JPS62252800A - 化学修飾タンパク質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は化学修飾タンパク質、殊に水溶性高分子で化学
修飾したタンパク質の製法に間する。

（従来の技術） 酵素の先天的な欠損あるいは異常に基づく先天性代謝病
の治療法の一つとして生体外から酵素を注入するいわゆ
る酵素補充療法が試みられ、またある種の腫瘍の治療に
酵素が人体に投与され、更には薬物や生理活性物質の安
定化剤として例えばアルブミンが加えられる等、臨床医
学において薬物あるいはその補助剤としての酵素やアル
ブミンのようなタンパク質の重要性が増加しつつある。

一般に、これらのタンパク質はヒトの組織からは充分な
量が得られないため、その起源をヒト以外に求めざるを
得ない場合が多い、このことはタンパク質の抗原性とい
う問題を提起する。すなわち。

ヒトにとって異種のタンパク質を反復投与することはア
ナフィラキシ−ショック等の重大な障害を惹起する恐れ
があるからである。更に、タンパク質が薬物として用い
られた場合２通常これはタンパク質分解酵素によって代
謝され、あるいはある組織に速やかに取り込まれてしま
うため、生体内における生物学的半減期が極めて短く、
目的とする組織に十分到達し得ないという問題に直面す
る。

こうした問題を解決するために、タンパク質の遊離アミ
ン基に水溶性高分子を結合させてタンパク質分子表面の
抗原決定基を覆うことにより、抗原性の低下あるいは消
失を図り、併せてタンパク質分解酵素からの攻撃をも防
ぐといういわゆるタンパク質の化学修飾が試みられてい
る。

これまで、酵素等のタンパク質に結合させる水溶性高分
子としては種々の分子量のポリエチレングリコールが用
いられてきたが、これは、ポリエチレングリコールが免
疫原性をもたないとされており１分子構造が直線的で電
荷をもたず種々の分子量のものが得やすく、水素結合に
よって多量の水を結合するため水に溶けやすいこと等の
理由によるものである。尚、ポリエチレングリコールの
活性（ヒには従来から塩化シアヌルが汎用されてきた（
例えば、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、第２５２巻第３５
７８−３５８１頁、１９７７年）、塩化シアヌルで活性
化させたポリエチレングリコールにより化学１疹飾する
この従来法の欠点は、酵素活性が大幅に低下してしまう
ことにある。しかも、塩化シアヌルによるポリエチレン
グリコールの活性化には１２時間以上を要し且つ活性化
の程度も充分ではない。

また、ポリエチレングリコールとタンパク質の遊離アミ
ノ基との結合はトリアジン環を介してなされているが、
このスペーサーはある場合には、活性塩素を保持したま
まタンパク質に結合しているため、更に他のタンパク質
分子をも結合して多量体を形成してしまう可能性がある
。

こうした欠点を克服するために、１．１’−カルボニル
ジイミダゾールによって活性化したポリエチレングリコ
ールを用いる化学修飾タンパク質の製法が報告されてい
る（　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、第５４巻第２５−３
３頁、１９８３年）、この場合、ポリエチレングリコー
ルとタンパク質の遊離アミノ基との間にはカルバメート
結合が形成され両者の間に新たに導入されるスペーサー
はＣ＝Ｏだけである。しかしながらこの製法には、化学
修飾反応に約１００時間を要するという問題がある。

本発明は従来技術方法における上述の問題点を排除する
ことにあり、具体的には、主として。

■水溶性高分子化合物の活性化が迅速且つ充分であり、
その活性化の程度が容易に測定でき。

しかも ■タンパク質に導入されるスペーサーが不活性であり、
また ■化学修飾反応が穏和な条件で且つ迅速に進行する 化学修飾タンパク質の製法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段及び作用）本発明によれ
ば、上述の問題点は。

式 （式中Ｒは水溶性高分子残基を意味する）にて示される
水溶性高分子をクロロホルメート化合物で活性化させて Ｒ−０−Ｃ−０−Ｒ’ （式中Ｒは前記の意味を有し、Ｒ１はクロロホルメート
化合物残基を意味する） となし、タンパク質の遊離アミノ基を化学修飾すること
により解決される。

式Ｒ−〇Ｈにて示される水溶性高分子としてはポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン。

ポリエチレングリコール等を例示することができるが、
ポリエチレングリコールが殊に好ましい。

この水溶性高分子の水酸基は一つを残して他はメチル、
エチル基のようなアルキル基でエーテル結合しているこ
とが好ましく５例えばＯ−モノメトキシポリエチレング
リコールが有利である。水溶性高分子の分子量としては
、この種の化学修飾目的に用いられる範囲であり、一般
的には約１００−〇−約２００００である。クロロホル
メート１ヒ合物としてはＮ−ヒドロキシスクシンイミド
クロロホルメー）、２，４．６−）リニトロフェニルク
ロロホルメート、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート
等を例示することができるが、ｐ−ニトロフェニルクロ
ロホルメートが殊に好ましい。

クロロホルメート化合物による水溶性高分子の活性化反
応はＮ、Ｎ“−ジメチルアミノピリジン存在下、室温且
つ無水条件下で１時間以内に終了する。活性化反応の程
度は、薄層クロマＬグラフィーによって未反応の水溶性
高分子と活性化された水溶性高分子とを分離し定性的に
追跡することができる。水溶性高分子は反応終了後２反
応液からジエチルエーテルで沈澱させ単離される。水溶
性高分子に結合したクロロホルメート化合物残基の量は
、活性化水溶性高分子を０．２Ｍの水酸化ナトリウムで
加水分解して生成するクロロホルメート化合物由来の発
色団の吸光度を測定することによって容易に定量てきる
。これは更に元素分析によって確認され１通常９０％以
上の水溶性高分子が活性化される。

次に、こうして得られた活性化水溶性高分子を。

タンパク質分子中に存在する遊離アミノ基に対し必要に
応じて５−１００倍量（モル比）加え、４’Ｃ，ｐＨ８
，５で反応させることによって通常１−２時間で所望の
化学１咬飾タンパク質を製造することができる。化学修
飾の程度は、タンパク質の遊離アミノ基の減少量をトリ
ニトロベンゼンスルホン酸を用いて定量することにより
、あるいはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法を用いて化学修飾タンパク質の移動度
の変化を追跡することにより調べることができる。

（発明の効果） 本発明による化学修飾タンパク質の製法の特徴は、先ず
、水溶性高分子の活性化が充分且つ速やかに進み、活性
化水溶性高分子の定量が極めて容易な点である４次に、
化学修飾されたタンパク質において、水溶性高分子とタ
ンパク質との間に導入されるスペーサーは不活性なＣ＝
０だけである。

また、１，１’−カルボニルジイミダゾールを用いる場
合に比べて、タンパク質の化学修飾に要する時間が短く
、化学修飾率も高いことが示された。

従って９本発明は、水溶性高分子で化学修飾したタンパ
ク質の製法として極めて有利である。

（実施例等） 次に、実施例、参考例等に関連して本発明を更に詳細に
説明する。

尚、実施例等において用いられた原料、試験法等は下記
の通りである。

■０−モノメトキシポリエチレングリコール（平均分子
ｊｉ１９００）及びｐ−ニトロフェニルクロロホルメー
ト（共に米国ミルウォーキー在。

アルドリッチ社より市販のもの） ■Ｎ、Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（京都在。

半井化学薬品株式会社より市販のもの）■非水滴定用ジ
オキサン及び無水ジエチルエーテル（共に大阪在、和光
純薬工業株式会社より市販のもので、水の含量がそれぞ
れ０．３％及び０．０１　％以下のもの） ■ウシ血清アルブミン（米国セントルイス在、シグマ社
より市販のもの） ■スフィンゴミエリナーゼ（ヒト胎盤より精製したもの
）の酵素活性は１時間に加水分解される１４（−スフィ
ンゴミエリン（ＳＭ）の童を測定して求めた。

■タンパク質の遊離アミノ基はＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、第１４巻第３２８−３３６頁（１９６６年）に記載
の方法に従いトリニトロベンゼンスルホン酸（大阪在、
和光純薬工業株式会社より市販のもの）を用いて定量し
た。

■タンパク質量はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、第７２巻第２９６−３０３頁（１９８１年）に記載
の方法に従って定量した。

Ｋ嵐叢１ユ 非水滴定用ジオキサンに溶かした１ｍｍｏｌの０−モノ
メトキシポリエチレングリコール（平均分子量１９００
）に５ｍｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロホルメート
を加え、５ｍｍｏｌのＮ−。

Ｎ′−ジメチルアミノピリジン存在下、攪はんしながら
室温で２時間反応させた。若干の析出物をろ過した後、
ろ液にジエチルエーテルを加えて沈澱物を得た。これを
アセトンに溶解し、再びジエチルエーテルにて沈澱させ
た。ろ液のジエチルエーテル中にｐ−ニトロフェニルク
ロロホルメートが検出されなくなるまでこの沈澱と溶解
の操作を数回繰り返した。最終的に得られた沈澱を真空
下。

五酸化リン上で乾燥させた。

薄層クロマトグラフィー（展開溶媒、ベンゼン：メタノ
ール＝２：１．容積比）による検討の結果、生成物には
遊離の０−モノメトキシポリエチレングリコール、ｐ−
ニトロフェニルクロロホルメート及びＮ、Ｎ’−ジメチ
ルアミノピリジンは殆ど検出されなかった。これに０．
２Ｍの水酸化ナトリウムを添加して生成するｐ−二トロ
フェノールの量を４００ｎｍの吸光度（分子吸光係数１
７０００）から求めたところ、０−モノメトキシポリエ
チレングリコールの９４％以上が活性化されていること
が判明した。この結果は元素分析によっても確認された
。

次に、このようにして得られた活性化ポリエチレングリ
コール（５０ｍＭ）を、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）に溶解したウシ血清アルブミン（１０ｍｇ／
ｍｌ）に加え４℃で反応させた０反応液を経時的に採取
し、セントリフローＣＦ−２５（米国ダンバース在、ア
ミコン社より市販のもの）を用いて未反応の活性化ポリ
エチレングリコールを除去した。化学修飾の程度は、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いて定性的に追跡した。すなわち。

化学修飾によるアルブミンの分子量増加及び直線的なポ
リエチレングリコール鎖の付加という２つの効果に伴い
、電気泳動の移動度が減少した。その結果、この条件で
は１時間の反応で化学修飾がほぼ飽和に達することが判
明した。また、化学修飾されていないアルブミンは殆ど
認められなかった。更に、タンパク質を定量し、アルブ
ミンの遊離アミノ基をトリニトロベンゼンスルホン酸で
定量した結果、１時間の反応でアミノ基の４８％が化学
修飾されていた。

衷羞ｆｌ工 実施例１に記載の方法で得られた活性化０−モノメトキ
シポリエチレングリコール（１０ｍＭ）を用いてスフィ
ンゴミエリナーゼ（０，３ｍｇ／ｍｌ）の化学修飾を試
みたところ、２０時間後。

６１％の遊離アミノ基が化学修飾され、残存活性は７７
％であった。

麦３」虹し工 比較のために、　　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、第５４
巻第２５−３３頁（１９８３年）に記載の方法に従い１
゜１′−カルボニルジイミダゾールによりＯ−モノメト
キシポリエチレングリコール（平均分子量１９００）を
活性化しく活性化率８５％）、これを用いて実施例１に
記載の条件でウシ血清アルブミンの化学修飾を行った。

その結果９本発明による方法（実施例１参照）に比べて
、この方法によるタンパク質の化学修飾には長時間を要
し、２０時間後でも遊離アミノ基の化学修飾率はわずか
６％であった。

沓３」［也ユ 参考例１に記載の方法で得られた活性化０−モノメトキ
シポリエチレングリコール（１，６ｍＭ）を用いてスフ
ィンゴミエリナーゼ（０，３ｍｇ／ｍｌ）の化学修飾を
試みたところ、２０時間後でも遊離アミン基の化学修飾
率及び残存活性はそれぞれ１６％及び７１％であり９本
発明による方法（実施例２参照）に比べて低かった。

試１」し工 実施例２に記載の方法で化学修飾したスフィンゴミエリ
ナーゼ（０，０３５ｍｇ／ｍｌ）の４℃。

ｐＨ７におけるα−キモトリプシン（０，００１ｍ　ｇ
　／　ｍ　ｌ　）に対する抵抗性について検討した。

その結果、消化酵素によって遊離の酵素は１．５時間で
３８％の活性を失うのに対し、活性化ポリエチレングリ
コールで化学修飾した酵素の場合は失活が１２％であり
消化酵素に対する抵抗性が強められることが判明した。

但し、至適ｐＨ，Ｋｍ値に大きな変化は認められず、酵
素本来の性質は保持されていた。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 Ｒ−ＯＨ （式中Ｒは水溶性高分子残基を意味する） にて示される水溶性高分子をクロロホルメート化合物て
   活性化させて ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは前記の意味を有し、Ｒ’はクロロホルメート
   化合物残基を意味する） となし、タンパク質の遊離アミノ基を修飾することを特
   徴とする、化学修飾タンパク質の製法。
2. （２）残基Ｒがポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
   リドン、Ｏ−置換−ポリエチレングリコール及びＯ−モ
   ノメトキシポリエチレングリコール残基から選ばれたも
   のであることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記
   載の化学修飾タンパク質の製法。
3. （３）クロロホルメート化合物がＮ−ヒドロキシスクシ
   ンイミドクロロホルメート、２，４，６−トリニトロフ
   ェニルクロロホルメート及びｐ−ニトロフェニルクロロ
   ホルメートから選ばれたものであることを特徴とする、
   特許請求の範囲第１又は２項に記載の化学修飾タンパク
   質の製法。
4. （４）タンパク質が酵素であることを特徴とする。 特許請求の範囲第１、２又は３項に記載の化学修飾タン
   パク質の製法。
5. （５）タンパク質がアルブミンであることを特徴とする
   、特許請求の範囲第１、２又は３項に記載の化学修飾タ
   ンパク質の製法。