JPS62500518A - 免疫毒素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫毒素及びその製造方法 本発明は、毒性分子を特にたとえば寄生虫のような成る行の真核細胞及び好まし くはヒト細胞のよう彦呻乳動牧ｊに供給して、これら細胞の特異的破滅をもたら す薬剤に関するものである。この薬剤は免疫毒素と呼ぶことができ、次の３種の 成分を有する：（ａ）成る種の真核細胞、たとえばヒト、猿などの細胞のような 補乳動物細胞或いはこれに関連する成る種の抗原に高度に特異的に結合するモノ クローナル抗体、たとえばネズミ若しくはその他の呻乳勘物のモノクローナル抗 体、（ｂ）リポソーム−失活蛋白員若しくは毒素、及び（ｃ）抗体が毒素を特定 の標的細胞へこの毒素を分離し又は活性化することなく供給して、動物体としう る環境中の標的細胞へ達せしめる抗体に対する毒素の結合である。

たとえば毒素のような薬理剤の特異的キャリヤとして抗体を使用する可能性が、 ／％イブリドーマ技術を使用してυ１度に特異的な純粋モノクローナル抗体を生 産しうる能力のため急速に発展しつつある研究の主題となっている。最近、ｊ挨 鵠関連抗原を識別するモノクローナル抗体が開発されている〔たとえば、リッツ （Ｒｌｔｚ　）等、ネイチャー、第２８５巻、第５８３〜５８５頁（１９８０） ；ウッドベリー（Ｗｏｏｄｂｕｒ）’　）等、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、第７７巻、 第２１８３−２１８６頁（１９８０）；ヘルリン（Ｈｅｒｌｙｎ　）等、ＰＮＡ Ｓ（ＵＳＡ）、第７６巻、第１４３８〜１４４２頁（１９７９）；並びにセエオ ン（５ｏｏｎ　）等、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、第８０巻、第８４５−８４９頁（１ ９８３）に記載されている〕。この種の抗体を利用して嵩性剤を特定の腫瘍細胞 に供給して、これらを選択的に死滅させうると思われる。リポソーム−失活用蛋 白質〔たとえばパルビニＩＪ　（Ｂａｒｂｉｅｒｌ　）等、カンサー・サーベー 、第１巻、第４８９−５２０頁（１９８２）：及びオルソｙ　（０１ｓｎｅｓ　 ）等、毒素及びウィルスの分子作用（コーヘン（Ｃｏｈｅｎ　）等編）、第５１ 〜１０５頁、エリセビール出版（１９８−２）　）が、この目的に対する理想的 々毒性剤であると思われる。大抵の努力は、ジスルフィド結合により結合された ２種の同一でないサブユニツ）（Ａ及びＢ連鎖）より々るリチン（ヒマの種子（ Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｒＩＴｎｕｎｉｇ　）から抽出される）を使用することに 向けられている。Ａ−鎖が細胞の細胞質甲に入ると、そのリポソームの触媒失活 によって細胞の死滅をもたらす。Ｂ−鎖は細胞表面の炭水化物成分に結合する性 質を有し、かつ細胞中へのＡ鎖の吸収を促進すると思われる。

従来、免疫毒素は完全リチンを抗体へ結合させて作成されていた〔ヨウ／’　（ Ｙｏｕｌｅ　）等、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、第７７巻、第５４８３−５４８６頁（ １９８０）；）ルベ等、ネイチャー、第２９７巻、第５９４−５９６頁及びパレ ラ（Ｖａｌｌｅｒａ　）等、サイエンス、第２２２巻、第５１２−５１５頁（１ ９８３））。゛この糧の免疫毒素は、リチンのＢ−鎖結合部位に対し高一度にて 細胞表面と競合する乳糖の存在下においてのみ特異的彬性を示す。生体内におい て、これらの免疫毒素はりチン自身と同様に非特異的付素であると予想され、し たがって移植用の骨髄のインビトロ処理において限られた用途を有するが治療価 値が低いと思われる。遊離リチンのＡ−釦は、Ｂ−鎖から完全分離されると、遊 離ＡＩＪが細胞表面に付着する能力がないため、完全リチンよりもインビロトに て１０６〜１０＠倍低い毒性を示す。Ａ−鎖が抗体に結合すると、得られる免疫 毒素は一般に適当が表面抗原を有するこれら細胞に対し特異的細胞毒性を示す。

しかしながら、毒性作用の発現はりチンと比較して遅いため、長い培養時間を用 いる８畏がある。高度の毒性は、化学結合がジスルフィド結合を含む時のみ示さ れた。免疫毒素が化学的に安定々非開裂性結合を有する場合には、殆んど又は全 く毒性がなかった〔マスホ叫、ジャーナル・バイオケミストリー、第９１巻、第 １５８３−１５５Ｍ頁（１９８２））。

リチンＡ−鎖の性質にのみ類似した性質及び特性を有する種類のリポソーム失活 用蛋白質が存在する。ゲロニン及び３棟の公知のヤマゴボウ抗ウイルス蛋白（Ｐ ＡＰ　）の基本的蛋白質であって、極めて安定であることが知られており、細胞 には結合せず、したがって完全細胞に対し極めて高疾度でない限り非毒性であり 、リチンにつき操作する際必要な高度の注意なしに精製及び操作するのに安全で ある。ゲロニン及びＰＡＰを使用して免疫毒素が作成されておりかつ一般にこれ らはりチンＡ−鎖で作成された免疫毒素に対し同程度の特異的細胞宿性を示した が〔トルベ（Ｔｈｏｒｐｅ　）等、ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミスト リー、第１１６巻、第４４７−４５４頁（１９８１）；”ランパッチ（Ｃｏｌｕ ｍｂａｔｔｉ　）　郷、ジャーナル・イミュノロジー、第１３１巻、第５０９１ −５０９５頁（１９ａ３）；ウイールス（Ｗｉｅｌｓ　）等、カンナーーリサー チ、第４４巻、第１２９−１３５頁（１９８４）及びラマクリシナン（Ｒａｍａ ｋｒｉｓｈｎａｎ　）等、カンサー・リサーチ、第４４巻、第２０１−２０８頁 （１９８４））、いずれも非結合抗体からは完全には精製されない。非結合抗体 の存在は、たとえば抗原を封鎖し或いは内部通路を飽和することにより細胞劣性 試験の結果に影譬を及ぼし、このことはこれら免疫毒素に一つき記載された能力 の大きな変動の原因となりうる。

リチンＡ−鎖と異なりゲロニン及びＰＡＰ毒素は利用可能なスルフヒドリル基を 持たないので、先ず最初にこれらはたとえば構造； 〔式中、ｍは１〜５の整数である〕 を有する一般的な架橋剤、たとえばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジ テオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させて、ジチオピリジル基のジスルフ ィド結合を還元した後に、スルフヒドリル含有毒素結合体を生成させ、次いでこ れを同様なジチオピリジル含有の抗体結合物に共有結合させてジスルフィド含有 結合を抗体と毒素との間に形成させる８薬がある。５ＰＤＰ々どとこの種の４素 との反応は参素の顕著な非可逆的失活をもたらして、最終的架橋毒素−抗体番合 体又は免疫毒素が顕著に低下した毒性活性を示すことを突き止めた。

本発明は、高活性の免疫粉素と呼ばれる毒素と抗体との間の共有架橋結合した複 合体を提供し、その際利用しうるスルフヒドリル基を持たないリポソーム失活用 蛋白質をイミノチオールエステル塩と反応させてスルフヒドリル含有の結合体を 生成させ、モノクローナル抗体な５ＰＤＰと反応させて第２のジチオピリジル含 有の結合体を生成させ、かつ両結合体を共有結合させて、抗体がジスルフィド結 合を介しリポソーム失活性蛋白質もしくは複素に結合している複合体若しくは免 疫毒素を生成させる。

利用しうるスルフヒドリル基を持たない任意のリポソーム失活性蛋白質を本発明 における毒素として使用することができ、この種のものとしてはグロニウム・ム ルチフロルム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ　）の種子からのゲ ロニン、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎ ａ　）の種子（ＰＡＰ　−Ｓ　”）又はその葉（ＰＡＰ若しくはＰＡＰＩＩ）か らのヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質、モモルジカ・チャランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉ ｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ　）からのＭＣＩ及びサポナリア・オフィシナリスＬ （５ａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｌｎａｌｉｓ　Ｌ、）からのリポソーム失活 性蛋白質が埜げられる。ゲロニンはスチルベ（５ｔｉｒｐｅ　）等によりジャー ナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５５巻、第６９４７−６９５５頁（ １９８０）に記載されたようにｆｖ製することができ、ＰＡＰ−８はパルビエリ 等によりバイオケミカル・ジャーナル、１４１，２０５巻、第５５−５９頁（１ ９Ｂ２）に記載されたように精製することができ、またＰＡＰ及びＰＡＰＩＩは アービン（Ｉｒｖｉｎ　）等によりＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ ）’ｓ、、第２００巻、第４１８−４２５頁（１９８０）に記載されたように精 製されたように精製することができ、ＭＣＩはバルビエリ等によりバイオケミカ ル・ジャーナル、第１８６巻、第４４５−４５２頁（１９８０）に記載されたよ うにｆｉｌ　＆！することができ、さらにサボナリア・オフィシナリスＬからの リポソーム失活性蛋白質はスチルベ等によりバイオケミカル・ジャーナル、第２ １６巻、第６１７−６２５頁に記載されたように精製することかで本発明におい て毒素と反応させうるイミノチオールエステル塩としては、構造： 又は 〔式中、ｎは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基 でありかつＡ″″は、たとえば塩素イオンのよ５な水溶性陰イオンである〕を有 するものが挙けられる。好適なエステル塩はメチル３−メルカプトプロピオンイ ミデート塩酸塩及び２−イミノチオラン塩酸塩を包含し、後者は４−メルカプト ブチルイミデートの環化型である。

本発明の免疫毒素における抗体としては、たとえば寄生虫及び捕乳動物細胞など の真核細胞に対し特異的な任意のモノクローナル抗体を使用することができる。

特に興味あるものは、ヒト腫瘍細胞に特異的な抗体である。

適するモノクローナル抗体としては、ヒ）Ｔ細胞に対し特異的なもの、たとえば ハイプリドーマ細胞ラインＡＴＣＣ４３５１５からのラインへＡ／ッ（Ｒｅ１ｎ ｈｅｒｚ　）の米国特許第４．４４へ４２７号における抗−Ｔ１２、ハイブリド ーマ細胞ラインＡＴＣＣ／％ＨＢ　８２１３からの抗−Ｔ　Ｉ　ＩＢ及びクール ター・イミュノロジーから入手しうる抗−Ｔ３、−Ｔ４、−Ｔ１１及び−ＴＩ２ モノクローナル抗体、並びに一般的な急性リンパ芽球白血病抗原に特異的なモノ クローナル抗体、たとえばリッツ等によりネイチャー、第２８３巻、第５１５− ５８５頁（１９８０）に記載されたようなＪ５及びリッツ等によりバイオロジカ ル・リスボンシス・イン・カンサーにヒラク編）、第１巻、第１−２１頁（１９ ８２）に記載されたようなＪ１５が挙けられ、″これら両者はクールター・イミ ュノロジーから入手することができる。

反応は次のように示すことができる： 結合体２ 結合体１＋結合体２　→ 〔ここでｎ及びｍは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個の炭素原子を有するアル キル基でありかつＡ−は非毒性の水素性陰イオンである〕。

毒素とイミノチオールエステル塩との間の反応は、たとえば任意の適当な緩衝剤 のような水性媒体中で約ｐＨ６〜９にて約Ｏ〜５０℃、好ましくは約Ｏ℃の温度 で行なうことができる。反応は好ましくは過剰のイミノチオールエステル塩を用 いて不活性雰囲気下に行ない、毒素中に導入されたスルフヒドリル基の酸化を防 止すると共に、好ましくは９０分間若しくはそれ以上かゆて毒素分子１個当り（ Ｌ６〜α７個のスルフヒドリル基を導入する。

この反応は、過剰のイミノチオールエステル塩を適当な緩衝剤でのゲル濾過によ り除去して停止させることができる。

モノクローナル抗体と５ＤＰＤ々どとの反応は、たとえば任意適当な緩衝剤のよ うな水性媒体中で約ｐＨ６〜９にてＯ″″〜５０℃、好ましくは２５〜３５℃の 温度で過剰の５ＤＰＤを用いることにより約３０分間若しくはそれ以上にわたっ て行なわれる。この反応は、緩衝剤でのゲル濾過により或いは緩衝剤に対する０ 〜４０℃での透析によって停止させることができる。このように製造された結合 体は、抗体分子１個当り約２〜２５個のジテオピリジル基を有する。

上記のように作成した２種の結合体を互いに反応させて所望の架橋した免疫痴素 を生成させることができ、その際単にこれらを互いに水性媒体、たとえば任意適 当な緩衝剤中で約ｐＨ６〜９にて０〜５０℃の温度で混合すれば良い。好ましく は、毒素結合体は抗体結合体の２：１〜８：１のモル比にて過剰に使用される。

ジスルフイイド基を有する架橋の形成をもたらす反応は２０時間以内で実質的に 完結する。次いで、全ての残存する遊離スルフヒドリル基は、たとえばイオドア セタミドの添加により封鎖することができ、かつ反応混合物を２５℃にてさらｌ ｃ１時間培養し、この時点で全ての架橋されてない毒素若しくは毒素結合体をゲ ル濾過により及び（又は）親和性クロマトグラフィーにより除去することができ る。

得られた精製免疫Ｓ素は、出発物質として用いた毒素とほぼ等しいリポソーム失 活能力を示すと共に、モノクローナル抗体出発物質から殆んど変化していない特 異性結合能力及び親和力を示す。本発明における免疫毒素の高レベルの細胞男性 は、これらを分析試薬として或いは骨髄のインビトロ処理におけると同様にＴ細 胞及び（又は）成る種の白血病細胞を選択的に破滅させるための治療剤として有 用にする。

以下、本発明の範囲を限定することな〈実施例により本発明の特徴を一層明療に 説明する。

実施例１ モノクローナル抗体Ｊ５（抗−ＣＡＬＬＡ）及びゲロニンから免疫壽素を作成し た。

Ｊ５抗体は、アイ等によりイミュノヶミストリー、第１５巻、第４２９−４３６ 員（１９７８）Ｋ記載されたように、蛋白Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（シグマ ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）における親和性り覧マドグラフィーにより ネズミの腹水液から精製した。さらに、この抗体を、グリシン（５０ｍＭ）及び 公比ナトリウム（α０１％ｗ／ｖ）を含有するｐＨ４０の１０ｍＭのリン酸ナト リウム緩衝液中でＣＭ−セルロース（ＣＭ−５２，７ツトマン・ケミカル・セパ レーションス社、クリ７トン、ＮＪ）のカラムにおけるイオン交換クロマドグ２ フイーにより精與した。このカラムを同じ緩衝液におけるＯ〜１００ｍ’Ｍの塩 化ナトリウム濃度勾配にて展開させた。ｎ製した抗体をリン酸緩衝塩水で透析し た。

ケロニンハ、スチルベ等によりジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第 ２５５巻、第６９４７−６９５５頁（１９８０）に記載されたように精製したが 、ただしリン酸緩衝塩水における微細セファデックスＧ−１００（７アルマシヤ ・ファイン・ケミカルス、ウプサラ、スエーデン）のカラムにおけるゲル濾過に よりさらに精製Ｎｎした抗体を、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有するｐＴＴＺＯの１ ００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に溶解させ（１４／ｄ）、かつエタノール中１ ０ｍＭの５ＰＤＰ（ピアス・ケミカル９カンパニー社、ｐツク７オード、ＩＬ） の新たに作成した溶液５．５μｌを抗体溶液１−当りに添加した。この反応混合 物を５０℃にて３０分間培養し、次いで抗体をＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有するｐ Ｈ７，０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に対し透析して過剰の試薬を除去 した。これらの条件下で抗体１分子当り約２個の基を導入して、ジチオピリジル 含有のＪ５結合体を生成させた。

スルフヒドリル含有ゲロニン結合体の生成ニリン酸緩衝塩水におけるゲロニン（ ４岬／−）を蒸留水と（Ｌ５Ｍ）リエタノールアミン／ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８， ０）とＱ、１ＭのＥＤＴＡとで２キ／−まで希釈して、トリエタノールアミン及 びＥＤＴＡの最終濃度をそれぞれ６０ｍＭ及び１ｍＭにした。この溶液な脱気し かつアルゴン下で０°ＣＫ保った。２−イミノチオラン塩酸塩（ピアス・ケミカ ル・カンバーニー社）を、０．５Ｍ）リエタノールアミン／ＨＣ１＆（１１液（ ｐＨ８，０）とｔｏｅのＮａＯＨとの氷冷混合物（１：ｊｖ／ｖ）により１５モ ルに溶解させ、かつこの水冷ゲロニン溶液へ１−当り２μｌを添加した。アルゴ ン下で０℃にて９０分間培培養た後、この溶液をＮａＣ１（５０ｒｎＭ　）及び ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有するｐ　Ｈ５，８の５ｍＭビストリス酢酸緩衝液にお けるセファデックスＧ−２５（微細）カラムで脱塩して未反応試薬を除去すると 共に、ゲロニン誘導体を形成させた。この工程及びその後の工程は全て４℃ＥＤ ＴＡ（α５　ｍ　Ｍ　）を含有するｐ　Ｈ７，０の１００ｍＭのＮａＰｉｉ衝液 における上記のジチオピリジル含有Ｊ５結合体（０，５−ｔ　ｏｗｑ／−）を、 ＮａＣ１（５０ｒｎＭ　）とＥＤ　ＴＡ　（１ｍＭ　）とを含有するｐＨ５，８ の５ｍＭビス−）　ＩＪス／酢酸緩衝液における上記スルフヒドリル含有ゲロニ ン結合体（α５−１Ｏ■／−）の同重量（約５倍モル過剰）と混合した。この混 合物のｐＨをα５Ｍ）リエタノールアミン／ＨＣＩ緩衝液（ＰＨ８，０）の添加 により７．０まで上昇させ、次いでこの混合物をアルゴン下で４℃にて２０時間 保った。最後に、イオドアセタミ基を封鎖すると共に、培養を２５℃にてさらに １時間続未結合のゲロニン並びにスルフヒドリル含有ゲロニン結合体を、上記し たよ５に蛋白Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂのカラム（抗体１００■にっきカラム １５ｍ）に溶液を通過させて混合物から除去した。結合した蛋白をＮａＣ１（１ ，１５Ｍ）を含有する１１Ｍ酢酸で溶出させ、かつ回収直後に各フラクショｙへ ０．１容量のｔＯＭＫＰｉ　緩衝剤（ｐ）（７，５）を添加した。この蛋白質を 、ＮａＣ１（３５ｍＭ　）とＮａＮ１　（α４　ｍ　Ｍ　）とを含有する５ｍＭ のＮａＰｉ緩衝液（ＰＨ４５）に対して透析し、次いで予め同じ緩衝液で平衡化 させたＣＭ−セル四−スのカラム（ワットマン、ＣＭ−５２；抗体１００Ｉｖに っきカラム３０−）に加えた。未結合のＪ５及びそのジチオピリジル含有結合体 はこれらの正確はイオン強度及びｐＨの条件下でＣＭ−セルロースに結合せず、 緩衝液での洗浄によってカラムから除去した。Ｊ５を含有しかつゲロニンを含有 する免疫毒素はカラムに結合し、ＮａＣ１（ｔ　ＯＭ）を含有する１１００ｒｎ のＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ６，５）にて小容量で溶出させた。かくして、未結合の Ｊ５並びにゲロニン及びその結合体の両者を含有せず、これをＮａＣ１（１４５ ｍＭ　）を含有する１　０　ｍＭ　ＫＰＩ緩衝液（ｐＨｚｏ）で平衡化させたセ ファクリルＳ−３００カラム（９９ｃ！ＩＬＸ　２．６ｃｍ）でのゲル濾過にか けて高分子量の凝集物を除去した。最後に、この免疫毒素を（Ｌ２２μｍの濾過 膜（ミレツクスーＧＶ、ミリボア・コーポレーション社、ベッドフォード、ＭＡ ）に溶液を通して滅菌した。

実施例２〜５ モノクローナル抗体ニー２、Ｊ５０、抗−Ｔ１１１Ｂ及び抗−’ｌ’１１　を、 ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ　）によＣ リジャーナル・イミュノロジー、メソッド、第１３巻、第２１５−２２６頁（１ ９７６）に記載されたように蛋白Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂにおける親和性ク ロマトグラフィーによって脱水液から精製した。抗体含有７ラクシヨンを直ちに １／１０容蓋のｔ　ＯＭ　ＮａＨＣＯｓの添加により中和し、次いでグリシン（ ５０ｍＭ）とＮａＮ。

（α４　ｍ　Ｍ　）とを含有する１０ｍＭのＮａＰｉ緩衝液（ｐＨｔｏ　）で透 析し、さらに同じ緩衝液で平衡化したＣＭ−セルロースのカラム（ワットマン、 ＣＭ−５２）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。

カラム（蛋白質１２０■につき床容槓５０−）を同じ緩衝液におゆるＮａＣ１の 濃度勾配、すなわちＩ−２、抗−Ｔ１１　及び抗−Ｔ１１１ｃについては０〜２ ００ｍＭ。

Ｂ またＪ５０については０〜３００ｍＭを用いて展開させた。精製した抗体を最後 にＮａＣｔ　（１ａ　５ｍＭ）を含有する１０ｍＭのＫＰｉ　緩衝液（ｐ　Ｈ７ ，２）で透析して、−７０℃で貯蔵した。

免疫￥Ｂ素をＩ−２、Ｊ３０、抗−Ｔ１１１Ｂ及び抗−Ｔ１１１ｃ並びにゲロニ ンから作成したが、手順は未結合の抗体をＣＭ−セルロースにより免疫毒素から 分離するために使用した溶液においてのみ実施例１とは異なっている。分離用の ４種の緩衝液は全てＮａＰｉ　（５ｍＭ）とＮａＮ１　（０，４ｍＭ　）とを含 有し、これらをｐＨ４５に調整したが、ただし、３１０に対する緩衝液はｐ　Ｈ ７，０に調整した。ＮａＣ１の濃度はＩ−２及びＪ３１Ｃついては溶液中４０ｍ Ｍとし、抗−Ｔ１１．ｃについては溶液中５４ｍＭとし、また抗−Ｔ１１１ＢＫ ついては溶液中２５ｍＭとした。

実施例６ 免疫毒素を抗−Ｔ１１．Ａ及びゲロニンから実施例１におゆると同じ手順で作成 したが、ただし抗−Ｔ１１．Ａは蛋白質Ａに結合しないので、この抗体を含有す る腹水液を彊白質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂに通過させて蛋白ｉＡに結合する ＠量のネズミ免疫グロブリンを除去することにより精製した。次いで、（ＮＨ４ ）ｔ　ＳＯ４を５０％飽和まで加えることにより溶出液を分画した。沈澱した蛋 白質を、ＮａＣ１（１ａ　ｓｍＭ）を含有する１０ｍＭのＫＰｉ　緩衝液（ｐ　 Ｈ７，２）に溶解させ、次いでｐＨ６，０の緩衝液で透析し、上記と同様にＣＭ −セルロースのカラムでクロマトグラフィーにかけた。カラムは０〜３００ｍＭ のＮａＣ１の濃度勾配で展開させた。抗−Ｔ１１１Ａを含有するフラクションを 集め、濃縮し、かつＮａＣ１（１４５ｍＭ）を含有する１０ｍＭのＫＰ　ｔ　（ ｐＨ７，２）に平衡化させたセファクリルＳ−３０００カラム（９９αＸ２．６ α）にてゲル濾過にかけた。

実施例１に記載した手順により、この抗−Ｔ１１１Ａ抗体とゲロニンとを架橋さ せた後、反応混合物を限外濾過によって濃縮し、かつ過剰の遊離ゲロニン並びに 高分子量のゲロニン結合体及び凝集体を、ＮａＣ１（１４５ｍＭ　）ヲ含有する １０ｍＭ＋７）ＫＰｉ　緩衝１（ｐＨ７２）で平衡化したセアアクリルＳ−３０ ０のカラム（９９ｃＩｎＸ２．５α、抗体１００■を含有する試料１２ゴにつき ）でのゲル濾過によって分離した。遊離の抗−Ｔ１１１Ａ及びそのジチオピリジ ル含有の結合体を実施例１に記載したと同様なＣＭ−セルロース分画によって免 疫毒素から分離した。ただし、緩衝液はＮａＣ１（２ｔ　５ｍＭ）とＮａＮ１（ ａ４ｍＭ）とを含有する５ｍＭのＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ６５）とした。精製した 免疫毒素を上記と同様にカラムから溶出させ、かつＮａＣ１（１４５ｍＭ）を含 有する１０ｒｎＭのＫＰｉ　緩衝液（１）　Ｈｙ、　ｏ　）で透析した。

実施例７−１１ 免疫毒素をＪ５並びに精製したＰＡＪ、ＰＡＰＩ［及びＰＡＰ−８のそれぞれか ら実施例１におけると同じ手順にしたがって作成した。さらに、免役毒素を抗− Ｔ１１１Ｂ及びＰＡＰ−８から実施例４におけると同じ手順で作成し、かつ抗− Ｔ１１　及びＰＡＰ−３から実施例６におＡ けると同手順で作成した。

抗体及び免疫毒素の抗原結合活性 各種の抗体及び免疫毒素の結合活性を間接的な免疫螢光性によって測定した。適 切な抗原を有する各種細胞（１×１０６個）の培養物を０℃にて３ａ分間培養し 、その際２．５％（ｖ　／　ｖ　）のＡＢ−型の収集したヒト血清とＮａＣ１（ α９％ｗ／ｖ）含有の１％（ｖ／ｖ）の１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７２）とを 補充した懸濁培養物に対するイーグル最小必須培地（ギプコ・ラボラドリース社 ）１００μノにて抗体若しくは免疫毒素をシリーズで希釈した。次いで、これら 細胞を氷冷した培地で３回洗浄した後、フルオレシン標識したヤギ抗−ネズミＩ ｇＧ抗体で０℃にて３０分間染色し、その際保存溶液（メロイ・ラボラドリース 社）を培地で１：２５に希釈したもの１００μｌを用いた。再び細胞を水冷培地 で３回洗浄した。螢光性の抗体４Ｉ佼した細胞を最後にＥＰＩＣ８ＩＶ細胞ソー タ（クールター・エレクトロエックス社、バイアＩＪ−１ＦＩ）で分析した。そ の結果は、適切な抗原陽性細胞に対する免疫毒素の結合が各対応の抗体自身にお けると同様であることを示した。さらに、免疫毒素は、抗原陰性細胞に対し検出 しうる結合を示さなかった。各抗体の特異性及び親和性が免疫毒素に完全に維持 された。

蛋白合成に対するゲロニン又はヤマゴボウ抗ウイルス蛋白及び免疫毒素の阻止活 性を、ウサギの網状赤血球溶別物で測定した。ＮａＣ１（２０ｍＭ　）及び牛血 清アルブミン（（Ｌ２■／−）を含有する１０ｍＭのＫＰｉ　緩衝液（ｐ　Ｈ７ ，４）にて［１０２μｇ／−のゲロニンまで希釈したゲロニン若しくは免疫毒素 の試料１μｌを、０．５　Ｍｌ。

のエツペンドルフ管における網状赤白球溶解物（１０μｌ）へ０℃にて添加した 。塩と緩衝剤カクテルにューイングランド・ヌクレア社）とを含有する混合物、 す々わち従来ペルハム（Ｐｅｌｈａｍ　）等によりヨーロピアン・ジャーナル・ バイオケミストリー、第６７巻、第２４７−２５６頁（１９７６）に記載されて いるような１９種のアミノ酸とクレアチン燐酸塩（ＣＬ１５μモル）とクレアチ ンホスホキナーゼ（２，５μｇ）とｍＲＮＡ（８０μｇ）と５７ｍＣ１／μモル の比放射性まで希釈した［：Ｈ”）−ロイシン（１６μＣｉ　）との混合物１６ μｌを添加して反応を開始させた。急速混合した後、チューブを３０℃で培養し た。試料（３μ））を種々異なる時点で採取し、蛋白質中への〔Ｈ８〕−ロイシ ンの組込みを、蒸留水（α４−）中への希釈によって停止させた。放射線標識し た蛋白質を、ペルハム等（上記）に記載されたように定量した。

上記のウサギ網状赤白球溶別物系における蛋白質合成は２０ｐ１のゲロニンによ り完全に阻止された。ジチオエリスリトールによる事前の還元（２０ｍＭ、３０ ℃にて５０分間）の後に２−イミノチオラン塩酸塩（ｔａチオール基１モル）と の反応により行なったゲロニン結合体の分析は正確に同じ阻止を示し、４個まで のチオール基が蛋白合成を阻止するその能力を阻害することなく２−イミノチオ ラン塩酸塩との反応により各ゲロニン分子中に混合されうろことが判明した。Ｊ ５−ゲロニン免疫毒素は、事前の還元なしに分析した場合、蛋白合成阻止剤とし て天然ゲロニンよりも低い活性を有するが、ジチオエリスリトールと共に予備培 養すればこの分析における蛋白質合成を阻止するその能力において天然ゲロニン から区別し元々いよすな充分活性のゲロニンを放出することが判明した。同様な 結果が、上記したような他のゲロニン免疫毒素並びにＰＡＰ、ＰＡＰ−ｎ及びＰ ＡＰ−８を含むような免疫毒素についても得られた。

細胞毒性分析： 細胞（ｓｘ１ｏ’個の細胞を含有する１１ゴの培地）を９６穴（平底）のポリス チレン製マイク；タイ）−板（マイクロテスト■、ベクトン・デキンソン社）に 塗床した。細胞毒性につき試験する蛋白質のシリーズ希釈物を含有する等容積（ α１−）の培地を各人に加え、次いでシェル−ＬＡＢ培養器（シェルダン・マニ ュファクチャリング・インコーポレーション社、コーネリウス、ＯＲ）にて５％ のＣＯ，を含有する湿潤雰囲気内で３７℃にて細胞を培養した。必要とする培養 時間の後、細胞Ｋ（Ｈ”　）−チ？ジｙ（ａｓμｃｉ／穴１個）Ｋて２時間パル ス処理し、次いで収穫し、かつＰＨＤ細胞ノー−ベスタ（ケンブリッジ・テクノ ロジー・インコーポレーション社、ケンブリッジ、ＭＡ）を用いてガラス繊維盤 上へ溶解させた。水とエタノールとで洗浄した後にフィルタ上に保持された放射 能を、パラカード・トリーカルブ４５３０シンチレーシヨンカウンタを用いて２ −のべ−タフラフ中で測定した。全ての分析は３反復で行ない、各冥験を少なく とも５回反復した。ＩＤｗ＊の値は、〔Ｈ１〕−チミジン組込みの５０チ阻止を 引起こす免疫毒素の濃度として測定した。

上記の分析を用いて免疫毒素の細胞毒性を試験し、全てがＣＡＬＬＡ−含有細胞 ラインの増殖に対する有力な阻止剤となり、宿性の開始が細胞を露出してから２ 〜３日後に出現することが判明した。

手続補正書 昭和６１年１２月２２日 特許辰官黒田明雄殿 事件の表示　、７　。

ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０１２９９ 補正をする者 事件との関係　特許出願人 〒１０３ 住　所　東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号油脂工業会館同 ）重圧の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文のｉ　≠−→←補正の内容　別紙の通り ｔ　請求の範囲を別紙の通りに訂正する。

２、　明細書６頁４行の「グロニウム１を「ゲロニウムー１に訂正する。

五　同同頁１２行のｒ　（ｓｔｉｒｐｅ）　」をｒ　（Ｓｔ　ｉ　ｒｐａ）ｊに 訂正する。

４、同８頁１３〜１４行の「にヒツク編）−」を「（ミヒツク編）」に訂正する 。

＆　同同頁下から３行の「イオド」を「ヨード」に訂正する。

Ｚ　同１１頁下から５〜４行の「窒化ナトリウム」を「アジ化ナトリウム」に訂 正する。。

８、　同１２頁１１行の「ジチオピリジル」を「ジチオピリジル」に訂正する。

９　同１３頁１１行及び下から５行の「酢酸」を「アセテート」に訂正する。

ＩＱ、　同１４３Ｋ　ｉ　行の「イオド」を「ヨード」に訂正する。

１ｔ　同同頁下から８行の「正確は」を「正確な」に訂正する。

１２、同１５頁１３行の「脱水」を「腹水」に訂正する。

１３、同１６頁下から５行の「緩衝液で」を「緩衝液に」に訂正する。

１４　同１９頁下から４〜３行及び２０頁６〜７行の「ジチオエリスリトール」 を「ジチオエリトリトール」に訂正する。

請求の範囲 １　組成： （毒素−ＮＨ）−Ｃ−（ＣＨｚ）ｎ−８−８−（ＣＨｚ）ｍ−Ｃ−（ＮＨ−抗体 ）〔式中、毒素−ＮＨは利用しうるスルフヒドリル基を持たないリポソーム失活 性蛋白質であり、ｎは１〜５の整数であり、ｍは１〜５の整数であり、ＮＨ−抗 体は真核細胞に対し又はこれに関連する抗原に対し特異性のモノクローナル抗体 であり、かつＡ−は非毒性の水溶性陰イオンである〕 を有する免疫毒素。

２　抗体が哺乳動物細胞に対し特異性である請求の範囲第１項記載の免疫沿素。

五　モノクローナル抗体が、と）Ｔ細胞に対し又は一般的な急性リンパ芽球白血 病抗原に対し特異性である請求の範囲第１項記載の免疫毒素。

４、　リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質であ る請求の範囲第１項又は第２項記載の免疫毒素。

５．ｎが３でありかつｍが２である請求の範囲第１項記載の免疫毒素。

乙　モノクローナル抗体が、と）Ｔ細胞に対し又は急性リンパ芽球白血病抗原に 対し特異性である請求の範囲第５項記載の免疫毒素。

２　リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質である 請求の範囲第５項記載の免疫毒素。

８、　モノクローナル抗体がヒ）Ｔ細胞に対し又は一般的な急性リンパ芽球白血 病抗原に対し特異性であり、かつリポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴ ボウ抗ウイルス蛋白質である請求の範囲第５項記載の免疫毒素。

９　利用しつるスルフヒドリル基を持たないリポソーム失活性蛋白質を水性媒体 中で組成：〔式中、ｎは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個の炭素原子を有する アルキル基でありかつえ−は水溶性陰イオンである〕 を有するイミノチオールエステル塩と反応させて、（を素−ＮＨ）−Ｃ−（ＣＨ ｚ）　−８Ｈを有する第１結合体を生成させ、 前記抗体を水性媒体中で構造： 〔式中、ｍは１〜５の整数である〕 を有する試薬と反応させて組成： を有する第２結合体を生成させ、 さらに第１及び第２結合体を水性媒体中で互いに反応させて免疫毒素を生成させ る （ｔＬｆｉ−ＮＨ）　−Ｃ−（ＣＨｚ）　ｎ−Ｓ−８−（ＣＨｚ）　ｍ−Ｃ−（ ＮＨ−抗体）１０、イミノチオールエステル塩が２−イミノチオラン塩酸塩であ り、ｎが３でありかつｍが２である請求の範囲第９項記載の方法。

１１、モノクローナル抗体が、ヒトＴ細胞に対し又は一般的な、急性リンパ芽球 白血病抗原に対し特異性である請求の範囲第９項記載の方法。

１２、リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質であ る請求の範囲第９項記載の方法。

１五モノクローナル抗体がヒ）Ｔ細胞に対し又は一般的な急性リンパ芽球白血病 抗原に対し特異性である請求の範囲第１０項記載の方法。

１４、リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質であ る請求の範囲第１０項記載の方法。

国際護査報告　ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１２９９１Ｍｌ＃１ｌｌＩＩＩｌａｌｌｌ ｌｌ　ａｏｏ＋ｒｃａｕａ。、。ＰＣＴＡ３ｚ−、’、／、！９９

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．組成： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、毒素−ＮＨは利用しうるスルフヒドリル基を持たないリポソーム失活性 蛋白質であり、ｎは１〜５の整数であり、ｍは１〜５の整数であり、ＮＨ−抗体 は真核細胞に対し又はこれに関連する抗原に対し特異性のモノクローナル抗体で あり、かつＡ−は非毒性の水溶性陰イオンである〕 を有する免疫毒素。
2. ２．抗体が哺乳動物細胞に対し特異性である請求の範囲第１項記載の免疫毒素。
3. ３．モノクローナル抗体が、ヒトＴ細胞に対し又は一般的な急性リンパ芽球白血 病抗原に対し特異性である請求の範囲第１項記載の免疫毒素。
4. ４．リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴポウ抗ウィルス蛋白質である 請求の範囲第１項又は第２項記載の免疫毒素。
5. ５．ｎが３でありかつｍが２である請求の範囲第１項記載の免疫毒素。
6. ６．モノクローナル抗体が、ヒトＴ細胞に対し又は急性リンパ芽球白血病抗原に 対し特異性である請求の範囲第５項記載の免疫毒素。
7. ７．リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴポウ抗ウィルス蛋白質である 請求の範囲第５項記載の免疫毒素。
8. ８．モノクローナル抗体がヒトＴ細胞に対し又は一般的な急性リンパ芽球白血病 抗原に対し特異性であり、かつリポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴポ ウ抗ウイルス蛋白質である請求の範囲第５項記載の免疫毒素。
9. ９．利用しうるスルフヒドリル基を持たないリポソーム失活性蛋白質を水性媒体 中で組成： ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等があります▼〔式 中、ｎは１〜５の整数であり、Ｒは１〜５個の炭素原子を有するアルキル基であ りかつＡ−は水溶性陰イオンである〕 を有するイミノチオールエステル塩と反応させて、組成：▲数式、化学式、表等 があります▼ を有する第１結合体を生成させ、 前記抗体を水性媒体中で構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｍは１〜５の整数である〕 を有する試薬と反応させて組成： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する第２結合体を生成させ、 さらに第１及び第２結合体を水性媒体中で互いに反応させて免疫毒素を生成させ る ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の免疫毒素の製造方法。
10. １０．イミノチオールエステル塩が２−イミノチオラン塩酸塩であり、ｎが３で ありかつｍが２である請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．モノクローナル抗体が、ヒトＴ細胞に対し又は一般的な、急性リンパ芽球 白血病抗原に対し特異性である請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴポウ抗ウイルス蛋白質であ る請求の範囲第９項記載の方法。
13. １３．モノクローナル抗体がヒトＴ細胞に対し又は一般的な急性リンパ芽球白血 病抗原に対し特異性である請求の範囲第１０項記載の方法。
14. １４．リポソーム失活性蛋白質がゲロニン又はヤマゴポウ抗ウイルス蛋白質であ る請求の範囲第１０項記載の方法。