DK167194B1

DK167194B1 - Murint monoklonalt antistof rettet mod human-brystcancerceller, murin x murin-hybridomacelle producerende et saadant antistof, immunotoxin omfattende et saadant antistof, murint monoklonalt antistof omfattende et maerkningsmiddel og fremgangsmaade til in vitro drab af human-brystcancerceller og til diagnosticering af human-brystcancerceller.

Info

Publication number: DK167194B1
Application number: DK460385A
Authority: DK
Inventors: Arthur Edward Frankel; David Baratt Ring; Michael Jon Bjorn
Original assignee: Cetus Corp
Priority date: 1984-02-08
Filing date: 1985-10-08
Publication date: 1993-09-13
Also published as: NO853961L; EP0153114B1; JPH0646958B2; JP2502000B2; DE3571648C5; NO2001004I1; JP2546570B2; JPH05184360A; NO164306B; LU90734I2; EP0153114A2; ATE44769T1; NL300040I1; WO1985003523A1; JP2769311B2; JPH05279400A; IL74271A0; NL300040I2; IE58974B1; DK460385D0

Description

i DK 167194 B1

Den foreliggende opfindelse angår murint monoklonalt antistof rettet mod human-brystcancerceller, murin x murin-hybridomacelle producerende et sådant antistof, immunotoxin omfattende et sådant antistof, murint monoklonalt antistof omfattende et mærkningsmiddel og frem-5 gangsmåde til in vitro drab af human-brystcancerceller og til diagnosticering af human-brystcancerceller.

Siden midten af 1970'erne er der fremkommet talrige rapporter om murine monoklonale antistoffer, som reagerer med de til human-10 brystcancer knyttede antigener. I de rapporterede undersøgelser blev mus immuniseret og boosted med human-globulære mælkefedtproteiner, brystcancercellelinier eller brystcancermembranekstrakter. Immuno-splenocytter blev fusioneret med musemyelomaceller, og hybridoma-celler blev udvalgt på basis af en vis specificitet i kulturmediet 15 for bryst- eller brystcancer-antigener. Taylor-Papadimitriou, J., et al., Int. J. Cancer (1981) 28: 17-21; Yuan, D., et al., JNCI (1982) 68: 719-728; Ciocca, D.R., et al, Cancer Res. (1982) 42: 4256-4258.

Talrige forskere har tidligere foreslået eller berettet om binding 20 af cytotoxiske reagenser til antistoffer til dannelse af "immunotox-iner". Den seneste interesse har centreret sig omkring immunotoxiner af monoklonale antistoffer, der ved hjælp af heterobifunktionel le reagenser er konjugeret til de enzymatisk aktive dele (A-kæder) af toxiner af bakterie- eller planteoprindelse. Neville, D.M. og Youle, 25 R.J., Immunol. Rev. (1982) 62: 75-91; Ross, W.C.J., et al., Euro- pean J. Biochem. (1980) 104; Vitteta, E.S., et al., Immunol Rev.

(1982) 62: 158-183; Raso, V. et al., Cancer Res. (1982) 42: 457-464; Trowbridge, I.W. og Domingo, D.L., Nature fCond.l (1981). 294: 171-173.

30

De hidtil kendte antistoffers reaktiviteter mod normalt væv er imidlertid forskellig fra reaktiviteterne mod normalt væv for antistofferne ifølge den foreliggende opfindelse.

35 Den foreliggende opfindelsen angår således et murint monoklonalt antistof, som er ejendommeligt ved, at det (a) binder selektivt til human-brystcancerceller, (b) er af G eller M isotype, DK 167194 B1 2 (c) som konjugeret til en ricin A-kæde udviser en TCID 50%-værdi overfor mindst én af cellerne: MCF-7, CAMA-1, SKBR-3 eller BT-20, i en koncentration på mindre end ca. 10 nM, og 5 (d) binder til et human-brystcancerantigen, hvortil også mindst en af følgende antistoffer: (a) 260F9, ATCC nr. HB 8488, (b) 113F1, ATCC nr. HB 8490, 10 (c) 2G3, ATCC nr. HB 8491, (d) 280D11, ATCC nr. HB 8487, (e) 266B2, ATCC nr. HB 8486, (f) 33F8, ATCC nr. HB 8697, (g) 245E7, ATCC nr. HB 8489, 15 (h) 454C11, ATCC nr. HB 8484, (i) 317G5, ATCC nr. HB 8485, (j) 520C9, ATCC nr. HB 8696 eller (k) 369F10, ATCC nr. HB 8682 20 binder.

Opfindelsen angår også murin x murin hybridomaceller samt afkom af sådanne hybridomaceller, hvilke hybridomaceller er ejendommelige ved, at de producerer et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen.

25

Opfindelsen angår endvidere et immunotoxin, som er ejendommeligt ved, at det er et konjugat af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen og en cytotoxisk del.

30 Opfindelsen angår tillige et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, som er ejendommeligt ved, at det er mærket med et detekterbart mærkningsmiddel.

Derudover angår opfindelsen en fremgangsmåde til in vitro drab af 35 human-brystcancerceller, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, atv-cellerne bringes i kontakt med en cytocidalt effektiv mængde af et immunotoxin ifølge opfindelsen.

Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til diagnosticering af, DK 167194 B1 3 om en human-celle er en brystcancercelle, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at a) en human-celle inkuberes med et antistof ifølge opfindelsen, og 5 b) tilstedeværelsen af mærkede binære immunkomplekser på human-cell en bestemmes.

En sådan analyse omfatter inkubering af celler med de monoklonale 10 antistoffer eller mærkede derivater af disse. Når de mærkede derivater anvendes, aflæses tilstedeværelsen af mærkede binære immunkomplekser på cellerne direkte. Når ikke-mærket antistof anvendes, inkuberes cellerne yderligere med et mærket antistof rettet mod det monoklonale antistof, og tilstedeværelsen af mærkede 15 ternære immunkomplekser på cellerne aflæses.

Ildførelsesformer for opfindelsen

Som anvendt i nærværende beskrivelse betegner "monoklonalt antistof" 20 en antistofsammensætning med en homogen antistofpopulation.

Hvad angår de i eksemplerne angivne monoklonale antistoffer af murin oprindelse rettet mod human brystcancer angiver betegnelsen "funktionel ækvivalent" som anvendt i nærværende beskrivelse et 25 monoklonalt antistof, som: (a) krydsblokerer et eksemplificeret, monoklonalt antistof, (b) binder selektivt til humane brystcancerceller, (c) er en G- eller M-isotype, (d) binder til samme antigen, som påvist ved immunopræci pi tering eller sandwichimmunoanalyse, og (e) når det er bundet til en ricin-A-kæde, udviser en TCID 50% mod 30 mindst en af cellerne MCF-7, CAMA-1, SKBR-3 eller BT-20 på mindre end 10 nM.

Hvad angår de monoklonale antistof-producerende hybridomaceller ifølge opfindelsen er det intentionen, at betegnelsen "afkom" som 35 anvendt i nærværende beskrivelse skal omfatte alle afstamninger, a^kom og efterkommere af moderhybridomacellerne, der producerer det monoklonale antistof mod human brystcancer, som fremstilles af modercellen, uafhængigt af frembringelsesmåden eller den karyotype identitet.

DK 167194 B1 4

Fremstilling af monoklonalt antistof

De antistof-producerende fusionspartnere, som anvendes til at frembringe hybridomacellerne ifølge opfindelsen, frembringes ved at 5 immunisere mus med levende human-brystcancerceller eller membranekstrakter lavet derudfra. Musene inokuleres intraperitonealt med en immunogen mængde af cellerne eller ekstraktet og boostes derpå med lignende mængder af immunogenet. Miltorganer samles fra de immuniserede mus et par dage efter den sidste boosterinjektion, og en 10 cellesuspension fremstilles derudfra til anvendelse ved fusionen.

Hybridomacellerne fremstilles ud fra splenocytterne og en mur in tumorpartner ved anvendelse af den almindelige somatiske cellehybri-diseringsteknik af Kohler, B. og Milstein, C., Nature (1975) 256: 15 495-497 som modificeret af Buck, D.W., et al., In Vitro (1982) 18: 377-381. Opnåelige murine myelomalinier, såsom dem, der kan fås fra The Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, kan anvendes til hydridi seringen. Som det grundliggende omfatter fremgangsmåden fusion af tumorcellerne og splenocytterne 20 ved anvendelse af et fusogen, såsom polyethylenglycol. Efter fusionen adskilles cellerne fra fusionsmediet og dyrkes i et selektivt vækstmedium, såsom HAT-medium, til eliminering af ikke-hybridiserede moderceller. Hybridomacellerne opdyrkes om ønsket, og supernatanter analyseres for anti-human-brystcanceraktivitet ved hjælp af 25 konventionelle immunoanalysemetoder (f.eks. radioimmunoassay, enzymimmunoassay eller fluorescensimmunoassay) ved anvendelse af immuniseringsreagenser (brystcancerceller eller membranekstrakt) som antigen. Positive kloner karakteriseres yderligere til bestemmelse af, om de tilfredsstiller kriteriet for antistofferne ifølge 30 opfindelsen.

Hybridomaceller, som producerer sådanne antistoffer, kan dyrkes in vitro eller in vivo ved anvendelse af kendte fremgangsmåder. De monoklonale antistoffer kan isoleres fra kulturmediet eller 35 legemsvæsker, som tilfældet nu måtte være, ved hjælp af konven-tionelle immunoglobulinoprensningsprocedurer, såsom ammoniumsul-fatfældning, gelelektroforese, dialyse, kromatografi og ultrafiltrering om ønsket.

DK 167194 B1 5

Udvælgelse og karakterisering af monoklonalt antistof

De vigtigste karakteristika for de monoklonale antistoffer er (1) deres immunoglobulinklasse, (2) deres selektivitet over for human-5 brystcancerceller og omfanget af de human-brystcancerceller, hvortil de bindes, samt (3) deres anvendelighed til fremstilling af effektive immunotoxiner mod human-brystcancer.

Selektiviteten og rækkevidden af et givet antistof bestemmes ved at 10 afprøve det mod prøvepaneler af (1) humanbrystcancervæv og -celler og (2) normale humanvæv eller human-celler, der stammer fra et bryst eller har anden oprindelse. Ved udvælgelse af antistofferne ifølge opfindelsen blev cirka 22000 dyrkede hybridomakulturer først scree-net mod de immuniserende brysttumormembraner eller mod en bryst-15 cellelinie, et panel af 8 normale vævsmembraner, en fibroblast-cellelinie og et frossent vævssnit af en brysttumor. Kloner, som reagerede med de neoplasti ske materialer, men ikke med de normale materialer, blev identificeret ved denne første screening og udvalgt til bestemmelse af i sotype og yderligere screening for selektivitet 20 og rækkevidde. Den yderligere screening inddrog: 16 normale vævssnit, 5 typer normale blodlegemer. 11 Neoplastiske vævssnit, der ikke var fra brystvæv, 21 brystcancervævssnit og 14 brystcancer-cellelinier. Antistofferne skønnedes at binde selektivt til brystcancer, hvis de bandt stærkt til mindre end 1/3 af de normale væv og 25 blodlegemetyper. 127 Antistoffer blev oprenset og testet ved den yderligere screening.

Antistoffer, som udviste acceptabel selektivitet og rækkevidde, blev konjugeret til en ricin A-kæde ved anvendelse af N-succinimi-30 dyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) eller iminothiolan (IT) som koblingsreagens. Konjugaterne blev testet mod MCF-7-, CAMA-1-, SKBR-3- og BT-20-celler i en 24-timers vævskulturanalyse. 16 Af antistofferne udviste acceptable immunotoxinaktiviteter (TCID 50% for mindre end 10 nM) mod mindst én af disse brysttumorlinjer. Det 35 blev fundet, at 7 af de 16 genkendte det samme 210.000 dalton antigen, idet 6 af de 7 formentlig genkendte det samme epitop, men med varierende affinitet.

Yderligere detaljer af karakteriseringen af disse antistoffer gives DK 167194 B1 6 i de efterfølgende eksempler.

Immunoforbi ndel ser 5 De immunoderivater af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, som er af størst vigtighed, er immunotoxiner (konjugater af antistoffet og en cytotoxisk del) og mærkede (f.eks. radioaktivitetsmærkede, enzymmærkede eller fluorochrommærkede) derivater, i hvilke mærkningsmidlet tilvejebringer et middel til identificering af 10 immunkomplekser, som indeholder det mærkede antistof.

Den cytotoxiske del af immunotoxinet kan være et cytotoxisk medikament eller et enzymatisk aktivt toxin af bakterie- eller plante-opr.indelse eller et enzymatisk aktivt fragment ("A-kæde") af et 15 sådant toxin. Enzymatisk aktive toxiner og fragmenter heraf foretrækkes og eksemplificeres med: difteri-A-kæde, ikke-bindende, aktive fragmenter af difteritoxin, exotoxin-A-kæde (fra Pseudomonas aeruainosal. ricin-A-kæde, abrin-A-kæde, modeccin-A-kæde, a-sarcin, Aleurites fordi i proteiner, dianthinproteiner, Phvtolacca americana 20 proteiner (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, saponaria officinalis inhibitor, gelonin, mito-gellin, restrictocin, phenomycin og enomycin. Ricin-A-kæde, ikke-bindende, aktive fragmenter af difteritoxin, abrin-A-kæde og PAPII foretrækkes. Konjugater af det monoklonale antistof og sådanne 25 cytotoxiske dele kan fremstilles ved anvendelse af flere forskellige bi funktionelle proteinkoblingsreagenser. Eksempler på sådanne reagenser er SPDP, IT, bifunktionelle derivater af imidoestere, såsom dimethyl adipimidat · HC1, aktive estere, såsom disuccinimidylsube-rat, aldehyder, såsom glutaraldehyd, bis-azidoforbindelser, såsom 30 bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin, bis-diazoniumderivater, såsom bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylendiamin, diisocyanater, såsom toly-len-2,6-diisocyanat og bis-aktive fluorinforbindelser, såsom 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen.

35 Konjugaterne vil, når de til diagnostiske formål anvendes til at dræbe human-brystcancerceller in vitro, typisk blive tilsat cel!ekulturmediet i en koncentration på mindst ca. 10 nM. Formulationen og tilsætningsmåden til in vitro-brug er ikke kritisk.

Der vil normalt blive anvendt vandige formulati oner, som er DK 167194 B1 7 forenelige med kultur- eller perfusionsmediet. Cytotoxicitet kan aflæses ved hjælp af konventionelle metoder til bestemmelse af forekomsten eller omfanget af brystcancer.

5 Når immunotoxinerne anvendes in vivo til terapi, indgives de i patienten i terapeutisk effektive mængder (dvs. mængder, som eliminerer eller reducerer patientens tumorlidelse). De vil normalt blive indgivet parenteralt, fortrinsvis intravenøst. Doseringen og doseringsskemaet vil afhænge af cancerens natur (primær eller meta-10 statisk) og dens udbredelse, det bestemte immunotoxins karakteristika, f.eks. dets terapeutiske index, patienten og patientens sygdomshistorie. Mængden af indgivet immunotoxin vil typisk ligge i området fra ca. 0,1 til ca. 10 mg/kg af patientens vægt.

15 Til parenteral indgivelse vil immunotoxinerne blive formuleret i form af en en injicerbar enhedsdosis (opløsning, suspension, emulsion) knyttet til en farmaceutisk acceptabel parenteral vehikel. Disse vehikler er i sig selv ikke-toxiske og ikke-terapeutiske. Eksempler på sådanne vehikler er vand, saltopløsning, Ringers væske, 20 dextroseopløsning og 5% human-serumalbumin. Ikke-vandige vehikler, såsom bestemte olier og ethyloleat, kan også anvendes. Liposomer kan anvendes som bærerer. Vehiklet kan indeholde mindre mængder additiver, såsom stoffer, der øger isotoniciteten og den kemiske stabilitet, f.eks. puffere og konserveringsmidler. Immunotoksinet vil 25 typisk blive formuleret i sådanne vehikler i koncentrationer på ca.

1 mg/ml til 10 mg/ml.

Cytotoxiske radiofarmaceutiske midler til behandling af brystcancer kan fremstilles ved binding af kraftige lineær-energi-overgangs-30 emitterende isotoper [eng: li ni ar energy transfer (LET) emitting isotopes] (f.eks. Y, Pr) til antistofferne. Det er intentionen, at betegnelsen "cytotoxisk del", som anvendt i nærværende beskrivelse, skal omfatte sådanne isotoper.

35 De mærkningsmidler, som anvendes til frembringelse af mærkede udgaver af antistofferne, omfatter dele, der kan påvises direkte, såsom fluorochromer og radioaktive mærkningsmidler, såvel som dele, såsom enzymer, der skal omsættes eller derivatiseres for at kunne påvises. Eksempler på sådanne mærkningsmidler er P, I, H, C, DK 167194 B1 8 fluorescein og dets derivater, rhodamin og dets derivater, dansyl, umbelliferon, luciferia, 2,3-dihydrophtalazindioner, peberrods-peroxidase, alkalisk phosphatase, lysozym og glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Antistofferne kan forsynes med sådanne mærknings-5 midler ved kendte metoder. For eksempel kan koblingsreagenser, såsom aldehyder, carbodiimider, dimaleinimid, imidater, succinimider, bis-diazotiseret benzadin og lignende, anvendes til forsyning af antistofferne med de ovenfor nævnte fluorescerende kemoluminisce-rende og enzymatiske mærkningsmidler.

10

Antistofferne og de mærkede antistoffer kan anvendes i et flertal af immunoafbi Idende eller immunoanalyserende procedurer til bestemmelse af forekomst af brystcancer hos en patient eller overvågning af status for en sådan cancer hos en patient, der allerede har fået 15 stillet denne diagnose. Ved anvendelse til overvågning af status for en cancer skal der anvendes en kvantitativ immunoassayprocedure. Ved denne overvågning udføres analyserne periodevis, og resultaterne sammenlignes til bestemmelse af, om patientens tumorlidelse er øget eller aftaget. Sædvanlige analysemetoder, som kan anvendes, omfatter 20 direkte og indirekte analyser. Direkte analyser omfatter inkubering af en vævsprøve eller celler fra patienten med et mærket antistof.

Hvis prøven indeholder brystcancerceller, vil det mærkede antistof binde til disse celler. Efter vask af vævet eller cellerne til fjernelse af ikke-bundet, mærket antistof aflæses vævsprøven for 25 tilstedeværelsen af mærkede immunkomplekser. I indirekte analyser inkuberes vævet eller celleprøven med ikke-mærket monoklonalt antistof. Prøven behandles derpå med et mærket antistof rettet mod det monoklonale antistof (f.eks. et mærket anti-murint antistof), vaskes og aflæses for forekomst af mærkede ternære komplekser.

30

Til diagnostisk anvendelse vil antistofferne typisk blive distribueret i form af analysesæt. Disse analysesæt vil typisk indeholde: antistoffet i mærket eller umærket form i egnede beholdere, reagenser til inkubering og vask, et mærket anti-murint antistof, hvis 35 analysesættet er beregnet til indirekte analyse, og substrater eller derivati serende reagenser afhængigt af mærkningsmidlets art. Kontrolprøver med human-brystcancerantigen og instruktioner kan også medfølge.

DK 167194 B1 9

De efterfølgende eksempler tilvejebringer en detaljeret beskrivelse af fremstillingen, karakteriseringen og anvendelsen af de repræsentative monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen.

5 Immunisering

Friskt human-brystcancervæv opnået ved kirurgisk indgreb samt forskellige normale væv blev anvendt til fremstilling af membranekstrakter ved homogenisering og diskontinuer sucrosegradient-10 centrifugering. Human-brystcancercellelinjer blev opnået fra The Breast Cancer Task Force, the American Type Culture Collection (ATCC) og fra Dr. Jorgen Fogh fra Memorial Sloan Kettering. Cellerne blev vedligeholdt og overført som anbefalet af The Breast Cancer Task Force, ATCC og Dr. Fogh. Ved immuniseringer blev enten 15 membranekstrakter indeholdende 100 mg protein (Lowry-analyse) eller ti millioner levende brystcancerceller inokuleret intraperitonealt i fem uger gamle Balb/c mus. Musene blev boosterinjiceret på samme måde to gange med månedlige mellemrum. Tre dage efter den sidste boosterinjekti on blev miltorganerne fjernet for anvendelse til 20 cellefusion.

Hvbridomacel1emetoder

Somatiske hybridceller blev fremstillet ved metoden af Buck, D.W., 25 et al, se ovenfor, ved anvendelse af den murine myelomalinje Sp-2/0-Agl4. Alle hybridomacellelinjer blev klonet ved grænsefortynding. Ved den ene halvdel af fusionerne blev der anvendt spleno-cytter fra mus immuniseret med brystcancermembranekstrakter og ved den anden halvdel splenocytter fra mus immuniceret med levende 30 brystcancercellelinjer. Ud fra disse fusioner blev der frembragt 83.424 brønde, af hvilke 22.459 udviste hybridomacellevækst.

Screen i nqsmetoder 35 Hybridomacellesupernatant blev analyseret for reaktivt antistof, enten ved en fastfase-enzymbundet immunoabsorbentanalyse (ELISA) med det immuniserende brystcancermembranekstrakt eller ved en indirekte immunofluoroscensanalyse med den immuniserende brystcancercellelinje. Ved fastfase-membran-ELISA-analysen blev 40 μΐ 0,1 mg/ml DK 167194 B1 10 brystcancermembranprotein anbragt i polyvinylchlorid-(PVC)-mi.krotitreringsbrønde i 12 timer ved 4°C. Ekstraktet blev opsuget, og brøndene blev vasket med phosphatpufret saltopløsning (PBS) indeholdende 1% okseserumalbumin (BSA). Brøndene blev derpå inku-5 beret med 45 /il af en 1:10 fortynding af hybridomacellesuperna-tanten. Fortyndingsmidlet indeholdt 25 mM af en buffer, 10% okseserum og 0,1% natriumazid. Efter 30 minutter ved stuetemperatur blev brøndene igen vasket og inkuberet i 45 minutter ved 37°C med en 1:200 fortynding af peroxidasekonjugeret gede-anti-mus-IgG. Fortyn-10 dingsmidlet var PBS. Brøndindholdet blev derpå vasket med PBS og omsat med 200 μΐ af 2,2-azi no-di (3-ethylbenzthiazol insul fonsyre) i 0,1 M natriumcitratbuffer, pH 4,2, i 30 minutter ved stuetemperatur.

Den optiske densitet blev målt ved 405 nm på en MicroElisa Reader.

For hvert forsøg blev en positiv kontrol med anti-beta-2-microglo-15 bulin, 5 /tg/ml, omsat med normal, human nyremembran. Dette gav en optisk densitet på 1,0 + 0,1 (standardafvigelse). Baggrunden var 0 + 0,1 enheder (O.D.) ved anvendelse af mediet uden det murine mono-klonale antistof. Brønde, der gav en reaktion med brystcancer-membranekstrakt på mere end 0,7 O.D., blev høstet.

20

Ved den indirekte analyse med immunofluorescerende cellelinjer blev 100.000 brystcancerceller fra den immuniserede cellelinje anbragt natten over med passende medie i hvert rum i et sæt af plader med otte rum. På samme måde blev 100.000 fibrobiastceller fra cellelinje 25 CC95 inkuberet natten over i rumopdel te plader. Cellerne blev vasket med PBS indeholdende 1% BSA. Brøndene, både dem der indeholdt brystcancerceller og dem, der indeholdt fibrobiastceller, blev inkuberet i 30 minutter ved 4°C med 1:10 fortyndinger af hybridoma-supernatant. Cellerne blev igen vasket og inkuberet i 30 minutter 30 ved 4°C med en 1:50 fortynding af fluoresceinisothiocyanat-(FITC)-konjugeret gede-Fiab'Jg-anti-mus-Ig. Cellerne blev vasket tre gange og fikseret i 1,5% formaldehyd i PBS i fem minutter, hvorpå brøndene blev tømt og renset i PBS. Pladerne blev derpå anbragt i en sammensætning indeholdende polyvinylal kohol, glycerol, buffere og et 35 konserveringsmiddel og undersøgt med et fluorescensmikroskop. Hybridoma-brønde, der viste stærk fluorescensbinding til brystcancerceller, men ingen fluorescensbinding til fibroblaster blev høstet. 5.155 Hybridoma-brønde viste brystcancerreaktivitet ved den første screening.

DK 167194 B1 11

Supernatanter fra de 5.156 positive brønde blev derpå analyseret ved hjælp af fastfase-ELISA med otte normale vævsmembranekstrakter (lever, lunge, colon, mave, nyre, tonsil, milt og pankreas). Hver brønd-supernatant, der gav en O.D, ved ELISA-analysen på mere end 5 0,3, blev kasseret. Det blev fundet, at 1.101 af supernatanterne ikke reagerede med normale vævsekstrakter.

1.101 Hybridomacellesupernatanter blev analyseret på frosne snit af humane brystcarcinomavæv. Snit på 6 mm blev fæstnet til pladerne, 10 fikseret i ti minutter i acetone ved 4°C, tørret i ti minutter ved stuetemperatur, vasket med PBS, blokeret med hesteserum og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur med 200 ml ren hybridomasuper-natant. Pladerne blev vasket med PBS og til sidst inkuberet i 20 minutter ved 37°C med en 1:50 fortynding af peroxidasekonjugeret 15 kanin-anti-mus-Ig, derpå vasket igen med PBS og til sidst inkuberet i 7,5 minutter ved 37°C med 0,5 mg/ml diaminbenzidin i 0,05 M Tris-puffer pH 7,2 indeholdende 0,01% hydrogenperoxid. Pladerne blev farvet med hematoxylin, dehydreret og anbragt i et medium indeholdende 35,9% methyl/n-butylmethacrylatcopolymer, 7,1% butyl benzyl-20 phthalat og 0,3% 2,6-ditertbutyl-p-cresol. 124 Brønde viste selektiv binding til brystcancer og blev klonet.

Oprensning og klassebestemmelse 25 Immunoglobul inklasse og -underklasse af de brystcancerselektive monoklonale antistoffer blev bestemt. Antistofferne selv blev også g mærket internt ved dyrkning af 2-3 x 10 hybridomaceller i 4 timer i oc oc methionin-frit medium indeholdende 0,2 /tCi S-methionin. S-mær-kede antistoffer blev immunopræcipiteret med fikserede Staphylo-30 coccus-A-celler eller med den til fiksering af Staphylococcus-A-cel-lerne benyttede komposition, præ-coated med kanin-anti-mus-immuno-globulin, og immunopræcipitaterne blev analyseret ved SDS-PAGE til bestemmelse af mobiliteten af lette og tunge antistofkæder, af, om der manglede ekstra kæder, og af hvert antistofs evne til at binde 35 til Staphylococcus-protein-A.

Antistofferne blev opdyrket in vivo. Balb/c eller FI (C57B/6 x Balb/c) mus blev forbehandlet med 0,5 ml pristan intraperitonealt (ip) og efter 10-14 dage inokuleret med én million hybridomaceller i DK 167194 B1 12 log-fase i PBS. Ascitesvæske blev opbevaret ved -70°C, optøet og filtreret gennem et 0,8 /im filter før yderligere oprensning.

IgG-antistoffer, som bandt Staphylococcus-protein-A, blev oprenset 5 ved affinitetschromatografi på protein-A-resin indeholdende agarose, dextran og/eller acrylamid og elueret med en trindelt pH-gradient. IgG-antistoffer, som ikke bandt protein A, blev præcipiteret ved tilsætning af ammoniumsulfat til 40% mætning ved 0°C. Præcipitaterne blev genopløst i PBS, dialyseret imod 20 mM Tris pH 7,2 og chroma-10 tograferet på en 1,6 x 50 cm søjle med di ethyl aminethyl cellulose (DEAE) elueret med 1,5 liter af en 0-600 mM NaCl-gradient ved 4°C med et strømningshastighed på 1 ml/min. I hvert tilfælde blev søjlefraktionernes indhold undersøgt på SDS-PAGE, og de reneste antistoffraktioner blev sammenføjet, koncentreret til 1-3 mg/ml, 15 dialyseret imod PBS/0,02% NaN^ og opbevaret ved 4°C.

IgM-antistoffer blev oprenset ved gel filtrering på en 2,6 x 40 cm søjle med resin indeholdende agarose, dextran og/eller acrylamid og elueret med PBS/0,01% natriumazid ved stuetemperatur med en 20 strømningshastighed på 1 ml/min.

Selekti vi tetsbestemmelse

Til beregning af antistoffernes selektivitet over for brystcancer 25 blev de oprensede antistoffer analyseret ved immunoperoxidasesnit-farvning af seksten snit af normale væv og ved immunofluorescenscel-lesortering af fem blodlegemetyper. Immunoperoxidasefarvning blev udført som ovenfor bortset fra, at kendte fortyndinger af oprensede antistoffer i PBS med 1-40 /ig/ml blev anvendt i stedet for hybrido-30 masupernatanter. De rene antistoffer blev først titreret til opnåelse af den mindste koncentration, der giver stærk immunoperoxidasefarvning af brystcancersnit, og derpå anvendt i denne koncentration ved normale vævsanalyser. Perifere blodlegemer (blodplader, lymfocytter, røde blodlegemer, granulocyter og monocyter) blev 35 frembragt ved centrifugering under anvendelse af et medium, som adskiller monocyter fra leucocyter med polymorf kerne. Cellerne blev omsat med antistof i den ifølge ovenstående bestemte optimale koncentration i 30 minutter ved 4°C, vasket, omsat med en 1:50 fortynding af fluorescerende i sothiocyanat-konjugeret gede-anti-mus 13 DK 167194 B1

Ig i 30 minutter ved 4°C, vasket igen og analyseret i et cellesorteringsapparat. Vaskepufferen og fortyndingsmidlerne var PBS med 1% gelatin og 0,02% natriumazid. Cellesorteringsapparatet var udstyret med en 76 micrometer dyse og en 1 Watt argon-ionlaser ved 488 nm. En 5 80 mm confocal linse blev anvendt på den optiske skinnesamling til focusering. Andre anvendte filtre var et 515 nm interferensfilter og et 515 nm absorbansfilter (til reflekteret laserlys) og et neutral-densitetsfilter 1,5 til reflekteret lys i en vinkel i fremadgående retning. Niveau-kurver af log fluorescein fluorescens versus frem-10 adrettet vinkel for spredt lys blev anvendt til analyse af prøverne.

Bindingsegenskaberne af antistofferne ifølge opfindelsen er vist i tabel 1 nedenfor.

15 20 25 30 35 DK 167194 B1 14 5,αωωωωωωω ..

"rHw .-t«Mr-irMCMO*-«c-IOOOOOOOO ,

P fij P

C3 r-4 <U II

. rj 44 · 44 I >, Λ 54 3

3 CO O S 0) W

4_i d J J J J (3 O O O i—I 4J

dj £ «-HOCM+I+loiOi-lr-tOOOOOOO 4J Jj 3 54 u o tu . c o ·Η Æ f—I ^ « Μ Λ W *ί u 54 cd Ό 54 0«HOOOOCMOOOOOOOO (304-1 <U 0) d o i> -u kV II 54 CO 44 44 l-l CO || u w juujuio OS o· K OONSnNHHOOOOOOOO jj ,-m Sk u ··> il 3 <u

pQ S-t ·» C 4J

3 S -H Cd 03

^ ^ 1 μ ·» 3 tS H

•d 4444 54 54 P 33

-j * W U M td W W ·Η 3 3 54 O

HONONHNHOOOHOOOO .ii 44 g 3 54 jj o i—i Λ i e il >, r-ι η -η cd *d O 60 3 u-t OOOOOOOOOOOOOOOO (J o 0 i-l <4-1 II S-I ,—t g <u —i ·« >, £) 44 44 QJ i—I t—I 4—3 i) 4J tU ·*> k*3 44

Sj OOOOOOOOOOOOOOOO jz || ·Η O TU

'2 tu 4J >-i o c

C -H t>~, 3 p CO

to s o. hJ -c o -Q

(fl °> .« 5 5 S4 m 3θΟΟθ88θ9θθΟΟΟΟΟΟ II Cfl Λ tu ™ > E II 54 4-t > tu w CO CU 4-4

j CO H 4J O

φ rH +j 4J

, .«&,·«>, 03

,-t 54 O cd U -H

J2 -3 tu 4J g O 4-1 T- M C ωω 'cd υ 2 1= 3

" g · «Η «-1 r-t Η FJ O CM —I O O O O O O O O 0 rH U

,2t4 cocdco^-ιαι m C ^ w 44 , > al ·Η II « Ci

Xi Ή B C · II d 54 -H

(0 -H t»1 54 _ ;> cd 4-> 3 "d r. J, 5 OOOOOOOOOOOOOOOO -HQ CO g ^ .Γ- 4-1+0)44

M cd ·« ·« 00 CO

σ' (30 -I C CU 0) C <|) <U 0) Td T-I c

H 3 u 3 J W J CO C co g d 3) O

trd ^oc5cm«4,-icm©oooo—ισοσο & 3 <U O 00 f4Cd II Cd Γ-4 Jh T—cg

3 2 35 31 3) l-H

O II c X! (0 o <u <44 C „ ··> C tJ co Ό 4j O o OOOOO^HOO+tOOOOOOO OOg 4-4 © 60 ijt—( cd E ·« cd P cj 1; o > % k ω > 03 O 03 O 0) i-i ~ « H pq -s cd 54 +J CO II 44 Q) 54 j-. cm || aj 3) 0)

£ - T- 35 II Cd 4J

O) fl £4 E-< f f-1 f4 P4 f4 c- C-1 ca CO T-4 4J

Sj «400ΓΜ»—tr4«4r-4c4»—(0000--1-4 .« C ly) d, >, > 35 ·« Cd T3 o

z 54 -r4 43 O O

S C 54 c r-4 -4 44 ·ι-4 01 + 3 3

— 03 O 00 Γ-4 C

tu Cd C CU 1-1 Cd OC ϊ - II cd >, ·Η 54 P Οθ55θΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ - . Ί ^ S 4-1 3 J ϋ II II 60 44 1 M ·· <; d Ό

ce W V, M S

,dw CM CU-^S^vCO

n-dUUUUUU| 4454 ·« d-Q

S* 5) NNONNHNHOOOOOOOO >r4 3 54 *«·Η os co i—i 0) 54 3 g

-©, c ΓΗ Π-l CU O

Q 333i4Jdco 1-4 *4 4-4 44 QJ -1-4 44 3 . ' «4 dQJr-ipKCÆ« ^35 « o o o -Η z

O O* Ή O ίΝ ^ ^ O ^rHOOOOOOO djOOM-i Q

WW3i d>54dPO

» -H i—i ocd o cd co

^ rH rH O o C « ΐ Λ > M

d piotoEnScjSSoiaiSEtSæ δ il II oosj 3

w £ηιΛποο<χ>^Γ“θΝ»ΜΪΗφΗ cd QJ <D U

•1-1 ηΗτϋ^ΕΟ^^ΗίΝιΛΟΠ^ιΛΟ Ti P Λ lij 4j ni-HfNrQfStNcN^nin-cr^r-r'r^r- ^ ^ ^ M ^ ^ c <2 in o m o f-< «Ν 15 DK 167194 B1

Bestemmelse af antistoffernes reaktivitetsbredde

Til bestemmelse af hvor bredt et udsnit af brystcancere hvert antistof kunne genkende blev brystcancerselekti ve antistoffer analy-5 seret ved immunoperoxidasefarvning af frosne snit fra 27 forskellige brysttumorer. Alle de til snitfarvning anvendte brystcancere var infiltrerende intraductal carcinoma, hvorfor der ikke kunne foretages nogen korrelation mellem antistofbinding og den histologiske type af brystcancer. Yderligere blev der ikke fundet nogen korre-10 lation mellem antistofbinding og knudetilstand eller østrogenrecep-torti Istand for tolv tumorers vedkommende, om hvilke der kunne opnås information om donoren. Antistofferne blev omsat lige godt med metastatiske og primære brysttumorer. Resultaterne af analyserne af antistofferne ifølge opfindelsen er anført i tabel 2 nedenfor.

15 20 25 30 35 DK 167194 B1 16 kil al 8j *—I o o ·—I <—i 81 -* o o o o

il O O O ri O

n| rM Si|oHH§oOOrlOOOO

^ S^l CNOOn—l—I—1-HoOOnOOOO

4-1

c “I

w 51 CNOon—I—IrH—IOOOCNOOOO

> > <|

M 51 CN O O CN O —I O O O O O CN O O O O

<u ϋ C <1 cfl cl, I noon—i—i—i—i—loonoo—io ' S e S. 51 CMOOCS^HOP^Or-t^orsiOOOO ^ Γ» ‘ ri i s <| -° 1 m| noon—i—i—toooonoooo w 5 <1 .ϋ Μ X| rioono—i—<n—<n—to—cncNn — •S « "S (y a: I noono-Hoooooooooo o •H S-ι z

Ol n—ton—nriggggngogg p> O £j .i 4-1 B £ 2 £ <1 « ~ CO i <Ν<Ρ©<Ν©0©0*ΗΟΟΓΜΟΟΟΟ C ^ c < £ <1 p

^ Kl MOHCNOHHOHOOHOOOO II

o £| η o o n o o —i —i o —i —t —I »—I —t ’—1 η ίΛ - , 2* C > .—i E-i| noonn—in—loooooooo s, <u

-Ω II

« «t| " H £u i noon-i—tonon—i—t—tnnn

Ml g-Hongggggggggggg £ a SI noon—i—t—i—iggo—igggg w

II

£| noonono—i—tooooooo cn S| noon—i—t—inonnnnnon d) jj •I—l <1 ω

1*31 HOHNOOOOOOONOOOO C

0)

JJ

8| n-Hnn-tnnnggnngggg -S

ω ω

51 —t—tonon—t-Hnoonno—i—i .S

C

1 O ·-< <~i O O r? r-*J τ-(Γι.^^ίΝ^-ίΐΓ)ςΓ«Γ'4^-<ςΛ0Οΐ0>—‘ ·** ^ ro Αοα.1ύ1οαυΰυ^&4ϋ£οο] “ rnD-^^OOvD^r'-OC^CnvO^CDf-i □ ηΗ^Ρνθα)νΟ«ΛΗ(ΝΐΛΦΠ^ΐΛνβ Ν(*>ΗΝ(ΝΝ(Ν*τηιη^ηΓ^ΡΝ^Γ> (A o in rt *—1 DK 167194 Bl 17

Antistofferne blev yderligere undersøgt for, hvor bredt et udsnit af brystcancere de kunne genkende, ved cellelinjeimmunofluorescens-analyse af 14 brystcancercellelinjer. Resultaterne af disse analyser af antistofferne ifølge opfindelsen er anført i tabel 3 nedenfor.

5 10 15 20 25 30 35 DK 167194 B1 18

O

m m £ +I|+ + + + + + + +|+ + + +

N

O

m 1++1+1+¾)¾¾¾¾¾¾¾ r~ m ^ "· j§ + + + + + + ιδ + δδ^δδδ + φ s *r4 H Ω

'rd 5 +«+ + + + +i + iit++iS

<D E-i

r—i T“I

^ s +++++++¾¾¾¾¾¾¾¾) s s C Λ 4-1 cd £> Q] ^ tn p> IS ++(+(+(((((((((1 ^ h ® P.

(-i m ,-) 9 ++1++11++^+1¾¾¾¾ dj Ϊ? ' ^ 4J *C 2

•tH

60 r—I

C <2 II

H £ + + + + + + + + + + + + + + t i Ό < h P δ s *Ω , « Λ ‘S S . > W E +1+ + +.++,¾¾^¾¾¾ ίή •H 5 (j0 4-J 3 cu å = M 11 n £ + + + + + + + + +1+)¾¾¾¾ i

. OS

i—i N -

“ -S

g § +++++++++111¾¾¾¾ % m co o a.

E] + + + + + + + + +( ( I ( I I I || u X + S , , . ω v ++ + + + + + + + + + + + + + + d S '4 c Ώ ί

^ +++ + + + + + + + + I + + + + _<U

•ri

<D

n; ^ y pElEdS^SOSSStlSSS« <o

Μΐ^ηίΛοοιΟ'ΠΌΝαιίΗΟΗ O

•h proH + ioaniiOHNifHon + inio 4-i NriHCKSNN + nin^nf'M'f' -x

C

< < m o in <-! »-4 19 DK 167194 B1

Endelig blev antistofferne analyseret ved hjælp af immunoperoxidase-farvning af 11 kræftformer, der ikke stammede fra brystvæv. Resultaterne for antistofferne ifølge opfindelsen er anført i tabel 4 nedenfor.

5 10 15 20 25 30 35 DK 167194 B1 20 4-> 60 -Θ ΕΟ

Vi

I B NHONNHWHOOONOOOO QJ

n) D τ) > -η -ti au ti > i cu ctj es i—i

>-i6 (NOOOOOOOOOOOOOOO rO

EU O

S ti <u

Cu 4-1 J3 00*-H0*H»H0000000000 D. ti > OM J3 (0 Θ- <w I * jL oooooooooooooooo ^

•K 'H 83 S

EU Vi rU ti

Vi p O JJ

(U

O ti

ti EU

2 (jj ENOENOO»—EOOOOOOOOOO p, > ti

i—I EEJ

U s jj (30 > ti ·Η I OOfMCSOOENOOOOOOOOO ^ C EU > (30

•r-l <J-J R) EU

jo e > c HJ >.

O V3 II

JJ

.2 I (NHHE^HHHEMHHOOOOOO ° JJ EU E0 ··> ti JJ 3 60

<! D Vi eeJ

> ·. to -<Γ Efl ^«2 OOENENrH»—I-—I»—IOiHO*—IOOOO 11 EU EU V T- J3 CU Λ! cd ~ H Jrf cd Vi I EJ ft) 22 E>J00CMr-lr-J^^-l0--E0^0E300 rø CV e/3

II

EU CM

60 £ OHNNOHOOHr-IO<-EOO«HO ..

ti ti

►J EU

60

C

*r-! c es o >

r-l C>J0000000#-40000000 U

o cd

U '* IW

M-t cd

Mh

O 4J

4J *H *-4 O O <U

Μ Η f**- Λ CS Η Η ΙΛ ft W H ft CO IQ xj ,J .tj Γ, nfcmnoOOvhONd'voH«H £ tj OnH^vovDcomHCNinvDn^invo <ζ <1)

U

C

in o in o *-i r-ί i-l CN * DK 167194 B1 21

Bestemmelse af cvtotoxiciteten

Antistofferne ifølge opfindelsen blev konjugeret til ricintoxin A-kæde (RTA) behandlet med SPDP som beskrevet af Carlsson, J. et al, 5 Biochem. J. (1978) 123:723-737 eller med iminothiolan (IT).

Kon.iuqering med SPDP

SPDP (20 mM i ethanol) blev tilsat i et 20 gange molært overskud i 10 forhold til antistof, og efter 30 minutters inkubering ved stuetemperatur blev det ikke-omsatte SPDP fjernet ved dialyse imod PBS. Graden af derivatisering blev bestemt ved måling af frigivelsen af pyridin-2-thion ved 343 nm efter reduktion med dithiothreitol (DTT). Afhængigt af antistoffet blev tre til otte lys i ngrupper (per anti-15 stofmolekyle) omdannet til pyridyldisulfidderivatet.

SPDP-Behandlede antistoffer blev konjugeret til RTA. Umiddelbart forinden binding blev RTA'et reduceret med 50 mM DTT og derpå afsaltet på en søjle med kromatografisk harpiks indeholdende 20 agarose, dextran og/eller acrylamid til fjernelse af DTT fra proteinet. Reduceret RTA blev tilsat i et tre til fem gange molært overskud i forhold til pyridyldisulfidantistof. En typisk reaktionsblanding (1 ml) bestod af 7 μΜ antistof og 30 mM RTA. Reaktionen fortsattes natten over ved 4°C. Graden af konjuger i ng af RTA til 25 antistof blev bestemt spektrofotometrisk ved måling af frigivelsen af pyridin-2-thion. I gennemsnit indeholdt konjugaterne to til tre RTA-molekyler per antistofmolekyle. Dette blev bekræftet på ikke-reducerende SDS-PAGE-geler (7,5%), som også viste, at den typiske preparation af konjugaterne indeholdt 10%-30% frit antistof.

30

Blandingen af konjugater blev kromatograferet på en HPLC-gelfil treringssøjle til adskillelse af konjugaterne fra resterende ikke-omsat RTA. Søjlen blev ækvilibreret med 0,1 M natriumsulfat/0,02 M natriumphosphat pH 6,8. Blandingen af konjugater (0,7 ml) blev 35 injiceret og derpå kromatograferet med en gennemstrømningshastighed på 1 ml/min (stuetemperatur). Fraktioner på 0,5 ml blev opsamlet, og top-konjugatfraktionerne blev sammenføjet og filtreringssteriliseret forinden analyse for cytotoxicitet.

DK 167194 B1 22

Kon.iuaerinq med i mi noth i ol an

Cirka 30 mg/ml antistof i 0,10 M Na-phosphat, 0,001 M Na-EDTA, pH

8,0 (i det følgende omtalt som P-EDTA-puffer) blev omsat med 1 mM 5 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoesyre) (DTNB) ved stuetemperatur i ca.

15 minutter og derpå afkølet til 0°C i et isbad. Tilstrækkeligt med IT blev tilsat denne opløsning til opnåelse af 2,5 IT-molekyler/-antistofmolekyle, og den resulterende opløsning blev opbevaret ved 0-5°C i ca. 24 timer. Derpå blev den dialyseret ved 0-5°C tre gange 10 imod et 100-ganges overskudsvolumen af P-EDTA-puffer.

RTA, Der normalt blev opbevaret i P-EDTA indeholdende 1 mM DTT, blev ultrafiltreret til en koncentration mellem 10 og 15 mg/ml og dialyseret ved 0-5°C tre gange imod et 100-gange overskudsvol umen af 15 P-EDTA. Tilstrækkeligt med RTA blev tilsat til det derivati serede antistof til opnåelse af 1,0-1,2 frie thiolgrupper i RTA/ blokeret thiol i derivatiseret antistof. Denne blanding inkuberedes ved stuetemperatur i 2 timer.

20 Blandingen fra koblingsreaktionen ti Iførtes en søjle med kromatografisk harpiks indeholdende et blåt farvestof forbundet til en fast bærer, hvilken blanding derpå elueredes med P-EDTA ved stuetemperatur. Søjlen var dimensioneret til at indeholde omtrent 2 ml lejevolumen per mg udgangs-antistof. Efter at en top af ikke-bundet 25 antistof i begyndelsen var blevet elueret fra søjlen, skiftedes der til elueringsvæsken, P-EDTA, indeholdende 1 M NaCl. Immunobundet og ikke-omsat RTA elueredes med denne puffer som en meget skarp top, som pool es og dialyseres ved 0-5°C én gang imod et 10-gange overskudsvolumen af 0,15 M Na-phosphat, pH 7,1 (i det følgende omtalt 30 som P..-puffer). Det dialyserede protein ti Iførtes en gel søjle ved 0-5°C og elueredes med en puffer ved en gennemstrømningshastighed på 6 cm/time. Søjlen var dimensioneret til at indeholde mindst 25 ml lejevolumen/ml tilført protein. Immunokonjugatet elueredes som en enkelt top kort efter det udelukkede volumen, der ved basislinie var 35 adskilt fra efterfølgende toppe af dimeriseret og monomer RTA. Den poolede top med immunokonjugat ultrafil treredes ved 35 psi til en slutkoncentration på 5,0 mg/ml og filtreringssteriliseredes.

23 DK 167194 B1

Analyse af cvtotoxicitptpn

De analyserede humanbrystcancercellelinjer, der blev anvendt til cytotoxicitetsanalyse, var MCF-7, CAMA-1, SKBR-3 og BT-20. De humane 5 fibroblastcell el injer CC95 og WI-38 blev anvendt som negative kontroller.

40.000 Testningsceller i 1 ml medium blev tilsat et sæt af 8 ml glas efterfulgt af tilsætning af fortyndinger af konjugatet (i PBS 10 indeholdende 100 øg/ml BSA). Efter inkubering ved 37°C i 22 timer blev mediet af suget, og monolagene blev vasket med PBS, og me- thioninfrit medium suppleret med S-methionin blev tilsat. Glassene blev yderligere inkuberet i 2 timer ved 37°C, mediet blev fjernet, og-cell erne blev vasket to gange med 2 ml 10% trichloreddikesyre 15 indeholdende 1 mg/ml methionin. Cellerne blev tørret, scintilla- tionsvæske blev tilsat, og radioaktiviteten blev talt i en scintil-lationstæller. Cytotoxiciteten blev udtrykt som den dosis af konjugatet, der hæmmer vævskulturen i et sådant omfang, at det resulterer i 50% hæmning af proteinsyntesen i forhold til en (ubehandlet) 20 kontrol prøve (TCID 50%).

Resultaterne af disse cytoxicitetsanalyser er angivet i tabel 5 nedenfor.

25 30 35 DK 167194 B1 24 co ro OOOQPOOOPP i ininmzzi/uninzz J—l

s Λ Λ Λ Λ Λ Λ I

,— S <Λ C σ; ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΡ ^ g m in in in min in in g ζ λλλλλλλλΙ ο 1 m Ο Μ Ο Η u g σιΝνοιηοο'ίορρο οο ο) ι ηη^ ηζζιπ ιηαο -S S Λ Λ Λ Λ X Ο 4- > Ο β 3 1 η νο ή] ιο mom m no 5- J Ρη «ν

Ο m OOOOOOCOOPQoOrH OH

§ ^ ΗΗΙΠ g 2 ΓΗ ΓΗ ΰ m >·, Η ,α Μ-Ι « 7 ·"» «> 4J <· « ·> ο; g oinoHinHcoopQo oo jj <3 N z zm in co

•H O

O Λ Λ Λ Λ

»r-J

Κ Ο Ρ Ο

4J

Ο ΗΤΓ ΙΟ C0 ♦··»»« *s ·· I ΟΟΟΟι—II—ΐνουοοοοοοοοο 1/1 g HHincNincoimn ,-ι 2 Α Λ Λ Λ Λ 0)

-Q

tO

Ε-< <Β ηι ·“* '—I Ο '—I '—I ι—I »—I OJ ι—I ι-Η Ή Ή ι—I I—I 1-Η αϋϋΰϋϋϋϋϋΰζυΰϋΰϋϋ ►<

JJ

Ο 4J

CO g μ <ϋ 4-1 03 <ΰ Μ 4J γΗ «Η Ο Ο φ s ?»iQH Μ ιΗ ι—ι HmcsmcomH .μ ι ω Cu C5 Iti fflQDaUOODuOfci&ECPffl Μ <33 OM^nooinvamoNOHcoH ·Η H-nicHHOioco^inroioNinnitino “g ΝΠΗΜΓΝ)ΜΜτίπηΐη·<τ^Γ'Γ'Γ' 11 4<ϋ a m o in z

Η tH

25 DK 167194 B1

Analyse af kon.iuaaterne in vivo

Konjugater af 245E7, 280D11 og 260F9 med RTA blev fremstillet som beskrevet ovenfor ved anvendelse af iminothiolan eller SPDP som 5 koblingsreagens. Virkeevnen af disse konjugater på MX-1 human brysttumorcel1 er in vivo blev bestemt som følger: 3

Athyme Balb/c-nu/nu-hunmus (20-24 g) blev anvendt. 1,0 mm 3 fragmenter blev opnået fra 600-800 mm tumorer uden tegn på central 10 nekrose og anbragt i en sprøjte. Mus fik implanteret s.c. med 0,05 ml af suspensionen i axil regionen ved et medio!ateralt stik. På den 7. og 14. dag efter implantation blev musene vejet, og graden af deres tumorlidelser blev beregnet ved måling af implantaterne med passer. Musene blev grupperet efter gennemsnitlig tumorstørrelse.

15

Konjugaterne blev injiceret i.v. i halevenen af kontrolmus Q2D x 6 til bestemmelse af den maksimale tolererbare dosis af det bestemte konjugat. Baseret på disse resultater blev doseringsskemaerne for indgivelse af konjugaterne i tumorbærende mus valgt. Grupper af 20 tumorbærende mus og kontrolmus blev injiceret i.v. med konjugaterne i overensstemmelse med de valgte doseringsskemaer. Dyrenes reaktioner, bivirkninger og dødelighed blev undersøgt dagligt sammen med målinger af tumorvoluminet og dyrets vægt. Ændringer i tumorvoluminet i slutningen af analyseperioden blev beregnet på 25 basis af gennemsnittet af summen af målinger over analyseperioden. Resultaterne af disse analyser er angivet i tabel 6 nedenfor.

30 35 DK 167194 B1 26 SIS |inmcnr»iNr-!0»H mim |c-icnmmooocn Em l-··-?'·''·*'·'·' rHO°OrHi—ti-to

U

CO

æ >

Vi 1 x 5 g

-1-1.¾ M

1 c in c>j m o TZ 3 o ci. o o o o " o ^

Smo o cm m o o

Ui m ^>ivvvZZvv GO O tt Di Qi Dj G Λ -M —- -— ro λ λ ^

nif-H ♦—! f-\ rH iHr-l»—l«H

^qpBqddqd ^

ΐ co m R- o ro o o o ^ G

C ·» ♦«» q r* o QJ

μ*Τ(ΝΓ'-00Γ'00 ω

r- in oocMMr^æ G

6-S ·Η

t—I

TJ

^ G

Λ o j;

5&ooo— ooo V S

cBoocnoooo " 3<- CM i in cm cm ro ^

M CO 1 I ° 1 1 1 1 & M

(,ο^οοοιηοοο ™ GGO^'^ro ^-^-W M ,_,

H G >— Ό T> ^3· Ό Ό Ό --- CU

Ό I ΟΟ'ΤΜ'Ό'Τ^'ί' Ό _ !—I \V r—t M m i—I M f—I dP (3 ^ cd ’ oo >.

M 7 JT M

ml in I a) <u m in tn ro m ^ "g £Ρκ>:χ*:κκκ n 2 H I 1 Η 1 «

M \ U

*w p] -Η ·Η ·Η -Η **H *H <y coed pi O' ^ O' CH Øi qj *^εηαα3.=13.3. _ m 00 ^Sinoooooo coin iiG cm o o o o o o ^ °

QCD M CM CM cs CM M CM O O

.H Q

O

6 o — «·

60 O O O O O

zl m in m o w ro ro rr v Q- 3 o, S S ~ tn ti y S °- s 0 “o ^ >- dP 1« ιη^ v -η < . s s' °* Si β < fj < PC I —' 'm s έ ? å ? f? ! 3 j 5..RE-IM r< M M CO — -¾ 5P to Μ I Μ Μ M CO ^

G I I Μ I ID <U dP H

*m r— i f—i a\ r- o i-ι co

Gcatao E ω co o ~ u o tn in o o in cm ii o ^ « ττ co in ·» 05 in cn CM CM CM CM CM + M fM 3 DK 167194 B1 27

Antistofaffinitet og antiqendensitet

En del af antistofferne ifølge opfindelsen blev i odineret og analyseret for binding til MCF-7- eller BT-20-celler. Antistofferne 1 5 blev mærket med I ved anvendelse af chloramin T til opnåelse af en specifik aktivitet på ca. 10 /iCi/mg. Til bestemmelse af immunora-diokemi sk renhed blev 100.000 cpm af to af de mærkede antistoffer i 0,5 ml føtal kalveserum sekventielt absorberet af fem prøvemængder af "måT'-celler i 15 minutter ved 0°C (almindeligvis 4.000.000 MCF-7 10 brystcancerceller per prøvemængde), og den resterende radioaktivitet i supernatanten blev efter hver absorption bestemt.

Til måling af associationskonstanter blev kendte koncentrationer af mær-kede og ikke-mærkede monoklonale antistoffer inkuberet med 15 "mål"-celler i føtal kalveserum i 15 minutter i is. Prøvemængder af celle/antistof-blandingen blev derpå talt i en gammatæller eller filtreret igennem Microfold filterplader (V & P Scientific), og filtrene blev talt. Til bestemmelse af ikke-bundet antistof tilbageholdt i væsken på filtrene blev der parallelt udført kontrol analyser 20 med de samme koncentrationer af antistof, men uden celler. Associationskonstanter og antigenkopiantal per "mål"-celle blev beregnet ud fra resultaterne af affinitetsanalyserne og er angivet i tabel 7 nedenfor.

25 Tabel 7 n Ka nKa

Antistof ~ 2G3 3,7e6 9,le6 3,4el3 113F1 2,3e6 l,le9 2,5el5 260F9 3,le5 5,6e7 l,7el3 30 266B2 8,0e4 2,7e8 2,2el3 280D11 3,9e5 8,8e6 3,4el2 317G5 3,2e6 l,6e6 5,lel2 452F2 2,5e5 6,8e6 l,7el2 454C11 3,9e5 4,8e7 l,9el3 520C9 5,0e5 8,2e6 4,lel2 n = antigen kopiantal pr. MCF-7-celle; Ka = associationskonstant med 35 MCF-7. nKa er produktét af n og Ka og relaterer antistofkoncentrationen til bundet antistof pr. celle.

Immunopræcipiteringsanalyser af antistofferne indicerede, at syv af DK 167194 B1 28 dem (454C11, 452F2, 520C9, 736G9, 741F8, 758G5 og 761B10) binder til et fælles monomerisk ca. 210.000 dalton protein, som findes i cancerbrystvæv. Seks af de syv (452F2, 520C9, 736G9, 741F8, 758G5 og 761B10) formodes at genkende det samme epitop på 210.000 dalton 5 proteinet. Relative affinitets-undersøgelser viser, at 520C9 har den største associationskonstant blandt disse seks.

Prøver af de hybridomaceller, som producerer de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen blev deponeret hos the American Type 10 Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776, USA. Kun 520C9 af de seks hybridomaceller, som producerer antistof, der genkender det samme epitop på 210.000 dalton proteinet, blev deponeret. De fem, der ikke blev deponeret, antages at .være funktionelt ækvivalente med 520C9. ATCC-accessionsnumre og 15 deponeringsdatoer for de deponerede hybridomaceller er:

Hybridoma/ antistof- 20 betegne!se Deoonerinasdato Accessionsnr.

260F9 27. januar 1984 HB 8488 113F1 27. januar 1984 HB 8490 2G3 27. januar 1984 HB 8491 25 280D11 27. januar 1984 HB 8487 266B2 27. januar 1984 HB 8486 245E7 27. januar 1984 HB 8489 454C11 27. januar 1984 HB 8484 33F8 9. januar 1985 HB 8697 30 317G5 27. januar 1984 HB 8485 520C9 8. januar 1985 HB 8696 369F10 13. december 1984 HB 8682 *260F9-1C9 7. november 1984 HB 8662 317G5 (CTCC 0055) 28. december 1984 HB 8691 35 788G6 (CTCC 0056) 28. december 1984 HB 8692 * Denne klon er et afkom af 260F9, og det blev fundet, at den havde en større antistofproduktion end 260F9.

5 29 DK 167194 B1

Disse deponeringer blev foretaget i henhold til Budapesttraktaten og vil blive opretholdt og gjort tilgængelige for andre i overensstemmelse med bestemmelserne herom.

10 15 20 25 30 35

Claims

1. Murint monoklonalt antistof, kendetegnet ved, at det 5 (a) binder selektivt til human-brystcancerceller, (b) er af G eller M i sotype, (c) som konjugeret til en ricin A-kæde udviser en TCID 50%-værdi overfor mindst én af cellerne: MCF-7, CAMA-1, SKBR-3 eller BT-20, i en koncentration på mindre end ca. 10 nM, 10 og (d) binder til et human-brystcancerantigen, hvortil også mindst en af følgende antistoffer: (a) 260F9, ATCC nr. HB 8488, 15 (b) 113F1, ATCC nr. HB 8490, (c) 2G3, ATCC nr. HB 8491, (d) 280D11, ATCC nr. HB 8487, (e) 266B2, ATCC nr. HB 8486, (f) 33F8, ATCC nr. HB 8697, 20 (g) 245E7, ATCC nr. HB 8489, (h) 454C11, ATCC nr. HB 8484, (i) 317G5, ATCC nr. HB 8485, (j) 520C9, ATCC nr. HB 8696 eller (k) 369F10, ATCC nr. HB 8682 25 binder.

2. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det binder til et ca. 210.000 dalton stort protein, som fore- 30 kommer i brystcancervæv.

3. Murin x murin hybridomacelle samt afkom af en sådan hybridoma-celle, kendetegnet ved, at den producerer et monoklonalt antistof ifølge krav 1. 35

4. Immunotoxin, kendetegnet ved, at det er et konjugat af et monoklonalt antistof ifølge krav 1 og en cytotoxisk del.

5. Monoklonalt antistof ifølge krav 1 eller 3, k e n - 31 DK 167194 B1 d e t e g n e t ved, at det er mærket med et detekterbart mærkningsmiddel .

6. Fremgangsmåde til in vitro drab af human-brystcancerceller, 5 kendetegnet ved, at cellerne bringes i kontakt med en cytocidalt effektiv mængde af et immunotoxin ifølge krav 4.

7. Fremgangsmåde til diagnosticering af, om en human-celle er en brystcancercelle, kendetegnet ved, 10 (a) at en humancelle inkuberes med et antistof ifølge krav 5, og (b) at tilstedeværelsen af mærkede binære immunkomplekser på human-cell en bestemmes. 15 20 25 30 35