JPS6360938A - 修飾組織型プラスミノ−ゲン活性化因子およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組織型プラスミノーゲン活性化因子分子内の
アミノ酸残基のアミン基に結合し得るように活−性化し
たポリエチレングリコールを活性基を介して結合するこ
とにより組織型プラスミノーゲン活性化因子の生理活性
の少なくとも本質的な部分を保持しつつ、血中半減期が
遅延されかつ抗原性を消失せしめた修飾組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子およびその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

近年医学分野において酵素蛋白質を非経口的に投与して
治療するいわゆる酵素療法に関する研究が盛んである。

酵素療法の欠点は酵素療法に用いられる酵素蛋白質が、
その由来がヒト以外の場合には、直接ヒトに投与した場
合生体内の免疫系を刺激して抗体を産生させ場合によっ
ては重篤な症状をひきおこすことと、ヒト由来を含めた
酵素蛋白質が酵素療法の目的で生体に投与されると生体
内における生理活性が非常に早く消失してしまうことで
ある。

このためこれらを医薬品として用いるに際しては、その
活性を保持したまま、生体内生理活性保持時間を延長さ
せ、さらにその抗原性を脆弱させる必要があり、その目
的で酵素蛋白質のアミノ酸残基と有機化合物を結合させ
たいわゆる化学修飾酵素蛋白質の研究が数多く行なわれ
ている（稲田ら生化学、第５２巻、第１２号、ｐ１２２
５−１２６７（１９８０））。

血栓溶解作用を有するいわゆるプラスミノーゲン活性化
因子は、その免疫学的特徴に基すいてウロキナーゼ型プ
ラスミノーゲン活性化因子および組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子に区別されている。これらのプラスミノー
ゲン活性化因子はいずれも不活性前駆体プラスミノーゲ
ンをプラスミンに変換する作用をもつエンドプロテアー
ゼであυ、その効能は心筋梗塞、肺塞栓症、胸部静脈血
栓症、末梢動脈閉塞症およびその他の血栓症におよぶ。

既に市販されている血栓溶解作用を有する２椙の蛋白製
剤ウロキナーゼとストレプトキナーゼについても一般に
行なわれている蛋白の化学修飾を応用することによシ免
疫原住の消失化、血中半減期の遅延化および生理活性の
保持が研究されている。

ヒト由来ウロキナーゼの場合、リジン残基およびＮ末端
アミノ基に平均分子［５０００のポリエチレングリコー
ル誘導体を活性カップリング剤を用いることにより化学
修飾し、これを正常家兎に静注した場合ウロキナーゼの
血中半減期が延長されたと報告されている（特開昭５８
−９６０２６号）。またストレプトキナーゼの場合も分
子中のアミノ基の５〜１０％の水素原子に対しトリアジ
ン環を介して分子量７５０〜１００００のポリエチレン
グリコール残基を結合させることにより、抗血栓作用を
示す酵素活性を保持しつつ抗原性を著シく消失させたス
トレプトキナーゼが得られたと報告されティる（％開Ｆ
Ｋ３５７−１１８７８９号）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼは、組織型プラ
スミノーゲン活性化因子（以下ｔ−ＰＡと称す）とくら
べて繊維素（フィブリン）に対する親和性が低いため、
溶解したい繊維素と結合しているプラスミノーゲンを優
先的に活性化することがない。即ち無制限にプラスミノ
ーゲンを活性化するため生成するプラスミンの多くは血
栓に到達する前に中和されてしまう。このため血栓溶解
剤として使用した場合所望の結果を得るためには、大量
に投与する必要があり内出血等の副作用の可能性を生じ
る。またストレプトキナーゼは強度に免疫原性であり、
高抗体価の患者には投与できない。

一方ｔ−ＰＡは、繊維素（フィブリン）に対する親和性
が高いため、ｆＸ！１．維素と結合しているプラスミノ
ーゲンを優先的に活性化する。このよりなｔ−ＰＡのす
ぐれた特性は血栓症の治療に効果的でちるが、生体に投
与された場合ｔ−ＰＡは、複雑な構造を持つ（Ｃｏ１１
ｅｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ　５２　２４−２６
　（１９８４）　）が故に諸々の生体内インヒビターの
阻害を受けやすいこと、又ｔ−ＰＡ自体代謝が極めて速
いことなどから血中半減期が２〜３分と極めて短い（Ｃ
。

Ｋｏｒｐｉｎ　ｇｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓ　４　（Ｅｌ　６５８−６６１（１９８１））。本
研究者の研究によると血中半減期は、諸々の実験条件に
よって違いニューシーラント白兎にネンプタール注射液
を耳静脈より注射し全身麻酔をかける方法では血中半減
期が１重鎖ｔ−ＰＡでは約６６秒、２本鎖ｔ−ＰＡでは
約３９秒と更に短い。

しかしながらｔ−ＰＡの生体内投与上の前述の欠点を解
消すべく、その安定化のための化学修飾に関する報告は
現在までのところない。

以上の理由からｔ−ＰＡの生体内における血中半減期の
遅延化、免疫原性の消失化のためにｔ−ＰＡを修飾する
ことの実用的′を義は極めて太きい。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明者らは鋭意研究の結果、ｔ−ｐ人のｚｙペプチド
鎖上に突出したりシン残基のアミノ基に平均分子量５０
００の？リエチジングリコールを結合させた修飾ｔ−Ｐ
Ａを白兎にューゾーランド産）に静注した場合その血中
半減期が約８倍に延長され、且つ少なくとも１０％以上
の残存活性を保持したまま１時間以上失活しないことを
見いだした。

すなわち１本発明は１式（Ｉ） Ｒ＋　　（０ＣＨｔＣＨｔ）　ｔｔ−ＯＨ（１）（式中
Ｒ４は炭素数１〜５個のアルキル基を、ｎは４０〜１４
０の整数を示す）で示される／　１７エチレングリコー
ルの末端水酸基を組織型プラスミノーゲン活性化因子の
アミノ酸残基のアミノ基と結合し得るように活性化し、
該活性化ポリエチレングリコールを組織型プラスミノー
ゲン活性化因子のアミノ酸残基のアミノ基に活性基を介
して結合してなる修飾組織型プラスミノーゲン活性化因
子を提供することにある。

本発明におけるｔ−ＰＡは、微生物培養系または細胞培
養系によシ産生されプロテアーゼ部分を含み、生体組織
中に存在するｔ−ＰＡと極めてよく似た生理活性を有す
る物質を全て包含する。即ちｔ−ｐ人は遺伝子操作によ
る産物、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正常細胞、
ヒトメラノーマ、乳癌細胞などの腫瘍細胞およびこれら
のセルライン化されたものから得られたもの全てを含む
。

本発明におけるｔ−ＰＡの理化学的性質は次の通りであ
る。

■分子量　６２０００〜７３０１１Ｑ ■作用および基質特異性 不活性前駆体プラスミノーゲンをゾラスミンに変換しフ
ィブリンを溶解する。市販の酵素製剤ウロキナーゼにく
らべてフィブリンに対する強い親和性を示す。合成基質
Ｓ−２２８８（第一化学。

夏１−Ｄ−Ｉｍｏｌ　ｅｕｅｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｌｙｌ−
Ｌ−ａｒｇｉｎ　ｉｎｅ　−ｐ　−ｎｌｔｒｏａｎｉ口
ｄ＊　ｄｌｈｙｄｒｏｅｈｌｏｌｉｄ＠）でのＫｒｎは
３．６Ｘ　１０−’　Ｍ、　Ｖｍａｘ　１１６　ｐｍｏ
ｌ　／　ｍｉｎ、１．Ｕ、である。

■至適ｐＨ７〜１１ ■安定ｐＨ４，５〜１１ ■作用適温　３０〜４５℃ ■温度耐性　９０分の加熱処理で５０℃までは殆ど失活
しない。

■紫外線吸収スペクトル ２８０　ｎｍに極太吸収あり。

■溶剤に対する溶解度 水あるいはリン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶解度
　　５０μｆ／ｄ それ以外の場合は溶解促進剤が必要。

■物質の性状　凍結乾燥品は白色粉末。

［相］呈色反応　　ＰＡＳ反応で糖蛋白に特有なピンク
色を呈す。

■等電点　　　ｐＨ７，５〜８．０ 本発明の活性化ポリエチレングリフール（以下活性化Ｐ
ＥＧと称す）は、以下に示す自体公知の方法で合成され
る。

式（１）で示されるポリエチレングリコール（以下ＰＥ
Ｇと称す）の水酸基を脂肪、族ジカルボン酸（炭素数３
〜６）でエステル化し、次いで末端のカルメキシル基と
Ｎ−ヒドロキシスクシニルイミドとをエステル結合させ
て以下の式で示されるＮ−ヒドロキシスクシニルイミド
破りグリコートを得る。

■ 式中Ｒ，ｄ、　　メチル、エチル、プロピル、イソゾロ
ビル、ブチル、イソブチルまたはペンチル基を示し、こ
のうち特にメチル基が好ましい。

式中−Ｃｏ−（Ｃ）Ｉ、）ｍ−〇〇−は、架橋性残基を
示し。

ｍは１〜４の整数であり、具体的には、マロニル基（−
ＣＯ−ＣＨ，−ＣＯ−）、　スクシニル基（−ｃｏ−（
ＣＨ２）！−〇〇−）、グルタリル基（−Ｃｏ−（ＣＨ
２）、−Ｃ０−）またはアノビル基（−ＣＯ−（ＣＨ，
）、−ＣＯ−）等があげられる。

これらの架橋性残基は、その一端をＰＥＧの末端水酸基
の残存ａ！累と結合し、他の一端をｔ　−ＰＡ分子内の
アミノ基残基群のうちリシン残基のε−アミノ基および
Ｎ末端のａ−アミノ基と結合するものである。

この他にＨＰＥＧとハロゲン化シアヌル、例えば塩化シ
アヌルとを反応させ活性化させる方法（Ｉｎａｄａ　ｅ
ｔ　ａＬ　Ｉｍｍｕｎｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ　１２　、
８９９−９０２（１９７５））があげられ反応式は次式
で示される。

ｅｔ ｅｔ （式中Ｒ１およびｎは前述とおなし） ０−　（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎ　Ｒ１ ｅｔ ２−フルコキシＰＥＧ−４，６−ジクロロ−１゜３．５
−トリアジン 更にはＰＥＧの末端ヒドロキシル基金クロル酢酸、次い
でジアゾメタンと反応させカルピキシメチルエステルを
得、ヒドラゾンで処理してアシルアシドの付加された活
性化ＰＥＧを得る方法（特公昭５６−２３５８７号）等
を用いてよい。

本発明に用いる活性化ＰＥＧは、前述のもの以外に中性
付近で反応性が高く反応条件が緩和でリシン残基のＣ−
アミノ基に対する選択性が高く人体に投与した時副作用
のない条件を満足するものであれば使用できる。

次にこうして得られた活性化ＰＥＧとｔ　−ＰＡとの修
飾反応は、ｔ−ＰＡの活性が極力失われない条件下で行
なわれなければならず通常の化学反応とは区別される。

ｔ−ＦＡの場合フィブリンと親和性を示すクリングル（
Ｋｒｉｎｇｌ・）領域とプラスミノーゲンに特−’−ｊ
’＋−２：”−、ｊ’−ｉ 異的に働いてこれを活性なプラスミンに変換するセリン
ゾロテアーゼ部分を有している（　Ｃｏ１１ｅａｅｔｉ
ｌ−Ｎａｔｕｒ＊３０１　２１４−２２１（１９８３）
）。

従ってｔ−ＰＡｉ修飾する場合、前述の活性部位を出来
るだけ保持するように修飾条件を設定しなくてはならな
い。

しかしながら、ｔ−ＰＡの活性を維持しつつ、血中半減
期を延長させる修飾試薬の選定および修飾条件の設定が
望ましいことであるが、一般に行なわれている酵素蛋白
の修飾においても非免疫性を与える為にある程度の活性
を犠牲にせざるを得ないのが現状である。ｔ−ＰＡの修
飾においてもｔ−ｐ人が複雑な構造を肩し、リシン残基
のε−アミノ基の局所環境の多様性から選択的な修飾を
行なうことは非常に難しい。

活性化ＰＥＧによるｔ−ｐｈの修飾方法を以下に例示す
る。

ｔ−ＰＡＬモル当たりＮ−ヒドロキシスクシニルイ　ミ
ドビリグリコートと２．４１Ｘ１０’　〜１．２７Ｘ１
０’倍モルとをｐＨ６，５〜９．０．好まｔ、＜ハｐｕ
ｓ、５〜７．５のホウ酸緩衝液又はリン酸緩衝液中で室
温以下で反応させる。この時のＰＥＧ平均分子量は１９
００〜５０００の範囲が好ましい結果を与える。

ｔ−ＰＡ−ＮＨ。

＋ Ｒ，−（ＯＣＲ，ＣＭ、）　ｎ−ｏ−ｃｏ−（ｃＨ，）
ｎ、−ｃｏＮｕ−ｔ−ＰＡこのようにして得られた修飾
ｔ−ｐ人のｒＩ製は。

ｔ　−ＦＡの生理活性を低下させない公知の蛋白精製法
１例えば透析、限外ろ過、ゲルろ過等を適宜組み合わせ
て行なう。

他の活性化ＰＥＧとして例えば塩化シアヌルの付加され
た２−アルコキシＰＥＧ−４，６−”／クロロー１．３
．５−トリアゾンを用いる場合。

ｔ−ＰＡと該活性化ＰＥＧとをホウ酸緩衝液中で反応さ
せ、反応終了後未反応の活性化ＰＥＧを公知の方法で取
り除き修飾ｔ−ＰＡを得る。

０−（ＣＨ，ＣＨ，Ｏ）　ｎ−Ｒ。

ｔ Ｏ−（ＣＨ，Ｃ）１．０）ｎ−Ｒ。

ｔ 〔発明の効果〕 こうして得られた修飾ｔ−ＰＡは、生体内インヒビター
の影響を受けに＜＜、かつ血中の活性持続時間が延長さ
れた血栓溶解剤として有効である。

得られた修飾ｔ−ＰＡは、　　ｔ−ｐ人の繊維素溶解活
性を少なくとも１５％以上保持しており物理化学的に安
定で生体に投与した場合の血中半減期は。

ｔ−ｐ人のそれと比べて約８倍に延長される。

また未修飾ｔ−ＰＡが約２０分で完全に活性を失うのに
対し修飾ｔ−ｐムはその活性の血中保持効果において少
なくとも１０％以上の残存活性を１時間以上保持しうる
。

本発明による修飾ｔ−ＰＡは、血栓症１例えば心筋梗塞
、肺塞栓症、胸部静脈血栓症、末梢動脈閉塞症等の治療
に安全にかつ有効に使用できる。

本発明の修飾ｔ−ＰＡを医薬品として使用する場合、血
管内、特に血栓を生じた部位に投与することができるが
、通常は静脈内投与するのが望ましいＯ 組成物の添加物としては、塩化ナトリウム、マンニット
、ブドウ糖等の等張引剤、マンニット、アルブミン、ゼ
ラチン、亜硫酸水素ナトリウム等の安定剤等が適当であ
る。投与量は患者の体重、年齢、症状、経過等によるが
５０　ｐｆ〜５００ｆｆｇの範囲で投与ができる。静脈
内投与の方法としては。

注射による投与がのぞましいが１点滴静注等の方法も可
能である。

〔実施例〕

以下に実施例を示す。

〔実施例１〕　活性化ＰＥＧ誘導体による１−ＰＡの修
飾 ■精製ｔ−ＰＡ ヒト横絞筋肉腫変異株ｘｙＭ−ｇ（明治乳業株式会社所
有株）（以下ＫＹＭ−Ｅと称す）培養上清より亜鉛キレ
ートカラム、抗ｔ−ＦＡモノクローナル抗体アフイニイ
テイークロマトグラフイー、セファクリール５−２００
カラムクロマトグラフイーによシ精製したもので蛋白濃
度は２６．９ｐｆ／＊ｌ、０．３　Ｍ　ＮａＣ１，０，
０１％Ｔｗｅ會ｎ　８０含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐｉ
（６，５中に溶解しであるものを使用した〇 ■修飾試薬 平均分子１５０００のＰＥＧのコハク酸エステルＱＮ−
ヒドロキシスクシニルイミドによシ活性化したＮ−ヒド
ロキシスクシニルイミド？リグリコート（日本油脂）（
以下活性化ＰＥＧ、。。と称す）を使用した。このもの
は次式であられされる。

■修飾方法 精製１−ＰＡ（分子量約７０１１００．３９９５ＩＵ／
ｄ）７５−を１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）
に対して４℃にて一昼夜透析、緩衝液の交換を行なった
。

次に該ｔ−ｐＡ液に活性化ＰＺＧｓｏ。。（日本油脂製
）を２．４ｆｌＯ回にわけて添加し４℃にて２時間反応
させた。この時のｔ−ＰＡおよび活性化ＰＥＧ、。。。

の濃度は各々５．７６Ｘ１０−’Ｍおよび４．３７　Ｘ
　１０−”Ｍであった、 この反応液を０．０２％（Ｗ　／　Ｖ　）　ｔｗｓｅｎ
　８０と０、１５　Ｍ　ＮａＣｔを含有する１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，５）で透析し、９履ｌに濃縮した
。この時の活性は％　３４６７ＩＵ／ＴＩＬｌであった
。

反応終了後得られた修飾ｔ−ＰＡについて高速液体クロ
マトグラフィー（スー、Ｑ−ロース１２、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社）カラムを用いた蛋白質の分子量測定標準曲線
（Ｃａ目ｂｒａｔｌｏｎｃｕｒｖｅ　）からその分子量
を推定すると約１２００００でめった。１−２人の分子
量が約７００００であることから約１０個のＰ　ＥＧ、
。。が架橋性残基を介して１−２人のポリペプチドのり
シン残基およびＮ末端アミノ基に結合した。

〔実施例２　Ｅ　　Ｂｏｗｅｓ株由来ｔ−ＰＡの修飾Ｂ
ｏｗｓｓ株よりｎ摂したｔ−Ｆ　Ａ（米国Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＤｉａｇｎｏｓｔｌｃａ　社）について色々な修飾
条件によυ実施した。修飾試薬は実施例１と同様の活性
化ＰＥＧ、。。。を使用した。結果を表１に示す０（試
験例１）　　ＫＹＭ−Ｅ由来の修飾ｔ−ＰＡの血中半減
期および血中活性保持効 果試験 体Ｎ２．８〜３．２陽の雄二ユージランド白兎にネンブ
タール注射液（３０■／９、大日本製薬）で全身麻酔し
、固定後耳静脈よシ実施例１で得た修＃ｔ−ＰＡ（３４
６７１，Ｕ、／ｄ）を２　ｍｌ投与し、投与後玉１．２
．３．４．５．６．８．１０．１５．２０．３０．４５
．６０分で、３．８チクエン酸す）　ＩＪウム０．３　
ｍｌを予め添加しておいた試験管に経時的に採血（各２
．７ｍｔ１回）した。コントロールとしてＫＹＭ−Ｅ由
来ｔ−ＰＡ（４５５０ｒ、Ｕ、／ｍｌ）を２ｄ同様にし
て兎に投与し、経時的に採血（Ｚ　７　ｍｌ　７回）し
た。

倍に希釈した後２％酢酸で〜ｐＨ５，９に調整し、４℃
にで３０分Ｄｌｌｉｆ後遠心分離しＥｕｇｌｏｂｌ　ｉ
ｎ分画を沈殿として得た。上清を除去後、Ｅｕｇｌｏｂ
ｕｌｉｎ分画沈殿を緩衝液Ａ　（０，１ＭＮａＣｔ、　
０．２５％ゼラチな０、Ｏ１％Ｔｗｅ＠ａ　８０含有５
０　ｒｎＭリン酸緩衝液。

ＰＨ７，７５）に溶解した。

これらのＥｕｇｌｏｂｕｌｌｎ分画についてｔ−２人の
活性測定をＲｌｊｋｉｎら（Ｒｉｊｉｋｅｎ　ａｔ　ａ
ｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈ＠ｍ、２５６　７０３５−７０４１（１９８１））
の方法を改良したフィブリンクロット溶解時間法により
行なった。フィブリンクロットは％　２．４１１９／Ｎ
ｌヒトフィブリノ−ダン０．５ｄ、標準ウロキナーゼ液
あるいはＥｕｇｌｏｂｕｌ　Ｉｎ分画液ｏ、　１　ａｌ
　ｓ　　０．３　”ｇヒトデラスミノ−ダン０．０５　
ａｌ、４ＯＮＩＨ単位／−トロンビン０．０５　ｍｌを
順次添加して形成した。

なおすべての試液は緩衝浪人で希釈調製した。トロンビ
ンの添加直後よりストップウォッチを始動し３７℃の恒
温水槽中で２分間インキニベートしフィブリンクロット
を完成させた後、直径３．２ｍｍのナイロンゴールをフ
ィブリンクロットの上に静置しナイロンゴールが試験管
の底面に到達するまでの経過時間を測定した。

各濃度のウロキナーゼを用いた場合のフィブリン溶解時
間（秒）を測定し、ウロキナーゼ単位と溶解時間を両対
数グラフにプロットし検量線を作製した。

Ｅｕｇｌ　ｏｂｕ　１１ｔ＋分画中の残存活性はウロキ
ナーゼの検量線から希釈倍数を乗じて算出しウロキナー
ゼ国際単位（ＩＵ）で表示した。

ゼロ時における残存活性を１００％とした場合の各時間
における残存活性の％を第１図に示し念。

修飾ｔ−ｐ人はゼロ時における残存活性を１００％とし
た場合未修飾ｔ−ＰＡより明らかに延長され、ｔ−ＰＡ
の半減期が約４０秒だったのに対し修飾ｔ−ＰＡの半減
期は約３２０秒と約８倍延長された。

又修飾ｔ−ＰＡは、少なくとも１０％以上の活性を保持
したまま６０分以上失活せずに血中に存在したのに対し
、未修飾ｔ−ＰＡは約２０分で完全に失活した。

活性化ＰＥＧの修飾は％　ｔ−ｐ人の血中での長時間の
活性保持に極めて有効であった。

〔試験例２〕　修飾条件による修飾ｔ−ＰＡの血中半減
期 実施例２で得られた各々の修飾ｔ−ＰＡについて血中半
減期を試験例１と同様な方法で白色家兎に投与し経時的
に採血し、Ｅｕｇｌｏｂｕｌｉｎ分画を得た。

これらのＥｕｇｌｏｂｕｌｉｎ分画について各々のｔ−
ＰＡ活性をフィブリンクロット溶解時間法の改良法によ
って測定した。結果を表２に示す。

表　　２ 表２の結果から修飾ｔ−ＰＡの血中半減期は未修飾ｔ−
ＰＡの血中半減期３９秒と比較して大幅に延長された。

残存活性は、少なくとも１５チ以上保持されていた。

〔試験例３〕　修飾ｔ−ＰＡの抗原性 ＫＹＭ−Ｅ由来ｔ−ＰＡを１３５　ｎｆ金含有る０、１
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５）５００ｐｔＫ活性化ＰＥ
Ｇ５０００を０．５〜２５Ｈ？粉末状態で添加し４℃に
て２時間反応させた。

反応終了後、サンドイッチ型酵素免疫測定法（以下ＥＩ
Ａと称す）により活性化モノメトキシＰＥＧを添加した
修飾ｔ−ＰＡおよび未修飾を−ＰＡについて抗原性を測
定したつ ＥＩＡは、試料液を１ｍＭＭｇｃｔｔ　　、０．１５　
ＭＮａＣＬ　、　０．１％牛血清アルブミン、０．１％
ＮａＮ３を含有する１０ｍＭす／酸緩衝液（ｐＨ７，０
）で２０倍、２００倍に希釈したものを測定試料とした
。

この試料駅１５０μｔに抗ｔ−ＰＡ抗体（兎ＩｇＧ）結
合ポリスチレンピース（直径３．２　ｒｕｍ　）を１個
加え３７℃で４時間インキュベートし、更に１夜反応さ
せた。反応後０．９％ＮａＣ’ｌでビーズを３回洗浄し
β−ガラクトシダーゼ標識抗体（兎Ｆａｂ’）２０００
単位加え３７℃にて６時間インキュベートした。反応後
０．９％ＮａＣｔで３回洗浄し、ビーズに結合したβ−
ガラクトシダーゼ活性を４−メチルランペリフェリール
ーβ−Ｄ−ガラクトシドを基質とし反応させ、生成した
４−メチルラン未すフエロンの螢光強度を励起波長３６
０圃、螢光波長４５０　ｎｍで測定した。酵素反応は３
７℃にて２０分間行なった。第２図にその結果を示す。

修飾ｔ−ＰＡは修飾による抗原性の消失がみられ、１０
ｍＭ活性化ＰＥＧ−Ｅ誘導体添化修飾ｔ−ＰＡではほぼ
１００％消失していた。０．２　ｍＭでも５０％以下に
なっていた。

この事は、本発明による修飾法がｔ−ＰＡの抗原性を消
失させるのに極めて有効であること全示温１図はＫＹＭ
−Ｅ由来修飾ｔ−ＰＡの兎における血中デラスミノーグ
ンアクチペーター活性の経時変化を示す。第２図はＰＥ
Ｇ各濃度での修飾におけるＥＩＡによる残存抗原性の変
化を示す０以上

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（ I ） Ｒ＿１−（ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２）＿ｎ−ＯＨ（ I ）（
   式中Ｒ＿１は炭素数１〜５個のアルキル基を、ｎは４０
   〜１４０の整数を示す）で示されるポリエチレングリコ
   ールの末端水酸基を組織型プラスミノーゲン活性化因子
   のアミノ酸残基のアミノ基と結合し得るように活性化し
   、該活性化ポリエチレングリコールを組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子のアミノ酸残基のアミノ基に活性基を
   介して結合してなる修飾組織型プラスミノーゲン活性化
   因子。
2. （２）式（ I ） Ｒ＿１−（ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２）＿ｎ−ＯＨ（ I ）（
   式中Ｒ＿１は炭素数１〜５個のアルキル基を、ｎは４０
   〜１４０の整数を示す）で示されるポリエチレングリコ
   ールの末端水酸基を組織型プラスミノーゲン活性化因子
   のアミノ酸残基のアミノ基と結合し得るように活性化し
   、該活性化ポリエチレングリコールを組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子のアミノ酸残基のアミノ基に活性基を
   介して結合させることを特徴とする修飾組織型プラスミ
   ノーゲン活性化因子の製造方法。