PT87096B - Processo para a preparacao dum derivado de um enzima fibrinolitico - Google Patents

Processo para a preparacao dum derivado de um enzima fibrinolitico Download PDF

Info

Publication number
PT87096B
PT87096B PT87096A PT8709688A PT87096B PT 87096 B PT87096 B PT 87096B PT 87096 A PT87096 A PT 87096A PT 8709688 A PT8709688 A PT 8709688A PT 87096 B PT87096 B PT 87096B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
human
immunoglobulin
group
amidinophenyl
enzyme
Prior art date
Application number
PT87096A
Other languages
English (en)
Other versions
PT87096A (pt
Inventor
Richard Anthony Godwin Smith
Sarkis Barret Kalindjian
Original Assignee
Beecham Group Plc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beecham Group Plc filed Critical Beecham Group Plc
Publication of PT87096A publication Critical patent/PT87096A/pt
Publication of PT87096B publication Critical patent/PT87096B/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de derivados de um enzima fibrinolítico em que o local catalítico no enzima que é responsável pela actividade fibrinolitica é bloqueado por uma imunoglobulina especifica ou por um seu fragmento, ligado ao mesmo por um grupo de ligação reversível e dirigido contra um antigénio associado a componentes de material trombótico.
processo compreende a reacção de uma imunoglobulina facultativamente modificada com um enzima fibriBEECHAM GROUP p.l.c.,
PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DUM DERIVADO DE UM ENZIMA FIBRINO LITICO
nolitico e com um agente de ligação.
E também referido o processo para a preparação de agentes de ligação de fórmula (III)
(III) z’ em que R^ a R4 são hidrogénio ou porções atractoras de electrões, Z ê um contra ião e n é um inteiro de 3 a 8, por reacção de compostos de fórmula (IV)
(IV) com compostos de fórmula V
MH //
C \ +
MH3 (V)
Este invento refere-se a derivados de enzima para utilização no tratamento e/ou profilaxia de doenças trombóticas.
A Patente Europeia No. 0.009.879 divu£ ga derivados de enzimas fibrinoliticos in vivo que são agentes terapêuticos úteis para o tratamento da trombose vencsa. Os derivados são caracterizados por o local catalítico activo dos enzimas ser bloqueado por um grupo que é removível por hidrólise, de maneira que a constante de velocidade de pseudo primeira ordem para a hidrólise varia entre 10 e 10 segundo -1.
A PE-A 0155388 divulga mais derivados de enzimas fibrinoliticos em que o local catalítico do enzima que é responsável pela actividade fibrinolitica está bloqueado por uma proteína humana ligada ao mesmo por meio dum grupo de ligação reversível. Estas proteínas, quando ligadas reversivelmente aos locais activos das enzimas fibrinoliticos, podem produzir derivados de enzimas com baixas velocidades de remoção fisiológica.
Descobriu-se agora que determinadas proteínas da classe imunoglobulina podem, quando ligadas aos locais activos de enzimas fibrinoliticas por utilização dos reagentes divulgados na EP-A-0155388, mediar a distribuição da actividade fibrinolitica a locais alvos definidos pelas especificidades de ligação das imunoglobul inas.
De acordo com o presente invento, proporciona-se um derivado dum enzima fibrinolitico em que o local catalítico do enzima que ê responsável pela actividade fibrinolitica está bloqueado por uma imunoglobul ina especifica, ou um fragmento da mesma, ligada àquele por um grupo de ligação reversível e orientada para um antigénio associado a componentes de substância trombôtica.
Como é aqui utilizado, a expressão grupo de ligação reversível compreende grupos que são removíveis por hidrólise a uma velocidade tal que a constante de velocidade de pseudo primeira ordem para a hidrólise se “6 —1 —3 —1 situa entre 10 seg e 10 seg~ , num meio aquoso isotónico, a um pH de 7,4 e a 3 7°C.
A constante de velocidade preferida
-5 -1 -4 -1 varia entre 1 x 10 seg e 8 x 10 seg
Convenientemente, o local catalítico do enzima é bloqueado por um grupo de estrutura I (Im)-B-A-X- (I) em que (Im) é uma imunoglobulina especifica com odefinido anteriormente, opcionalmente modificada por tratamento com um reagente específico de cadeia linear de amino ácido para incluir um grupo de ligação de proteína,
X é um grupo acilo de fórmula
O
II
-R-Cem que R é um resíduo aromático ou alifático, A é um grupo ponte compreendendo pelo menos um hetero átomo seleccionado a partir de oxigénio, enxofre e azoto, em que o azoto é opcionalmente substituído por alquilo C^-Cg, e B é um grupo de ligação hidrofílico linear, ligado ao grupo de ligação de proteína em (Im).
O termo enzima fibrinolitico é utilizado aqui para significar qualquer enzima que demonstra actividade fibrinolitica in vivo como definido na Patente
Europeia No. 0009 879 (US 4285932). 0 termo inclui aqui aqueles enzimas que actuam por proteõlise directa de fibrina (tal como plasmina) e aqueles que actuam por activação de plasminogénio (tal como um activador de plasminogénio de tecido humano Zt-PA7, urocinase (ambos de alto e baixo peso molecular e as formas de cadeia simples) e complexos de estreptocinase com plasmina). Tais enzimas são possíveis de obter a partir de urina, sangue ou tecidos de mamífero, ou por métodos de ADN recombinante, tais como aqueles em que organismos hospedeiros heterólogos, tais como bactérias, fermentos, fungos e linhas de células de mamíferos, expressam genes especificadores dos enzimas. 0 termo também inclui:
(a) as proteínas híbridas fibrinoliticamente activas como as divulgadas na PE-A-0155387;
(b) os derivados de enzimas fibrinoliticos como os divulgados na PE-A-0155388;
(c) os conjugados de proteinas como divulgadas na PE-A-0152736;
(d) os conjugados compreendendo um enzima fibrinolitico ligado a pelo menos um polímero solúvel em água por meio dum grupo de ligação reversível, como divqlgado na PE-A-0183503;
(e) muteínas de enzimas fibrinoliticos naturais, tais como as divulgadas na PE-A-0201153, PE-0207589, W0-8604351 e PE-0199574.
Conforme é aqui utilizado, o termo imunoglobulina compreende o soro e proteinas secretoras das classes IgG, IgA, IgD, IgM e IgE e as suas subclasses reconhecidas obtidas por antigénios específicos a partir de espécies animais tais como o homem, coelhos, carneiros, ca bras, vacas, cavalos, porcos e roedores. 0 termo cobre, quer os produtos de resposta imune policlonal em animais, quer os produtos expressos por células de hibridoma monoclonal em cultura. Estão também incluídos os fragmentos de mimunoglobulina produzidos por degradação proteolitica ou química das proteínas intactas e que retêm os domínios responsáveis pela ligação de antigénios específicos. Exemplos de tais fragmentos podem ser as formas monoméricas e diméricas do domínio Fab. As imunoglobulinas e os seus domínios da expressão heterôloga de cADN codificadores de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina (ou os fragmentos ou os seus híbridos) estão também incluídas no termo.
termo especifico como é aqui utilizado para descrever as imunoglobulinas, refere-se à propriedade de ligação de alta afinidade de tais imunoglobulinas para com um conjunto simples ou restrito de estruturas químicas afins (determinantes de antigénios), que caracteriza a massa trombótíca ou as variações patológicas subjacentes da estrutura dos vasos sanguíneos que podem provocar o aumento quer directa. quer indirectamente dos fenomenos trombóticos. Exemplos de tais entidades antigénicas associadas ao trombo ou a lesões podem ser os complexos de glicoproteinas Ilb/IIa e Ia de plateletes humanas activadas(Thrombos. Haemostas. 55, 153-157, 1986 e Blood 68, 733-786, 1986 ), determinantes antigénicos presentes na fibrina polimérica ou monomérica (mas não no fibrinogénio precursor) tais como os expostos pela remoção de fibrinopeptidos A e B durante a formação de coágulos (Science 1983 Vol. 222, 1129-1132), as proteínas de membrana de eritrocitos humanos(Biochem. Biophys. Acta. 1974 342, 69-80) e linfócitos (Arthritis Rheum. 18, 1-8 1975), colagénios dos tipos encontrados nas lesões arterioescleróticas e neoantigénios expressos por células do endotélio e subendotélio vascular durante o desenvolvimento da placa acteromatosa (Clin. Sei. 69 supplement 12, 80 p, 1985).
i
Exemplos adequados de imunoglobulinas especificas para utilização neste invento podem ser a imunoglobulina G anti-(glicoproteína de membrana de eritrocito humano) policlonal de coelho (Biochem. Biophys, Acta. 1974 342, 69-80) e imunoglobulina G anti-(fibrina humana) monoclonal de rato (Science 1983 vol. 222, 1129-1132).
Exemplos de grupos X adequados incluem grupos derivados dos grupos de bloqueamento descritos na Patente Europeia No. 0.009.879. Os grupos preferidos são grupos de benzoilo substituídos facultativamente, conforme está descrito na Patente Europeia atrás mencionada, substitu^ dos adicionalmente na posição 2 ou 4 pelo grupo A, grupos de acriloilo facultativamente substituídos, também descritos na Patente Europeia atrás mencionada, e ligados a A pela posição 2 ou 3 e naftoilo.
Os grupos A adequados são aqueles que proporcionam uma estabilização suficiente do acil-enzima resultante de modo a se obter uma constante de velocidade de pseudo primeira ordem para a hidrólise que varia dentro do intervalo atras indicado, e preferivelmente entre 1 x 10 e 8 x 104 seg-1.
A compreende de preferencia um ou dois heteroátomos.
Exemplos de A são:
- NH T
Ra
- NH - O - S -
- N - NH -
Ra Ra
O - NH
R em que R é um grupo alquilo θ
ο grupo de ligação de proteína é uma funcionalidade derivada por modificação da imunoglobina com um reagente ί-
específico para uma ou mais cadeias laterais de amino ácido e que
contém um grupo capaz de reagir com um grupo B.
Os exemplos de grupos B são alcanos -°10
susbstituídos tais como 6-aminohexilo, ou polímeros lineares tais como polietileno glicol, propileno glicol, poli-glicina, poli alanina ou poli-sarcosina. 0 grupo B linear pode conter facultativamente uma secção de clivagem para facilitar a análise do derivado ou para reagir com o grupo de ligação de proteína tal como aqueles derivados de um derivado de 3-tio-propionilo ou 2-tio-acetilo da função w-amino alcano ou polímero. Um exemplo de uma secção de clivagem é uma ligação de bíssulfureto. De preferência, a ligação de bissulfureto é derivada da reacção de (Im) com o grupo B linear e é assim produzida na ligação de B com (Im). Alternativamente, a secção de clivagem pode compreender uma função α, β dihidroxi.
Preferivelmente, B é uma estrutura do tipo -S-(CH_)--CONH-(CHO) - em que n varia entre 0 e 8, mais preferic á Zn velmente entre 2 e 8. Exemplos de B podem ser
Como exemplo, a produção de uma função de tiol livre por reacção da imunoglobulina especifica com
2-iminotiolano ou tiolactona de homocisteína de N-acetilo permite a ligação do grupo de ligação de proteína a uma estrutura B tiol-reactiva. Alternativamente, o grupo de ligação de proteína pode conter uma entidade tiol-reactiva tal como o grupo 6-maleimidohexilo ou um grupo 2-piridi1-ditio que pode reagir com um tiol livre em B. De preferencia, o grupo de ligação de proteína é derivado de agentes de modificação de proteínas tais como 2-iminotiolano que reage com grupos de έ-amino de lisina em proteínas.
' De preferencia, a proteína (Im) da fórmula (I) é da classe IgG, de origem monoclonal do rato e ou é modificada para introduzir 1-3 grupos tiol, ou é fragmentada e reduzida parcialmente para produzir um domínio Fab contendo uma função tiol simples, como descrito por exemplo por L. Hudson e F.C. Hay 'Practical Immunology1 1, 196-199, Blackwell, Oxford 23 Ed. 1980,
Os derivados do presente invento podem ser preparados por reacção em conjunto de uma imunoglobulina especifica facultativamente modificada para incluir um grupo de ligação de proteína, com um enzima fíbrinolitico e com um agente de ligação possuindo uma metade capaz de reagir com o local catalítico do enzima e uma metade capaz de reagir com um grupo amino de proteína ou um grupo de ligação de proteína para formar um grupo de ligação reversível, como definido atrás.
Em particular, os derivados do presente invento podem ser preparados por reacção em conjunto com uma imunoglobulina especifica que foi modificada facultativamente por tratamento com um reagente especifico de cadeia lateral de amino ácido para incluir um grupo de ligação de proteína, com um agente de acilação de fórmula (II) (II)
em que Β, A e X são como definidos para a fórmula (I), U representa um grupo capaz de reagir directamente com a cadeia lateral de amino ácido de uma imunoglobulina especifica ou, quando a imunoglobulina inclui um grupo de ligação de protei na, W representa um grupo capaz de reagir com o grupo de ligação, 1 representa um contra-ião, preferivelmente um haleto ou p-toluenossulfonato, e cada um de R1 a R4 representa hidrogénio ou uma metade de remoção de electrões que aumenta a reactividade de um éster de amidinofenilo;
e por reacção com a imunoglobulina produzida desse modo com um enzima fibrinolitico.
Os novos agentes de acilação de fórmula (II) fazem parte do invento.
Em particular, o invento proporciona agentes de acilação de fórmula (III):
(III)
Zj
em que n é um inteiro entre 3 e 8 mais preferivelmente entre e 6, Z é um contra-ião e cada umè R^a R^ representa hidrogénio ou uma metade de remoção de electrões que aumenta a reactividade de um éster de amido-fenilo.
Descobriu-se surpreendentemente que quando o comprimento da ponte de alquileno no composto de fórmula III é aumentado, se dá uma redução correspondente da constante Φ velocidade de hidrólise (K) dos derivados do invento preparados a partir do composto.
A gama de variação preferida de constantes de velocidade para um derivado do invento para tratamento -4 de enfarte do miocárdio agudo varia entre 1.9 x 10 e
6.4 x 10 , correspondendo a uma meia vida de desacilação de aproximadamente 1-3 horas. Os novos agentes de acilação de fórmula (III) permitem a preparação de derivados do invento com constantes de velocidade dentro da gama preferida.
Quando W representa um grupo capaz de reagir directamente com a cadeia lateral de amino ácido de uma proteína é preferível um grupo de N-succinimidi lo. Quando W representa um grupo capaz de reagir com um grupo de ligação de proteína é preferível um grupo de piridiltio.
Facultatívamente, W pode ser um grupo fotoactivo tal como 2-nitro-4-azido fenilo.
Preferivelmente, cada um de R a R4 representa hidrogénio ou halogénio.
Os derivados do presente invento podem também ser preparados por tratamento duma imunoglobulina especifica, que foi modificada por tratamento com um reagente especifico de cadeia lateral de amino ácido para poder incluir um grupo de ligação de proteína, com um enzima fibrino-12-
litico o qual foi modificado por tratamento, com um agente de acilação de fórmula (II) em que W é um grupo capaz de reagir com o grupo de ligação de proteína, na proteína.
De preferencia, W é um grupo piridilt io.
Nos processos anteriores, a modificação da imunoglobulina especifica para introduzir um grupo de ligação de proteína é preferivelmente levada a cabo em meios tamponados aquosos a um pH entre 3,0 e 9,0, dependendo do reagente utilizado. Para um dos reagentes preferidos,
2-iminotiolano, o pH é preferivelmente 6.5-8,5. A concentração de imunoglobulina é preferivelmente elevada ( ?10 mg/ml) e o reagente de modificação ê utilizado com um excesso molor moderado (1,1 a 5 vezes) dependendo da reactividade do reagente. A temperatura e duração da reacção variam preferivelmente entre 0o e 40°C e entre 10 minutos e 7 dias. A extensão da modificação da proteína pode ser determinada por ensaios da imunoglobulina relativamente a grupos de ligação introduzidos.
Esses ensaios podem ser efectuados por técnicas químicas padrão sobre proteínas, tais como titulação com 5,5'-ditiobis(âcido 2-nitrobenzoico). Preferivelmente, introduzem-se em média 0,5-3,0 moles de um grupo de ligação de proteína por mole de imunoglobulina. A imunoglobulina modificada pode ser separada cts agentes de modificação em excesso por técnicas padrão tal como diálise, ultrafiltração, filtração de gel e precipitação de solvente ou sal. E normalmente desejável fazer-se reagir a imunoglobulina modificada com o agente de acilação ou com o enzima fibrinolitico acilado logo que possível, mas em certos casos, a substância intermediária pode ser guardada em solução congelada ou liofilizada.
A imunoglobulina modificada preparada da maneira descrita anteriormente pode ser feita reagir
com o agente de acilação de fórmula (II) sob condições semelhantes aquelas utilizadas para a introdução inicial do grupo de ligação de proteína, mas com as seguintes limitações:
(a) Para evitar a hidrólise do éster amidinofeni1ico, a gara de pH preferida varia entre 7,0 e 8,0 e preferem-se os tampõs não-nucleofi1icos.
(b) A temperatura preferida varia entre 0°C e 30°C e a duração da reacção pode ir até 6 horas.
(c) A relação molar do agente de acilação para o grupo de ligação de proteína varia de preferencia entre 1 e 10.
(d) A reacção pode, facultativamente, ser controlada por observação da libertação de um derivado de grupo W (p.e. 2-tiona de piridina).
(e) Por causa da reactividade do produto (um agente de acilação proteináceo), é desejável separar-se o produto do excesso de agente de acilação de fórmula (II) o mais rápido possível. Para este fim, pode-se utilizar a cromatografia de exclusão de dimensões de alto rendimento ou a diafiltração.
(f) 0 produto deve preferivelmente ser feito reagir imediatamente com o enzima fibrinolitico, mas pode ser armazenado numa solução congelada (não liofilizada) a menos de -40°C, durante pequenos períodos de tempo.
tratamento de uma imunoglobulina especifica não modificada com um agente de acilação de fórmula (II) é geralmente realizado sob condições semelhantes aquelas utilizadas para a introdução de um grupo de ligação de proteína. Contudo, a reactividade deste tipo de reagente exige que se tomem precauções semelhantes aquelas indicadas *1 nos parágrafos (a) a (f) anteriores.
Na situação do processo do invento que utiliza uma reacção entre uma imunoglobulina especifica modificada e um enzima fibrinolitico acilado, o enzima pode em primeiro lugar ser feito reagir com um agente de acilação de fórmula (II) sob as condições descritas para a introdução de grupos de bloqueamento no Pedido de Patente Europeia Publicado No. 0.009.879. Depois de ter sido liberto do excesso de reagentes pelas técnicas mencionadas anteriormente, o enzima acilado pode então ser feito reagir com a imunoglobulina contendo um grupo de ligação de proteína sob condições semelhantes às utilizadas nos parágrafos (a) a (d) anterior. Contudo, é preferível conduzir a ligação abaixo de 10°C(preferivelmente entre 0o e 4°C) a fim de minimizar a hidrólise do enzima acilado. Além disso, a imunoglobulina modificada pode ser utilizada com um grande excesso molar relativamente ao enzima acilado. As últimas condições também se aplicam à ligação entre um agente de acilação proteináceo e um enzima fibrinolitico.
Os derivados do presente invento podem ser separados dos componentes não reagidos em excesso por uma variedade de técnicas de separação. Geralmente, as técnicas preferidas exploram as especificidades de ligação quer do componente de enzima fibrinolitico, quer do componente de imunoglobulina. Assim, um conjugado de uma imunoglobulina G especifica com um activador de p1asminogénio de tecido humano pode ser purificado:
1) por passagem através duma coluna de lisina imobilizada para reter o activador de plasminogénio e remover a imunoglobulina, ou
2) por passagem através de colunas contendo quer a Proteina A Staphy1ococcus Aureus imobilizada, quer o antigénio contra o
qual se dirige a imunoglobulina (para remover o excesso de activador de plasminogénio).
Alternativamente, a última etapa pode ser realizada cfe preferencia por cromatografia de permeação de gel que explora a diferença entre os pesos moleculares do conjugado e do activador de plasminogénio não modificado.
Os agentes de acilação de fórmula (II) podem ser preparados por meio de uma variedade de processos standard. Uma das vias sintéticas gerais preferidas é apresentada em baixo.
(a) Reacção de um agente de acilação contendo uma funcionalidade reactiva mascarada (por exemplo), N-succinímidil-3-(2-piridilditio)propionato-SPDP) com um derivado de ácido benzoico 2- ou 4-substituido contendo uma função nucleofilica nos substituintes (por exemplo: ácido 4-hidrazinobenzoico, ácido N-2(6-aminohexi1)aminobenzoico ou ácido N-4(2-aminoeti1)aminobenzoico). As condições de reacção preferidas necessitam de piridina seca (ou outro solvente básico) à temperatura ambiente durante 1-48 horas.
(b) 0 ácido intermediário de (a) é esterificado com um sal de 4-amidinofenol (ou um seu derivado substituído no anel) utilizando-se diciclohexilcarbodiimida num solvente ligeiramente básico, como descrito para os agentes de bloqueamento simples na Patente Euripeia Publicada 0.009.879. E preferível utilizar-se um ligeiro excesso molar do amidinofenol (1,5 a 4 vezes) para assegurar uma esterificação eficiente. Facultativamente, a esterificação pode ser realizada na presença de ácido p-toluenossulfónico como um catalizador ácido.
invento também proporciona um processo para a preparação de novos compostos de fórmula (III) que compreende a esterificação de um ácido de fórmula(IV)
SS-(CH ) CONHtCH ) NH
2. 2 Π
com um álcool de fórmula (V):
NH
Z (V) nas quais as variáveis são como definidas para a fórmula (III).
Os derivados benzoicos apropriadamente substituidos para utilização na etapa (a) podem ser preparados de maneira convencional. Por exemplo, o ácido 4-fluo robenzoico pode ser esterificado com um álcool adequado tal como t-butanol, e o grupo fluor pode ser substituído por uma diamina adequada a temperaturas elevadas.
Os derivados deste invento são preferivelmente administrados como composições farmacêuticas.
Deste modo, o presente invento também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um derivado do invento em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
As composições de acordo com o inven-
to podem ser formuladas em conformidade com os processos de rotina como composições farmacêuticas adaptadas para administração intravenosa a seres humanos.
Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções do derivado esterilizado num tampão aquoso isotónico esterilizado. Quando necessário, a composição pode também incluir um agente solubi 1 izante para manter o derivado em solução e um anestético local tal como lignocaína para atenuar a dor no local da injecção. Geralmente, o derivado será fornecido na forma de dosagem unitária por exemplo como um pó seco ou um concentrado livre de água num contentor hermeticamente fechado, tal como uma âmpola ou um saquinho indicando a quantidade de derivado em unidades de actividade, bem como com uma indicação do tempo ao fim do qual a proteína não modificada livre será libertada. Quando o derivado deve ser administrado por injecção, o derivado é distribuído com uma ampola de água esterilizada para injecção. A composição injectável ou infusível será obtida por mistura dos ingredientes antes da administração.
A quantidade de material administrado dependerá da quantidade de fibrinólise requerida e da velocidade com que é requerida, da gravidade do estado trombo embólico e da posição e da dimensão do coágulo. A dose precisa a empregar e o modo de administração deve per force, em face da natureza da doença, ser dicída de acordo com as circunstâncias pelo médico que acompanha o tratamento. Contudo, em geral, um doente que está a ser tratado a um trombo receberá normalmente uma dose diária entre 0,10 e 10 mg/kg de peso corporal quer por injecção até cinco doses, quer por infusão. Para o tratamento da trombose coronária pode-se administrar uma dose semelhante sob a forma dum bolo intravenoso simples.
Os derivados deste invento podem também ser utilizados na prevenção de perturbações trombóticas, através da administração de doses semelhantes ao doente numa
altura antes da crise trombótica antecipada. Por exemplo, a prevenção ou a melhora da trombose venosa forte na sequência do trauma provocado pela cirurgia de substituição do osso ilíaco pode ser alcançada por meio da administração de um agente capaz de libertar a actividade fibrinolitica a um local com um trombo potencial, durante um período de horas, apôs a geração desse local por trauma cirúrgico. Um tal derivado deve ser administrado imediatamente antes do (ou possivelmente durante) o processo operatório.
Não estão indicados quaisquer efeitos toxicológicos prejudiciais para os compostos do invento dentro da gama de dosagem atrás descrita.
Deste modo, de acordo com um outro aspecto do invento proporciona-se um método de tratamento e/ou profilaxia de perturbações trombôticas, o qual compreende a administração ao mamífero com necessidade de tal tratamento e/ou profilaxia de uma quantidade não-toxica eficaz de um derivado do invento.
invento também proporciona a utilização dum derivado do invento para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de perturbações trombóticas.
Os seguintes Métodos e Exemplos ilustram o invento.
Métodos (a) Ensaio de substrato cromogénico
A urocinase e a t-PA foram ensaiadas contra os substratos cromogéicos (kabiVitrum, Suécia) S-2444 e S-2288, respectivamente a uma concentração de substrato de 1 mM em trietanolamina O,1M. HC1 pH 8,0 a 25°C. Um
SU é definido como a quantidade de actividade que proporciona um aumento de D.E. de 0,001/min em 1 ml de substrato numa célula de comprimento de precurso de 1 cm.
(b) Determinação da constante de velocidade
A constante de velocidade de pseudo primeira ordem é determinada por hidrólise do enzima-acilo sob condições fisiológicas, i.e. em meio aquoso isotónico a um pH de 7,4 e a 37°C. Ao fim de intervalos regulares, retiraram-se aliquotas e incubaram-® com um substrato cromogénico e a velocidade de conversão do substrato foi medida da maneira indicada anteriormente.
A hidrólise é mantida até à altura em que a velocidade de conversão do substrato atinge um máximo. A constante de velocidade K pode então ser calculada por traçagem do gráfico:
Lo3e(1-At/Amax) versus 1 em que Amax é a velocidade máxima à qual um aliquota converte um substrato e At é a velocidade à qual um aliquota converte um substrato ao fim do tempo t.
De preferêficia, estas constantes de velocidade são calculadas por análise de regressão não-linear computorizada, fornecendo-se os dados A e tempo à equação:
A. = A_ + (A_, - An) (1-e _kt) t o ' max o' ' ' em que Αθ é a actividade da preparação de enzima de acilo antes da desacilação.
(c( Ensaio da placa de fibrina em relação à actividade fibrinolitica
Prepararam-se placas de fibrina a partir de fibrinogénio humano a 0,4% (p/v) (Kabi, Flow Laboratories, Escócia) as quais foram dissolvidas em barbitona 0,029 M em NaCl 125 mM, pH 7,4, e estas foram fornecidas por meio duma pipeta (9 ml) a pratos de plástico quadrados de 10 x 10 cm (Sterilin) e coagulados por mistura rápida com 0,3 ml de trombina de bovino (50 unidades de NIH/ml, Parke-Davis, RU). As placas foram incubadas a 37° normalmente durante 18-24 h, mas poderiam sê-lo por mais tempo se necessário, e foram tingidas com azul de bromofenol aqLDso. Para cada zona de lise, mediram-se dois diâmetros perpendiculares um ao outro utilizando-se caliperes de Verbier. Para cada amostra obteve-se a média de todos od diâmetros, e esta foi convertida em actividade fibrinolitica através de uma curva de calibração.
Exemplo 1
Conjugado ligado ao centro activo de urocinase humana de alto peso molecular com ímunoglobulina G de anti-(glicoproteina de membrana de erítrocíto humano) policlonal de______ coelho, preparado por utilização de 4-N-/2-N-(3-f2-piridi1ditiojpropionillaminoetil/aminobenzoato de 4'-amidinofenilo
COO-UK lgG-NH~C-(CH2)3-S-S-(CH2)2-Ç-NH-(CH2)2-NH
NH 0
(a) Imunoglobulina G de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocito humano) de coelho de N- 6-(4-tiobutirimino)-/LISINA7
IgG policlonal de coelho desenvolvido sobre gl icoproteinas de eritrocito humano, como descrito por O.J. Bjerrum e P. Lundahl (Biochem.Biophys. Acta. 1974 342, 69-80),/3,0 ml de 30 mg/ml em 0,90% p/v de cloreto de sódio/ foi misturada com fosfato de sódio 0,05 M, cloreto de sódio, 0,1 M, 0,01% p/v de detergente Tween 80 pH 7,4 /tampão fosfato/ (1,0 ml) e adicicrou-se 2-iminotiolano acabado de preparar (50 μ 1 de 50 mM em água). A mistura foi incubada durante 30 minutos a 25°C e depois foi precipitada por adição de uma solução saturada cfe sulfato de amónio (4,0 ml) e por centrifugação durante 20 minutos a 9000 g/4°C. A pelete foi dissolvida em L-arginina 0,5M, cloreto de sódio 0,5 M, Trishidroximetilaminometano 20 mm. cloridrato, 0,01/ p/v de detergente Tween 80 pH 7,4 (tampão ANT, 2,0 ml) e filtrada com gel numa coluna pequena (PD 10) de Sephadex G-25 num tampão ANT (3,0 ml) a 4°C. A solução continha aproximadamente 25 mg/ml de proteína e a titulação de tiol livre com 5,5 de ditiobis(ãcido 2-nitrobenzoico) indicou um conteúdo de sulfidrilo de 136 /jM, i.e. um nível médio de substituição de 0,84 moles de tiol por mole de proteína. 0 produto foi utilizado imediatamente.
(b) Urocinase humana de alto peso molecular de aminobenzoilo de 4-/2-N-(3-/2-piridilditio/propioni 1)-aminoetilo/ lirocínase de alto PM (10° Iv, aprox.
105 nmoles) foi dissolvida em tampão fosfato (1,0 ml) e adicionou-se 4-N-/2-N-(3-£2-piridilditio/propioni1)aminoeti1/ aminobenzoato de 4'-amidinofeni Io (exemplo 3f de PE-A-0155388, 25 ul de 20 mM em solução de dimetilsulfóxido seco). A mis-22-
tura foi incubada durante 30 minutos a 25°C e a adição e a incubação foram reperidas. A actividade amidolítica da urocinase diminuiu para 2,4% do seu valor inicial. 0 produto foi libertado do excesso de agente de acilação por filtração com gel a 4°C numa coluna pequena (PD 10) de Sephadex G-25 num tampão ANT (3,0 ml) e foi utilizado imediatamente.
(c) Ligação e purificação do composto do título urocinase humana de alto peso molecular 4-N-/2-N 1-(3-/)41-butirimino-(imunoglobul ina G de anti-/.gl icoproteina de membrana de eritrocito humanoj de coelho N-£-lisJditiopropioni1)-aminoeti ljaminobenzoi1-0-(ser-356)
As soluções anteriores foram misturadas e adicionou-ss um inibidor de tripsina de pulmão de bovino (Aprotinina, 0,5 ml de 2,9 mg/ml). 0 volume da mistura foi reduzido por concentração centrífuga (Amicon Centricon-10, a 2°C, 5000 g durante 2,5 horas) para cerca de 2,0 ml e o produto foi armazenado a -196°C. A amostra total foi aplicada a uma coluna de 300 x 21,5 mm de matriz de permeação de gel de CLAP TSK G3000 SWG equilibrada e eluida com um tampão ANT a 20-23°C, 2,0 ml/min. Os picos de proteínas foram detectados por eluição a cerca de 72 ml, 86 ml e 118 ml. 0 material que eluiu entre 68 e 88 ml foi reunido, filtrado com gel (PD10, como anteriormente) para 0,2% p/v de D-manitol, 20 nM de bicarbonato de amónio e 1,0 mM de ácido 6-aminohexanoico, pH 7,4 /(21 mlj, foi liofilizado em lotes de 15 x 1,4 ml e armazenado a -40°C. 0 produto foi desacilado a 37°C em tampão fosfato com uma constante de
-4 -1 velocidade média de cerca de 2.9 x 10 seg
Exemplo 2
Conjugado ligado ao centro activo de activador plasminogénio de tecido humano com imunoglobulina G de anti-(glicoproteína de membrana de eritrocito humano)policional de coelho preparada utilizando-se 4-N-[2-N-(3-[2-piridilditio]propionil)aminoetil]-aminobenzoato de 4’-amidinofenilo
IgG-NH-(CH2)3-S-S-(CH2)2-
-NH-(CH2)2-NH
NH (a) Imunoglobulina G de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocito humano) de coelho de N-Ç-(4-tiobutirimino-[LISINA] anticorpo de coelho do Exemplo I (63 pl de 30 mg/ml, 12 nmoles) foi adicionado a 0,9% p/v de cloreto de sódio (0,9 ml) e foi tamponado com fosfato de sódio 1,0 M, 0,01% p/v de detergente Tween 80 pH 7,4 (0,1 ml). Uma solução acabada de preparar de 2-iminotiolano (25 μΐ de 100 mM em água) foi adicionada e a mistura foi incubada a 25°C durante 30 min. Adicionou-se uma solução saturada de sulfato de amónia (2,0 ml) e o produto foi isolado por centrifugação a 5000 g durante 40 min. a 4°C. A pelete foi dissolvida no tampão fosfato do Exemplo 1 (0,5 ml) e a etapa de precipitação foi repetida. A solução final (0,5 ml) foi titulada com 5,5 d i t i obi s-( ác i do 2~ni t r oberrzo i co ) e continha 79 μΜ de grupos de tiol livres, correspondendo a cerca de 3,2 moles de tiol por mole de proteína. 0 produto foi utilizado imediatamente.
(b) Activador de plasmínogénio de tecido humano de 4-Z2-N-( 3-/2-pi ridi ldi tio/propioni 1 )aminoeti 11 aminobenzoilo t-PA purificada (aprox. 100 nmoles no tampão ANT do Exemplo 1 2,0 ml) foi misturada com 4-Ν-Γ4-Ν-(3-/2-pi ridilditio/propioni1)aminoeti Ijami nobenzoato de 4'-amidinofeni lo (50 /J1 de 20 mM em dimeti lsulfóxido) e incubada durante 20 minutos a 25°C. Após este período, a actividade amídolitica do enzima foi reduzida em cerca de 95%. 0 produto foi filtrado com gel utilizando-se uma pequena coluna (PD10) de Sephadex G-25 a 4°C para um tampão ANT (3,4 ml). A redução de um alíquota desta solução com
2,5 mM de ditiotreitol e o controlo da 2-tiona de piridina libertada a 343 nM indicaram que o produto continha cerca de 102 nmoles da função de 2-piridi1ditio. 0 material foi armazenado a -I96°C.
(c) Ligação e purificação do composto do titulo activador de plasmínogénio de tecido humano de 4-N-/2-N1-(3-/41 -butirimino-(imunoglobulina G de anti-Zglicoproteina membrana de eritrocito humano/ de coelho de N- è-l ís)_7 ditiopropionil)aminoetil/aminobenzoil-0-(ser-478)
A totalidade do produto de IgG tiolada anterior foi mistura com parte do produto de (b) anterior (1,5 ml, 45 nmoles) e o volume foi reduzido por concentração centrífuga (condições de acordo com o Exemplo 1, mas apenas durante 2 horas) para cerca de 0,2 ml. 0 produto foi cromatografado da maneira descrita no Exemplo 1. Um conjunto de fracções (2,0 ml) eluindo entre 64 e 72 ml foi retido, armazenado temporariamente a -70°C e depois concentrado por concentração centrífuga a cerca de 1,0 ml. 0 produto final foi armazenado a 196°C. 0 produto foi desacilado a 37°C num tampão fosfato com uma constante de velocidade de primeira ordem média de 1,92 x 10 seg
Exemplo 3
Conjugado ligado ao centro activo de activador de plasminogénio de tecido humano com imunoglobulina G de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocito humano)policional de coelho preparada utilizando-se 4-N-[8-N-(3-[2-piridilditio]propioni1)-amino-3,6-dioxaocti11aminobenzoato de 4’-amidinofenilo
IgG-NH|-(CH2)3-S-S-(CH2)2-ΝΉ-(CH2)2-θ-(ch2)2“
NH
COO-t-PA (Q) 4-Fluorobenzoato de t-butilo
ÍK t-Butanol (6,6 ml) e piridina (5,62 ml) foram ’ dissolvidos em diclorometano (40 ml) seco e foram arrefecidos num ' banho de acetona/gelo seco a -50°C. Adicionou-se lentamente uma solução de cloreto de ácido 4-fluorobenzoico (10,0 g) em diclorometano seco (20 ml) à solução alcoólica. A solução foi mantida sob azoto e deixada aquecer lentamente até à temperatura ambiente. Foi então aquecida ao refluxo durante 1 d. Adicionaram-se mais t-butanol (1 ml) e piridina (1 ml) e o refluxo continuou durante mais dois dias. Após arrefecimento, a mistura de reacção foi lavada sucessivamente com ácido clorídrico 2M (40 ml), com 10% de uma solução de hidrogenocarbonato de sódio (40 ml) e com uma solução
saturada de sulfato de sódio aquoso. A camada orgânica foi seca, foi filtrada e evaporada para deixar um óleo (10,52 g). Este continha o composto do título e alguma quantidade de anidrido 4-fluorobenzoico. Os dois componentes foram separados por cromatografia de coluna (100 g de sílica/30% de diclorometano/70% de éter de petróleo) para deixar o composto do título (8,48 g, 69%) ^RMN (CDC13) Ã 8,05, 7,05 (4H, m, aril-H ) e 1,60 (9H, S, CH3). Infra vermelho (Filme Fino)
Vmav 2970, 1715, 1610, 1510, 1290, 1155, 1120, 850 e 770 cm-1 ΠΊ α X (b) 4-N-(8-amino-3,6-dioxaocti1)amidobenzoato de t-butílo
4-Fluorobenzoato de t-butilo de (a) anterior (1,0 g) foi dissolvida em 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano (4 ml) e aquecida até 120°C sob uma atmosfera de azoto seco durante 3 d. Adicionou-se água (5 ml) e a solução foi basificada com uma solução de hidróxido de sódio 5 Μ. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 x 10 ml). A camada orgânica foi re-extraida com uma solução saturada de sulfato de sódio (5 ml) e depois foi filtrada e evaporada para deixar um óleo (1,42 g, 86%), o composto do título.
RMN (CDC13) í 7,8 (2H,d,J:8Hz,ari1-H),6,55 (2H, d, 0:8Hz, aril-H), 4,9 (1H, sl, aril-NH), 3,5 (10H,m, 4 x CH20 +
CH2NH aril), 2,8 (2H, t, J=5Hz, CH.2NH2), e 1,55 (11H, S, CCH, + NH0). Infra cermelho (Filme Fino), Vm3V 3370, 1690, —J —L· 1 ιΠαΧ
1610, 1530, 1290, 1160, 1110 e 770 cm-1.
Produziu-se um sal de ácido di-p-toluenossulfónico pf 117-8°C. Encontrado C, 54,79; H, 6,58; N, 3,92. C17H2qN2042 C7HgS03.1/2H20 requere C, 54,93;
H, 6,69; N, 4,13%.
-27(c) 4-N-£8-N-(3-/2-piridilditio.7propionil)amino-3,6-dioxaocti Ijaminobenzoato de t-butilo
4-N-(8-amino-3,6-d ioxaocti1)aminobenzoato de t-butilo de (b) anterior (110 mg) foi dissolvido em piridina (1 ml) e adicionou-se N-succinimidi l-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (106 mg). A solução foi agitada â temperatura ambiente, sob azoto, durante 3 d. Apôs este período, removeu-se a piridina por evaporação e adicionou-se acetato de etilo (5 ml) e a camada orgânica foi extraída com uma solução aquosa a 10% de hidrogenocarbonato de sódio (5 ml). A camada orgânica foi seca, filtrada e evaporada para deixar um óleo amarelo (127 mg). Este foi purificado por cromatografia (1 g de si 1 ica/acetato de etilo)para deixar o composto do titulo (90 mg, 51%).
!H RMN (CDC 13) J 8,5 (1H, m,2-piridi 1-H ), 7,75 (4H, m, 2x aril-H + 2x piridil-H ), 7,2 (1H, m, piridil-H), 6,6 (3H, m, aril-H + NHCO), 4,6 (1H,s,ari1-N-H), 3,65 (14H,m, 2x NCH + 4x 0CH2 + C0CH2), 2,6 (2H,t,J=5Hz,CH2S), e 1,55 (9H,s,CCHq). Infra vermelho(Filme Fino) 3350, 1690,1670,
1610, 1290 e 1160 cm1.
espectro de massa FAB em álcool
3-nitrobenzi1ico (3-N0BA)mostra 522 (MH+), 466, 410, 337, 305, 289, 219, 206.
(d) Sal de ditrif 1 uoroacetato de ácido 4-N-Z’8-N-(3-Z’2-piri- di lditiojpropioni 1) amino-3,6-dioxaocti l_7aminobenzoico éster t-butilico preparado em (c) anterior (90 mg) foi suspenso em ácido trifluoroacético (2 ml) e deixado em repouso à temperatura ambiente durante
a noite. A solução foi filtrada através dum tampão de fibra de vidro e o material volátil foi removido por evaporação. Este deixou o composto do titulo (120 mg, 100%), um óleo amarelo pálido.
rmn d® acetona/ CDCl^8,7 (1H, d,J=4Hz, 2-piridil-
H), 7,9 ) 5H,m,ari1-H + NHCO), 6,8 (2H,d,J=8Hz, aril-H),
3,6 (14H,m,2x NCH2 + 4x 0CH2 + C0CH2), e 2,7 (2H, t,J=6Hz, ch2s).
(e) Sal cloridrato de 4-N-/8-N-(3-Z’2-piridilditioJpropionil) amino-3,6-dioxaoctilJamino-benzoato de 4'-amidinofenilo
sal de âcido-trifluoroacetato de (d) anterior (212 mg) foi dissolvido em piridina (1 ml). Adicionou-se 4-amidinofenol(53 mg) seguido por diciclohexi 1carbodiimida (DCCI) (64 mg). A reacção foi agitada sob uma atmosfera de azoto seco durante 4 d. A solução foi então filtrada, evaporada e a goma cor-de-laranja triturada com clorofórmio (2x3 ml). A goma foi então dissolvida em etanol (0,5 ml) e foi filtrada. Adicionou-se éter dietilico até o produto, uma goma, ter precipitado. Este foi isolado por decantação e evaporação para deixar o composto do titulo (11 mg), uma goma castanha pálida. 1H rmn mostrou que este material era cerca de 60% puro, sendo a maior impureza cloridrato de 4-amidinofenol.
rmn d^DMS0^9,25 (4H, dl,D20 permutável, +NH2), 8,75 (1H, S,NH), 8,45(1H,m,2-piridi1-H), 7,8 (6H,m,2x aril-H + 2x amidinofenil-H + 2x piridil-H), 7,5 (2H,d,J=9Hz, amidinofenil-H), 7,25 (lH,m,piridi1-H), 6,80(lH,t, 2Hz,aril-NH), 6,70 (2H,d,J=9Hz,ari1-H), 3,60 (14H,m, 4x 0CH2 + 2χ ^HCH^ + C0CH2) θ 3>0 (2H,t,J=8Hz, CH2S-S).
Espectro de massa FAB em 3-N0BA:584 (M+ para o catião livre).
(f) Activador de plasminogênio de tecido humano de
4-N-£8-N-(3-£2-piridilditio7propionil)amino-3,6-
-dioxaocti 1/aminobenzoilo t-PA purificada (aprox. 77 nmoles em tampão ANT, 1,6 ml) foi misturada com o agente de acilação de (e) anterior (20 μ1 de 83 mM em dimetilsulfóxido seco) e mantoda a 0°C durante 16 horas. Após este período, a activídade amidolítica do enzima foi reduzida em mais do que 98%. 0 produto foi filtrado com gel sobre uma pequena coluna (PD10) de Sephadex G-25 a 4°C para um tampão ANT (3,5 ml) e foi armazenado a -196°0..
(g) Ligação de IgG tiolada e purificação do composto do título activador de plasminogênio de tecido humano de 4-N-/B-N1 -(3-/4 1-butirimino-(iminoglobul ina G de anti-£glicoproteina de membrana de eritrocito humano? de coelho de N- 8-1is^-ditiopropioni1)amino-3,6-dioxaoctiljamino benzoil-0-(ser-478)
IgG de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocito humano) de coelho tiolado foi preparada como no Exemplo l(a), excepto que se utilizaram 30 pl da solução de 2-iminotiolano. 0 produto continha cerca de 0,76 moles de tiol/mole de proteína. Este material foi misturado com o produto de (f) anterior e foi então concentrado para um volume de aproximadamente 2,5 ml e cromatografado como descrito no Exemplo l(c) anterior. 0 ensaio das fracções in-
dividuais por hidrólise parcial de alíquotas a 37°C e determinação amidolitica de t-PA utilizando substrato S-2288, indicou que o pico de actividade de alto peso molecular eluiu a cerca de 69 ml (actividade de baixo peso molecular-i,e. acil-t-PA não ligado-eluiu a cerca de 90 ml). Urn conjunto de fracções eluindo entre 62 e 76 ml precipitou com uma solução saturada de sulfato de amónio (16 ml) a 10.000 g, 4°C durante 30 min. A pelete reconstituída foi filtrada com gel como descrito anteriormente para o tampão fosfato (3,5 ml) e foi armazenada a -196°C. 0 produto foi desacilado a 37°C em tampão fosfato com uma constante média de velocidade de desacilação de primeira ordem de cerca de 2,5 χ 104 seg-·1·.
Exemplo 4
Conjugado ligado ao centro activo de activador de plasminogénio de tecido humano com imunoglobulina G de antí-(gl ícoproteina de membrana de eritrocito humano)preparada utilizando-se 4-N-Ã4-N-(3-f2-piridilditio7propionil)aminobutíljamínobenzoato de 4'-amidinofenilo
^COO-t-PA
NH O (a) 4-N-(4-aminobuti1)aminobenzoato de t-butilo
4-Fluorobenzoato de t-butilo (1,0 g) foi misturado com 1,4-diaminobutano (10 ml) e a mistura foi aquecida a 120°C durante a noite. Após arrefecimento, adicionou-se água (10 ml) seguida por uma solução de hidróxido de sódio 5M (4 ml). A solução aquosa foi extraída com acetato de etilo (2 x 15 ml) e a camada orgânica foi seca (sulfato de sódio), foi filtrada e foi evaporada. Esta deixou o com-31-
posto do titulo, contaminado com a diamina de partida. A rnistira foi recolhida em acetato de etilo (50 ml) e foi lavada com uma solução saturada de sulfato de sódio (20 ml). A camada orgânica foi seca, foi filtrada e evaporada para produzir o composto do titulo (1,02 g, 76%).
*Η rmn (CDClg) í-7,8 (2H, d,J=8Hz), 6,55 (2H, d,J=8Hz ),
4,5 (lH,sl), 3,1 (2H,t,J=7Hz), 2,7 (2H,t,J=7Hz) e
1,55 (15H, sl).
V 3370, 3225, 1690, 1600, 1530, 1290, 1160 e 1115 cm'1 max
Preparou-se um sal de ácido 4-toluenos- | sulfónico e recrista1izou-se a partir de etanol e éter p.f. 134-7°C. Encontrado C 59,68; H, 7,57; N, 6,54%.
^22Η32Ν2^θ5 reduere C, 59,90; H, 7,42; N, 6,54%.
(b) 4-N-/'4-N-(3-/’2-piridilditio2propionil)aminobutilJ aminobenzoato de t-butílo
4-N-(4-aminobutii)aminobenzoato de t-butilo (169 mg) de (a) anterior foi dissolvido em piridina (2 ml). SPDP (200 mg) foi adicionado â reacção agitada à temperatura ambiente sob uma atmosfera de azoto seco durante 2 d. A piridina foi removida por evaporação e o óleo foi recolhido em acetato de etilo (5 ml). A camada orgânica foi lavada com uma solução a 10% de hidrogenocarbonato de sódio (2 ml). A camada orgânica foi seca, foi filtrada e eva porada para produzir um sólido (219 mg). 0 composto do título foi isolado por cromatografia (2 g de si 1 ica/acetato de etilo) sob a forma dum sólido (166 mg, 56%) p.f. 98-9° a partir de díclorometano e éter de petróleo.
RMN (CDC13)4 8,5 (lH,m), 7,8 (4H,m), 7,1 (lH,m), 6,9 (1H, m), 6,6 (2H,d,J=8Hz), 4,2 (lH,s), 3,2 (6H,m),
2,6 (2H,t,J=6Hz) e 1,55 (13H,m).
V„,v Infra vermelho 3350, 1680, 1660, 1605, 1530, 1300, m α X i
1160, 1120, 910, 835 e 730 cm .
Encontrado: C 58,95; H, 6,74; N, 9,04. C23HgjNg03S2. V2H20 requere C 58,69; H, 6,85; N, 8,92%.
(c) Acido 4-N-/¾-N-(3-/2-piridi 1 ditio_7propioni 1)aminobuti 1_7 amínobenzoico éster t-butilico preparado em (b) anterior (153 mg) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (2 ml) e deixado ficar em repouso à temperatura ambiente durante 24 horas. A solução foi filtrada e evaporada para produzir um óleo amarelo (290 mg) que era um sal de trifluoroacetato do composto do titulo. 0 material foi utilizado sem purificação adicional.
rmn (d® acetona/C0Cl3) ^8,3 (lH,m), 8,1 (5H,m),
3,3 (6H,m), 2,8 (2H,t,J=5Hz), e 1,8 (4H, sl).
(d) 4-N-/4-N-( 3-/2-pi ridi lditiojpropionol)aminobuti 1/-
-aminobenzoato de 4'-amidinofenilo sal de ácido-trifluoroacetato de (c) anterior (216 mg) foi dissolvido em piridina (1 ml) e adicionou-se 4-amidinofenol (45 mg). Introduziu-se também DCCI (54 mg). A solução foi agitada durante 3 d sob uma atmosfera de azoto à temperatura ambiente. A solução foi filtrada e evaporada. 0 óleo foi recolhido em clorofórmio (200 jul) θ foi precipitado com éter de petróleo. 0 óleo foi separado por decantação e foi sucessivamente triturado com clorofórmio (2 ml), água (2 ml), salmoura (2 ml) e finalmente água (2 ml). Apôs secagem no vácuo, o oleo foi dissolvido
em etanol (2 ml), foi filtrado e evaporado. 0 óleo foi recolhido numa quantidade pequena de etanol (200 ul) e foi precipitado com éter dietilico. Após decantação, este processo final foi repetido e o produto (40 mg) foi seco no vácuo. Este material era cerca de 40% do composto do título com grandes quantidades dos dois produtos de hidrólise presen tes(o ácido de partida e o fenol). A repetição da precipitação do produto levou a um material 80% puro.
rmn(d5DMS0) \ 9,25 (4H,dl), 8,35 (lH,m) 7,80 (6H,m), 7,50 (2H,d,J=9Hz), 7,25 (lH,m) 6,80 (1H,t,J=5Hz), 6,65 (2H,d,J=9Hz), 3,1 (8H,m), 1,5 (4H,m).
Espectro de massa FAB em 3-Nitroben ziláicool M+ de base livre a m/e 524,460,440, 423.
(e) Imunoglobu 1 ins de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocíto humano) de coelho de N-£ -(4-tiobutirimino)-fLISINA/ anti-corpo de coelho do Exemplo 1 (0,5 ml de 30 mg/ml em cloreto de sódio a 0,9% p/v foi diluído para 2,0 ml em tampão fosfato e foi tratado com uma solução fresca de 2-iminotiolato (30 μΐ de 100 mM em água) durante 30 min. a 25°C. 0 produto foi filtrado em gel para um tampão de fosfato (3,4 ml), como especificado anteriormente. A titulação do tiol, de acordo com o anterior, indicou um conteúdo de sulfidrilo livre de cerca de 69 pM e uma substituição média de 2,4 moles de tiol/mole de proteína. 0 produto foi utilizado imediatamente.
(f) Actívâdor de plasminogénio de tecido humano de 4-N-/'4-N-(3-£2-piridilditioJpropionil)aminobutil_7aminobenzoilo t-PA purificada (2,0 ml em tampão ANT, 112 nmoles) foi tratada com o agente de acilação de (d) anterior em solução em dimetiIsulfôxido seco em duas etapas: 1) 25 μΐ de 10 mM durante 30 min a 25°C, 2) 25 yul de 50 mM durante 2,5 h a 25c’C. Após este período, perdeu-se 98,6% da actividade amidolitica inicial. 0 produto foi fil- trado em gel para um tampão ANT (3,4 ml) como especificado anteriormente e a redução (de acordo com o Exemplo 2 (b) indicou um conteúdo de grupo piridilditio de 37 μΜ. 0 material foi armazenado a -196°C.
(g) Ligação e purificação do composto do titulo, activador de plasminogênio de tecido humano de 4-N-/“2-N1- (3-ZT4'-butirimino-( imunoglobul ina
G de anti-Zglicoproteina de membrana de eritrocito humano/ de coelho de N”-£.-1 is)7ditiopropioní1)aminobuti1/aminobenzoi1-0-(ser-478)
A totalidade da IgG tiolada de (e) anterior foi misturada com o produto de (f) (1,0 ml de 37 nmoles) e o volume da mistura foi reduzido por cencentração centrífuga (de acordo com o Exemplo l(c), mas durante
1,5 horas) para 0,5 ml. 0 produto foi diluido para 1,5 ml com tampão ANT e foi filtrado com gel (como anteriormente) para um tampão de fosfato (3,4 ml). A solução foi aplicada a uma coluna (0,8 x 2,0 cm) de L-lisina-Sepharose(Pharmacia) e foi lavada com um tampão de fosfato (5,0 ml). A coluna foi eluida com um tampão ANT (5,0 ml) e o eluido foi concen-
trado (como anteriormente) até cerca de 1,0 ml. 0 produto foi cromatografado da maneira descrita no Exemplo l(c) e as fracçÕes que eluiram entre 66 e 74 ml foram reunidas e concentradas (como atrás) para cerca de 1,2 ml. O produto final foi armazenado a
-196°C.
A constante média de velocidade de desacilação de primeira ordem num tampão de fosfato a 37°C foi de 1,65
-1 x 10 seg.
Exemplo 5
Conjugado ligado ao centro activo de activador de plasminogénio de tecido humano com uma imunoglobulina G de anti-(fibrina humanalmonoclonal de rato preparada utilizando-se 4-N-[2-N-(3-[2-piridilditio]-propioni1)aminoeti1]aminobenzoato de 4'-ami dinofenilo
IgG-NH-j!- (CH2 ) 3-S-S- (CH2 ) 2-<j>NH- (CH2 ) 2-NH-/0VcOO-t-PA
NH 0 ( a ) imunoglobul ina G de ant i - ( f ibr ina humano de rato de N—€ —(4 —
-tiobutirimino)-[LISINA]
Um anti-corpo monoclonal de rato, purificado, dirigido contra um antigénio gerado pela conversão de fibrinogénio humano em fibrina (Código: Y22, W. Nieuwenhuizen et al., Fibrinólise (82 Congresso Internacional sobre Fibrinólise) Resumo N2 139; 1,7 mg em 0,9 ml de cloreto de sódio a 0,9% p/v) foi misturado com tampão de fosfato de sódio 1,0 M, e com Tween 80 pH 7,4 a 0,01% (0,1 ml). A solução tamponada foi tratada duas vezes com uma solução
fresca de 2-iminotiolano (25 μΐ de 100 mM) (primeiramente durante 30 min. e depois durante 15 min., em ambos os casos a 25°C) e depois foi filtrada em gel, conforme descrito anteriormente, para o tampão de fosfato do Exemplo l(a) (3,4ml). O produto foi usado imediatamente.
(b) Ligação ao actívador de plasmínogénio de tecido humano de 4-/N-2-(3-á2-piridiIditiojpropioni1)aminoetil/aminobenzoilo e purificação do composto do titulo, actívador de plasminogénio de tecido hurano de 4-Ν-£2-Ν 1 -(3-£4'-butirimino-(imunoglobulina G de anti-£fibrina humana/monoclonal de rato de N- íL-1is)IditiopropioniI)-aminoetil/aminobenzoi1 -0-(ser-478).
produto do Exemplo 2(b) (1,5 ml, nmoles) foi adicionado â totalidade da amostra anterior e a mistura foi concentrada por concentração centrífuga para um volume pequeno (condições de acordo com o Exemplo 2(c), foi diluida para cerca de 1,5 ml com tampão ANT e foi reconcentrada para cerca de 0,5 ml durante 1,5 h. 0 produto foi cromatografado da maneira descrita no Exemplo l(c) e as fracçoes que eluiram entre 64 e 76 ml foram reunidas e reconcentradas (4000 g, 40°C, 1,75 h) para um volume final de cerca de 1,5 ml. 0 material foi armazenado a -196°C.
A constante de velocidade de desacilação média de primeira ordem em tampão de fosfato a 37°C foi de 2,9 x 10“4 seg..
Exemplo 6
Conjugado ligado ao centro activo de activador de plasminogênio de tecido humano com imunoglobulina G de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocito humano)policlonal de coelho preparada utilizando-se 4-N-£6-N-( 3-f2-piridi lditio^propionil)aminohexiljaminobenzoato de 4'-amidinofenilo
(a) 4-N-(6-aminohexi1)aminobenzoato t-butilo
4-Fluorobenzoato de t-butilo (0,5g) foi dissolvido em 1,6-diaminohexano (5 ml). A mistura foi aquecida a 120°C sob uma atmosfera de azoto seco durante 3 d. Adicionou-se água (5 ml), seguida por uma solução de hidróxido de sódio 5M (2ml). A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (10 ml) e a camada orgânica foi lavada sucessívamente com uma solução de hidróxido de sódio 2M (10 ml) e água (10 ml). A camada de acetato de etilo foi seca, foi filtrada e evaporada para deixar um sólido amarelo (517 mg, 69%), que era o composto do título.
rmn (CDC13) S, 7,8(2H,d, J=9Hz, aril-H),
6,55 (2H,d,J=9Hz, aril-H), 4,1 (1H, s1,ari1-N-H), 3,15(2H,tl, aril-NHCHg), 2,7 (2H,t, J=6Hz,CHgNHg),
1,6 (5H,s,CCH3), 1,5 (8H,m, 4xCH2), vmax 3370, 1690, 1610, 1530, 1480, 1370, 1295, 1160, 1120, 910 e 735 cm-1.
-38(b) 4-Ν-/6-Ν-(3-Z2-PÍridi Iditio/propioni 1 )aminohexi 1J7- aminobenzoato de t-butílo
A amina de (a) (187 mg) foi dissolvida em piridina (2 ml) e adicionou-se SPDP (200 mg). A reacção foi agitada sob uma atmosfera de azoto seco durante 3 d. A solução foi evaporada e o residuo foi recolhido em acetato de etilo (2 ml). Este foi lavado com uma solução aquosa a 10% de hidrogenocarbonato de sódio (2 ml). A camada orgânica foi seca, foi filtrada e evaporada para deixar um sólido (212 mg). Este foi cromatografado (2 g, si 1ica/acetato etílico) para deixar o composto do titulo (131 mg, 42%), p.f. 104-5°C.
TH rmn(CDCl3) S· , 8,5 (lH,m,aril-H), 7,9(4H,m,aril-H), 7,2 (lH,m,piridi1-H), 6,6 (3H,d,aril-H + N-H C0), 4,0 (lH,sl, N-H aril), 3,1 (6H,m,CH2-N + CH2C0), 2,6 (2H,t, J=6Hz, CH2), e 1,6(17H,M, CH3 + 4xCH,), vm3V 3350, 1680, 1650, 1605, 1530,1415,1295, —d mαX i
1160, 1115, 830, e 760 cm1.
Encontrado: C, 61,67; H, 7,28; N,8,54, C^HggNgS^g requere: C, 61,32; H,7,20; N 8,53%.
(c) Acido 4-N-£6-N-(3-/2-piridilditio/propioni1)aminohexilfaminobenzoico éster t-butilíco de (b) (113 mg) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (2 ml). A solução foi deixada em repouso durante a noite e depois foi filtrada e evaporada de forma a deixar um óleo cor-de-laranja (159mg). Este era o sal ditrifluoroacetato do composto do titulo.
rmn(d^ acetona/CDClg £ 8,7 (lH,m, aril-H),
8,l(6H,m, 5 x aril-H + NHCO), 7,2 (2H,d,0=9Hz,ari1-H),
4,4(lH,sl,aril-NH), 3,3 (6H,m, CH2N + CH2C0), 2,8(2H,t,J=4Hz, CH2S), 1,4 (8H,m, 4xCH2).
(d) 4 - N - /f6 - N- (3 - [2. - p i r i d i 1 d i t i ojp r op i on i 1) am i η o hex i 1J - aminobenzoato de 4'-amidinofenilo sal de ditrifluoroacetato ácido de (c)(159 mg) e 4-amidinofenol (42 mg) foram dissolvidos em piridina seca (1 ml) e adicionou-se DCCI (100 mg). A solução foi agitada à temperatura ambiente sob uma atmosfera de azoto seco durante 7 d, e nesta altura adicionaram-se mais dois aliquotas de DCCI (100 mg cada). Após este período, a solução foi filtrada e evaporada. A goma residual cor-de-laranja foi sucessivamente triturada com cloroformio (2x2 ml), água (2 ml), salmoura (2 ml) e finalmente água (2 ml). A goma residual foi seca por evaporação e adicionou-se etanol ( 1 ml). A solução foi filtrada e introduziu-se éter dietilico. 0 composto do titulo precipitou sob a forma duma espuma (30 mg). Esta ncstrou ser 75% pura por rmn. 0 único contaminante significativo foi o ácido de partida.
ZH rmn (d6DMSO) í9,22 (4H,s, amidina N-H), 8,45 (lH,m, piridil-H), 7,8(6H,m, 2 x aril-H + 2 x piridil-H), 7,50 (2H,d,0=9Hz, fenol-H), 7,25 (1H,m,piridi1-H), 6,8 (1H,t,J:4Hz, aril-NH), 3,3 (2H,m, CH2NH), 3,0(6H,m, CH2C0 + CH2NH Ar + (CH2S), e 1,3 (8H,m, 4xCH2).
(e) Imunoglobulina G de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocito humano) de coelho de N-/8-(4-tíobutírimíno)J-fLISINAj
O anti-corpo de coelho do Exemplo 1 (0,2 ml de 30 mg/ml em cloreto de sódio a 0,9% p/v) foi diluído para 2,2 ml em tampão de fosfato e foi tratado com uma solução fresca de 2-iminotiolano (20 yul de 100 mm em tampão de fosfato) durante 30 minutos a 25°C. 0 produto foi filtrado com gel para um tampão de fosfato como descrito anteriormente. A titulação do tiol como anteriormente, indicou um conteúdo de sulfidrilo livre de 33,5 /um e uma substituição média de 2,9 moles de tiol/mole de proteina.0 produto foi utilizado imediatamente.
(f) Activador de plasminogênio de tecido humano de 4-N-/6-N-(3-f2-piridilditioJpropionil)aminohexilJ-
-aminobenzoilo t-PA purificada (1,0 ml em tampão ANT, 54 nmoles) foi tratada com o agente de acilação de (d) anterior (50 pl de 10 mm em dimetilsulfóxido seco) durante 1 h a 25°C. Após este periodo, 96% da actívidade amidolítica inicial foi perdida. 0 produto foi filtrado em gel para um tampão ANT (3,4 ml) e foi armazenado a -196°C.
(g) Ligação e Purificação do composto do título, activador de plasminogénio de tecido humano de 4-N-Z2-N1-(3-/41-butirimino-(imunoglobulina G de anti-/gl icoproteina de membrana de eritrocito humano^de coelho de N- ò-1 is)7ditiopropioni1)aminohexil7aminobenzoil-0-(ser-478)
A totalidade da IgG tiolada de (e) anterior foi misturada com a tatotalidade do acil-enzima de (f), foi mantida durante 16 h a -40°C e depois foi concentrada (como descrito no EXemplo 4(g)) para um volume de 1,5 ml. 0 produto foi filtrado em gel para um tampão de fosfato (3,4 ml) como descrito anteriormente e foi aplicado a uma coluna de 1 isina-Sepharose, como especificado no Exemplo 4(g). A coluna foi lavada com tampão de fosfato (10 ml) e o produto foi eluido com tampão ANT (10 ml). 0 eluido foi tratado com uma solução saturada de sulfato de amónio (10 ml), e o produto precipitou a 10.000 g durante 30 min a 4°C.A pelete foi dissolvida em tampão ANT (0,5 ml) e aplicada a uma coluna 600 x 7,5 mm de matriz de permeação de gel de CLAP TSK G 3000 SWG (com coluna de protecção)equi1ibrada e eluida com tampão ANT a 20-23°C, 0,5 ml/min. As fracções de 0,3ml foram recolhidas e os picos de proteina que eluiram a 13,9 e 18,9 ml foram detectados. Um conjunto de fracções que eluiram entre 13,3 e 14,8 ml foi feito e armazenado a -196°C.O produto foi desacilado a 37°C em tampão de fosfato com uma
- 5 -1 constante de velocidade média de 9,99 x 10 seg. .
Exemplo 7
Conjugado ligado ao centro activo de activador de plasminogénio de tecido humano com imunoglobulina G de anti-(glicoproteina de membrana de eritrocito humano), policlonal de coelho preparada utilizando-se 4-N- (3-N-£3-(2-pí ridi lditio)propioní ljamí nopropi 1)aminobenzoato de 4'-amidinofenilo (a)
IgG-NH-C- (CH2 ) 3-S-S- (CH2 ) 2C-NH- (CH2) 3-NH-/0VcOO-t-PA
II I)
NH O
4-N-(3-aminopropi1)aminobenzoato de t-butilo
4-Fluorobenzoato de t-butilo (0,5 g) foi dissolvido em 1,3-diaminopropano (2,5 ml) e a reacção foi aquecida até 120°C sob uma atmosfera de azoto seco durante 16 h, após cujo tempo nenhum material de partida pode ser detectado por c.c.f. A solução foi deixada evaporar-se a pressão reduzida e adicionou-se água (10 ml), seguida por suficiente ácido clorídrico concentrado para solubilizar 0 material. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (10 ml), 0 qual foi depois rejeitado. A camada aquosa foi basificada com uma solução aquosa de hidróxido de sódio e depois foi extraída com acetato de etilo (2 x 10 ml). A camada orgânica foi seca, foi filtrada e evaporada para deixar 0 composto do titulo (488 mg, 77%).
JH rmn, (CDCI3) í, 7,82 (2H,d,J=9Hz, aril-H), 6,55 (2H,d,J=9Hz, aril-H), 4,7 (1H,s1,ari1-N-H), 3,30 (2H,t,J=7Hz, NHCHg-), 2,85(2H,t,J=7Hz,CHgNHg), 1,8 (2H,m,CH2CH2CH2), 1,6(9H,s,CCH3), e 1,3 (2H, sl, NHn). vmav(Nujol), 3370, 1685, 1610,1535, 1290, 1160, 920, 840, e 770 cm1, m/e encontrado 250,1695,C14H22N202 requere 250,1681.
<___
(b) A-N-^S-N-CB-^-piridilditioJpropionilJaminopropilJaminobenzoato de t-butilo
A amina de (a) (100 mg) e SPDP (125 mg) foram dissolvidos em piridina (1 ml). A reacção foi agitada à temperatura ambiente sob uma atmosfera de azoto seco durante 12. horas. A piridina foi removida por evaporação e adicionou-se acetato de etilo (5 ml). A camada orgânica foi lavada com uma solução a 10% de hidrogenocarbonato de sódio (2 ml). Esta foi então seca, filtrada e evaporada para deixar uma goma (142 mg) que era quase pura. A purificação final foi obtida por cromatografia de coluna (2 g de silica, acetato de etilo) para deixar o composto do titulo (95 mg, 53%).
!H rmn (CDC13) 8,45 (lH,m,6-piridi1-H), 7,7 (4H,m, aril-H), 7,1 (2H,m,ari1-H+NHCO), 6,55 (2H,d,0=9Hz, aril-H), 4,5 (lH,sl,aril-NH), 3,3 (6H,m,NHCH2 x 2 + C0CH2), 2,6 (2H,t,0=6Hz, CH2S), 1,8(2H,t,J=6Hz, CH2CH2CH2) e 1,55 (9H,s,CCH3). vm3X(Nujol) 3350,1680, 1660, 1610,1530, 1470, 1330, 1160, 1120, 910, 835, e 730 cm”l.
(c) Acido 4-N-Z3-N-(3-£2-piridi1 ditio/propioni1)aminopropiljaminobenzoico éster t-butilico de (b) (85 mg) foi dissolvido em ácido trifluoroacético e foi deixado em repouso à temperatura ambiente durante a noite. 0 material volátil foi removido por evaporação para deixar um óleo (117 mg). Este mostrou ser o sal di-trifluoroacetato do composto do titulo, o qual foi utilizado sem purificação adicional.
-4l· ^Hrmn (D^ acetona/CDClg) í ,8,8)1H, d,piridi1-H), 8,0 (9H,m, 2 x aril-H + piridil-H), 6,9 (2H,d,J=8Hz, aril-H), 3,3 (6H,m 2 x ΝΟΗ?), 2,8 (2H, t,J=6Hz, CH2S) e 1,9 (2H, m, CH2CH2CH2).
(d) Sal cloridrato de 4-N-(3-N-/3-(2-piridilditio)pro- pionil/aminopropi1)aminobenzoato de 41-amidinofenilo di-trif1uoroacetato ácido de (c) (117 mg) foi dissolvido em piridina (1 ml), e 4-amidinofenol (3,4 mg) foi adicionado por DCCI (41 mg). A solução foi agitada sob uma atmosfera de azoto seco durante 18 horas. A piridina foi removida por evaporação e o resíduo foi triturado sucessivamente com clorofórmio (1 ml), água (1 ml), salmoura (1 ml) e finalmente água (1 ml). A solução foi seca sob vácuo e adicionou-se etanol (0,5 ml) ao resíduo castanho. A solução foi filtrada e adicionou-se dietiléter (5 ml).A solução tornou-se turva e deu-se a precipitação de um óleo castanho. Após decantação, o óleo foi seco no vácuo e tornou-se numa espuma (20 mg), o composto do titulo, o qual por rmn mostrou ser 80% puro.
rmn(D6DMS0) Ç 9,29 (4H,s,amidina-NH), 8,45 (lH,d,J=4Hz aril-H), 8,06 (lH,m, CONH), 7,80 (6H,m, 2 x aril-H + 2 x amidinofenil-H + 2 x piridil-H), 7,48 (2H,d,J=8Hz, aril-H de amidinofenol), 7,25 (lH,m,aril-H piridina), 6,66 (2H,d, J=8Hz, aril-H); 5,59 (lH,d, J = 8Hz, aril-NH), 3,3 (4H,m, 2 x NHCH2), 3,15 (2H,t, J=6Hz, C0CH2), 3,05 (2H,t, J=6Hz,CH2SS), e 1,25 (2H,m, CH2CH2CH2).
(e) Activador de plasmínogénío de tecido humano de
4-N-Z~3-N-(3-£2-piridi ltiojpropioni 1 )aminopropí ljaminobenzoilo t-PA de dias cadeias purificada (2,0 ml em tampão ANT, 108 nmoles) foi tratada com o agente de acilação de (d) anterior (50 /11 de solução 20 mM em dimetilsulfóxido seco durante 30 min. a 25°C. 0 produto foi mantido em gelo durante 30 min e foi filtrado em gel para um tampão ANT (3,4 ml). 0 produto foi precipitado por adição de uma solução saturada de sulfato de amónio (7,6 ml), foi centrifugado durante 30 minutos a 10.000 g/4°C e o precipitado dissolveu-se em 0,9 ml de tampão ANT. 0 produto continha aproximadamente 92 nmoles de função piridilditio, conforme determinado por redução (exemplo 2 (b) e foi armazenado a -196°C.
(f) Tiolação, ligação e purificação do composto de titulo, activador de plasmínogênio de tecido humano de 4-N-/2-N 1 -(3-/41 -butirimino-( imunoglobulina G de anti-/glicoproteina de membrana de eritrocito humano^de coelho de N -E-lis)7 ditiopropioni1)aminopropi lj-aminobenzoi1-0-
-(ser-478) anti-corpo de coelho do exemplo (1,0 ml de uma solução de 13,3 mg/ml em cloreto de sódio a 0,9%) foi diluido para 2,5 ml em tampão de fosfato, ajustado para pH 7,4, e foi tratado com 2-iminotiolano(20 /11 de 100 mm em água) durante 30 min a 25°C. Foi então filtrado em gel para um tampão de fosfato como dscrito anteriormente e mostrou conter 63 um de grupos de sufidrilo (2,5 moles de tiol/ /mole de proteína). A totalidade do produto foi misturada com o acil-t-PA de (e) anterior (0,9 ml) e o volume foi redu
i zido por concentração centrífuga da maneira descrita no exemplo 4 (g) anterior para um volume de 1,5 ml. 0 produto foi filtrado em gel para um tampão fosfato (3,4 ml) da maneira descrita anteriormente e foi aplicado a uma coluna (0,8 x 3,0 cm) de 1 isina-Sepharose (Pharmacia), lavando-se com tampão de fosfato (13,6 ml). 0 produto foi eluido com tampão de arginina (9,0 ml), e foi precipitado com uma solução saturada de (NH4)2S4 (9,0 ml, 10.000 g/30 min/2°C). A pelete foi dissolvida em tampão ANT (0,4 ml) e foi aplicada a uma coluna (7,5 nm x 60 cm) de gel de CLAP TSK G 3000 SWG e foi eluida com tampão ANT a 0,5 ml/min, 20-23°C. 0 pico de proteína que elui entre 13,0 e 14,8 ml foi recolhido e mantido a -196°C. Este produto desacilou em tampão de fosfato a 37°C com uma constante de velocidade de desacilação média de primeira ordem de 1,79 x 104 se.“L
Exemplo 8
Sal de Cloridrato de 4-N-/5-N-(3-Ã2-piridiIditioJpropioni1)aminopentil/aminobenzoato de 41-amidinofenilo (a) 4-N-(5-aminopenti1)aminobenzoato de t-butilo
4-f1uorobenzoato de t-butilo (0,5 g) foi dissolvido em 1,5-diaminopentano (5 ml) e a reacção foi aquecida a 100°C sob uma tamosfera de azoto seco. A reacção foi mantida durante 48 h, após o que não se detectou por ccf qualquer material de partida. Adicionou-se água (5 ml) e a camada aquosa foi basificada com uma solução aquosa 5M de hidroxido de sódio e depois foi extraída com acetato de etilo (10 ml). A camada orgânica foi seca, foi filtrada e evaporada para deixar o composto do titulo contaminado com a diamina de partida. 0 material foi recolhido em acetato de
etilo (10 ml) e foi lavado sucessivamente com hidróxido de sódio 5M (10 ml) e água (10 ml). A camada orgânica foi seca, foi filtrada e evaporada para deixar o produto (0,51 g, 72%). Ή rmn (CDClg) £7,8 (2H, d, J=9Hz), 6,4 (2H, d, J=9Hz), 4,1 (1H, sl) 3,1 (2H, m), 2,7 (2H, t, J=5Hz), 1,5(17H, m).
(b) 4-N-275-N-(3 - Z2~ p i r i d i 1 d i t i o_7p rop i on i 1) am i nopen t i 1^ aminobenzoato de t-butilo
A amina (178 mg) e SPDP (200 mg) foram dissolvidos em piridina (2 ml). A reação foi agitada sob uma atmosfera de azoto seco durante 48 horas. A piridina foi removida por evaporação e adicionou-se acetato de etilo (5 ml). A camada orgânica foi lavada com uma solução aquosa a 10% de hidrogeno carbonato de sódio (1 ml). A solução orgânica foi seca, foi filtrada e evaporada para deixar uma goma que mostrou ser quase pura. Contudo, a purificação final foi obtida por cromatografia de coluna (sílica, acetato de etilo) para deixar o produto (140 mg, 46%).
Ή rmn (CDC13) Í8,4 (1H, m), 7,7 (4H, m), 7,1 (1H, m), 6,8 (1H, t, J=5Hz), 6,45 (2H, d, J=8Hz), 4,35 (1H, t, J=6Hz), 3,1 (6H, m), 2,6 (2H, t, J=6Hz), 1,55 (15H, s).
(c) Acido 4-N-/'5-N-(3-£2-piridilditio7propionil)amino- pentilojaminobenzoico éster t-butilico (130 mg) preparado anteriormente foi dissolvido em ácido trifluoroacético (1 ml) e foi mantido à temperatura ambiente durante 48 h. A solução filtrada e evaporada para deixar um óleo (192 mg). Este era o ácido na forma de um sal de trifluoroacetato. 0 material foi utilizado para transformações posteriores sem
qualquer purificação adicional.
Ή rmn d^ acetona/CDCl^ i8,7 (lH,m), 7,9 (7H, m),6,9 (2H, d, J=8Hz), 3,2 (6H, m), 2,7 (2H, t, J=5Hz), 1,5 (6H, sl).
(d) Ester do titulo ácido (192 mg de sólido, 115 mg de ácido efectivo) preparado anteriormente foi dissolvido em piridina (1 ml) e adicionou-se 4-amidinofenol (47 mg) seguido por DCCI (113 mg). A solução foi agitada sob uma atmosfera de azoto seco durante 7 d. A solução foi filtrada para remover a diciclohexilureia precipitada e a piridina foi removida por evaporação. 0 resíduo foi triturado sucessivamente com cloroformio (3 x 1 ml), água (1 ml), salmoura (1 ml) e finalmente água (1 ml). A solução foi seca no vacuo e adicionou-se etanol (3 ml) ao resíduo castanho. A solução foi filtrada e concentrada. Adicionou-se éter dietilico (5 ml) e deu-se a precipitação dum sólido castanho. A solução foi decantada e o solido foi seco. Este provou ser o composto do titulo (31 mg, 19%), o qual era cerca de 80% puro por r.m.n. protónica.
Ή rmn(d6DMS0) 49,35 (4H, sl), 8,45 (lH,m), 7,8 (7H, m), 7,5 (2H, d, J=9Hz), 7,25 (1H, m), 6,80 (1H, t, j_=5Hz), 6,65 (2H, d, J=9Hz), 3,1 (6H, m), 1,55 e 1,40 (6H, m). 2 protões não são visíveis.Eles estão provávelmente escondidos pelo pico de DMSO a 2,5 ppm.
Demosntração da ligação especifica a eritrocitos humanos pelo composto do Exemplo 1 (a) Método
Sangue humano totalmente citrado acabado de recolher (0,6 ml) foi misturado com um aliquota da preparação liofilizada do Exemplo 1 dissolvida em fosfato de sódio 0,05M, cloreto de sódio O,1M, 10 mg/ml de albumina de soro humano pH 7,4 (tampão PBSA, 0,2 ml) e foi agitado suavemente. durante 10 min a 4°C. Como controlos, utilizaram-se no processo uma preparação liofilizada comparável de um conjugado preparado da mesma maneira que no Exemplo 1, mas utilizando IgG não-especifica humana(controlo NSI), uma amostra do composto do Exemplo 1 hidrolizada em tampão de fosfato a 37°C durante 200 min (controlo de hidrólise) e salina normal ou urocinase não-modificada. As amostras foram diluidas com tampão de PBSA (3,0 ml), agitadas rapidamente e centrifugadas a 2000 g, 4°C durante 2 min. 0 sobrenadante foi removido e os eritrocitos peletizados foram lavados cinco vezes com tampão de PBSA (3,5 ml) e centrifugadas como anteriormente. A preparação celular final foi suspensa em tampão de PBSA (0,75 ml, volume total de aprox. 1,0 ml) e agitada suavemente num banho de água a 37°C. Ao fim de vários intervalos até 180 minutos, removeram-se aliquotas (100/j1) e adicionaram-se a PBSA (100 jul) em microtubos mantidos em gelo. As amostras foram centrifugadas e os topos dos microtubos foram cortados para facilitar a remoção do sobrenadante. As últimas foram armazenadas a -40°C até ao ensaio.0 ensaio de urocinase foi efectuado quer com o substrato
S-2444, quer pelo ensaio fibrínolitíco em placas de fibrina humana calibradas (veja-se a secção dos Métodos).
(b) Resultados
A figura 1 mostra que a libertação da actividade amidolítica do tipo da urocinase pode ser detectada a partir dos eritrocitos expostos ao composto do Exemplo l,mas não a partir de células expostas quer ao composto pré-hidrolisado, quer â urocinase não-modifiçada.
A figura 2 mostra que a actividade libertada -foiça fibrinolitica e que também nem o conjugado com IgG não-especifica nem os proprios eritrocitos não tratados poderiam libertar tal actividade.
Nas figuras:
Figura 1 Libertação da actividade amidolítica de urocinase para um meio tampão contendo eritrocitos humanos lavados expostos ao composto do exemplo 1( * ), composto pre-h idrol izado (o) e urocinase não-modifiçada (<)
Figura 2 Libertação de actividade fibrinolitica de urocinase para um meio tampão contendo eritrocitos humanos lavados expostos ao composto do Exemplo 1 ( · ) ou
Controlos NSI/salina (ambos a )
Ambas as Figuras Média + d.m.p. (n=4) eixo dos X : minutos a 37°C eixo dos Y : urocinase libertada para o meio (nM)

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES li. - Processo para a preparação de um derivado de um enzima fibrinolítico, em que o local catalítico no enzima que é responsável pela actividade fibrinolítica é bloqueada por uma imunoglobulina específica, ou um seu fragmento, ligada ao mesmo tempo por um grupo de ligação reversível e dirigido contra o antigénio associado aos componentes de material trombótico, caracterizado por compreender a reacção em conjunto duma imunoglobulina específica facultativamente modificada para incluir um grupo que se liga a proteína, dum enzima fibrinolítico e dum agente de ligação com uma porção capaz de reagir com o local catalítico do enzima e com uma porção capaz de reagir com um grupo amino de proteína ou com um grupo que se liga a proteínas para formar um grupo de ligação reversível, como atrás definido.
  2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o local catalítico no enzima ser bloqueado por um grupo de estrutura I (Im)-B-A-X- (I) na qual (Im) é uma imunoglobulina específica como definido anteriormente, facultativamente modificada por tratamento com um reagente específico de cadeia lateral amino ácido para incluir um grupo que se liga a proteínas.
    X é u mgrupo acilo de fórmula
    -R-C52 na qual R é um resíduo aromático ou alifático, A é um grupo em ponte compreendendo pelo menos um hetero-átomo seleccionado entre oxigénio, enxofre e azoto, em que o azoto é facultativamente substituído por alquilo C1 e B é um grupo de ligação didrofílico linear, ligado ao grupo que se liga a proteínas em (Im).
  3. 3Ê. - Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado poi’ -B-A-X- ter a estrutura
    -S-(CH2)2-conh-(CH2)nem que n é um inteiro de 2 a 8.
  4. 4®. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por o grupo de ligação ser derivado de:
    4-N-[4-N-(3-[2-pi ri di1d it i o]propi oni1)aminobuti1]aminobenzoato de 4'-amidinofenilo;
    4-N-[6-N-(3-[2-piridilditio]propionil)amino-hexil]aminobenzoato de 4’-amidinofenilo;
    4-N-(3-N-[3-(2-piridilditio)propionil]aminopropil)aminobenzoato de 4’-amidinofenilo;
    4-N-[5-N~(3-[2-piridilditio]propionil)aminopentil]aminobenzoato de 4’-amidinofenilo;
    4-N-[8-N-(3-[2-piridilditio]propionil)amino-3,6-dioxaoctil]aminobenzoato de 4'-amidinofenilo;
    4-N-[2-N-(3-[2-piridilditio]propionil)aminoetil]aminobenzoato de 4’-amidinofenilo.
  5. 5a. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por o enzima fibrinolitico ser um activador de plasminogénio.
  6. 6a. - Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o enzima fibrinol itico ser um activador de plasminogénio tipo tecido ou uma urocinase de alto peso molecular.
  7. 7a. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por a imunoglobulina especifica ser imunoglobulina G de coelho anti-/glicoproteina de membrana de eritrócito humano/ ou imunoglobulina monoclonal de rato anti-(fibrina humana).
  8. 8a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar urocinase humana de alto peso molecular 4-N-/2-N'-(3-/41-butirimino-(N-ê -1 is imunoglobulina G de coelho anti-/gl icoproteina de membrana de eritrócito hurnano_7)7ditiopropioni 1 )aminoeti1/aminobenzoi 1-0-(ser-356), activador de plasminogénio tipo tecido humano 4-N-/2-N' -(3-/4'butirimino-(N- é.-lis imunoglobulina G de coelho anti-Zglicoproteina de meiiibrana de eritrócito humano/)/ditiopropioni1) aminoetil7aminobenzoil-0-(ser-478), activador de plasminogénio tipo tecido humano 4-N-/8-N-(3-/4-butirimino-(N- e-lis imunoglobulina G de coelho anti-/glicoproteina de membrana de eritrócito humano/)/ditiopropioni1) amino-3,6-dioxaoctil/aminobenzoi1-0-(ser-478), activador de plasminogénio tipo tecido humano 4-N-/2-N'-(3-/4l-butirimino-(N-£>-l is imunoglobulina G de coelho anti-/glicoproteina de membrana de eritrócito humano/)Zditiopropioni1) aminobuti12aminobenzoi1-0-(ser-478), activador de plasminogénio tipo tecido humano 4-N-/2-N'-(3-/4
    -butirimino-N- -lis imunoglobulina G de ratinho anti-/fibrina humana7)7ditiopropionil)amino etil7aminobenzoil-0-(ser-478), activador de plasminogénio tipo tecido humano 4-N-/~2-N'—(3—/—41-butirimino-(N- 8-lis imunoglobulina G de coelho anti-/glicoproteína de membrana de eritrocito humano727ditiopropionil)amino-hexil7aminobenzoil-0-(ser-478), ou activador de plasminogénio tipo tecido humano 4-N-/2-N'-(3—/ 41-butirimino-(N-8 -lis imunoglobulina G de coelho anti-/glicoproteina de membrana de eritrocito humano7ditiopropionil)aminopropi17aminobenzoi1-0-(ser-478).
  9. 9â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente de ligação ter a fórmula (II):
    (II) lOâ. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o agente de ligação de fórmula II ser feito reagir com a imunoglobulina num tampão não nucleofilico a uma temperatura de 0°-30°C e a um pH de 7-8 e por o agente de ligação ser feito reagir com o enzima aos componentes da reacção, por exemplo pH 4-8, à temperatura ambiente, ou inferior a esta.
    llâ. - Processo para a preparação duma composição farmacêutica caracterizado por se combinar
    0,1 a 99% de um derivado obtido de acordo com a reivindicação
    1 com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
  10. 12â. - Método para o tratamento e/ou profilaxia de doenças trombóticas caracterizado por se administrar ao mamífero, necessitado da tal tratamento, uma quantidade eficaz, não tóxica, de um derivado obtido de acordo com a reivindicação 1, sendo a gama de dosagem de ingrediente activo de 0,10 a 10,0 mg por kg de peso corporal por dia.
  11. 133. - Processo para a preparação de um composto de fórmula (III) z
    (III) na qual n é um inteiro de 3 a 8, Z é um contra-ião e cada um de r! a R4 representa hidrogénio ou uma porção atractora de electrões que aumenta a reactividade dum éster amídinofeniIico, caracterizado por compreender a esterificação de um ácido de fórmula (IV):
    SS-{CH2)2CONH(CH2)nNH (IV)
    IflW'’’
    na qual n é como fórmula (V): definido na fórmula (III), com um álcool de 1 2 R R /-/ NB HO----- ♦ (V) X__X 4 NH? z 3 Z R J R na qual R^ , R^ , R^ , R^ e Z são como definidos na fórmula (III).
    ti
  12. 14Ê. - Processo de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por se preparar:
    „ 4-N-[4-N-(3~[2~piridiltitio]propionil)aminobut i1Jaminobenzoato de
    4’-amidinofenilo, / 4-N-[6-N-(3-[2-piridilditio]propioni1)aminohexi1]aminobenzoato de
    4 ’-amidinof eni lo ,
    4-N-(3-N-[3-(2-piridilditio)propionil]aminopropil)aminobenzoato de 4’-amidinofenilo,
    4’-N-[5-N-(3-[2-piridilditio]propioni1)aminopentilJaminobenzoato de 4'-amidinofenilo, ou um seu sal.
  13. 15®. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por se preparar um derivado em que a imunoglobulina específica ou um seu fragmento é dirigida contra um antigénio seleccionado a partir de:
    Complexo de glicoproteína Ilb/IIIa de plaquetas humanas activadas;
    Complexo de glicoproteína la de plaquetas humanas activadas;
    Determinantes antigénicos presentes em fibrina polimérica ou monomérica;
    Proteína de membrana de eritrócitos humanos;
    Proteína de membrana de linfócitos humanos;
    Colagénio; e
    Neoantigénios expressos por células do endotélio e subendotélio vascular durante o desenvolvimento de placa ateromatosa.
PT87096A 1987-03-27 1988-03-25 Processo para a preparacao dum derivado de um enzima fibrinolitico PT87096B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878707369A GB8707369D0 (en) 1987-03-27 1987-03-27 Enzyme derivatives

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT87096A PT87096A (pt) 1988-04-01
PT87096B true PT87096B (pt) 1992-07-31

Family

ID=10614785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT87096A PT87096B (pt) 1987-03-27 1988-03-25 Processo para a preparacao dum derivado de um enzima fibrinolitico

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0284413A3 (pt)
JP (1) JPS63269980A (pt)
KR (1) KR880011328A (pt)
AU (1) AU609105B2 (pt)
DK (1) DK165088A (pt)
GB (1) GB8707369D0 (pt)
NZ (1) NZ224025A (pt)
PT (1) PT87096B (pt)
ZA (1) ZA882145B (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992018139A1 (en) * 1991-04-09 1992-10-29 Brigham And Women's Hospital Chimeric molecule with plasminogen activator activity and affinity for atherosclerotic plaques
US5470997A (en) * 1992-04-06 1995-11-28 Biosite Diagnostics Incorporated Amphetamine derivatives and protein and polypeptide amphetamine derivative conjugates and labels
US5331109A (en) * 1992-04-06 1994-07-19 Biosite Diagnostics Incorporated Phencyclidine derivatives and protein and polypeptide phencyclidine derivative conjugates and labels

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ191320A (en) * 1978-09-07 1982-09-14 Beecham Group Ltd In vivo fibrinolytic enzyme having active site blocked by hydrolytically removable group pharmaceutical compositions
EP0109653A3 (en) * 1982-11-17 1986-01-29 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Process for preparing urokinase complex
GB8334498D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Compounds
GB8334499D0 (en) * 1983-12-24 1984-02-01 Beecham Group Plc Derivatives
GB8400653D0 (en) * 1984-01-11 1984-02-15 Beecham Group Plc Conjugates
EP0266032A1 (en) * 1986-08-29 1988-05-04 Beecham Group Plc Modified fibrinolytic enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
ZA882145B (en) 1989-01-25
GB8707369D0 (en) 1987-04-29
DK165088D0 (da) 1988-03-25
EP0284413A3 (en) 1990-06-13
NZ224025A (en) 1991-02-26
PT87096A (pt) 1988-04-01
JPS63269980A (ja) 1988-11-08
AU1376588A (en) 1988-09-29
AU609105B2 (en) 1991-04-26
KR880011328A (ko) 1988-10-27
EP0284413A2 (en) 1988-09-28
DK165088A (da) 1988-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4414148A (en) Anti-cancer drugs for the treatment of melanomas and method for preparing thereof
AU2020200975B2 (en) New stable antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof
US4880935A (en) Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
KR910000029B1 (ko) 효소와 항체의 공유 결합에 의해 결합된 접합체의 제조방법
ES2386258T3 (es) Relaciones de adición conjugadas para la entrega controlada de compuestos farmacéuticamente activos
ES2299177T3 (es) Conjugados de citotoxinas que contienen dipeptidos.
JP5025059B2 (ja) 核酸を細胞に導入するための配合剤
JP4896959B2 (ja) ドキソルビシン免疫測定法
CA2000048A1 (en) Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand bindin g
CA1209472A (en) Anti-cancer drugs for the treatment of leukaemias t constituted by the chain a of ricin and a specific monoclonal antibody
Vogel et al. Induction of immune cytolysis: tumor-cell killing by complement is initiated by covalent complex of monoclonal antibody and stable C3/C5 convertase.
JPS60174724A (ja) 蛋白質複合体
EP0146050B1 (en) Site selective plasminogen activator and method of making and using same
JPH048411B2 (pt)
JPS60178864A (ja) 酵素誘導体の製造において使用するアシル化剤用化合物
PT97423B (pt) Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo conjugados de anticorpos para o tratamento de neoplasias
CHENOWETH Complement mediators of inflammation
PT87096B (pt) Processo para a preparacao dum derivado de um enzima fibrinolitico
KR930003333B1 (ko) 탄수화물 단위가 변형된 리보솜을 비활성화시키는 당단백질 성분을 함유하는 지속-작용성 면역독소의 제조방법
ABSHER et al. The endothelial heparan sulfate-antithrombin III natural anticoagulant pathway in normal and transplanted human kidneys
DE69737202T2 (de) Thrombolytische substanzen mit antithrombotische aktivität
JPH04266829A (ja) 免疫結合体を形成するための抗体の化学修飾
WO1992009627A1 (fr) Peptide ayant le pouvoir d&#39;inhiber l&#39;infiltration des cellules cancereuses, composite a base de ce peptide et inhibiteur de la metastase du cancer
JPS61143325A (ja) 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物
JPH0228197A (ja) フイブリンに対する抗体；抗体の製造に使用される免疫原、抗体及び抗体を基剤とした製薬学的製剤でフイブリンを測定する方法

Legal Events

Date Code Title Description
FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 19920117

MM3A Annulment or lapse

Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES

Effective date: 19930731