JPS63269980A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物

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JPS63269980A
JPS63269980A JP63074254A JP7425488A JPS63269980A JP S63269980 A JPS63269980 A JP S63269980A JP 63074254 A JP63074254 A JP 63074254A JP 7425488 A JP7425488 A JP 7425488A JP S63269980 A JPS63269980 A JP S63269980A
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immunoglobulin
group
pyridyldithio
amidinophenyl
propionyl
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リチヤード・アントニー・ゴツドウイン・スミス
サーキス・バレツト・カリンジヤアン
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Beecham Group PLC
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血栓症の治療および／または予防に使用するた
めの酵素誘導体に関する。
〔従来の技術〕
欧州特許第０００９８７９号明細書は、静脈血栓症の有
用な治療薬剤であるｉｎ　ｖｉｖｏ線維素溶解活性の酵
素誘導体を開示している。これらの誘導体は、酵素上の
活性触媒部位が加水分解により除去しうる基（加水分解
の擬−次反応速度定数は１０−６〜１０″Ｓ／秒の範囲
にある）Ｋよって遮断されている点に特徴がある。
欧州特許出願第０１５５３８８号明細書は、線維素溶解
作用に関与する酵素上の触媒部位が可逆的な結合基によ
ってそ、れに結合されたヒトタンパク質釦より遮断され
九線維素溶解酵素の誘導体をさらに開示している。この
種のタンパク質は、線維素溶解酵素の活性部位に可逆的
に結合された場合、遅い生理学的クリアランス速度をも
つ酵素誘導体を生成することができる。
〔発明が解決しようとする課題〕
今や、免疫グロブリンクラスのある種のタンパク質は、
欧州特許出願第０１５５３８８号明細書に記載の試薬を
使用して線維素溶解酵素の活性部位にの送達（ｄｅｌｉ
ｖｅｒ７　）を媒介することが見出され九本発明によれ
ば、線維素溶解作用に関与する酵素の触媒部位が、可逆
的な結合基によってそれに結合された特異的免疫グロブ
リンまたはその断片（血栓物質の成分と関連した抗原に
対して導かれた免疫グロブリンま九はその断片）によシ
遮断されている線維素溶解酵素の誘導体が提供される。
〔課題を解決する九めの手段〕
本明細書中で用いる”可逆的結合基１なる表現は、加水
分解の擬−次反応速度定数がｐＨ７，４の等張水油媒体
中３７℃で１０−６ｌ秒〜１０′″３／秒の範囲となる
ような速度で加水分解により除去できる基を包含する。
好適な反応速度定数はｉ　ｘ　１ｏ−ｓ、’秒〜８　Ｘ
　１０−’／秒の範囲である。
適当には、酵素の触媒部位は構造式（１）の基によって
遮断される： （Ｉｍ）−Ｂ−Ａ−Ｘ　　　（１） 〔式中、（Ｉｍ）は先に定義した通シの特異的免疫グロ
ブリンであり、場合によシ、タンパク質結合基を含むよ
うにアミノ酸側鎖特異的試薬で処理することにより修飾
されていてもよい；Ｘは式：−Ｒ−Ｃ−のアシル基であ
り、ここでＲは芳香族またけ脂肪族残基である；Ａは酸
素、硫黄および窒素から選ばれる少なくとも１個のへテ
ロ原子を含む架橋基であり、その際窒素は場合により０
ｌ−ｒ６アルキル基で置換されてｈてもよい；そしてＢ
は（Ｉｍ）のタンパク質結合基へ連結される親水性の線
状連結基である。〕 本明細書中で用いる１線維素溶解酵素（ｆｉｂｒ−ｉｎ
ｏｆｆｔｉｃ　ｅｎｚ）’ｍｅ　）　”なる用語は、欧
州特許第０００９８７９号（ＵＳ４２８５９３２　）明
細書で定義されるようなｉｎ　ｖｉｖｏ線維素溶解作用
を示すあらゆる酵素を意味する。従って、この用語はフ
ィブリンの直接的分解に機能する酵素（例えばプラスミ
ン）、およびプラスミノーゲンの活性化に機能するもの
（例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ　）、ウロキナーゼ〔高分子量と低分子量の両方、お
よび−重鎖形〕、ならびにストレプトキナーゼとプラス
ミンの複合体）を包含する。
この種の酵素は補乳動物の尿、血液ま九は組織から得る
ことができ、１＋細菌、酵母、菌類または哨乳動物細胞
株のような異種宿主生物がその酵素を特定する遺伝子を
発現する場合のような組換えＤＮＡ法によっても得られ
る。この用語はさらに次のものを包含する： （ａ）　　欧州特許出願第０１５５３８７号明細書に記
載されるような、線維素溶解作用を有する／・イブリッ
ドタンパク質； （ｂ）　　欧州特許出願第０１５５３８８号明細書に記
載されるような、線維素溶解酵素の誘導体；（ｃ）　　
欧州特許出願第０１５２ｆｆ３６号明細書に記載される
ような、タンパク質複合体； （ｄ）　　欧州特許出願第０１８３５０３号明細書に記
載されるような、可逆的結合基によって少なくとも１つ
の水溶性ポリマーに結合された線維素溶解酵素から成る
複合体； （ｅ）　　欧州特許出願第０２０！１５３号、欧州特許
第０２０７５８９号、国際出願第８６０４３５１号およ
び欧州特許第０１９９５７４号の各明細書に記載される
ような、自然界に存在する線維素溶解酵素の突然変異酵
素。
本明細書中で用いる１免疫グロブリン１なる用語はヒト
、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマおよびネズミ類を
含めた動物種において特定抗原により産生される１、！
ｉ’Ｇ、　　Ｉ９Ａ、　　１．９Ｄ、　ＩｇＭおよび１
９Ｅクラスならびにそれらの認められたサブクラスの血
清タンパク質および分泌タンパク質を包含する。この用
語は動物内でのポリクローナル免疫応答の産物、および
モノクローナルハイブリドーマ細胞培養物により発現さ
れる産物の両方を包含する。完全なタンパク質の酵素的
または化学的分解により生じた免疫グロブリンの断片（
特定抗原との結合に関与するドメインを保持する）も含
まれる。このような断片の例にはＦａｂドメインの単量
体および二量体が含まれる。免疫グロブリンの重鎮およ
び軽鎖（ｔたはそれらの断片および）・イブリッド）を
コードするｃＤＮＡの異種発現からの免疫グロブリンお
よびそれらのドメインもまたこの用語に包含される。
免疫グロブリンを説明する丸めに本明細書中で用りる１
特異的１なる用語は、血栓現象を直接的または間接的に
生起させうる血管構造の基本的な病理学的変化または血
栓塊を特徴づける一組のもしくは制限された組の関連化
学構造（抗原決定基）へのこの種の免疫グロブリンによ
る高親和性結合の性質を意味する。このような血栓−ま
たは病変−関連抗原物質の例には活性化ヒト血小板の糖
タンパク質複合体１１ｂ／−およびｌａ（Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓ。
Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、５５ｓ１５３−１５７　ｅ　１９
８６およびＢｌｏｏｄ６８．７８３−７８６．１９８６
を参照）、凝血中ＶＣフィブリノペプチドＡおよびＢの
除去により露出されるようなフィブリン重合体または単
量体に存在する（しかし前駆体フィブリノーゲンには存
在しない）抗原決定基（５ｃｉｅｎｃｅ　１９８３　、
　ｖｏｌ、２２２，１１２９−１１３２　）、ヒ、ト赤
血球（Ｂｌｏｃｈｅｍ、ＢｉｏＰｈ７ｇ、Ａｃｔａ、１
９７４　ｔ　３４２６９−８０　）およびリンパ球（Ａ
ｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、１Ｂ、１−８．１９７
５）の膜タンパク質、じゆく状硬化病変に見られる型の
コラーゲン、およびじゆく状斑の発生中に血管内皮およ
び内皮下層の細胞てよって発現される唾瘍抗原が含まれ
る。
本発明で使用するのに適した特異的免疫グロブリンの例
としては、ウサギポリクローナル抗（ヒト赤血球膜糖タ
ンパク質）免疫グロブリンＧ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈ７ｓ、Ａａｔａ、１９７４，３４２　、６９−８０
を参照）およびマウスモノクローナル抗（ヒトフィブリ
ン）免疫グロブリンＧ　（５ｅｌｅｎｅｅ　１９８３　
ｖｏｌ。
２２２．１１２９−１１３２を参照）が挙げられる。
適当な基Ｘの例には欧州特許第０００９８７９号明細書
に記載の遮断基から誘導される基が含まれる。
好適々基は上記欧州特許明細書に記載されるような任意
に置換されたベンゾイル基（その２位または４位が基Ａ
でさらに置換される）、同様に上記欧州特許明細書に記
載される任意に置換されたアクリロイル基（その２位ま
た＃ｉ３位でＡに結合される）、およびナフトイル基で
ある。
適当な基Ａは加水分解の擬−次反応速度定数を上記範囲
（好マシくは１　ｘ　１０″Ｂ〜８　ｘ　１０−’／秒
）とするのに十分な安定性を生成したアシル−酵素に与
えるものである。Ａは１個ま九は２個のへテロ原子を含
むものが好ましい、Ａの例は一〇−−８− 一に−−■−猪一 一旧−ｏ−−Ｎ−双一 タンパク質結合基は１つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖
に特異的な試薬で免疫グロブリンを修飾することにより
誘導された官能基であって、基Ｂと反応しうる基を含む
ものである。
基Ｂの例は置換されたＣ１−Ｃｌ０アルカン（例えば６
−アミノヘキシル〕、または線状ポリマー（例えばポリ
エチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ
グリシン、ポリアラニンまたはポリサルコシン）である
。線状、！！！ｉＢは上記のアミノアルカンまたはポリ
マーの３−チオプロピオニルまたは２−チオアセチル誘
導体のような、タンパク質結合基と反応するための、あ
るいはその誘導体の分析を容易にするための切断可能な
部分を含んでいてもよい。切断可能部分の例はジスルフ
ィド結合である。好ましくは、ジスルフィド結合は（Ｉ
ｍ）と線状基Ｂとの反応から誘導され、従−ってＢと（
Ｉｍ）との結合点に生成される。これとは別に、切断可
能部分は、α、β−ジヒドロキシ結合であシうる。
好適には、Ｂは−８−（ＣＨｓ　ｈ−Ｃ０ＮＨ−（ＣＨ
Ｉ　）ｎ　−ｃ式中ｎは０〜８．より好ましくは２〜８
である）の形をし九構造である。Ｂの例は −８（ＣＨｚ）ｓＣＯＮＫ−、−Ｓ　−（ＣＨＩ　）Ｉ
Ｃｏ正（ＣＨｚ）４−２−　Ｓ　−（ＣＨｔ　ｈｃＯＮ
Ｈ（ＣＨｘ　）ｓ　−−−Ｓ　−（ＣＨｚ　ｈｃＯＮＨ
（ＣＨｓ　）ｓ　−−−８−（ＣＨｚ）ＩＣＯＮＨ（Ｃ
Ｈ意）意　−。
−Ｓ　−（ＣＨＩ　）ＩｃＯ正（ＣＨ冨）５−および−
Ｓ　−（ＣＨＩ　）ＩＣＯＮＨ（ＣＨｚ）鵞０　（ＣＨ
ＩｈＯ（Ｃ）ｉｘ）＊　−テある。
１つの例として、特異的免疫グロブリンと２−イミノチ
オランまたはＮ−アセチルホモシスティンチオラクトン
との反応による遊離チオール基の生成は、そのタンパク
質結合基とチオール反応性Ｂ構造とのカップリングを可
能にするであろう。
また、タンパク質結合基はＢに含まれる遊離チオールと
反応しうる６−マレイミドヘキシル基または２−ビリジ
ルージチオ基のようなチオール反応性基を含むことがで
きる。好ましくは、タンパク質結合基はタンパク質のり
シン感−アミノ基と反応する２−イミノチオランのよう
なタンパク質修飾剤から誘導される。
好ましくは、式（１）中のタンパク質（Ｉｒｎ）はＩｇ
Ｇクラスのものであシ、マウスモノクローナル由来のも
のであり、そして１〜３個のチオール基を導入するよう
に修飾されるか、あるいは例えばハドソン（Ｌ、Ｈｕｄ
ｓｏｎ　）およびヘイ（Ｆ、Ｃ，Ｍａｙ　）、’　Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ　Ｉｒｎｍｕｎｏｌｏｇｙ　’　１　＊
　１９６−１９９　＃　　ブラックウェル、オックスフ
ォード、第２ｉ、１９８０に記載されるように、１個の
チオール官能基を含むＦａｂドメインを与えるように断
片化されて部分還元されるであろう。
本発明誘導体は、タンパク質結合基を含むように場合に
より修飾された特異的免疫グロブリン、線維素溶解酵素
および先に定義した可逆的な結合基を形成するための酵
素の触媒部位と反応しうる部分およびタンパク質アミノ
基またはタンパク質結合基と反応しうる部分をもつ結合
剤を一緒に反応させることにより製造゛される。
よシ詳細には、本発明誘導体はタンパク質結合基を含む
ようにアミノ酸側鎖特異的試薬で処理することにより場
合により修飾された特異的免疫グロブリンを式（ＩＩ）
のアシル化剤： 〔式中、Ｂ、ＡおよびＸは式（りに関して定義した通り
であり、Ｗは特異的免疫グロブリンのアミノ酸側鎖と直
接反応しうる基を表すか、または免疫グロブリンがタン
パク質結合基を含む場合は、Ｗはそのタンパク質結合基
と反応しうる基を表し、２は対陰イオン（好ましくはハ
ロゲンイオンまたＨｐ−）ルエンスルホン酸イオン〕で
あり、そしてＲ１へＲ４はそれぞれ水素またはアミジノ
フェニルエステルの反応性を高める電子吸引基を表す〕
と反応させ；その後生成し九免疫グロブリン誘導体を線
維素溶解酵素と反応させる；ことによシ製造される。
式（ＩＩ）の新規アシル化剤は本発明の一部を構成する
。
特に１本発明は式（Ｉｌｌ）のアシル化剤を提供する：
（式中、ｎは３〜８の整数、より好ましくは３〜６であ
り、２は対イオンであり、セしてＲ１−Ｒ４はそれぞれ
水素またはアミジノフェニルエステルの反応性を高める
電子吸引基を表す。） 驚いたことに、式（Ｉｌｌ）の化合物のアルキレン鎖長
が長くなると、その化合物から製造される本発明誘導体
の加水分解速度定数（ｋ）はそれに対応して減少するこ
とが見出された。
急性心筋梗塞治療用の本発明誘導体の速度定数の好適な
範囲は１，９　Ｘ　１０−’〜６．４　Ｘ　１０−’で
あり、約１〜３時間の脱アシル化半減期に相当する。式
（Ｉ［Ｉ）の新規アシル化剤は好適な範囲内の速度定数
をもつ本発明誘導体を提供しうる。
Ｗがタンパク質のアミノ酸側鎖と直接反応しうる基を表
す場合、それは好ましくはＮ−スクシンイミジル基であ
る。Ｗがタンパク質結合基と反応しうる基を表す場合、
それは好ましくはピリジルチオ基である。場合によシ、
ＷＲ２−＝）ロー４−アジドフェニル基のような光活性
化基であシうる。
好ましくは、Ｒ１へＲ４はそれぞれ水素またはハロゲン
を表す。
また、本発明誘導体はタンパク質結合基を含むようにア
ミノ酸側鎖特異的試薬で処理すること和より修飾された
特異的免疫グロブリンを、式（…）のアシル化剤（但し
Ｗはタンパク質のタンパク質結合基と反応しうる基であ
る）で処理することにより修飾された線維素溶解酵素と
反応させることによシ製造しうる。好ましくは、Ｗはピ
リジルチオ基である。
上記方法において、タンパク質結合基を導入するための
特異的免疫グロブリンの修飾は、好ましくは、使用する
試薬に応じてｐＨ３，０〜９．０で緩衝水性媒体中で実
施される。好適な試薬の２−イミノチオランの場合は…
６．５〜８．５であるのが好ましい。免疫グロブリンの
濃度は好ましくは高く（〉１０■／１７）、そして修飾
試薬はその試薬の反応性に応じて適度（１，１〜５倍）
にモル過剰で使用される。温度および反応時間は好まし
くはＯ°〜４０℃および１０分〜７日の範囲である。タ
ンパク質の修飾度は導入した結合基について免疫グロブ
リンを検定するととくより測定できる。
上記検定は５，５１−ジチオビス−（２−ニトロ安息香
酸）Ｋよる滴定のような標準タンパク質化学的手法で６
Ｊ）うる。好ましくは、免疫グロブリン１モル当たり平
均して０．５〜３．０モルのタンパク質結合基が導入さ
れるであろう。修飾された免疫グロブリンは透析、限外
濾過、ゲル濾過、および溶剤または塩沈降のような標準
技術により過剰の修飾剤から分離される。一般には、修
飾免疫グロプリンをアシル化剤またはアシル化線維素溶
解酵素とできるだけ速やかに反応させることが望ましい
。しかし、いくつかの場合には、この中間体物質を凍結
溶液中に貯蔵するか、あるいは凍結乾燥することもでき
る。
上記の如く製造された修飾免疫グロブリンは、タンパク
質結合基の初期導入のために使用した条件と類似するが
、以下の制限を有する条件下で式（ｎ）のアシル化剤と
反応させる： （ａ）　　アミジノフェニルエステルの加水分解を避け
るために、好適な声範囲は７．０〜８．０であり、そし
て非求核性緩衝液が好適である。
（ｂ）　　好適な温度範囲は０℃〜（９）℃であり、反
応時間け６時間までである。
（Ｃ）　　アシル化剤対タンパク質結合基のそルレｂは
好ましくは１〜１０の範囲である。
（ｄ）　　この反応は任意に基Ｗの誘導体（例えばピリ
ジン２−チオン）の放出を観察することによシ監視する
ことができる。
（ｅ）　　生成物（タンパク質含有アシル化剤）の反応
性ゆえに、その生成物は式（■）の過剰のアシル化剤か
らできるだけ迅速に分離することが望ましい。
このために、高性能サイズ排除クロマトグラフィーまた
は透析が使用される。
（ｆ）　　生成物は好ましくけ直ちに線維素溶解酵素と
反応させるべきであるが、短期間の間−４０’Ｃ以下の
凍結溶液中に貯蔵（または凍結乾燥）することができる
。
非修飾特異的免疫グロブリンの式（ＩＩ）のアシル化剤
による処理は、一般にタンパク質結合基の導入のために
使用した条件と類似した条件下で行われる。しかしなが
ら、このタイプの試薬の反応性は、上記（ａ）〜（ｆ）
に示した予防策を講じることが必要である。
修飾した特異的免疫グロブリンとアシル化し九線維素溶
解酵素との反応を利用する本発明の方法の面において、
その酵素は初めに欧州公開特許出願第０００９８フ９ て述べ九条件下で式（ＩＩ）のアシル化剤と反応させる
。上記手法によって過剰の試薬を除去した後、アシル化
酵素は上記（ａ）〜（ｆ）で使用した条件と類似し九条
件下でタンパク質結合基を含む免疫グロブリンと反応さ
せる。しかしながら、アシル化酵素の加水分解を最小限
に抑えるために、このカップリング反応は１０’Ｃ以下
（好ましくはＣｆ−４℃）で行うのが好適である。さら
に修飾免疫グロブリンはアシル化酵素よりも大モル過剰
量で使用される。
後者の条件はまたタンパク質含有アシル化剤と線維素溶
解酵素とのカップリングにも適用される。
本発明誘導体はいろいろな分離技術によって過剰の未反
応成分から分離できる。一般に、好適な技術は線維素溶
解酵素成分と免疫グロブリン成分の両方の結合特異性を
利用するであろう。従って。
特異的免疫グロブリンＧとヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子との複合体は次の１）または２）により精製で
きる； １）プラスミノーゲン活性化因子を保持し且つ免疫グロ
ブリンを除く念めに固定化リシンのカラムを通過させる
；または ２）過剰のプラスミノーゲン活性化因子を除く念めに、
固定化した黄色ブドウ球菌（　５ｔａｐｈ７１ｏｃｏ−
ｅｃｕｓ　Ａｕｒｅｕｓ　）プロティンＡまたは免疫グ
ロブリンに対して特異的な抗原を含むカラムを通過させ
る。
別法としてそして好ましくは、後者の工程は複合体と非
修飾プラスミノーゲン活性化因子の分子量の差を利用す
るゲル透過クロマトグラフィーによ）行うことができる
。
式（Ｉｆ）のアシル化剤は標準方法によりｇ造しうる。
好適な一般合成経路を以下に示す。
（＆）マスヤングし九反応性官能基を含むアシル化剤（
例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネ−）　：　５ＰＤＰ　）と、置換基上
に求核性官能基を含む２−または４−置換安息香酸誘導
体（例えば、４−ヒドラジノ安息香酸．Ｎ−２（６−ア
ミノヘキシル）アミノ安息香酸またはＮ−４（２−アミ
ノエチル）アミン安息香酸）との反応。好適な反応条件
は周囲温度で１〜４８時間、乾燥ピリジン（または他の
塩基性溶剤）を必要とする。
缶）工程（ａ）からの中間体酸は欧州公開特許出願第０
００９８７９号明細書中で単純な遮断剤てつぃて記載さ
れるように、弱塩基性溶剤中でジシクロへキシルカルボ
ジイミドを使用して４−アミジノフェノール（またはそ
の環置換誘導体）の塩でエステル化する。完全にエステ
ル化するために、わずかにモル過剰のアミジノフェノー
ル（１，５〜４倍）全使用することが好ましい。場合に
より、エステル化は酸触媒としての無水ｐ−）ルエンス
ルホン酸の存在下で行われる。
本発明はまた式（ＩＶ）の酸： （■） を式（Ｖ）のアルコール： Ｃ式中の可変記号は式（ＩＩＩ）で定義し走通シである
）でエステル化することからなる式（ＩＩＩ）の新規化
合物の製法を提供する。
工程（−で使用するための適当に置換された安息香酸誘
導体は慣例的に製造できる。例えば、４−フルオロ安息
香酸をｔ−ブタノールのよう々適当なアルコールでエス
テル化し、そのフルオロ基を昇温下に適当なジアミンで
置換する。
本発明誘導体は好ましくは薬剤組成物として投与される
。
従って、本発明はまた本発明誘導体と薬剤学的に許容さ
れる担体とを組み合わせて々る薬剤組成物を提供する。
本発明による組成物はヒトへの静脈内投与に適した薬剤
組成物として常法に従って処方される。
一般に、静脈内投与用組成物は滅菌等張水性緩衝液中の
無菌誘導体の溶液である。必要に応じて本組成物はさら
に誘導体を溶解状態に保つための可溶化剤および注射部
位の疼痛を和らげるためのリグノカインのような局所麻
酔剤を含むことができる。一般に、本発明誘導体は単位
剤形で１例えば活性単位で誘導体の量を示し且つ遊離の
非修飾タンパク質を放出する時間を示すアンプルや小袋
のような気密容器中の乾燥粉末または水不含濃縮物とし
て供給されるであろう。本発明誘導体が輸液により投与
される場合は、その誘導体は滅菌”注射用水１を含む輸
液ぴんと共に供与されるであろう。その誘導体が注射に
より投与される場合は、滅菌注射用水のアンプルと共に
供与される。
注射用または輸液用組成物は投与に先立って諸成分を混
合することにより調製されるであろう。
投与する物質の量は必要とする線維素溶解の量および速
度、血栓塞栓症の程度、ならびに血塊の位置および大き
さにより左右されるであろう。正確な投与量および投与
方式は、疾病の性質を考慮して主治医が諸情況に応じて
決定しなければならない。しかしながら、一般に血栓を
治療しようとする患者は０．１０〜１０．０■／ｋｇＣ
体重）の１日分の用量を、５回までの注射または輸液に
より受は取るであろう。冠状動脈血栓症の治療のために
は。
同じ用量が１回の静脈内ポーラスとして投与される。
本発明誘導体はま九、予期される血栓症誘発に先立って
一度に同様の用量を患者に投与することにより、血栓症
を予防するために使用される。例えば、股関節部置換手
術の外傷の結果起こる深部静脈血栓症の予防または改善
は、外科的外傷による潜在的血栓部位の発生後に、一定
時間にわたってその部位に線維素溶解活性を放出しうる
薬剤を投与することによシ達成される。この種の誘導体
は手術直前（ま九は手術中）に投与されるであろう。
上記の投与量範囲内で本発明化合物は毒性作用を全く示
さない。
従って、本発明の別の面において、無毒性有効量の本発
明誘導体を血栓症の治療および／または予防を必要とす
る哺乳類に投与することから成る、血栓症の治療および
／または予防方法が提供される。
本発明はさらに血栓症の治療および／ま九は予防用薬剤
を調型するための本発明誘導体の使用に関する。
以下の１方法１および１実施例１は本発明を例示するた
めのものである。
方法 ウロキナーゼおよびｔ−ＰＡは５℃、ｐＨ８，０で０．
１ＭトリエタノールアミンＨＣＪ中の１ｔｒ＋Ｍの基質
濃度でそれぞれ発色性基質（カビビトラム社、スエーデ
ン）Ｓ−２４４４およびＳ−２２８８に対して検定し之
。５ＵＶｉ行路長さが１ａ１１のセル中の基質ＩＲｔに
おいて０．００Ｘ　７分のＯｏＤ、増加を与える活性量
として定義される。
（ｂ）　　反応速度定数の決定 擬−次反応速度定数は生理学的条件（すなわち３７℃、
ｐＨ７，４の等張水注媒体中］においてアシル−酵素を
加水分解することにより決定される。一定の間隔でアリ
コートを取り出し、発色性基質と共にイン中ユベーショ
ンし、そして基質の転化速度を上記のように測定する。
加水分解は基質の転化速度が最大に達するまで続ける。
その後、速度定数にはｔに対してＬｏｇｅ　（１−Ａｔ
／Ａｍａｘ　） （ここでＡｍａｘはアリコートが基質を転化する最大速
度であり、セしてＡｔはアリコートが時間ｔで基質を転
化する速度である）をプロットすることにより算出する
ことができる。
好ましくは、このような速度定数は方程式：％式％） （式中、Ａｏは脱アシル化前のアシル−酵素調製物の活
性である） にＡｔと時間データをあてはめて、コンピユータ化され
九非直線回帰分析を行うことにより求められる。
（ｃ）　　線維素溶解活性のフィブリン平板検定フィブ
リン平板は１０　Ｘ　１０　ｃｄプラスチック製皿（ス
テリリン）にピペットで分取（９１１１ｔ）　Ｌ念１２
５　ｒｒＭ　ＮａＣ１（ｍ　７．４　）中の０．０２９
Ｍバルビトンに溶解した０、４　ｗ／　ｖ　％ζトフイ
プリノーゲン（カヒ、クレードｌ、フローラボラトリー
ズ、スコツトランド）を、ウシトロンビン（５ＯＮＩＨ
単位／ＩＬｔｌパーク・デービス、ＵＫ）０，３ＪＩｊ
と急速混合して凝固させることにより調製した。平板は
３７℃で通常１８〜２４時間、必要に応じてそれより長
時間インキュベーションし、ブロモフェノールブルー水
溶液で染色し念。それぞれの溶解域について、互い対し
て垂直の２つの直径をノギス（副尺付きカリパス）を用
いて測定し九。それぞれの試料にっ込て全部の直径の平
均を出し、この平均値を検量線と関連させて線維素溶解
活性に変換し念。
実施例１ リンＧとの活性中心結合複合体 ＮＥ（Ｑ ベルム（０，Ｊ、Ｂｊｅｒｒｕｍ　）およびランドール
（Ｐ、Ｌｕｎｄａｈｌ　）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ、１９７４１３４２　、６９〜８０に
記載される如くヒト赤血球塘タンパク質に対して産生さ
れたウサギポリクローナルＩｇＧ　（０，９０ｗ／ｖ　
％塩化ナトリウムＩＩＬｔ当たり３ｏＴｎ９の溶液３．
Ｏｄ　Ｊを０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０，１Ｍ塩化
ナトリウム、　０．０１ｗ／ｖ　’４ツイーン８ｏ界面
活性剤ｐＨ７，４（リン酸緩衝液）（１，０ＪｒＬｔ）
と混合し、新たＫｍ造した２−イミノチオラン（５０ｍ
Ｍ水溶液、５０Ａｌ）を加えた。この混合物を２５℃で
加分間インキュベーションし、その後飽和硫酸アンモニ
ラム溶液（４，０１１）を加えて沈殿させ、９０００　
Ｘ１／４℃で加分間遠心した。その沈殿物を０．５　Ｍ
Ｌ−アルギニン、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭト
リスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、０．０１ｗ
／ｖ％ツイーン帥界面活性剤ｐＨ７，４（ＡＮＴ緩債液
、２，０１ｊ）中に溶解し、そしてＡＮＴ緩衝液（３，
ＯＭｌ　）を流してセファデックスＧ−２５の小型カラ
ム（ＰＤＩＯ）で４℃にてゲル濾過した。この溶液は約
２５■／ｍｌのタンパク質を含んでおり、５．５−シチ
オピス−（２−二トロ安息香酸）ンζよる遊離チオール
基の滴定は１３６μＭのスルフヒドリル含量（ス々ｂチ
、０．８４モルチオール１モルタンパク質の平均置換レ
ベル）を示した。この生成物はすぐに使用し喪。
高分子量ウロキナーゼ（１０’ＩＵ　、　約１０５す１
モル）はリン酸緩衝液（１，０１ｊ）に溶解し　４１゜
アミジノフェニル４’−Ｎ−（２−Ｎ−（３−（２−ビ
リジルジチオ〕プロピオニル）アミノエチルコアミノ安
息香酸エステル（欧州特許出願第０１５５３８８号の実
施例３ｆ％２０ｍＭの乾燥ジメチルスルホキシド溶液２
５４）を加えた。この混合物を２５℃で凹分間インキエ
ベーションし、添加とインキュベーションを繰り返した
。ウロキナーゼのアミド分解活性は初めの値の２．４チ
に減少した。
この生成物はＷ緩衝液（３，０ＩＬｔ）を流してセファ
デックスＧ−２５の小型カラム（ＰＤＩＯ）で４℃にて
ゲル濾過することにより過剰のアシル化剤を除き、直ち
に使用した。
上記溶液を混合し、ウシ肺トリプシン阻害剤（アブｏチ
ニｙ、２．９１ｎ９／ＩＬｔを０，５Ｊｌｊ）を加え九
この混合物の容量を約２．０！Ｌｔに遠心濃縮（アミコ
ン・セントリコン−１０，２℃、５ｏｏｏ　ｘ　ｇで２
．５時間）して減らし、生成物を一１９６℃で貯蔵し九
全部の試料をＴＳＫＧ３０００蜜心ＨＰＬＣゲル透過ｉ
トリックスの３００　Ｘ　２１．５雪カラムに装填し、
平衡化し、に〜２３’Ｃ１２，０ｒＩＬｔ／分でにｑ緩
衝液を用いて溶出した。７２ｒｐＬｔ、８６ＩＬｔおよ
び１１８ＩＩｌ付近で溶出するタンパク質ピークを検出
し九、６８〜８８ＩＩＬｌの間で溶出する物質を集めｓ
　Ｏ，２ｗ／ｖ　％　Ｄ−マンニトール、２０ｍＭ重炭
酸アンモニウム、１．０　ｍＭ　６−アミノヘキサン酸
、ｐＨ７，４（２１ＩＬｔ）を流してゲル濾過しく　Ｐ
ｏ１ｏ　、上記の通り）、１５　Ｘ　１，４−〇ロット
に凍結乾燥し、そして−４０”Ｃで貯蔵した。生成物は
約２．９　Ｘ　１０’″４／秒の平均速度定数でリン酸
緩衝液中３７℃で脱アシル化された。
実施例２ 免疫グロブリンＧとの活性中心結合複合体ＮＨＯ 実施例１のウサギ抗体（３０■／−を６３μ！、１２ナ
ノモル）を０　、９ｗ／ｖ　’４塩化ナトナトリウム、
９ｒＩＬｔ）Ｋ加え、１．ＯＭリン酸ナトリウム％　０
．Ｏ１ｗ／マチツイーｙｓｏ界面活性剤ｐＨ７，４（Ｑ
、１ｒＬｔ）で緩衝化した。２−イミノチオランの新た
に調製した溶液（１００ｍＭ　　水溶液２５Ａｌ）を加
え、この混合物を５℃で凹分間イン争ユベーションした
。飽和硫酸アンモニウム溶液（２，Ｏｄ）を加え、生成
物を５０００×ｙ、４℃で４０分間遠心して分離した。
この沈殿物を実施例１のリン酸緩衝液（０，５ｒｎｔ）
に溶解し、沈殿工程を繰シ返した。！終溶液（０，５！
ＩＬｔ）は、５．５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香
酸）で滴定し、７９μＭの遊離チオール基を含んでおシ
、これは約３．２モルチオール１モルタンパク質に和尚
した。この生成物はすぐに使用しな。
Ｎ判し危ｔ−ＰＡ（実施例１のハＪ緩衝液中約１００ナ
ノモル、２．０ＩＬｔ）を４１−アミジノフェニル４−
Ｎ−（４−Ｎ−（３−（２−ピリジルジチオ〕プロピオ
ニル〕アミノエチル〕アミノ安、ｌ香酸エステル（乾燥
ジメチルスルホキシド中２０ｍＭ　、　５０Ｍ）と混合
し、５℃で四分間イン中ユベーションした。この後、こ
の酵素のアミド分解活性は約９５Ｓまで低下した。この
生成物をＡＮＴ緩衝液（３，４ｄ）を流してセファデッ
クスＧ−２５の小型カラム（ＰＤ　１０　）で４℃にて
ゲル濾過し九。この溶液のアリコートの２．５ｍＭジチ
オトレイトールでの還元および３４３　ｎｍ　での放出
ピリジン２−チオンの監視は、この生成物が約１０２ナ
ノモルの２−ピリジルジチオ基を含むことを示した。こ
の物質は一１９６℃で貯蔵した。
上記のチオール化ＩｇＧ生成物の全部を上記工程（ｂ）
からの生成物の一部（１，５ＩＬｔ％６ナノモル）と混
合し、遠心濃縮（実施例１と同じ条件であるが、２時間
だけ行う）してその容量を約０．２　ｄに減らし喪、こ
の生成物を実施例１に記載の如くクロマトグラフィーに
かけた。６４〜７２祷の間で溶出する分画（２，０Ｉｌ
ｔ）を集め、−７０℃で一時的に貯蔵し、その後約１．
０ｄＫ遠心濃縮した。最終生成物は一１９６℃で貯蔵し
た。この生成物は１．９２　Ｘ　１０−’／秒の平均−
次速度定数でリン酸緩貸液中３７℃で脱アシル化された
。
実施例３ ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−（８−Ｎ−（３−ＮＨ
Ｏ ｔ−ブタノール（６，６１ｄ）およびピリジン（５，６
２１ｄ　）を乾燥ジクロロメタン（４Ｍ）に溶解し、ド
ライアイス／アセトン浴中で一５０℃に冷却した。乾燥
ジクロロメタン（２０ｄ）中の４−フルオロ安息香酸塩
化物（１０，Ｏ，！ｉ＋　）の溶液をアルコール溶液に
徐々に加えた。この溶液を反応の間中窒素下に保ち、室
温まで次第に温めた。その後１日中還流加熱した。追加
のｔ−ブタノール（１！！Ｌｔ）とピリジン（１−）を
加え、２日間以上還流を続けた。冷却後反応混合物を置
火２Ｍ塩酸（４０１＋１４）、１０チ炭酸水素す）　Ｉ
Ｊウム溶液（４０ＷＬｔ）および飽和硫酸ナトリウム水
溶液で洗った。有機層を乾燥し、濾過し、蒸発させて油
状物（１０，６２Ｆ　）を得た。これは表題化合物と若
干の無水４−フルオロ安息香酸を含んでいた。２つの成
分をカラムクロマトグラフ’ｆ　−（１００Ｆシリカ；
３０％ジクロロメタン／７０チ石油エーテル）で分離し
て表題化合物（８，４８ｇ、６９％）を得た。
”ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ　ｓ　）δ８．０５，７．０５（
４Ｈ，ｍ、アリール−Ｈ）および１．６０　（９Ｈ，Ｓ
　、　ＣＨｓ　）　、赤外１１ｔｌＪ（薄膜）　Ｖｍ　
ａ　ｘ　２９７０　＋１７１５　、１６１０　、１５１
０　、１２９０　、１１５５　、１１２０　、８５０　
、および７７０ａＲ−’　。
上記工程（＆）からの４−フルオロ安息香酸ｔ−ブチル
（１，Ｏｇ）を１．８−ジアミノ−３，６−シオキサオ
クタン（４成）に溶解し、乾燥窒素の雰囲気下１２０℃
で３日間加熱した。水（５−）を加え、この溶液を５Ｍ
水酸化ナトリウム溶液で塩基性とした。水層は酢酸エチ
ル（２Ｘ１０ｊ！７りで抽出し九有機層は飽和硫酸す）
　ＩＪウム溶液（５Ｎ）で再抽出し、その後乾燥し、濾
過し、蒸発させて表題化合物の油状物（１，４２，９、
８６％）を得た。
２．８　（２Ｈｅ　ｔ　ｅ　Ｊ＝５Ｈｚ　ｅ　ＧｂＮＨ
４）　ｔおよび１．５５（ＩＩＨ，Ｓ。
ＣＣＨｍ　＋　ＮＨＩ　）　、赤外線（薄膜）Ｖｍａｘ
３３７０，１６９０゜１６１０．１５３０，１２９０，
１１６０．１１１０．および７７０ｃｍ＋−”　。
ジーｐ−）ルエンスルホン酸塩（融点１１７〜１１８℃
）を製造した。実測値：　Ｃ、５４，７９；Ｈ，６，５
８；Ｎ　ｖ　３．９２　、　Ｃ１ｙＨｕＮｔＯａ　２　
　Ｃ？ＨＩ　ＳＯｌ、　１／２　Ｒｈｏとしての計算値
：　Ｃ，５４，９３；Ｈ６，６９；Ｎ、４．１３チ。
上記工程（ｂ）からの４−Ｎ−（８−アミノ−３，６−
ジオキサオクチル）アミノ安息香酸ｔ−ブチル（１１０
■）をピリジン（ｌ−）に溶解し、Ｎ−スクシンイミジ
ル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−）　（５
ＰＤＰ　）　（１０６ｍ９）を加えた。コの溶液を室温
で窒素下に、３日間攪拌した。この後ピリジンを蒸発さ
せて除き、酢酸エチル（５−）を加え、その有機層を１
０１ｓ炭酸水素ナトリウム水溶液（５ＩＬｔ）で抽出し
た。有機層を乾燥し、濾過し、蒸発させて黄色の油状物
（１２７ｒｎ９）を得た。
これをクロマトグラフィーＣ１９シリカ／酢酸エチル）
で精製して表題化合物を得た（９０■、５１％）’Ｈｎ
ｍｒ　（■Ｃｌ５）δ８．５（ＩＨ，ｍ、２−ピリジル
−Ｈ）。
赤外線（薄膜）Ｖｍａｘ３３５０，１６９０，１６７°
０，１６１０゜１２９０および１１６０ａｋ−’。
３−ニトロベンジルアルコール（３−Ｎ０ＢＡ　）中で
の質量スペクトルＦＡＢ：　５２２（ＭＨ＋）、４６ｆ
ｆ。
４１０．３３７，３０５，２８９，２１９，２０６゜上
記工程（ｃ）で大造したｔ−ブチルエステル（９０１ｎ
９）をトリフルオロ酢酸（２ｄ）中に懸濁し、室温に一
晩放置させた。この溶液をガラスクールのプラグに通し
て濾過し、揮発性物質を蒸発により除去した。淡黄色油
状物として表題化合物（１２０■、１００％）を得た。
’Ｈｎｍｒ　ｄ’アセトン／ＣＤ（Ｊｓδ８．７（ＩＨ
，ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ。
６Ｈｚ　、　ＣＨＩＳ　）　。
上記工程（ｄ）からの酸−トリフルオロ酢酸塩（２１２
■）をピリジン（ＩＩＬｔ）中に溶解した。４−アミジ
ノフェノール（５３１１！９）’ｅ加え、続いてジシク
ロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ　）　（６４ｍｇ
）を加えた。この反応混合物を乾燥窒素の雰囲気下で４
日間攪拌した。その後この溶液を濾過し、蒸発させ、橙
色のガムをクロロホルム（２）＜３ｍ４）ですりつぶし
た。次いで、ガムをエタノール（０＋、　５’　ｔ＜−
）に停零して濾過した。生成物のガムが析出するまでジ
エチルエーテルを加えた。これをデカンテーションおよ
び蒸発により単離して、淡褐色ガムとして表題化合物（
１１ｒｎ９）を得た。
”Ｈｎｍｒはこの物質が約６０％の純度であり、主な不
純物は４−アミジノフェノール塩酸塩であることを示し
た。
”Ｈｎｍｒ　ｄ’ＤＭｓｏδ９．２５（４Ｈ，巾広ｄ−
ＤｍＯ交換可能。
＋？’ＪＨり−８，７５（ＩＨ−８＃ＮＨ）−８，４５
（ＩＨ−ｍ−２−ピリジルー　Ｉ（）　ｅ　７．８　（
６Ｈｅ　ｍ　＋　２ｘアリール−Ｈ＋２ｘアミジノフエ
ニ（ＩＨ，Ｌ２Ｈｚ＋アリール−ＮＨ）、６．７０（２
Ｈ，ｄ、Ｊ＝９Ｈｚｅ７リールーＨ）Ｃ３，６０（１４
Ｈ，ｍｅ４ｘＯｃＨ雪＋２ＸＮＨＣＨ１＋　Ｃ０ＣＨ＊
　）および３．０（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ。
ＣＨｘＳ−８）。
３−　Ｎ０ＢＡ中−ｔ’ｃ）ＦＡＢ質量スペクトル：　
５８４　（遊離カチオンのＭ＋３ ゲン活性化因子 精製したｔ−ＰＡ　（ＡＮＴ緩衝液中約７７ナノモル、
１．６Ｉｎりを上記工程（ｅ）からのアシル化剤（乾燥
ジメチルスルホキシド中８３ｍＭ％加μｌ）と混合し、
０℃に１６時間保持した。この後、酵素のアミド分解活
性は９８チ以上低下した。生成物はセファデックスＧ−
２５の小型カラム（ＰＤ　１０　）で４℃にてＡＮＴ緩
衝液（３，５１ｔ）を流してゲル濾過し、−１９６℃で
貯蔵した。
チオール化つサギ抗（ヒト赤血球膜糖タンパク質）　Ｉ
ｇＧを実施例１０）のようにして製造した（但し、２−
イミノチオラン溶液を田μ！使用した）。
この生成物はタンパク質１モル当たシ約０．７６モルの
チオール基を含んでいた。この物質を上記工程（ｆ）か
らの生成物と混合し、次いで約２．５−の容量になるま
で濃縮し、そして実施例１（Ｃ）の如くクロマトグラフ
ィーＫかけた。３７℃でのアリコートの部分加水分解に
よる個々の分画の検定、および基質Ｓ　−２２８８を使
用するｔ−ＰＡのアミド分解測定は、高分子景活性のピ
ークが約６９祠で溶出する（低分子量活性、すなわちカ
ップリングしていないアシル−ｔ−ＰＡは約９０−で溶
出する）ことを示した。６２〜７６ｄの間で溶出する分
画のプールは、飽和硫酸アンモニウム溶液（１６ｄ）を
用いて１００００　Ｘ　９．４℃でＩ分間沈殿させた。
この沈殿物をリン酸緩衝液（３，５Ｉ！Ｌｔ）を流して
上記のようνにゲル戸遇し、−１９６℃で貯蔵した。と
の生成物は約２．５　Ｘ　１０’／秒の平均−次脱アシ
ル化速度定数でリン酸緩衝液中３７”Ｃで脱アシル化さ
れた。
実施例４ 嘉　　　　　　　　　　０ ４−フルオロ安息香酸ｔ−ブチル（１，０、！ｉ’　）
を１．４−ジアミノブタン（１０１ｔｔ）と混合し、こ
の混合物を１２０℃で一晩加熱した。冷却後、水（ｌＱ
ｄ　）を加え、次いで５Ｍ水酸化ナトリウム溶液（４成
）を加えた。この水溶液を酢酸エチル（２Ｘ１５ｍ）で
抽出し、有機層を乾燥しく硫酸ナトリウム）、濾過し、
そして蒸発させた。出発ジアミンで汚染された表題化合
物を得た。この混合物を酢酸エチル（５０ｒＬｔ）に溶
解し、飽和硫酸ナトリウム溶液（２０ＩＬりで洗浄した
。有機層を乾燥し、濾過し、蒸発させて表題化合物（１
，０２９，７６チ）を得た。
宜Ｈｎｍｒ　（ＣＤＣ）３　）　　δ　７．８（２Ｈ，
ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）、６．５５（２Ｈ。
ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ　）、４．５（ＩＨ，巾広ｓ　）、３．
１（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ）、２．７（２Ｈ，ｔ、Ｊ−
７Ｈｚ）および１．５５（１５Ｈ，巾広ｓ）。
０ｍ　ａ　ｘ　３３７０　ｅ　３２２５　ｙ　１６９０
−１６００−１５３０−１２９０−１１６０および１１
１５０−１゜ ｐ−）ルエンスルホン酸ｔＪｌＩＪ造し、：ｘ−９ノー
ルとエーテルから再結晶した。融点１３４〜１３７℃。
実測値：　Ｃ，５９，６８；Ｈ，７，５７；Ｎ、６．５
４チ。
ＣｎＨａＮｓＳＯｇ　１／４ＨｍＯとしての計算値：　
Ｃ、５９，９０；Ｈ，７，４２；Ｎ、　６．５４％。
上記工程（ａ）からの４−Ｎ−（４−アミノブチル）ア
ミノ安息香酸ｔ−ブチル（１６９■）をピリジン（２耐
）に溶解した。　５ＰＤＰ　（２００■）を加え。
この反応混合物を室温で乾燥窒素の雰囲気下に２日間攪
拌した。ピリジンを蒸発により除き、油状物を酢酸エチ
ル（５ｍｌ）に溶解した。その有機層を１０チ炭酸水素
ナトリウム溶液（２ｄ）で洗浄した。有機層を乾燥し、
濾過し、蒸発させて固体（２１９■）を得た。表題化合
物はクロマトグラフィー（２ｇシリカ／酢酸エチル）に
より固体（１６６■、５６％）として単離し、ジクロロ
メタンおよび石油エーテルから再結晶した。融点郭〜的
℃。
ｌＨＮＭＲ（ＣＤＣＡ！ｓ）８．５（ＩＨ，ｍ）、７．
８（４Ｈ，ｍ）、７．１（ＩＨ，ｍ）、６．９（ＩＨ，
ｍ）、６．６（２Ｈ，ｄ、　Ｊ＝８Ｈｚ）、４．２（Ｉ
Ｈ，ｓ）、３．２（６Ｈ，ｍ）、２．６（２Ｈ，ｔ、Ｊ
＝６Ｈｚ）および１．５５（１３Ｈ，ｍ）。
赤外線υｍａｘ３３５０−１６８０ｓ１６６０−１６０
５−１５３０−１３００．１１６０，１１２０，９１０
，８３５．および７３０ｃ！ｎ−’。
実測値：　Ｃ，５８，９５；Ｈ，６，７４；Ｎ、　９．
０４゜ＣｕＨｓｔＮｓＯｓＳ＊　、１／２Ｈ２０として
の計算値：　Ｃ，５８，６９；Ｈ，６，８５；Ｎ、　８
．９２チ。
香酸 上記工程（ｂ）で製造したｔ−ブチルエステル（１５３
■）をトリフルオロ酢酸（２−）に溶解し、室温で冴時
間放置させた。この溶液を濾過し、蒸発させて黄色の油
状物（２９０■）を得、これは表題化合物のトリフルオ
ロ酢酸塩であった。この物質はこれ以上精製することな
く使用した。
”Ｈｎｍｒ　（ｄ’アセトン／ＣＤＣｌ５　）δ８．３
（ＩＨ，ｍ）、８．１（５ＨｓｍＬ３．３（６ＨｔｍＬ
２．８（２ＨｓｔｔＪ＝５Ｈｚ）ｔおよび１．８（４Ｈ
，巾広ｓ）。
ミノブチルコアミノ安息香酸エステル 上記工程（ｃ）からの酸−トリフルオロ酢酸塩（２１６
１ｎ９）をビリジ／（１５１１７）Ｋ溶解し、４−アミ
ジノフェノール（４５■）を加えた。ＤＣＣＩ　（５＃
　）も加え九。この溶液を室温で窒素雰囲気下に３日間
攪拌した。その後濾過して蒸発させ念。油状物をクロロ
ホルム（２００１ＪＪｔ）にとシ、石油エーテルで沈殿
させた。油状物はデカンテーションして分離し、順次ク
ロロホルム（１ｔ）、水（２１Ｌｔ）、ブライン（２ｄ
）そして最後に水（２−）ですりつぶし念。真空乾燥後
、油状物をエタノール（２ＩＬｔ）に溶解し、炉遇し、
そして蒸発させた。この油状物を少量のエタノール（２
００４ｆ　）にとり、ジエチルエーテルで沈殿させた。
デカンテーション後、この最後の方法を繰り返し、生成
物（４０■）を真空乾燥した。この物質は約４０　ｔｓ
が表題化合物であり、多量の２種類の加水分解産物（出
発酸およびフェノール）が存在していた。生成物の反復
沈殿はこの物質を８０チ以上の純度へ導いた。
”Ｈｎｍｒ　（ｄ’ＤＭＳＯ）δ９．２５（４Ｈ，巾広
ｄ　）、８．３５（ＩＨ。
ｍ）、７．８０（６Ｈ，ｍ）、７．５０（２Ｈ，ｄ、Ｊ
＝９Ｈｚ）、７．２５（ＩＨ＝ｍ）−６，８０（ＩＨ−
ｔ−Ｊ＝５Ｈｚ　）＊６．６５（２Ｈ−ｄ−Ｊ＝９Ｈｚ
Ｌ３．１（８ＨｅｍＬ１．５（４Ｈ＃ｍ）。
３−ニトロベンジルアルコール中でのＦＡＢ　’ｊｌ　
ｉ″スペクトル　ｍ／ｅ　５２４．４６０　、４４０　
、４２３　　に遊離塩基のＭ＋。
実施例１のウサギ抗体（０，９ｗ／ｖ％　塩化ナトリウ
ム中３０■／ＩＲｔ、　０．５１）をリン酸緩衝液で２
．０−に希釈し、２−イミノチオランの新しい溶液（１
００ｍＭ水溶液、（至）μｌ）で５℃で（９）分処理し
た。
生成物を上記のようにリン酸緩衝液（３，４１１！ｔ）
を流してゲル濾過した。上記のようなチオール滴定は、
約６９μＭの遊離スルフヒドリル含量および２．４モル
チオール１モルタンパク質の平均置換レベルを示した。
この生成物はすぐに使用し念。
ジイルヒト組織プラスミノーゲン活性化因子精製したｔ
−ＰＡ　（ＡＮＴ緩衝液中２．０−１１１２ナノモル）
は上記工程（ｄ）からのアシル化剤と、乾燥ジメチルス
ルホキシド中の溶液として２段階：すなわち１）　　２
５４！の１０□溶液と５℃で（９）分、２）２５４の５
０ｍＭ溶液と５℃で２．５時間、において処理した。こ
の後、初期アミド分解活性の９８．６％が失われた。生
成物は上記のように前緩衝液（３，４ｒ！Ｌｔ）を流し
てゲル濾過した。実施例２（ｂ）のような還元は３７μ
Ｍのピリジルジチオ基含量を示した。この物質を一１９
６℃で貯蔵した。
１７ｇウサギ抗〔ヒト赤血球膜糖タンパク質〕免疫グロ
ブリンＧ）〕ジチオプロピオニルコアミノブト組織プラ
スミノーゲン活性化因子の精製上記工程（ｅ）からのチ
オール化ＩｇＧの全部を工程（ｆ）からの生成物（１，
０ｄ、３７ナノモル）と混合し、この混合物の容量を遠
心濃縮（実施例１　（ｃ）と同じ。
但し１．５時間）して０．５−に減じた。この生成物を
前緩衝液で１．５−に希釈し、リン酸緩衝液（３，４／
１ｌｌｌ）を流して（上記のように）ゲル濾過し念。こ
の溶１ｔ−Ｌ−リシン−セファロース（ファーマシア社
）のカラム（０，８Ｘ　２．Ｏａｎ　）にかけ、リン酸
緩衝液（５，ＯＩＬｔ）で洗った。このカラムをＡＮＴ
緩衝液（５，０ＩＬｔ）で溶出し、溶出物を約１．０−
に（上記のように）濃縮した。この生成物を実施例１（
ｃ）の如くクロマトグラフィーにかけ、閉〜７４＋＋４
の間で溶出する分画をプールし、約１．２−に（上記の
ように）濃縮し九。最終生成物は一１９６℃で貯蔵した
。３７℃においてリン酸緩衝液中での平均−次脱アシル
化速度定数は１．６５　Ｘ　１０’／秒であつ之。
実施例５ リンＧとの活性中心結合複合体 ＮＨＯ 旦 ヒトフィブリノーゲンのフィブリンへの転化の際に生ず
る抗原九対して導かれた精製マウスモノクローナル抗体
〔コー）”　：　Ｙ２２、二ニーベンハイツエン（Ｗ、
Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ　）ら、Ｆｉｂｒｌｎｏｌ
ｙｓ１ｍ（線維素溶解に関する第８回国際会議）アブス
トラクトＮａ　１３９　；　０，９ｖ／ｖ％塩化ナトリ
ウム０．９　ａｊ中１．７１７９　）を１．０Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、０．０１チツイーン８０ｐＨ７，４
（０，Ｉ　Ｍｔ）と混合した。
この緩衝化溶液は新たに調製した２−イミノチオランの
溶液（１００ｍＭ　　溶液、２５ＡＩ）で２回（初めは
加分間、２回目は１５分間、両方の場合とも５℃で）処
理し、その後実施例１（転）のリン酸緩衝液（３，４１
７）を流して上記の如くゲル濾過した。この生成物はす
ぐに使用し九。
実施例２〜）の生成物（１，５１ｊ、４５ナノモル）を
上記試料の全部に加え、この混合物を遠心濃縮して少容
量となしく実施例２（Ｃ）と同じ条件）、に任緩衝液で
約１．５Ｒｔに希釈し、その後１．５時間にわたって約
０．５属に再濃縮した。この生成物を実施例１（ｃ）の
如くクロマトグラフィーにかけ、６４〜７６１０間で溶
出する分画をプールし、約１．５−の最終容量に再濃縮
した（　４０００　Ｘ　ｇ、４０℃、１．７５時間）こ
の物質は一１９６℃で貯蔵した。π℃においてリン酸緩
衝液中での平均−次脱アシル化速度定数は２．９　Ｘ　
１０−’　／秒であり九。
実施例６ ＮＨ０ ４−フルオロ安息香酸ｔ−ブチル（０，５ｇ）を１．６
−ジアミツヘキサン（５−）に溶解した。この混合物を
乾燥窒素雰囲気下１’Ｃ１２０℃で３日間加熱し九、水
（５ｄ）を加え１次に５Ｍ水酸化ナトリウム溶液（２！
ＩＬｔ）を加えた。水層を酢酸エチル（１０ｍ）で抽出
し、その有機層を順次２Ｍ水酸化ナトリウム溶液（１０
＃Ｉｊ）および水（１０１１１）で洗った。酢酸エチル
層を乾燥し、濾過し、蒸発させて黄色の固体として表題
化合物（５１７■、６９％）を得喪。
”Ｈｎｍｒ　（ＣＤＣｌ　ｍ　）δｅ　７．８　（２Ｈ
ｔ　ｄ　ｅ　Ｊ＝＝９Ｈｚ　ｍアリール−Ｈ）＝　６．
５５（２Ｈ−ｄ−Ｊ＝９Ｈｚｍアリール−Ｈ）、４．１
（ＩＨ。
巾広Ｓ、アリール−Ｎ−Ｈ）、３．１５（２Ｈ，巾広ｔ
、アリール−ＮＨＣＨＩ）　１２．７（２Ｈ＃ｔ＃　Ｊ
ｅ＝６ＨｚＩＣＨ！ＮＨＩ）１１．６（９Ｈ＄１＠ＣＣ
Ｈ８）＃１．５（８Ｈ＃ｎｌ＃４ＸＣ旦鵞）。
ｕｍａｚ３３７０，１６９０．１６１０，１５３０．１
４８０，１３７０゜１２９５．１１６０１１１２０＠９
１０．および７３５ｃｒｎ−”　。
工程ωからのアミン（１８７１ｎ９）をピリジン（２ｄ
）Ｋ溶解し、５ＰＤＰ　（２００１ｎ９’）を加えた。
この反応混合物を乾燥窒素の雰囲気下ＶＣ３日間攪拌し
た。この溶液を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（２ｒ！
Ｌｔ）に溶解した。これを１０ｔ４炭酸水素ナトリウム
水溶液（２ｆｆ！ｊ）で洗った・有機層を乾燥し１濾過
し、蒸発させて固体（２１２η）を得た・これをクロマ
トグラフィー（２ｇシリカ／酢酸エチル）Ｋかけて表題
化合物（１３１■、４２％）を得た。
融点１０４−１０５℃ ’Ｈｎｍｒ　（ＣＤ（Ｊｓ　）δｅ　８．５（ＩＨｓｍ
＊アリール−Ｈ）ｔ’７．９（４１Ｅ（＊ｍｔアリール
ーＨ）＊７．ｚ（ＩＨｓｍ＊ビリジ＃−Ｈ）。
６．６（３Ｈ，ｄ、アリール−Ｈ＋Ｎ−ＨＣｏ）、４．
０　（ＩＨ，巾広ｃＨ３＋４ｘＣＨｎ）。
ｕｍａｘ３３５０＊１６８０，１６５０ｔ１６０５，１
５３０，１４１５゜１２９５．１１６０．１１１５，８
３０．および７６０国→。
実測値：　Ｃ，６１，６７；Ｈ，７，２８；Ｎ、８．５
４゜ＣＨＨｕＮｓＳ諺Ｏｓとしての 計算値：　Ｃ，６１，３２；Ｈ，７，２０；Ｎ、８．５
３チ。
息香酸 工程（ｂ）からのｔ−ブチルエステル（１１３１ｎ９）
をトリフルオロ酢酸（２−）に溶解し念。この溶液を一
晩放置させ、その後炉遇し、蒸発させて橙色の油状物（
１５９η）を得た。これは表題化合物のジトリフルオロ
酢酸塩であった。
’Ｈｎｍｒｄ’アセトン／ＣＤＣｌ５δ８．７（１）Ｌ
ｍｔアリール一工程（ｅ）からの酸−トリフルオロ酢酸
塩（１５９１ｎ９）および４−アミジノフェノール（４
２■）を乾燥ピリジン（１ｄ）に溶解し、ＤＣＣＩ　（
１００叩）を加えた。この溶液を乾燥窒素の雰囲気下に
室温で７日間攪拌し、この時点でＤＣＣＩ　　のアリコ
ート２以上（それぞれ１００■）を加えた。その後溶液
を戸過して蒸発させた。橙色の残留ガムはクロロホルＡ
（２Ｘ２ｒｎｌ）、水（２ｄ）、プライ／（２ｍ）そし
て最後に水（２１Ｌｔ）で順次す〕つぶした。残留ガム
を蒸発によシ乾燥し、エタノール（１ｄ）を加えた。こ
の溶液を濾過し、ジエチルエーテルを注入した。表題化
合物が泡状物（３０■）として析出した。これは”Ｈｎ
ｍｒで測定して７５　％の純度であった。唯一の有意な
汚染物質は出発酸であった。
ｌＨｎｍｒ　（ｄ’ＤＭｓｏ　）δ９．２２（４Ｈ，ｓ
、アミジ／Ｎ−Ｈ）＃８．４５（ＩＨ１ｍ＊ピリジル−
Ｈ）ｐ　７．８　（６Ｈ＊ｍ＊　２ｘアリール−Ｈ）＋
２ｘピリジル−Ｈ）、７．５０（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ
、フエ１．３　（８Ｈｅ　ｍ　＋　４　ｘ　ＣＨｈ　）
　一実施例１のウサギ抗体（０，９ｗ／ｖ　９６塩化ナ
トリウム中３０ｒＩ！９７ａｔ、０，２１ＬＩ　）をリ
ン酸緩衝液で２．２ＩＬＩＫ希釈し、新たに調製した２
−イミノチオラン溶液（リン酸緩衝液中１００　ｍＭ、
２０４）で５℃にて（９）分処理し念、この生成物を上
記のようにリン酸緩衝液を流してゲル濾過し九、チオー
ル滴定（上記の通シ）はお、５崗の遊離スルフヒドリル
含量およヒ２．９モルチオール１モルタンパク質の平均
置換を示した。この生成物は直ちに使用し念。
精製ｔ−ＰＡ（ＡＮＴ緩衝液中１．０１、ヌナノモル）
は上記工程（ωからのアシル化剤（乾燥ジメチルスルホ
キシド中１０　ｍＭ　、　５０　ｐｌ　）と５℃にて１
時間処理した。この後、初期アミド分解活性の９６％が
失われ念、生成物はＡＮＴ緩衝液（３，４ｄ　＞を流し
てゲルー過し、−１９６℃で貯蔵した。
グ日プリンＧ）〕ジチオプロピオニル）アミノへ上記工
程（ｅ）からのチオール化ＩｇＧの全部を工程（ｆ）か
らのアシル−酵素の全部と混合し、−４０℃に１６時間
保持し、その後（実施例４ωに記載の如く）１．５Ｈの
容量に濃縮した。この生成物を上記のようにリン酸緩衝
液（３，４ｄ）を流してゲル濾過し、実施例４（ロ）で
詳述したようなリシン−セファロースのカラムにかけた
。このカラムをリン酸緩衝液（１０１１１４）で洗い。
生成物を分野緩衝液（１０ｄ）で溶出した。溶出液を飽
和硫酸アンモニウム溶液（１０ｒ１１ｔ）テ処理シ、生
成物をｉｏｏｏｏｘｇ、４℃で加分沈殿させた。この沈
殿物をにＪ緩衝液（０，５１Ｌｔ）に溶解し、ＴＳＫＧ
３０００渦ＩＩＰＩ、Ｃゲル透過マトリックスの６００
　Ｘ　７，５　ｗカラム（ガードカラムを有する）にか
け、平衡化し、その後に江緩衝液で２０〜２３℃、０．
５ｒＩｌｔ／分にて溶出した。０．３ＩＬｔＯ分画を集
め、１３．９１１１１と１８．９　ｄで溶出するタンパ
ク質ピークを検出した。１３．３〜１４．８　／１１ｔ
の間で溶出する分画をプールし、−１９６℃で貯蔵した
。この生成物はリン酸緩衝液中３７℃で９．９９　Ｘ　
１０−７秒の平均速度定数でもって脱アシル化された。
実施例７ 双　　　　　　　　　　０ ４−フルオロ安息香酸ｔ−ブチル（０，５９）ｅｌ、３
−ジアミノプロパン（２，５ｊ！ｔ）に溶解し、この反
応混合物を乾燥窒素の雰囲気下に１２０℃で１６時間加
熱し、その後ｔｉｅで出発物質は全く検出されなかった
。この溶液を減圧下で蒸発させ、水（１０−）を加え、
その後十分な濃塩酸を加えてこの物質を可溶化し念、水
層をジクロロメタン（１０−）で抽出し、これは捨てた
。水層を水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にし、続いて
酢酸エチル（２ＸＩＭ）で抽出した。有機層を乾燥し、
濾過し、蒸発させて表題化合物（４８８■、７７チ）を
得た。
ｌＨｎｍｒ、（ＣＤＣｌ５）δ、　７．８２　（２）（
、ｄ　、　Ｊ＝９Ｈｚ　、アリール−Ｈ）＊６．５５（
２Ｈ＊ｄｓＪ＝９Ｈｚ＊アリール−！（）。
４．７（ＩＨ，巾広３．アリール−Ｎ−Ｈ）、３．３０
（２Ｈ，ｔ。
Ｊ−７Ｈｚ　、ＮＨＣＨｓ−）　、　２．８５　（２Ｈ
，ｔ　、　Ｊ＝７Ｈｚ　。
口＊ＮＥ（ｓ　）　ｅ　１．８　（２Ｈｓ　ｍ　ｍ　ｃ
ＨｓｃＨｔ　ＣＴ（ｓ　）　＊　１．６　（９Ｈｅｓ　
＊　ＣＣＨｓ　）　ａおよび１．３（２Ｈ，巾広ｓ、Ｎ
ＨＩ）。
υｍａｘ（ヌジョール）、３３７０．１６８５，１６１
０，１５３５゜１２９０．１１６０，９２０，８４０．
および７７０ｔｙｓ−’。
ｍ／ｅ実測値：　２５０．１６９５＊Ｃ１ａＨｎＮｓＯ
ｓとしての計算値：　２５０，１６８１； チオ〕プロピオニル）アミノプロピルコアミノ安工程伝
）からのアミン（１００■）および５ＰＤＰ（１２５２
１１５；’）をピリジン（１Ｍ）に溶解した。この反応
混合物を乾燥窒素の雰囲気下に室温で７２時間攪拌した
。ピリジンを蒸発により除き、酢酸エチル（５Ｒ１）を
加えた。この有機層を１０％炭酸水素ナトリウム溶液（
２−）で洗った。その後これを乾燥し、濾過し、蒸発さ
せてほとんど純粋なガム（１４２■）を得た。カラムク
ロマトグラフィー（２，Ｆシリカ、酢酸エチル）で最終
的に精製して表題化合物（９５■、５３％）を得た。
”Ｈｎｍｒ　（ＣＤＣＩｓ）δｔ８．４ｓ（ＩＨｔｍｔ
６−ピリジル一旦）７．７（４Ｈｚｍ＊アリールーＨ）
ｅ７．１（２Ｈｔｎｎｓアリール一旦＋Ｎ！！ｃＯ）、
６．５ａ（２Ｈ，ｄ　、Ｊ＝９Ｈｚ　、アリール一旦）
４．５（ＩＨ，巾広Ｓ、アリール−ＮＨ）＃　３．３　
（６Ｈ，ｍ５（９ＨｅｓｓαＭｓ　）　。
ｔＪｍａｘ（ヌジョール）３３５０，１６８０，１６６
０，１６１０゜１５３０．１４７０，１３３０，１１６
０．１１２０，９１０，８３５および７３０ｃｙｔｔ−
’。
（ｃ）　　４−　Ｎ　−（３−Ｎ　−（３−（２−ピリ
ジルジチオ〕プロピオニル）アミノプロピルコアミノ安
息香酸 工程缶）からのｔ−ブチルエステル（８５１Ｒ９）ヲ）
リフルオロ酢酸に溶解し、室温で一晩放置させ九揮発性
物質を蒸発により除き、油状物（１１７１ｎ９）を得た
。これは表題化合物のジトリフルオロ酢酸塩であること
が分かり、これ以上精製することなく使用した。
’Ｈｎｍｒ　（ｄ’アセトン／ＣＤＣｌ　ｓ　）δ、８
．８（ＩＨ，ｄ、ビリジに−Ｈ）ｅ　８．０　（９Ｈｚ
ｍｔ　２ｘアリール−Ｈ＋ビリジルーＨ）。
６．９　（２Ｈ，ｄ　、Ｊ＝８Ｈｚ　、アリール　Ｈ）
＃３．３（６Ｈ＠ｔｎ＃２ＸＮＣＨり　、　２．８　（
２１Ｈ，ｔ　、　Ｊ＝６Ｈｚ　、　０ＩｘＳ　）および
１．９　（２Ｈ＃　ｍ　ｓ　ＣＨｘＣＨｍＣＨｍ　）　
。
工程（ｅ）からの酸−ジトリフルオロ酢酸塩（１１７即
）をピリジン（１ｍＪ　）Ｋ：溶解し、４−アミジノフ
ェノール（３，４即）続いてＩ）ＣＣＩ　（４１ｒｖ）
を加えた。この溶液を乾燥窒素の雰囲気下に１８時間攪
拌した。ピリジンを蒸発によシ除き、残留物は頴次クロ
ロホルム（１ｍ）、水（ｌａ（）、ブライン（ＩＩｔｌ
）および最後に水（１ｄ）ですりつぶしたこの溶液を真
空乾燥し、褐色残留物にエタノール（０，５１１！ｊ　
）を加光た。この溶液を濾過し、ジエチルエーテル（５
ｄ）を加えた。溶液は濁り始め。
褐色の油が沈殿した。デカンテーション後、その油を真
空乾燥し、泡状物（２０＋Ｗ）として表題化合物を得た
。これは’ＨｎｍｒＫより約８０％の純度でおった。
’Ｈｎｍｒ　（Ｄ・ＤＭＳＯ）δｅ９．２９（４Ｈｓｓ
ｅアミジン−ＮＨ）８．４５（ＩＨ，ｄ　、Ｊ＝４Ｈｚ
アリール−Ｈ）、８．０６（ＩＨ。
ｍ＊ｃＯＮＨ）＊７．８０（６Ｈｚｍｅ２ｘアリールー
Ｈ＋２ｘアミジノフェニル−Ｈ＋２にピリジルーＨ）、
７．４８（２Ｈ，ｄ。
Ｊ　＝　８　ＨＺ　＃アミジノフェノールからのアリ−
ルー：Ｅ）、７．２５（ＩＨｅｍｓアリール−Ｈピリジ
ン）、６．６６（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝−ルーＮＨ）ｔ　３．
３　（４Ｈ＊ｍｓ　２ｘＮＨＣＨｓ）ｅ　３．１５　（
２ＨｓＣＨｓＳＳ　）−および１．２５　（２Ｈｔ　ｍ
　ｅ　ＣＦｘ　Ｃ）（ｔ　ＣＨ雪）　−精製した２本鎖
ｔ−ＰＡ　（ＡＮＴ緩衝液中２．Ｑａｆ。
１０８ナノモル）は上記（ｄ）からのアシル化剤（乾燥
ジメチルスルホキシド中の２０　ｍＭ溶液、５０ｍ）と
５℃にて加分処理した。この生成物を氷上に加分保持し
、に江緩衝液（３，４１４）を流してゲル濾過した。生
成物は飽和硫酸アンモニウム溶液（７，６１）の添加に
よシ沈殿させ、１１０００Ｘ／４℃で（資）分遠心し、
そして沈殿物をＸ緩衝液（０，９１１ｊ）に溶解した。
この生成物は還元によ〕測定（実施例２（ｂ）〕したと
き約ｎナノモルのピリジルジチオ基を含んでお、り、　
−１９６℃で貯蔵した。
り質〕免疫グロブリンＧ）］ジチオプロピオニル）因子
の精製 実施例１のウサギ抗体（０，９％塙化ナトリウム中の１
３．３　■／耐浴溶液１．９＊／）をリン酸緩衝液で２
．５−に希釈し、ｐＨ７，４に調整し、セして２−イミ
ノチオラン（１００ｎＭ水溶液、２０Ｉ４）で５℃にて
加分処理した。その後、上記のようにリン酸緩衝液を流
してゲル濾過し、それは６３μＭの遊離スルフヒドリル
＆”　（２，５モルチオール１モルタンパク質）を含む
ことが分つ九。この生成物全部を上記工程（ｅ）からの
アシル−ｔ−ＰＡ　（０，９ａｕ　）と混合し、実施例
４＠の如く遠心濃縮してその容量を１，５　＃Ｌ／に減
じた。生成物を上記のようにリン酸緩衝液（３，４１７
）を流してゲル濾過し、リシン−セファロース（ファー
マシア社）のカラム（０，８Ｘ　３．Ｏｃ！Ｒ）にかけ
、リン酸緩衝液（１３，６１／　）で洗った。
生成物はアルギニン緩衝液（９，Ｏａｕ　）で溶出し、
飽和（ＮＨ４）ｍｓＯ４溶液（９，Ｏｒｎｌ、　１００
００　ｘ　ｌ！／３０分／２℃）で沈殿させた。この沈
殿物を趙緩衝液（０，４ｍ　）に溶解し、ＴＳＫ　Ｇ　
３０００蜜心叩！ゲルのカラム（７゜５　ｔｍ　Ｘ　６
０　ｃｍ　）にかけ、ＡＮＴ緩衝液を用いて０．５１Ｌ
ｌ１分、加〜２３’Ｃで溶出し念。１３．０〜１４．８
１ｎｌの間で溶出するタンパク質ピークを集め、−１９
６℃に保持した。この生成物はリン酸緩衝液中３７”Ｃ
で１，７９　Ｘ　ｌｏ−’／秒の平均−次脱アシル化速
度定数でもって脱アシル化された。
実施例８ ４−フルオロ安息香酸ｔ−ブチル（０，５９）　ヲ１．
５−ジアミノペンタン（５＊／）に溶解し、この反応混
合物を乾燥窒素の雰囲気下で１００℃に加熱した。この
反応混合物を絽時間保ち、その後ｔｉｅにより出発物質
は全く検出されなかった。水（５ｍｌ　）を加え、水層
を５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性とし、その後酢
酸エチル（１０ｊｌｌｊ）で抽出した。その有機層を乾
燥し、濾過し、蒸発させて出発ジアミンで汚染された表
題化合物を得た。この物質を酢酸エチル（１０ｊｌｔ）
ＩＣ＆シ、順次５Ｍ水酸化ナトリウム（１０１１１４）
および水（１０ＩＬｔ）で洗った。有機層を乾燥し、炉
遇し、蒸発させて生成物を得た（　０．５１　＃　、　
７２チ）。
ｌＨｎｍｒ　（ＣＤＣｊ　ｍ　）δ７．８　（２Ｈ、ｄ
　、　Ｊ＝９Ｈｚ　）　、　６．４（２Ｈ，ｄ、Ｊ＝９
１Ｈｚ　）、４．１　（ＩＨ，巾広ｓ）、３．１（２Ｈ
。
ｍ）ｔ２．７（２Ｈｓｔ＊Ｊ＝ｘ５Ｈｚ）ｔｌ、５（１
７Ｈｅｍ）。
アミン（１７８■）および５ＰＤＰ　（２００■）をピ
リジン（２−）に溶解した。この反応混合物を乾燥窒素
の雰囲気下で絽時間攪拌した。ピリジンを蒸発によシ除
き、酢酸エチル（５祷）を加えた。
有機層は１０チ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｌ成）で洗
った。この有機溶液を乾燥し、濾過し、蒸発させてほと
んど純粋なガムを得た。しかしながら、カラムクロマト
グラフィー（シリカ、酢酸エチル）で最終的に精製して
表題化合物（１４０１１’９，４６％）を得た。
’Ｈｎ０ｍ、ｒ、　（ＣＤＣＡ’ｓ　）δ８．４　（Ｉ
Ｈ−ｒｎ　）　ｅ　７．７　（４Ｈ−ｍ）７．１　（Ｉ
Ｈｐｍ）　−６−８（ＩＨｅ　ｔ　−Ｊ＝５Ｈｚ　）　
−６−４５（２Ｈ＊ｄｔＪ＝８Ｈｚ）Ｔ４．３５（ＩＨ
ｅｔｔＪ−６Ｈｚ）Ｔ３．１（６Ｈ，ｍ）、２．６（２
Ｈ，ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ）、１．５５（１５Ｈ、ｓ　）　。
息香酸 上で製造したｔ−ブチルエステル〔１３ｏ■）をトリフ
ルオロ酢酸（’ｌ！ＩＬｔ）に溶解し、室温に槌時間放
置した。この溶液を濾過し、蒸発させて油状物（１９２
■）を得た。これはトリフルオロ酢酸塩の形の酸であっ
た。この物質はさらに精製することなく以後の反応に使
用した。
ｌＨｎ、ｍ、ｒ、ｄ’アセトン／ＣＤＣｌ５δ８．７　
（ＩＨ，ｍ）　−７，９（７Ｈ，ｍ）、６．９（２Ｈ，
ｄ＊Ｊ−８Ｈｚ）、３．２（６Ｈ，ｍ）２．７　（２Ｈ
＃　ｔ　−Ｊ−５Ｕｚ　）　−１，５（６）（−巾広ｓ
）。
（ω　表題エステル 上で製造した酸（固体１９２ｒｎ９、実際の酸１１５■
）をピリジン（１−）に溶解し、４−アミジノフェノー
ル（４７■）続いてＤＣＣＩ　（１１３■）を加えた。
この溶液を乾燥窒素の雰囲気下で７日間攪拌した。
この溶液を一過して析出したジシクロヘキシル尿素を除
き、ピリジンを蒸発によシ除去した。残留物は順次り四
ロホルム（３Ｘ１１１１ｊ）、水（１ｄ〕、プライン（
ｌＩｌｌｌ）および最後に水（１ｄ）をすりつぶした、
この溶液を真空乾燥し、褐色残留物にエタノール（３１
１！ｔ）を加えた。この溶液を濾過して濃縮し念、ジエ
チルエーテル（５麻）を加え、褐色固体を沈殿させた。
デカンテーション後固体を乾燥させた。これはプロトン
ｎｍｒによシ約８０チの純度の表題化合物（３１■、１
９チ）であることが分かった。
”Ｈｎｏｍ、ｒ（ｄ’ＤＭｓＯ）δ９．３５（４Ｈ，巾
広ｓ）、８．４５（ＩＨｅｍ）Ｔ７．８（７Ｈ＃ｍ）Ｔ
７．５（２ＨｓｄｔＪ＝９Ｈｚ）Ｔ７．２５（ＩＨ，ｍ
）＃６．８０（ＩＨ−ｔ−Ｊ＝５Ｈｚ）−６，６５（２
Ｈ，ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ　）、３．１（６Ｈ，ｍ）、１．５
５および１．４０（６Ｈ，Ｔ１１）。
２個のプロトンは見られない。これらは恐らく２．５−
のＤＭＳＯビークによシ遮蔽されたと考えられる。
合の証明 （ａ）　　方法 新たに採取したクエン酸塩添加ヒト全血（０，６Ｊ！１
１）を０．０５　Ｍリン酸ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム、１０■／ａｔヒト血清アルブミン…７．４（
ＰＢＳＡ緩衝液、０．２１Ｌｔ〕中に溶解した実施例１
の凍結乾燥調製物のアリコートと混合し、４℃で１０分
分間中かにかきまぜた。この方法では、対照として、実
施例１と同じ方法であるがヒト非特異的ＩｇＧを使用し
て製造した複合体の凍結乾燥調製物（ＮＳＩ対照）、リ
ン酸緩衝液中３７℃で２００分間加水分解した実施例１
の化合物の試料（加水分解対照）、生理食塩水または非
修飾ウロキナーゼを使用した。試料はＰＢＳＡ緩衝液（
３，ＯＩＩＬｔ）で希釈し、短時間振とうし、セして２
０００　ＸＦ、　４℃で２分間遠心した。上清を除き、
沈殿した赤血球は前のように遠心してＰＢＳＡ緩衝液（
３，５ＩＬｌ）で５回洗った。最後の細胞調製物をＰＢ
ＳＡ緩衝液（０，７５１Ｊ、全容量的１．Ｏｄ　）中に
懸濁し、３７℃の水浴中で穏やかに振とうした。１８０
分までのいろいろな間隔でアリコー）　（１００μｌｔ
−取シ出し、氷上に保持したマイクロチューブ中のＰＢ
ＳＡ　（１００４）に加えた。この試料を上記のように
遠心し、上清の除去を容易にするためにマイクロチュー
ブから上部を切シ取った。上清は検定まで一４０℃で保
存した。ウロをナーゼ検定は基質Ｓ−２４４４を用いて
実施するか、あるいは検量されたヒトフィブリン平板（
１方法１のセクションを参照）上での線維素溶解検定に
よシ実施した。
（ｂ）　　結果 第１図は、ウロキナーゼ様アミド分解活性の放出が実施
例１の化合物に露出された赤血球から検出されるが、予
め加水分解した化合物または非（Ｆ飾つロキナーゼに露
出された細胞からは検出されないことを示している。
第２図は放出された活性が繊維素溶解活性であり、また
非特異的ＩｇＧを含む複合体または未処理赤血球それ自
体がこのよう表活性を放出できないことを示している。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例１の化合物（・）、予め加水分解した化
合物（ロ）および非修飾ウロキナーゼ（ム）に露出され
た洗浄ヒト赤血球を含む緩衝媒体へのウロキナーゼアミ
ド分解活性の放出を示す。 第２図は実施例１の化合物（・）またはＮＳＩ／生理食
塩水対照（両方とも口）に露出された洗浄ヒト赤血球を
含む緩衝媒体へのウロ中ナーゼ線維素溶解活性の放出を
示す。 両方の図面：平均士標準誤差（ｎ＝４）Ｘ軸−３７℃で
の分 Ｙ軸−媒体に放出されたウロキナ ーゼ（ｎＭ　） 代理人　弁理士　　秋　沢　政　光 信１名 ７−１１Ｂ 自発手続補正齋 昭和Ｇ３年５月６　日

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）線維素溶解酵素の誘導体であり、線維素溶解活性
    に関与する酵素の触媒部位が可逆的な結合基によってそ
    れに結合され且つ血栓物質の成分と関連した抗原に対し
    て導かれた特異的免疫グロブリンまたはその断片により
    遮断されていることを特徴とする線維素溶解酵素の誘導
    体。
  2. （２）酵素の触媒部位は構造式（ I ）の基によって遮
    断される （Ｉｍ）−Ｂ−Ａ−Ｘ（ I ） 〔式中、（Ｉｍ）は上記定義通りの特異的免疫グロブリ
    ンであり、場合によりタンパク質結合基を含むようにア
    ミノ酸側鎖特異的試薬で処理することにより修飾されて
    いてもよい； Ｘは式：▲数式、化学式、表等があります▼のアシル基
    であり、 （ここでＲは芳香族または脂肪族残基である）Ａは酸素
    、硫黄および窒素から選ばれる少なくとも１個のヘテロ
    原子を含む架橋基であり、その際窒素は場合によりＣ＿
    １＿−＿６アルキル基で置換されていてもよい；そして Ｂは（Ｉｍ）のタンパク質結合基へ連結される親水性の
    線状連結基である〕 請求項１記載の誘導体。
  3. （３）−Ｂ−Ａ−Ｘ−は次の構造を有しる ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｎは２〜８の整数である）請求項２記載の誘導体
    。
  4. （４）結合基は ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−〔４−Ｎ−（３−〔２
    −ピリジルジチオ〕プロピオニル）アミノブチル〕アミ
    ノ安息香酸エステル； ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−〔６−Ｎ−（３−〔２
    −ピリジルジチオ〕プロピオニル）アミノヘキシル〕ア
    ミノ安息香酸エステル； ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−（３−Ｎ−〔３−（２
    −ピリジルジチオ）プロピオニル〕アミノプロピル）ア
    ミノ安息香酸エステル； ４−アミジノフェニル４′−Ｎ−〔５−Ｎ−（３−〔２
    −ピリジルジチオ〕プロピオニル）アミノペンチル〕ア
    ミノ安息香酸エステル； ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−〔８−Ｎ−（３−〔２
    −ピリジルジチオ〕プロピオニル）アミノ−３，６−ジ
    オキサオクチル〕アミノ安息香酸エステル；または ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−〔２−Ｎ−〔２−ピリ
    ジルジチオ〕プロピオニル）アミノエチル〕アミノ安息
    香酸エステル から誘導される、請求項１〜３のいずれか１つに記載の
    誘導体。
  5. （５）線維素溶解酵素はプラスミノーゲン活性化因子で
    ある、請求項１〜４のいずれか１つに記載の誘導体。
  6. （６）線維素溶解酵素は組織プラスミノーゲン活性化因
    子または高分子量ウロキナーゼである請求項５記載の誘
    導体。
  7. （７）特異的免疫グロブリンはウサギ抗−〔ヒト赤血球
    膜糖タンパク質〕免疫グロブリンＧまたはマウスモノク
    ローナル抗〔ヒトフィブリン〕免疫グロブリンＧである
    請求項１〜６のいずれか１つに記載の誘導体。
  8. （８）４−Ｎ−〔２−Ｎ′−（３−〔４′−ブチルイミ
    ノ−（Ｎ′−■−ｌｙｓウサギ抗−〔ヒト赤血球膜糖タ
    ンパク質〕免疫グロブリンＧ）〕ジチオプロピオニル）
    アミノエチル〕アミノベンゾイル−Ｏ−（ｓｅｒ−３５
    ６）ヒト高分子量ウロキナーゼ；４−Ｎ−〔２−Ｎ′−
    （３−〔４′−ブチルイミノ−（Ｎ′−■−ｌｙｓウサ
    ギ抗−〔ヒト赤血球膜糖タンパク質〕免疫グロブリンＧ
    ）〕ジチオプロピオニル）アミノエチル〕アミノベンゾ
    イル−Ｏ−（ｓｅｒ−４７８）ヒト組織プラスミノーゲ
    ン活性化因子； ４−Ｎ−〔８−Ｎ′−（３−〔４′−ブチルイミノ−（
    Ｎ′−■−ｌｙｓウサギ抗−〔ヒト赤血球膜糖タンパク
    質〕免疫グロブリンＧ）〕ジチオプロピオニル）アミノ
    −３，６−ジオキサオクチル〕アミノベンゾイル−Ｏ−
    （ｓｅｒ−４７８）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因
    子； ４−Ｎ−〔２−Ｎ′−（３−〔４′−ブチルイミノ−（
    Ｎ′−■−ｌｙｓウサギ抗−〔ヒト赤血球膜糖タンパク
    質〕免疫グロブリンＧ）〕ジチオプロピオニル）アミノ
    ブチル〕アミノベンゾイル−Ｏ−（ｓｅｒ−４７８）ヒ
    ト組織プラスミノーゲン活性化因子； ４−Ｎ−〔２−Ｎ′−（３−〔４′−ブチルイミノ−（
    Ｎ′−■−ｌｙｓウサギ抗〔ヒト赤血球膜糖タンパク質
    〕免疫グロブリンＧ）〕ジチオプロピオニル）アミノブ
    チル〕アミノベンゾイル−Ｏ−（ｓｅｒ−４７８）ヒト
    組織プラスミノーゲン活性化因子； ４−Ｎ−〔２−Ｎ′−（３−〔４′−ブチルイミノ−（
    Ｎ′−■−ｌｙｓウサギ抗−〔ヒト赤血球膜糖タンパク
    質〕免疫グロブリンＧ）〕ジチオプロピオニル）アミノ
    ヘキシル〕アミノベンゾイル−Ｏ−（ｓｅｒ−４７８）
    ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子；または ４−Ｎ−〔２−Ｎ′−（３−〔４′−ブチルイミノ−（
    Ｎ′−■−ｌｙｓウサギ抗−〔ヒト赤血球膜糖タンパク
    質〕免疫グロブリンＧ）〕ジチオプロピオニル）アミノ
    プロピル〕アミノベンゾイル−Ｏ−（ｓｅｒ−４７８）
    ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。
  9. （９）タンパク質結合基を含むように場合により修飾さ
    れていてもよい特異的免疫グロブリン、線維素溶解酵素
    、および可逆的結合基を形成するための酵素の触媒部位
    と反応しうる部分とタンパク質アミノ基またはタンパク
    質結合基と反応しうる部分をもつ結合剤を一緒に反応さ
    せることから成る、請求項１記載の誘導体の製法。
  10. （１０）請求項１記載の誘導体を製薬的に許容される担
    体と組み合わせて成る医薬組成物。
  11. （１１）治療用活性物質として使用するための請求項１
    記載の誘導体。
  12. （１２）血栓症を治療および／または予防するための請
    求項１記載の誘導体。
  13. （１３）血栓症の治療および／または予防用医薬を製造
    するための請求項１記載の誘導体の使用。
  14. （１４）式（III）の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中ｎは３〜８の整数であり、Ｚは対イオンであり、
    Ｒ＾１〜Ｒ＾４はそれぞれ水素またはアミジノフェニル
    エステルの反応性を高める電子吸引基を表す）（１５）
    ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−〔４−Ｎ−（３−〔２
    −ピリジルジチオ〕プロピオニル）アミノブチル〕アミ
    ノ安息香酸エステル； ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−〔６−Ｎ−（３−〔２
    −ピリジルジチオ〕プロピオニル）アミノヘキシル〕ア
    ミノ安息香酸エステル； ４′−アミジノフェニル４−Ｎ−（３−Ｎ−〔３−（２
    −ピリジルジチオ）プロピオニル〕アミノプロピル）ア
    ミノ安息香酸エステル；または４′−アミジノフェニル
    ４−Ｎ−〔５−Ｎ−（３−〔２−ピリジルジチオ〕プロ
    ピオニル）アミノペンチル〕アミノ安息香酸エステル、
    もしくはその塩。
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