
【００８２】検討を行うにあたって、本発明のヒト型モ
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。その
結果、単位重量当たりの腫瘍部への集積量（Ｔ）の単位
重量当たりの血液への集積量（Ｂ）の比（Ｔ／Ｂ）は、
２８Ｋ２９−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が８．５、
ｈＩｇＭ−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が０．２であ
った。したがって、Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用いた場
合も腫瘍部への集積性が顕著に認められた。 （３）精製Ｆ（ａｂ’）2 を用いたＥＩＡ 固相化用抗体として、それぞれ精製Ｆ（ａｂ’）2 を用
いて、実施例２の（２）と同様に１μｇ／ｍｌに濃度を
調整し、ウェル当たり５０μｌづつ分注した。ビオチン
標識抗体は実施例２と同様のものを使用した。
ノクローナル抗体の他に、肺癌組織と反応しないヒト型
抗体（ＩｇＭ、カペル社）を用いて比較を行った。その
結果、単位重量当たりの腫瘍部への集積量（Ｔ）の単位
重量当たりの血液への集積量（Ｂ）の比（Ｔ／Ｂ）は、
２８Ｋ２９−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が８．５、
ｈＩｇＭ−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が０．２であ
った。したがって、Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用いた場
合も腫瘍部への集積性が顕著に認められた。 （３）精製Ｆ（ａｂ’）2 を用いたＥＩＡ 固相化用抗体として、それぞれ精製Ｆ（ａｂ’）2 を用
いて、実施例２の（２）と同様に１μｇ／ｍｌに濃度を
調整し、ウェル当たり５０μｌづつ分注した。ビオチン
標識抗体は実施例２と同様のものを使用した。
【００８３】その結果、肺癌患者血漿を用いた場合の陽
性率は、それぞれ２８Ｋ２９−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片
の場合が７０％（７／１０：陽性検体／テスト検体）、
ｈＩｇＭ−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が０％（０／
１０）であった。従って、Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用
いた癌診断薬としての有用性が明かとなった。
性率は、それぞれ２８Ｋ２９−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片
の場合が７０％（７／１０：陽性検体／テスト検体）、
ｈＩｇＭ−Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片の場合が０％（０／
１０）であった。従って、Ｆ（ａｂ’）2 抗体断片を用
いた癌診断薬としての有用性が明かとなった。
【００８４】
【実施例７】 対応抗原の生化学的解析 （１）肺癌細胞株からの細胞抽出物の調製 ２８Ｋ２９抗体が結合する物質を明らかにするため、肺
癌細胞株Ａ５４９および肺小細胞癌細胞株ＰＣ６（中村
治彦他、肺癌、３１，５０３−５１０，１９９１）の細
胞抽出物を作製し、ウエスタンブロットにより、それぞ
れの対応抗原の分子量をもとめた。７５ｃｍ2 の細胞培
養用フラスコ（４本）にて、Ａ５４９およびＰＣ６細胞
をそれぞれ培養し、サブコンフルエント状態になった
時、細胞を集めた。すなわち、付着細胞をＰＢＳ緩衝液
にて１度洗浄した後、０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを１
０ｍｌづつフラスコに分注して、３７℃、１０分間静置
した。
癌細胞株Ａ５４９および肺小細胞癌細胞株ＰＣ６（中村
治彦他、肺癌、３１，５０３−５１０，１９９１）の細
胞抽出物を作製し、ウエスタンブロットにより、それぞ
れの対応抗原の分子量をもとめた。７５ｃｍ2 の細胞培
養用フラスコ（４本）にて、Ａ５４９およびＰＣ６細胞
をそれぞれ培養し、サブコンフルエント状態になった
時、細胞を集めた。すなわち、付着細胞をＰＢＳ緩衝液
にて１度洗浄した後、０．０２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを１
０ｍｌづつフラスコに分注して、３７℃、１０分間静置
した。
【００８５】その後、５％牛胎児血清添加ＲＤＦ培地を
５ｍｌ加え、セルスクレイパーにて細胞を集めた。１２
００ＲＰＭ、５分間の低速遠心にて、細胞を集め、細胞
抽出緩衝液（１％トライトンＸ１００、５μｇ／ｍｌの
ロイペプチン、５μｇ／ｍｌのキモスタチン、５μｇ／
ｍｌのペプスタチンＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライドを添加したＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．
４）１ｍｌを加え、細胞を懸濁し、０℃、４５分間、５
分毎に撹拌し、静置した。４５分後、２０００ｒｐｍ、
５分間遠心し、上清を新しい遠心管に移し、さらに１０
０００ＲＰＭ、３０分間遠心し、遠心上清液を集めた。
この上清液を細胞抽出物として、ウェスタンブロット実
験に用いた。 （２）ウェスタンブロット 細胞抽出物１０μｌをＳＤＳ電気泳動用緩衝液（０．０
６２５Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８、１０％グリセロール、
２％ＳＤＳ、５％の２−メルカプトエタノール［還元下
条件時のみ添加］、０．００５％ブロモフェノールブル
ー色素）４０μｌで５倍に希釈し、９４℃，３分間熱処
理した。
５ｍｌ加え、セルスクレイパーにて細胞を集めた。１２
００ＲＰＭ、５分間の低速遠心にて、細胞を集め、細胞
抽出緩衝液（１％トライトンＸ１００、５μｇ／ｍｌの
ロイペプチン、５μｇ／ｍｌのキモスタチン、５μｇ／
ｍｌのペプスタチンＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライドを添加したＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．
４）１ｍｌを加え、細胞を懸濁し、０℃、４５分間、５
分毎に撹拌し、静置した。４５分後、２０００ｒｐｍ、
５分間遠心し、上清を新しい遠心管に移し、さらに１０
０００ＲＰＭ、３０分間遠心し、遠心上清液を集めた。
この上清液を細胞抽出物として、ウェスタンブロット実
験に用いた。 （２）ウェスタンブロット 細胞抽出物１０μｌをＳＤＳ電気泳動用緩衝液（０．０
６２５Ｍトリス塩酸ｐＨ６．８、１０％グリセロール、
２％ＳＤＳ、５％の２−メルカプトエタノール［還元下
条件時のみ添加］、０．００５％ブロモフェノールブル
ー色素）４０μｌで５倍に希釈し、９４℃，３分間熱処
理した。
【００８６】熱処理サンプルを氷冷し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル（２−１５％、第１化学薬品社）のレ
ーンに５μｌづつアプライした。電気泳動は、電気泳動
緩衝液（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン３．
０ｇ，グリシン１４．４ｇ，ＳＤＳ１ｇを蒸留水に溶解
し全量を１Ｌとした液）にて、２０ｍＡの定電流で約１
時間泳動した。泳動後、イモビロン−Ｐ（ＰＶＤＦ膜、
ミリポア社）に、２０％メタノール添加ＳＤＳ電気泳動
用緩衝液を用いて、セミドライ型のブロッティング装置
（バイオラッド社）で、１００ｍＡの定電流の条件下で
１時間ブロットした。
クリルアミドゲル（２−１５％、第１化学薬品社）のレ
ーンに５μｌづつアプライした。電気泳動は、電気泳動
緩衝液（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン３．
０ｇ，グリシン１４．４ｇ，ＳＤＳ１ｇを蒸留水に溶解
し全量を１Ｌとした液）にて、２０ｍＡの定電流で約１
時間泳動した。泳動後、イモビロン−Ｐ（ＰＶＤＦ膜、
ミリポア社）に、２０％メタノール添加ＳＤＳ電気泳動
用緩衝液を用いて、セミドライ型のブロッティング装置
（バイオラッド社）で、１００ｍＡの定電流の条件下で
１時間ブロットした。
【００８７】ブロッティング後、５％スキンミルクで室
温、３０分間、膜をブロッキングした。その後、ビオチ
ン化標識抗体１μｇ／ｍｌ（０．５％スキンミルク／Ｐ
ＢＳ中）で、室温、１時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン１μｇ
／ｍｌ（０．５％スキンミルク／ＰＢＳ中）で、室温、
０．５時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ
発色キット（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社、Ｎ
ｏ．５０−８１−００）にて発色させ、発色後、水洗し
反応を停止させた。
温、３０分間、膜をブロッキングした。その後、ビオチ
ン化標識抗体１μｇ／ｍｌ（０．５％スキンミルク／Ｐ
ＢＳ中）で、室温、１時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅ
ｅｎ２０添加ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ア
ルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン１μｇ
／ｍｌ（０．５％スキンミルク／ＰＢＳ中）で、室温、
０．５時間反応させ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ
発色キット（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社、Ｎ
ｏ．５０−８１−００）にて発色させ、発色後、水洗し
反応を停止させた。
【００８８】この結果、ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産
生するヒト型モノクローナル抗体を用いた場合、Ａ５４
９及びＰＣ６において主要なバンドとして分子量約５０
万〜約８０万の位置（還元下および非還元下）のバンド
が認められた。従って、これらの対応抗原は癌細胞株に
顕著に発現されていることが確認できた。
生するヒト型モノクローナル抗体を用いた場合、Ａ５４
９及びＰＣ６において主要なバンドとして分子量約５０
万〜約８０万の位置（還元下および非還元下）のバンド
が認められた。従って、これらの対応抗原は癌細胞株に
顕著に発現されていることが確認できた。
【００８９】
【発明の効果】本発明にかかるヒト型モノクローナル抗
体は、以上のように、肺癌の治療薬、体内診断薬あるい
は体外診断薬として利用することができるという効果を
奏する。
体は、以上のように、肺癌の治療薬、体内診断薬あるい
は体外診断薬として利用することができるという効果を
奏する。
【図１】図１は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４９と
の反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。
の反応性を４０５ｎｍの吸光度で示した図である。
【図２】図２は、ヒト型抗体の担癌ＳＣＩＤマウス腫瘍
部への集積性を腫瘍部への単位重量当たりの集積量
（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量（Ｂ）に対す
る比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。
部への集積性を腫瘍部への単位重量当たりの集積量
（Ｔ）の血液への単位重量当たりの集積量（Ｂ）に対す
る比（Ｔ／Ｂ）で表した図である。
【図３】図３は、ヒト型抗体の肺腺癌細胞株Ａ５４９に
対するＣＤＣ活性を示した図である。
対するＣＤＣ活性を示した図である。
【図４】図４は、肺癌血漿検体を用いた酵素免疫測定結
果を４０５ｎｍの吸光度表示した図である。
果を４０５ｎｍの吸光度表示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/574 Ｄ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞の特性
を有するハイブリドーマ２８Ｋ２９。 - 【請求項２】 ハイブリドーマ２８Ｋ２９が、以下の特
性を有する抗原： （１）該抗原は上記ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産生す
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺小細胞癌株ＰＣ−６株の細胞抽出物中
に含まれ、かつ還元および非還元下でのＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動上で主要なバンドとして、分子量
が約５０万〜約８０万の位置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞膜上に存
在し： （４）該抗原が肺癌患者体液中に存在する： （５）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する：を認識し
てなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体産生能を有する
請求項１記載のハイブリドーマ２８Ｋ２９。 - 【請求項３】 工業技術院生命工学工業研究所に受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１４１１９号で寄託された細胞の特性
を有するハイブリドーマ２８Ｋ２９が産生するヒト型モ
ノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ヒト型モノクローナル抗体が、以下の特
性を有する抗原： （１）該抗原は上記ハイブリドーマ２８Ｋ２９が産生す
るヒト型モノクローナル抗体によって結合され得： （２）該抗原が肺小細胞癌株ＰＣ−６株の細胞抽出物中
に含まれ、かつ還元および非還元下でのＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動上で主要なバンドとして、分子量
が約５０万〜約８０万の位置に存在し： （３）該抗原が肺腺癌細胞株Ａ５４９株の細胞膜上に存
在し： （４）該抗原が肺癌患者体液中に存在する： （５）該抗原が肺癌患者癌組織中に存在する：を認識し
てなるＩｇＭヒト型モノクローナル抗体である請求項３
記載のヒト型モノクローナル抗体。 - 【請求項５】 請求項３に記載のヒト型モノクローナル
抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を主成分
とする癌検査薬。 - 【請求項６】 請求項３に記載のヒト型モノクローナル
抗体若しくは該ヒト型モノクローナル抗体断片を成分と
する癌治療薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6301836A JPH08154671A (ja) | 1994-12-06 | 1994-12-06 | ハイブリドーマ２８ｋ２９ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6301836A JPH08154671A (ja) | 1994-12-06 | 1994-12-06 | ハイブリドーマ２８ｋ２９ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08154671A true JPH08154671A (ja) | 1996-06-18 |
Family
ID=17901749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6301836A Withdrawn JPH08154671A (ja) | 1994-12-06 | 1994-12-06 | ハイブリドーマ２８ｋ２９ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08154671A (ja) |
-
1994
- 1994-12-06 JP JP6301836A patent/JPH08154671A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020305 |