JPS6270400A - ガン関連抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ｔ１、免疫グロブリン生産能を有するヒトＢ−セ
ルと免疫グロブリン生増能を実質的に欠損しているヒト
Ｂ−セルとの新しいタイプのヒト／ヒト融合細胞クロー
ン、それらが生産した抗原特異的ヒト免疫グロブリン、
更にｔｉｔ該ヒト免疫グロブリンの製法に関する。

更に詳Ｌ−＜は、本発明はヒト胃癌患者のヒトＢ−セル
とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／ヒト
融合細胞株で千−って抗原特異的ヒト免疫グロブリン生
産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマに関する。本発
明ｉ、ｔ　ｉ！た、核ヒト／ヒト融合細胞株が生産した
抗原特異的ヒト免疫グロブリンにも関する。

更に本発明け、核ヒト／ヒト融合細胞株を培地に培養［
７、その培養物より抗原特異的ヒト免疫グロブリンを採
取することを特徴とする特許ヒト免疫グロブリンの製法
にも関する。

該抗原特異的免疫グロブリンは、例えばヒト肺癌、胃癌
、脳腫瘍、悪性黒色．ｌｌＩ′Ｉｉ′ｆｒどの予防、治
療、診断の如き医学及び薬学分野生化学的試薬、生体高
分子の精製試薬などの薬理学分野、癌抗原の精製などの
生化学分野の研究等の広い分野において有用である。

従来、癌その他の抗卯によって感作さねたマウスＢーセ
ルと骨髄性白血病（ｍｙ　ｅ　ｌ　ｏｍａ　）マウスか
らのマウスＩ）一セルとの融合細胞をマウス体外で形成
Ｌ，　　｝−：”ｔ＋’＋Ｆ，ｔΔ原に対するマウス免
疫グロブリン生産能を有し、目つ自己増殖性を崩ずるマ
ウス／マウス融合細胞を形成した報告は知られている〔
例えば、ケ−　シー　●ジー、ミルスタイン−シー、ネ
イチャ”　（Ｋ’ｔ；ｈｌｔｔｒ　Ｇ，　、　Ａｆｔｌ
ｓｔｅｉｎ　Ｃ，　。

ｕａ．ｔｕｒｅ）、２５６，４９５（１９７５）ｌディ
ボールド・イ−　・ジー，ロイド・ケー・オー，リー●
エル●テイー・シー，イケダ・エイチ，エットゲン●エ
イチ参エフ，オールド●エル＃エイ。

プ。シーディング　オブ　ナショナル　アカデミイ　オ
ブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッドステート　オ
ブ　アメリカ（１）ｉｐｐｏｌｄ，　Ｅ，　Ｇ，　。

Ｌｌｏｙｄ，　Ｋ．Ｏ，　、　ＩＡ，　Ｌ．Ｔ，Ｃ，　
、　Ｉｋｅｄａ　、　Ｈ．。

Ｏｅｔｔｇｅｎ，　Ｂ，　Ｆ，　＆　Ｏｌｄ，　Ｌ，　
　Ｊ，　、　Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔ。

Ａｃａｄ．　　Ｓｃｔ，　　Ｕ，　　Ｓ，　　イ。）、
７７，６Ｂ４（１９８０）１等〕。

又、抗原によって感作されたヒトＢ−セルと骨髄性白血
病マウスからのマウスＢーセルとの融合細胞を体外で形
成シ７、上記抗原に対するヒト免疫グロブリン生産能を
有［７目一つ自己増殖＋′１を南するヒト／マウス融合
細胞を形成した報告も知られている〔例えばシュローム
―ジエイ，ワンダーリツヒ・デイー，アンド　テラモト
●ワイ●エイ　プロシーディング　オプ　ナショナル　
アカデミイオブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテツド
　ステート　オブ　アメリカ（、Ｓｃｈｌｏｍ　／，　
、　Ｗｕｎｄｅｒ−ｒｔＣｈ　Ｐ．　、　ａｎｄ　Ｔｇ
ｒａｍｏｔｏ　Ｙ，　Ｈ４．　、　Ｐｒｏｏ．Ｎａｔ。

ＡＣａｄ，　　Ｓｃｉ，　、　Ｕ．Ｓ，　Ａ．　）　、
　７　７　（　１　１　）　ｓ６８４１　（１９８０）
）。

ｊ〜か１，々から、ヒト免疫グロブリン生産能を有する
融合細胞を取得しようという上記後者の試みにおいては
、経時的に染色体欠落を伴い、前記ヒト免疫グロブリン
生産能が、経時的に喪失し、免疫グロブリン生産能が極
めて不安定である致命的な欠陥を有する。

ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒト融合細胞
を形成する試みと；〜で、抗原として・・シカ●ビール
ス又はハブテン（ｈａｐｔｅｎ）　［：　２　、　４　
−ジニトロフェニル〕によって感作されたヒトＢ−セル
をドナーとして使用１〜、こねと骨髄性白血病患者から
のヒト免疫グロブリン生産能を有するセルライン（ヒト
Ｂ−セル，親株）との融合細胞をヒト体外で形成し、上
記抗原に対するヒト免疫グロブリン生産能を有し、旧つ
自己増殖性を有するヒト／ヒト融合細胞を形成した報告
が知られている〔例えば、クロツチェψシー・エム，ラ
イネンバツハ●エイ，ホール●ダブリュ，ステブレスキ
ーΦゼット，コブロウスキー・エイチ，ネイチャ−　（
Ｃｒｏｃｅ，　Ｃ，　Ｍ，　、　Ｌｉｎｎｅｎｂａｃｈ
，　Ａ．　、　Ｈａｌｌ。

Ｗ，　、　Ｓｔｇｐｌｅｗｓｋｉ，　Ｚ　＆　Ｋｏｐｒ
ｏｗａｋｔ，　Ｆｌ．。

Ｎａｔｕｒｅ，　２　８　８　、　４　８　８　（　１
　９　８　０　）　ｊオルソン、エル，カプラン．エイ
チ争エス，ブロシーｆイング　オブ　ナショナル　アカ
デミイ　オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　
ステートオブ　アメリカ（　Ｏｌｇｓｏｎ，　Ｌ　ｓｔ
　Ｋａｐｌａｎ，　Ｈ，　、５．　。

ｐｒｏａ，　Ｎａｔ，　Ａｃａ．ｄ．　Ｓｃｉ．Ｉｆ，
　Ｓ，Ａ．）　、　？　（９　）　。

　６　一 ５４２９　（１９８０）　１等〕。

しか１７ながら、上述の方法Ｖ６１マウスマウスでは、
マウスの免疫グロブリンを作製−する方法であり、マウ
ス／ヒトハイブリドーマでｔｌ、マウス由来の生産物が
細胞Ｊ’？ｉ　曾中に生成さＪすることけ避目られ々い
。ヒト染色体の欠失に伴うヒト免疫グロブリン生産の消
失が起こる場合もある。そこでヒト／ヒト融合細胞かｒ
〕採取されるヒト型免疫グロブリンの生産が望まれる理
由である。しかしガがら、上記のヒト７／ヒトハイブリ
ドーマから生産さＪするヒト免疫グロブリンの報告、癌
細胞に対″′する結合の記載は々い。

本発明者等の一人によって、ヒト子宮癌患者のヒト／（
−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト
／ヒト融合細胞株で夕〕って抗原特異的ヒト免疫グロブ
リン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマが創造さ
れた（特開昭５９−１３７４９７号）。そして、子宮頚
部偏平上皮癌細胞、該細胞由来の株化１ｔｆｆｌ　胞Ｈ
ｅ　ｌ　ａ及びＣａ５ｋｉに対し、ｉＥ　常４Ｒ維芽細
胞（Ｉｒｌ　Ｉ　−３８）に対−する結合ＪＪに１Ｌ１
．てより強い結合力を示したことが報告された。

Ｅ７かｊ〜ながら、ヒト肺癌、胃癌、脳！１−ド瘍細胞
などへの結合性に関しては言及してい々い。

本発明者等は、ヒト７／ヒトハイブリドーマの創製研究
を行ってきた。その結果、ヒト胃癌患者のヒトＩ３−セ
ルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクローンとのヒト／に
ト融合細胞株であって、抗原特異的ヒト免疫グ「Ｊプリ
ン生産能を有するヒト／ヒトハイブリドーマの創製に成
功した。

更に、本発明のヒト／ヒトハイブリドーマが生産−する
免疫グロブリンは胃・癌のみ表らず、その発生の起源の
異々る肺癌細胞に対［７て結合力を有１〜、たとえばヒ
ト株化細胞、Ａ　ｓ　４９　（肺癌）に対して結合力を
有し、とくにこの株化細胞の分子叫約３７、０００の抗
啄に特異的に結合することがわかった。さらに又、肺癌
、胃癌、ｒｊｆ４Ｂ４瘍、悪性黒色腫に共通であること
のわかった分子ｆｉ３７．ｏｏＯの共通抗原に同様に特
異的に結合するという新たな知見を得た。

本発明の該ヒト／ヒトバイブリド−マは、ヒト胃癌患者
のヒトＩＪ−セルの免疫学的形質を有し７目。

つそのような形質を安定Ｖ（持Ｌｋ！”ぺし得ること及
び該ヒト／ヒトバイブリド−マリ、ヒト免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧ）生産能を有Ｌ７目つ生産されたこれら抗体
はヒト肺癌細胞、胃癌細胞、悪性黒色腫細胞に結合性を
示す抗原特異的モノクローナル抗体であることを発見］
−汀つそのような抗原特異的ヒト免疫グロブリンの製造
に成功した。

又更に、上記の新しいタイプのヒト／ヒトハイブリドー
マは、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セルを含侑するヒト細胞
群とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン〔ヒトＢ−セ
ル〕を含有するヒト細胞群とを、人間の体外で融合して
ヒトＢ−セルとヒトＢ−セルとの融合細胞を産生し２、
常法のＨ，ＡＴ培地中で培養して融合細胞クローンを取
得することにより産生できるととを発見し−［１つ子の
よう寿手法で上記ヒト／ヒトハイブリドーマ（たとえば
、ＳＬＮＦ１０）を創製することに成功した。

−〇　− 従って、本発明の目的はヒト胃癌患者のヒト　Ｂ−セル
とヒトリンパ芽球細胞株のサブクローン〔ヒトＢ−セル
〕とのヒト／ヒト融合細胞株であって、抗原特異的ヒト
免疫グロブリン生産能を南するヒト／ヒトハイブリドー
マを提供するにある。

本発明の他の目的は、」−記ヒト／ヒトハイブリドーマ
な用いて、ヒト肺癌細胞、胃癌細胞、悪性黒色腫細胞、
脳腫瘍などに結合性を示す癌関連抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリン（モノクローナル抗体）を製造する方法及び該
ヒト免疫グロブリンを提供するにある。

本発明の、上記目的及び更に多くの目的ならびに利点は
、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明のヒト／ヒトハイブリドーマはヒト胃癌患者のヒ
トＢ−セルたとえば該患者の血中リンパ節、牌臓、骨髄
などから得ることのできるヒトＢ−セルとヒトリンパ芽
球細胞株のサブクロー／〔ヒトＢ−セル〕、たとえばＵ
ＣＴ２９−６株（ＡＴＣＣ（１？Ｌ８０６１：微工研寄
託拒否通−ｌ　〇　− 融合細胞株であって、ヒト肺癌細胞、胃癌細胞、悪性黒
色腫細胞、脳腫瘍などに結合性を示す抗原特異的ヒト免
疫グロブリン生産能（モノクローナル抗体生産能）を有
する。

本発明者の研究により、ヒト胃癌患者のヒト　Ｉ）−セ
ルを用い、これを免疫グロブリン生産能を実質的に欠損
しているヒト　ＩＪンパ芽球細胞株のサブクローン〔ヒ
トＢ−セル〕と人間の体外で融合させ、胃癌、肺癌、悪
性黒色腫細胞などの噛関連抗原に特異的に結合するヒト
免疫グロブリン生産能を有するヒト／′ヒトハイグリド
ーマが初めて産生された。

との融合細胞を産生する融合操作それ自体は、公知の如
何なる方法で行ってもよい。例えば、融合操作は液媒中
で融合促進剤の存在ドに、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セル
とｅト′す゛ンバ芽球細胞株のサブクローン〔ヒトＢ−
セル〕とを接触させることにより行うととができる。と
のような融合方法の例と１−２では、仙台ビールス（Ｈ
ＴＩＪ）、ポリエチレングリコールなどの融合促進剤を
用いる方法や高電圧で電気的に融合する方法などを例示
するととができる。

例えば、水性媒体中、上記例示の如き融合促進剤の存在
下、所望によりおだやかな攪拌を加乏て系を均一にＬ２
、次いで、前記ヒト　Ｂ−セルの１ケと前記−リ゛ブク
ローン（ヒトＢ−セル）の１ケから成る融合細胞が産生
される時間、たとえば数分間のオーダーで静置すること
によｈ１所望の融合細胞が産生できる。液媒の例と１７
では、水、生理食塩水、５チジメチルスルホキシド水溶
液、５チグリセロール水溶液々どを例示することができ
る。

所望の融合細胞が産生された系を、例えば、遠心分離し
て細胞群を採取１−、−　、再び適当な培地に、たと對
げｌＯチ仔牛血清含有ＲＰＭＩ−１６４０液体培地中に
前記例示の如き試薬を加オ、採取し５た該細胞群を分散
させ、との分散液を例えばマイクロ−タイター中プレー
トの穴に、夫々、一定量づつ分取注入し２、例えば、５
チＣＯ１の存在下、３７℃で培養を行うことができろ。

各穴中の培養液を例えば３［１毎に新しい培養液と取り
かえ、例えば２週間培養を続けたのち、顕微鐘ドで一合
細胞の有無を調べ、コロニーの認められた試別の培養液
を採取し７、ヒト免１’ｆグロブリンの有無を例えび１
２Ｂを用いたラジオ・イムノ・アッセイ酵素抗体法によ
り検出することができる。

このようにして、ヒト免疫グロブリンの生産の認められ
たコロニーを、新しい培養液に移して培養し、融合細胞
を増殖させることにより融合細胞クローンを取得するこ
とができる。更に、必要に応じてザブ・クローニングし
て、所望のヒト背痛、肺癌、悪性黒色腫などの癌関連抗
原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン生産性クロー
ンを得るととができる。

この態様の実施に際しては例えば下記文献により公知の
手法を利用することができる。〔グラツシイ・エム會シ
ー、ハンドレイ・エイチ譬エイチ。

ハギワラ拳エイチ、アンド　ロイストン・アイ。

プロシーディング　オシ　ナショナル　ア力デミイ　オ
シ　サイエンス　オシ　ザ　ユナイテッドステート　オ
シ　アメリカ（Ｇｌαｓｓｙ、　Ｍ、（、’、　。

Ｈａｎｄｌｅｙ、　、Ｈ，Ｈ，、Ｉｌａｇｔｗａｒａ、
　Ｈｌａｎｄ　Ｒｏｙｓｔｏｎ。

１、　、　ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄｏ、Ｓｃｉ
、　Ｕ、　、５．　Ａ、　）　。

８０．６３２７．（１９８３）〕。

たとえば、上記文献に記載の手法を利用して健康なヒト
牌臓からパイオシシー（Ｂｉｏｐ８ｔｔ）により、リン
パ芽球、骨髄性白血病患者のリンパ球などの如きリンパ
系細胞をとり、その中の免疫グロブリン生産能を実質的
に有１〜ないＢモル９フフ培地中では死滅する感受性を
有するヒトＢ−セルを得ることができる。例えば後記実
施例で利用したヒトＢセルＵＣＴ２９−６は上記リンパ
芽球を用いて６−チオグアニン含有槁地で培養して得る
ことができる。

前述の手法により、ヒト胃癌患者のヒｌ−　Ｂ−セルと
ヒドリ／バ芽球細胞株のサブクローン〔ヒト５７微寄文
第６６４号〕から産生された抗原特異的免疫グロブリン
生産性ヒト／ヒトハイブリドーマ（ｔｉｕｍａｎ　Ｉｌ
ｙｂｒｉｄｏｍａ）　Ｓｌ、　Ｎ　Ｆ　１０　〔倣工研
寄託受託ｔｌｊ否通知釘通知番Ｑ：ｌ’ｔ　Ｏ微′Ｊ文
第Ｂ９７号〕の細胞生化学的性質を以下に示す。

ヒトヒトハイブリドーマＳ１．ＮＦｌＯ（１）　　ヒト
免疫グロブリンＧ　（Ｉ　Ｑ　Ｇ　）分泌（生産）、（
２）倍加時間（ダブリング−タイム）約３０時間、（３
Ｂ）　Ｎ　Ａ含Ｖが正常ヒト　ＩＪンバ球の約２倍、た
とえば２〜２５倍、 （４）上記（１）のＩｇＧはヒト株化細胞Δ５４９（肺
癌）に対し７て結合性を７ドす、 （５）組織適合性抗原Ｂ　Ｌ　Ａとし７てＡ１０をもつ
。

更に、−ヒ目己ヒト／ヒトへイブリドーマＳ　Ｌ　＃　
Ｆｌｏは、 （６）　　ＩＩ　Ａ　Ｔ選択培地（ヒボキサンチン、ア
ミノブチリン、チンン含有培地）中で分裂増殖可能であ
る。

尚、相対ＤＮＡ含址（ｉＥ常ヒトリンパ球のＴＵＮＡ含
量に対する比率）は、ハイブリドーマを７０ビジュウム
−アイオダイドで染色したのち、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ。

メーターで分離分析する方法によって決定されに０本゛
竜明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンＶ１、ヒト胃癌患
者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞株のサブクロー
ン〔ヒトＢ−セル〕トのヒト／ヒト融合細胞株であって
抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有する細胞株を
培地に培養し、その培イｒ物より抗原特異的ヒト免疫グ
ロブリンを採取するととにより製造できる。

例えば前述のようにして産生できるヒト／ヒトハイブリ
ドーマを適当な培地、たとえば１０１仔牛血清含有Ｒ１
）Ａｆｔ　−１６４０培地で培養し、培養液を採取する
ことによりヒト胃癌、肺癌、悪性黒色腫のガン関連抗原
に特異的に結合する免疫グロブリン含有物質を得ること
ができる。更に、所望により精製して精製免疫グロブリ
ンとすることもできる。精製はたとえば、硫安分画法、
アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、電気泳動法などの如き生体液
から免疫グロブリンを採取、精製する際に利用できると
同様な′ｆｆｌ製手段を利用する乙とができる。

本発明によれば、前述した融合細胞クローン又はその培
養液からヒト胃癌、肺癌、悪性黒ｅ　＋ｔＢｉのガン関
連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン含有物質
又は該免疫グロブリンを取得するに際し、抗原性組織（
例えば癌組織）を一度、免疫物質生産能を欠如するか若
しくは極めて弱い生体例えばヌード・マウス（ｎｕｄａ
　ｍｏｕｓｅ）等に植えつけ組織を維持１〜だ後、その
組織に対して成いは、培養系にもどされた組織に対して
反応するヒト免疫グロブリン（抗体）を探し出し、これ
を分離するのが有利である。

上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培替に利用できる培地
の他の例としては、１０優ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−
１６４０培地、Ｉ）ｕ、　ｌ　ｂ　ｅ　ｃ　ｏ培地及び
ＩＩ　Ａ　Ｍ培地の三者混合培地（混合比２：１：１）
であるＲＤＦ培地、及びトランスフェリン、インシュリ
ン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミンならびに
β−メルブトエタノール添加のＲｒ）Ｆ培地などを例示
することができる。又、培養条件としては、たとえば５
５４ｃｏ、の存在下、３７℃の条件を例示できる。

上述のようにして得ることのできる本発明のガン関連抗
原特異的ヒト免疫グロブリンの例として、１前述したヒ
ト／ヒトハイブリドーマＳＬＮＦ１０を用いて得られる
本発明グロブリ／を例示できる。

その特性を以下に示す。ヒト／ヒトハイブリドーマ、Ｓ
ＬＮＦ１０の生産するガン関連抗原特異的ヒト免疫グロ
ブリン： ０）　ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でおって、（ロ
）ヒト株化細胞、（５４９（肺癌）に対して結合力を有
し、この株化細胞の分子量約３７．０００の抗原に特異
的に結合する。ヒト株化細胞Ｇ−３６１（悪性黒色腫）
、ヒト株化細胞ＡＧＥ（胃癌）彦とに対しても結合力を
示し、これら細胞の分子量約３７．０００の共通抗原に
特異的に結合する。

（ハ）Ｈ鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）及びＬ鎖（Ｈｇ
ｈｔ　ｃｈａｉｎ）より成り、分子量が約１５万である
。

上記ヒト株化細胞Ａ５４９（肺癌）は、ＡＴＣＣＣＣＬ
−１８５として、又は、ヒト株化細胞Ｇ−３６１は、Ａ
ＴＣＣＣＲＬ−１４２４としてＡＴＣＣ（アメリカン参
タイプ争カルチャーΦコレクション）から自由に入手す
るととができる。

本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンはたとえばヒト
肺癌、胃癌、脳腫瘍、悪性黒色腫の如き、ヒト癌への作
用抗体或い壷−ｊそれ自体の作用でと、れら癌細胞の増
殖抑制、癌細胞のタヒ滅を行わせたり、ヒト体外で量産
されたとれらの癌組織認識抗体に補体もｌ〜くけ、Ｔ−
ＩＪンバ球の助けをかりて癌細胞の増殖抑制や癌細胞死
滅のはたらきをさせたりするととができる。更にまた、
ヒト体外で神意された癌特異的抗体をキャリアーとして
利用して例えば化学療法剤結合−ヒト・モノクローナル
抗体、インターフェロン結合−ヒトモノクローナル抗体
、高分子青素結合−ヒト・モノクローナル抗体、薬物入
りリボゾーム結合−ヒト・モノクローナル抗体などの形
で癌細胞の増殖抑制や死滅のｔまたらきをさせたりする
のに有用である。オた、本発明方法で得られるヒト・モ
ノクローナル抗体をキャリアーとして利用し、とれに放
射線感受性物質を結合させて、獣者に投与し、癌細胞に
選択的に集まる性質を利用【７て患部を検知し放射線療
法に利用すると−とができる。とのよう々癌に対する利
用に際しては、ヒト・モノクローナル抗体として完全な
抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法で特異的抗
原認識部位を含すより小さな分子に切断して用いたり、
痩け、そのような小さな分子もしくけ特異的抗原認識部
位のみを池の抗体の非特異的抗原認識部分と結合させて
、より有効性のある修飾ヒト−モノクロナル抗体を化学
的手法で創製し７て用いることもできる。

以下、実施例により、本発明方法実施の数例をさらに詳
しく述べる。

実施例１ 胃癌騒音から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手し
た。リンパ節を７１サミで細かく切りきざみ、内部のリ
ンパ球を培地Ｒ１）Ｆ　（Ｒ７’Ａ／Ｂ６４０：ＤＭＥ
：Ｆ−１２＝２：１：１）中に分散させ、続いて２重の
ガーゼを用いて、濾過を行い、脂肪層を除いた後に、Ｐ
液中の細胞（リン・く球〉８０チ）を遠心法によって集
める〔ヒトＢ−セルドナーを含むヒトリンパ球分画（ド
ナ−Ｈ−セル）〕。

その後、このリンパ球分画を２０％牛脂児血清および、
１０ｆＪジメチルスルホオキサイド（，１）　Ａｆ　Ｓ
ｏ　）を含むＲ７）　Ｆ培地中で凍結（−１３０℃）１
７、細胞融合を行う日まで保存１２だ。

ドナーリンパ球と免疫グロブリン生産能を実質的（ｒ（
欠損している親ヒトＢ−セル（ＵＣ７２９−６）のそれ
ぞれをＺ２Ｘ１０・および４．４Ｘ１０’個混合し、３
５チポリエチレングリコール１５００の存在下に融合を
完了させる。その後、１００ＧＢ０分間の遠心処理を行
ってポリエチレングリコールを除き、新たに、１０チ牛
脂児血清および、ヒボキナンチン、ア建ノブテリン、チ
ミジン（ｌＴＡＴ）を含むＲＤＦ培地を加える。この細
胞群を含む培養液２００μｔ（この中には６Ｘ１０’個
のセルを含む）づつを９６個の穴をもつミクロプレート
に分注し、約２週間、３７℃、５９ｇＣ０□条件下のイ
ンキュベーターで培養した。この間、ＨＡＴ及びｔＯＷ
牛脂児血清を含むＲＤＦ培地を３日に１度交換した。親
Ｂ−セル（Ｕ（？７２９−６）はアミ７ノプテリン存在
ではヒポキサンホスホリボシールトランスフェラーゼを
欠損しているだめ、生きることが出来ない。またリン／
４球は通常の培地たとえばＲＤＦ＋ＬＯ％牛脂児血清中
では永続的に増殖［７生きのびることができない。よっ
てＨＡＴを含む培地で永続的に増殖した細胞はリンノ（
球と親Ｂ−セルの融合した細胞である。２週間培養の後
、ミクロプレートの９６個の穴の中に２個の〕蔦イブリ
ドーマのサブクローンが見られた。とのうちの１個のノ
蔦イブリドーマサブクローンは更に、クローン化され、
ＳＬＮＦｘｏと命名された。これが、ハイブリドーマで
あることをさらに確認するために細胞内、Ｉ）ＮＡ含量
を調べた。その方法を以下に説明する。

遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理により上清を除
去する。７０チエタノール溶液で３０分以上固定を行う
。遠心処理により上清を除き、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮα
δ−）溶液を加え、静かに振盪し、ＲＮＡを分解する。

３７℃で３０分間反応させた後、再び蒸留水で２度洗浄
する。プロビデイウムイオダイ）”　（Ｐ　Ｉ　）をＪ
ｌｌｌえ、室温で２０分間、染色した後、さらに蒸留水
で２度洗浄する。

蒸留水で再希釈１〜、セルソー　ターを用いて分析した
結果、ＳＬＮＦｘｏには親ヒトＢセル（Ｕ　Ｃ７２９−
６１の２倍喰のＩ）　Ｎ　ＡＮＭが認められた。

また市販のＩＩ　Ｌ　Ａタイピング−キラｌ−（ＴＹ’
ＰＩＮＧＫＩＴ）　　［ヘキスト社製］を用いて、ＳＬ
ＮＦ１０のＨＬ　Ａタイプを調べた結果、親Ｂ−セル（
Ｕ　Ｃ７２９−６１に卵、られないタイプＡ１０が検出
され、これはドナーリンパ球由来のものと思わＪする。

決定した。５　Ｌ　Ｎ　Ｆ　ｌｏのＨｒ、　、（タイプ
１求、イ８１、．４　　．４　　　ＢＢ　　　　Ｂ　　
　８ｗ４　８ｗ６１ＸＩ（ｌ　　為　　　　ｌ　　蔦　
　　　飄丁　）４６Ｍであった。以ｌ二の結果より、Ｓ
ＬＮＦ１０は／・イブリドーマであることが確認された
。

このＳｌ、ＮＦｌｏがヒト免疫グロブリン（Ｈｕｌｃｔ
）を産出していることを酵素抗体法を用いて確めた。

以下、その方法を説明する。

ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫グロブリン抗
体を滴下〔５０μ／）Ｌ、、３７℃で１時間プレートに
吸着させる。０３チのゼラチンを含む１０７Ｂ邊ＪＴ）
Ｂ、Ｓ（ゼラチン緩衝液）で３回洗浄した後、１チ牛血
清アルブミン溶液を滴下（２００μｌＨ，，３７℃で１
時間吸着させる。

ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する
。次に検液（培養上清）を滴下（５０μｌ）して、３７
℃で１時間反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。ペ
ルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩＱ抗体を滴下（５０μ
ｍりシて、３７℃で３０分間反応させ、培ｔｈ清中のヒ
トＩｇと結合させる（酵素抗体法）。ゼラチン緩衝液で
３回洗浄後、過酸化水素とＯ−フェニレンジアミンを含
む基質溶液を加え、暗室でＩｏ分間反応させる。５Ｎ−
Ｂ、ＳＯ，（ｓａμｌ）を加えて反応をＢ−める。もし
ミクロプレートＨにペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩ
ｇ抗体が残っている場合、す々わちそれに結合されるヒ
トＩｇが残っている場合には４９０ｎｍに吸収をもつ哉
色の基質反応物が生産される。

との曖を吸光度語を用いて測定し、ハイブリドーマ培養
−上清中に含まれるヒトＩｇの叶を知る。ハイプリドー
マ培養土清中にヒトＩｇが存在しない場合には、ペルオ
キシダーゼ結合ヤギ抗ヒｔ−１ｒｔ抗体は洗浄の段階で
洗いＩＩｆ、される。

以−Ｌの測定方法を用いた結果Ｓ１．ＮＦ’１ＯＶＦヒ
トＩｇＧを生産していることがわか１）だ（ドナーＩノ
ーセルと同形質のＩｖ）。

２週間後にＳＬＮＦ１０を２４個の穴をもつミクロプレ
ート（２ｍ／／穴）に植え加えた後、さらに１週間培養
を続けた。融合後３週間目に、ｊΔ養液の上清を採取、
神々の株化細胞を標的細胞と１７でヒトハイブリドーマ
から生産されるＩＱの特朕性を調べた（一定の形質をも
つｒｇ又は特定の形質をもつＩｇ）。そのブＪ法を以下
に説明する。

ヒトの種々の株化培養細胞（これらはＡ　Ｔ　ＣＣより
人手ｎＪ能）を／′）Ｆ培地（ＤＡｆＥ：　Ｆ−１２＝
１：ＩＮ’こ１０チ牛脂児血清を加えた培地で培養する
。細胞の数が５Ｘ１０’〜ｌＸｌ０’になった段階で、
トリプシンを用いて細胞をシャーシ／の底面から剥が１
７、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく洗浄する。

９６個の穴をもつミクロタイタープレートの各穴に細胞
を一定数（１０”／１ｏｏμｌ）ずつ分注し、３７℃で
１晩、プレートに吸着させる。次に、３チグルタルアル
デヒド溶液を滴下（５０μｌ）し２．３７℃で２０分間
、細胞の固定を行う。遠心法（２００（７ｚ　１０分間
）で細胞をおと］〜、ゼラチン緩衝Ｗｊで３回洗浄した
後、１チ牛血清アルブミン溶液を滴下（２００μｌ）し
、３７℃で１時間プレートに吸着させる。

ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する
。その後、検液（培養上清）を細胞の上に滴下（５０μ
Ｊ）Ｌ、３７℃で１時間反応させ、ゼラチン緩衝液で３
回洗浄する。続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒトＢ７抗
体を滴下（５０μｌ）し、３７℃で３０分間反応させる
。ゼラチン緩衝液で３回洗浄を行”りた後、先述の酵素
抗体法で述べた方法によって細胞に結合する培養液中の
ヒトＩｇの量を測定する。

以上の方法によって、ＳＬＮＦｌｏのＩｇＧの標的細胞
特異性をそれぞれ調べだ結果、Ｓｌ、ＮＦＩＯ培養液中
のＩＱＧは胃癌由来の株化細胞−４Ｇ　Ｓに対して結合
力を・−自しており、本発明者の検討に１れげ胃癌Ｂ外
の株化細胞であるＧ−３６１（悪性黒色間）、７１５４
９（肺癌）に対１．でも結合部を有する。

すなわち、ドナーＩｔ−セルは体内に胃癌をもつ患者か
ら採取さＪまたものであるので、細胞融ＦＮ　’ｉノ、
：によってイ乍り出された自己増殖性をもつハイプリド
ーマのクローンからを１ドナーＢ−セルと同形質のかつ
特電の抗原結合部位をもつモノクロナール（学−）抗体
を生産Ｌ２ているととを示（−ている。

約３週間後に、ハイブリドー−７の１７％　）ｌｈから
ＩｌＡＴを除きＲ１）Ｆ＋１０チ牛脂児血清でＦＡ　棹
、倍加時間２４時間で、Ｓｌ、ＮＦｌｏけ１Ｘ１０”ｌ
固／　ｍｅ細胞が培地で生育する特約１μｇ／ｒａＩ！
の閘でヒトＩｇＧを生産し２続けている。

ハイブリドーマの多Ｅ辻培養液を７０≠の硫ｎｒｒンモ
ニウム沈殿させ、粗ｒｇ分画を集めた。得られだ沈殿を
生理俣塩水に溶かＩ、、ＩｒｔＧ６寸プロティン１ノを
結合させたセフ了ロースを用いてアフイニテイクロマト
グラフイーの手法で精製さシまた。

収率しｔＦｌ、ＮＦｌｏの培養蹄Ｂから１■のＩＱＧが
得ら′ＦＬだ。これらのアフイニデイクロマトグラフイ
を用いて精製（７たＩσ標晶をＳｌ）　Ｓ−電気泳動法
で分析し、た−結果、ヒトＩσと同形質σ）分子量１５
万のＩ　Ｑ　Ｇを生産していることが確められた。

また、市販の’ｒＡヒトＩｇＧ血清を用いて、ＳＺ、Ｎ
　Ｆ’１０の１−ＢするＩ　ｇＧ（ｄ０２タイプである
ととが確めらねた。

実施例２ 実施例１において得られた）・イブリドーマ、’；ＬＮ
Ｆ１０の２５代継代株（２０チ牛脂リ一、血清、１０チ
Ｉ）Ｍ　ＳＯ金含有　７）　Ｆ培地中に一１９２℃で凍
結保存せるもの）をＭ伸し、ｌＯチ牛脂児血清含治ＲＩ
）　Ｐ’培地へ移［７、遠心分離（ｓ　ｏ　ｏ　ｒ、ｐ
、　ｒｎ、　。

５分間）して、沈降させた細胞を１０％牛口ｈ１品而清
含有Ｒ１）　Ｆ培地に分散させ、細胞懸濁液をルー製す
る。別に予じめ、牛血清アルブミン、ヒト）ランスフェ
リン、インシュリン（仔牛）、曲ヒレン酸ナトリウム、
エタノールアミン′、β−メルカプトエタノール含有Ｒ
１）Ｆ培地約６１を調製しておく。この陪池へ上記細胞
懸濁液を細胞濃度ｌＸｌ０’〜５Ｘ１０’程１＃′にな
るように加え均一に分散さす、回転培養ビン（ローラー
ボトル、径約１２ｃｍ円筒部長さ約５０ｃｍ　）　ｌ　
Ｏ−、ｒドに約６０　ｆｌ　ｍｌずつ分注し、５％ＣＯ
，条件下のインキュベー　ター中で回転培滲を行なう（
３７°Ｃ，約２　／　３　ｒ、ｐ、　ｍ、’　）。

約６　Ｒ３間の培養で細胞濃度約ｌＸｌ０＠に達した培
養液を遠心分離ｌ−で細胞を除き、培塗液約６１を得た
。こねを吸引濾過（Ｐ紙人１３１）Ｉ、、炉液を更に１
．２〜５．０μｍのミクロフィル、ターで精密濾過して
、炉液約６７を得た。これに硫安を加え、７０チ飽和溶
液とな［７、沈殿を遠心分離１７、粗免疫グロブリンＩ
ｇＧ含有物を得た。同様にしてＳＬＡＭ”１０　３０代
継代株、３５代継代株より粗免疫グロブリンＩｇＧ含有
物を分酸し、合計的１８１の培養液中より粗免疫グロブ
リン含有物を収得した。これを１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＢＳ。

ｐ　Ｂ７．０　）約２００ｍ／に溶解し、ν過後、ｐ液
を１０　ｍＡｆ　　ｐ　Ｚ？　Ｓに対して透析を行い（
２４時間×２回）、透析内液的２００ｍ＋！を得だ（免
疫グロブリン含有透析液）。別にプロティンＡを結合さ
セｆｒｃＮＢ　ｒ−活性化セファロース−４Ｂゲル（Ｂ
ｅｄ容積３０　ｍｌ　）充填カラムを謂製し７ておき、
ＬＯｍＡｆ　　Ｐ、ＢＳを流し洗浄と平衡化をする。こ
れに−上記透析内液をゆっくりと添加し、ＩｇＧを吸着
させ、吸着カラムをＬＯｍＡｆ　　ｐｕｓ約３００ｍ１
で洗浄する。次いで！Ｌ　５　Ｍｋｆｇｃ　ｌ、含有１
０ｎ＊　Ｍ　　Ｐ　Ｂ　Ｓ約４Ｑｍｔを用いて溶出させ
た。溶出液のチェックは２８０ｎｍにおける吸光度の測
定により行った。有効画分は３．５　Ｍ　　、、ＭｇＣ
ｌ、溶出区分に集中した。これを集めて３Ｑｉ１！のＩ
ｇＯ含有画分を得だ。これを予じめ調製せるセファデッ
クスＧ−２５ゲル（ベッド容積１５０ｍ／）充填カラム
へ流し、１０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液で溶出させ、脱塩
させた精製１（ＩＧ金含有分約３Ｑｍｌを得た。

この液を試料として５ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥ（ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法）にかけた。ヒトＩ　ｇ　Ｏ（Ｃ
ａｐｐｅ１社製）を標準品とし、標準蛋白質として、フ
ォスフォリラーゼｂ　（分子＠　９４０００）、アルブ
ミン（分子Ｂ６７０００）、卵白アＡ／　７’　ｉ−３
〇　− ン（分子１ｔ４３０００）、カルボニックアンヒドラー
ゼ（分子址３ｏｏｏｏ）、）リブシンインヒビター（分
子…２０１００）、α−ラクトアルブミン（分子昭−１
４４００）を用いた（いずれもファルマシアファインケ
ミカル社製）。

上記で得た電気線ＢＢシＩＶ」、試料中にｔ−を標準品
ヒト　１０　Ｇのバンドと一致する２本のバンド〔ＪＩ
釦（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）及びＬ鎖（Ｈｇｈｔ　ｃ
ｈａｉｎ）　）のみを示した。また標準蛋白質と対Ｂ１
して分子用約１５００００のＩｇＧが存在するととがわ
かつた。

十８［し梢製１ｇＧ合有液中の蛋白質の合計をＬｏｗｒ
　ｙ法により、ヒト　Ｉ　Ｑ　Ｇ　（Ｃαｐｐｅ　１社
製）を用いて作成１−また検徊線より求めノこ結果的１
８〜でおった。

即ちハイプリドーマＳＬＮＦＩＯ株の２５〜３５代絆代
株の培養液１８１よりヒトＩ　ｇ　Ｇが約１８■産生し
たことを示し、培養液Ｂ当ね１ｌｉｌｐのヒトＩｇＧを
産生°すると、とがわかる。どのことは本ハイブリドー
マＳ１．　＃　Ｆ　１０　＆：ｊ継代椿養を行っても、
ＩｇＧの産生には変動ががいととを示している。

実施例３ 実施例１において得られたノ・イブリドーマＳＬＮＦ１
０が生産するモノクロナール（単一）抗体（精製品）の
認識する抗原は癌細胞抽出液の中に存在するトトカウエ
スタンブロツテイング法によって確認された。その方法
を以下に説明する。

ヒト肺癌由来の株化細胞Ａ３４９及びヒト悪性黒色腫由
来の株化細胞Ｇ−３６１を１（ｌ牛胎児血清を含む１）
Ｆ培地＜ＤｕＥ：ｐ−ｔ　２＝１　：　ｔ　）にて培養
する。適当細胞数増殖ｌ〜だところで、細胞を剥離回収
し、遠心法により細胞沈殿を集める。

沈殿ヲ１　ｍ　ＡＩ　　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　（フェニルメ
チルスルホニルフルオリド、蛋白質分解酵素阻害剤）含
有ＬＯｍＡＩ＋）ン酸緩衝液中に懸濁し、粉砕器を用い
て細胞を破砕する。遠心分＾ｔｒを行い、得た一Ｌ清の
一部を５−２０％の濃度勾配をかけだＳ　７）　Ｓ−ｐ
　Ａ　Ｇ　Ｅ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）
に供する。泳耐１終了後、直ちにゲル上に蛋白質吸着能
の高いフルオロカーボン系膜を重ね、ゲル中の蛋白質を
電気泳動的に膜上に移動させる。膜をゲルより剥し、３
チ牛血清アルブミン溶液（ＢＥイ）中にて、ゆるやかに
１時間振盪することにより、膜上に残存するタンパク吸
着部分を消失させる。

次に１０ｍＭ　ＰＢＳで洗浄し、過剰ノＢ　Ｓ　Ａを除
去した後、アフイニテイクロマトグラフイにより精製し
たＩ　ｇＧ　（Ｓ　ＬＮＦ　１０産出）と室温で１６時
間反応させる。その後１０ｍＡｆ　　ＰＢＳでよく洗浄
し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩＱＧ抗体ど室温
で、１時間反応させる。１゜ｍＭ　　ＰＦＪ、Ｓで洗浄
後、ペルオキシダーゼの基質溶液（５ｍｌエタノール、
１５η４−クロロ、１−ナフトール、２５ｘ／クエン酸
緩衝液、６μｌ過酸化水素）と室温で、２０分間反応さ
せる。この方法により、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒ
ト　ＩＱＧ抗体が残存する場合、つまり、ＳＬＮＦ１０
が産生するモノクロナール抗体（Ｓｌ、Ｎ−ＩＱＧ）に
より認識される抗原が存在する場合、青いバンドとして
検出される。

以−Ｌの測定方法を用いた結果ＡＢ４９、Ｇ−３６１に
ついては両者とも分子ｉ１３７０００の単一　３３− 一分子が検出された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞
   株のサブクローンとのヒト／ヒト融合細胞株が生産した
   抗原特異的ヒト免疫グロブリン。 ２、ヒト／ヒトハイブリドーマＳＬＮＦ１０である細胞
   株が生産した特許請求の範囲第１項記載の抗原特異的ヒ
   ト免疫グロブリン。 ３、該免疫グロブリンが、 （イ）ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であつて、（ロ
   ）ヒト株化細胞Ａ５４９（肺癌）に対して結合力を有し
   、この株化細胞の分子量約３７，０００の抗原に特異的
   に結合する、 の生化学的性質を有し、ヒト／ヒトハイブリドーマＳＬ
   ＮＦ１０が生産したものである特許請求の範囲第１項記
   載の抗原特異的ヒト免疫グロブリン。 ４、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セルとヒトリンパ芽球細胞
   株のサブクローンとのヒト／ヒト融合細胞株であつて、
   抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産能を有するヒト／ヒ
   トハイブリドーマ。 ５、ヒト／ヒトハイブリドーマＳＬＮＦ１０である特許
   請求の範囲第４項記載のヒト／ヒトハイブリドーマ。 ６、下記（１）〜（５） （１）ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分泌（生産）、
   （２）倍加時間（ダブリング・タイム）約３０時間、（
   ３）ＤＮＡ含量が正常ヒトリンパ球の約２倍、（４）上
   記（１）のＩｇＧはヒト株化細胞Ａ５４９（肺癌）に対
   して結合性を示す、 （５）組織適合抗原ＨＬＡとしてＡ１０を持つ、の細胞
   生化学的性質を有する特許請求の範囲第４項もしくは第
   ５項記載のヒト／ヒトハイブリドーマ。