KR20230005841A

KR20230005841A - 변형된 면역글로불린

Info

Publication number: KR20230005841A
Application number: KR1020227037241A
Authority: KR
Inventors: 위안 구오; 바이홍 리우; 이 양; 유에레이 쉔
Original assignee: 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2020-04-26
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2023-01-10
Also published as: EP4143234A1; BR112022021625A2; CA3179891A1; IL297545A; US11987615B2; WO2021218862A1; US20230041757A1; JP2023524669A; AU2021264838A1; MX2022012973A; CN115803344A

Abstract

본 발명은 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체로서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체를 제공한다. 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물 및 폴리펩티드 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

변형된 면역글로불린

우선권 주장

본 출원은 2020년 4월 26일에 출원된 PCT 출원 제PCT/CN2020/087036호, 2021년 1월 21일에 출원된 PCT 출원 제PCT/CN2021/073085호, 및 2021년 4월 2일에 출원된 PCT 출원 제PCT/CN2021/085181호의 이익을 주장한다. 상술한 것들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

기술 분야

본 개시는 변형된 면역글로불린에 관한 것이다.

항체는 특정 항원에 결합하는 면역학적 단백질이다. 일반적으로, 항체는 표적에 특이적이고, 면역 이펙터 기전을 매개하는 능력을 가지며, 혈청에서 긴 반감기를 갖는다. 이러한 특성은 항체를 강력한 치료제로 만든다. 단클론성 항체는 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 장애를 포함하는 다양한 질병의 치료를 위해 치료적으로 사용된다.

다양한 치료 목적을 위해 많은 새로운 항체 형식이 제안된다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 표적 또는 표적 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하여 개별 항체의 효과보다 우수한 상가적 또는 상승적 효과를 생성할 수 있다. 면역사이토카인은 종양 병변에 우선적으로 국소화하고 질환 부위에서 항암 면역을 활성화시킬 잠재력이 있는 항체-사이토카인 융합 단백질이다. 이들의 개념적 이점에도 불구하고, 이러한 항체 형식은 제조하기 어렵고 이들을 약물로서 개발하기는 어렵다. 이들 항체 형식에 대한 많은 기존 제조 접근법은 낮은 효율로 인해 곤란을 야기하고, 복잡한 정제 공정에 의해 제한된다. 많은 다른 단백질 조작 및 분자 생물학 기법이 제안되었다. 그러나, 일단 이러한 공지되어 있는 조작된 항체 형식이 채택되면, 이들 분자는 일반적으로 이들의 유리한 생화학적 및/또는 생물물리학적 특성, 혈청 반감기, 및/또는 안정성을 상실하여, 불량한 효능, 불안정성 및 높은 면역원성을 초래한다. 특히, 많은 이중특이적 항체 형식은 낮은 발현 수준과 관련이 있는 것으로 널리 알려져 있다. 안정하고 약학적 용도에 적합하며 높은 발현 수준에서 안정적으로 발현될 수 있는 개선된 항체 형식을 제공할 필요가 여전히 존재한다.

본 개시는 변형된 면역글로불린을 제공한다. 본 개시는, 부분적으로, 전체 기능성 단백질이 면역글로불린의 CH3 도메인의 특정 영역에 융합될 수 있고, 변형된 면역글로불린이 안정적이고 높은 수준으로 안정적으로 발현될 수 있다는 예상치 못한 발견에 기초한다.

일 양태에서, 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기와 제2 아미노산 잔기 사이의 야생형 CH3 도메인에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실된다.

일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 CH2 도메인을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 CH2 도메인을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 CH1 도메인을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 CH1 도메인을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 IgG-유사 항체이다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 링커 서열을 통해 제1 폴리펩티드에 연결된다.

일부 구현예에서, 링커 서열은 5개 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함한다.

일부 구현예에서, 링커 서열은 적어도 4개의 글리신 잔기를 포함한다.

일부 구현예에서, 링커 서열은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 약 또는 적어도 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개의 아미노산 잔기를 갖는다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 약 6개 내지 500개의 아미노산 잔기(예를 들어, 10개 내지 500개, 또는 20개 내지 300개의 아미노산 잔기)를 갖는다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 가용성 폴리펩티드이다.

일부 구현예에서, 가용성 단백질은 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35, 또는 IL-36)이다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 IL3, IL4, IL5, IL6, IL-7, IL8, IL9, IL13, IL15, 또는 IL-21이다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 단쇄 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 단일-도메인 항체(나노바디))를 포함한다.

일부 구현예에서, 단쇄 항원-결합 폴리펩티드는 세포 항원(예를 들어, 이펙터 세포 항원)에 특이적으로 결합한다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 막관통 단백질(예를 들어, 형질전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFbR2)) 또는 분비 단백질의 가용성 부분(예를 들어, 세포외 영역)을 포함한다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 리간드(예를 들어, ATOR1015-CD86)이다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 나노바디(예를 들어, KN035) 또는 VHH이다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체 내의 제3 폴리펩티드는 단리된 제3 폴리펩티드와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 수준의 생물학적 활성을 갖는다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 모 폴리펩티드 복합체와 비교하여 표적에 대해 대략 동일하거나 더 높은 수준의 결합 친화성을 갖는다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 2개의 항원에 특이적으로 결합하고, 폴리펩티드 복합체는 동일한 2개의 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 발현 수준을 갖는다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 응집체를 형성하지 않는다(예를 들어, 정제된 형태로).

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 폴리펩티드 복합체 내의 제3 폴리펩티드가 표적 단백질과 상호작용하지 않을 때, Fc 수용체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 형태의 폴리펩티드 복합체는 Fc 수용체에 결합할 수 있다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 단리된 scFv와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 수준의 결합 친화성을 갖는다.

일부 구현예에서, 제4 폴리펩티드를 추가로 포함하는 폴리펩티드 복합체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제4 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제2 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제4 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 제4 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 제2 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 제4 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 제2 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 제5 폴리펩티드를 추가로 포함하는 폴리펩티드 복합체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제5 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다.

일부 구현예에서, 제5 폴리펩티드는 링커 서열을 통해 제1 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다.

일부 구현예에서, 링커 서열은 10개 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함한다.

일부 구현예에서, 링커 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 9)와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 제5 폴리펩티드는 10개 초과의 아미노산 잔기를 갖는다.

일부 구현예에서, 제5 폴리펩티드는 약 10개 내지 500개의 아미노산 잔기를 갖는다.

일부 구현예에서, 제5 폴리펩티드는 사이토카인이다.

일부 구현예에서, 사이토카인은 IFNa4이다.

일부 구현예에서, 제6 폴리펩티드를 추가로 포함하는 폴리펩티드 복합체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제6 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 C-말단에 융합된다.

일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 노브-인-홀(KIH) 기법을 통해 이종이량체를 형성한다.

일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하여 항원-결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하지 않는다.

일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제1 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하여, 제1 항원-결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제2 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하여, 제2 항원-결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 항원-결합 부위 및 제2 항원-결합 부위는 동일하거나 상이한 항원에 특이적으로 결합한다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 폴리펩티드 복합체 내의 제3 폴리펩티드가 제3 폴리펩티드에 대한 결합 파트너와 상호작용하지 않을 때 Fc 수용체에 결합할 수 있다.

일 양태에서, 변이체 Fc를 포함하는 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 변이체 Fc에 융합된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 변이체 Fc에 융합된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 변이체 Fc에 융합된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 변이체 Fc를 포함하는 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 383 내지 위치 391의 영역에서 변이체 Fc에 융합된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 및 392에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 변이체 Fc를 포함하는 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 383 내지 위치 385의 영역에서 변이체 Fc에 융합된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 382, 383, 384, 385, 및 386에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 변이체 Fc를 포함하는 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 413 내지 위치 422의 영역에서 변이체 Fc에 융합된다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 및 423에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, Fc는 IgG Fc이다. 일부 구현예에서, Fc는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc이다. 일부 구현예에서, 단백질은 IgG-유사 항체 또는 면역글로불린(예를 들어, IgM, IgD, IgE, IgA, 또는 IgG)이다. 일부 구현예에서, 단백질은 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)이다.

일 양태에서, 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 383 내지 위치 391의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 및 392에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 383 내지 위치 385의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 382, 383, 384, 385, 및 386에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 413 내지 위치 422의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 및 423에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 제1 비-천연 폴리펩티드 서열을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드; 제2 중쇄 폴리펩티드; 제1 경쇄 폴리펩티드; 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 변형된 항체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드는 서로 회합하여 제1 항원 결합 영역을 형성한다.

일부 구현예에서, 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드는 서로 회합하여 제2 항원 결합 영역을 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 비-천연 폴리펩티드 서열은 EU 넘버링에 따른 제1 중쇄 폴리펩티드의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제1 중쇄 폴리펩티드에 융합된다.

일부 구현예에서, 제2 중쇄 폴리펩티드는 제2 비-천연 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 비-천연 폴리펩티드 서열은 EU 넘버링에 따른 제2 중쇄 폴리펩티드의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제2 중쇄 폴리펩티드에 융합된다.

일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 동일한 항원에 특이적으로 결합한다.

일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 상이한 항원에 특이적으로 결합한다.

일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 종양 관련 항원에 특이적으로 결합한다.

일부 구현예에서, 제1 비-천연 폴리펩티드 서열 및/또는 제2 비-천연 폴리펩티드 서열(예를 들어, scFV 또는 나노바디)은 세포 항원(예를 들어, 이펙터 세포 항원)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다.

일부 구현예에서, 기능성 폴리펩티드는 제1 중쇄 폴리펩티드의 C-말단에 연결된다.

일부 구현예에서, 기능성 폴리펩티드는 제2 중쇄 폴리펩티드의 C-말단에 연결된다.

일 양태에서, CH2, 및 CH3의 제1 부분을 포함하는 제1 영역; 비-천연 폴리펩티드 서열을 포함하는 제2 영역; CH3의 제2 부분을 포함하는 제3 영역을 포함하는 융합 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CH3의 제1 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 341-343을 포함하고, CH3의 제2 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 383-447을 포함한다.

일부 구현예에서, CH3의 제1 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 341-350을 포함하고, CH3의 제2 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 363-447을 포함한다. 일부 구현예에서, CH3의 제1 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 341-357을 포함하고, CH3의 제2 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 363-447을 포함한다.

일부 구현예에서, 제1 영역은 VH 및/또는 CH1을 추가로 포함한다.

일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 2개의 경쇄 폴리펩티드; 및 융합 중쇄 폴리펩티드 중 2개를 포함하는 변형된 항체가 본원에 제공된다.

일 양태에서, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위, 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적 항체가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 제2 항원 결합 부위는 다중특이적 항체에 융합된 폴리펩티드 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 제2 항원 결합 부위가 제2 항원에 특이적으로 결합하는 경우, 다중특이적 항체의 이펙터 기능은 억제되거나 감소된다.

일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 제1 항원은 종양 세포로부터의 것이고, 제2 항원은 이펙터 세포로부터의 것이다. 일부 구현예에서, 이펙터 세포는 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 마이크로파지, 수지상 세포, 또는 호중구이다.

일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위가 제1 항원에 특이적으로 결합하고 제2 항원 결합 부위가 제2 항원에 결합하지 않을 때, 다중특이적 항체는 이펙터 기능을 유도한다.

일부 구현예에서, 이펙터 기능은 ADCC 또는 ADCP이다.

일부 구현예에서, 제2 항원 결합 부위는 단쇄 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, scFv 또는 나노바디)를 포함하는 폴리펩티드 내에 위치한다.

일부 구현예에서, 제2 항원 결합 부위는 다중특이적 항체의 CH3 도메인에 융합된 scFv 또는 나노바디 내에 위치한다.

일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위는 CH1 도메인 또는 CH2 도메인의 N 말단에 연결된 scFv 또는 나노바디이다.

일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위는 VH 및 VL에 의해 형성된다.

일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.

일 양태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위, 및 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체(예를 들어, 사이토카인 수용체) 결합 부위를 포함하는 변형된 항체로서, 수용체 결합 부위는 변형된 항체에서 융합된 폴리펩티드 내에 위치하고, 수용체 결합 부위가 수용체에 특이적으로 결합하는 경우, 변형된 항체의 이펙터 기능이 억제되거나 감소되는, 변형된 항체가 본원에 제공된다.

일 양태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위, 및 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드(예를 들어, 사이토카인 수용체 또는 수용체 리간드) 결합 부위를 포함하는 변형된 항체로서, 리간드 결합 부위는 변형된 항체에 융합된 폴리펩티드 내에 위치하고, 리간드 결합 부위가 리간드 수용체에 특이적으로 결합하는 경우, 변형된 항체의 이펙터 기능이 억제되는, 변형된 항체가 본원에 제공된다.

일 양태에서, 본 개시는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위, 그 결합 파트너와 특이적으로 상호작용하는 결합 폴리펩티드를 포함하는 변형된 항체로서, 수용체 결합 부위는 변형된 항체에 융합된 폴리펩티드 내에 위치하고, 수용체 결합 부위가 수용체에 특이적으로 결합하는 경우, 변형된 항체의 이펙터 기능이 억제되는, 변형된 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 리간드이고, 결합 파트너는 리간드에 대한 수용체이다. 일부 구현예에서, 결합 폴리펩티드는 수용체의 가용성 부분이고, 결합 파트너는 수용체와 특이적으로 상호작용하는 리간드이다.

일부 구현예에서, 변형된 항체는 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 변형된 항체는 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 변형된 항체는 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 CH3 도메인에 융합된다.

일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.

일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 인코딩하는 핵산이 본원에 제공된다.

일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터가 본원에 제공된다.

일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.

일 양태에서, 폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 생산하는 방법으로서, 폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 생산하기에 적합한 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.

본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, 면역글로불린 경쇄로부터의 3개의 CDR 중 임의의 것 또는 면역글로불린 중쇄로부터의 3개의 CDR 중 임의의 것)을 함유하고 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항원-결합 분자를 지칭한다. 항체의 비-제한적인 예는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 단쇄 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 및 인간화 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 항체의 Fc 영역을 함유한다. 용어 항체는 또한 유도체, 예를 들어, 이중특이적 항체, 단쇄 항체, 디아바디, 선형 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "IgG-유사"는 IgG 항체와 대체로 유사한 분자를 지칭한다. IgG-유사 분자의 비-제한적인 예는 IgG 항체에 첨가된 하나 이상의 비-천연 폴리펩티드를 갖는 IgG 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 IgG-유사 분자를 포함하거나 이로 이루어진다.

본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 단편"은 항체의 일부가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 전장 항체의 일부를 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 단편은 적어도 하나의 가변 도메인(예를 들어, 중쇄의 가변 도메인 또는 경쇄의 가변 도메인)을 함유한다. 항체 단편의 비-제한적 예는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간에 존재하는 내인성 핵산(예를 들어, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자좌)에 의해 인코딩된 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 인간으로부터 수집되거나 인간 세포 배양물(예를 들어, 인간 하이브리도마 세포)에서 생산된다. 일부 구현예에서, 인간 항체는 비-인간 세포(예를 들어, 마우스 또는 햄스터 세포주)에서 생산된다.

본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 적어도 두 개의 상이한 항체(예를 들어, 인간 및 마우스 항체와 같은 두 개의 상이한 포유동물 종으로부터의 항체)에 존재하는 서열을 함유하는 항체를 지칭한다. 키메라 항체의 비-제한적 예는 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 가변 도메인 서열(예를 들어, 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인 서열 전부 또는 이의 일부) 및 인간 항체의 불변 도메인을 함유하는 항체이다. 키메라 항체의 추가 예는 본원에 기재되어 있으며, 당분야에 공지되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "인간화 항체"는 비-인간(예를 들어, 마우스) 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하고 인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 함유하는 비-인간 항체를 지칭한다. 비-제한적인 예에서, 인간화 항체는 수용자 항체의 초가변(예를 들어, CDR) 영역 잔기가 비-인간 항체(예를 들어, 공여자 항체), 예를 들어, 원하는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼 항체로부터의 초가변(예를 들어, CDR) 영역 잔기로 대체된 인간 항체(수용자 항체)이다. 일부 구현예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간(예를 들어, 마우스) 면역글로불린 잔기로 대체된다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어질 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "단쇄 항체"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 두 개의 면역글로불린 가변 도메인(예를 들어, 포유동물 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인)을 함유하는 단일 폴리펩티드를 지칭한다. 단쇄 항체의 비-제한적인 예는 본원에 기재된다.

본원에서 사용되는 용어 "다중특이적 항체"는 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 포유동물 세포(예를 들어, 인간 T-세포)의 표면 상에서 하나의 표적 분자(예를 들어, PD-1)를 적어도 하나의 제2 표적 분자(예를 들어, CTLA-4)에 가교시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체를 언급할 때, 어구 "특이적으로 결합하는" 및 "특이적으로 결합하다"는 상호작용이 표적 분자 상의 특정 구조(즉, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 좌우되고; 다시 말해서, 시약이 일반적으로 모든 분자가 아니라 특이적 구조를 포함하는 분자를 인식하고 이에 결합하기 때문에 항체가 이의 표적 분자(예를 들어, PD-1)와 바람직하게는 다른 분자에 상호작용한다는 것을 의미한다. 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 표적-특이적 항체로 지칭될 수 있다. 예를 들어, PD-1 분자에 특이적으로 결합하는 항체는 PD-1-특이적 항체 또는 항-PD-1 항체로 지칭될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체" 및 "환자"는 명세서 전반에 걸쳐 상호교환 가능하게 사용되고, 본 발명의 방법에 따른 치료가 제공되는 동물, 인간 또는 비-인간을 나타낸다. 수의학 및 비-수의학 적용이 본 발명에 의해 고려된다. 인간 환자는 성인 인간 또는 청소년 인간(예를 들어, 18세 미만 연령의 인간)일 수 있다. 인간 외에, 환자는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 페럿, 고양이, 개, 및 영장류를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스, 저빌, 햄스터, 페럿, 토끼), 토끼목, 돼지과(예를 들어, 돼지, 미니어처 돼지), 말과, 개과, 고양잇과, 소과, 및 기타 가축, 농장, 및 동물원 동물이 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 적어도 두 개의 아미노산의 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드 복합체"는 특정 기능을 수행하는 데 회합되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 중쇄 및/또는 경쇄이거나 항체로부터 유래된다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자", 및 "핵산 서열"은 적어도 두 개의 뉴클레오티드의 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 제한 없이, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 및 이들의 변형을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "융합" 또는 "융합된"은 아미노산 서열(예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질)과 관련하여 사용될 때, 2개 이상의 아미노산 서열의, 예를 들어, 화학적 결합 또는 재조합 수단에 의한 자연적으로 존재하지 않는 단일 아미노산 서열로의 조합을 지칭한다. 융합 아미노산 서열은 2개의 인코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 유전적 재조합에 의해 생산될 수 있고, 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 작제물을 숙주 세포에 도입하는 방법에 의해 발현될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "연결된"은 아미노산 서열(예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질)과 관련하여 사용될 때, 화학적 결합(예를 들어, 펩티드 결합, 디설파이드 결합, 비스-설폰 링커)에 의한 2개 이상의 아미노산 서열의 조합을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "전장 항체"는 야생형 항체와 비교하여 온전한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 전장 항체는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 갖는 항체이다.

본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30%, 25%, 20%, 25%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일부 구현예에서, 수치 값 또는 수준 앞에 올 때 용어 "약" 또는 "대략"은 값 + 또는 - 15%, 10%, 5%, 또는 1%의 범위를 나타낸다. 용어 "대략 동일한 수준"은 15%, 10%, 5%, 또는 1%의 범위를 더하거나 뺀 수준을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결하다" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 관심 생물학적 서열이 스페이서 또는 링커 서열과 함께 또는 이들 없이 이들이 의도된 방식으로 기능하게 하는 관계에 있도록 한 병치를 지칭한다. 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 이는 연결된 산물이 의도된 생물학적 기능을 갖도록 하는 방식으로 폴리펩티드 서열이 연결됨을 의미하고자 한 것이다. 예를 들어, 항체 가변 영역은 항원-결합 활성을 갖는 안정한 생성물을 제공하기 위해 불변 영역에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 용어는 또한 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 수 있다. 한 가지 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동 가능하게 연결될 때, 이는 폴리뉴클레오티드 서열이 폴리뉴클레오티드로부터의 폴리펩티드의 조절된 발현을 허용하는 방식으로 연결됨을 의미하고자 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "결합 파트너"는 또 다른 분자의 특이적 구조적 양태를 인식할 수 있는 분자 쌍의 구성원을 지칭하며, 여기서 결합 파트너는 특이적, 비공유 또는 공유 상호작용에 의해 서로 상호작용한다. 이러한 결합 파트너 및 상응하는 분자 또는 조성물의 예는 임의의 부류의 면역-타입 결합 쌍, 예컨대, 항원/항체; 및 또한 임의의 부류의 비면역-타입 결합 쌍, 예컨대, 리간드/수용체, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 디곡시게닌/항-디곡시게닌 F(ab')2, 엽산/폴레이트 결합 단백질, 상보적 핵산 세그먼트, 단백질 A 또는 G/면역글로불린, 렉틴/탄수화물, 기질/효소, 억제제/효소, 또는 바이러스/세포 수용체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에서 사용하기 위해 본원에 기재되어 있으며; 당분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 다른 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1은 레인 6에서 PDL1-mIL7-HC 및 레인 11에서 PDL1-mIL7-LC를 나타내는 전기영동의 이미지이다.
도 2는 레인 10에서 PDL1-hIL21-KIH를 나타내는 전기영동의 이미지이다. 레인 11은 단백질 마커이다.
도 3은 EU 넘버링에 따른 항체의 중쇄 CH3 도메인을 나타내는 개략도이다. 4개의 융합 부위는 직사각형 또는 원으로 강조 표시된다.
도 4는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역(hIgG1-CH; SEQ ID NO: 1), 인간 IgG2 중쇄 불변 영역(hIgG2-CH; SEQ ID NO: 2) 및 인간 IgG4 중쇄 불변 영역(hIgG4-CH; SEQ ID NO: 3)의 서열 정렬이다. CH2 영역은 점선으로 표시되고, CH3 영역은 실선으로 표시된다.
도 5a는 표 5에 나타낸 바와 같은 정제된 단백질을 나타내는 전기영동의 이미지이다.
도 5b는 PDL1-mIL7-3A의 SEC-HPLC(크기 배제 크로마토그래피) 결과를 나타내는 이미지이다.
도 5c는 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4의 SEC-HPLC 결과를 나타내는 이미지이다.
도 6은 PBS(블랭크), mIL7 단백질, PDL1-mIL7-3A-mIFNa4, 또는 PDL1-mIL7-3A로 치료된 마우스 비장 세포에서 유세포 분석에 의해 결정된 pSTAT5 신호를 보여준다.
도 7은 PBS(블랭크), PDL1-mIL7-3A, 또는 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4로 치료된 마우스 비장 세포에서 유세포 분석에 의해 결정된 pSTAT1 신호를 보여준다.
도 8a는 다양한 Fc 수용체에 대한 PDL1-아벨루맙, PDL1-mIL7-3A-mIFNa4, 및 PDL1-mIL7-3A의 결합 친화성을 요약한다.
도 8b는 다양한 Fc 수용체에 대한 PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1, AB-IgG1, PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4, 및 AB-IgG4의 결합 친화성을 요약한다.
도 9a는 정제된 단백질을 나타내는 전기영동의 이미지이다.
도 9b는 도 9a의 결과에 대한 레인 번호, 상응하는 단백질 명칭(저장 온도), 이론적 분자량(MW) 및 겉보기 분자량을 나타내는 표이다.
도 9c는 도 9b에 도시된 바와 같은 단백질의 SEC-HPLC 결과이다.
도 10a는 여러 정제된 단백질을 나타내는 전기영동의 이미지이다.
도 10b는 도 10a의 결과에 대한 레인 번호 및 상응하는 단백질 명칭을 나타내는 표이다.
도 11a는 레인 10에서 3F2-hIL7-3A를 나타내는 겔 이미지이다.
도 11b는 레인 번호, 상응하는 단백질 명칭 및 이론적 분자량(MW)을 나타내는 표이다.
도 11c는 3F2-hIL7-3A의 SEC-HPLC 결과이다.
도 12a는 레인 8에서 3F2-hIL7-3A-mIFNa4를 나타내는 겔 이미지이다.
도 12b는 레인 번호, 상응하는 단백질 명칭, 이론적 분자량(MW) 및 겉보기 분자량을 나타내는 표이다.
도 12c는 3F2-hIL7-3A-mIFNa4의 SEC-HPLC 결과이다.
도 13은 PBS(블랭크), hIL7 단백질, 3F2-hIL7-3A, 또는 3F2-hIL7-3A-mIFNa4로 치료된 마우스 비장 세포에서 유세포 분석에 의해 결정된 pSTAT5 수준을 보여준다.
도 14a는 레인 13에서 PDL1-hIL21-HC를 나타내는 겔 이미지이다.
도 14b는 레인 번호 및 상응하는 단백질 명칭을 나타내는 표이다.
도 15a는 레인 1에서 3F2-hIL21-3A를 나타내는 겔 이미지이다.
도 15b는 레인 번호 및 상응하는 단백질 명칭을 나타내는 표이다.
도 15c는 3F2-hIL21-3A의 SEC-HPLC 결과이다.
도 16a는 레인 14에서 3F2-hIL21-3A-mIFNa4를 나타내는 겔 이미지이다.
도 16b는 레인 번호 및 상응하는 단백질 명칭을 나타내는 표이다.
도 16c는 3F2-hIL21-3A-mIFNa4의 SEC-HPLC 결과이다.
도 17은 PBS(블랭크), hIL21 단백질, 3F2-hIL21-3A, 또는 3F2-hIL21-3A-mIFNa4로 치료된 마우스 비장 세포에서 유세포 분석에 의해 결정된 pSTAT3 수준을 보여준다.
도 18a는 레인 1에서 PDL1-TGFbR2-3A를 나타내는 겔 이미지이다.
도 18b는 레인 번호, 상응하는 단백질 명칭, 이론적 분자량(MW) 및 겉보기 분자량을 나타내는 표이다.
도 18c는 PDL1-TGFbR2-3A의 SEC-HPLC 결과이다.
도 19는 여러 변형된 면역글로불린의 ADCC 효과를 보여준다.
도 20a 내지 도 20d는 상이한 변형된 면역글로불린 형식을 보여준다.
도 21은 인간 IgG(HuIgG), 인간 IgA(HuIgA), 인간 IgM(HuIgM), 인간 IgE(HuIgE), 뿔상어(Heterodontus franscisci; HShrk), 제노푸스 라에비스(Xenus laevis; Xen), 무스 무스큘러스(Mus musculus; Mus), 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris)(개), 및 레서스 원숭이(Macaca mulatta; Maq)의 CH3 도메인의 부분에 대한 서열 정렬 결과를 보여준다.
도 22는 정제된 PDL1-TGFbR2-3A(레인 1), PDL1-TGFbR2-3B(레인 2), PDL1-TGFbR2-3C(레인 3), 및 PDL1-TGFbR2-3D(레인 4)를 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 23은 정제된 PDL1-TGFbR2-3A(레인 1), PDL1-TGFbR2-3A-IgG4(레인 2), PDL1-TGFbR2-3AF1(레인 3), PDL1-TGFbR2-3AF2(레인 4), PDL1-TGFbR2-3AF3(레인 5), PDL1-TGFbR2-3AR1(레인 6), PDL1-TGFbR2-3AR2(레인 7), PDL1-TGFbR2-3AR3(레인 8), 및 PDL1-TGFbR2-3AR4(레인 9)을 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 24는 정제된 PDL1-hIL21-3A-IgG4(레인 1), PDL1-hIL21-3AF1(레인 2), PDL1-hIL21-3AF2(레인 3), PDL1-hIL21-3AF3(레인 4), PDL1-hIL21-3AR1(레인 5), PDL1-hIL21-3AR2(레인 6), PDL1-hIL21-3AR3(레인 7), 및 PDL1-hIL21-3AR4(레인 8)을 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 25a는 정제된 PDL1-TGFbR2-3A(레인 1), PDL1-TGFbR2-3A1(레인 2), PDL1-TGFbR2-3A2(레인 3), PDL1-TGFbR2-3A3(레인 4), 및 PDL1-TGFbR2-3A4(레인 5)를 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 25b는 레인 1에서 정제된 PDL1-TGFbR2-3A1(새로운 배치)을 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 26은 정제된 PDL1-TGFbR2-3A(레인 1), PDL1-TGFbR2-3A1(레인 2), PDL1-TGFbR2-3A2(레인 3), PDL1-TGFbR2-3A3(레인 4), 및 PDL1-TGFbR2-3A4(레인 5)를 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 27은 정제된 PDL1-CD86-3A(레인 1), PDL1-CD86-3A-IgG4(레인 2), PD1-KN035-3A-IgG1(레인 3), PD1-KN035-3A(레인 4), PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1(레인 5), PD1-PL1-3F2-FV3A(레인 6), CT4-KN035-3A-knob(레인 7), 및 CT4-KN035-3A-hole(레인 8)을 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 28은 정제된 PDL1-CD86-3A-IgG1(레인 1), PDL1-CD86-3A-IgG4(레인 2), 및 PDL1-CD86-3A-TGFbR2(레인 3)를 나타내는 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 29는 여러 변형된 면역글로불린의 ADCC 효과를 보여준다.
도 30a는 정제된 PDL1-3F2(레인 1), 3F2-hIL3-3A(레인 2), 3F2-hIL3-HC(레인 3), 3F2-hIL4-3A(레인 4), 3F2-hIL4-HC(레인 5), 3F2-hIL5-3A(레인 6), 3F2-hIL5-HC(레인 7), 3F2-hIL6-3A(레인 8), 및 3F2-hIL6-HC(레인 9)를 나타내는 천연 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 30b는 정제된 PDL1-3F2(레인 1), 3F2-hIL8-3A(레인 2), 3F2-hIL8-HC(레인 3), 3F2-hIL9-3A(레인 4), 3F2-hIL9-HC(레인 5), 3F2-hIL13-3A(레인 6), 3F2-hIL13-HC(레인 7), 3F2-hIL15-3A(레인 8), 및 3F2-hIL15-HC(레인 9)를 나타내는 천연 겔 이미지이다. M은 단백질 마커이다.
도 31a는 3F2-hIL5-3A 및 3F2-hIL5-HC의 SEC-HPLC 결과를 보여준다.
도 31b는 3F2-hIL9-3A 및 3F2-hIL9-HC의 SEC-HPLC 결과를 보여준다.
도 31c는 3F2-hIL13-3A 및 3F2-hIL13-HC의 SEC-HPLC 결과를 보여준다.
도 31d는 3F2-hIL15-3A 및 3F2-hIL15-HC의 SEC-HPLC 결과를 보여준다.
도 32a는 3F2-hIL5-HC의 질량 분석 결과를 보여준다.
도 32b는 3F2-hIL5-HC의 항체 이차 펩티드 커버리지 맵핑 결과를 보여준다. 괄호 안의 영역은 3F-hIL5-HC의 중쇄 C-말단에서 결실된 서열을 나타낸다.
도 33은 인간 IgD, 인간 IgG4, 인간 IgG3, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgA, 및 인간 IgM 사이의 서열 정렬 결과를 보여준다. 별표("*")는 단일의 완전히 보존된 잔기를 갖는 위치를 나타낸다. 마침표(".")는, Gonnet PAM 250 매트릭스에서 ≤0.5 및 > 0의 점수와 대략 동등한, 약하게 유사한 특성의 그룹 간의 보존을 나타낸다. 콜론 마크(":")는, Gonnet PAM 250 매트릭스에서 > 0.5의 점수와 대략 동등한, 매우 유사한 특성의 그룹간 보존을 나타낸다.
도 34는 인간 IgG4, 인간 IgG3, 인간 IgG1, 및 인간 IgG2 사이의 서열 정렬 결과를 보여준다.
도 35는 래트 IgG2C, 마우스 IgG3, 인간 IgG1, 래트 IgG1, 래트 IgG2A, 마우스 IgG1, 마우스 IgG2B, 래트 IgG2B, 마우스 IgG2A, 및 마우스 IgG2C 사이의 서열 정렬 결과를 보여준다.
도 36은 인간 IgG1, 원숭이 IgG3, 원숭이 IgG1, 및 원숭이 IgG2 사이의 서열 정렬 결과를 보여준다.
도 37은 인간 IgG1, 개 IgG2, 개 IgG3, 개 IgG1, 및 개 IgG4 사이의 서열 정렬 결과를 보여준다.
도 38a는 3F2-mIL12-3A의 개략적 구조를 보여준다.
도 38b는 3F2-mIL12-3A의 변형된 중쇄, 경쇄 및 IL12b를 인코딩하는 플라스미드의 개략도를 보여준다.
도 39a는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 개략적 구조를 보여준다.
도 39b는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 변형된 중쇄, 경쇄 및 IL12b를 인코딩하는 플라스미드의 개략도를 보여준다. L은 링커 서열을 나타낸다.
도 40은 3F2-mIL12-3A 및 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 비환원 SDS-PAGE 결과를 보여준다.
도 41a는 3F2-mIL12-3A의 SEC 결과를 보여준다.
도 41b는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 SEC 결과를 보여준다.
도 42는 마우스 결장암 세포 MC38이 주사되고 PDL1-3F2, 3F2-mIL12-3A, 또는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4로 치료된 이중 인간화 hPD-1/hPD-L1 마우스의 시간 경과에 따른 체중을 나타내는 그래프이다. 염수 용액을 대조군으로 주사하였다.
도 43은 마우스 결장암 세포 MC38이 주사되고 PDL1-3F2, 3F2-mIL12-3A, 또는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4로 치료된 이중 인간화 hPD-1/hPD-L1 마우스의 시간 경과에 따른 체중 변화를 나타내는 그래프이다. 염수 용액을 대조군으로 주사하였다.
도 44는 마우스 결장암 세포 MC38이 주사되고 PDL1-3F2, 3F2-mIL12-3A, 또는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4로 치료된 상이한 그룹의 이중 인간화 hPD-1/hPD-L1 마우스에서 평균 종양 부피를 나타내는 그래프이다. 염수 용액을 대조군으로 주사하였다.
도 45a는 MC38-hPD-L1 세포가 주사되고 단일클론 항체(G2 및 G3), 단일특이적 항체의 조합(G4), 또는 이중특이적 항체(G5 및 G6)로 치료된 B-hPD-1/hCD40 마우스의 시간 경과에 따른 체중을 나타내는 그래프이다. PBS 용액을 대조군(G1)으로 투여하였다.
도 45b는 MC38-hPD-L1 세포가 주사되고 단일클론 항체(G2 및 G3), 단일특이적 항체의 조합(G4), 또는 이중특이적 항체(G5 및 G6)로 치료된 B-hPD-1/hCD40 마우스의 시간 경과에 따른 체중 변화를 나타내는 그래프이다. PBS 용액을 대조군(G1)으로 주사하였다.
도 45c는 MC38-hPD-L1 세포가 주사되고 단일클론 항체(G2 및 G3), 단일특이적 항체의 조합(G4), 또는 이중특이적 항체(G5 및 G6)로 치료된 B-hPD-1/hCD40 마우스의 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타내는 그래프이다. PBS 용액을 대조군(G1)으로 주사하였다.
도 46a는 단클론성 항체(G2 및 G3), 이중특이적 항체 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G4) 또는 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5)가 주사된 B-hPD-1/hCD40 마우스의 시간 경과에 따른 체중을 나타내는 그래프이다. PBS 용액을 대조군(G1)으로 주사하였다.
도 46b는 단클론성 항체(G2 및 G3), 이중특이적 항체 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G4) 또는 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5)가 주사된 B-hPD-1/hCD40 마우스의 시간 경과에 따른 체중 변화를 나타내는 그래프이다. PBS 용액을 대조군(G1)으로 주사하였다.
도 47a는 PBS(G1), 단클론성 항체(G2 및 G3), 이중특이적 항체 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G4) 또는 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5)가 주사된 상이한 그룹의 B-hPD-1/hCD40 마우스에서 그룹화 후 7일차의 마우스 혈액 ALT 수준을 보여준다.
도 47b는 PBS(G1), 단클론성 항체(G2 및 G3), 이중특이적 항체 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G4) 또는 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5)가 주사된 상이한 그룹의 B-hPD-1/hCD40 마우스에서 그룹화 후 7일차의 마우스 혈액 AST 수준을 보여준다.
도 48a 내지 도 48k는 본 개시에서 논의된 여러 서열을 제공한다.
도 49는 카바트 넘버링에 따른 항-CTLA4 항체 4G12, 항-OX40 항체 9H3, 항-PD-L1 항체 3F2 및 항-PD-1 항체 1A7에 대한 CDR 서열을 제공한다.
도 50은 코티아 넘버링에 따른 항-CTLA4 항체 4G12, 항-OX40 항체 9H3, 항-PD-L1 항체 3F2 및 항-PD-1 항체 1A7에 대한 CDR 서열을 제공한다.

이중특이적 항체는 치료용 항체의 새로운 카테고리로 성장하고 있다. 이들은 2개의 상이한 표적 또는 표적 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하여 개별 항체의 효과보다 우수한 상가적 또는 상승적 효과를 생성할 수 있다. 면역사이토카인은 종양 병변에 우선적으로 국소화하고 질환 부위에서 항암 면역을 활성화시킬 잠재력이 있는 항체-사이토카인 융합 단백질이다. 이중특이적 항체 및 면역사이토카인에 대한 많은 기존의 제조 접근법은 낮은 효율, 불안정성, 및 응집의 문제를 갖는다.

본 개시는 Fc 영역에서 선택된 영역에 융합된 융합 폴리펩티드가 있는 면역글로불린이 매우 안정하고 높은 수준으로 안정적으로 발현될 수 있음을 보여준다. 또한, 면역글로불린에 대한 폴리펩티드의 융합은 면역글로불린의 결합 친화성 또는 융합된 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 변형된 면역글로불린은 노브-인-홀(KIH) 변형과 양립 가능하고, 다수의 다른 항체-조작 기법에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 다양한 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 및 면역사이토카인을 생성하는 데 사용될 수 있는 개선된 항체 형식을 제공한다.

변형된 면역글로불린

본 개시는 변형된 면역글로불린을 제공하고, 여기서 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 영역에서 선택된 영역에 융합된다. 일 양태에서, 본 개시는 변형된 Fc 영역을 제공하고, 여기서 기능성 단백질은 Fc 영역에서 선택된 영역에 융합된다.

일반적으로, 면역글로불린(항체로도 불림)는 두 부류의 폴리펩티드쇄, 경쇄 및 중쇄로 구성된다. 본 개시의 항체의 비-제한적 예는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄를 포함하는 온전한 네 개의 면역글로불린쇄 항체일 수 있다.

각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, V_H) 및 다중의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 함유하는 중쇄는 이들의 불변 도메인 내에 이황화 결합을 통해 서로 결합하여 항체의 "줄기"를 형성한다. 각각 하나의 가변 도메인(또는 가변 영역, V_L) 및 하나의 불변 도메인(또는 불변 영역)을 함유하는 경쇄는 이황화 결합을 통해 각각 하나의 중쇄에 결합한다. 각 경쇄의 가변 영역은 이것이 결합되는 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 경쇄와 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 보다 보존된 골격 영역(FR) 사이에 개재된 세 개의 초가변 영역을 함유한다. 상보성 결정 영역(CDR)으로 알려진 이러한 초가변 영역은 항체의 항원 결합 표면을 포함하는 루프를 형성한다. 네 개의 골격 영역은 주로 베타-시트 입체배열을 채택하고, CDR은 베타-시트 구조를 연결하는, 그리고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 사슬 내의 CDR은 골격 영역에 의해 매우 가깝게 유지되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항원-결합 영역의 형성에 기여한다.

중쇄는 이소형에 따라 가변(VH) 도메인 및 여러 불변(CH) 도메인을 포함하는 4개 내지 5개의 도메인을 갖는다: IgG, IgA 및 IgD에서 3개의 CH 도메인(CH1, CH2, CH3) 및 IgM 및 IgE에서 4개의 CH 도메인(CH1, CH2, CH3, CH4). 항원-결합 단편(Fab)은 경쇄(VL 및 CL) 및 중쇄의 처음 2개의 도메인(VH 및 CH1)에 의해 형성되고, 항원 결합에 특이적으로 관여한다. Ig Fc(결정화 가능한 단편) 부분은 각각의 중쇄로부터 CH2 및 CH3 불변 도메인에 의해, 및 선택적으로 CH4 불변 도메인으로 형성된다. Fc 영역은 각각의 항체가 특정 부류의 Fc 수용체, 및 다른 면역 분자, 예컨대, 보체 단백질에 결합함으로써 주어진 항원에 대한 적절한 면역 반응을 발생시키는 것을 보장한다. 이를 수행함으로써, 이는 옵소닌화된 입자의 인식(FcγR에 결합), 세포의 용해(보체에 결합), 및 비만 세포, 호염기구, 및 호산구의 탈과립화(FcεR에 결합)를 포함하는 상이한 생리학적 효과를 매개한다.

면역글로불린의 모든 도메인은 유사한 구조를 가지며 2개의 β 시트로부터 작제된다. 시트는 이황화 브릿지에 의해 연결되고 함께 β 배럴로 알려진 대략 배럴-형상의 구조를 형성한다. 면역글로불린 단백질 도메인의 독특한 접힘 구조는 면역글로불린 접힘으로 알려져 있다. 불변 도메인은 4개의 가닥이 하나의 β 시트를 형성하고 3개의 가닥이 제2 시트를 형성하도록 배열된 7개의 β 가닥으로부터 구축된다. β 가닥을 연결하는 루프는 비교적 짧고, 결과적으로 도메인의 잔기의 대부분은 2개의 β 시트에 함유된다. 이들 가닥은 A-가닥, B-가닥, C-가닥, D-가닥, E-가닥, F-가닥, 및 G-가닥을 포함한다. β 가닥을 연결하는 서열은 AB-턴, BC-루프, CD-가닥, DE-턴, 및 EF-턴을 포함한다. 불변 도메인의 구조의 상세한 설명은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Lefranc et al., "IMGT® and 30 years of Immunoinformatics Insight in antibody V and C domain structure and function." Antibodies 8.2 (2019): 29]에서 찾아볼 수 있다.

본 개시는 비-천연 폴리펩티드가 면역글로불린의 Fc 영역에서 특정 영역에 융합될 수 있는 것을 입증한다. 본원에서 사용되는 "비-천연" 폴리펩티드는 야생형 면역글로불린의 Fc 영역에서 발견될 수 없는 폴리펩티드를 지칭한다. 본 개시에서 이러한 특정 영역은 "3A 부위"로 지칭된다. 3A 부위는 위치 344에서 시작하여 위치 382(EU 넘버링)까지 CH3 도메인에 위치한다. 비-천연 폴리펩티드의 융합은 우수한 결과를 제공할 수 있다. 일부 다른 변형된 면역글로불린과 비교하여, 이러한 변형을 갖는 면역글로불린은 매우 안정하며, 이러한 부위에서 융합된 비-천연 폴리펩티드를 갖는 면역글로불린은 높은 수준으로 발현될 수 있고 이들은 응집체를 형성하지 않는다. 이러한 융합 부위의 특성은 또한 예기치 않은 것이었는데, 그 이유는 3A 부위가 A-가닥 및 B-가닥에 위치하여 CH3 도메인의 기능 및 안정성에 중요한 것으로 보이기 때문이다. 본 개시의 결과는 면역글로불린이 CH3 도메인의 일부 다른 위치와 비교하여 3A 부위에서 비-천연 서열에 대해 훨씬 더 높은 내성을 갖는다는 것을 입증하였다.

CH3 도메인의 서열 정렬은 도 21에 도시된 바와 같이 3A 부위가 종들간 및 상이한 면역글로불린들 간에 비교적 보존됨을 보여준다. 따라서, 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 상이한 동물로부터의 항체에 유사한 변형이 이루어질 수 있다. 비-인간 동물은, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 페럿, 고양이, 개, 및 영장류를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 설치류(예를 들어, 래트, 마우스, 저빌, 햄스터, 페럿, 토끼), 토끼목, 돼지과(예를 들어, 돼지, 미니어처 돼지), 말과, 개과, 고양잇과, 소과, 및 기타 가축, 농장, 및 동물원 동물로부터이다. 일부 구현예에서, 변형은 인간, 설치류(예를 들어, 래트, 마우스), 낙타과, 개, 뿔상어, 제노푸스 라에비스, 원숭이(예를 들어, 레서스 원숭이), 고양이, 또는 토끼로부터의 항체에 대해 이루어진다. 일부 구현예에서, 변형은 IgG, IgM, IgD, IgE, 또는 IgA에 대해 이루어진다. 따라서, 본 개시는, 일 양태에서, 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 변형된 Fc 영역 또는 폴리펩티드 복합체를 제공한다. 일부 구현예에서, CH3 도메인은 중쇄 CH3 도메인이다. 2개의 폴리펩티드는 서로 상호작용하고 동종이량체 또는 이종이량체를 형성할 수 있다. 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 3A 부위에서 1개 또는 2개의 폴리펩티드의 중쇄 CH3 도메인에 융합될 수 있다. 3A 부위는 위치 344 내지 위치 382(EU 넘버링)에서 시작한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 임의의 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 또는 39개 아미노산을 대체하거나, 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드가 융합 부위에서 2개의 비-연속적인 아미노산 사이에 삽입될 때, 이는 또한 2개의 비-연속적인 아미노산 사이의 모든 아미노산을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인의 2개의 아미노산 잔기에 연결된다. 2개의 아미노산 잔기는 연속적이거나 비-연속적일 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 제1 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 제2 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 중쇄 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제1 중쇄 CH3 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 복합체는 제1 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드, 제2 중쇄 CH3 도메인을 포함하는 제2 중쇄 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 중쇄 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제1 중쇄 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인의 2개의 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383 중 임의의 2개로부터 선택된다. 비-천연 폴리펩티드는 중쇄 CH3 도메인에서 시작 아미노산 및 종결 아미노산에 연결된다. 본 개시는 또한 3A 부위에서 시작 아미노산 및 종결 아미노산의 모든 상이한 조합을 제공한다. 예를 들어, 비-천연 폴리펩티드가 위치 343 및 위치 383에 위치한 아미노산 잔기에 연결되는 경우, 전체 3A 부위(위치 344-382)는 비-천연 폴리펩티드로 대체된다. 비-천연 폴리펩티드가 2개의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어, 위치 357 및 위치 358에 위치한 아미노산 잔기에 연결되는 경우, 비-천연 폴리펩티드는 2개의 연속 아미노산 잔기들 사이에 삽입된다. 중쇄 CH3 도메인(EU 넘버링)의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383에서 임의의 2개의 아미노 잔기의 특정 조합이 제공된다.

일부 구현예에서, 시작 아미노산은 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 또는 356으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 시작 아미노산은 357, 358, 359, 360, 361, 또는 362로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종결 아미노산은 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 또는 383으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 종결 아미노산은 358, 359, 360, 361, 362, 또는 363으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 융합 부위는 위치 351 내지 위치 362(EU 넘버링)의 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 모든 아미노산(예를 들어, 351-362)을 대체하거나, 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입되고, 예를 들어, 위치 351-352, 352-353, 353-354, 354-355, 355-356, 356-357, 357-358, 358-359, 359-360, 360-361, 또는 361-362에 삽입된다.

일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363 중 임의의 2개로부터 선택된다. 이들 시작 아미노산과 종결 아미노산의 조합은 하기 표에서 제공된다. 예를 들어, 비-천연 폴리펩티드가 위치 350 및 363에 위치한 아미노산 잔기에 연결되는 경우, 이러한 융합 부위(위치 351-362)에서 아미노산은 비-천연 폴리펩티드로 대체된다. 비-천연 폴리펩티드가 2개의 연속 아미노산 잔기, 예를 들어, 위치 350 및 351에 위치한 아미노산 잔기에 연결되는 경우, 비-천연 폴리펩티드는 2개의 연속 아미노산 잔기들 사이에 삽입된다.

[표 1]

일부 구현예에서, 융합 부위는 358 내지 362(EU 넘버링)의 영역에 위치한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 모든 아미노산을 대체하거나, 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입되고, 예를 들어, 위치 358-359, 359-360, 360-361, 또는 361-362에서 삽입된다.

일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363 중 임의의 2개로부터 선택된다. 이들 시작 아미노산과 종결 아미노산의 조합은 하기 표에서 제공된다.

[표 2]

따라서, 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 357 및 358이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 357 및 359이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 357 및 360이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 357 및 361이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 357 및 362이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 357 및 363이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 358 및 359이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 358 및 360이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 358 및 361이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 358 및 362이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 358 및 363이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 359 및 360이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 359 및 361이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 359 및 362이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 359 및 363이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 360 및 361이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 360 및 362이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 360 및 363이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 361 및 362이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 361 및 363이다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 362 및 363이다.

3A 부위에서 비-천연 폴리펩티드의 융합은 면역글로불린의 항원-결합 부위를 방해하지 않는다. 또한, 융합된 비-천연 폴리펩티드는 이의 생체활성을 유지할 수 있다. 또한, 3A 부위에서의 변형은 FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIB, 또는 FcRn 수용체에 대한 Fc의 결합 친화성에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIB, 또는 FcRn 수용체에 대한 변형된 Fc의 결합 친화성은 임의의 변형 전의 동일한 면역글로불린과 비교하여 대략 동일하다. 일부 구현예에서, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIB, 또는 FcRn 수용체에 대한 변형된 Fc의 결합 친화성은 임의의 변형 전의 동일한 면역글로불린과 비교하여 더 높다(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%). 일부 구현예에서, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIB, 또는 FcRn 수용체에 대한 변형된 Fc의 결합 친화성은 임의의 변형 전의 동일한 면역글로불린과 비교하여 더 낮다(예를 들어, 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 더 낮음).

일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 보체 의존성 세포독성(CDC) 또는 아폽토시스 활성 중 적어도 하나를 갖는다. 일부 구현예에서, 3A 부위에서 융합된 폴리펩티드가 표적 단백질과 상호작용할 때, Fc는 입체 효과로 인해 FcγRIIA, FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIB 수용체에 결합하지 않을 것이다. 따라서, 3A 부위에서 융합된 폴리펩티드가 표적 단백질과 상호작용할 때, ADCC, ADCP, 및 CDC 효과는 감소된다. 이는 여러 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 경우, 이는 종양 관련 항원 및 면역 세포 항원을 표적화하도록 설계될 수 있다. 이중특이적 항체가 바로 면역 세포 항원에 결합하는 경우, ADCC, ADCP, 및 CDC 효과는 효과가 면역 세포를 사멸시킬 것이기 때문에 바람직하지 않을 것이다. 그러나, 이러한 문제는 변형된 면역글로불린 형식에 의해 용이하게 해결될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 종양 항원에 결합할 수 있고, scFv는 면역 세포 항원을 표적화하기 위해 융합 부위에 도입될 수 있다. 일단 변형된 면역글로불린이 종양 세포에 결합하고, 동시에 3A 부위에서 scFv가 면역 세포에 결합하지 않으면, 이는 ADCC, ADCP, 및 CDC 효과를 촉발시킬 수 있다. 그러나, 3A 부위에서 scFv가 면역 세포에 결합하는 경우, 원치 않는 ADCC, ADCP, 및 CDC 효과는 감소되거나 제거될 수 있다.

또한, 3A 부위에서 비-천연 폴리펩티드의 융합은 비-천연 폴리펩티드의 기능을 방해하지 않는다. 특히, 변형된 면역글로불린 중의 비-천연 폴리펩티드는 단리된 비-천연 폴리펩티드와 비교하여 대략 동일하거나 심지어 더 높은 수준의 생물학적 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린에서 비-천연 폴리펩티드의 생물학적 활성은 단리된 비-천연 폴리펩티드의 적어도 또는 약 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 수 있다.

3A 부위에서 비-천연 폴리펩티드의 융합은 변형된 면역글로불린의 결합 친화성을 방해하지 않는다. 특히, 변형된 면역글로불린은 모 면역글로불린과 비교하여 대략 동일하거나 심지어 더 높은 수준의 결합 친화성을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "모" 분자는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 비-천연 폴리펩티드가 분자에 융합되거나 임의의 다른 변형이 분자에 이루어지기 전의 분자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 결합 친화성은 모 면역글로불린의 적어도 또는 약 85%, 90%, 95%, 또는 100%일 수 있다.

3A 부위에서 비-천연 폴리펩티드의 융합은 발현 수준을 방해하지 않으며, 발현 수율을 감소시키지 않는다. 특히, 변형된 면역글로불린은 매우 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 발현 수준은 유사한 이중특이적 항체(예를 들어, 동일한 표적에 결합하는 항체) 또는 면역사이토카인(예를 들어, Fc의 C-말단에서 연결된 사이토카인을 갖는 항체)의 발현 수준보다 적어도 또는 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 더 높을 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 쉽게 응집체를 형성하지 않는다. 일부 구현예에서, 정제된 형태(예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된 후)에서 응집체의 백분율은 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이다.

또한, 변형된 면역글로불린은 이중특이적 항체의 경우와 같은 쌍형성오류 문제가 없다. 따라서, 변형된 면역글로불린을 제조하고 정제하는 것이 더 용이하고, 수율은 전형적인 이중특이적 항체보다 훨씬 더 높을 수 있다.

더욱이, 변형된 면역글로불린은 안정하고, 응집체를 형성하거나 쉽게 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 실온에서 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 또는 12주, 또는 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 동안 안정하다.

본 개시는 또한 Fc 영역의 일부 다른 부위에서 변형을 제공한다. 이들 부위는 "3B" 부위, "3C" 부위, 및 "3D" 부위를 포함한다. 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 3B 부위에서 1개 또는 2개의 폴리펩티드의 중쇄 CH3 도메인에 융합될 수 있다. 3B 부위는 위치 383 내지 위치 391(EU 넘버링)에서 시작한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 3B 부위에서 전체 아미노산 서열을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인의 2개의 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 및 392로부터 선택되고, 이들 2개의 아미노산 잔기의 모든 가능한 조합이 또한 제공된다.

일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 3C 부위에서 1개 또는 2개의 폴리펩티드의 중쇄 CH3 도메인에 융합될 수 있다. 3C 부위는 위치 383 내지 위치 385(EU 넘버링)에서 시작한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 아미노산을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 3C 부위에서 전체 아미노산 서열을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인의 2개의 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 382, 383, 384, 385, 및 386으로부터 선택되고, 이들 2개의 아미노산 잔기의 모든 가능한 조합이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 384 및 385이다.

일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 3D 부위에서 1개 또는 2개의 폴리펩티드의 중쇄 CH3 도메인에 융합될 수 있다. 3D 부위는 위치 413 내지 위치 422(EU 넘버링)에서 시작한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 3D 부위에서 전체 아미노산 서열을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인의 2개의 아미노산 잔기에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개의 잔기는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 및 423으로부터 선택되고, 이들 2개의 아미노산 잔기의 모든 가능한 조합이 또한 제공된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 1개 또는 2개의 중쇄(예를 들어, 본원에 기재된 온전한 중쇄, 이의 일부, 또는 변형된 중쇄)를 갖고, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 1개 또는 2개의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 Fc 영역(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 야생형 또는 변형된 Fc 영역)을 갖고, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 FC 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 1개 또는 2개의 경쇄(예를 들어, 본원에 기재된 온전한 경쇄, 이의 일부, 또는 변형된 경쇄)를 갖고, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 1개 또는 2개의 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, 인간 면역글로불린은 IgA, IgD, IgM, IgE, 또는 IgG이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4이다. 인간 IgD의 아미노산 269-375(SEQ ID NO: 102), 인간 IgG4의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 107), 인간 IgG3의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 106), 인간 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 104), 인간 IgG2의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 105), 인간 IgA의 아미노산 224-333(SEQ ID NO: 101), 및 인간 IgM(SEQ ID NO: 103)의 아미노산 324-433 사이의 서열 정렬은 도 33에 나타나 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362(EU 넘버링에 따름); 및 인간 IgA, IgD, IgM의 상응하는 잔기는 박스 내에 표시되어 있다. 비-천연 폴리펩티드는 이러한 부위에 유사하게 융합될 수 있다. 구체적으로, 중쇄 CH3 도메인에서의 융합 부위는 하기 아미노산 서열을 갖는다: LTKNQ(인간 IgG1; SEQ ID NO: 130); MTKNQ(인간 IgG2; SEQ ID NO: 131); MTKNQ(인간 IgG3; SEQ ID NO: 132); 및 MTKNQ(인간 IgG4; SEQ ID NO: 133). 인간 IgA, IgD, 및 IgM에서 융합 부위에 대한 아미노 잔기는 각각 LALNEL(SEQ ID NO: 134), DPPEAA(SEQ ID NO: 135), 및 LNLRES(SEQ ID NO: 136)이다. 상기 정렬 결과는 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362(EU 넘버링에 따름)가 인간 면역글로불린에 걸쳐 고도로 보존되지 않음을 보여준다. 따라서, 본원에 기재된 영역 내에서 본원에 기재된 변형(예를 들어, 비-천연 폴리펩티드의 융합)은 단백질 발현, 안정성, 및/또는 기능에 영향을 미치지 않으면서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, CH3 영역은 면역글로불린 중쇄로부터의, (만약 하나가 존재한다면)CHS 영역 없이, CH3 엑손 코딩 영역에 상응하는 불변 도메인이다. 일부 구현예에서, CHS 영역은 CH3의 말단에 있다. CHS 영역은 분비된 면역글로불린 중쇄의 C-말단 단부에 있는 코딩 영역이다. 세부사항은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템(IMGT)에서 찾아볼 수 있다. 유사하게, 인간 IgG4의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 107), 인간 IgG3의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 106), 인간 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 104), 및 인간 IgG2의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 105) 사이의 서열 정렬은 도 34에 도시되어 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362(EU 넘버링에 따름)는 표시되어 있다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgA, IgD, 및 IgM의 중쇄 CH3 도메인에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 전체 아미노산 서열을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인의 2개의 아미노산 잔기에 연결된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 설치류 면역글로불린(예를 들어, 마우스 IgG, 래트 IgG)이다. 일부 구현예에서, 래트 면역글로불린은 래트 IgG1, 래트 IgG2A, 래트 IgG2B, 또는 래트 IgG2C이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 마우스 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, 마우스 면역글로불린은 마우스 IgG1, 마우스 IgG2A, 마우스 IgG2B, 마우스 IgG2C, 또는 마우스 IgG3이다. 래트 IgG2C의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 111), 마우스 IgG3의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 116), 인간 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 104), 래트 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 108), 래트 IgG2A의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 109), 마우스 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 112), 마우스 IgG2B의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 114), 래트 IgG2B의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 110), 마우스 IgG2A의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 113), 및 마우스 IgG2C의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 115) 사이의 서열 정렬은 도 35에 도시되어 있다. 인간 IgG1의 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362(EU 넘버링에 따름), 및 마우스 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, 또는 IgG3) 및 래트 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2A, IgG2B, 또는 IgG2C)에서의 상응하는 잔기는 괄호로 표시된다. 구체적으로, 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362에 상응하는 아미노산 잔기(EU 넘버링에 따름)는 MSKNK(래트 IgG2C; SEQ ID NO: 137), MSKKK(마우스 IgG3; SEQ ID NO: 138), MTQNE(래트 IgG1; SEQ ID NO: 139), MTQSQ(래트 IgG2A; SEQ ID NO: 140), MAKDK(마우스 IgG1; SEQ ID NO: 141), LSRKD(마우스 IgG2B; SEQ ID NO: 142), LTEQT(래트 IgG2B; SEQ ID NO: 143), MTKKQ(마우스 IgG2A; SEQ ID NO: 144), 및 MTKKE(마우스 IgG2C; SEQ ID NO: 145)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 원숭이 면역글로불린(예를 들어, 원숭이 IgG)이다. 일부 구현예에서, 원숭이 면역글로불린은 원숭이 IgG1, 원숭이 IgG2, 또는 원숭이 IgG3이다. 인간 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 104), 원숭이 IgG3의 CH3 영역(SEQ ID NO: 119), 원숭이 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 117), 및 원숭이 IgG2의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 118) 사이의 서열 정렬은 도 36에 나타나 있다. 인간 IgG1의 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362(EU 넘버링에 따름), 및 원숭이 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)에서 상응하는 잔기는 괄호로 표시된다. 구체적으로, 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362에 상응하는 아미노산 잔기(EU 넘버링에 따름)는 LTKNQ(원숭이 IgG3; SEQ ID NO: 146), LTKNQ(원숭이 IgG1; SEQ ID NO: 147), 및 LTKNQ(원숭이 IgG2; SEQ ID NO: 148)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린은 개과(예를 들어, 개) 면역글로불린(예를 들어, 개 IgG)이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린은 개과 IgG1, 개과 IgG2, 개과 IgG3, 또는 개과 IgG4이다. 인간 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 104), 개과 IgG2의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 121), 개과 IgG3의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 122), 개과 IgG1의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 120), 및 개과 IgG4의 CH3-CHS 영역(SEQ ID NO: 121) 사이의 서열 정렬은 도 37에 도시되어 있다. 인간 IgG1의 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362(EU 넘버링에 따름), 및 개과 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)에서 상응하는 잔기는 괄호로 표시된다. 구체적으로, 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362에 상응하는 아미노산 잔기(EU 넘버링에 따름)는 LSKNT(개과 IgG2; SEQ ID NO: 149), MSKNT(개과 IgG3; SEQ ID NO: 150), LSSSDT(개과 IgG1; SEQ ID NO: 151), 및 LSSSDT(개과 IgG4; SEQ ID NO: 152)이다. 인간 IgG1의 중쇄 CH3 도메인의 위치 358-362에 상응하는 부위(EU 넘버링에 따름)는 비-천연 펩티드에 대한 융합 부위로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 이들 융합 부위에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 융합 부위에서 전체 아미노산 서열을 대체한다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 이러한 융합 부위에서 임의의 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 비-천연 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인의 2개의 아미노산 잔기에 연결된다.

항체 형식

변형된 면역글로불린은 다양한 형태 또는 형식을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 변형 전의 모 항체는 온전한 면역글로불린 분자(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA)일 수 있다. IgG 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)는 고도로 보존되어 있으며, 이들의 불변 영역, 특히 이들의 힌지 및 상부 CH2 도메인이 상이하다. 이들 면역글로불린의 EU 넘버링, IgG 서브클래스의 서열 및 차이는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Vidarsson, et al, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; Lefranc et al., "IMGT® and 30 years of Immunoinformatics Insight in antibody V and C domain structure and function." Antibodies 8.2 (2019): 29]에 기재되어 있다.

항체는 또한 임의의 종(예를 들어, 인간, 설치류, 래트, 마우스, 낙타과, 개, 뿔상어, 제노푸스 라에비스, 레서스 원숭이, 고양이, 토끼)로부터 유래된 면역글로불린 분자일 수 있다. 본원에 개시된 항체는 또한 다클론성, 단클론성, 단일특이적, 다특이적 항체, 및 또 다른 폴리펩티드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 용어 "항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 단편"은 온전한 항체의 특이적 결합 활성을 보유하는 항체의 부분, 즉, 온전한 항체의 표적 분자 상에 있는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 임의의 부분이다. 이는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, 및 이들 단편의 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들어, scFv, Fv, Fd, dAb, 이중특이적 항체, 이중특이적 scFv, 디아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체, 및 항체 결합 도메인이거나 이와 동종인 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 항원 결합 도메인의 비-제한적 예는, 예를 들어, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR, 온전한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역, 온전한 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄, 또는 온전한 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 개별적인 CDR을 포함한다.

본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 항체의 단편이 또한 제공된다. Fab 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 이들 사이의 힌지 시스테인에 의해 이들의 카르복시 말단 근처에서 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링은 또한 당분야에 공지되어 있다.

일부 구현예에서, 항체의 중쇄는 IgM, IgG, IgE, IgA, 또는 IgD를 포함하는 임의의 이소형 또는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 등을 포함하는 하위-이소형일 수 있다. 경쇄는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄일 수 있다. 항체는 경쇄의 2개의 동일한 카피 및 중쇄의 2개의 동일한 카피를 포함할 수 있다.

변형된 면역글로불린은 다양한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 융합 단백질, 효소, 가용성 단백질, 구조 단백질, 전사 조절 단백질, 수용체, 번역 조절 단백질, 염색질 단백질, 호르몬, 세포 주기 조절 단백질, G 단백질, 신경활성 펩티드, 면역조절 단백질, 혈액 성분 단백질, 열 충격 단백질, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 항생제 내성 단백질, 단백질 중 어느 하나의 기능성 단편, 단백질 중 어느 하나의 에피토프 단편, 및 임의의 이들의 조합이다.

일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 항원에 결합하고, 변형된 면역글로불린은 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 2개의 항원에 결합하고, 변형된 면역글로불린은 동일한 2개의 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 3개의 항원에 결합하고, 변형된 면역글로불린은 동일한 3개의 항원에 특이적으로 결합하는 삼중특이적 항체와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 발현 수준을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 4개의 항원에 결합하고, 변형된 면역글로불린은 동일한 4개의 항원에 특이적으로 결합하는 사중특이적 항체와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 발현 수준을 갖는다.

일부 구현예에서, 항원은 종양-관련 항원이다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 관련 항원"은 종양 세포 표면에 있거나 종양 세포 표면 상에 제시될 수 있고 종양 세포 상에 또는 내에 위치하는 항원을 지칭한다. 일부 다른 구현예에서, 종양 관련 항원은 오로지 종양 세포 상에서만 발현될 수 있거나, 비-종양 세포와 비교하여 종양 특이적 돌연변이를 나타낼 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 종양 관련 항원은 종양 세포와 비-종양 세포 둘 모두에서 발견될 수 있지만, 비-종양 세포와 비교할 때 종양 세포에서 과발현되거나, 비-종양 조직과 비교하여 종양 조직의 덜 조밀한 구조로 인해 종양 세포에서 결합하는 항체에 접근 가능하다. 일부 구현예에서, 종양 관련 항원은 종양의 혈관계에 위치한다. 종양 관련 표면 항원의 예시적인 예는 CD10, CD19, CD20, CD22, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD34, CD37, CD44v6, CD45, CD133, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), Her2neu, Her3, IGFR, IL3R, 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), CDCP1, Derlin1, Tenascin, frizzled 1-10, 혈관 항원 VEGFR2(KDR/FLK1), VEGFR3(FLT4, CD309), PDGFR-알파(CD140a), PDGFR-베타(CD140b) 엔도글린, CLEC14, Tem1-8, 및 Tie2이다. 추가의 예는 A33, CAMPATH-1(CDw52), 암배아 항원(CEA), 카르보안하이드라제 IX(MN/CA IX), de2-7 EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Ep-CAM, 폴레이트-결합 단백질, G250, Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT-3, CD135), c-Kit(CD117), CSF1R(CD115), HLA-DR, IGFR, IL-2 수용체, IL3R, MCSP(흑색종-관련 세포 표면 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸), Muc-1, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 항원(PSA), 및 TAG-72를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 항원은 이펙터 세포에 대한 항원이다. 본원에서 사용되는 용어 "이펙터 세포"는 자극에 능동적으로 반응하고 일부 변화에 영향을 미치는 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이펙터 세포는 면역 세포, 예를 들어, NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 마이크로파지, 수지상 세포, 또는 호중구이다. 따라서, 항원은 면역 세포 항원일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "면역 세포 항원"은 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 상에 주로 제시되는 항원을 지칭한다. 특정 구현예에서, 항원은 CD3, 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD16, CD47, CD19, CD20, CD22, CD33, CD38, CD123, CD133, CEA, cdH3, EpCAM, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII(EGFR의 돌연변이체 형태), HER2, HER3, dLL3, BCMA, 시알릴-Lea, 5T4, ROR1, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, 메조텔린, 폴레이트 수용체 1, VEGF 수용체, EpCAM, HER2/neu, HER3/neu, G250, CEA, MAGE, 프로테오글리칸, VEGF, FGFR, 알파V베타3-인테그린, HLA, HLA-DR, ASC, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD21, CD23, CD24, CD28, CD30, CD37, CD40, CD41, CD44, CD52, CD64, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, 강글리오시드 GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4 Trp2, gp100, 티로시나제, Muc-1, 텔로머라제, 서바이빈, G250, p53, CA125 MUC, Wue 항원, 루이스 Y 항원, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EpHA2 및 세포 표면 표적 GC182, GT468 또는 GT512이다.

일부 구현예에서, 항원은 면역 체크포인트 분자이다. 면역 체크포인트는 면역계의 조절자이다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, B7-H3, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, 4-1BB, OX40, GITR, 또는 CD40이다. 일부 구현예에서, 항원은 세포 예정사 단백질 1(PD-1), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4), 림프구 활성화 3(LAG-3), B 및 T 림프구 관련(BTLA), 세포 예정사 1 리간드 1(PD-L1), CD27, CD28, CD40, CD47, CD137, CD154, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체(TIGIT), 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질(GITR), T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM-3), 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 4(TNFRSF4 또는 OX40)이다.

변형에 사용될 수 있는 치료용 항체의 예는 리툭시맙(rituximab)(Rituxan, IDEC/Genentech/Roche)(예를 들어, 미국 특허 제5,736,137호 참조), 비-호지킨 림프종을 치료하도록 승인된 키메라 항-CD20 항체; 현재 Genmab에서 개발 중인 항-CD20인 HuMax-CD20, 미국 특허 제5,500,362호에 기술된 항-CD20 항체인 AME133(Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc.), HumaLYM(Intracel), 및 PRO70769(PCT 출원 제PCT/US2003/040426호), 트라스투주맙(trastuzumab)(Herceptin, Genentech)(예를 들어, 미국 특허 제5,677,171호 참조), 유방암 치료를 위해 승인된 인간화 항-Her2/neu 항체; 현재 Genentech에 의해 개발 중인 퍼투주맙(pertuzumab)(rhuMab-2C4, Omnitarg); 미국 특허 제4,753,894호에 기재된 항-Her2 항체; 세툭시맙(cetuximab)(Erbitux, Imclone)(미국 특허 제4,943,533호; PCT 공개 제WO 96/40210호), 다양한 암에 대한 임상 시험에서 키메라 항-EGFR 항체; 현재 Abgenix-Immunex-Amgen에 의해 개발 중인 ABX-EGF(미국 특허 제6,235,883호); 현재 Genmab에 의해 개발 중인 HuMax-EGFr(미국 특허 제7,247,301호); 425, EMD55900, EMD62000 및 EMD72000(Merck KGaA)(미국 특허 제5,558,864호; 문헌[Murthy et al., (1987) Arch. Biochem. Biophys. 252 (2) : 549-60; Rodeck et al., (1987) J. Cell. Biochem. 35 (4) : 315-20; Kettleborough et al., (1991) Protein Eng. 4 (7) : 773-83)]; ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT 공개 제WO 95/20045호; 문헌[Modjtahedi et al., (1993) J. Cell Biophys. 22 (1-3) : 129-46; Modjtahedi et al., (1993) Br. J. Cancer 67 (2) : 247-53; Modjtahedi et al., (1996) Br. J. Cancer 73 (2) : 228-35; Modjtahedi et al., (2003) Int. J. Cancer 105 (2) : 273-80)]; TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada 및 Cuba, Centro de Immunologia Molecular, Cuba(미국 특허 제5,891,996호; 미국 특허 제6,506,883호; 문헌[Mateo et al., (1997) Immunotechnol. 3 (1) : 71-81]); mAb-806(Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(문헌[Jungbluth et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2): 639-44]); KSB-102(KS Biomedix); MR1-1(IVAX, National Cancer Institute)(PCT 공개 제WO 0162931호); 및 SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138); 알렘투주맙(alemtuzumab)(Campath, Millenium), B-세포 만성 림프구성 백혈병의 치료를 위해 현재 승인된 인간화 mAb; 무로모납-CD3(오르토클론 OKT3), Ortho Biotech/Johnson & Johnson에 의해 개발된 항-CD3 항체, 이브리투모맙 툭세탄(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin), IDEC/Schering AG에 의해 개발된 항-CD20 항체, 젬투주맙오조가마이신(gemtuzumabozogamicin)(Mylotarg), Celltech/Wyeth에 의해 개발된 항-CD33(p67 단백질) 항체, 알레파셉트(alefacept)(Amevive), Biogen에 의해 개발된 항-LFA-3 Fc 융합, Centocor/Lilly에 의해 개발된 에이빅시맙(abciximab)(ReoPro), Novartis에 의해 개발된 바실릭시맙(basiliximab)(Simulect), Medimmune에 의해 개발된 팔리비주맙(palivizumab)(Synagis), Centocor에 의해 개발된 항-TNF 알파 항체인 인플릭시맙(infliximab)(Remicade), Abbott에 의해 개발된 항-TNF 알파 항체인 아달리무맙(adalimumab)(Humira), Celltech에 의해 개발된 항-TNF 알파 항체인 Humicade, Centocor에 의해 개발된 완전(fully) 인간 TNF 항체인 골리무맙(golimumab)(CNTO148), Immunex/Amgen에 의해 개발된 p75 TNF 수용체 Fc 융합인 에타너셉트(etanercept)(Enbrel), 기존에 Roche에 의해 개발된 p55TNF 수용체 Fc 융합, 레너셉트(lenercept), Abgenix에 의해 개발 중인 항-CD147 항체인 ABX-CBL, Abgenix에 의해 개발 중인 항-IL8 항체인 ABX-IL8, Abgenix에 의해 개발 중인 항-MUC18 항체인 ABX-MA1, Antisoma에 의해 개발 중인 항-MUC1인 펨토마맙(Pemtumamab)(R1549, 90Y-muHMFG1), Antisoma에 의해 개발 중인 항-MUC1 항체인 Therex(R1550), Antisoma에 의해 개발 중인 안지오맵(AngioMab)(AS1405), Antisoma에 의해 개발 중인 HuBC-1, Antisoma에 의해 개발 중인 티오플라틴(AS1407), Biogen에 의해 개발 중인 항-알파-4-베타-1(VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체인 안테그렌(Antegren)(나탈리주맙(natalizumab)), Biogen에 의해 개발 중인 항-VLA-1 인테그린 항체인 VLA-1 mAb, Biogen에 의해 개발 중인 항-림포톡신 베타 수용체(LTBR) 항체인 LTBR mAb, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발 중인 항-TGF-.베타.2 항체인 CAT-152, Abbott에 의해 개발 중인 항-IL-12 p40 항체인 ABT 874(J695), Cambridge Antibody Technology 및 Genzyme에 의해 개발 중인 항-TGF.베타.1 항체인 CAT192, Cambridge Antibody Technology에 의해 개발 중인 항-Eotaxinl 항체인 CAT-213, Cambridge Antibody Technology와 Human Genome Sciences Inc.에 의해 개발 중인 항-Blys 항체인 LymphoStat-B, Cambridge Antibody Technology와 Human Genome Sciences Inc.에 의해 개발 중인 항-TRAIL-R1 항체인 TRAIL-RlmAb, Genentech에 의해 개발 중인 항-VEGF 항체인 어베스틴 베바시주맙(Avastin bevacizumab), rhuMAb-VEGF, Genentech에 의해 개발 중인 항-HER 수용체 패밀리 항체, Genentech에 의해 개발 중인 항조직 인자 항체인 항-조직 인자(ATF), Genentech에 의해 개발 중인 항-IgE 항체인 Xolair(오말리주맙(Omalizumab)), Genentech와 Xoma에 의해 개발 중인 항-CD11a 항체인 랩티바(Raptiva)(에팔리주맙(Efalizumab)), Genentech 및 Millenium Pharmaceuticals에서 개발 중인 MLN-02 항체(이전의 LDP-02), Genmab에 의해 개발 중인 항-CD4 항체인 HuMax CD4, Genmab과 Amgen에 의해 개발 중인 항-IL15 항체인 HuMax-IL15, Genmab과 Medarex에 의해 개발 중인 HuMax-Inflam, Genmab 및 Medarex와 Oxford GcoSciences에 의해 개발 중인 항-헤파라나제 I 항체인 HuMax-Cancer, Genmab과 Amgen에 의해 개발 중인 HuMax-Lymphoma, Genmab에 의해 개발 중인 HuMax-TAC, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발 중인 항-CD40L 항체인 IDEC-131, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발 중인 항-CD4 항체인 IDEC-151(클레놀릭시맙(Clenoliximab)), IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발 중인 항-CD80 항체인 IDEC-114, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발 중인 항-CD23인 IDEC-152, IDEC Pharmaceuticals에 의해 개발 중인 항-대식세포 이동 인자(MIF) 항체, Imclone에 의해 개발 중인 항-이디오타입 항체인 BEC2, Imclone에 의해 개발 중인 항-KDR 항체인 IMC-1C11, Imclone에 의해 개발 중인 항-flk-1 항체인 DC101, Imclone에 의해 개발 중인 항-VE 카드헤린 항체, Immunomedics에 의해 개발 중인 항암성 배아 항원(CEA) 항체인 CEA-Cide(레바투주맙(labetuzumab)), Immunomedics에 의해 개발 중인 항-CD22 항체인 LymphoCide(에프라투주맙(Epratuzumab)), Immunomedics에 의해 개발 중인 AFP-Cide, Immunomedics에 의해 개발 중인 MyelomaCide, Immunomedics에 의해 개발 중인 LkoCide, Immunomedics에 의해 개발 중인 ProstaCide, Medarex에 의해 개발 중인 항-CTLA4 항체인 MDX-010, Medarex에 의해 개발 중인 항-CD30 항체인 MDX-060, Medarex에 의해 개발 중인 MDX-070, Medarex에 의해 개발 중인 MDX-018, Osidem(IDM-1) 및 Medarex와 Immuno-Designed Molecules에 의해 개발 중인 항-Her2 항체, Medarex와 Genmab에 의해 개발 중인 항-CD4 항체인 HuMax-CD4, Medarex와 Genmab에 의해 개발 중인 항-IL15 항체인 HuMax-IL15, Medarex와 Centocor/J&J에 의해 개발 중인 항-TNF.알파. 항체인 CNTO 148, Centocor/J&J에 의해 개발 중인 항-사이토카인 항체인 CNTO 1275, MorphoSys에 의해 개발 중인 항 세포간 접착 분자-1(ICAM-1)(CD54) 항체인 MOR101 및 MOR102, MorphoSys에 의해 개발 중인 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR-3) 항체인 MOR201, Protein Design Labs에 의해 개발 중인 항-CD3 항체인 Nuvion(비실리주맙(visilizumab)), Protein Design Labs에서 개발 중인 항-감마 인터페론 항체인 HuZAF, Protein Design Labs에 의해 개발 중인 항-α5β1 인테그린, Protein Design Labs에 의해 개발 중인 항-IL-12, Xoma에 의해 개발 중인 항-Ep-CAM 항체인 ING-1, Genentech 및 Novartis에 의해 개발 중인 인간화 항-IgE 항체인 Xolair(오말리주맙) 및 Xoma에 의해 개발 중인 항-베타 2 인테그린 항체인 MLN01을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 치료제는 KRN330(키린, Kirin); huA33 항체(A33, Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95(알파 V 인테그린, Centocor); MEDI-522(알파 V.3 인테그린, Medimmune); 볼록시시맙(volociximab)(알파 V.베타.1 인테그린, Biogen/PDL); 인간 mAb 216(B 세포 당화 에피토프(epitope), NCI); BiTE MT103(이중특이적 CD19 CD3, Medimmune); 4G7 H22(Bispecific Bcell. times. FcgammaR1, Medarex/Merck KGa); rM28(이중특이적 CD28 x MAPG, 유럽 특허 제EP1444268호); MDX447(EMD 82633)(이중특이적 CD64 EGFR, Medarex); 카투악소맙(Catumaxomab)(레모밥, removab)(이중특이적 EpCAM 항-CD3, Trion/Fres); 에투막소맙(Ertumaxomab)(이중특이적 HER2/CD3, Fresenius Biotech); 오레고보맙(oregovomab)(OvaRex)(CA-125, ViRexx); Rencarex(WX G250)(탄산 무수물 IX, Wilex); CNTO 888(CCL2, Centocor); TRC105(CD105(엔도글린), 트라콘); BMS-663513(CD137 작용제, Brystol Myers Squibb); MDX-1342(CD19, Medarex); 시필리주맙(Siplizumab)(MEDI-507)(CD2, Medimmune); 오파투무맙(Ofatumumab)(Humax-CD20)(CD20, Genmab); 리툭시맙(Rituxan)(CD20, Genentech); 벨투주맙(veltuzumab)(hA20)(CD20, Immunomedics); 에프라투주맙(CD22, Amgen); 루밀리시맙(lumiliximab)(IDEC152)(CD23, Biogen); 무로모납-CD3(CD3, Ortho); HuM291(CD3 fc 수용체, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCI); MDX-060(CD30, Medarex); MDX1401(CD30, Medarex); SGN-30(CD30, Seattle Genentics); SGN-33(린투주맙(Lintuzumab))(CD33, Seattle Genentics); 자놀리무맙(Zanolimumab)(HuMax-CD4)(CD4, Genmab); HCD122(CD40, Novartis); SGN-40(CD40, Seattle Genentics); Campathlh(알렘투주맙)(CD52, Genzyme); MDX-1411(CD70, Medarex); hLL1(EPB-1)(CD74.38, Immunomedics); 갈릭시맙(Galiximab)(IDEC-144)(CD80, Biogen); MT293(TRC093/D93)(절단 콜라겐, Tracon); HuLuc63(CS1, PDL Pharma); 이필리무맙(ipilimumab)(MDX-010)(CTLA4, Brystol Myers Squibb); 트레멜리무맙(Tremelimumab)(티실리무맙(Ticilimumab), CP-675,2)(CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1(마파투무맙(Mapatumumab))(DR4 TRAIL-R1 작용제, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655(DR5, Amgen); 아포맙(Apomab)(DR5, Genentech); CS-1008(DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2(렉사투무맙(lexatumumab))(DR5 TRAIL-R2 작용제, HGS); 세툭시맙(Erbitux)(EGFR, Imclone); IMC-11F8(EGFR, Imclone); 니모투주맙(Nimotuzumab)(EGFR, YM Bio); 파니투무맙(Panitumumab)(Vectabix)(EGFR, Amgen); 잘루투무맙(Zalutumumab)(HuMaxEGFr)(EGFR, Genmab); CDX-110(EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics); 아데카투무맙(adecatumumab)(MT201)(Epcam, Merck); 에드레콜로맙(edrecolomab)(Panorex, 17-1A)(Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003(엽산 수용체 a, Morphotech); KW-2871(갱글리오시드 GD3, Kyowa); MORAb-009(GP-9, Morphotech); CDX-1307(MDX-1307)(hCGb, Celldex); 트라스투주맙(허셉틴, Herceptin)(HER2, Celldex); 퍼투주맙(rhuMAb 2C4)(HER2(DI), Genentech); 아폴리주맙(apolizumab)(HLA-DR 베타 쇄, PDL Pharma); AMG-479(IGF-1R, Amgen); 항-IGF-1R R1507(IGF1-R, Roche); CP 751871(IGF-R, Pfizer); IMC-A12(IGF1-R, Imclone); BIIB022(IGF-1R, Biogen); Mik-베타-1(IL2Rb(CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328(IL6, Centocor); 항-KIR(1-7F9)(살해 세포 Ig-유사 수용체(KIR), Novo); Hu3S193(Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11(LTBR, Biogen); HuHMFG1(MUC1, Antisoma/NCI); RAV12(N-연결 탄수화물 에피토프, Raven); CAL(부갑상선 호르몬 관련 단백질(PTH-rP), 캘리포니아 대학교); CT-011(PD1, CureTech); MDX-1106(ono-4538)(PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011(PD1, Curetech); IMC-3G3(PDGFRa, Imclone); 바비툭시맙(bavituximab)(포스파티딜세린(phosphatidylserine), 페레그린(Peregrine)); huJ591(PSMA, 코넬 리서치 재단(Cornell Research Foundation)); muJ591(PSMA, 코넬 리서치 재단); GC1008(TGFb (팬) 억제제(IgG4), Genzyme); 인플릭시맙(Remicade)(TNF. 알파, Centocor); A27.15(트랜스페린 수용체, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3(트랜스페린 수용체, Salk Institute); 베바시주맙(Bevacizumab)(아바스틴, Avastin)(VEGF, Genentech); HuMV833(VEGF, Tsukuba Research Lab) PCT 공개 제WO/2000/034337호, 텍사스 대학교(University of Texas)); IMC-18F1(VEGFR1, Imclone); IMC-1121(VEGFR2, Imclone)을 포함한다. 다수의 이들 항체는, 예를 들어, 제WO2019057122A1호에 기재되어 있다. 이들 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

일부 구현예에서, 모 면역글로불린 또는 변형된 면역글로불린은 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 형식을 가질 수 있다. 이들 항체 형식의 상세한 설명은, 예를 들어, 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Brinkmann, et al., "The making of bispecific antibodies." MAbs. Vol. 9. No. 2. Taylor & Francis, 2017]에서 찾아볼 수 있다. 일부 구현예에서, 모 면역글로불린 또는 변형된 면역글로불린은 도 20a 내지 도 20d에 나타낸 바와 같은 형식을 가질 수 있다.

[표 3]

항원에 대한 항체의 결합 친화성은 CDR에 의해 결정된다. 이들은 면역글로불린(항체) 및 T 세포 수용체에서 가변 사슬의 일부이다. 항체의 아미노산 서열을 분석함으로써 항체의 CDR 영역을 확인하기 위한 방법은 널리 공지되어 있으며, 다수의 CDR 정의가 일반적으로 이용된다. 카바트(Kabat) 정의는 서열 가변성을 기준으로 하고, 코티아(Chothia) 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기준으로 한다. 이들 방법 및 정의는, 예를 들어, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan .1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007)]에 기재되어 있다.

CDR은 항원의 에피토프를 인식하는 데 있어서 중요하다. 본원에서 사용되는 "에피토프"는 항체의 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 분자의 가장 작은 부분이다. 에피토프의 최소 크기는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개의 아미노산일 수 있지만, 이들 아미노산은 에피토프가 항원의 이차 및 삼차 구조를 기준으로 한 항원의 3-차원 입체배열에 좌우될 수 있기 때문에 항원의 일차 구조의 연속적인 선형 서열에 있을 필요가 없다.

비-천연 폴리펩티드는 이들 분자가 중쇄 CH3 도메인을 갖는 한, 다양한 변형된 면역글로불린, 항체, 항체-유사 또는 IgG-유사 분자에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 항체의 다량체화는 항체의 자연 응집을 통해 또는 당분야에 공지된 화학적 또는 재조합 연결 기법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 비율의 정제된 항체 제제(예를 들어, 정제된 IgG1 분자)는 항체 동종이량체 및 다른 고차 항체 다량체를 함유하는 단백질 응집체를 자발적으로 형성한다.

일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하기 위해 한 쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스를 조작하는 것에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 함유할 수 있다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체하는 것에 의해 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 상보적 "공동(cavity)"이 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 기타 원하지 않는 최종-산물 대비 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 그 전체가 참조로 포함되는 제WO 96/27011호에 기재되어 있다. Fc 영역에 대한 변형이 이루어지지만, 본 개시는 또한 변형이 노브-인-홀과 양립할 수 있음을 보여준다. "노브 인투 홀" 접근법은 하나의 중쇄에 큰 측쇄를 갖는 아미노산에 대한 돌연변이, 및 다른 중쇄에 작은 측쇄를 갖는 아미노산에 대한 돌연변이를 도입한다. 따라서, 동일한 중쇄는 서로 회합할 가능성이 더 낮고, 2개의 상이한 중쇄는 서로 회합할 가능성이 더 높다. "노브 인투 홀" 접근법은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Ridgway, John BB, Leonard G. Presta, and Paul Carter. "'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization." Protein Engineering, Design and Selection 9.7 (1996)]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, IgG의 CH3 도메인에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 치환된다. 일부 구현예에서, 하나의 중쇄는 다음 치환 Y349C 및 T366W 중 하나 이상을 갖는다. 다른 중쇄는 하나 이상의 다음 치환 E356C, T366S, L368A, 및 Y407V를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 중쇄는 T366Y(노브) 치환을 갖고, 다른 중쇄는 Y407T(홀) 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, 하나의 중쇄는 T366Y(노브) 치환을 갖고, 다른 중쇄는 이들 치환 T366S, L368A, Y407V(홀) 중 1개, 2개, 또는 3개를 갖는다.

일부 구현예에서, 항체는 DVD-Ig, CrossMab, BiTE 등과 같은 형식을 갖는다. 이들 형식은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Spiess et al., "Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies." Molecular immunology 67.2 (2015): 95-106]에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 트리오맙; 하이브리드 하이브리도마(쿼드로마); 다중특이적 항칼린 플랫폼(Pieris); 디아바디; 단쇄 디아바디; 탠덤 단쇄 Fv 단편; TandAb, 삼중특이적 Ab; 다트(이중 친화성 재표적화; Macrogenics); 이중특이적 Xmab(Xencor); 이중특이적 T 세포 인게이저(Bites; Amgen; 55 kDa); 삼중체; 트리바디(Fab-scFv) 융합 단백질(CreativeBiolabs) 다작용성 재조합 항체 유도체; 듀오바디 플랫폼(Genmab); 도킹 및 잠금 플랫폼; 인간화 이중특이적 IgG 항체(REGN1979)(Regeneron); Mab2 이중특이적 항체(F-Star); DVD-Ig(이중 가변 도메인 면역글로불린)(Abbvie); 카파-람다 바디; TBTI(4가 이중특이적 탠덤 Ig); 및 크로스맙에 기초한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 이중특이적 폴리펩티드 복합체는 "전체" 항체, 예컨대, 전체 IgG 또는 IgG-유사 분자의 형식, 및 작은 재조합 형식, 예컨대, 탠덤 단쇄 가변 단편 분자(taFv), 디아바디(Db), 단쇄 디아바디(scDb) 및 이들의 다양한 다른 유도체, 및 BiTE(이중특이적 T 세포 인게이저)에 기초한다.

"MAb-Fv" 또는 "IgG-Fv"는 하나의 Fc 사슬의 C-말단에 VH, 및 별도로 발현되거나 도메인간 이황화 결합에 의해 안정화된 Fv를 갖는 이중특이적, 3가 IgG-Fv(mAb-Fv) 융합 단백질에서 생성된 다른 하나의 C-말단에 융합된 VL 도메인의 융합에 의해 형성된 융합 단백질을 지칭한다.

"ScFab-Fc-scFv2" 및 "ScFab-Fc-scFv"는 단쇄 Fab와 Fc 및 이황화-안정화된 Fv 도메인의 융합에 의해 형성된 융합 단백질을 지칭한다.

"부속된 IgG"는 이중특이적(Fab)2-Fc의 형식을 형성하기 위해 IgG에 융합된 Fab 아암을 갖는 융합 단백질을 지칭한다. 이는 연결부의 존재 또는 부재에서 IgG 분자의 C-말단 또는 N-말단에 융합된 Fab와 함께 "IgG-Fab" 또는 "Fab-IgG"를 형성할 수 있다.

"DVD-Ig"는 IgG 중쇄 및 경쇄에 대한 제2 특이성의 추가적인 VH 도메인 및 VL 도메인의 융합에 의해 형성되는 이중-가변-도메인 항체를 지칭한다. "CODV-Ig"는 2개의 VH 및 2개의 VL 도메인이 (N-말단에서 C-말단으로) 순서 VH A-VH B 및 VL B-VL A, 또는 순서 HV B-HV A 및 VL A-VL B로 배열된 가변 VH-VL 도메인의 교차 쌍형성을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 관련 형식을 지칭한다.

"CrossMab"은 비변형된 경쇄와 상응하는 비변형된 중쇄의 쌍형성 및 변형된 경쇄와 상응하는 변형된 중쇄의 쌍형성, 이에 따라 경쇄에서 감소된 쌍형성오류를 갖는 항체를 생성하는 기법을 지칭한다.

"BiTE"는 VH-VL 배향으로 제2 특이성을 갖는 제2 scFv에 연결된 VH-VL 배향으로 제1 항원 특이성을 갖는 제1 scFv를 포함하는 이중특이적 T-세포 인게이저 분자이다.

본 개시의 변형된 면역글로불린은 또한 요망되는 이펙터 기능 또는 혈청 반감기를 제공하도록 Fc 영역에서 변형될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 안정화 분자(예를 들어, 대상체 또는 용액에서 변형된 면역글로불린의 반감기를 증가시키는 분자)에 접합될 수 있다. 안정화 분자의 비-제한적인 예는 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민)을 포함한다. 안정화 분자의 접합은 반감기를 증가시키거나, 시험관내(예를 들어, 조직 배양에서 또는 약학적 조성물로서 저장 시) 또는 생체내(예를 들어, 인간)에서 항체 또는 항원-결합 단편의 생물학적 활성을 연장시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 치료제에 접합될 수 있다. 변형된 면역글로불린을 포함하는 항체-약물 접합체는 치료제에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료제는 세포독성 또는 세포정지제(예를 들어, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신, 마이탄시노이드, 예컨대, DM-1 및 DM-4, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 에피루비신, 및 사이클로포스파미드 및 유사체)이다.

일부 구현예에서, 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 비-천연 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 치료제는 비-천연 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 측쇄)에 공유적으로 연결될 수 있다(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 상이한 융합 부위에 융합됨).

일 양태에서, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 폴리펩티드가 변형된 면역글로불린에 융합된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 중쇄 CH3 도메인의 하나의 아미노산 잔기에 융합된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 중쇄 CH3 도메인의 C-말단 아미노산 잔기에 융합된다.

일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드는 다중특이적 항원 결합 단백질에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 단백질(MABP)은 (a) 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 제1 항원 결합 부분으로서, VH와 VL이 함께 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하는, 제1 항원 결합 부분, 및 (b) 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 제2 항원 결합 부분으로서, 제1 항원 결합 부분 및 제2 항원 결합 부분이 서로에 대해 융합되는, 제2 항원 결합 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, MABP는 각각이 sdAb를 포함하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 그 초과의 상이한 항원 결합 부분 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개의 동일한 sdAb는 서로 융합되고, 이는 제1 항원 결합 부분에 추가로 융합된다. 일부 구현예에서, 2개의 상이한 sdAb는 서로 융합되고, 이는 제1 항원 결합 부분에 추가로 융합된다. 일부 구현예에서, (a) 각각이 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 제1 항원 결합 부분의 2개 카피로서, VH 및 VL은 함께 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하는 카피, 및 (b) 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 sdAb를 포함하는 제2 항원 결합 부분의 단일 카피로서, 제2 항원 결합 부분은 제1 항원 결합 부분의 2개 카피 중 하나에 융합되는 카피를 포함하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항원 결합 단백질이 제공된다. 일부 구현예에서, (a) 각각이 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 제1 항원 결합 부분의 2개 카피로서, VH 및 VL은 함께 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하는 카피, 및 (b) 제1 에피토프와 상이한 에피토프에 각각 특이적으로 결합하는 동일하거나 상이한 복수의(예컨대, 2개, 3개, 또는 4개) sdAb로서, 서로에 대해, 및/또는 제1 항원 결합 부분에 융합되는 sdAb를 포함하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항원 결합 단백질이 제공된다. 다양한 다중특이적 항원 결합 단백질은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2018014855A1호에 기재되어 있다.

도 20a 내지 도 20d는 몇 가지 예시적인 면역글로불린 형식을 추가로 제공한다. 도 20a에 도시된 바와 같이, HC 형식에서, 비-천연 폴리펩티드는 항체의 중쇄의 C-말단에 연결된다. 대조적으로, LC 형식에서, 비-천연 폴리펩티드는 항체의 경쇄의 C-말단에 연결된다. HC 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 2에서 PDL1-mIL7-HC, 실시예 6에서 PDL1-hIL21-HC, 실시예 7 및 실시예 9에서 M7824; 및 실시예 23에서 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4를 포함한다. LC 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 2에서 PDL1-mIL7-LC를 포함한다.

3A는 비-천연 폴리펩티드가 항체의 3A 부위에 융합된다는 것을 나타낸다. FV3A는 융합된 비-천연 폴리펩티드가 scFv임을 나타낸다. 3A-HC 형식에서, 기능성 폴리펩티드는 3A 형식의 중쇄의 C-말단에 추가로 연결된다. 3A 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 3에서 PDL1-mIL7-3A; 실시예 5에서 3F2-hIL7-3A; 실시예 6에서 3F2-hIL21-3A; 실시예 7, 실시예 9, 및 실시예 11에서 PDL1-TGFbR2-3A; 실시예 9 및 실시예 11에서 PDL1-TGFbR2-3A-IgG4; 실시예 9에서 PDL1-TGFbR2-3AF1; 실시예 12 및 실시예 13에서 PDL1-CD86-3A; 실시예 12 및 실시예 13에서 PDL1-CD86-3A-IgG4; 실시예 12에서 PD1-KN035-3A-IgG1; 실시예 12에서 PD1-KN035-3A; 및 실시예 16에서 3F2-mIL12-3A를 포함한다. FV3A 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 8 및 실시예 10에서의 PDL1-C40-6A7-FV3A; 실시예 8 및 실시예 10에서 PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4; 실시예 8 및 실시예 12에서 PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1; 및 실시예 23에서 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4를 포함한다. 3A-HC 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 3에서 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4; 실시예 5에서 3F2-hIL7-3A-mIFNa4; 실시예 6에서 3F2-hIL21-3A-mIFNa4; 실시예 13에서 PDL1-CD86-3A-TGFbR2; 및 실시예 17의 3F2-mIL12-3A-mIFNa4를 포함한다.

Fab-사이토카인-KIH 형식에서, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인은 사이토카인으로 대체된다. KIH는 노브-인-홀 변형이 2개의 중쇄에 부가되었음을 나타낸다. Fab-사이토카인-KIH 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 2에서 PDL1-hIL21-KIH를 포함한다.

유사하게, Fab-half-3A-KIH 형식에서, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인이 제거된다. 비-천연 폴리펩티드는 항체의 3A 부위에 융합된다. Fab-half-3A-KIH 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 4에서 PDL1-mIL7-Fab-half-3A-KIH를 포함한다.

3A-hole 형식에서, 비-천연 폴리펩티드는 홀 변형이 있는 중쇄의 3A 부위에 융합된다. 대조적으로, 3A-knob 형식에서, 비-천연 폴리펩티드는 노브 변형이 있는 중쇄의 3A 부위에 융합된다. 3A-hole 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 4에서 PDL1-mIL7-3A-hole; 및 실시예 12에서 CT4-KN035-3A-hole을 포함한다. 3A-knob 형식을 갖는 변형된 면역글로불린의 예는 실시예 4에서 PDL1-mIL7-3A-knob; 및 실시예 12에서 CT4-KN035-3A-knob를 포함한다. 이들 형식은 서로, 그리고 본원에 기재된 바와 같은 다양한 변형으로 조합될 수 있다.

3A-HC 형식은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 항원-결합 부위(즉, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및 제6 항원-결합 부위)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 부위는 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 부위는 VHH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원-결합 부위는 본원에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 항원-결합 부위는 동일한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 항원-결합 부위는 상이한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제4 항원-결합 부위는 동일한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제4 항원-결합 부위는 상이한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제5 및 제6 항원-결합 부위는 동일한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 제5 및 제6 항원-결합 부위는 상이한 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 형식은 도 20c에 도시되어 있다.

일부 구현예에서, 3A-HC 형식은 2개의 중쇄의 3A 부위에서 융합된 2개의 비-천연 폴리펩티드(예를 들어, 각각 E 및 F를 표적화함); 및 2개의 중쇄의 C-말단에 융합된 2개의 비-천연 폴리펩티드(예를 들어, 각각 G 및 H를 표적화함)를 가질 수 있다. 3A-HC 형식은 또한 A를 표적화하는 제1 항원-결합 부위 및 B를 표적화하는 제2 항원-결합 부위를 가질 수 있다. 또한, 3A-HC 형식은 2개의 경쇄의 C-말단에 융합된 2개의 비-천연 폴리펩티드(예를 들어, 각각 C 및 D를 표적화함)를 가질 수 있다. K를 표적화하는 Fab 도메인은 또한 3A-HC의 항원-결합 부위 중 하나에 융합될 수 있다. 도 20b는 예시적인 면역글로불린 형식을 제공한다.

일부 구현예에서, 1개 또는 2개의 비-천연 폴리펩티드는 변이체 Fc의 3A 부위에 융합될 수 있다. 도 20d는 본원에 기재된 바와 같은 변이체 Fc를 포함하는 단백질의 예시적인 형식을 제공한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 면역글로불린은 이중특이적 항체, 예를 들어, PD-1 및 CD40을 표적화하는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 3A 형식을 갖는 이중특이적 항체(예를 들어, 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4)의 독성은 HC 형식을 갖는 상응하는 이중특이적 항체(예를 들어, 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4)와 비교하여 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 또는 10% 미만이다. 일부 구현예에서, 독성은 혈액 생화학적 시험(예를 들어, ALT 및/또는 AST 수준을 측정함으로써), 또는 간의 조직병리학적 검사에 의해 평가된다.

융합된 폴리펩티드

다양한 폴리펩티드가 변형된 면역글로불린에 융합될 수 있다. 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 부위(예를 들어, 중쇄의 3A 부위 및/또는 C-말단)에 융합될 수 있다. 본 개시에 나타낸 바와 같이, 폴리펩티드가 Fc 영역에 융합된 후, 융합된 폴리펩티드는 적절한 입체배열을 채택하고 이의 생체활성을 유지할 수 있다.

본원에서 사용되는, 본 개시에서 용어 "융합 단백질"은 2개 이상의 단백질 또는 이의 단편이 펩티드의 이들 각각의 주쇄를 통해 공유 결합으로 연결된 분자를 지칭하며, 더욱 바람직하게는 융합 단백질은 이들 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 유전적 발현에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 Fc-융합 단백질이다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 융합 단백질, 효소, 가용성 단백질, 구조 단백질, 전사 조절 단백질, 수용체, 번역 조절 단백질, 염색질 단백질, 호르몬, 세포 주기 조절 단백질, G 단백질, 신경활성 펩티드, 면역조절 단백질, 혈액 성분 단백질, 열 충격 단백질, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 항생제 내성 단백질, 단백질 중 어느 하나의 기능성 단편, 단백질 중 어느 하나의 에피토프 단편, 및 이들의 임의의 조합이다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)이다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 단쇄 가변 단편(scFv)이다. scFv는 일반적으로 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, scFv는 2개의 중쇄 가변 도메인, 및 2개의 경쇄 가변 도메인을 갖는다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 단일 도메인 항체이다. 나노바디로도 공지된 단일-도메인 항체(sdAb)는 단일 모노머성 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 전체 항체와 마찬가지로, 이는 특정 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일-도메인 항체는 낙타과에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작되고, VHH 단편으로 불린다. 본원에서 사용되는 "VHH"는 중쇄 단독 항체의 항원-결합 단편을 지칭한다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 사이토카인이다. 본원에서 사용되는 용어 "사이토카인"은 포유동물에서 미리 선택된 세포-타입, 예를 들어, 암 세포 또는 바이러스-감염된 세포에 대한 세포사멸 면역 반응을 자극하거나 유도할 수 있는 임의의 단백질 또는 펩티드, 이의 유사체 또는 기능적 단편을 지칭한다. 따라서, 다양한 사이토카인이 본원에 기재된 부위에서 Fc에 융합될 수 있는 것으로 고려된다. 유용한 사이토카인은, 예를 들어, 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL), 림포카인(L), 콜로니 자극 인자(CSF), 종 변이체를 포함하는 인터페론(IFN), 이러한 세포사멸 면역 반응을 자극하거나 유도할 수 있는 이의 절단된 유사체를 포함한다. 유용한 종양 괴사 인자는, 예를 들어, TNF를 포함한다. 유용한 림포카인은, 예를 들어, LT를 포함한다. 유용한 콜로니 자극 인자는, 예를 들어, GM-CSF 및 M-CSF를 포함한다. 유용한 인터루킨은, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-15 및 IL-18을 포함한다. 유용한 인터페론은, 예를 들어, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ를 포함한다. 일부 구현예에서, 인터페론은 IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, IFN-τ, IFN-δ, IFN-N, IFN-ω, 또는 IFN-γ이다. 일부 구현예에서, 인터페론은 IFNa1, IFNa2, IFNa4, IFNa5, IFNa6, IFNa7, IFNa8, IFNa10, IFNa13, IFNa14, IFNa16, IFNa17, 또는 IFNa21이다. 일부 구현예에서, 인터페론은 마우스 IFNa4(mIFNa4)이다. 일부 구현예에서, mIFNa4는 SEQ ID NO: 10 또는 NCBI 참조 NP_034634.1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인터페론은 인간 IFNa4(hIFNa4)이다. 일부 구현예에서, hIFNa4는 SEQ ID NO: 129 또는 NCBI 참조 NP_066546.1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35, 또는 IL-36이다.

일부 구현예에서, 사이토카인은 IL4, IL6, 또는 IL10이다. 일부 바람직한 사이토카인은 하기 표에 열거되어 있다.

[표 4]

일부 구현예에서, 사이토카인은, 예를 들어, SEQ ID NO: 93에 제시된 서열을 갖는 IL3(예를 들어, 인간 IL3)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 SEQ ID NO: 94에 제시된 서열을 갖는 IL4(예를 들어, 인간 IL4)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 SEQ ID NO: 95에 제시된 서열을 갖는 IL5(예를 들어, 인간 IL5)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 SEQ ID NO: 96에 제시된 서열을 갖는 IL6(예를 들어, 인간 IL6)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 SEQ ID NO: 97에 제시된 서열을 갖는 IL8(예를 들어, 인간 IL8)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 SEQ ID NO: 98에 제시된 서열을 갖는 IL9(예를 들어, 인간 IL9)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 SEQ ID NO: 99에 제시된 서열을 갖는 IL13(예를 들어, 인간 IL13)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 SEQ ID NO: 100에 제시된 서열을 갖는 IL15(예를 들어, 인간 IL15)이다.

따라서, 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 면역사이토카인이다. 본원에서 사용되는 용어 "면역사이토카인"은 (i) 미리 선택된 항원, 예를 들어, 세포-타입 특이적 항원에 대한 결합 특이성을 갖고 이에 결합할 수 있는 항체 결합 부위, 및 (ii) 전형적으로 암 또는 바이러스-감염된 세포에 대해 세포사멸 면역 반응을 유도하거나 자극할 수 있는 사이토카인의 융합을 지칭한다. 미리 선택된 항원의 예는 암 세포 또는 바이러스-감염된 세포와 같은 세포 표면 항원, 및 예를 들어, 세포막에 부착된 채로 남아 있을 수 있는 괴사 세포의 불용성 세포내 항원을 포함한다. 바람직한 항원은 종양 특이적 항원과 같은 종양 세포 특유의 표적 항원이다. 따라서, 면역사이토카인은 사이토카인이 표적 세포에 대한 국소 면역 반응을 매개할 수 있도록 생체내에서 사이토카인을 표적(이는 전형적으로 세포임)에 선택적으로 전달할 수 있다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 IL7(NCBI Ref: NP_000871.1), IL21(NCBI Ref: NP_068575.1), IL4(NCBI Ref: NP_000580.1), IL6(NCBI Ref: NP_000591.1), 또는 IL10(NCBI Ref: NP_000563.1) 모두 또는 이들의 일부(예를 들어, 가용성 부분)를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 TGFbR2(NCBI Ref: NP_003233.4)의 가용성 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 TGFB1(NCBI Ref: NP_000651.3, 예를 들어, NP_000651.3의 아미노산 292-390), APRIL(NCBI Ref: NP_003799.1, 예를 들어, NP_003799.1의 아미노산 115-250), CD161(NCBI Ref: NP_002249.1, 예를 들어, NP_002249.1의 아미노산 68-225), SOST(NCBI Ref: NP_079513.1, 예를 들어, NP_079513.1의 82-162), B7H4(NCBI Ref: NP_078902.2, 예를 들어, NP_078902.2의 아미노산 29-258), SIGLEC15(NCBI Ref: NP_998767.1, 예를 들어, NP_998767.1의 아미노산 20-263), DLL3(NCBI Ref: NP_982353.1, 예를 들어, NP_982353.1의 아미노산 27-492), 및/또는 MCSFR(CSF1R; NCBI Ref: NP_003799.1, 예를 들어, NP_003799.1의 아미노산 20-512)의 가용성 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 TGFB1(NCBI Ref: NP_000651.3), APRIL(NCBI Ref: NP_003799.1), CD161(NCBI Ref: NP_002249.1), SOST(NCBI Ref: NP_079513.1), B7H4(NCBI Ref: NP_078902.2), SIGLEC15(NCBI Ref: NP_998767.1), DLL3(NCBI Ref: NP_982353.1), 및/또는 MCSFR(CSF1R; NCBI Ref: NP_003799.1) 모두 또는 이들의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 이들 서열과 적어도 또는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 동일하다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 14의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 15의 전부 또는 일부를 포함한다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 작용제이다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 길항제이다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 단쇄 가변 단편(scFv)이다. 일부 구현예에서, scFv는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, scFv는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 16의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 132의 전부 또는 일부를 포함한다.

일부 구현예에서, scFv는 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, scFv는 CD40에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO: 16의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 132의 전부 또는 일부를 포함한다.

일부 구현예에서, scFv는 CD86에 특이적으로 결합한다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 대상체에서 면역 반응을 유도하도록 구성된 항원이다. 따라서, 본 개시는 또한 대상체에서 항체를 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 변형된 면역글로불린을 선택적으로 애주번트와 함께 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 변형된 면역글로불린은 항원 제시 세포를 특이적으로 표적화할 수 있고(예를 들어, 항원 제시 세포 상의 마커를 표적화함으로써), 항원 제시 세포에 항원을 효과적으로 전달할 수 있고, 이에 의해 이러한 항원에 대한 항체 생산 효율을 증가시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 적어도 또는 약 5 kD, 6 kD, 7 kD, 8 kD, 9 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD, 40 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD, 또는 100 kD의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 최대 5 kD, 6 kD, 7 kD, 8 kD, 9 kD, 10 kD, 20 kD, 30 kD, 40 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD, 또는 100 kD의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 기능성 단백질이고, 50 kD 미만이다.

일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 적어도 또는 약 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 또는 1000개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 최대 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 또는 1000개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 약 50개 내지 400개의 아미노산 잔기, 약 50개 내지 300개의 아미노산 잔기, 약 50개 내지 200개의 아미노산 잔기, 약 100개 내지 300개의 아미노산 잔기, 또는 약 100개 내지 200개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 기능성 단백질이고, 500개 미만의 아미노산 잔기를 갖는다.

링커 서열

폴리펩티드는 선택적으로 링커 서열을 통해 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드(예를 들어, CH3 도메인이 있는 중쇄를 갖는 폴리펩티드)의 본원에 기재된 임의의 부위(예를 들어, 3A 부위 및/또는 C-말단)에 융합될 수 있다.

일부 구현예에서, 링커 서열은 적어도 또는 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 적어도 또는 약 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 20개, 25개, 30개, 또는 40개의 글리신 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 세린 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 글리신 잔기와 세린 잔기 둘 모두를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30) 또는 GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 124)와 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 9) 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO: 90)와 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 적어도 또는 적어도 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의, GGGGS(SEQ ID NO: 31)의 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 최대 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개의 아미노산 잔기를 포함한다.

일 양태에서, 폴리펩티드는 변형된 면역글로불린의 중쇄 CH3 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 삽입된 폴리펩티드는 N-말단 링커 서열 및 C-말단 링커 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "N-말단 링커 서열"은 삽입된 또는 융합된 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 링커 서열을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "C-말단 링커 서열"은 삽입된 또는 융합된 폴리펩티드의 C-말단에 위치한 링커 서열을 지칭한다. N-말단 링커 서열 및 C-말단 링커 서열은 동일하거나 상이할 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 링커 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

항체 및 항원-결합 단편

본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 다양한 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원은 종양-관련 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 면역 세포 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 면역 체크포인트 분자이다.

일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 작용제이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 길항제이다.

본 개시는 CTLA4에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 항원-결합 단편은 CTLA4에 결합할 수 있고, CTLA4 억제 경로를 억제하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 개시는 마우스 항-CTLA4 항체 4G12 및 이의 인간화 항체를 제공한다.

4G12, 및 4G12 유래된 항체에 대한 CDR 서열은 카바트 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 54 내지 SEQ ID NO: 56, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 57 내지 SEQ ID NO: 59를 포함한다(도 49 참조). 코티아 넘버링 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 SEQ ID NO: 66 내지 SEQ ID NO: 68에 제시되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 SEQ ID NO: 69 내지 SEQ ID NO: 71에 제시된다(도 50 참조).

4G12, 및 4G12 유래된 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)에 대한 아미노산 서열이 또한 제공된다. 인간화 4G12 항체(예를 들어, CT4-4G12-IgG1)의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 44에 제시된다. 인간화 CT4-4G12 항체(예를 들어, CT4-4G12-IgG1)의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 45에 제시된다. 마우스 4G12 항체의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 50에 제시된다. 마우스 4G12 항체의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 51에 제시된다.

일부 구현예에서, CT4-4G12-IgG1의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 42 및 SEQ ID NO: 43에 제시된다. 일부 구현예에서, 4G12, 또는 4G12 유래된 항체(예를 들어, 인간화 항체)는 IgG1 또는 IgG4 아형을 갖는다.

CTLA4 항체 4G12의 세부 사항은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제PCT/CN2017/102816호에서 찾아볼 수 있다.

본 개시는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 항원-결합 단편은 OX40에 결합할 수 있고, OX40 신호전달 경로를 촉진하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 개시는 마우스 항-OX40 항체 9H3 및 이의 인간화 항체를 제공한다.

9H3, 및 9H3 유래된 항체에 대한 CDR 서열은 카바트 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 60 내지 SEQ ID NO: 62, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 63 내지 SEQ ID NO: 65를 포함한다(도 49 참조). 코티아 넘버링 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 SEQ ID NO: 72 내지 SEQ ID NO: 74에 제시되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 SEQ ID NO: 75 내지 SEQ ID NO: 77에 제시된다(도 50 참조).

9H3, 및 9H3 유래된 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)에 대한 아미노산 서열이 또한 제공된다. 인간화 9H3 항체(예를 들어, O40-9H3-IgG1)의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 48에 제시된다. 인간화 9H3 항체(예를 들어, 9H3-IgG1)의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 49에 제시된다. 마우스 9H3 항체의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 52에 제시된다. 마우스 9H3 항체의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 53에 제시된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 scFv는 9H3, 및 9H3 유래된 항체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 9H3, 또는 9H3 유래된 항체(예를 들어, 인간화 항체)는 IgG1 아형을 갖는다.

항-OX40 항체 9H3의 세부 사항은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제PCT/CN2017/112832호에서 찾아볼 수 있다.

본 개시는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 항원-결합 단편은 PD-L1에 결합할 수 있고, PD1/PD-L1 신호전달 경로를 차단하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 개시는 마우스 항-PD-L1 항체 3F2 및 이의 인간화 항체를 제공한다.

3F2, 및 3F2 유래된 항체에 대한 CDR 서열은 카바트 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 18 내지 SEQ ID NO: 20, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 21 내지 SEQ ID NO: 23을 포함한다(도 49 참조). 코티아 넘버링 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 SEQ ID NO: 78 내지 SEQ ID NO: 80에 제시되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 SEQ ID NO: 81 내지 SEQ ID NO: 83에 제시된다(도 50 참조).

일부 구현예에서, PDL1-3F2-IgG1의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 36 및 SEQ ID NO: 37에 제시된다.

일부 구현예에서, 3F2, 또는 3F2 유래된 항체(예를 들어, 인간화 항체)는 IgG1 또는 IgG4 아형을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 scFv는 3F2, 및 3F2 유래된 항체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 3F2로부터 유래된 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 17에 제시된다.

항-PD-L1 항체 3F2의 세부 사항은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제PCT/CN2020/075983호에서 찾아볼 수 있다.

본 개시는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 항원-결합 단편은 PD-1에 결합할 수 있고, PD1 신호전달 경로를 억제하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 개시는 마우스 항-PD-1 항체 1A7 및 이의 인간화 항체를 제공한다.

1A7, 및 1A7 유래된 항체에 대한 CDR 서열은 카바트 넘버링에 의해 정의된 바와 같은 중쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 24 내지 SEQ ID NO: 26, 및 경쇄 가변 도메인의 CDR, SEQ ID NO: 27 내지 SEQ ID NO: 29를 포함한다(도 49 참조). 코티아 넘버링 하에, 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열은 SEQ ID NO: 84 내지 SEQ ID NO: 86에 제시되고, 경쇄 가변 도메인의 CDR은 SEQ ID NO: 87 내지 SEQ ID NO: 89에 제시된다(도 50 참조).

1A7, 및 1A7 유래된 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)에 대한 아미노산 서열이 또한 제공된다. 인간화 1A7 항체(예를 들어, PD1-1A7-IgG4)의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 40에 제시된다. 인간화 1A7 항체(예를 들어, PD1-1A7-IgG4)의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 41에 제시된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 scFv는 1A7, 및 1A7 유래된 항체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 1A7, 또는 1A7 유래된 항체(예를 들어, 인간화 항체)는 IgG1 또는 IgG4 아형을 갖는다.

항-PD-1 항체 1A7의 세부 사항은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제PCT/CN2018/077016호에서 찾아볼 수 있다.

본 개시는 CD40에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 항원-결합 단편은 CD40에 결합할 수 있고, CD40 신호전달 경로를 촉진하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 본 개시는 마우스 항-CD40 항체 6A7 및 이의 인간화 항체를 제공한다.

6A7, 및 6A7 유래된 항체의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)에 대한 아미노산 서열이 또한 제공된다. 인간화 6A7 항체(예를 들어, C40-6A7-IgG2)의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 91에 제시된다. 인간화 6A7 항체(예를 들어, C40-6A7-IgG2)의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 92에 제시된다.

일부 구현예에서, 6A7, 또는 6A7 유래된 항체(예를 들어, 인간화 항체)는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 아형을 갖는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 scFv는 6A7, 및 6A7 유래된 항체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 6A7로부터 유래된 scFv의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16에 제시된다. 일부 구현예에서, 6A7로부터 유래된 scFv는 scFv 안정성을 증가시키기 위해 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 돌연변이를 포함한다.

항-CD40 항체 6A7의 세부 사항은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제PCT/CN2018/096494호에서 찾아볼 수 있다.

일부 구현예에서, 항-CD40 항체(예를 들어, 셀리크렐루맙)의 중쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 130에 제시된다. 일부 구현예에서, 항-CD40 항체(예를 들어, 셀리크렐루맙)의 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 131에 제시된다.

IL12 경로를 표적화하는 단백질 복합체

본 개시는 IL12 경로를 표적화하는 단백질 복합체를 제공한다. 일부 구현예에서, 단백질 복합체는 변형된 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL12(예를 들어, 인간 IL12)이다. 일부 구현예에서, IL12는 IL12a이다. 일부 구현예에서, IL12a는 마우스 IL12a(mIL12a)이다. 일부 구현예에서, mIL12a는 SEQ ID NO: 125와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mIL12a는 NCBI 참조 NP_001152896.1 또는 NP_032377.1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL12a는 인간 IL12a(hIL12a)이다. 일부 구현예에서, hIL12a는 SEQ ID NO: 127과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hIL12a는 NCBI 참조 NP_000873.2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인터루킨 12는 IL12b이다. 일부 구현예에서, IL12b는 마우스 IL12b(mIL12b)이다. 일부 구현예에서, mIL12b는 SEQ ID NO: 126과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mIL12b는 NCBI 참조 NP_001290173.1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL12b는 인간 IL12b(hIL12b)이다. 일부 구현예에서, hIL12b는 SEQ ID NO: 128과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hIL12b는 NCBI 참조 NP_002178.2와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인터루킨 12 폴리펩티드는 본원에 기재된 링커 서열과 선택적으로 연결된 IL12a 및 IL12b 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, IL12a 및 IL12b는 비-공유 상호작용에 의해 서로 회합하여 기능성 IL12 단위를 형성한다.

일 양태에서, 본 개시는 면역조절 모이어티와 융합된 표적화 모이어티를 포함하는 단백질 복합체에 관한 것이다. 일부 구현예에서, (a) 표적화 모이어티는 PD-1 리간드에 특이적으로 결합하고; 및 (b) 면역조절 모이어티는 인터루킨-12 수용체(IL12R)에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용되는 "표적화 모이어티"는 특정 분자 또는 세포 성분을 국소화하고 이에 결합하는 능력을 갖는 분자를 지칭한다. 표적화 모이어티는 항체, 항체 단편, scFv, Fc-함유 폴리펩티드, 융합 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 앱타머, 리간드, 핵산, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 세포 또는 조직에 존재하는 분자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 이환된 세포 또는 조직, 예를 들어, 암 세포 또는 종양에서 분자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 분자는 정상 세포 또는 조직, 예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 면역 반응을 조절하는 세포 또는 세포외 분자에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 PD-1 리간드(예를 들어, PD-L1)에 결합한다. 본원에서 사용되는 "면역조절 모이어티"는 면역 세포(예를 들어, T 세포, 조절 T 세포, 골수 억제 세포, 또는 수지상 세포)의 특정 구성요소에 결합하고 면역 세포의 수 또는 기능을 조절하는 리간드, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 Fc-함유 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, "면역조절 모이어티"는 면역계를 조절하는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 공동-자극 분자, 또는 공동-억제 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 IL-12R에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 결합된 분자의 기능을 증가시키는 작용제이다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 항체 또는 항원-결합 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), Fc-함유 폴리펩티드, 또는 IL12R에 특이적으로 결합하는 융합 단백질을 포함한다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 IL12R 작용제이다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 IL12를 포함한다. 일부 구현예에서, IL12는 IL12a(예를 들어, 인간 IL12a), IL12b(예를 들어, 인간 IL12b), 및/또는 이의 변이체를 포함한다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 PD-1 리간드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), Fc-함유 폴리펩티드, 또는 융합 단백질을 포함한다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 전장 항체를 포함한다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 PD-1의 세포외 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, PD-1 리간드는 PD-L1 또는 PD-L2이다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 PD-1과 PD-1 리간드 사이의 상호작용을 차단한다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 PD-1 리간드와 1 Х 10^-8 M 미만 또는 1 Х 10^-9 M 미만의 KD를 갖는다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티 및 면역조절 모이어티는 스캐폴드 단백질(예를 들어, 알부민)에 융합된다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 PD-1 리간드 및 IL12R에 결합한다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 IL12R에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 면역조절 모이어티를 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 PD-1 리간드에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 표적화 모이어티를 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 2개의 CH3 도메인을 포함하는 Fc를 포함한다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 Fc에서 2개의 CH3 도메인의 CH3 도메인에 연결된다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 2개의 CH3 도메인의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 Fc의 2개의 CH3 도메인의 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 IL12a 및 IL12b를 포함한다. 일부 구현예에서, IL12a는 Fc에 연결된다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 IL12a 및 IL12b를 포함한다. 일부 구현예에서, IL12b는 Fc에 연결된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 Fc에서 2개의 CH3 도메인의 CH3 도메인에 연결된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 Fc에서 2개의 CH3 도메인의 CH3 도메인의 C-말단에 연결된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 Fc의 2개의 CH3 도메인의 CH3 도메인에 융합된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 scFv(예를 들어, PD-1 리간드를 표적화하는 scFv)를 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 2개의 경쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 2개의 경쇄 중 하나에 연결된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 2개의 경쇄 중 하나에 연결된다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 인터페론(예를 들어, IFNa1, IFNa2, IFNa3, IFNa4, 및/또는 IFNγ)을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 사이토카인(예를 들어, IL2, IL7, IL15, IL18, 및/또는 IL21)을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 인터페론 또는 사이토카인은 링커 서열에 의해 단백질 복합체에 연결된다.

일부 구현예에서, 단백질 복합체는 링커 서열 (GGGGS)n을 포함한다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 수 있다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2 또는 IgG4)이다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 상보성 결정 영역(CDR) 1, 2, 및 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.

일부 구현예에서, VH CDR1 영역은 선택된 VH CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2 영역은 선택된 VH CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3 영역은 선택된 VH CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL CDR1 영역은 선택된 VL CDR1 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2 영역은 선택된 VL CDR2 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR3 영역은 선택된 VL CDR3 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택된 VH CDR 1, 2, 및 3 아미노산 서열 및 선택된 VL CDR, 1, 2, 및 3 아미노산 서열은 하기 중 하나이다:

(1) 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3에 제시되고, 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6에 제시되고;

(2) 선택된 VH CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9에 제시되고, 선택된 VL CDR 1, 2, 3 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12에 제시된다.

일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, 또는 SEQ ID NO: 19와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.

일부 구현예에서, 면역조절 모이어티는 SEQ ID NO: 28과 적어도 80% 동일한 서열 및 SEQ ID NO: 29와 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.

일 양태에서, 본 개시는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단백질 복합체를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 대상체는 PD-L1-발현 암을 갖는다.

일부 구현예에서, 암은 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체 치료에 내성이다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 유효량의 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

일 양태에서, 본 개시는 대상체에서 종양 미세환경에서의 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단백질 복합체를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시는 대상체의 종양 미세환경에서 T 세포를 활성화시키는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단백질 복합체를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시는 IL12를 대상체에 전달할 때 IL12 독성을 감소시키는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단백질 복합체를 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시는 치료제에 공유 결합된 본원에 기재된 바와 같은 단백질 복합체를 포함하는 단리된 분자에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 치료제는 세포독성제 또는 세포정지제이다.

일 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 복합체; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 복합체를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 개시는 단백질 복합체를 생산하기 위한 방법으로서, 단백질 복합체를 생산하기에 적합한 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 본 개시는 융합된 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 융합된 폴리펩티드는 IL12a(NCBI Ref: NP_000873.2)의 전부 또는 일부를 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 사이토카인은 IL12이다. 일부 구현예에서, IL12는 IL12b(예를 들어, 인간 IL12b)를 포함한다. 일부 구현예에서, IL12는 IL12a 및/또는 IL12b의 변이체(예를 들어, 융합된 단백질 또는 이의 절두된 단백질)를 포함한다. 일부 구현예에서, IL12는 신호 펩티드(예를 들어, IL12a 또는 IL12b의 신호 펩티드)를 포함하지 않는다.

변형된 면역글로불린을 제조하는 방법

본 개시는 또한 본원에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 본원에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 재조합 벡터(예를 들어, 발현 벡터), 재조합 벡터가 도입된(즉, 숙주 세포가 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유하도록) 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 변형된 면역글로불린의 생산을 제공한다.

본원에서 사용되는 "벡터"는 벡터가 숙주 세포에 도입된 경우, 숙주 세포에 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 전달할 수 있는 임의의 작제물이다. "발현 벡터"는 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드(들)를 전달하고, 인코딩된 폴리펩티드로 발현할 수 있다. 따라서, 발현 벡터에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에서, 또는 숙주 세포의 게놈에서 관심 폴리뉴클레오티드의 통합 부위에 있거나, 그 부근에 있거나, 또는 그를 측접하는 프로모터, 인핸서 및/또는 폴리-A 테일(poly-A tail)과 같은 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는 것에 의해 벡터 내에서 발현을 위해 위치되어, 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에서 관심 폴리뉴클레오티드가 번역될 것이다.

벡터는 당분야에 공지된 방법, 예를 들어, 전기천공(electroporation), 화학적 형질감염(예를 들어, DEAE-덱스트란), 형질전환, 형질감염 및 감염 및/또는 형질도입(예를 들어, 재조합 바이러스에 의한 것)에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 벡터의 비-제한적 예는 바이러스 벡터(재조합 바이러스를 생성하기 위해 이용될 수 있음), 네이키드(naked) DNA 또는 RNA, 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파지 벡터(phage vector) 및 양이온성 축합제(cationic condensing agent)와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함한다.

발현 벡터는 적어도 하나의 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 마커는, 예를 들어, 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 환원 효소 또는 네오마이신 내성과 이. 콜라이 및 기타 박테리아에서 배양하기 위한 테트라사이클린 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 세포와 같은 박테리아 세포; 효모 세포와 같은 진균 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS, 보우즈 흑색종(Bowesmelanoma) 및 HK 293 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본원에 기재된 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 조건은 당분야에 공지되어 있다.

번역된 단백질을 소포체의 내강, 주변 세포질 공간 또는 세포외 환경으로 분비하기 위해, 적절한 분비 신호가 발현된 폴리펩티드에 혼입될 수 있다. 신호는 폴리펩티드에 내인성이거나 이종 신호일 수 있다.

항체 또는 항원 결합 단편에 대한 추가 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)는 Fc 영역에 도입되고, 이에 의해 이러한 영역에서 쇄간 이황화 결합 형성을 가능하게 할 수 있다. 이에 따라 생성된 동종이량체 항체는 시험관내 및/또는 생체내에서 임의의 증가된 반감기를 가질 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내에서 증가된 반감기를 갖는 동종이량체 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Wolff et al., "Monoclonal antibody homodimers: enhanced antitumor activity in nude mice." Cancer research 53.11 (1993): 2560-2565]에 기재된 바와 같은 이종이작용성 가교제를 이용하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체가 조작될 수 있다.

일부 구현예에서, 변형된 면역글로불린에 대해 공유 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 공유 변형은 화학적 또는 효소적 합성에 의해, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 다른 유형의 공유 변형이 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 항체 또는 단편의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시킴으로써 분자에 도입된다.

일부 구현예에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 결합된 푸코스(fucose)가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 그러한 항체 조성물 중의 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어, 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같은, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같은 Asn297에 결합된 모든 당구조(glycostructure)(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)의 합 대비 Asn297에서 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 위치 약 297(Fc 영역 잔기들의 Eu 넘버링; 또는 카바트 넘버링에서 위치 314)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; 항체 중 소수의 서열 변이로 인해, Asn297은 또한 위치 297의 상류 또는 하류 약 ±3개의 아미노산 위치, 즉, 위치 294과 위치 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 글리칸 이질성을 감소시키기 위해, 항체의 Fc 영역은 위치 297에서 아스파라긴을 알라닌으로 대체(N297A)하도록 추가로 조작될 수 있다.

일부 구현예에서, Fab-아암 교환(Fab-arm exchange)을 피하는 것에 의해 생산 효율성을 촉진하기 위해, IgG4의 위치 228(EU 넘버링)에서 세린을 프롤린으로 대체하도록(S228P) 항체의 Fc 영역을 추가로 조작하였다. S228 돌연변이에 관한 상세한 설명이, 예를 들어, 그 전체가 참조로 포함되는 문헌[Silva et al. "The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation." Journal of Biological Chemistry 290.9 (2015): 5462-5469]에 기재되어 있다.

본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레오티드 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 아미노산 서열과 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 임의의 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 500개, 또는 600개 미만의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 또는 500개 미만의 아미노산 잔기이다.

일부 구현예에서, 아미노산 서열은 (i) 아미노산 서열을 포함하거나; (ii) 아미노산 서열로 이루어지고, 여기서 아미노산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 서열 중 어느 하나이다.

일부 구현예에서, 핵산 서열은 (i) 핵산 서열을 포함하거나; (ii) 핵산 서열로 이루어지고, 여기서 핵산 서열은 본원에 기재된 바와 같은 서열 중 어느 하나이다.

두 개의 아미노산 서열, 또는 두 개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적으로 정렬된다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 이 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열이 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 이후 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그러한 위치에서 동일하다(본원에서 사용되는 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 같음). 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다. 예를 들어, 서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 12의 갭 페널티, 4의 갭 확장 페널티, 및 5의 프레임시프트 갭 페널티를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하여 달성될 수 있다.

치료 방법

본원에 기재된 바와 같은 변형된 면역글로불린은 다양한 치료 목적을 위해 이용될 수 있다.

일 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법, 대상체에서 시간의 경과에 따라 종양의 부피 증가 속도를 감소시키는 방법, 전이가 발생할 위험을 감소시키는 방법, 또는 대상체에서 추가적인 전이가 발생할 위험을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료는 암의 진행을 중단시키거나, 둔화시키거나, 지연시키거나, 또는 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 대상체에서 암의 하나 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 지속기간의 감소를 가져올 수 있다.

일 양태에서, 본 개시는 필요로 하는 대상체(예를 들어, 암, 예를 들어, 유방암(예를 들어, 3중-음성 유방암(triple-negative breast cancer)), 유암종(carcinoid cancer), 자궁경부암, 자궁내막암, 신경교종, 두경부암, 간암, 폐암, 소세포폐암, 림프종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 결장직장암, 위암, 고환암, 갑상선암, 방광암, 요도암, 또는 혈액 악성종양을 갖거나, 갖는 것으로 확인되거나 또는 진단된 대상체)에게 치료적 유효량의 본원에 개시된 변형된 면역글로불린을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 상기 암은 절제불능 흑색종 또는 전이성 흑색종, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 소세포 폐암(SCLC), 방광암, 또는 전이성 호르몬-불능성 전립선암(metastatic hormone-refractory prostate cancer)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 고형 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 암은 두경부 편평세포암종(SCCHN), 신장 세포 암종(RCC), 삼중-음성 유방암(TNBC), 또는 결장직장 암종이다. 일부 구현예에서, 대상체는 호지킨 림프종을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 삼중 음성 유방암(TNBC), 위암, 요로상피암, 메르켈-세포 암종, 또는 두경부암을 갖는다. 일부 구현예에서, 암은 흑색종, 췌장 암종, 중피종, 혈액 악성종양, 특히 비호지킨 림프종, 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 또는 진행성 고형 종양이다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 암의 위험이 있는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 암이 있는 환자는 당분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 확인될 수 있다.

일 양태에서, 본 개시는 비정상적인 또는 원치 않는 면역 반응과 관련된 장애, 예를 들어, 자가면역 장애를 치료하거나, 예방하거나, 이의 발병 위험성을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 염증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 염증성 또는 자가면역 질환은 관절염, 대장염, 건선, 천식, 크론병, 또는 다발성 경화증이다.

본원에서 사용되는 "유효량"은 질환, 예를 들어, 암, 또는 자가면역 질환의 진행의 중단, 둔화, 지연, 또는 억제를 포함한 유용한 또는 원하는 결과를 가져오기에 충분한 양 또는 투여량을 의미한다. 유효량은, 예를 들어, 치료제가 투여될 대상체의 연령 및 체중, 증상의 중증도 및 투여 경로에 따라 변할 것이고, 따라서, 투여는 개별적 기준으로 결정될 수 있다.

유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 예로서, 변형된 면역글로불린의 유효량은 환자에서 자가면역 질환 또는 암의 진행을 개선하고, 중단하고, 안정화시키고, 역전시키고, 억제하고, 둔화시키고 및/또는 지연시키기에 충분한 양이거나, 시험관내에서 세포(예를 들어, 생검된 세포, 본원에 기재된 임의의 암세포, 또는 세포주(예를 들어, 암세포주))의 증식을 개선하고, 중단하고, 안정화시키고, 역전시키고, 둔화시키고 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 당분야에서 이해되는 바와 같이, 변형된 면역글로불린의 유효량은, 특히, 환자 병력뿐만 아니라 사용되는 치료제의 타입(및/또는 투여량)과 같은 기타 인자에 따라 변할 수 있다.

본원에 개시된 변형된 면역글로불린, 및/또는 조성물을 투여하기 위한 유효량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있고, 그러한 결정을 내리는 것은 당업자의 기술 내에 속한다. 당업자는 투여되어야 하는 투여량이, 예를 들어, 본원에 개시된 변형된 면역글로불린, 및/또는 조성물을 투여 받을 포유동물, 투여 경로, 사용되는 본원에 개시된 변형된 면역글로불린, 및/또는 조성물의 특정한 타입 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 다를 것이라는 점을 이해할 것이다.

변형된 면역글로불린의 유효량의 전형적인 일일 투여량은 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg(환자의 체중 kg 당 mg)이다. 일부 구현예에서, 투여량은 100 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg 미만일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.05 mg/kg, 또는 0.01 mg/kg 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.2 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg이다.

본원에 기재된 임의의 방법에서, 변형된 면역글로불린, 또는 약학적 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 변형된 면역글로불린, 또는 약학적 조성물), 및, 선택적으로, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 대상체에게 주당 적어도 1회(예를 들어, 주당 1회, 주당 2회, 주당 3회, 주당 4회, 1일 l회, 1일 2회, 또는 1일 3회) 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 면역글로불린 및 적어도 하나의 추가적인 치료제는 동일한 조성물(예를 들어, 액체 조성물)로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 변형된 면역글로불린 및 적어도 하나의 추가적인 치료제는 2종의 상이한 조성물(예를 들어, 적어도 하나의 변형된 면역글로불린을 함유하는 액체 조성물 및 적어도 하나의 추가적인 치료제를 함유하는 고체 경구 조성물)로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 알약, 정제, 또는 캡슐로 투여된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 지연-방출형 경구 제형(sustained-release oral formulation)으로 투여된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 변형된 면역글로불린의 투여 전에 또는 그 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제 및 적어도 하나의 변형된 면역글로불린은 대상체에서 하나 이상의 추가적인 치료제 및 적어도 하나의 변형된 면역글로불린의 생체활성 기간이 중첩되도록 대상체에게 투여된다.

일부 구현예에서, 대상체에 연장된 기간에 걸쳐(예를 들어, 적어도 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 또는 5년의 기간에 걸쳐) 적어도 하나의 변형된 면역글로불린이 투여될 수 있다. 숙련된 의료 전문가가 진단을 위한 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하거나 치료의 유효성(예를 들어, 암의 적어도 하나의 증상의 관찰)에 따라 치료 기간의 길이를 결정할 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 추가적인 치료제는 B-Raf의 억제제, EGFR 억제제, MEK의 억제제, ERK의 억제제, K-Ras의 억제제, c-Met의 억제제, 역형성 림프종 키나제(anaplastic lymphoma kinase; ALK)의 억제제, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(phosphatidylinositol 3-kinase; PI3K)의 억제제, Akt의 억제제, mTOR의 억제제, 이중 PI3K/mTOR 억제제, 브루톤 티로신 키나제(Bruton's tyrosine kinase; BTK)의 억제제 및 이소시트레이트 데하이드로게나제 1(Isocitrate dehydrogenase 1; IDH1) 및/또는 이소시트레이트 데하이드로게나제 2(Isocitrate dehydrogenase 2; IDH2)의 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1(IDO1)의 억제제(예를 들어, 에파카도스타트(epacadostat))이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 HER3의 억제제, LSD1의 억제제, MDM2의 억제제, BCL2의 억제제, CHK1의 억제제, 활성화된 헤지호그 신호전달(hedgehog signaling) 경로의 억제제 및 에스트로겐 수용체를 선택적으로 분해하는 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 트라벡테딘(Trabectedin), nab-파클리탁셀, 트레바나닙(Trebananib), 파조파닙(Pazopanib), 세디라닙(Cediranib), 팔보시클립(Palbociclib), 에베롤리무스(everolimus), 플루오로피리미딘(fluoropyrimidine), IFL, 레고라페닙(regorafenib), 레오라이신(Reolysin), 알림타(Alimta), 지카디아(Zykadia), 수텐트(Sutent), 템시롤리무스(temsirolimus), 악시티닙(axitinib), 에베롤리무스(everolimus), 소라페닙(sorafenib), 보트리엔트(Votrient), 파조파닙(Pazopanib), IMA-901, AGS-003, 카보잔티닙(cabozantinib), 빈플루닌(Vinflunine), Hsp90 억제제, Ad-GM-CSF, 테마졸로미드(Temazolomide), IL-2, IFNa, 빈블라스틴(vinblastine), 탈로미드(Thalomid), 다카르바진(dacarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 레날리도미드(lenalidomide), 아자시티딘(azacytidine), 레날리도미드(lenalidomide), 보르테조미드(bortezomid), 암루비신(amrubicine), 카르필조밉(carfilzomib), 프랄라트렉세이트(pralatrexate) 및 엔자스타우린(enzastaurin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 애주번트, TLR 작용제, 종양 괴사 인자(TNF) 알파, IL-1, HMGB1, IL-10 길항제, IL-4 길항제, IL-13 길항제, IL-17 길항제, HVEM 길항제, ICOS 작용제, CX3CL1을 표적화하는 치료제, CXCL9을 표적화하는 치료제, CXCL10을 표적화하는 치료제, CCL5을 표적화하는 치료제, LFA-1 작용제, ICAM1 작용제 및 셀렉틴(Selectin) 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 카르보플라틴, nab-파클리탁셀, 파클리탁셀, 시스플라틴, 페메트렉세드(pemetrexed), 겜시타빈, FOLFOX, 또는 FOLFIRI가 대상체에게 투여된다.

일부 구현예에서, 추가적인 치료제는 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체, 또는 항-GITR 항체이다.

약학적 조성물 및 투여 경로

또한, 본원에 기재된 변형된 면역글로불린 중 적어도 1개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 또는 4개)를 함유하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 임의의 변형된 면역글로불린 중 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 또는 4개)이 임의의 조합으로 약학적 조성물에 존재할 수 있다. 약학적 조성물은 당분야에 공지된 임의의 방식으로 제형화될 수 있다.

"약학적으로 허용되는 담체"는 대상체에게 생체활성이 허용되고 무독성인, 활성 성분 이외의 약학적 제형의 성분을 지칭한다. 본원에 개시된 약학적 조성물에 사용하기 위한 약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 액체, 겔, 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분배제, 봉쇄제 또는 킬레이트제, 희석제, 애주번트, 부형제, 또는 비독성 보조 물질, 당분야에 공지된 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합을 포함한다. 일부 적합한 성분은, 예를 들어, 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대, 당 및 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는, 예를 들어, 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 소듐 티오설페이트, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화된 하이드록사니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 제공된 약학적 조성물에 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제의 포함은 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체의 산화를 감소시킨다. 이러한 산화의 감소는 결합 친화성의 손실을 방지하거나 감소시켜, 단백질 안정성을 개선하고 저장 수명을 최대화한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 개시된 폴리펩티드 복합체 또는 이중특이적 폴리펩티드 복합체 및 하나 이상의 항산화제, 예컨대, 메티오닌을 포함하는 조성물이 제공된다.

약학적 조성물은 또한 이들의 의도된 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하, 또는 복강내)와 양립가능하도록 제형화된다. 조성물의 제제는 앰플, 일회용 주사기, 또는 다중 용량 바이알에 제형화되고 봉입될 수 있다. 필요한 경우(예를 들어, 주사용 제형에서와 같이), 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대, 레시틴, 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 변형된 면역글로불린의 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴)를 포함함으로써 연장될 수 있다. 대안적으로, 제어 방출은 생분해성, 생체적합성 폴리머(예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산)를 포함할 수 있는 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 변형된 면역글로불린 중 하나 이상을 함유하는 조성물은 투여 단위형(즉, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 물리적으로 별개인 단위)로의 비경구(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피내, 피하 또는 복강내) 투여를 위해 제형화될 수 있다.

비경구 투여용 약학적 조성물은 바람직하게는 멸균되고 실질적으로 등장성이고 우수 의약품 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practice; GMP) 조건 하에 제조된다. 약학적 조성물은 단위 투여형(즉, 단일 투여를 위한 투여량)으로 제공될 수 있다. 주사를 위해, 변형된 면역글로불린은 주사 부위에서 불편함을 감소시키기 위해 수용액, 바람직하게는 생리학적으로-적합한 완충액으로 제형화될 수 있다.

예시적인 용량은 대상체의 체중 킬로그램 당 본원에 기재된 임의의 변형된 면역글로불린의 밀리그램 또는 마이크로그램 양(예를 들어, 약 1 μg/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 μg/kg 내지 약 500 mg/kg; 약 100 mg/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 10 μg/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 10 μg/kg 내지 약 0.5 mg/kg; 약 1 μg/kg 내지 약 50 μg/kg; 약 1 mg/kg kg 내지 약 10 mg/kg; 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg)을 포함한다. 이러한 용량은 광범위한 범위를 포괄하지만, 당업자는 변형된 면역글로불린을 포함하는 치료제의 역가가 다양하고, 유효량은 당분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 전형적으로, 처음에는 비교적 낮은 용량이 투여되고, 담당 의료 전문가 또는 수의학 전문가(치료 적용의 경우) 또는 연구원(아직 개발 단계에서 작업하는 경우)은 적절한 반응이 얻어질 때까지 후속하여 점진적으로 용량을 증가시킬 수 있다. 또한, 임의의 특정 대상체에 대한 특정 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식이, 생체내에서 변형된 면역글로불린의 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도, 및 반감기를 포함하는 다양한 요인들에 좌우될 것임이 이해된다.

약학적 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다. 본 개시는 또한 본원에 기재된 바와 같은 다양한 용도를 위한 변형된 면역글로불린을 제조하는 방법을 제공한다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술되며, 하기 실시예는 청구항에 기재된 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1. 항체를 제조하고 정제하는 방법

ExpiCHO-S 세포(Thermo-Fisher, GIBCO, 카탈로그 #A29133)를 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 플라스미드(1:1의 몰비)로 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 35℃에서 그리고 8% CO₂로 진탕 인큐베이터에서 배양하였다. 12일 후에 세포 배양물로부터 상청액을 수집하였다. 이어서, 항체를 AKTA^TM AVANT150 시스템과 연결된 단백질 A 비드로 충전된 크로마토그래피 컬럼에 의해 정제하였다.

실시예 2. C-말단 또는 Fab 영역에서의 PD-L1 항체 변형

다양한 치료 목적을 위해 많은 이중특이적 항체 형식 및 면역사이토카인 형식이 제안된다(예를 들어, 도 20a 내지 도 20d 참조). 이들의 개념적 이점에도 불구하고, 이러한 항체를 만들고 제조하는 것은 어렵다. 이들 항체 형식에 대한 많은 기존 제조 접근법은 낮은 효율로 인해 곤란을 야기하고, 복잡한 정제 공정에 의해 제한된다. 노브-인-홀 변형을 갖는 이중특이적 항체의 경우에도, 이들은 여전히 쌍형성오류 및 저수율 문제를 가졌다.

이러한 이중특이적 항체 및 면역사이토카인의 발현 효율 및 안정성을 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 플라스미드는 항-PD-L1 IgG1 항체(PDL1-아벨루맙; 중쇄 SEQ ID NO: 35 및 경쇄 SEQ ID NO: 4)의 중쇄 C-말단에서 연결된 마우스 인터루킨 7(mIL7, 분자량: 17.5 kDa)을 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 작제되었다. 융합 단백질을 PDL1-mIL7-HC로 명명하였고, 이의 구조는 도 20a에 HC로서 예시되어 있다. 사이토카인(예를 들어, mIL7)을 중쇄의 C-말단에 부착하였다.

플라스미드는 또한 mIL7을 항-PD-L1 항체 경쇄(PDL1-mIL7-LC)의 C-말단에 연결하도록 작제되었다. PDL1-mIL7-LC 융합 단백질의 개략적 구조는 도 20a에 LC로서 나타나 있다. 사이토카인(예를 들어, mIL7)을 경쇄의 C-말단에 부착하였다.

2개의 융합 단백질의 발현 수준을 평가하였다. 구체적으로, ExpiCHO-S 세포를 플라스미드에 의해 형질감염시키고, 발현된 융합 단백질을 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 레인 6의 PDL1-mIL7-HC 융합 단백질은 천연 겔에서 다수의 비-표적 밴드를 나타냈다. 레인 11에서 PDL1-mIL7-LC 융합 단백질은 천연 겔에서 어떠한 가시적 밴드도 갖지 않았으며, 낮은 발현 수준을 나타냈다.

PD-L1 항체의 하나의 Fab 아암을 SEQ ID NO: 12에 제시된 서열(NP_068575.1의 아미노산 25-162)을 갖는 인간 인터루킨 21(hIL21)로 대체하도록 비대칭 항체도 발현하였다. 노브-인-홀(KIH) 변형을 또한 Fc 영역에 도입하였다. 융합 단백질 PDL1-hIL21-KIH 구조는 도 20a에 Fab-사이토카인-KIH로서 나타나 있으며, 여기서 원은 hIL21을 나타낸다. 이는 중쇄의 힌지 영역에 연결되어 있으며, 이를 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 2의 결과는 레인 10에서 PDL1-hIL21-KIH가 천연 겔에서 다수의 비-표적 밴드를 나타냈다는 것을 보여주었다.

요약하면, 대칭 구조를 갖는 변형된 항체(예를 들어, PDL1-mIL7-HC, 또는 PDL1-mIL7-LC)에 대한 발현 수준은 상이한 프로젝트 간에 크게 다양하였다. 발현 수준은 낮을 수 있고, 발현된 샘플은 비-표적 단백질을 가졌다. 유사하게, 비대칭 구조를 갖는 변형된 항체(예를 들어, PDL1-hIL21-KIH)는 샘플에서 다량의 비-표적 단백질로 인해 정제하기가 어려웠다.

실시예 3. 3A 부위에서 융합된 PD-L1 항체

도 3에 도시된 바와 같이, 플라스미드는 항-PD-L1 IgG1 항체(PDL1-아벨루맙)의 3A 부위에 융합된 마우스 인터루킨 7 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 작제되었다. 융합 부위가 PD-L1 항체의 중쇄 CH3 도메인의 3A 부위 내에 위치하였기 때문에, 융합 단백질을 PDL1-mIL7-3A로 명명하였다(도 20a에 3A, 중쇄로 나타낸 구조는 SEQ ID NO: 5임).

항체의 중쇄 CH3 도메인의 다른 융합 부위를 또한 시험하였다(도 3). 예를 들어, IL7을 3B 부위(SEQ ID NO: 6); 3C 부위(SEQ ID NO: 7); 및 3D 부위(SEQ ID NO: 8)에서 융합하였다. 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4(SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 3) 중쇄 불변 영역 사이의 서열 정렬은 도 4에 도시되어 있고, 여기서 아미노산 서열은 하기와 같이 제시된다(서열 및 EU 넘버링은 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템(IMGT)에서 확인될 수 있음). IgG1, IgG2 및 IgG4의 이소형(SEQ ID NO: 32 내지 SEQ ID NO: 34)은 도 48a 내지 도 48k에 나타나 있다.

추가로, 마우스 인터페론 알파 4(mIFNa4)(SEQ ID NO: 10)를 링커 서열(SEQ ID NO: 9)을 통해 mIL7-융합된 항-PD-L1 항체 중쇄의 C-말단에 연결하였다(3A-HC로서 도 20a에 도시된 구조). 작제물을 사용하여 CHO 세포를 형질감염시키고 발현 수준을 평가하였다. 하기 표에 도시된 바와 같이, 3A 융합 부위는 3B, 3C 또는 3D 부위에서 융합을 갖는 항체와 비교하여 가장 높은 발현 수준을 나타냈다.

[표 5]

융합 단백질을 단백질 A 크로마토그래피로 정제하고, 천연 겔에 의해 분석하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, PDL1-mIL7-3A(레인 1), PDL1-mIL7-3A-mIFNa4(레인 5) 및 PDL1-mIL7-3B-mIFNa4(레인 6)는 각각, 표에서 결정된 바와 같은 발현 수준으로 확인되면서, 명확한 밴드를 나타냈다. PDL1-mIL7-3D(레인 4)는 PDL1-mIL7-3B-mIFNa4(레인 6)와 비슷한 발현 수준을 갖는 것으로 결정되었지만, 도 5a에서 하나의 명확한 밴드를 나타내지 않았는데, 이는 PDL1-mIL7-3D가 응집을 가졌다는 것을 시사한다. PDL1-mIL7-3A, PDL1-mIL7-3B, PDL1-mIL7-3A-mIFNa4 및 PDL1-mIL7-3B-mIFNa4는 모두 하나의 명확한 밴드를 가졌는데, 이는 이들 변형된 항체가 비교적 높은 순도를 가졌음을 시사한다.

PDL1-mIL7-3A 및 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4의 결과를 도 5b 및 도 5c에서 크기-배제 크로마토그래피 HPLC(SEC-HPLC)에 의해 추가로 확인하였다. 도 5b 및 도 5c에 도시된 바와 같이, SEC-HPLC로부터의 결과는 PDL1-mIL7-3A 및 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4에 대해 단지 하나의 주요 피크를 가졌는데, 이는 이들 변형된 항체가 고순도로 높은 발현 수준을 갖고, 발현 산물이 안정하고, 응집체를 형성하지 않았음을 시사한다.

PD-L1 단백질에 대한 결합 친화성의 결정

정제된 6X히스티딘-태깅된 인간 PD-L1(hPDL1-His)과 PDL1-아벨루맙, PDL1-mIL7-3A, 또는 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4 사이의 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM(Biacore, INC, Piscataway N.J.) T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. PDL1-mIL7-3A에서, mIL7을 3A 부위에 융합시켰다. PDL1-mIL7-3A-mIFNa4에서, mIFNa4를 항체 PDL1-mIL7-3A의 C-말단에 연결하였다.

융합 단백질(1 μg/mL)을 20초 동안 10 μL/min으로 Biacore^TM T200 바이오센서에 주입하여 요망되는 단백질 밀도를 달성하였다. 이어서, 6X히스티딘-태깅된 인간 PD-L1 단백질(hPDL1-His)을 180초 동안 30 μL/min으로 주입하였다. 해리를 300초 동안 모니터링하였다. 글리신(pH 2.0, 5초 동안 30 μL/min)으로 각 적정의 마지막 주입 후 칩을 재생시켰다. 당업자가 이해할 바와 같이, 파라미터(예를 들어, 항체 농도)에 대한 적절한 조정으로 동일한 방법이 각각의 시험된 항체에 대해 수행되었다. 시험된 항체에 대한 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 6]

Biacore^TM T200 평가 소프트웨어 3.0을 이용하여, 데이터를 전체적으로 1:1 Langmuir 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110)에 핏팅시키는 것에 의해 동역학적 결합 속도(kon)와 해리 속도(koff)를 동시에 얻었다. 친화성을 운동 속도 상수의 몫(quotient)(KD=koff/kon)으로부터 계산하였다. 결과는 PDL1-mIL7-3A 및 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4가 비변형된 모 항-PD-L1 항체(PDL1-아벨루맙)와 비교하여 인간 PD-L1 단백질에 대해 유사한 결합 친화성을 가졌다는 것을 시사하였다.

사이토카인 활성의 검증

하기 재료들을 사용하였다.

적혈구 용해 완충제는 Beyotime Biotechnology(카탈로그 번호 C3702)로부터 구입하였다.

항-CD16/32(aCD16/32) 항체는 Miltenyi Biotec로부터 구입하였다.

소 태아 혈청(FBS)은 ExCell Biotech Co, Ltd.로부터 구입하였다.

포스포-STAT5(Tyr694) 단클론성 항체(SRBCZX) APC, eBioscience^TM는 ThermoFisher(카탈로그 번호 17-9010-41)로부터 구입하였다.

포스포-STAT1(Ser727) 재조합 토끼 단클론성 항체(Stat1S727-C6), PE를 ThermoFisher(카탈로그 번호 MA5-28056)로부터 구입하였다.

CD8a 단클론성 항체(53-6.7), FITC, eBioscience^TM를 ThermoFisher(카탈로그 번호 11-0081-82)로부터 구입하였다.

삽입된 mIL7 및 mIFNa4의 생체활성을 측정하였다. 마우스 비장을 BALB/c 배경 마우스로부터 수집하였다. 비장을 분쇄하고 필터에 통과시켰다. 필터를 3 ml의 PBS로 세척하고, 분쇄된 비장 세포를 400 g/min으로 3분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 버리고, 1 ml의 적혈구 용해 완충제를 첨가하여 4℃에서 15분 동안 적혈구를 용해시켰다. 나머지 세포를 5 ml의 PBS에 재현탁시킨 다음, 400 g/min으로 3분 동안 원심분리하고, 이어서 원심분리 후 상청액을 제거하였다. 세포 재현탁, 원심분리 및 상청액의 제거를 1회 반복하였다. 나머지 세포를 200 μl의 PBS에 의해 재현탁시키고, aCD16/32(항-마우스 CD16/32) 항체를 첨가하여 4℃에서 15분 동안 세포를 차단하였다. 차단된 세포를 10 ml의 PBS에 추가로 희석하고, 세포 수를 계수하였다. 이후, 세포를 400 g/min으로 3분 동안 원심분리하고, 이어서 상청액을 제거하였다. 적절한 부피의 RPMI 1640 배지를 첨가하여 세포 역가를 조정하였다.

세포를 특정 사이토카인(예를 들어, 마우스 인터루킨 7, 또는 mIL7), 또는 사이토카인 도메인을 포함하는 융합 단백질로 처리하였다. 구체적으로, 200 μl의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여, 각 웰이 10⁵개 세포를 갖도록 하였다. 이후, PBS(5 μl), mIL7 단백질(100 ng), PDL1-mIL7-3A(550 ng) 또는 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4(650 ng)를 각각 별도의 웰에 첨가하였다. mIL7 그룹, PDL1-mIL7-3A 그룹 및 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4 그룹 내 mIL7은 대략 동등했다. 세포를 부드럽게 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

처리된 세포를 실온에서 15분 동안 4% 포름알데하이드(최종 농도)-PBS 용액에 의해 투과시켰다. 이후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 100% 빙냉 메탄올에 재현탁시키고, 아이스 배쓰에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS(0.5% BSA가 보충됨)로 3회 세척하였다.

한 실험에서, mIL7 활성을 측정하였다. APC-표지된 포스포-STAT5(Tyr694) 단클론성 항체(SRBCZX, eBioscience^TM) 및 FITC-표지된 CD8a 단클론성 항체(53-6.7; eBioscience^TM)를 첨가하여 세포를 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 염색 단계 후, 염색된 세포를 PBS로 세척하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. mIL7은 Tyr694에서 마우스 비장 STAT5를 인산화시킬 수 있기 때문에, mIL7의 존재는 APC(알로피코시아닌)의 형광 신호 증가에 의해 시사될 것이다. 도 6에 도시된 바와 같이, mIL7 단백질, PDL1-mIL7-3A 및 PDL1-mIL7-3A-mIFNa4는 모두 PBS-처리된 비장 세포(블랭크)와 비교하여 증가된 APC 수준을 나타냈다.

별도의 실험에서, mIFNa4 활성을 유사한 방법으로 측정하였다. 포스포-STAT1(Ser727) 재조합 토끼 단클론성 항체(Stat1S727-C6) 및 FITC-표지된 CD8a 단클론성 항체(53-6.7; eBioscience^TM)를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 세포를 염색하였다. 염색 단계 후, 염색된 세포를 PBS로 세척하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. mIFNa4는 Ser727에서 마우스 비장 STAT1을 인산화시킬 수 있기 때문에, mIFNa4의 존재는 증가된 형광 신호에 의해 시사될 것이다. 도 7에 도시된 바와 같이, PDL1-mIL7-3A-mIFNa4만 증가된 신호를 나타낸 반면, PDL1-mIL7-3A는 PBS-처리된 비장 세포(블랭크)와 비교하여 변하지 않은 신호를 나타냈다.

상기 실험은 변형된 항체에서 삽입된 mIL7 및 mIFNa4가 이들의 생체활성을 보존하였다는 것을 시사하였다.

Fc 수용체에 대한 결합 친화성의 결정

다양한 Fc 수용체에 대한 PD-L1 항체(PDL1-아벨루맙), PDL1-mIL7-3A-mIFNa4, 및 PDL1-mIL7-3A의 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM(Biacore, INC, Piscataway N.J.) T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. Fc 수용체는 FcγRIIB(FcγRIIB-Acro), FcγRIIA(FcγRIIA-H167-Acro), FcγRIIIA(FcγRIIIA-V176-Acro), FcγRIIIB(FcγRIIIB-NA1-Acro), FcγRI(FcγRI-Sino), 및 FcRn(FcRn-Acro)을 포함하였다.

상이한 실험에서, 다양한 Fc 수용체에 대한 PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1, AB-IgG1(PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1과 동일한 IgG1 아형을 갖는 대조군 항체), PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4, 및 AB-IgG4(PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4와 동일한 IgG4 아형을 갖는 대조군 항체)의 결합 친화성을 상기 기재된 바와 같이 Biacore^TM를 사용하여 측정하였다. Fc 수용체는 FcγRI(FcγRI-Sino), FcγRIIA(FcγRIIA-H167-Acro 및 FcγRIIA-R167), FcγRIIB, FcγRIIIA(FcγRIIIA-F176 및 FcγRIIIA-V176-Acro), 및 FcγRIIIB(FcγRIIIB-NA1-Acro)을 포함하였다.

구체적으로, 항-PD-L1 항체 PDL1-3F2(PDL1-3F2-IgG1, 또는 3F2)의 VH 및 VL 서열을 갖는 scFv(SEQ ID NO: 17)를 항-PD-1 항체 PD1-1A7-IgG4(VH SEQ ID NO: 40; VL SEQ ID NO: 41)의 3A 부위에 융합시키고, 이어서 IgG4를 IgG1 아형으로 대체함으로써 PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1을 생성하였다. 항-CD40 항체 C40-6A7(6A7)의 VH 및 VL 서열을 갖는 scFv(SEQ ID NO: 16)를 PDL1-아벨루맙의 3A 부위에 융합시키고, 이어서 IgG1을 IgG4 아형으로 대체함으로써 PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4를 생성하였다. 2개의 융합 단백질 구조는 도 20a에 FV3A로서 도시되어 있다.

[표 7]

결과는 도 8a 및 도 8b에 나타나 있으며, 항-PD-L1 항체에서 mIL7 및 mIFNa4의 융합은 모 항-PD-L1 항체와 비교하여 FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRIIIB 또는 FcRn에 대한 항체의 결합 친화성을 실질적으로 변화시키지 않았다. 또한, IgG1 또는 IgG4 아형을 갖는 융합된 scFv는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, 및 FcγRIIIB를 포함하는 다양한 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화성을 실질적으로 변화시키지 않았다.

단백질 안정성 시험

융합 단백질 PDL1-mIL7-3A를 -20℃또는 40℃에서 1개월 동안 저장한 다음, 천연 겔 및 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하였다. 결과는 도 9a 내지 도 9c에 나타나 있다. 천연 겔에 의해 시사된 바와 같은 각각의 처리된 단백질의 겉보기 분자량(MW)을 또한 이론치와 비교하였다(도 9b).

-20℃에서 저장된 단백질은 하나의 명확한 밴드를 나타냈다. 40℃에서 1개월 동안 저장한 후, PDL1-mIL7-3A는 안정하게 유지되었다.

실시예 4. 노브-인-홀(KIH)과 3A 삽입의 조합

3A 삽입 및 KIH 변형의 상용성을 시험하였다. 4개의 융합 단백질을 설계하였다(도 10b).

발현된 융합 단백질을 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 노브 사슬(PDL1-mIL7-3A-knob, 도 20a에 3A-knob로서 도시된 구조), 홀 사슬(PDL1-mIL7-3A-hole, 도 20a에서 3A-hole로서 도시된 구조), 또는 사슬 둘 모두(PDL1-mIL7-Fab-half-3A-KIH, 도 20a에 Fab-half-3A-KIH로서 도시된 구조)에서 융합된 mIL7을 갖는 융합 단백질은 하나의 명확한 주요 밴드를 나타냈다. 따라서, 3A 삽입은 KIH 변형과 조합하여 사용될 수 있다.

실시예 5. hIL7과 융합된 PD-L1 항체

PD-L1 IgG1 항체 PDL1-3F2(PDL1-3F2-IgG1, 또는 3F2; 중쇄 SEQ ID NO: 36; 경쇄 SEQ ID NO: 37)를 3A 부위에서 인간 인터루킨 7(hIL7)(3F2-hIL7-3A)과, 또는 3A 부위에서 hIL7(SEQ ID NO: 11) 및 중쇄 C-말단에서 mIFNa4(SEQ ID NO: 10)(3F2-hIL7-3A-mIFNa4)와 각각 융합하였다.

융합 단백질, 3F2-hIL7-3A 및 3F2-hIL7-3A-mIFNa4를 정제하고, SEC 및 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 결과는 도 11a 내지 도 11c, 및 도 12a 내지 도 12c에 나타나 있다. 두 융합 단백질 모두는 천연 겔에서 명확한 주요 밴드 및 SEC 결과에서 하나의 명확한 주요 피크를 나타냈다.

정제된 인간 PD-L1 및 3F2, 3F2-hIL7-3A 또는 3F2-hIL7-3A-mIFNa4 사이의 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM(Biacore, INC, Piscataway N.J.) T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 실험을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였고, 시험된 단백질 면역사이토카인(ICK)에 대한 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 8]

결과는 변형된 항체가 비변형된 모 항-PD-L1 항체와 비교하여 인간 PD-L1 단백질에 대해 유사한 결합 친화성을 가졌다는 것을 시사하였다.

마우스 비장 세포를 사용하여 hIL7 활성을 평가하기 위해 실험을 또한 수행하였다. 구체적으로, 수집된 세포를 먼저 PBS, hIL7 단백질, 3F2-hIL7-3A 또는 3F2-hIL7-3A-mIFNa4로 처리한 다음, 포스포-STAT5(Tyr694) 단클론성 항체(SRBCZX) 및 CD8a 단클론성 항체(53-6.7)로 염색하였다. 염색 단계 후, 세포를 PBS로 세척하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. hIL7은 Tyr694에서 마우스 비장 STAT5를 인산화시킬 수 있기 때문에, hIL7 활성은 증가된 APC(알로피코시아닌) 신호에 의해 시사될 것이다. 도 13에 도시된 바와 같이, hIL7 단백질, 3F2-hIL7-3A, 및 3F2-hIL7-3A-mIFNa4는 모두 PBS-처리된 비장 세포(블랭크)와 비교하여 증가된 APC(알로피코시아닌) 수준을 나타냈다. 상기 실험은 항체에서 삽입된 hIL7이 이의 생체활성을 보존하였음을 시사하였다.

실시예 6. hIL21과 융합된 PD-L1 항체

플라스미드는 도 20a에 도시된 바와 같이(HC 구조 참조) PDL1-아벨루맙 중쇄의 C-말단에 연결된 인간 인터루킨 21(hIL21)(SEQ ID NO: 12)을 갖는 융합 단백질을 발현하도록 설계되었다. 융합 단백질 PDL1-hIL21-HC를 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 14a 및 도 14b에 도시된 바와 같이, 비-표적 밴드가 천연 겔 상에서 표적 밴드에 검출되었다.

인간 인터루킨 21(hIL21)을 PDL1-3F2 항체의 3A 부위에서 융합시켰다(3F2-hIL21-3A). mIFNa4를 3F2-hIL21-3A의 중쇄의 C-말단에 부가하였다(3F2-hIL21-3A-mIFNa4). 융합 단백질, 3F2-hIL21-3A 및 3F2-hIL21-3A-mIFNa4를 정제하고, SEC-HPLC 및 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 결과는 도 15a 내지 도 15c, 및 도 16a 내지 도 16c에 나타나 있다. 두 융합 단백질 모두는 천연 겔에서 명확한 주요 밴드 및 SEC-HPLC 결과에서 명확한 주요 피크를 나타냈다.

정제된 인간 PD-L1과 모 PD-L1 항체(3F2), 3F2-hIL21-3A 또는 3F2-hIL21-3A-mIFNa4 사이의 결합 친화성을 SPR에 의해 측정하였다. 실험을 상술된 방법에 기재된 바와 같이 수행하였고, 결과는 하기 표에 요약되어 있다.

[표 9]

결과는 3F2-hIL21-3A 및 3F2-hIL21-3A-mIFNa4가 모 PD-L1 항체와 비교하여 인간 PD-L1 단백질에 대해 유사한 결합 친화성을 가졌다는 것을 시사하였다.

HIL21 활성을 또한 마우스 비장 세포를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 수집된 세포를 먼저 PBS, hIL21 단백질, 3F2-hIL21-3A, 또는 3F2-hIL21-3A-mIFNa4로 처리한 다음, APC-표지된 포스포-STAT3 단클론성 항체 및 FITC-표지된 항-CD8a 단클론성 항체(53-6.7)로 염색하였다. 염색 단계 후, 세포를 PBS로 세척하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. hIL21은 마우스 비장 STAT3을 인산화시킬 수 있기 때문에, hIL21의 존재는 증가된 APC 신호에 의해 시사될 것이다. 도 17에 도시된 바와 같이, hIL21 단백질, 3F2-hIL21-3A, 및 3F2-hIL21-3A-mIFNa4는 모두 PBS-처리된 비장 세포(블랭크)와 비교하여 증가된 APC(알로피코시아닌) 수준을 나타냈다. 상기 실험은 삽입된 hIL21이 이의 생체활성을 보존하였음을 시사하였다.

실시예 7. TGFbR2와 융합된 PD-L1 항체

PD-L1 항체(PDL1-아벨루맙)를 중쇄 3A 부위에서 인간 TGFbR2(형질전환 성장 인자, β 수용체 II)(SEQ ID NO: 13)의 세포외 도메인과 융합시켰다. 융합 단백질, PDL1-TGFbR2-3A를 정제하고, SEC-HPLC 및 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 18a 내지 도 18c에 도시된 바와 같이, 융합 단백질은 천연 겔에서 명확한 주요 밴드 및 SEC-HPLC 결과에서 명확한 주요 피크를 나타냈다.

TGFb1과 정제된 M7824(중쇄: SEQ ID NO: 38; 경쇄: SEQ ID NO: 39) 사이의 결합 친화성, 및 TGFb1과 PDL1-TGFbR2-3A 사이의 결합 친화성을 SPR에 의해 측정하였다. M7824는 이작용성 항-PD-L1/TGFβ Trap 융합 단백질이다. TGFbR2의 세포외 도메인은 M7824에서 항-PDL1 항체의 Fc의 C 말단에서 연결된다. 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 10]

결과는 3A 부위에 융합된 TGFbR2의 세포외 도메인을 갖는 PD-L1 항체가 M7824와 비교하여 TGFb1 단백질에 대해 유사한 결합 친화성을 가졌다는 것을 시사하였다. 융합은 변형된 단백질의 결합 친화성에 영향을 미치지 않았다.

실시예 8. 항-CD40 scFv와 융합된 PD-L1 항체

플라스미드는 PD-L1 IgG1 항체(PDL1-아벨루맙)의 중쇄 3A 부위에서 융합된 항-CD40 단쇄 가변 단편(scFv)(SEQ ID NO: 16)을 갖는 융합 단백질을 발현하도록 설계되었다. 융합 단백질을 PDL1-C40-6A7-FV3A로 명명하였다.

ADCC 효과를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 결과는 CD40에 대한 3A 부위에서 scFv의 결합이 입체 효과로 인해 IgG와 Fc 수용체 사이의 친화성의 감소 또는 손실을 초래하였음을 시사하였다.

실험에서, PD-L1 항체 PDL1-아벨루맙(G1)을 모 항체로서 사용하였다. hIL7(PDL1-hIL7-3A; G2) 및 항-CD40 항체 C40-6A7의 scFV(SEQ ID NO: 16)(PDL1-C40-6A7-FV3A; G3)를 3A 부위에 혼입시키고, 시험하였다. PDL1-C40-6A7-FV3A의 IgG4 아형을 또한 제조하였다. IgG4는 이펙터 기능을 촉발시키는 능력이 제한되었고, 이를 음성 대조군으로 사용하였다(PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4; G5).

PD-1 IgG4 항체 PD1-1A7(1A7, 또는 PD1-1A7-IgG4; VH SEQ ID NO: 40; VL SEQ ID NO: 41)을 또한 모 항체로서 사용하였다. 항-PD-L1 항체 3F2의 scFV(SEQ ID NO: 17)를 PD-1 항체의 IgG1 아형의 3A 부위에서 융합시켰다(PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1; G4). hCD16-발현 Jurkat 세포 및 PD-L1-발현 CHO 세포를 실험에 사용하였다. hCD16-발현 Jurkat 세포는 또한 루시페라제를 발현하기 위한 Luc 유전자를 포함하였다.

실험은 다음과 같이 수행되었다. PD-L1을 발현하는 CHO 세포를 37℃에서 회수하고, 웰 당 2 Х 10⁴개 세포로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 이후 Jurkat 세포 현탁액을 웰 당 25 μl(또는 웰 당 8 Х 10⁴개 세포)로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 다음으로, G1-G5를 1:3의 희석비로 25 μl 검정 완충제에 희석한 후, 100 nM의 최종 농도로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 96-웰 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 발색 시약을 각 웰에 첨가하고, 암소에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이후 플레이트를 발광 검출기에 배치하여 각 웰의 생체발광 신호를 검출하였다.

도 19에 도시된 바와 같이, 결과는 3A 부위에서 scFV 또는 사이토카인의 융합이, 변형된 항체의 ADCC 활성에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었다. 그러나, 3A 부위에서 삽입된 scFV가 표적 단백질(CHO 세포 상의 PD-L1)에 결합하는 경우, 표적 세포에 대한 ADCC 효과는 감소되거나 손실되었다. 다시 말해서, 3A 부위에서 삽입된 scFV가 표적 단백질에 결합하는 경우, 입체 효과는 Fc가 Fc 수용체에 결합하여 ADCC 이펙터 기능을 촉발시키는 것을 막았다.

실시예 9. 3A 부위 내의 아미노산 대체 또는 삽입 범위의 시험

3A, 3B, 3C, 또는 3D 부위에서 가용성 도메인과 융합된 항체

PD-L1 항체(PDL1-아벨루맙)를 중쇄 3A 부위(EU 넘버링에 따른 위치 358 내지 위치 362의 아미노산이 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체됨), 3B(EU 넘버링에 따른 위치 383 내지 위치 391의 아미노산이 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체됨), 3C(TGFbR2의 세포외 도메인이 EU 넘버링에 따른 위치 384와 위치 385 사이에 삽입됨), 또는 3D 부위(위치 413 내지 위치 422의 아미노산이 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체됨)에서 인간 TGFbR2(형질전환 성장 인자, β 수용체 II)의 세포외 도메인과 융합시켰다.

상응하는 융합 단백질, PDL1-TGFbR2-3A, PDL1-TGFbR2-3B, PDL1-TGFbR2-3C, 및 PDL1-TGFbR2-3D를 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 22 및 표 11에 나타낸 바와 같이, PDL1-TGFbR2-3A, PDL1-TGFbR2-3C, 및 PDL1-TGFbR2-3D만 천연 겔에서 명확한 주요 밴드를 나타냈다. 각각의 융합 단백질의 발현 수준을 또한 결정하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, PDL1-TGFbR2-3A, PDL1-TGFbR2-3C, 및 PDL1-TGFbR2-3D는 발현되었지만, PDL1-TGFbR2-3B는 발현되지 않았다.

[표 11]

실시예 3에 제시된 결과와 일관되게, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A는 안정적으로 발현되었다. 실시예 3의 결과와 비교하여, 3A 부위에서의 융합은 항상 안정적인 발현을 제공하였다.

다양한 시작 및 종결 위치를 갖는 3A 부위에서 융합된 항체

PD-L1 IgG1 항체(PDL1-아벨루맙)를 다양한 시작 및 종결 위치를 갖는 3A 부위에서 인간 TGFbR2의 세포외 도메인과 융합시켰다. 구체적으로, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A는 위치 358 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었고, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A-IgG4는 유사하게 IgG4 아형을 갖는 PD-L1 IgG1 항체를 사용하여 수득되었다.

PDL1-아벨루맙을 다양한 시작 위치 및 종결 위치를 갖는 3A 부위에서 인간 TGFbR2의 세포외 도메인과 융합시켰다. 예를 들어, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3AF1은 위치 351 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3AF2는 위치 347 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3AF3은 위치 344 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었다. 예를 들어, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3AR1은 위치 358 내지 위치 372(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3AR2는 위치 358 내지 위치 378(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3AR3은 위치 358 내지 위치 381(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3AR4는 위치 373 내지 위치 377(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 TGFbR2의 세포외 도메인으로 대체함으로써 수득되었다.

융합 단백질을 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 23 및 표 12에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A(레인 1) 및 PDL1-TGFbR2-3A-IgG4(레인 2)가 천연 겔에서 명확한 주요 밴드를 나타냈다. 각각의 융합 단백질의 발현 수준을 또한 결정하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A, PDL1-TGFbR2-3A-IgG4, 및 PDL1-TGFbR2-3AF1의 발현은 검출되었지만, 다른 시험된 융합 단백질은 검출되지 않았다. 결과는 IgG 아형이 융합 단백질의 발현에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다. 또한, 위치 351 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산이 융합 부위로서 사용될 수 있다.

[표 12]

다양한 시작 및 종결 위치를 갖는 3A 부위에서 융합된 항체

PD-L1 IgG1 항체(PDL1-아벨루맙)를 다양한 시작 및 종결 위치를 갖는 3A 부위에서 인간 IL21(hIL21)과 융합시켰다. 구체적으로, 융합 단백질 PDL1-hIL21-3A-IgG4는 IgG4 아형을 갖는 PDL1-아벨루맙을 사용하여 IgG4의 CH3 도메인 내의 위치 358 내지 362(EU 넘버링에 따름)로부터의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다. PDL1-아벨루맙은 다양한 시작 위치 및 종결 위치를 갖는 3A 부위에서 인간 IL21과 융합되었다. 예를 들어, 융합 단백질 PDL1-hIL21-3AF1은 위치 351 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-hIL21-3AF2는 위치 347 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-hIL31-3AF3은 위치 344 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다. 예를 들어, 융합 단백질 PDL1-hIL21-3AR1은 위치 358 내지 위치 372(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-hIL21-3AR2는 위치 358 내지 위치 378(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-hIL21-3AR3은 위치 358 내지 위치 381(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-hIL21-3AR4는 위치 373 내지 위치 377(EU 넘버링에 따름)의 아미노산을 인간 IL21로 대체함으로써 수득되었다.

융합 단백질을 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 24 및 표 13에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질 PDL1-hIL21-3A-IgG4(레인 1) 및 PDL1-hIL21-3AF1(레인 2)이 천연 겔에서 명확한 주요 밴드를 나타냈다. 각각의 융합 단백질의 발현 수준을 또한 결정하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 융합 단백질 PDL1-hIL21-3A-IgG4 및 PDL1-hIL21-3AF1의 발현은 검출되었지만, 다른 시험된 융합 단백질의 발현은 검출되지 않았다.

[표 13]

상기 결과에 따르면, 비-천연 폴리펩티드는 단백질 발현을 방해하지 않으면서 위치 351 내지 위치 362에서 PD-L1 항체의 3A 부위에 융합될 수 있다.

3A 부위 내에 인간 TGFbR2의 삽입

인간 TGFbR2의 세포외 도메인을 항체(PDL1-아벨루맙)의 3A 부위에서 삽입하였다. 구체적으로, 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A1은 3A 부위 내의 위치 358과 위치 359(EU 넘버링에 따름) 사이에 인간 TGFbR2의 세포외 도메인을 삽입함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A2는 3A 부위 내의 위치 359과 위치 360(EU 넘버링에 따름) 사이에 인간 TGFbR2의 세포외 도메인을 삽입함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A3은 3A 부위 내의 위치 360과 위치 361(EU 넘버링에 따름) 사이에 인간 TGFbR2의 세포외 도메인을 삽입함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A4는 3A 부위 내의 위치 361과 위치 362(EU 넘버링에 따름) 사이에 인간 TGFbR2의 세포외 도메인을 삽입함으로써 수득되었다.

융합 단백질을 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하고, 이들의 발현 수준을 결정하였다. 도 25a 및 표 14에 나타낸 바와 같이, 모든 융합 단백질이 천연 겔에서 명확한 주요 밴드를 나타냈다. 각각의 융합 단백질의 발현 수준을 또한 결정하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 융합 단백질의 발현이 검출되었다.

[표 14]

단백질 분해에 의해 야기될 수 있는 PDL1-TGFbR2-3A1(레인 2)에 대해 비-표적 밴드가 관찰되었다. 이를 확인하기 위해, PDL1-TGFbR2-3A1을 새로운 세포 배치로부터 정제하고, 즉시 천연 겔에서 분석하였다. 도 25b 및 하기 표 15에 나타낸 바와 같이, 비-표적 밴드는 관찰되지 않았는데, 이는 PDL1-TGFbR2-3A1의 저장 동안 단백질 분해가 발생했다는 것을 시사한다.

[표 15]

새로 정제된 PDL1-TGFbR2-3A1을 10일 동안 유지한 후, 표 14의 정제된 PDL1-TGFbR1-3A, PDL1-TGFbR1-3A2, PDL1-TGFbR1-3A3, PDL1-TGFbR1-3A4와 동일한 천연 겔에 로딩하였다. 도 26의 겔 전기영동 결과는 PDL1-TGFbR1-3A1(레인 2)에서 비-표적 밴드를 나타냈는데, 이는 비-표적 밴드가 단백질 분해에 의해 야기되었다는 것을 시사한다.

상기 결과는 비-천연 폴리펩티드가 위치 351 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)에서의 임의의 아미노산, 특히 위치 358 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)에서의 임의의 아미노산을 대체하거나 그 사이에 삽입될 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 위치 358과 위치 359(EU 넘버링에 따름) 사이에 인간 TGFbR2의 세포외 도메인의 삽입은 다른 삽입 부위만큼 안정적이지 않았다. 359-360, 360-361, 또는 361-362에 삽입이 있는 항체 및 3A 부위에 대체가 있는 항체는 매우 안정하였다.

융합 단백질의 열 안정성

수득된 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A, PDL1-TGFbR2-3C, PDL1-TGFbR2-3D, PDL1-TGFbR2-3A1, PDL1-TGFbR2-3A2, PDL1-TGFbR2-3A3, 및 PDL1-TGFbR2-3A4의 열안정성을 용융 온도(Tm)를 측정함으로써 결정하였다. M7824를 대조군으로 사용하였다.

[표 16]

일반적으로, 결과는 Tm이 3A 또는 3C 부위 내의 아미노산 대체 또는 삽입에 의해 최소한으로 영향을 받았다는 것을 보여주었다. PDL1-TGFbR2-3D는 아마도 낮은 순도 또는 불안정한 구조로 인해 M7824에 비해 비교적 낮은 Tm을 나타냈다.

TGFβ1에 대한 결합 친화성의 결정

수득된 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A, PDL1-TGFbR2-3C, PDL1-TGFbR2-3D, PDL1-TGFbR2-3A1, PDL1-TGFbR2-3A2, PDL1-TGFbR2-3A3, 및 PDL1-TGFbR2-3A4의 인간 TGFβ1에 대한 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정하였다. 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 17]

결과는 시험된 모든 융합 단백질이 높은 친화성으로 인간 TGFβ1에 대한 특이적 결합을 나타냈다는 것을 보여주었다. 따라서, 결과는 3A 부위에서 삽입된 폴리펩티드가 적절하게 폴딩될 수 있고 여전히 작용성임을 추가로 시사하였다.

실시예 10. 3A 및 3C 부위에서 scFv와 융합된 항체

발현 수준 및 순도

항체(PDL1-아벨루맙)를 중쇄 3A 부위(EU 넘버링에 따른 위치 358 내지 위치 362의 아미노산이 항-CD40 scFv로 대체됨), 또는 3C 부위(항-CD40 scFv는 EU 넘버링에 따른 위치 384와 위치 385 사이에 삽입됨)에서 항-CD40 scFv와 융합하여, 융합 단백질 PDL1-C40-6A7-FV3A 및 PDL1-C40-6A7-FV3C를 각각 생성하였다. PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4는 또한 IgG1을 IgG4 아형으로 대체함으로써 수득되었다.

또한, 융합 단백질 PDL1-C40-6A7-FV3A1은 3A 부위 내의 위치 358과 위치 359(EU 넘버링에 따름) 사이에 항-CD40 scFv를 삽입함으로써 수득되었다. 또한, 융합 단백질 PDL1-C40-6A7-FV3A2는 3A 부위 내의 위치 359와 위치 360(EU 넘버링에 따름) 사이에 항-CD40 scFv를 삽입함으로써 수득되었다. 융합 단백질 PDL1-C40-6A7-FV3A3은 3A 부위 내의 위치 360과 위치 361(EU 넘버링에 따름) 사이에 항-CD40 scFv를 삽입함으로써 수득되었다. 융합 단백질을 정제하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 시험된 융합 단백질 모두가 천연 겔에서 명확한 주요 밴드를 나타냈다.

CD40에 대한 결합 친화성의 결정

수득된 융합 단백질 PDL1-C40-6A7-FV3A(IgG1), PDL1-C40-6A7-FV3A-IgG4, PDL1-C40-6A7-FV3C(IgG1), PDL1-C40-6A7-FV3A1(IgG1), PDL1-C40-6A7-FV3A2(IgG1), 및 PDL1-C40-6A7-FV3A3(IgG1)의 인간 CD40에 대한 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정하였다. scFV가 유래된 본래의 항-CD40 단클론성 항체 C40-6A7 IgG2(6A7, VH SEQ ID NO: 91, VL SEQ ID NO: 92)를 대조군으로 사용하였다. 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 18]

결과는 시험된 모든 융합 단백질이 높은 친화성으로 인간 CD40에 대한 특이적 결합을 나타냈다는 것을 보여주었다.

실시예 11. Fc 수용체에 대한 결합 친화성의 결정

인간 Fc 수용체에 대한 융합 단백질 PDL1-TGFbR2-3A(IgG1)(또는 PDL1-TGFbR2-3A-IgG1) 및 PDL1-TGFbR2-3A-IgG4의 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. Fc 수용체는 FcγRI-Sino, FcγRIIA-R167-Sino, FcγRIIIA-F176-Sino, FcγRIIIB-Sino, 및 FcγRn을 포함하였다. 인간화 CTLA4 항체 CT4-4G12-IgG1(CT4-4G12, 또는 4G12; VH SEQ ID NO: 44, VL SEQ ID NO: 45)을 대조군으로 사용하여 FcγRn에 대한 결합 친화성을 시험하였다. PDL1-아벨루맙을 대조군으로 사용하여 FcγRI-Sino, FcγRIIA-R167-Sino, FcγRIIIA-F176-Sino, 및 FcγRIIIB-Sino에 대한 결합 친화성을 시험하였다. 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 19]

결과는 PD-L1 항체의 3A 부위에 비-천연 폴리펩티드의 삽입이 있을 때 Fc 수용체에 대한 결합 친화성이 유의하게 영향을 받지 않았다는 것을 보여주었다.

실시예 12. 3A 부위 내에서 다양한 유형의 분자의 대체

다양한 유형의 분자, 예를 들어, 사이토카인, 수용체, scFv, 리간드, 나노바디, 또는 이의 단편은 하기 표에 나타낸 바와 같이 항체 중쇄의 3A 부위(예를 들어, EU 넘버링에 따른 위치 358 내지 위치 362의 아미노산)에서 융합될 수 있다. 항체는 IgG1 또는 IgG4 아형일 수 있다.

[표 20]

상기 표에 나타낸 바와 같은 하기 서열을 예로서 사용하였다. 예를 들어, 사이토카인은 SEQ ID NO: 12(NP_068575.1의 아미노산 25-162)에 제시된 서열을 갖는 인간 IL21(hIL21)로부터 유래될 수 있다. 수용체는 SEQ ID NO: 13(NP_003233.4의 아미노산 24-159)에 제시된 서열을 갖는 TGFbR2로부터 유래될 수 있다. scFv는 SEQ ID NO: 17에 제시된 서열을 갖는, 인간화 항-PD-L1 항체 PDL1-3F2로부터 유래될 수 있다. 리간드는 SEQ ID NO: 14에 제시된 서열을 갖는 ATOR1015-CD86(인간 CD86의 Ig-유사 V-타입 도메인의 최적화된 버전)일 수 있다. ATOR1015-CD86의 세부 사항은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제WO2018202649A1호에서 찾아볼 수 있다. ATOR1015-CD86은 ATOR1015의 CD86 부분이다.

나노바디는 SEQ ID NO: 15에 제시된 가변 영역 서열을 갖는 KN035-PDL1(또는 KN035)일 수 있다. KN035의 세부 사항은, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 제US20180291103A1호에서 찾아볼 수 있다.

발현 수준 및 순도

항체 중쇄의 위치 358 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)에 상응하는 아미노산을 다양한 비-천연 분자로 대체함으로써 하기 융합 단백질을 수득하였다. ATOR1015-CD86을 PD-L1 항체(PDL1-아벨루맙)에 융합시켜 PDL1-CD86-3A(또는 PDL1-CD86-3A-IgG1)를 생성하였다. IgG1을 IgG4 아형으로 대체함으로써 PDL1-CD86-3A-IgG4를 수득하였다. KN035를 PD-1 항체 PD1-1A7-IgG4에 융합시켜 PD1-KN035-3A(또는 PD1-KN035-3A-IgG4)를 생성하였다. PD1-KN035-3A-IgG1은 IgG4를 IgG1 아형으로 대체함으로써 수득되었다. 항-PD-L1 scFv는 PD1-1A7-IgG4에 융합되어 PD1-PL1-3F2-FV3A(또는 PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG4)를 생성할 수 있다. PD1-PL1-3F2-FV3A-IgG1은 IgG4를 IgG1 아형으로 대체함으로써 수득되었다. KN035를 노브 사슬(도 20a에 3A-knob 나타낸 구조)에서 CTLA4 항체 CT4-4G12-IgG1(CT4)에 융합시켜 CT4-KN035-3A-knob(또는 CT4-KN035-3A-knob-IgG1)를 생성하였다. KN035를 홀 사슬(도 20a에 3A-hole로 도시된 구조)에서 CT4-4G12-IgG1에 융합시켜 CT4-KN035-3A-hole(또는 CT4-KN035-3A-hole-IgG1)을 생성하였다(도 20a).

도 27 및 표 21에 나타낸 바와 같이, 각각의 융합 단백질은 6% 천연 겔에서 레인 당 4 μg으로 로딩되었다. 모든 융합 단백질에서 명확한 주요 밴드가 검출되었다. 각각의 융합 단백질의 발현 수준을 또한 결정하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 융합 단백질은 안정적으로 발현되었다.

[표 21]

결합 친화성의 결정

인간 CTLA4(hCTLA4-His) 또는 인간 PD-L1(hPDL1)에 대한 융합 단백질의 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다. 결과는 하기 표에 나타나 있다. CTLA4 항체 CT4-4G12-IgG1(CT4)을 대조군으로서 사용하였다. ATOR1015-CD86(CD86) 및 KN035-IgG1(중쇄 불변 도메인에 D265A 돌연변이가 있음)을 또한 대조군으로 사용하였다.

[표 22]

결과는 ATOR1015-CD86이 PD-L1 항체에 융합된 후 인간 CTLA4에 대한 이의 결합 친화성을 유지하였음을 보여주었다. 또한, 결과는 KN035가 PD-1 또는 CTLA4 항체에 융합된 후 인간 PD-L1에 대한 이의 결합 친화성을 유지하였다는 것을 보여주었다. 항-PD-L1 scFv는 또한 PD-1 항체에 융합된 후 PD-L1에 대한 높은 결합 친화성을 유지하였다. 또한, IgG의 아형(예를 들어, IgG1 또는 IgG4)은 융합된 분자의 결합 친화성에 영향을 미치지 않았다.

실시예 13. 3A-HC, 또는 3A 구조를 갖는 융합 단백질의 발현 및 정제

TGFβR2의 세포외 도메인은 PDL1-CD86-3A-IgG1 중쇄의 C-말단에 연결되어(도 20a에 3A-HC로 도시된 구조) PDL1-CD86-3A-TGFbR2를 생성하였다.

융합 단백질 PDL1-CD86-3A-IgG1, PDL1-CD86-3A-IgG4 및 PDL1-CD86-3A-TGFbR2를 정제하고 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 28 및 표 23에 나타낸 바와 같이, 모든 융합 단백질이 천연 겔에서 명확한 주요 밴드를 나타냈다. 각각의 융합 단백질의 발현 수준을 또한 결정하였다. 하기 표에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 융합 단백질의 발현이 검출되었다. 결과는 3A-HC 구조를 갖는 융합 단백질이 발현되고 정제될 수 있다는 것을 시사한다.

[표 23]

실시예 14. 항-OX40 scFv와 융합된 CTLA4 항체

플라스미드는 CTLA4 항체 CT4-4G12-IgG1의 중쇄 C-말단에서 연결되거나, 3A 부위에서 융합된 항-OX40 단쇄 가변 단편(scFv)을 갖는 융합 단백질을 발현하도록 설계되었다. 융합 단백질을 CT4-O40-SCFV-HC 및 CT4-O40-FV3A로 명명하였고, 상응하는 중쇄 서열은 각각 SEQ ID NO: 46 및 SEQ ID NO: 47에 제시된다.

ADCC 효과를 평가하기 위해 실험을 수행하였다. 결과는 OX40에 대한 중쇄 C-말단 또는 3A 부위에서 scFv의 결합이 IgG와 Fc 수용체 사이의 친화성을 유지하였다는 것을 시사하였다.

실험에서, CTLA4 항체 CT4-4G12-IgG1(CT4)을 모 항체로서 사용하였다. scFV는 인간화 항-OX40 항체 OX40-9H3(VH SEQ ID NO: 48; VL SEQ ID NO: 49)로부터 유래되었다. OX40 항체 OX40-9H3-IgG1(O40)을 또한 대조군으로 사용하였다.

hCD16-발현 Jurkat 세포 및 OX40-발현 CHO 세포를 사용하여 실시예 8에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. hCD16-발현 Jurkat 세포는 또한 루시페라제를 발현하도록 Luc 유전자를 포함하였다.

도 29에 도시된 바와 같이, 결과는 중쇄 C-말단에 연결되거나 3A 부위에서 융합된 scFV가 표적 단백질(CHO 세포 상의 OX40)에 결합하는 경우, 표적 세포에 대한 ADCC 효과가 유지될 수 있다는 것을 보여주었다. 모 항체와 비교하여 ADCC 효과의 감소는 입체 효과에 의해 야기될 수 있다.

실시예 15. 상이한 사이토카인과 융합된 PD-L1 항체

본원에 논의된 바와 같이, 사이토카인(예를 들어, IL7 또는 IL21)은 3A 부위에 융합되어, 발현하기 쉽고, 안정하며, 기능성인 다작용성 융합 단백질을 생성할 수 있다. 융합된 사이토카인은 가용성인 것들과 비교하여 유사한 기능을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 사이토카인 융합은 특정 항원 또는 Fc 수용체(예를 들어, FCRn)에 대한 모 항체의 결합 친화성에 영향을 미치지 않았다. 이러한 실시예에서, 융합 단백질을 생성하기 위해 더 많은 사이토카인이 선택되었고, 단백질 발현이 검출되었다.

하기 서열을 사용하였다. 예를 들어, 사이토카인은 SEQ ID NO: 93에 제시된 서열을 갖는 인간 IL3(hIL3); SEQ ID NO: 94에 제시된 서열을 갖는 인간 IL4(hIL4); SEQ ID NO: 95에 제시된 서열을 갖는 인간 IL5(hIL5); SEQ ID NO: 96에 제시된 서열을 갖는 인간 IL6(hIL6); SEQ ID NO: 97에 제시된 서열을 갖는 인간 IL8(hIL8); SEQ ID NO: 98에 제시된 서열을 갖는 인간 IL9(hIL9); SEQ ID NO: 99에 제시된 서열을 갖는 인간 IL13(hIL13); 및 SEQ ID NO: 100에 제시된 서열을 갖는 인간 IL15(hIL15)로부터 유래될 수 있다.

PDL1-3F2-IgG1을 모 항체로서 선택하였다. PDL1-3F2-IgG1 항체 중쇄의 위치 358 내지 위치 362(EU 넘버링에 따름)에 상응하는 아미노산을 사이토카인 분자로 대체함으로써 다음 융합 단백질을 수득하였다: 3F2-hIL3-3A; 3F2-hIL4-3A; 3F2-hIL5-3A; 3F2-hIL6-3A; 3F2-hIL8-3A; 3F2-hIL9-3A; 3F2-hIL13-3A; 및 3F2-hIL15-3A.

또한, 사이토카인은 링커 서열(SEQ ID NO: 9)을 통해 모 항체 중쇄의 C-말단에 연결되었다(구조는 도 20a에 HC로 도시됨). 하기 융합 단백질을 수득하였다: 3F2-hIL3-HC; 3F2-hIL4-HC; 3F2-hIL5-HC; 3F2-hIL6-HC; 3F2-hIL8-HC; 3F2-hIL9-HC; 3F2-hIL13-HC; 및 3F2-hIL15-HC.

융합 단백질을 단백질 A 크로마토그래피로 정제한 다음, 겔 전기영동(천연 겔 사용)에 의해 분석하였다. 결과는 도 30a 및 도 30b에 나타나 있다. 도 30a에 도시된 바와 같이, 시험된 모든 융합 단백질은 비교적 높은 순도를 나타냈다. 그러나, 도 30b에서, HC 구조를 갖는 일부 융합 단백질은 다중 밴드(예를 들어, 레인 5, 레인 7, 및 레인 9)를 나타낸 반면, 3A 구조를 갖는 상응하는 융합 단백질은 단일 밴드(예를 들어, 레인 4, 레인 6, 및 레인 8)를 나타냈다.

또한, 3A 구조를 갖는 항체 및 HC 구조를 갖는 항체의 이론적 분자량은 유사하다. 그러나, 3F2-hIL5-3A를 나타내는 밴드(도 30a의 레인 6)는 3F2-hIL5-HC를 나타내는 밴드(도 30a의 레인 7)보다 높았는데, 이는 3F2-hIL5-3A가 3F2-hIL5-HC보다 더 높은 분자량을 가졌다는 것을 시사한다.

상기 기재된 융합 단백질을 추가 분석하였다. SEC-HPLC를 사용하여 단백질 순도를 측정하였고, 결과는 도 31a 내지 도 31d에 나타나 있다. 구체적으로, 3F2-hIL5-3A(순도: 89.05%)는 3F-hIL5-HC(순도: 86.82%)에 비해 약간 더 높은 순도를 가졌다. 다른 시험된 융합 단백질에서, 3A 구조는 상응하는 HC 구조보다 더 높은 순도를 나타냈다. 예를 들어, 3F2-hIL9-3A(순도: 98.90%)는 3F2-hIL9-HC(순도: 81.83%)보다 높은 순도를 가졌고; 3F2-hIL13-3A(순도: 98.24%)는 3F2-hIL13-HC(순도: 93.32%)보다 높은 순도를 가졌고; 3F2-hIL15-3A(순도: 83.79%)는 3F2-hIL15-HC(순도: 48.61%)보다 높은 순도를 가졌다.

SEC-HPLC에서 3F2-hIL5-HC의 체류 시간(RT)이 3F2-hIL5-3A의 체류 시간(RT)보다 늦었기 때문에(도 31a 참조), 3F2-hIL5-HC의 분자량은 이론치보다 작은 것으로 확인되었다. 따라서, 질량 분광법(MS)을 사용하여 3F2-hIL5-HC의 분자량을 측정하였고, 결과는 3F2-hIL5-HC의 분자량이 이론치보다 작았다는 것을 확인시켜 주었다(도 32a). 3F2-hIL5-HC의 발현은 불완전했을 수 있다. 또한, 이차 펩티드 커버리지 맵핑 결과(도 32b)는 중쇄의 C-말단에 서열 결실이 있었다는 것을 보여주었다.

실시예 16. PD-L1 항체의 3A 부위에서 융합된 IL12a

플라스미드는 도 38a에 도시된 바와 같이 인간화 항-PD-L1 항체 PDL1-3F2의 2개의 중쇄 각각의 3A 부위(EU 넘버링에 따른 위치 358 내지 위치 362)에서 융합된 마우스 인터루킨 12 알파 서브유닛(IL12a, 또는 P35)을 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 작제되었다. PDL1-3F2 IgG1 항체는 SEQ ID NO: 36에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SEQ ID NO: 37에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 구체적으로, IL12a의 N-말단은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)를 통해 PDL1-3F2 IgG1 중쇄의 위치 357(EU 넘버링에 따름)에 연결되었고, IL12a의 C-말단은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)를 통해 PDL1-3F2 IgG1 중쇄의 위치 363(EU 넘버링에 따름)에 연결되었다.

마우스 인터루킨 12 베타 서브유닛(IL12b, 또는 P40) 및 PDL1-3F2 IgG1 경쇄는 별도의 플라스미드에 의해 인코딩되었다. 플라스미드의 개략도는 도 38b에 제시되어 있다. IL12(IL12a 및 IL12b 포함)와 융합된 변형된 PDL1-3F2 IgG1 항체는 3F2-mIL12-3A(또는 3F2-mIL12-3A-IgG1)로 명명되었다.

실시예 17. PD-L1 항체의 중쇄 C-말단에서 연결된 IFNa4

플라스미드는 링커 서열(SEQ ID NO: 9)을 통해 3F2-mIL12-3A의 2개의 중쇄 C-말단 각각에 연결된 마우스 인터페론 알파 4(IFNa4)(SEQ ID NO: 10)를 추가로 포함하는 융합 단백질을 발현하도록 작제되었다. 도 39a에 도시된 바와 같이, IL12(IL12a 및 IL12b 포함) 및 IFNa4와 융합된 변형된 PDL1-3F2 IgG1 항체는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4로 명명되었다. 3F2-mIL12-3A와 유사하게, IL12b 및 경쇄는 별도의 플라스미드에 의해 인코딩되었다. 플라스미드의 개략도는 도 39b에 도시되어 있다.

실시예 18. 다양한 구조를 갖는 융합 단백질

플라스미드는 또한 하기 기재된 바와 같이 융합 단백질을 발현하도록 작제되었다.

1) 3F2-mIL12-3A-knob

3F2-mIL12-3A-knob는 노브-인투-홀(KIH) 돌연변이를 갖는 PDL1-3F2 IgG1의 노브 중쇄의 3A 부위(EU 넘버링에 따른 위치 358 내지 위치 362)에서 융합된 IL12a를 포함하는 융합 단백질이다. 구체적으로, IL12a의 N-말단은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)를 통해 노브 중쇄의 위치 357(EU 넘버링에 따름)에 연결되었고, IL12a의 C-말단은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)를 통해 노브 중쇄의 위치 363(EU 넘버링에 따름)에 연결되었다. IL12b 및 경쇄는 별도의 플라스미드에 의해 인코딩되었다.

2) 3F2-mIL12-3A-hole

3F2-mIL12-3A-hole은 노브-인투-홀(KIH) 돌연변이를 갖는 PDL1-3F2 IgG1의 홀 중쇄의 3A 부위(EU 넘버링에 따른 위치 358 내지 위치 362)에서 융합된 IL12a를 포함하는 융합 단백질이다. 구체적으로, IL12a의 N-말단은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)를 통해 홀 중쇄의 위치 357(EU 넘버링에 따름)에 연결되었고, IL12a의 C-말단은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)를 통해 홀 중쇄의 위치 363(EU 넘버링에 따름)에 연결되었다. IL12b 및 경쇄는 별도의 플라스미드에 의해 인코딩되었다.

3) 3F2-mIL12-3A-IgG4

3F2-mIL12-3A-IgG4는 IgG1 불변 영역이 IgG4 불변 영역으로 대체된 것을 제외하고는 3F2-mIL12-3A와 동일한 전체 구조 및 서열을 포함하는 융합 단백질이다.

실시예 19. 3F2-mIL12-3A 및 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 정제

융합 단백질 3F2-mIL12-3A 및 3F2-mIL12-3A-mIFNa4를 정제하고, 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석하였다. 구체적으로, 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를 작제하고, CHO 세포를 일시적으로 형질전환시키는 데 사용하였다. 이어서, 형질감염된 CHO 세포를 37℃에서 6일 내지 7일 동안 배양하였다. 이후, 배양 상청액을 원심분리에 의해 수집하고, 융합 단백질을 먼저 단백질 A 친화성 컬럼으로 정제한 다음 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 단백질 순도를 SEC에 의해 추가로 측정하였다.

6% 아크릴아미드 겔을 사용하여 비-환원 SDS-PAGE를 수행하였다. 단백질 샘플을 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 단백질 샘플을 1 mg/ml까지 희석하였다. 2.4 μl의 희석된 단백질 샘플을 6 μl의 Tris-글리신 SDS 샘플 완충제(2Х) 및 3.6 μl의 증류수와 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 2분 동안 비등시키고, 로딩 전에 즉시 원심분리하였다. 도 40에 도시된 바와 같이, 3F2-mIL12-3A와 3F2-mIL12-3A-mIFNa4 둘 모두는 정확한 분자량을 갖는 단일 밴드를 나타냈다.

단백질 순도를 Agilent 1260 시리즈 HPCL 시스템에 연결된 TSKgel^® G3000SW_XL HPLC 컬럼(Tosoh Bioscience LLC)을 사용하여 SEC에 의해 추가로 측정하였다. 단백질 A 정제된 융합 단백질 샘플을 SEC-HPLC에 의해 분석하였다. 주입 전에, 샘플을 1 mg/ml까지 희석한 다음, 0.22 μm 필터로 여과하였다. 실험 파라미터는 다음과 같이 설정하였다: 유량: 0.7 mL/min; 시간: 30분; 및 검출 파장: 280 nm. Agilent 액체 크로마토그래피 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 시험된 융합 단백질의 크로마토그래피 곡선을 수득하였다. 도 41a 및 도 41b에 도시된 바와 같이, 총 검출된 피크 면적 백분율 및 체류 시간(RT)을 기록하였다. 일반적으로, 단백질 A-정제된 융합 단백질 3F2-mIL12-3A의 순도는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 순도보다 약간 더 높았다(86.88% 순도, 소량의 불순물 있음).

실시예 20. PD-L1에 대한 결합 친화성의 결정

정제된 His-태깅된 인간 PD-L1(hPL1-His; ACRO Biosystems)과 PDL1-3F2 IgG1, 3F2-mIL12-3A, 3F2-mIL12-3A-mIFNa4 사이의 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM(Biacore Inc., Piscataway N.J.) T200 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 측정하였다.

융합 단백질 3F2-mIL12-3A 및 3F2-mIL12-3A-mIFNa4(1 μg/mL)을 30초 동안 10 μL/min으로 Biacore^TM T200 바이오센서에 주입하여 요망되는 단백질 밀도(약 67 RU)를 달성하였다. 이어서, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM, 및 1.5625 nM의 농도의 His-태깅된 인간 PD-L1(hPL1-His)을 30 μL/min으로 100초 동안 주입하였다. 해리를 400초 동안 모니터링하였다. 글리신(pH 2.0, 12초 동안 30 μL/min)으로 각 적정의 마지막 주입 후 칩을 재생시켰다. 당업자가 이해할 바와 같이, 파라미터(예를 들어, 융합 단백질 농도)에 대한 적절한 조정과 함께 동일한 방법을 각각의 시험된 융합 단백질에 대해 수행하였다. 시험된 융합 단백질에 대한 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 24]

Biacore^TM T200 평가 소프트웨어 3.0을 이용하여, 데이터를 전체적으로 1:1 Langmuir 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110)에 핏팅시키는 것에 의해 동역학적 결합 속도(kon)와 해리 속도(koff)를 동시에 얻었다. 친화성을 운동 속도 상수의 몫(KD=koff/kon)으로부터 계산하였다. 결과는 모든 3개의 시험된 융합 단백질 PDL1-3F2 IgG1, 3F2-mIL12-3A, 및 3F2-mIL12-3A-mIFNa4가 비슷한 결합 친화성으로 hPL1-His에 결합할 수 있다는 것을 보여주었다. 비-특이적 효과는 관찰되지 않았다.

실시예 21. IL12에 대한 결합 친화성의 결정

정제된 His-태깅된 재조합 마우스 IL12RB2 단백질(mIL12R-B2-His; Sino Biological Inc., Cat#: 50099-M08H)과 3F2-mIL12-3A, 3F2-mIL12-3A-mIFNa4 사이의 결합 친화성을 사전-고정된 단백질 A 센서 칩이 장착된 Biacore^TM(Biacore Inc., Piscataway N.J.) T200 바이오센서를 사용하여 SPR에 의해 측정하였다. 실험을 실시예 5에 기재된 바와 같이 유사한 방법에 의해 수행하였다. 시험된 융합 단백질에 대한 결과는 하기 표에 나타나 있다.

[표 25]

결과는 시험된 융합 단백질 3F2-mIL12-3A 및 3F2-mIL12-3A-mIFNa4 둘 모두가 비슷한 결합 친화성으로 mIL12R-B2-His에 결합할 수 있다는 것을 보여주었다. 비-특이적 효과는 관찰되지 않았다.

실시예 22. 생체내 약리학적 검증

hPD-1/hPD-L1 마우스 모델(Biocytogen Pharmaceuticals(Beijing) Co., Ltd.로부터 입수됨, Cat# 120522)을 키메라 PD-1 단백질 및 키메라 PD-L1 단백질을 발현하도록 조작하였다. 키메라 PD-1 단백질은 마우스 PD-1 단백질의 세포외 영역의 일부를 상응하는 인간 PD-1 세포외 영역으로 대체하는 것을 포함한다. 키메라 PD-L1 단백질은 마우스 PD-L1 단백질의 세포외 영역의 일부를 상응하는 인간 PD-L1 세포외 영역으로 대체하는 것을 포함한다.

인간화 마우스 모델(hPD-1/hPD-L1)은 인간과 마우스 PD-1 또는 PD-L1을 발현하는 일반 마우스에서의 임상 결과 간의 차이를 유의하게 감소시킴으로써 임상 환경에서 새로운 치료학적 치료를 시험하기 위한 도구를 제공한다. 인간화 PD-1 마우스, PD-L1 마우스 및 hPD-1/hPD-L1 마우스 모델에 관한 상세한 설명은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/CN2017/090320, PCT/CN2017/099574, 중국 출원 제201710505554.0호 및 중국 출원 제201710757022.6호에서 찾아볼 수 있다.

PD-1/PD-L1 이중 인간화 마우스(5주령 내지 8주령)에 마우스 결장암 세포 MC38(5 Х 10⁵개/100 μl PBS)을 피하 주사하고, 종양 부피가 약 100 mm³ 내지 150 mm³까지 성장했을 때, 마우스를 종양 크기 기준으로 대조군 및 6개의 치료군으로 나누었다(n = 7/군). 치료군을 인간화 항-인간 PD-L1 항체 PDL1-3F2 IgG1 치료(1 mg/kg 또는 3 mg/kg), 융합 단백질 3F2-mIL12-3A 치료(1.82 mg/kg 또는 5.46 mg/kg), 또는 융합 단백질 3F2-mIL12-3A-mIFNa4 치료(2.11 mg/kg 또는 6.34 mg/kg)에 대해 무작위로 선택하였다. 3F2-mIL12-3A 및 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 몰 투여량(예를 들어, 몰/kg)은 PDL1-3F2 IgG1의 몰 투여량과 동일하였다. 대조군 마우스에 동일한 부피의 생리 식염수(PS)를 주사하였다. 투여 빈도는 주 2회(총 6회 투여)였다. 종양 부피를 주 2회 측정하고, 또한 마우스의 체중을 쟀다. 마우스의 종양 부피가 3000 mm³에 도달했을 때 안락사를 수행하였다.

[표 26]

전반적으로, 각 그룹의 마우스는 건강했다. 모든 치료군 및 대조군 마우스의 체중은 증가하였고, 체중은 서로 명확하게 다르지 않았다(도 42 및 도 43). 도 44에 도시된 바와 같이, 대조군의 종양은 실험 기간 동안 계속 성장하였다. 대조군 마우스와 비교할 때, 치료군의 종양 부피는 대조군보다 작았다. 따라서, 항-인간 PD-L1 항체 PDL1-3F2 IgG1 및 2개의 융합 단백질 3F2-mIL12-3A, 3F2-mIL12-3A-mIFNa4는 잘 관용되었고, 마우스에서 종양 성장을 억제하였다.

하기 표는 그룹화 당일(0일차), 그룹화 14일 후(14일차), 및 실험 종료 시(25일차)의 종양 부피; 종양이 없는 마우스의 수; 마우스의 생존율; 종양 성장 억제 값(TGI_TV); 및 치료군과 대조군 간의 마우스 종양 부피의 통계적 차이(P 값)를 포함하여, 본 실험에 대한 결과를 요약한 것이다.

[표 27]

실험 종료(25일차) 시, 각 그룹의 체중이 증가하였고, 치료군(G5 제외)과 대조군 마우스 간에 유의한 차이가 없었다. G5 그룹 마우스의 체중은 G1 그룹 마우스의 체중보다 낮았지만, G5 그룹 마우스는 실험 기간 내내 계속 체중이 증가하였고, 체중은 실험 종료 시 약 10% 증가하였다. 체중 변화의 명확한 차이는 관찰되지 않았다. G5 그룹의 마우스가 실험의 종료 시 더 낮은 종양 부피를 가졌다는 것을 고려하면, G5 그룹과 G1 그룹 간의 체중 차이는 주로 종양 중량에 의해 초래된 것이었다. 결과는 항-인간 PD-L1 항체 PDL1-3F2 IgG1 및 2개의 융합 단백질 3F2-mIL12-3A, 3F2-mIL12-3A-mIFNa4가 마우스에 의해 잘 관용되었다는 것을 시사한다.

모든 치료군(G2 내지 G7)의 종양 부피는 대조군(G1)보다 작았다. 결과는 또한 항-인간 PD-L1 항체 PDL1-3F2 IgG1 및 2개의 융합 단백질 3F2-mIL12-3A, 3F2-mIL12-3A-mIFNa4가 상이한 종양 억제 효과를 가졌고, 이것이 투여량-의존적이었다는 것을 보여주었다. 동일한 조건(예를 들어, 투여 용량 및 빈도) 하에, 융합 단백질(G4 내지 G7)의 억제 효과는 다른 항-PD-L1 항체(G2 및 G3)보다 우수했다. 이는 PD-L1 항체에 대한 IL12의 융합이 PD-L1 항체의 생체내 효능을 개선할 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 동일한 투여량에서, 3F2-mIL12-3A의 효과는 3F2-mIL12-3A-mIFNa4의 효과보다 약간 더 우수하며, 이는 인터페론 알파(예를 들어, INFa4)의 융합이 3F2-mIL12-3A의 종양 억제 효과를 추가로 촉진하지 않을 수 있다는 것을 시사하였다.

상기 결과는 2개의 융합 단백질(3F2-mIL12-3A, 3F2-mIL12-3A-mIFNa4)이 PD-1/PD-L1 이중 인간화 마우스에서 PDL1-3F2 IgG1과 비교하여 유의하게 더 우수한 종양 성장 억제 효과를 나타냈다는 것을 보여주었다. 또한, 이러한 융합 단백질은 마우스에서 명확한 독성 효과를 갖지 않았다.

실시예 23. PD-1/CD40 BsAB에 대한 생체내 결과

CD40은 면역계에서 항원-제시 세포(APC)의 표면에 존재하는 주요 면역 공동-자극 경로 수용체이며, 선천 및 적응 면역 시스템 기전의 활성화에서 중요한 역할을 한다. 현재 개발 중인 항-CD40 항체는, 예를 들어, Apexigen에 의해 개발된 APX005M, Roche에 의해 개발된 RG7876(셀리크렐루맙), Viela Bio에 의해 개발된 VIB4920, 및 Alligator Biosciences에 의해 개발된 ADC-1013을 포함한다. 본 실험에서, 항-CD40 단클론성 항체 셀리크렐루맙(VH SEQ ID NO: 130; VL SEQ ID NO: 131; scFV SEQ ID NO: 132)을 선택하여 중쇄 3A 부위 및 중쇄 C-말단에서 항-PD-1 단클론성 항체 1A7-H2K3-IgG4와 조합하여 이중특이적 항체를 생성하였다. 생성된 항체를 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(SEQ ID NO: 133에 제시된 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 134에 제시된 경쇄 서열을 가짐) 및 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(SEQ ID NO: 135에 제시된 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 136에 제시된 경쇄 서열)로 명명하였다.

hPD-1/hCD40 마우스 모델(Biocytogen Pharmaceuticals(Beijing) Co., Ltd.로부터 입수됨, Cat# 120526)을 키메라 PD-1 단백질 및 키메라 CD40 단백질을 발현하도록 조작하였다. 키메라 PD-1 단백질은 마우스 PD-1 단백질의 세포외 영역의 일부를 상응하는 인간 PD-1 세포외 영역으로 대체하는 것을 포함한다. 키메라 CD40 단백질은 마우스 CD40 단백질의 세포외 영역의 일부를 상응하는 인간 CD40 세포외 영역으로 대체하는 것을 포함한다.

인간화 마우스 모델(예를 들어, B-hCD40 마우스, 또는 이중 인간화 CD40/PD-1 마우스(B-hPD-1/hCD40 마우스))은 인간과 마우스 CD40 또는 PD-L1을 발현하는 일반 마우스에서의 임상 결과 간의 차이를 유의하게 감소시킴으로써 임상 환경에서 새로운 치료학적 치료를 시험하기 위한 새로운 도구를 제공한다. 인간화 CD40, 인간화 PD-1 및 이중 인간화 CD40/PD-1 마우스 모델에 관한 상세한 설명은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT/CN2018/091845 및 PCT/CN2017/090320에서 찾아볼 수 있다.

이전의 생체내 약물 효능 실험과 유사하게, 항체를 결장 암종의 마우스 모델에서 생체내 종양 성장에 대한 이들의 효과에 대해 시험하였다. 인간 PD-L1을 발현하는 MC-38 암 종양 세포(결장 선암종 세포)(MC38-hPD-L1)를 이중 인간화 CD40/PD-1 마우스(B-hPD-1/hCD40 마우스)에 피하 주사하였다. 마우스의 종양이 약 400 mm³의 부피에 도달했을 때, 마우스를 종양 부피 기준으로 상이한 그룹(그룹 당 8마리 마우스)으로 무작위 배정하였다.

각 그룹에서, B-hPD-1/hCD40 마우스에 인산염-완충 염수(PBS, G1), 1 mg/kg의 항-CD40 단클론성 항체 셀리크렐루맙(셀리크렐루맙-IgG2, G2), 1 mg/kg의 항-PD-1 단클론성 항체 1A7-H2K3-IgG4(G3), 1 mg/kg의 1A7-H2K3-IgG4와 조합한 1 mg/kg의 셀리크렐루맙(G4), 1.35 mg/kg의 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5), 또는 1.35 mg/kg의 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G6)을 복강내(i.p.) 투여에 의해 주사하였다. 투여 빈도는 주 2회(총 6회 투여)였다. 세부 사항은 하기 표에 나타나 있다.

[표 28]

마우스의 체중을 전체 치료 기간 동안 모니터링하였다. 상이한 그룹에서 마우스의 평균 체중은 모두 상이한 정도까지 증가하였다(도 45a, 및 도 45b). 모든 마우스는 처리 기간의 종료 시 상이한 그룹들 중에서 체중이 증가하였다.

항체로 처리된 그룹에서의 종양 크기는 도 45c에 제시되어 있다. 17일차(그룹화 17일 후)에 TGI_TV%를 하기 표에 나타낸 바와 같이 계산하였다. 하기 표의 P 값은 17일차의 데이터에 기초하여 계산하였다.

[표 29]

결과는 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5)와 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G6) 둘 모두가 단클론성 항체(G2 및 G3) 및 항체 조합(G4)보다 높은 TGI_TV%(예를 들어, 17일차에)로 종양 성장을 억제하였다는 것을 보여주었다. 결과는 PD-1/CD40 이중특이적 항체 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4 및 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4의 융합 단백질이 우수한 효능으로 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있었다는 것을 시사한다.

또 다른 실험에서, PD-1/CD40 이중특이적 항체의 독성을 마우스에서 시험하였다. 이중 인간화 CD40/PD-1 마우스(약 7주령)를 이들의 체중에 따라 상이한 그룹(그룹 당 3마리 마우스)에 무작위로 배정하였다. 다음 항체들 중 하나를 무작위로 선택하고, 그룹화 당일 및 그 후 3일마다 투여하였다: 항-CD40 단클론성 항체 셀리크렐루맙(G2), 항-PD-1 단클론성 항체 1A7-H2K3-IgG4(G3), 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G4) 및 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5). 대조군(G1)에 PBS를 주사하였다.

[표 30]

도 46a 및 도 46b에 도시된 바와 같이, 실험 결과는 G2 그룹 마우스만 유의한 체중 감소를 나타냈고, 다른 치료군에서 마우스의 체중은 대조군 마우스와 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다는 것을 보여주었다.

그룹화 후 7일차에, 말초 혈액을 수집하여 아스파라긴 아미노트랜스페라제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스페라제(ALT)의 농도를 검출하였다. 도 47a 및 도 47b에 도시된 바와 같이, ALT 및 AST 검출 결과는 G2 그룹 마우스(항-CD40 단클론성 항체 셀리크렐루맙이 투여됨)에서 ALT 및 AST 아미노트랜스페라제 둘 모두의 농도가 가장 높았다는 것을 보여주었다. 이중특이적 항체 그룹(G4 및 G5)에서 아미노트랜스페라제 농도는 G2 그룹보다 낮았다.

그룹화 후 10일차에, 마우스 간을 단리하고, 현미경으로 검사하였다. 결과는 하기 표에 나타나 있으며, 이는 이중특이적 항체 1A7-셀리크렐루맙-FV3A-IgG4(G5)의 독성이 단클론성 항체(G2 및 G3) 및 1A7-셀리크렐루맙-FVHC-IgG4(G4)의 독성보다 낮았다는 것을 보여주었다.

결과는 PD-1/CD40 이중특이적 항체의 3A 구조 형식이 항-CD40 항체의 독성을 유의하게 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 결과는 PD-1/CD40 이중특이적 항체의 3A 구조 형식이 PD-1/CD40 이중특이적 항체의 HC 구조 형식보다 더 낮은 독성을 나타냈다는 것을 시사한다.

[표 31]

기타 구현예

본 발명은 이의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하려는 것이며 이를 제한하려는 것은 아니고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 범위에 의해 규정된다는 것을 이해해야 한다. 기타 양태, 이점, 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Biocytogen Pharmaceuticals（Beijing）Co., Ltd <120> MODIFIED IMMUNOGLOBULINS <130> 1 <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1-heavy chain constant region(CH) <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 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75 80 Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 135 <211> 716 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A7-selicrelumab-FVHC-IgG4 heavy chain <400> 135 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 450 455 460 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp 465 470 475 480 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp Leu 485 490 495 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr 500 505 510 Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 515 520 525 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 530 535 540 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu Thr 545 550 555 560 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 565 570 575 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 580 585 590 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 595 600 605 Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met 610 615 620 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp 625 630 635 640 Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly 645 650 655 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu 660 665 670 Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 675 680 685 Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr Phe Asp 690 695 700 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 705 710 715 <210> 136 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1A7-selicrelumab-FVHC-IgG4 light chain <400> 136 Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala 115 120 125 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 130 135 140 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 145 150 155 160 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly 165 170 175 Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp 180 185 190 Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp 195 200 205 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys 210 215 220 Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 245 250 255 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 260 265 270 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 275 280 285 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 290 295 300 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 305 310 315 320 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 340 345 350

Claims

제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드,
제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드
를 포함하는 폴리펩티드 복합체로서,
제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제1항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제1항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제3항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제1항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제5항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제2항, 제4항 또는 제6항에 있어서, 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기와 제2 아미노산 잔기 사이의 야생형 CH3 도메인에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 결실되는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 CH2 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 CH2 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 CH1 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 중쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 CH1 도메인을 추가로 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 복합체는 2개의 경쇄 폴리펩티드를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 복합체는 IgG-유사 항체인, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 링커 서열을 통해 제1 폴리펩티드에 연결되는, 폴리펩티드 복합체.
제14항에 있어서, 링커 서열은 5개 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제14항 또는 제15항에 있어서, 링커 서열은 적어도 4개의 글리신 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 서열은 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 30)와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 6개 초과의 아미노산 잔기를 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 약 6개 내지 500개의 아미노산 잔기를 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 가용성 폴리펩티드인, 폴리펩티드 복합체.
제20항에 있어서, 가용성 단백질은 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35, 또는 IL-36)인, 폴리펩티드 복합체.
제21항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 IL3, IL4, IL5, IL6, IL-7, IL8, IL9, IL13, IL15, 또는 IL-21인, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 단쇄 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 단일-도메인 항체(나노바디))를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제23항에 있어서, 단쇄 항원-결합 폴리펩티드는 세포 항원(예를 들어, 이펙터 세포 항원)에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 막관통 단백질(예를 들어, 형질전환 성장 인자 베타 수용체 2(TGFbR2)) 또는 분비 단백질의 가용성 부분(예를 들어, 세포외 영역)을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 리간드(예를 들어, ATOR1015-CD86)인, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 나노바디(예를 들어, KN035) 또는 VHH인, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 복합체 내의 제3 폴리펩티드는 단리된 제3 폴리펩티드와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 수준의 생물학적 활성을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 복합체는 모 폴리펩티드 복합체와 비교하여 표적에 대해 대략 동일하거나 더 높은 수준의 결합 친화성을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 복합체는 2개의 항원에 특이적으로 결합하고, 폴리펩티드 복합체는 동일한 2개의 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 발현 수준을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 형태로 응칩체를 형성하지 않는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 형태의 폴리펩티드 복합체는 Fc 수용체에 결합할 수 있는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 scFv를 포함하고, scFv는 단리된 scFv와 비교하여 대략 동일하거나 더 높은 수준의 결합 친화성을 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제4 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 제4 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제2 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제34항에 있어서, 제4 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제34항에 있어서, 제4 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 제2 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제36항에 있어서, 제4 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제34항에 있어서, 제4 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 제2 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제38항에 있어서, 제4 폴리펩티드는 제2 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제2 CH3 도메인의 위치 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 제5 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제40항에 있어서, 제5 폴리펩티드는 링커 서열을 통해 제1 폴리펩티드의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제41항에 있어서, 링커 서열은 10개 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제42항에 있어서, 링커 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 9)와 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는, 폴리펩티드 복합체.
제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 폴리펩티드는 10개 초과의 아미노산 잔기를 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 폴리펩티드는 약 10개 내지 500개의 아미노산 잔기를 갖는, 폴리펩티드 복합체.
제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제5 폴리펩티드는 사이토카인인, 폴리펩티드 복합체.
제46항에 있어서, 사이토카인은 IFNa4인, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제6 폴리펩티드를 추가로 포함하고, 제6 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 C-말단에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 노브-인-홀(KIH) 기법을 통해 이종이량체를 형성하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하여 항원-결합 부위를 형성하고, 제2 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하지 않는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 제1 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하여 제1 항원-결합 부위를 형성하고, 제2 폴리펩티드는 제2 경쇄 폴리펩티드와 상호작용하여 제2 항원-결합 부위를 형성하고, 제1 항원-결합 부위 및 제2 항원-결합 부위는 동일한 항원 또는 상이한 항원에 특이적으로 결합하는, 폴리펩티드 복합체.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 복합체는 폴리펩티드 복합체 내의 제3 폴리펩티드가 제3 폴리펩티드에 대한 결합 파트너와 상호작용하지 않는 경우 Fc 수용체에 결합할 수 있는, 폴리펩티드 복합체.
변이체 Fc를 포함하는 단백질로서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 변이체 Fc에 융합되는, 단백질.
제53항에 있어서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 및 383에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
제54항에 있어서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 변이체 Fc에 융합되는, 단백질.
제55항에 있어서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
제53항에 있어서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 변이체 Fc에 융합되는, 단백질.
제57항에 있어서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 357, 358, 359, 360, 361, 362, 및 363에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
변이체 Fc를 포함하는 단백질로서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 383 내지 위치 391의 영역에서 변이체 Fc에 융합되는, 단백질.
제59항에 있어서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 및 392에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
변이체 Fc를 포함하는 단백질로서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 383 내지 위치 385의 영역에서 변이체 Fc에 융합되는, 단백질.
제61항에 있어서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 382, 383, 384, 385, 및 386에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
변이체 Fc를 포함하는 단백질로서, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 413 내지 위치 422의 영역에서 변이체 Fc에 융합되는, 단백질.
제63항에 있어서, 폴리펩티드는 변이체 Fc의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 변이체 Fc의 위치 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 및 423에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단백질.
제53항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, Fc는 IgG Fc인, 단백질.
제53항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, Fc는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc인, 단백질.
제53항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, IgG-유사 항체 또는 면역글로불린(예를 들어, IgM, IgD, IgE, IgA, 또는 IgG)인, 단백질.
제53항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)인, 단백질.
제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드,
제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드
를 포함하는 폴리펩티드 복합체로서,
제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 383 내지 위치 391의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제69항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 및 392에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드,
제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드
를 포함하는 폴리펩티드 복합체로서,
제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 383 내지 위치 385의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제71항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 382, 383, 384, 385, 및 386에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드,
제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드
를 포함하는 폴리펩티드 복합체로서,
제3 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 413 내지 위치 422의 영역에서 제1 CH3 도메인에 융합되는, 폴리펩티드 복합체.
제73항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 제1 CH3 도메인의 제1 아미노산 잔기 및 제2 아미노산 잔기에 연결되고, 제1 및 제2 아미노산 잔기는 EU 넘버링에 따른 제1 CH3 도메인의 위치 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 및 423에서의 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드 복합체.
제1 비-천연 폴리펩티드 서열을 포함하는 제1 중쇄 폴리펩티드;
제2 중쇄 폴리펩티드;
제1 경쇄 폴리펩티드; 및
제2 경쇄 폴리펩티드
를 포함하는 변형된 항체로서,
제1 중쇄 폴리펩티드와 제1 경쇄 폴리펩티드는 서로 회합하여 제1 항원 결합 영역을 형성하고,
제2 중쇄 폴리펩티드와 제2 경쇄 폴리펩티드는 서로 회합하여 제2 항원 결합 영역을 형성하고,
제1 비-천연 폴리펩티드 서열은 EU 넘버링에 따른 제1 중쇄 폴리펩티드의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제1 중쇄 폴리펩티드에 융합되는, 변형된 항체.
제75항에 있어서, 제2 중쇄 폴리펩티드는 제2 비-천연 폴리펩티드 서열을 포함하고, 제2 비-천연 폴리펩티드 서열은 EU 넘버링에 따른 제2 중쇄 폴리펩티드의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 제2 중쇄 폴리펩티드에 융합되는, 변형된 항체.
제75항 또는 제76항에 있어서, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 동일한 항원에 특이적으로 결합하는, 변형된 항체.
제75항 또는 제76항에 있어서, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역은 상이한 항원에 특이적으로 결합하는, 변형된 항체.
제75항 또는 제76항에 있어서, 제1 항원 결합 영역 및/또는 제2 항원 결합 영역은 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는, 변형된 항체.
제75항 또는 제76항에 있어서, 제1 비-천연 폴리펩티드 서열 및/또는 제2 비-천연 폴리펩티드 서열(예를 들어, scFV 또는 나노바디)은 세포 항원(예를 들어, 이펙터 세포 항원)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는, 변형된 항체.
제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 폴리펩티드는 제1 중쇄 폴리펩티드의 C-말단에 연결되는, 변형된 항체.
제75항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 폴리펩티드는 제2 중쇄 폴리펩티드의 C-말단에 연결되는, 변형된 항체.
CH2, 및 CH3의 제1 부분을 포함하는 제1 영역;
비-천연 폴리펩티드 서열을 포함하는 제2 영역;
CH3의 제2 부분을 포함하는 제3 영역
을 포함하는 융합 폴리펩티드로서,
CH3의 제1 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 341-343을 포함하고, CH3의 제2 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 383-447을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
제83항에 있어서, CH3의 제1 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 341-350을 포함하고, CH3의 제2 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 363-447을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
제83항에 있어서, CH3의 제1 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 341-357을 포함하고, CH3의 제2 부분은 EU 넘버링에 따른 CH3 도메인의 아미노산 잔기 363-447을 포함하는, 융합 폴리펩티드.
제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 영역은 VH 및/또는 CH1을 추가로 포함하는, 융합 폴리펩티드.
2개의 경쇄 폴리펩티드; 및
제83항 내지 제86항 중 어느 한 항의 융합 중쇄 폴리펩티드 중 2개
를 포함하는 변형된 항체.
제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위,
제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위
를 포함하는 다중특이적 항체로서,
제2 항원 결합 부위가 제2 항원에 특이적으로 결합하는 경우, 다중특이적 항체의 이펙터 기능은 억제되거나 감소되는, 다중특이적 항체.
제88항에 있어서, 다중특이적 항체는 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 중쇄 CH3 도메인에 융합되는, 다중특이적 항체.
제88항에 있어서, 다중특이적 항체는 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 중쇄 CH3 도메인에 융합되는, 다중특이적 항체.
제88항에 있어서, 다중특이적 항체는 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 중쇄 CH3 도메인에 융합되는, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원은 종양 세포로부터의 것이고, 제2 항원은 이펙터 세포로부터의 것인, 다중특이적 항체.
제92항에 있어서, 이펙터 세포는 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 마이크로파지, 수지상 세포, 또는 호중구인, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위가 제1 항원에 특이적으로 결합하고 제2 항원 결합 부위가 제2 항원에 결합하지 않는 경우 다중특이적 항체는 이펙터 기능을 유도하는, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 기능은 ADCC 또는 ADCP인, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 부위는 단쇄 항원-결합 폴리펩티드(예를 들어, scFv 또는 나노바디)를 포함하는 폴리펩티드 내에 위치하는, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 부위는 다중특이적 항체의 CH3 도메인에서 융합된 scFv 또는 나노바디 내에 위치하는, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 CH1 도메인 또는 CH2 도메인의 N 말단에 연결된 scFv 또는 나노바디인, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 부위는 VH 및 VL에 의해 형성되는, 다중특이적 항체.
제88항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인, 다중특이적 항체.
항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위,
결합 파트너와 특이적으로 상호작용하는 결합 폴리펩티드
를 포함하는 변형된 항체로서,
항원 결합 부위는 변형된 항체에 융합된 폴리펩티드 내에 위치하고, 항원 결합 부위가 수용체에 특이적으로 결합하는 경우 변형된 항체의 이펙터 기능은 억제되거나 감소되는, 변형된 항체.
제101항에 있어서, (1) 결합 폴리펩티드는 리간드이고, 결합 파트너는 리간드에 대한 수용체이거나, (2) 결합 폴리펩티드는 수용체의 가용성 부분이고, 결합 파트너는 수용체와 특이적으로 상호작용하는 리간드인, 변형된 항체.
제101항 또는 제102항에 있어서, 변형된 항체는 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 344 내지 위치 382의 영역에서 중쇄 CH3 도메인에 융합되는, 변형된 항체.
제101항 또는 제102항에 있어서, 변형된 항체는 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 351 내지 위치 362의 영역에서 중쇄 CH3 도메인에 융합되는, 변형된 항체.
제101항 또는 제102항에 있어서, 변형된 항체는 중쇄 CH3 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 중쇄 CH3 도메인의 위치 358 내지 위치 362의 영역에서 중쇄 CH3 도메인에 융합되는, 변형된 항체.
제1항 내지 제105항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제105항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 인코딩하는, 핵산.
제107항의 핵산을 포함하는, 벡터.
제107항의 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 생산하기 위한 방법으로서, 폴리펩티드, 폴리펩티드 복합체, 또는 항체를 생산하기에 적합한 조건 하에 제109항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.