JPH0276899A - 双特異性抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、異なる２つの抗原のそれぞれに同時に反応す
ることのできる双特異性抗体の製造法に関するものであ
る。

異なる２つの抗原のそれぞれに同時に反応することので
きる双特異性抗体が、産業上実用的な品質および価格で
供給できるようになれば、免疫反応を利用したたとえば
次のような各種の用途にその有用性を発揮することがで
きる。

（１）測定すべき物質に存在する抗原と、測定上有用な
標識化合物、たとえは蛍光色素や酵素などに存在する抗
原との双方に特異的に反応する抗体からなる双特異性抗
体を使用した前者の抗原を有する物質の定性的または電
機的測定。

（２）測定すべき物質に存在する抗原と、抗体を保持す
るに有用な担体に存在する抗原との双方に特異的に反応
する抗体からなる双特異性抗体を使用した前者の抗原を
有する物質の同相法による定性的または定屓的測定。

（３）除去またはＭ８すべき物質に存在する抗原と、抗
体を保持するに有用な担体に存在する抗原との双方に特
異的に反応する抗体からなる双特異性抗体を使用した面
者の抗原を有する物質の同相法による除去または精製。

（／【）治療すべき標的細胞に存在する抗原と、治療に
適した薬物またはナチュラルキラー細胞なとの攻撃細胞
に存在する抗原との双方に特異的に反応する抗体からな
る双特異性抗体を使用した標的細胞の治療。

（従来の技術および本発明が解決しようとする課題） １分子の抗体は１８Ｍ抗体と分泌型１ｇＡ抗体を除き、
１分子の軽鎖（以下り鎖と略称）と１分子の重鎮（以下
Ｈ鎖と略称）がジスルフィド結合により結合して成り立
つ半分子が、さらに２つ会合し、Ｈｍ間でジスルフィド
結合を介して、結合したものであることが知られている
。１分子の抗体は通常同価の抗原認識能を持つ半分子が
２つ結合することにより構成されているが、自然界には
通常存在しないと考えられている抗原認識能の異なる半
分子同士を結合させた２つの異なる抗原認識能を有する
双特異性抗体の作製法がいくつか報告されている。

たとえば（Ａ）ニソノフ（Ｎ　１ｓｏｎｏｆｆ）らは・
５ｃｉｅｎｃｅ、　　ｖｏｌ、１３４．　ｐ　３７６−
３７９　（１９６４）に、２種類のウサギ完全グロブリ
ンを用いて、まずＨｆｆ１間のジスルフィド結合を選択
的に還元し、得られた半分子の異なるもの同士を再結合
する双特異性抗体の作製法を報告している。

同じく（Ｂ）ニソ、ノフ（Ｎ１５ｏｎｏｆｆ）　　らは
、Ａｒｃｈ、　Ｒｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、
　Ｖｏｌ、　８９．　ｐ２３０−２４４　（１９６０）
、ならびに同、　　Ｖｏｌ、　９３．　ｐ４６０−４６
２　（１９６０）に、完全抗体の代わりに、たとえはペ
プシンのような適当なプロテアーゼで切断したＦ（ａｂ
　’　）２　　を用いて同様に双特異性抗体を作成する
ことができることを報告している。

（ｃ）ラソ（Ｒａｓｏ）およびグリフイン（Ｇｒｉｆｆ
ｉｎ）　　らは、　Ｆｅｄ、　　Ｐｒｏｃ、、Ｖｏｌ、
　３７．　　ｐ１３５０　　（１９７８）　に、細胞毒
性薬剤を所望の！ＪＩ織表面表面異的に供給する手段と
しての双特異性抗体の利用について報告している。

（Ｄ）ミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らは、Ｐｒ
ｏｃ、　　Ｒ，Ｓｏｃ、　　Ｌｏｎｄ、、　　ＶＯｌ、
　　８２＋１．　　ｐ　　３９３−４１２（１９８１）
に、腫瘍細胞を特異的に処理するためここ、毒性物質の
キャリアとしてモノクローナル抗体を使用する可能性を
述べ、Ｆ（ａｂ’）２は良好な標的剤であると報告して
いる。

（Ｅ）ポーラス（Ｐａｕｌｕｓ、　Ｈｅｎｒｙ、　Ｐ、
）らは、特表昭５８−５０２１８２号に、２種類の異な
る抗原に反応するＦ（ａｂ’）２を、それぞれ還元剤と
してメルカプトエチルアミンを用いて還元して半分子と
したのち、一方の半分子のチオール基を　　５．５′−
ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（以下ＤＴＮＢと略
称）で修飾し、他方の半分子のチオール基と反応させて
双特異性抗体を作製する方法を報告している。

（Ｆ）ミルシュタイン（Ｍｉ　ｌ５ｔｅ＋ｎ）およびフ
ェロ（ｃｕｅｌｌｏ）らはＮａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　
３０５．　ｐ　５３７−５４０（＋９８３）に、それぞ
れ異なる抗体を生成する２種類の細胞を融合させて、双
特異性抗体を産生しうるハイブリドーマを作成する方法
を報告している。

すなわちこの方法は、異なるモノクローナル抗体を産生
ずるマウスハイブリドーマをさらに融合させて、得られ
たハイブリッド・ハイブリドーマより双特異性抗体を得
るという方法である。

（Ｇ）リーディング（ｃ，Ｌ、　Ｒｅａｄｉｎｇ）らは
、米国特許４，４７４，８９３号および特閏昭５８−５
９９９４号に、ハイブリッド・ハイブリドーマとしてク
アドローマまたはトリオーマを作り、双特異性組換えモ
ノクローナル抗体を製造する方法を報告している。

同様の手法による双特異性抗体についてはこの他に、　
（Ｈ）−１Ｆルバラン（Ｊ、　Ｒ，Ｆ、　Ｃｏｒｖａｌ
ａｎ）らが、　　　（”、ａｎｃｅｒ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、１ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２４：ｐ　　１３３−１３
７゜（１！３８７）に、癌胎児性抗原（ｃＥＡ）に対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとビンカアル
カロイドに対するモノクローナル抗体産生ハイブリド−
マを融合させたハイブリッド・ハイブリドーマを作成し
て双特異性抗体を作製する方法を報告している。

また、　　（１）ランザベチア（Ａ、　Ｌａｎｚａｖｅ
ｃｃｂｉａ）らは、　　Ｅｕｒｏｐ、　　、１．　　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　　ｖｏｌ、　　１７．　　ｐ　１０５
−Ｉｔｌ　（１９８７）ζこ、ヒト細胞障害性Ｔ細胞に
対する抗体産生ハイブリドーマと各種抗原に対する抗体
埋土ハイブリドーマを融合させたハイブリッド・ハイブ
リドーマを報告している。

このように双特異性抗体の調製および有用性については
既に多くの報告または特許が公開されているが、それら
には、それぞれ以下のような問題点がある。

たとえば、（Ｅ）の方法においては、異なる抗原に反応
する２秤項のＦ（ａｂ’）２を、それぞれ還元剤で還元
して半分子とした後、還元剤を分離しなけれはならず、
操作が煩雑である。　　ざらに一方の半分子のチオール
基をＤＴＮＢで修飾する際のＤ　′ｒＮ　Ｂ濃度が低濃
度であるため、反応効率が悪く、かつ目的とするチオー
ル基間以外の部位でのジスルフィド化反応を惹起する恐
れがある。

一般に、　（Ａ）〜（Ｅ）のような化学的手法による双
特異性抗体の製造においては、Ｉ（鏡開にジスルフィド
結合が一つしか存在しないウサギ抗体などを使用すれば
特別な問題はないと考えられているが、マウス　１ｇＧ
抗体などのように、Ｈ鏡開のジスルフィド結合が３個所
存在するような場合には、ジスルフィド結合を選択的に
切断しても、抗原特異性の異なるＨ鏡開でジスルフィド
結合を再構成するときに、分子内ジスルフィド結合など
の目的以外のジスルフィド結合が生じるため、双特異性
抗体な高収率で得ることは難しいと考えられてきた。

そこで、このような問題を解決する方法として、目的と
するチオール基以外のチオール基を保護したのちにＨ鏡
開でジスルフィド結合を再構成する方法が報告されてい
る。

たとえば、　（Ｊ）ポーラス（Ｐａｕｌｕｓ、　Ｈｅｎ
ｒｙ、　Ｐ、）らは特表昭６１−５０１４１８号におい
て、また（■０ブレナン　（Ｍ、　Ｂｒｅｎｎａｎｎ）
らは、　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ。

２２９、ｐ　８１−８３　（１９８５）において、２種
類の異なる抗原に反応するＦ（ａｂ’）２を、それぞれ
メルカプトエチルアミンで還元して半分子とするが、そ
の際に隣接するチオール基を保護し、同一分子内でジス
ルフィド結合が生じないようにするために、亜ひ酸化合
物（たとえば亜ひ酸ナトリウム）を使用する方法につい
て述べている。

しかしこの方法によれば、人体に有毒な亜ひ酸化合物を
その反応過程で使用するために、得られた双特異性抗体
を人体に投与することは、安全性の面で危険を伴うもの
と考えられる。

一方（Ｆ）〜（Ｉ）のようなハイブリッド・ハイブリド
ーマから双特異性抗体を調製する方法によれば、２種類
の異なる初期し鎖とＨ鎖の可能な組合せのすへての抗体
分子が混合物として産生されるため、目的の双特異性抗
体を得るために、混合物をざらにイオン交換クロマトグ
ラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによ
り高度に精製する必要があり、目的の双特異性抗体を低
収率でしか得られないという問題点を有していた。

以上本発明者らが、本発明を完成した時点においては、
毒性上の問題がなく、人体に投与するに好適な双特異性
抗体を高収率に製造する方法は完成していなかった。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、前記した従来の双特異性抗体の製造法が
抱える問題点を解決すべく鋭意検討した結果、特定手段
を用いることにより抗体断片の還元反応に使用した還元
剤を分離せずに、引続き、ワンポットで、一方のＦａｂ
’のチオール基の活性化を行った後、他方のＦａｂ　’
と抗体半分子間の分子問結合反応を行えること、ならび
にチオール基活性化剤を特定濃度で使用することにより
反応に関与しないチオール基を無保護状態で反応させて
も効率よく分子間のジスルフィド結合反応が進行し、高
収率に双特異性抗体が得られることを見いだし、本発明
を完成した。

生訓婁嬰后 本発明は、異なる抗原決定基を認識する抗体に由来する
二種類のＦ（ａｂ’）２を、それぞれキレート化剤を共
存させながらジチオール型環元剤によろ遣元反応に付し
、遊離のチオール基を有するＦａｂ′を得る反応工程（
ａ）、該反応液から還元剤を分離せずに、反応工程（ａ
）により得られた一方のＦａｂ’を含有する反応液に、
過剰濃度のチオール基活性化剤を存在させてＦａｂ’の
チオール基を活性化する反応工程（ｂ）、ならびに反応
工程（ｂ）で得られたチオール基の活性化された Ｆａｂ’と反応工程（ａ）で得られた遊離のチオール基
を有する他方のＦａｂ’とを反応させ、異なる抗原決定
基を認識するＦ（ａｈ　’　）２を合成する反応工程（
ｃ）からなることを特徴とする特異性抗体の製造法であ
る。

肚許立主五 Ｆ（ａｂ’ル：本発明では、免疫グロブリンのＨ鎖のＮ
末端側２本とＬ鎖の２本がジスルフィド結合を介して結
合した２価の免疫グロブリン断片を意味する。

Ｆａｂ’　：　　Ｆ（ａｂ　’　）２のＨ鏡開ジスルフ
ィド結合を適当な還元剤で処理してジスルフィド結合を
切断したものとする。

Ｆａｂ’−ＮＢ：　Ｆａｂ’の遊離チオール（ＳＨ’）
基に５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）　（
ＤＴＮＢ）を反応させて、チオニトロ安息香酸誘導体の
形にしたもの。

抗体Ａ：反応工程（ｂ）において、Ｆａｂ“−ＮＯを製
造するための原料となる抗体。

抗体Ｂ：反応工程（ｃ）において、抗体人由来のＦａｂ
’−ＮＢと反応させる遊離チオール基を有するＦａｂ’
の原料となる抗体。

Ｄ　Ｔ　Ｎ　Ｂ：　５，５’−ジチオビス（２−ニトロ
安息香酸） （５，５’−Ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ　（２−ｎｉｔｒｏ
ｂｅｎｚｏｉｃ　　ａｃｉｄ））ＤＴＴ：　ジチオスレ
イトール （Ｄｉｔｈｉｏｔ、ｈｅｒｅｉｔｏ１）ＳＰＤＰ：　Ｎ
−サクシニミジル３−（２−ピリミジルチオ）プロピオ
ン酸エステル（Ｎ−５ｕｃｃｉｎｉ−ｍｉｄｙｌ　３−
（２−ｐｙｒｉｍｉｄｙｌｔｈｉｏ）　ｐｒｏｐｉｏｎ
ａｔｅ）ＳＡＭＳＡ：無水Ｓ−アセチルメルカプトコハ
ク酸 （Ｓ−Ａｃｅｔｈｙｌｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉ
ｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）ＣＤ　３　：　　（ｃ１ｕｓ
ｔｅｒ　Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ　３　）リンパ球表面
抗原に関するワークショップにより決められた成熟Ｔ細
胞の表面抗原 （Ｒｈｅｉｎｈｅｒｔｚ、　Ｅ、　Ｌ、、　Ｈａｙｎｅ
ｓ、　Ｂ、　Ｆ、、　Ｎａｄ−ｌｅｒ　Ｌ、　Ｍ、　ａ
ｎｄ　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ、　１．　Ｄ、　（ｅｄ、）
：Ｌｍ玉吏−」旦」−旦Ｕ■−Ｉｔ、　Ｓｐｒｉｎ３ｅ
ｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（１９８６）　　参照）ＣＤ　１
６　：（ｃ１ｕｓｔｅｒ　Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ　１
６　）リンパ球表面抗原に関するワークショップにより
決められたＮ　Ｋ　ｍ胞および好中球の表面抗原 （Ｒｈｅｉｎｈｅｒｔ、ｚ、　Ｅ、　ｌ４．、　ｔｌａ
ｙｎｅｓ、　Ｂ、　Ｆ、。

Ｎａｄｌｅｒ、　Ｌ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｂｅｒｎｓｔｅ
ｉｎ、　１．　Ｄ、（ｅｄ、）：ｅ′９Ｉ１．　Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（１９８６）参照）ＮＫ細胞：ナ
チュラルキラー細胞 え匪夏見腟力１月 罷体 本発明方法の原料として使用する抗体は、それが認識す
る抗原の種類、抗体の免疫グロブリンとしてのクラスお
よびサブクラス、その抗体の由来（動物種）、その製造
法によっては制限されない。

すなわち、抗体は動物細胞（’１１胞、腫瘍細胞など）
、生理活性蛋白質（各種サイト力イン、ティシュ−・プ
ラスミノーゲン・アクチベーター。

アンチスロンビンなとの線溶凝固因子、アビジン。

ストレプトアビジンなど）、酵素（ペルオキシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、各種オキシダ
ーゼなど）、癌マーカー（ｃＥＡ、ＡＦＰなとの癌胎児
性抗原、ＣＡ　　１９−９など）、蛍光物質（フィコエ
リスリンなどのフィコビリ蛋白など）ハブテン（各種芳
香族化合物、各種ヌクレオシド、各種ヌクレオチド、各
種アミノ酸、ビオチンなど） 各種医薬品（ビンカアルカロイド、アドリアマイシン、
プレオマイシン、アドリアマイシンＤ。

ニトロソウレア類、シスプラチン、シタラビン。

５−フルオロウラシル、リシンなどの抗腫瘍剤など）、
微生物（各種ウィルス、各種細菌、各種カビなと）に特
異性を有するものを使用することができる。

免疫グロブリンの種類は［ｇＣ；（ＴｇＧＩ、ＩｇＧ２
ａ、［ｇＣ；２ｂ、　　１ｇＧ３など）またはＩｇＡが
好ましい。

抗体の由来としては、マウス、ラット、ヒト、ウサギ、
ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシなどの哺乳類、ニワトリなど
の鳥類を挙げることができる。これらのうち、とりわけ
マウス由来の抗体が好ましい。

抗体の製法としては、公知の方法が適用される。

すなわち、ハイブリドーマ法、ＥＢＶ）ランスフフオー
ム法などのモノクローナル抗体を製造する方法、動物に
抗原を接種し、血清から抗体を製造する方法、抗体遺伝
子によってトランスフェクトされた細胞（微生物、動物
など）を培養して製造する方法などによって抗体を製造
することができる。

本発明の反応の出発原料であるＦ（ａｂ’）２は公知の
方法によって製造することができる。

たとえば抗体を、その免疫グロブリンの種類により使い
分けて、ペプシンまたはパパインなどの蛋白分解酵素を
使用して分解し、■■鎖のＣ末端側断片を除去すること
によって製造できる（たとえばパルハム（Ｐａｒｈａｍ
、　Ｐ、）ら　１．１ｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｖｏｌ、　５３．　ｐ　１３３−１
７３　（１９８２）参照）。

−−１“１ Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド結合を還元して、Ｆａｂ
’を得る反応は、キレート化剤の存在下ジチオール型環
元剤を作用させることによって行うことができる。

ジチオール型環元剤としては、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）が最も好ましいが、ＤＤＴの代わりにジチオエリ
スリトールなど他のジチオール型環元剤を使用すること
もてきる。

反応は、キレート化剤（たとえば、エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）など）を含有する緩衝液（たとえば、
トリス塩酸緩衝液）中、室温付近で数十分〜数時間で完
了する。

なお、反応を、不活性ガス（たとえば、窒素ガスなど）
の雰囲気下で行うことにより、より反応を効率よく進行
させることができる。

−レ　・′、　　　近Ｌ〔程二り山０−）反応工程（ａ
）により得られた、一方のＦａｂ’　（抗体へより得ら
れたもの）の遊離のチオール基を活性化する反応は、反
応工程（ａ）の反応液から前記還元剤をを分離除去せず
に過剰量のチオール基活性化剤を作用させることにより
行うことができる。

チオール基活性化剤としては、ＤＴＮＢが好ましいが、
ＤＴＮＢの代わりに、たとえば２，２′−ジピリジルジ
スルフィドまたは４，４′−ジピリジルジスルフィドを
使用することもできる。

本発明において、反応液中のチオール基活性化剤の濃度
を過剰量とすることは、分子内ジスルフィド化反応を防
ぐために必須である。具体的には、可能な限りＦａｂ　
’の遊離チオール基をチオニトロ安息香酸誘導体とする
ことができる程度の過剰型であることが必要であり、通
常５〜２０ｒｎＭ程度が好適である。

反応は、室温付近において数十分〜数時間で終了する。

なお、反応を不活性ガス（窒素ガスなど）雰囲気下で行
ってもよい。

反応終了後、ゲルｙ！！過などの分子ふるい処理を行う
ことによって反応工程（ｃ）の反応を阻害する試薬を除
去し、反応工程（ｃ）に供する。

′　　　　　　　ニロＬｂヨユ 反応工程（ｂ）により得られたチオール基の活性化され
たＦａｂ’　（Ｆａｂ’−ＮＢ）と、反応工程（ａ）に
より得られた遊離のチオール基を有する他方のＦａｂ’
　（抗体Ｂより得られたもの〉を、ジスルフィド交換反
応により反応させ、抗体Ａと抗体Ｂの双方にに対応する
抗原決定基認識能のあるＦ（ａｂ“）２を再構成し、本
発明の目的物である双特異性抗体を製造することができ
る。なお、Ｆａｂ’−ＮＯとＦａｂ　’とを反応させて
、Ｆ（ａｂ’）２に再構成させること自体は公知である
。

反応は、Ｆａｂ”−ＮＢを含む溶液とＦａｂ　’を含む
溶液を、Ｆａｂ’−ＮＢとＦａｂ’が等モル数付近にな
るように混合し、０°Ｃ〜室温程度で数時間〜数十時間
反応することにより完でする。

また、反応は、不活性ガス（窒素ガスなど）の雰囲気下
で行うことにより効率よく進行する。

反応後、公知慣用の方法（ゲル濾過など）により目的物
を精製することができろ。

（実施例） 以下、実施例によって本発明の双特異性抗体の製造法を
より具体的に説明する。

実施例　１ 抗体Ａとして抗（４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル
）−アセチル抗体（抗ＮＰ抗体）、抗体Ｂとして抗２，
４−ジニトロフェニル抗体（抗ＤＮＰ抗体）を使用した
。まずパルハム（Ｐａｒｈａｍ、　Ｐ、）らの方法に従
って両抗体を還元剤非存在下でパパイン処理しそれぞれ
をＦ（ａｂ’）２とした。次に抗ＮＰ抗体のＦ（ａｂ’
）２を窒素ガスで飽和させた　Ｔ　Ｂ　Ｓ／Ｅ　Ｄ　Ｔ
Ａ温溶液以下、０．１５Ｍの食塩と３ｍＭのＥＤＴＡを
含有するｉｏｍＭ）リス塩酸緩衝液をＴＢＳ／ＥＤＴＡ
という）に溶解させ、ＤＴＴを最終濃度が０．５１１Ｉ
Ｍになるように加え、素早く窒素ガスを反応溶液に吹き
付けながら鏡開ジスルフィド結合を還元して遊離チオー
ル基にしたＦａｂ　’を調製した。　　３０分間尺応後
、反応溶液と等容量の１０ｍＭＤＴＮＢ含有ＴＢＳ／Ｅ
ＤＴＡ溶液を加え還元反応を停止すると同時にＦａｂ”
と　ＤＴＮＢとの結合物であるＦａｔ＋’−ＮＢを形成
させた。反応終了後、ＴＢＳ／ＥＤＴＡで充分に平衡化
したセファデックス０２５の分子ふるいカラムに通し、
過剰の試薬を除去してＦａｂ’−ＮＢを得た。

一方、抗ＤＮＰ抗体より得られたＦ（ａｂ’）２につい
ても、同様に窒素ガスで飽和したＴＢＳ／ＥＤＴ　Ａ溶
液中で１ｍＭＤＴ’ｆ’を作用させ、鏡開ジスルフィド
結合を還元して遊離チオール基にしたＦａｂ“を調製し
た。　　還元後セファデックス（７２５カラムによって
過剰のＤＴＴを除去した。

抗ＤＮＰ抗体よりＦａｂ’を調製した直後に、抗ＮＰ抗
体より調製したＦａｂ’−Ｎｊ３を、出発のＦ（ａｂ’
）２のＯＤ　２８０から計算１ノで等全混合し、限外濾
過で約１０　ｍｇ／ｍｌになるように濃縮し、窒素ガス
置換を続けなから４°Ｃ１４８時間反応さｔｔな。

反応溶液をゲル濾過することにより反応生成物であるＦ
（ａｈ’）２と未反応の化合物を分離した。

これにより、約８５〜９ｏｚがＦ（ａｂ’）２として回
収された。また得られたＦ（ａｂ’）２の一定量をＤＮ
Ｐ結合セファ０−ス４Ｂ　　（ファルマシア製）または
ＮＰ結合セファ０−ス４８　　カラムにかけ、それぞれ
のハブテンに対する結合能を調べた結果、約５χがＮＰ
結合セブ７０−ス４Ｂに結合せずに溶出した。

実施例　２ ヒトＴ細胞表面抗原のＣＤ３に対する特異的モノクロー
ナル抗体であるＯ　Ｋ　Ｔ　３抗体（マウスＩ　ｇＧ２
ａ、オーツダイアグノスティックシステム（株）製）と
、抗腫瘍抗体として全ての腫瘍細胞に反応するといわれ
ているＨＢＪ１２７抗体（マウスＩｇＧ１、橋本嘉幸ら
、Ｇａｎｎ、　７６、　ｐ　３８６−３９４　（１９８
５）参照）を用いた。航者はパパインで、後者はペプシ
ンで消化してそれぞれＦ（ａｈ　’　＞２とした。つい
で両者を実施例１と同様にＤＴＴで還元したのち、後者
にζ、ｔＤＴＮＢを加えて遊離のチオール基を安定なチ
オニトロ安息香酸誘導体とし、前者のＤＴＴで還元した
Ｆａｂ’の遊離のチオール基と反応させ、双特異性抗体
とした。またＤＴＮＢのかわりに、従来からの方法であ
る５ＰＤＰおよびＳＡＭＳＡを用いる方法でも双特異性
抗体を調製し相互に比較した。

その結果、反応最終液をＴＳＪ（２０００（東ソーＨ製
）カラムにかけ０．０１　Ｍリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢ
Ｓ）で溶出し分析したところ、ＤＴＮＢをチオール基活
性化剤として使用した場合にはＦ（ａｂ’）２が８０１
の効率で検出されたが、ＳＰ［）Ｐを使用した場合には
１０〜２０χであった（第２図）。ＳＡＭＳＡを使用し
た場合は２０〜３０χであった。また、ＮＫ細胞感受性
のに５６２細胞またはＮＫ＠胞抵抗抵抗性ａｕｄ　ｉ細
胞を標的細胞とし、正常ヒト末梢血単核球細胞（ＰＭＢ
Ｃ）をエフェクター細胞として、双特異性抗体がエフェ
クター細胞の標的細胞に対する細胞障害活性を増強する
効果をみた。標的細胞（Ｔ）をＳＩＣ，でラベルしたの
ちに、正常ヒト末梢血より、Ｃｏｎｒａｙ−Ｆｉｃｏｌ
［比重遠心法（矢田純−ら、［リンパ球機能検索法」第
１７頁、１９８０年、■中外医学社発行）で分離したＰ
ＭＢＣ（エフェクター細胞（Ｅ））と、Ｔかに５６２細
胞の場合にはＥ／Ｔ＝０．５、ＴがＤａｕｄ　ｉ細胞の
場合にはＥ／Ｔ＝２０で混合し双特異性抗体を加えて、
４時閉培養し、”Ｃｒの遊離試験法（矢田純−ら、　「
リンパ球機能検索法」第３５３頁、１９８０年、ｎ中外
医学社発行）により細胞障害活性を測定した。

その結果、Ｋ　５６２ｍ胞、Ｄａｕｄ　ｉ細胞のどちら
に対してもＤＴＮＢを使用して調製された双特異性抗体
は他のチオール基活性化剤を使用して調製された双特異
性抗体に比べＰＭＢＣの細胞障害活性を著しく増強した
く第３図）。

実施例　３ ヒ）ＴＲＩ胞表面表面抗原Ｄ３に対する特異的モノクロ
ーナル抗体である０ＫＴ３抗体（マウスＩｇＧ２ａ、　
　オーツダイアグノスティックシステム（株）製）と、
ヒ）　Ｎ　Ｋ細胞表面抗原のＣＤＩ（３に対するモノク
ローナル抗体であるＭＧ１２（マウスＩｇＧ１、久留米
大学医学部横山三男教授から入手）を用いた。前者はパ
パインで、後者はペプシンで消化してそれぞれＦ（ａｂ
’）２とした。ついでＤ　Ｔ　１’で還元したのち、後
者にＤＴＮＢを加えてチオール基を安定なＴＮＢ誘導体
とし、前者の還元したＦａｂ’のチオール基と反応させ
、双特異性抗体とした。

（発明の効果） （１）ジスルフィド結合の還元反応において還元剤とし
てＤＴＴを使用し、キレート化剤を存在させることによ
り、有害な亜ひ酸ナトリウムなどの分子内ジスルフィド
結合生成阻害剤を使用することなく、高収率にＦａｂ　
’を生成させることができる。

（２）反応工程（ａ）終了後、Ｆａｂ　’と還元剤を分
離せずに遊離チオール基の活性化反応を行うことができ
るので反応工程が簡便である。

（３）反応工程（ｂ）において高濃度のＤＴＮＢを使用
することにより、遊離チオール基のチオニトロ安息香酸
化を十分に行うことができ、分子内ジスルフィド結合反
応の生成を抑制することができる。

（４）以上の特徴が相まって、高い生物活性を有する双
特異性抗体を高収率に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の基本概念をしめしたものであり、　第
２図は実施例２の方法で調製された双特異性抗体のゲル
濾過分析パターンであり、第３図は実施例２の方法で調
製された双特異性抗体の細胞障害活性を示す。 特許出願人　株式会社日本免疫研究所 第１図 抗ｆ本Ａ　　　　　　抗イ本Ｂ 双特異性抗体 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）異なる抗原決定基を認識する抗体に由来する二種類
   のＦ（ａｂ’）＿２を、それぞれキレート化剤を共存さ
   せながらジチオール型環元剤による還元反応に付し、遊
   離のチオール基を有するＦａｂ’を得る反応工程（ａ）
   、該反応液から還元剤を分離せずに、反応工程（ａ）に
   より得られた一方のＦａｂ’を含有する反応液に、過剰
   濃度のチオール基活性化剤を存在させてＦａｂ’のチオ
   ール基を活性化する反応工程（ｂ）、ならびに反応工程
   （ｂ）で得られたチオール基の活性化されたＦａｂ’と
   反応工程（ａ）で得られた遊離のチオール基を有する他
   方のＦａｂ’とを反応させ、異なる抗原決定基を認識す
   るＦ（ａｂ’）＿２を合成する反応工程（ｃ）からなる
   ことを特徴とする双特異性抗体の製造法。 ２）ジチオール型環元剤が、ジチオスレイトールである
   請求項１記載の双特異性抗体の製造法。 ３）チオール基活性化剤が５、５’−ジチオビス（２−
   ニトロ安息香酸）である請求項１記載の双特異性抗体の
   製造法。 ４）チオール基活性化剤の濃度が５〜２０ｍＭである請
   求項１記載の双特異性抗体の製造法。 ５）反応工程（ａ）および（ｃ）を不活性ガス雰囲気下
   で行う請求項１記載の双特異性抗体の製造法。