NO164306B - Murinmonoklonalt antistoff for in vitro diagnose av brystkreft og fremgangsmaate ved in vitro diagnostisering. - Google Patents

Abstract

Murine monoklone antistoffer fremstilles og karakteriseres idet de binder selektivt til humnanbryst-kreftceller, er IgG eller IgM, og, når konjugert til ricin A-kjede, viser en TCID 50\ mot minst en av MCF-7-, CAMA-1-, SKBR-3- eller BT-20 celler på mindre enn ca. 10 nM.Det beskrives metoder for diagnostisering, overvåking og behandling av humanbrystkreft med antistoffene eller immunotoksinene som fremstilles derfra.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår det tekniske felt immunologi og nærmere bestemt in vitro kreftdiagnose. •

Mer spesielt angår oppfinnelsen et murinmonoklonalt antistoff for anvendelse ved in vitro diagnose av brystkreft og oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for gjennomføring og denne in vitro diagnostisering av hvorvidt en humancelle er en brystkreftcelle.

Siden midten av 70-årene har det vært tallrike rapporter om murine monoklonale antistoffer som viser interaksjon med humanbrystkreftforbundne antigener. I disse rapporterte studier ble: mus immunisert og foret méd humanmelkefett-globulproteiner, brystkreftcellelinjer eller brystkreft-membranekstrakter. Immunsplénocytter' ble sammenføyet med musemyelomceller og hybridomer ble valgt på en viss spesi-fisitet på kulturmedia for bryst- eller brystkreftantigener. Se til dette Taylor-Papadimitriou, J. , et al. "Int. J. Cancer" (1981) 28:17-21; Yuan, D. , et al, "JNCI" (1982) 68: 719-728; Ciocca, D. R., et al , "Cancer Res" (1982 ) 42:4256-4258. De normale vevreaktiviteter for disse tidligere kjente antistoffer er forskjellige fra de normale veveaktivitetene for antistoffene ifølge oppfinnelsen.

Tallrike tidligere forskere har foreslått eller rapportert å binde cytotoksiske midler til antistoffer for å fremstille "immunotoksiner". Nyere interesse har sentrert seg om immunotoksiner av monoklonale antistoffer konjugert til de enzymatisk aktive deler (A-kjeder) av toksiner av bakterie-eller planteopprinnelse via heterobiofunksjonelle midler. Se til dette Neville, D.M. og Youle, R.J. , "Immunol. Rev."

(1982) 62: 75-91; Ross, W.C.J., et al, "European J-. Biochem."

(1980) 10<4>; Vitteta, E.S. , et al, "Immunol. Rev." (1982) 62:158-183; Raso, V., et al, "Cancer Res." (1982) 42:457-464; Trowbridge, I.W. ånd Domirigo,- D.L, "Nature" Cond) (1981) 294:171-173. Som nevnt ovenfor angår foreliggende oppfinnelse et murinmonoklonalt antistoff for anvendelse ved in vitro diagnose av brystkreft og dette karakteriseres ved at det er et av de følgende antistoffer: a) 26GF9, ATCG 8488; g) 245E7, ATCC 8489; b) 113F1, ATCC 8490; h) 454C11 ATCC 8484; c) 2G3, ATCC 8491; i) 317G5, ATCC 8485; d) 280D11, ATCC 8487; j) 520C9, ATCC CRL 10197;

e) 266B2, ATCC 8486; eller

f) 33F8, ATCC HB 8697; k) 369F10, ATCC 8682.

som a) binder selektivt til humanbrystkreftceller;

b) har en G- eller M-isotype; og

c) når konjugert til ricin-A-kjede, viser en TCID 50% mot minst en av MCF-7-, CAMA-1-, SKBR-3- eller BT-20-celler på mindre enn ca. 10 nM. Oppfinnelsen angår som nevnt også en fremgangsmåte for in vitro diagnostisering av hvorvidt en humancelle er en brystkreftcelle, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved a) inkubering av en humancelle med et antistoff ifølge krav 1; og b) å bestemme nærværet av merkede binære immunkomplekser på den humane celle.

Således angår oppfinnelsen direkte og indirekte Immuno-analyser for påvisning hvorvidt en humancelle er en brystkreftcelle. Disse analyser involverer inkubering av cellene med de monoklonale antistoffer eller merkede derivater derav. Når de merkede derivater benyttes avleses nærværet av merkede binære immunkomplekser på cellene direkte. Når umerket antistoff benyttes blir cellene ytterligere inkubert med et merket antistoff mot det monoklonale antistoff og nærværet av merkede ternære immunkomplekser på cellene avleses.

Som brukt her betyr uttrykket "monoklonalt antistoff" et antistoffpreparat med homogen antistoffpopulasjon. Uttrykket skal ikke begrenses når det gjelder kilden for antistoffet eller den måte på hvilken det lages.

Som benyttet her med henblikk på de eksemplifiserte murin monoklonale anti-humanbrystkreftantistoffer betyr uttrykket "funksjonell ekvivalent" et monoklonalt antistoff som: a) kryssblokkerer et eksemplifisert monoklonalt antistoff; b) binder selektivt til humanbrystkrefteeller; c) har en G- eller M-isotype; d) binder til det samme antigen som bestemt ved immunopresi-pitering eller sandwich immunoanalyse; og e) når konjugert til ricin A-kjede, viser en TCID 50$ mot minst en av MCF-7-, CAMA-1-, SKBR-3-, eller BT-20-celler

på mindre enn ca. 10 nM.

Som benyttet her med henblikk på de monoklonale antistoff-produserende hybridomer ifølge oppfinnelsen er uttrykket "avkom" ment å omfatte alle derivater, efterkommere, produkter eller lignende av opprinnelseshybridomet som produserer det monoklonale antihumane brystkreftantistoff som produseres av opphavet, uansett generasjon eller karyotypisk identitet.

De antistoffdannende sammenføyningspartnere som benyttes for å danne hybridomene dannes ved immunisering av mus med levende humanbrystkreftceller eller membranekstrakter fremstilt derfra. Musene inokuleres intraperitonalt med en immunogen mengde av cellene eller ekstrakten og gies så tilsvarende mengder av immunogen. Milter samles fra immuni-serte mus noen dager efter den siste Inngivelse og en cellesuspensjoh fremstilles derfra for anvendelse ved sammenføyningen.

Hybridomene fremstilles fra splenocyttene og en murin tumorpartner ved bruk av den generelle somatiske . celle-hybridlseringsteknikk ifølge Kohler/ B. og Milstein, C, "Nature" (1975) 256:495-497 som modifisert av Buck, D.W., et al, "In Vitro" (1982) 18:377-381. Tilgjengelige murin myelomlinjer slik som de fra Salk Institute, Cell Distribu-tion Center, San Diego, California, USA, kan benyttes ved hybridisering.

Prinsipielt involverer teknikken sammenføyning av tumor-cellene og splenocyttene ved bruk av et fusogen som poly-etylenglykol. Efter sammenføyningen separeres cellene fra sammenføyningsmediet og dyrkes i et selektivt dyrkingsmedium som et HAT-medium, for å eliminere ikke-hybridiserte opphavsceller. Hybridomene ekspanderes hvis ønskelig og supernatantene analyseres på antihumanbrystkreftaktivitet ved konvensjonelle immunoanalyseprosedyrer (for eksempel radioimmunoanalyse, enzymimmunoanalyse eller fluorescens-immunoanalyse) ved bruk av immuniseringsmidlet (brystkreftceller eller -membranekstrakt) som antigen. Positive kloner karakteriseres ytterligere for å bestemme hvorvidt de oppfyller foreliggende oppfinnelses antistoffers kriterier.

Hybridomer som fremstiller slike antistoffer kan dyrkes in vitro eller in vivo ved bruk av kjente prosedyrer. De monoklonale antistoffer kan isoleres fra dyrkingsmedia eller kroppsvæsker alt efter som, ved konvensjonelle immunoglobulin-renseprosedyrer slik som ammoniumsulfatutfelling, gelelektroforese, dialyse, kromatografi og ultrafiltrering, hvis ønskelig.

Utvalg og karakterisering av monoklonale antistoffer.

De viktige karakteristika for monoklonale antistoffer er

1) deres Immunoglobulinklasse,

2) deres selektivitet for humanbrystkrefteeller og området for humanbrystkreftceller hvor til de binder, og 3) deres brukbarhet ved fremstilling av effektive antihuman-brystkref timmunotoksiner .

Selektiviteten og området for et gitt antistoff bestemmes ved prøving av dette mot paneler av 1) humanbrystkreftvev og -celler og 2) normalt humanvev- eller celler fra bryst eller annen opprinnelse. Ved utvalget av de krevede antistoffer ble til å begynne med ca. 22 000 voksne hybridomkulturer undersøkt mot de immuniserende brysttumormembraner eller cellelinjer, et panel på åtte vanlige vevmembraner, en fibroblast cellelinje og et brysttumorfrysesnitt. Klonene som reagerte med de neoplastiske materialer men ikke med normale ble identifisert i denne første bedømmelse og valgt for. isotyping og ytterligere bedømmelse for selektivitet og område. Den ytterligere bedømmelse medførte: 16 vanlige vevsnitt, 5 vanlige blodcelletyper, 11 ikke-bryst neoplasma-snitt, 21 brystkreftsnitt og 14 brystkreftcellelinjer. Antistoffer ble bedømt til å binde selektivt til brystkreft hvis de bandt sterkt til mindre enn ca. 1/3 av det vanlige vev og blodcelletyper. 127 antistoffer ble renset og prøvet ved den ytterligere bedømmelse.

Antistoffer som viser aksepterbar selektivitet og område ble konjugert til ricin-A-kjede ved bruk av en succinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat, SPDP, eller iminotiolan. IT, som koblingsmiddel. Konjugatene ble prøvet mot MCF-7-, CAMA-1-, SKBR-3-, og BT-20-celler i en 24 timers vevkulturanalyse. 16 av antistoffene viste aksepterbar immunotoksinaktivitet (TCID 50% av mindre enn 10 nM) mot minst en av disse brysttumorlinjer. 7 av de 16 ble funnet å erkjenne det samme 210 000 Dalton antigen mens seks av de syv sannsynligvis erkjente den samme epitop men skilte seg når det gjaldt affinitet.

Ytterligere detaljer av karakteriseringen av disse antistoffer er gitt i eksemplene nedenfor.

Immunokjemikalier.

Immunokjemikaliederivatene av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen som er av primær betydning er immunotoksiner (konjugater av antistoffer og en cytotoksisk del) og merkede (for eksempel radiomerkede, enzym-merkede eller fluormerkede) derivater der merkelappen gir et middel for identifisering av immunkomplekser som inkluderer det merkede antistoff.

Den cytotoksiske del av immunotoksinet kan være et cytotoksisk medikament eller et enzymatisk aktivt toksin av bakterie- eller planteopprinnelse, eller et enzymatisk aktivt fragment ("A-kjede") av et slikt toksin. Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav er foretrukket og er eksemplifisert ved difteri A-kjeden ikke-bindende aktive fragmenter av difteritoksin, exotoksin-A-kjede (fra Pseudo-monas aeruginosa), ricin-A-kjede, abrln-A-kjede, modeccin-A-kjede, cx-sarcin, Aleurites fordi i-proteiner, diantin-proteiner, Phytolacca americana-proteiner (PAPI, PAPII, og PAP-S), momordica charantia-inhibitor, cursin, crotin, saponaria officinalis-inhibitor, gelonin, mitogellin, restriktosin, fenomysin og enomysin. Ricin-A-kjeden, ikke-bindende aktive fragmenter av difteritoxin, abrin-A-kjeden og PAPII er foretrukket. Konjugater av det monoklonale antistoff og slike cytotoksiske deler kan lages ved å benyttet en varietet av bifunksjonelle proteinkoblings-midler. Eksempler på slike reagenser er SPDP, IT, bifunksjonelle derivater av imidoestere slik som dimetyl adipimidat. HC1, aktive estere som disuccinimidylsuberat, aldehyder som glutaraldehyd, bis-azidoforbindelser som bis(p_-azidobenzoyl )-heksandiamin, bis-diazoniumderivater som bis-(p-diazonium-benzoyl)-etylendiamin, diisocyanater som tolylen-2,6-diiso-cyanat og bisaktive fluorforbindelser som 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen.

Benyttet for å drepe humanbrystkreftceller in vitro for diagnoseformål vil konjugatene karakteristisk tilsettes til cellekulturmediet i en konsentrasjon av minst ca. 10 nM. Formuleringen og inngivelsesmåten for in vitro-anvendelse er ikke kritisk. Vandige formuleringer som er kompatible med kulturen eller perfusjonsmediet vil vanligvis kunne benyttes. Cytotoksisiteten kan avleses ved konvensjonelle teknikker for å bestemme nærværet eller graden av brystkreft.

Cytotoksisk radiofarmasøytika for behandling av brystkreft kan fremstilles ved konjugering av høylineær energiover-førings(LET)-emiterende isotoper (for eksempel Y, Pr.) til antistoffene. Uttrykket "Cytotoksisk del " slik den her benyttes er ment å Inkludere slike isotoper.

Merkelappene som benyttes ved fremstilling av merkede versjoner av antistoffene inkluderer deler som kan detek-teres direkte, for eksempel fluorkrom og radiomerkede så vel som deler slik som enzymer som må omsettes eller derivati-seres for detektering. Eksempler på slike merkelapper er ^P, 125I, 3H, 14C, fluorescein og derivater derav, rodamin og derivater derav, dansyl, umbelliferon, luciferia, 2,3-di-hydroftalazindioner, pepperrotperoksydase, alkalisk fos-fatase, lysozym og glukose-6-fosfatdehydrogenase. Antistoffene kan gis slike merkelapper ved kjente metoder. For eksempel kan koblingsmidler slik som aldehyder, karbodi-imider, dimaleimid, imidater, succinimider, bis-diazotert benzadin og lignende benyttes for å merke antistoffene med de ovenfor beskrevne fluorescerende, kjemiluminescente og enzymmerkelapper.

Antistoffene og de merkede antistoffer kan benyttes i immunobilledgivende eller Immunoanalyseprosedyrer for å påvise nærværet av brystkreft hos en pasient eller overvåke status for slik kreft hos en pasient som allerede har fått diagnose. Brukt for å overvåke status for en kreft må en kvantitativ immunoanalyseprosedyre benyttes. Hvis slik overvåking gjennomfører analyser periodisk og resultatene sammenlignes for å bestemme hvorvidt pasientens tumorbyrde har øket eller er blitt redusert. Vanlig analyseteknikker som kan benyttes inkluderer direkte og indirekte analyse. Direkte analyse involverer inkubering av en vevprøve eller celle fra pasienten med et merket antistoff. Hvis prøven inkluderer brystkreftceller vil det merkede antistoff binde til disse celler. Efter vasking av vevet eller cellen for å fjerne ikke-bundet merket antistoff blir vevprøven avlest for nærværet av merkede immunkomplekser. I indirekte analyser inkuberes vev- eller celleprøven med ikke-merket monoklonalt antistoff. Prøven behandles så med et merket antistoff mot det monoklonale antistoff, for eksempel et merket antimurinantistoff, vaskes og avleses for nærvær av merkede ternære komplekser.

For diagnoseformål vil antistoffene karakteristisk fordeles i form av et sett. Disse vil karakteristisk omfatte: antistoffet i merket eller ikke-merket form i egnede beholdere, reagenser for inkubering og vasking, et merket antimurinantistoff hvis settet er beregnet for indirekte analyse, og substrater eller derivatiserende midler avhengig av merkelappens art. Humanbrystkreftantigenkontroller og instruksjoner kan også være med.

De følgende eksempler gir en detaljert beskrivelse av preparering, karakterisering og bruk av representative monoklonale antistoffer Ifølge oppfinnelsen. Disse eksempler er ikke ment å begrense oppfinnelsen på noen måte.

Immunisering

Friskt efterkirurgisk humanbrystkreftvev og et antall normalvev ble benyttet for å preparere membranekstrakter ved homogenisering og diskontinuerlig sukrosegradientsentri-fugering. Humanbrystkreftcellelinjer ble oppnådd fra Breast Cancer Task Force, Amercan Type Culture Collection (ATCC9 og fra dr. Jorgen Fogh ved Memorial Sloan Kettering). Cellene ble holdt tilbake og benyttet som anbefalt av Breast Cancer Task Force, ATCC og dr. Fogh. For immunisering ble hver membranekstrakt inneholdende 100 pm protein (Lowery assay) eller ti millioner levende brystkreftceller Inokulert intraperitonealt i fem uker gamle Balb/c mus. Musene ble behandlet på identisk måte to ganger med månedsintervaller. Tre dager efter det siste skudd ble milten fjernet for cellefusjon.

Hvbridommetodene

Somatiske cellehybrider ble preparert ved metoden i henhold til D.W. Buck et al., supra, ved bruk av murinmyelomlinjen Sp-2/0-Agl4. Alle hybridomcellelinjene ble klonet ved begrenset fortynning. Halvparten av sammenføyningene benyttet splenocytter fra mus immunisert med brystkreftmembran-ekstrakter og halvparten brukte splenocytter fra mus immunisert med levende brystkreftcellelinjer. 83.424 brønner ble generert fra disse fusjoner av hvilke 22.459 viste hybridom-vekst.

Utvelgelsesmetoder

Hybridomsupernatant ble analysert på reaktive antistoffer enten ved en fastfase enzymbundet immunosorbentanalyse, ELISA, med immunisering av brystkreftmembranekstrakten, eller en indirekte immunofluorescensanalyse med den immuniserende brystkreftcellelinje. For fastfasemembran ELISA ble 40 pl 0,1 mg/ml brystkreftmembranprotein anbragt I polyvinyl klorid—mikrotiterbrønner i 12 timer ved 40 C. Ekstrakten ble suget av og brønnene vasket med fosfatbufret saltoppløsning, PBS, inneholdende 1% bovinserumalbumin, BSA. Brønnene ble så inkubert med 45 pl av en 1:10 fortynning av hybridomsupernatant. Fortynningen var media med 25 mM buffer, 10% bovinserum og 0, 1% natriumazid. Efter 30 minutter ved romtemperatur ble brønnene vasket igjen og inkubert i 45 minutter ved 37°C med en 1:200 fortynning av peroksydase-konjugert gjeteantimuse IgG. Fortynningsmidlet var PBS. Brønnene ble så vasket med PBS og omsatt med 200 pl .2,2-azino-di(3-etylbenztiazolinsulfonsyre) i 0,1 M natrium-citratbuffer med pH 4,2 i 30 minutter ved romtemperatur. Optisk tetthet ble målt ved 405 nm på en "MicroElisa'Reader". For hvert forsøk ble en positiv kontroll, anti-p 2 mikro-globulin ved 5 pg/ml omsatt med vanlig humannyremembran. Dette ga en optisk tetthet på 1,0 ± 0,1 (standard avvik). Bakgrunnen var 0 ± 0,1 optisk tetthetsenheter, O.D, ved bruk av media uten musemonoklonalt antistoff. Brønner som ga en reaksjon på brystkreftmembranekstrakten på over 0,7 O.D. ble beholdt.

For den indirekte immunofluorescenscellelinjeanalyse ble 100 000 kreftceller av den immuniserende cellelinje over natt anbragt med egnet medium i hvert kammer av et sett på 8 kammerinndelte objektglass. På samme måte ble 100 000 fibroblastceller fra cellelinje CC95 inkubert over natt i kammerutstyrte slide-brønner. Cellene ble vasket med PBS inneholdende 1% BSA. Brønnene, både brystkreft- og fibro-blastbrønnene, ble inkubert i 30 minutter ved 4°C med 1:10 fortynninger av hybridomsupernatanten. Cellene ble igjen vasket og inkubert i 30 minutter ved 4°C med 1:50 fortynning av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-konjugerte gjete F(ab')2 antimuse-Ig. Cellene ble vasket tre ganger, fiksert i 1,5$ formaldehyd i PBS i fem minutter, kamrene fjernet og skyllet 1 PBS. Disse slides ble så montert i en blanding inneholdende polyvinylalkohol, glycerol, buffere og et preser-ver ingsmiddel og undersøkt med et fluorescensmikroskop. Hybridombrønner som viste sterk fluorescentbinding til brystkreftcellene men ingen fluorescentbinding til fibro-blastcellene ble gjemt. 5156 hybridombrønner viste bryst-kref treaktivitet ved den første utvelgelse.

Supernatantene fra de 5156 positive brønner ble så prøvet ved fastfase-ELISA med åtte normalvevmembranekstrakter (lever, lunge, tykktarm, mave, nyrer, mandel, milt og pankreas). Enhver brønnsupernatant med en ELISA O.D. på over 0,3 ble kassert. 1101 av supernatantene ble funnet å være ikke-reaktive med vanlige vevekstrakter.

Disse 1101 hybridomsupernatanter ble prøvet på frysesnitt av humanbrystkarsinomvev. 6 pm snitt ble festet til glass, fiksert i 10 minutter i aceton ved 4°C, tørket i 10 minutter ved romtemperatur, vasket med PBS, blokkert med hesteserum og Inkubert i 20 minutter ved romtemperatur med 200 pl ren hybridomsupernatant. Glassene ble vasket med PBS og til slutt inkubert i 20 minutter ved 37°C med en 1:50 fortynning av peroksydase-konjugert kanin-anti-muse lg, vasket igjen med PBS, og til slutt inkubert 7,5 minutter ved 37°C med 0,5 mg/ml diaminobenzidin i 0,05 M Tris buffer pH 7,2 inneholdende 0,01$ hydrogenperoksyd. Glassene ble flekket med hematoksylin, dehydratisert og montert i et medium inneholdende 35,9$ metyl/n-butylmetylakrylatkopolymer, 7,1$ butyl-benzylftalat og 0,3$ 2,6-ditertbutyl-p-kresol. 124 brønner ga brystkreftselektiv binding og ble klonet.

Rensing og klassebestemmelse

Immunoglobulinklassen og underklassen for de monoklonale brystkreftselektive antistoffer ble bestemt. Antistoffene ble også merket internt ved dyrking av 2-3 x 10^ hybridomceller i 4 timer i et metioninfritt medium inneholdende 0,2 pCio <35>S metionin. <35>S-merkede antistoffer ble immunopresi-pitert med fikserte stafylokokkus A-celler eller med preparatet som ble benyttet til å fiksere stafylokokkus A-cellene på forhånd belagt med kaninantimuse immunoglobulin, og immunopresipitåtene ble analysert ved SDS-PAGE for å bestemme antistoff-lett- og -tungkjedemobilitet, mangelen av ekstrakjeder, og evnen for hvert antistoff til å binde stafylokokkprotein A.

Antistoffene ble ekspandert in vivo. Balb/c eller Fl (C57B/ x Balb/c) mus ble primet med 0,5 ml pristan intraperitonealt og efter 10-14 dager inokulert med en million log fase hybridomceller i PBS. Ascites-fluid ble lagret ved -70"C, tint og filtrert gjennom et 0,8 pm filter før ytterligere rensing.

IgG-antistoffer som binder stafylokokkprotein A blir renset ved affinitetskromatografi på protein A-kromatografisk harpiks inneholdende agarose, dekstran og/eller akrylamid med pH IgG-antistoffer som ikke binder protein A ble presipitert ved tilsetning av ammoniumsulfat til 40$ metning ved 0°C. Presipitatene ble gjenoppløst i PBS, dialysert til 20 mM Tris pH 7,2 og kromatograf ert på en 1,6 x 50 cm kolonne av dietylaminoetylcellulose, DEAE, med eluering med en 1,5 liter 0-600 mM NaCl-gradient ved 4°C og en strømningshastig-het på 1 ml/min. I hvert tilfelle ble kolonnefraksjonene overvåket ved SDS-PAGE og de reneste antistofffreaksjoner slått sammen, konsentrert til 1-3 mg/ml, dialysert til PBS/0,02$ NaN3, og lagret ved 4°C.

IgM-antistoffer ble renset ved gelfiltrering på en 2,6 x 40 cm kolonne av kromatografisk harpiks inneholdende agarose, dekstran og/eller akrylamid med eluering med PBS/0,01$ natrlumazid ved romtemperatur ved en strømningshastighet på 1 ml/min.

Selektiv bestemmelse

For å evaluere selektiviteten mot brystkreft ble de rensede antistoffer prøvet ved immunoperoksydase-snittflekking på snitt av 16 normalvev, og ved immunofluorescent celle-sortering på fem blodcelletyper. Immunoperoksydaseflekkingen ble gjennomført som ovenfor bortsett fra at kjente fortynninger av rensede antistoffer i PBS innen området 1-40 pg/ml ble benyttet i stedet for hybridomsupernatanter. De rene antistoffer ble først titrert for å finne den minimale konsentrasjon som ga sterkt immunoperoksydaseflekking på brystkreftsnitt og så benyttet ved denne konsentrasjon for normale vevprøver. Perifere blodceller (plater, lymfocytter, røde blodceller, granulocytter og monocytter) ble preparert ved sentrifugering ved bruk av et medium som separerer monocytter fra polymorfonukleære leukocytter. Cellene ble omsatt med antistoff ved den optimale konsentrasjon som bestemt ovenfor i 30 minutter ved 4<*>C, vasket, omsatt med 1:50 fortynning av fluorescens isotiocyanat-konjugert gjeteantimus lg i 30 minutter ved 4°C, vasket igjen og undersøkt i en cellesorterer. Vaskebufferen og fortynnlngs-midler var PBS med 1$ gelatin og 0,02$ natrlumazid. Celle-sortereren var utstyrt med en 76 pm dyse og 1 Watt argonione-laser ved 488 nm. En 80 mm konfokal linse ble benyttet på den optiske skinnemontering for fokusering. Andre filtere som ble benyttet var et 515 nm interferensf ilter og et 515 nm absorbansefilter (for spredd laserlys) og et nøytraldénsitets 1,5 filter for fremvlnkellysspredning. Konturplot av log fluorescinfluorescens mot fremvlnkellysspredning ble benyttet for prøveanalyse.

Bindingsoppførselen for de krevede antistoffer er angitt i tabell 1.

Områdebestemmelse

For å bestemme hvor bredt område av brystkreft som kan erkjennes av hvert antistoff ble de brystkreftselektive antistoffer prøvet ved immunoperoksydaseflekking på frosne snitt av 27 forskjellige brysttumorer. Brystkreftene som ble benyttet for snittflekking var alle infiltrerende intra-duktale karsinomer slik at det ikke skulle kunne gjøres noen korrelasjon av antistoffbinding med brystkreft av histo-logisk type. I tillegg ble det ikke funnet noen korrelasjon mellom antistoffbinding og nodalstatus eller estrogen-reseptorstatus for de 12 tumorer for hvilke donorinforma-sjoner var tilgjengelige. Antistoffene reagerte like godt med metastatiske og primære brysttumorer. Resultatene av disse prøver for de. krevede antistoffer er angitt i tabell 2.

Antistoffer ble ytterligere evaluert for område av bryst-krefterkjennelse ved cellelinjeimmunofluorescensanalyse på 14 brystkreftcellelinjer. Tabell 3 angir resultatene av disse prøver for de krevede antistoffer.

Til slutt ble antistoffene prøvet ved immunoperoksydaseflekking på 11 ikke-bryst ondartetheter. Resultatene for de krevede antistoffer er angitt i tabell 4.

Cytotoksisk bedømmelse

De krevede antistoffer ble konjugert til ricintoksin A-kjede, RTA, behandlet med SPDP som beskrevet av Carlsson, J., et al, "Biochem J" (1978) 173:723-737 eller med iminotiolan, IT.

SPDP kon. 1ugas. 1on

20 nM SPDP i etanol ble tilsatt i 20 ganger molart overskudd til antistoff og efter en 30 minutters inkubering ved romtemperatur ble ikke-omsatt SPDP fjernet ved dialyse mot PBS. Graden av derivatisering ble bestemt ved måling av frigivelsen av pyridin-2-tion ved 343 nm efter reduksjon med ditiotreitol, DTT. Avhengig av antistoffet ble tre til åtte lysin aminosyregrupper pr. antistoffmolekyl omdannet til pyridy1-disulf idderivåtet.

SPDP-behandlede antistoffer ble konjugert med RTA. Umiddel-bart før konjugering ble RTA redusert med 50 mM DTT, derefter avsaltet på en kolonne av kromatografisk harpiks inneholdende agarose, destran og/eller akrylamid for å fjerne DTT fra protein. Redusert RTA ble tilsatt i et tre til fem ganger overskudd over pyridyldisulfidantistoff. En typisk reaksjons-blanding i en mengde av 1 ml Inneholdt 7 pM antistoff og 30 jjM RTA. Reaksjonen ble tillatt å skride frem over natt ved 4°C. Graden av konjugasjon av RTA til antistoff ble bestemt spektrofotometrisk ved måling av frigivelsen av pyridin-2--tion. I gjennomsnitt inneholdt konjugatene to til tre RTA-molekyler pr. antistoffmolekyl. Dette ble bekreftet ved ikke-reduserende SDS-PAGE-gel (7,5$) som også viste at det typiske konjugatpreparat inneholdt 10-30$ fritt antistoff.

Konjugatblandingen ble kromatografert på en HPLC-størrelses-eksklusjonskolonne for å separere konjugater fra resterende ikke-omsatt RTA. Kolonnen ble ekvilibrert i 0,1 M natrium-sulfat/0,02 M natriumfosfat pH 6,8. 0,7 ml konjugatblanding ble injisert og så kromatografert ved en strømningshastighet på 1 ml pr. minutt ved romtemperatur. Fraksjoner på 0,5 ml ble samlet og signalkonjugatfraksjonene ble slått sammen og filtersterilisert før cytotoksisk prøving.

Iminotiolankon. 1ugas. 1on

Ca. 30 mg/ml antistoff i 0,10 M Na fosfat, 0,001 M Na EDTA, pH 8,0 (herefter kalt P-EDTA-buffer) omsettes med 1 mM 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre), DTNB, ved romtemperatur i ca. 15 minutter og avkjøles derefter til 0°C i et isbad. Nok IT tilsettes til denne oppløsning for å gi 2,5 IT molekyler pr. antistoffmolekyl og den resulterende oppløsning lagres ved 0-5°C i ca. 24 timer. Derefter dialyseres den ved 0-5°C mot tre 100-ganger .overskuddsvolumer av P-EDTA buffer.

RTA, vanligvis lagret i P-EDTA inneholdende 1 mM DTT, ultrafUtreres til en konsentrasjon mellom 10 og 15 mg/ml og dialyseres ved 0-5°C mot tre 100-ganger overskuddsvolumer av P-EDTA. Nok RTA tilsettes til det derivatiserte antistoff til å gi 1,0-1,2 frie tioler på RTA/blokkert tiol på derivatisert antistoff. Denne blanding inkuberes ved romtemperatur i 2 timer.

Kobllngsreaksjonsblandingen bringes til en kolonne av en kromatograflsk harpiks basert på et blått farvestoff festet opp på en fast bærer, hvilken blanding så elueres med P-EDTA av romtemperatur. Kolonnen skaleres til å inneholde ca. 2 ml sjiktvolum pr- mg utgangsantistoff. Efter at den første topp av ikke-konjugert antistoff er eluert fra kolonnen byttes elueringsmidlet over til P-EDTA inneholdende 1 M NaCl.

Immunokonjugat og ikke-omsatt RTA elueres i denne buffer som en meget skarp topp, denne slåes sammen og dialyseres ved 0,5°C mot et 10-ganger overskuddsvolum av 0,15 M Na-fosfat, pH 7,1 ( herefter kalt P^-buffer). Det dialyserte protein bringes til en kolonne av en gel ved 0-5°C og elueres med buffer i en•strømningshastighet av 6 cm pr. time. Kolonnen skaleres til å inneholde minst 25 ml sjiktvolum pr. ml tilført protein. Immunokonjugat elueres som en enkelt topp, noe efter det kasserte volum, baselinje gjenoppløses fra følgende topper av dimerisert og monomer RTA. Sammenslått immunokonjugattopp ultrafUtreres ved 35 psi til. en slutt-konsentrasjon på 5,0 mg/ml og filtersteriliseres.

Cvtotoksisltetsprøver

Testhumanbrystkreftlinjene som benyttes i cytotoksisltets-prøvene var MCF-7, CAMA-1, SKBR-3 og BT-20. Humanfibroblast-.cellelinjer CC95 og WI-38 ble benyttet som negative kontroller . 40 000 prøveceller i 1 ml medium ble tilsatt til ett sett av 8 ml glassampuller fulgt av tilsetning av konjugatopp-løsninger (i PBS inneholdende 100 pg/ml BSA). Efter inkubering ved 37° C i 22 timer ble mediet sugd av, monosj iktene vasket med PBS og metioninfritt medium supplert med <35>g metionin ble tilsatt. Ampullene ble ytterligere inkubert i 2 timer ved 37°C, mediet ble fjernet og cellene vasket to ganger med 2 ml 10$ trikloreddiksyre inneholdende 1 mg/ml metionin. Cellene ble tørket, scintillasjonsfluid tilsatt og radioaktiviteten ble tellet i en scintillasjonsteller. Cytotoksisiteten ble uttrykt som den vevkulturinhiberende dose av konjugat som resulterte i 50$ kontroll (ubehandlet) proteinsyntese, TCID 50$.

Resultatene av,disse cytotoksisitetsprøver er angitt i tabell 5.

In vlvo- testing av konjugater

Konjugater av 245E7, 280D11 og 260F9 med RTA ble fremstilt som ovenfor ved å benytte iminotiolan eller SPDP som koblingsmiddel. Effektivitetene for disse konjugater mot MX-1 humanbrysttumorceller in vivo ble bedømt som følger.

Atymiske Balb/c-nu/nu hunnmus med en kroppsvekt på 20-24 g ble benyttet. 1,0 mm<5> fragmenter ble oppnådd fra 600-800 mm' tumorer uten tegn på sentralnekrose og pakket i en sprøyte. Mus ble inmplantert s.c. med 0,05 ml av suspensjonen 1 aksilærområdet ved mediolateral punktur. På dag 7 eller 14 efter implantering ble musene veiet og deres tumorbyrde ble bedømt ved måling av implantatet ved hjelp av en passer. Musene ble gruppert i henhold til midlere tumorstørrelse.

Konjugatene ble injisert intravenøst i halevenen i kontrollmus 02D x 6 for å bestemme maksimal tolererbar dose for det spesielle konjugat. Basert på disse resultater ble doseplan for administrering av konjugatene til tumorholdige mus valgt. Grupper av tumorbærende mus og kontrollmus ble injisert Intravenøst med konjugatet ifølge den valgte plan. Dyrets reaksjon, bivirkninger og mortalitetene ble overvåket daglig sammen med målinger av tumorvolumet og dyrets vekt. Endringer I tumorvolumet ved slutten av prøveperioden ble beregnet basert på gjennomsnittet av summen av målingene over prøveperioden. Resultatene av disse prøver er angitt i tabell 6.

Antlstoffaffinitet og antlgendensitet

Flere av de krevede antistoffer ble iodert og prøvet på binding til en MCF-7 - eller BT-20 celler. Antistoffene ble merket med <125>j vec} bruk av kloramin T til en spesifikk aktivitet på ca. 10 pCi/jjg. For å bestemme immunoradiokjemisk renhet ble 100 000 cpm av to av de merkede antistoffer i 0,5 ml fetalkalveserum serieabsorbert med fem like deler på målceller i 15 minutter ved 0°C (generelt 4 000 000 MCF-7 brystkreftceller pr. del), og den gjenværende radioaktivitet i supernatanten efter hver absorpsjon ble bestemt.

For målinger av assosiasjonskonstanter ble kjente konsen-trasjoner av merkede og umerkede monoklonale antistoffer inkubert med målceller i f etalkalveserum i 15 minutter i is. Like mengder av celle-antistoffblanding ble så tellet i en gammateller eller filtrert gjennom "Microfold"-filterplater og filtrene tellet. For å ta med i betraktning ikke-bundet

antistoff holdt tilbake 1 væsken på filtrene gjennomførte man kontroller inneholdende den samme konsentrasjon antistoff men ingen celle ble tatt parallelt. Assosiasjonskonstantene og antigenkopiantallet pr. mål beregnes fra affinitets-prøveresultatene og er angitt i tabell 7 nedenfor.

Immunopresipiteringsprøver på antistoffene.antydet at syv av dem (454-11, 452F2, 520C9, 736G9, 741F8, 758G5 og 761B10) binder et felles monomert ca. 210 000 Dalton-protein funnet i cancerholdig brystvev. Seks av de syv (452F2, 520C9, 736G9, 741F8, 758G5 og 761B10) antas å erkjenne den samme epitop på 210 000 Dalton-proteinet. Av disse seks antydet relative affinitetsstudier at 520C9 hadde den høye assosiasjons-konstant.

Prøver av hybridomer som produserte de krevede monoklonale antistoffer ble deponert i.American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive. Rockville, Maryland 20852-1776, USA. Kun 520C9 ble deponert av de seks hybridomer som produserer antistoff som erkjenner den samme epitop på 210 000 Dalton-protein. De fem som ikke ble deponert ansees å være funksjonelt ekvivalente med 520C9. Deres ATCC tilgjenge-lighetsnummer og deponeringsdata for de deponerte hybridomer er:

<x>Denne klon er et avkom av 260F9 og ble funnet å være en bedre antistoffprodusent enn 260F9.

Disse deponeringer skjedde under Budapest-traktaten og vil holdes å være tilgjengelige for andre Ifølge Budapest-trak-tatens forutsetninger.

Claims (2)

1. Murinmonoklonalt antistoff for anvendelse ved in vitro diagnose av brystkreft, karakterisert ved at det er et av de følgende antistoffer: a) 260F9, ATCC 8488; g) 24 5E7, ATCC 8489; , b) 113F1, ATCC 8490; h) 454C11 ATCC 8484; c) 2G3, ATCC 8491; i) 317G5, ATCC 8485; d) 280D11, ATCC 8487; J) 520C9, ATCC CRL 10197; e) 266B2, ATCC 8486; eller f) 33F8, ATCC HB 8697; k) 369F10, ATCC 8682. som a) binder selektivt til humanbrystkreftceller; b) har en G- eller M-isotype; og c) når konjugert til ricin-A-kjede, viser en TCID 50 % mot minst en av MCF-7-, CAMA-1, SKBR-3- eller BT-20 celler på mindre enn 10 nM.

2. Murinmonoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det binder til et protein på ca.

210 000 Dalton funnet i kreftholdig brystvev.

3- Fremgangsmåte for in vitro diagnostisering av hvorvidt en humancelle er en brystkreftcelle, karakterisert veda) inkubering av en humancelle med et antistoff ifølge krav i; og b) å bestemme nærværet av merkede binære immunkomplekser på den humane celle.