JPS63238100A - 抗体複合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗原へ特異的に結合する機能をもつ抗体と、各種化合物
とを共有結合で結合した複合体は、多方面に用いられる
。例えば、特定の抗体を不溶性支持体に結合した複合体
は、アフィニティクロマトグラフィーに使用され、混合
物から特定の物質を分離することを可能にする。又、生
体内の特定の組織１例えば悪性腫瘍に特異性をもつ抗体
に、γ線放出性の放射性同位元素を結合して得られる複
合体は、生体内に投与すると、腫瘍に放射活性を集積さ
せるので、癌の画像診断に用いることができる。さらに
、抗体に生物活性物質を結合した複合体は、選択性が高
い薬物となり得る。例えば、抗腫瘍抗体と制癌薬あるい
はその他の細胞毒とを結合した複合体は、腫瘍に選択的
に作用する癌拍療薬となる。抗体に螢光物質や酵素を結
合した複合体は、例えば、免疫・生化学試薬や診断薬と
して用いられる。また将来発生するニーズに対して、ざ
らに新しい複合体が考案されよう。

これらの複合体の製造方法に共通する要件は、必要とす
る物質を抗体に満足に結合できる製造方法であると同時
に、抗体が元来持っている殿能である抗原に特異的に結
合する特性を損わない製造方法であることである。

抗体に物質を結合させる場合に最も一般的に使われる方
法に、物質を抗体を構成するアミノ酸が含有するアミノ
基（リジンやＮ−末端アミノ酸が含有する）や、カルボ
キシル基（グルタミン酸やアスパラギン酸が含有する）
に結合する方法があり、なかでも、アミノ基に結合する
方法は、特に多用されている。例えば、アフィニティク
ロマトグラフィーによる特定物質の分離精製のために供
される抗体と不溶性支持体との複合体は、支持体にアミ
ノ基との反応性基、即ちエポキシ基、カルボン酸活性エ
ステル基、酸アジド基、ブロモアセチル基、臭化シアン
活性化基等の反応性基を導入し、次いで抗体をそのアミ
ノ基で反応させて、支持体に結合する方法によって製造
されている（山崎誠２石井信−１岩井浩−編、「アフィ
ニティクロマトグラフィー」講談社、　１９７５年、第
１９頁、８１頁参照）。また、抗体に放射性物質を結合
させた複合体は、放射性ヨード元素の導入試薬であるポ
ルトン・ハンター試薬と抗体との反応で例示されるよう
に、カルボン酸の活性エステルを含有した化合物と抗体
のアミノ基との反応で製造されたり（Ａ、　Ｅ、　Ｂｏ
ｌｔｏｎ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｍ、　Ｈｕｎｔｅｒ　。

３　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　、１３３．　５２９−５３９
　（１９７３）参照）。

またジエチレントリアミノペンタアセチック　アシッド
（ＤＴＰＡと省略する）で例示されるタイプのキレート
化剤を、その含有するカルボキシル基で抗体のアミノ基
に結合した上で、′■ｎで例示される放射性金属をキレ
ート化剤に結合する方法で製造される（Ｂ、Ａ、Ｋｈａ
ｗ、Ｊ、Ｔ。

Ｆａｌｌｏｎ　、　Ｈ，Ｗ、　５ｔｒａｕｓｓ、　Ｅ、
　Ｈａｂｅｒ。

３　ｃｉｅｎｃｅ、ユ姐、２９５参照）。また抗体と生
物活性物質の複合体の製造においても、例えば制癌薬メ
ソトレキセートの結合方法（Ｐ、Ｎ。

Ｋｕｌｋａｒｎｉ、Ａ、　Ｈ，Ｂｌａｉｒ、　Ｔ、　　
１．　Ｇｈｏｓｅ。

ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、リー、　２７００
〜２７０６　（１９８１）参照）で例示されるごとく、
生物活性物質の含有するカルボキシル基で抗体のアミノ
基に結合して製造され、また例えば細胞毒リシンのＡ鎖
の結合方法（Ｋ、　Ａ、　Ｋｒｏｌｉｃｋ、　Ｃ，Ｖｉ
ｌｌｅｍｅｚ　、　Ｐ。

ｌ５ａｋｓｏｎ、　Ｊ、　Ｗ、　Ｕｈｒ、　ａｎｄ　Ｅ
、　Ｓ、　Ｖｉｔｅｔｔａ。

Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　
ｔＪｓＡ、、７７゜５４１９−５４２３　（１９８０）
参照）で例示されるごとく、先ず架橋剤９例えば活性ジ
スルフィド基導入用の架橋剤Ｎ−サクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、を抗体のアミ
ノ基に反応させて導入し、かくして導入された活性ジス
ルフィド基にリシンＡｌｌが含有するチオール基を反応
させて、新たなジスルフィド結合を形成させることによ
り、抗体・リシンＡ鎖複合体が製造されている。

しかしながら、抗体のアミノ基への反応による、従来用
いられている各種複合体製造方法は、それらに共通する
欠点をもつ。それは、抗体蛋白質に存在する多数のアミ
ノ基の内１個〜数個に物質を結合する場合、それらのア
ミノ基は、それらが抗体の抗原への結合活性に関与して
いるといないとにかかわらず、無差別に物質の結合に供
される、という事実である。従って、抗原への結合に関
与するアミノ基が化学反応に供されやすい場合には特に
それらのアミノ基が修飾を受け、その結果、得られた複
合体の抗原結合活性が著しく低下する。

倒木ば、メラノーマの細胞膜が有する高分子抗原に対す
る単クローン抗体２２５．２８８にキレート剤ＤＴＰＡ
の分子内酸無水物を当モル反応させて得られた複合体の
抗体活性は、元の抗体の約１７２に低下した（Ｒ，Ａ、
Ｆａｗｗａｚ　、Ｔ、Ｓ、Ｔ。

ＷａｎｇＩ△、　Ｅｓｔａｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　Ｍ、　
Ｒｏｓｅｎ、　Ｍ。

Ａ、　Ｈａｒｄｙ、　Ｐ、　Ｏ，Ａｌｄｅｒｓｏｎ　、
　Ｓ、　Ｃ。

Ｓ　ｒｉｖａｓｔａｖａ　、　Ｐ　、　Ｒ１ｃｈａｒｄ
ｓ　、　ａｎｄ　Ｓ　。

Ｆｅｒｒｏｎｅ、　Ｊ、　Ｎｕｃｌｅａｒ　　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ、　　２６．　４８８−４９２　　（１９８５
）　）。

本発明者らは、従来の方法では避けがたいかかる不都合
をきたす事なく、物質をアミノ基に結合する目的で広く
一般的に用いることができる抗体−物質複合体製造方法
を開発すべく鋭意研究した結果、抗体またはそのフラグ
メントのアミノ基に所望の物質や置換基を導入するに際
し、抗体が抗原に結合する活性に関与するアミノ基を含
む１乃至複数のアミノ基を可逆的ｒＭｒｓ剤を用いて保
護することを基本とする、抗体複合体の製造方法を考案
し、しかして得られた複合体は、従来法で製造する場合
には複合体の抗体活性が低下する場合、抗体活性を充分
保持していることを知見して、本発明に到った。

すなわち本発明は、アミノ基を修飾することにより抗原
結合活性が低下する抗体またはそのフラグメントのアミ
ノ基の一部を蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤で修飾した
後、抗体またはそのフラグメントにアミノ基反応性官能
基を有す物質を反応させ、しかる後、生成物より蛋白質
アミノ基の可逆的修飾剤残基と、さらに、アミノ基以外
の官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の残基が
導入された場合には必要に応じてかかる残基を、除去す
ることを特徴とする抗体複合体の製造方法である。

本発明において、アミノ基を修飾することにより抗原結
合活性が低下する抗体は、その特異性については、いか
なる抗原やハプテンに対する抗体でもよい。すなわち、
例えば、癌、１１菌、ウィルス、カビ、マイコプラズマ
、寄生虫に対する抗体。

病原性物質、腫瘍関連物質に対する抗体、腫瘍関連抗原
、細胞の分化抗原１組織適合性抗原、その池の細胞膜抗
原に対する抗体、Ｒ素、酵素、アレルゲン、ホルモン、
薬物、その伯の生物活性物質に対する抗体等を用いるこ
とができる。また本発明において、抗体は、例えば、動
物を抗原やハブテンで免疫して作るポリクローナル抗体
でも、あるいは、細胞融合や、ＥＢウィルスを用いる抗
体産生細胞の形質転換法等によって作られるモノクロー
ナル抗体でもよい。モノクローナル抗体は、細胞融合法
やウィルス形質転換法により、さまざまな抗原に対し特
異性の明確な高純度の抗体を多量に得ることができると
いう利点を有する。

また、本発明方法はいかなるクラス、サブクラスの抗体
にも適用することができる。すなわち、抗体にはｔｇＧ
、Ｉ（ｌ　Ａ、ＩＩＪ　Ｍ、ＩｇＤおよび１（ＪＥのク
ラスが知られており、さらにＩ（ＩＧにはＩ（ｌ　Ｇ１
．　　ｆｉｌｌ　Ｇ２ａ、　　Ｉ（］　Ｇ２ｂ、　　Ｉ
Ｃ１Ｇ３＋７）サブクラスが、ＩａＡにはＩｏ　Ａ１．
ＩＣＩ　Ａ２のサブクラスが、Ｉｃ＋ＭにはＩｇＭｌ、
１０Ｍ２のサブクラスがあるが、これらのどのクラス、
サブクラスの抗体であっても本発明の抗体として用いる
ことができる。抗体は分子全体を用いてもよいが、その
抗原結合部分を含むフラグメントを用いることができる
。かかるフラグメントとしては、例えばＩ（ＩＭ抗体の
ｌ量体１ｇＭ５やＩ（ＩＡの単量体。

抗体分子をペプシンで分解することによって得られる２
価の７ラグメントＦ（ａｂ’）ｚ、パパインで分解する
ことによって得られる１価の７ラグメントＦａｂ等を挙
げることができる。

本発明において、蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤とは、
抗体またはそのフラグメントの抗原との結合に深くかか
わっているアミノ基を化学的に修飾しく可逆的修飾剤残
基の共有結合）、その後、抗体またはそのフラグメント
にアミノ基反応性官能基を右する物質を反応させ、しか
る後、生成物より直ちにか、あるいは生成物をさらに化
学反応に付した後にその生成物より、その（可逆的修飾
剤）残基を除去しアミノ基を再生し得る化合物であれば
いかなるものでもよい。かかる蛋白質アミノ基の可逆的
修飾剤としては、例えば、無水マレイ酸類、無水コハク
酸類、ポリハロゲン化カルボン酸の反応性誘導体、ジケ
テン、２−ヒトＯキシアセトアルデヒドがあり、具体例
としては、例えば、無水マレイン酸類では、無水マレイ
ン酸無水コハク酸類では、無水テトラフルオロコハクン
ドキソーΔ４−テトラヒドロフタール酸ンドキソヘキサ
ヒドロフタール酸 反応性誘導体としては、無水トリフルオロ酢酸を挙げる
ことができる。

本発明方法において、アミノ基反応性官能基を有する物
質とは、抗体またはそのフラグメントに抗原結合活性を
損わずに導入することが必要であってしかもアミノ基反
応性官能基を有する物質であればいかなる物質でもよく
、広笥囲に及ぶが、その例として、架橋剤、生物活性物
質、キレート化剤、放射性物質、螢光物質、不溶性支持
体等を挙げることができる。

本発明方法におけるアミノ基反応性官能基を有する物質
としての生物活性物質には、細胞毒性物質。

抗腫瘍性物質、抗菌性物質、抗ウイルス性物質。

杭カビ性物質、抗マイコプラズマ性物質、抗寄生虫性物
質、ホルモン、酵素等が含まれる。ここで、ａｌ１１１
１毒性物質とは、それ自体で殺細胞効果を示すか、他の
物質により細胞内に導入された場合に殺細胞効果を示す
物質を意味し、α線またはβ線放出性放射性同位元素と
キレート結合をしたキレート化剤や、抗腫瘍性物質、毒
素またはその酵素活性を有するフラグメント等である。

かかるアミノ基反応性官能基を有する物質としては、ア
ミノ基反応性官能基としてカルボキシル基の活性化誘導
体を有する物質が特に望ましく、その具体例としては、
例えば抗腫瘍性物質では、以下の化学式で表わされる化
合物のカルボキシル基の活性化誘導体を挙げることがで
きる。

ニトロソウレア誘導体 ＯＣＨ３ クロラムブシル メソトレキセート ＮＨ２ＣＨ３０Ｃ０２Ｈ マイトマイシンＣ誘導体 アクヂノマイシンーＤ　オキサジノン誘導体ビンブラス
チン誘導体 また、キレート化剤では、以下の化学式で表わされる化
合物のカルボキシル基の活性化誘導体を挙げることがで
きる。

ジエチレントリアミノペンタ酢酸 トリス（カルボキシメチル）アミノ □。２ｏ」 かかるカルボキシル基の活性化誘導基には、活性エステ
ル基、活性アミド基、酸アジド基、酸無水物基等があり
、活性エステル基を形成するアルコール残基の具体例と
しては、２，４−ジニトロフＮ−５−ノルボルネン−２
，３−ジカルボキシイミでもよく、また、分子内の適当
な位置に２個のカルボキシル基を有する化合物ではそれ
らのカルボキシル基が結合した分子内酸無水物基でもよ
い。

これらの酸無水物基を、以下にキレート化剤の酸無水物
について例示する。

ジエチレントリアミノペンタ酢ｉ！誘導体２．６−シオ
キソーＮ−（カルボキシメチル）−モルホリン なお、カルボキシル基は、例えばジシクロへキシルカル
ボジイミド等の縮合剤を用いて、アミノ基と縮合しアミ
ド結合を形成し得るので、例えば上に例示したカルボキ
シル基を有する化合物はそれ自体で本発明のアミノ基反
応性官能基を有する物質であるが、カルボキシル基を有
する化合物が例えば縮合剤のジシクロへキシルカルボジ
イミドと反応してできる反応性中間体くカルボキシル基
を有する化合物をＲ−Ｃ−ＯＨで示せば、また、本発明
で言うカルボキシル基の活性化誘導基を有する化合物に
含まれる。

本発明の方法において原料として用いられる蛋白質アミ
ノ基の可逆的性Ｓ剤である、無水マレイン酸、無水シト
ラコン酸、無水２．３−ジメチルマレイン酸、無水シス
アコニチン酸等の無水マレイン酸類、無水テトラフルオ
ロコハク酸、無水エキソ−シス−３，６−ニンドキソー
△４−テトラヒドロフタール酸、無水エキソ−シス−３
，６−ニンドキソヘキサヒドロフタール酸等の無水コハ
ク酸類。

無水トリフルオロ酢酸等のポリハロゲン化カルボン酸の
反応性誘導体類、ジケテン、２−ヒドロキシアセトアル
デヒド、等の物質は、いづれも工業製品として供給され
る。又、本発明の方法において原料として用いられる抗
体に結合されるべきアミノ基反応性官能基を有する化合
物は、架橋剤。

生物活性物質、キレート化剤、放射性物質、螢光物質、
不溶性支持体等広範囲に及ぶが、こ°れらは、すでに有
用な物質として工業的に供給されているか、或いは工業
的に供給され得る物質を抗体のアミノ基と反応して結合
させる目的に好都合であるように加工して本発明の原料
として使用し得るものである。

本発明の方法は、通常下記の３つの段階的反応の）Ｉｉ
！続的操作を経て実施される。すなわち、１）蛋白質ア
ミノ基の可逆的修飾剤による抗体またはそのフラグメン
トのアミノ基の保護反応、２）アミノ基反応性官能基を
有する化合物を一部のアミノ基が保護された抗体または
そのフラグメントに結合し、必要ならば結合した化合物
をさらに加工する反応、３）生成物より可逆的修飾剤残
基と、さらに、アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性
官能基を有する物質が反応しその残基が導入された場合
には必要に応じてかがる残基を、除去する反応である。

第１の反応において用いる蛋白質アミノ基の可逆的修飾
剤の陽は、用いる抗体および／または修飾剤によって異
なり、好ましくは、抗体又はフラグメントに対して１〜
５００倍モルであ゛る。反応は抗体活性並びに蛋白質と
しての特性に障害をおよぼさない緩和な条件下すなわち
、反応液のｐＨは４〜１０の範囲９反応温度は一４°〜
３５℃が好ましい。反応条件としては、用いるアミノ基
の可逆的修飾剤が無水マレイン酸類ではｐＨ８〜１０の
弱アルカリでの反応が好ましく、ポリハロゲン化カルボ
ン酸の反応性誘導体である無水トリフルオロ酢酸ではｐ
Ｈ７〜９が好ましい。また、ジケテン、２−ヒドロキシ
アセトアルデヒド等は１）Ｈ４〜９での反応が好ましい
。反応時間は、通常１０分〜２４時間であるが、３０分
〜５時間で終了することが多い。可逆的修飾剤でアミノ
基を保護した抗体は、一度ｔａｌｔして次の工程で用い
るか、またはその反応溶液のまま次の工程の反応に供さ
れる。後者の操作は、可逆的修飾剤が加水分解されて一
定時間の後には反応系に存在しなくなる場合に好ましく
用いられ、無水マレイン酸類等の酸無水物が一般に該当
する。精製する場合は、例えばセファデックスＧ−２５
を用いる簡単なゲル濾過力ラム操作や、４℃下での透析
等によってこれを成し得る。

アミノ基反応性官能基を有する化合物を一部のアミノ基
が保護された抗体またはそのフラグメントに結合し、必
要ならば結合した化合物をさらに加工する反応について
は、先ずアミノ基反応性官能基を有する化合物の反応に
おいて、反応は抗体に障害を及ぼさない条件下、すなわ
ち、反応のｐＨは４〜１０の範囲１反応温度は一４°〜
３５℃でおこなうのが好ましい。さらに抗体のアミノ基
に結合している修飾剤残基の脱離を促すような条件は好
ましくない、すなわち、無水マレイン酸類。

無水エキソ−シス−３，６−ニンドキソーΔ４−テトラ
ヒドロフタール酸、無水エキソ−シス−３，６−ニンド
キソヘキサヒドロフタール酸等で修飾した抗体への反応
はｐＨ７〜１０の弱アルカリ溶液中で行うのが好ましく
、また、無水テトラフルオロコハク酸、無水トリフルオ
ロ酢酸、ジケテン等で修飾した抗体への反応はｐＨ４〜
８で行うのが好ましい。

抗体に結合した物質にさらに加工を加える場合の反応条
件もまた同様である。この場合、２−ヒドロキシアセト
アルデヒドで修飾した抗体への反応では、いまだアミノ
保護基をそのまま保持する必要がある場合には、過ヨー
ソ酸を用いてはならない。

反応に用いるアミノ基反応性官能基を有する化合物の母
は、化合物の性質により異なるが、モル比で抗体または
そのフラグメントの１〜１００（９が好ましい。化合物
の水溶性が小さい場合は、人望に抗体に結合することに
より抗体が不溶化する場合があり、その様な場合は、反
応に用いる物質量を限定して用いる。ただし、結合する
物質が、例えば不溶性のゲルの様な本来不溶性物質とし
て用いるべき物質の場合はこの限りでない。

アミノ基反応性官能基を有する化合物が、架橋剤の場合
、それらを抗体またはそのフラグメントに結合した後、
かくして抗体またはそのフラグメントに導入された架橋
剤残基に架橋剤反応性官能基を有する化合物を反応させ
て結合する等の加工反応を加えることができるが、その
場合の反応における好ましい反応条件もまた、上と同様
である。

アミノ基よりアミノ基の可逆的修飾剤残基と、さらに、
アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性官能基を有する
物質の残基が導入された場合に必要に応じてかかる残基
を除去する反応は、その前段階の反応後、−たん生成物
を精製した後行なってもよいが、多くの場合精製するこ
となく行うこともできる。精製を加える場合は、ゲル口
過、イオン交換等のカラムクロマドグラフイーや、透析
等を行う。

なお、アミノ基の可逆的修飾剤残基と、アミノ基以外の
官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の残基が導
入された場合であって必要に応じてかかる残基を除去す
る場合、除去の反応に先立って、アミノ基の可逆的修飾
剤が未反応のまま系に残存している場合には、必要に応
じてこれを、例えばリジン、２−アミノエタノール等の
アミノ基を有する化合物で処理して不活化してもよい。

アミノ基の可逆的修飾剤残基を除去する反応と、アミノ
基以外の官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の
残基が導入された場合であって必要に応じてかかる残基
を除去する反応は、どちらを先に行ってもよく、また、
同時に行っても差し支えない。反応によっては、一方を
除去する条件で他方もまたその一部が除去されることも
ある。

次に、抗体のアミノ基より可逆的修飾剤残基を除去する
反応の好ましい条件について述べる。マレイル基、エキ
ソ−シス−３，６−ニンドキソーΔ４−テトラヒドロフ
タリル基、エキソ−シス−３，６−ニンドキソヘキサヒ
ドロフタリル基１等はｐＨ４〜８の弱酸性ないしは中性
付近の条件での処理によって除去するのが好ましい。反
応温度は一４°〜３５℃が好ましく１反応時間は通常０
．５時間〜９６時間である。また、テトラフルオロサク
シニル基、トリフルオロアセチル基、アセトアセチル基
は、ｐＨ８〜１０の弱アルカリ条件下で除去するのが好
ましい。さらに、助剤としてヒドロキシルアミノ、モル
ホリン等の塩基性物質を１０　ｍＭ〜１００１１１Ｍの
濃度で加えて反応を促進させることもできる。反応温度
は一４°〜３５℃が好ましく、反応時間は通常０．５時
間〜９６時間である。また、２−ヒドロキシエチル基は
１〜１０１１Ｍの過日−ソ酸を作用して除去することが
できる。

カルボキシル基の活性化誘導基はアミノ基との反応性が
高いが、セリン、スレオニン、糖鎖の水酸基等とも反応
性を有している。従ってアミノ基反応性官能基を有する
物質がカルボキシル基の活性化誘導基をもつ物質である
場合には、かかる物質を、アミノ基の一部を蛋白質アミ
ノ基の可逆的修飾剤で作為した抗体またはそのフラグメ
ントと反応させた場合、アミノ基反応性官能基を有する
物質は抗体のセリン、スレオニン、糖鎖残基とも反応す
る。本発明の、アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性
官能基を有する物質の残基が導入された場合とは例えば
かかる場合である。アミノ基以外の官能基に導入された
アミノ基反応性官能基を有する物質の残基は、必要に応
じて除去されるが、上に例示した、カルボキシル基の活
性化誘導基が抗体のせリン、スレオニン残基、糖鎖と反
応してアミノ基反応性官能基を有する物質がエステル結
合によって抗体に導入された場合には、かかる残基は、
エステル結合を弱アルカリ性や弱酸性の条件で加水分解
するか、或いは、例えばヒドロキシルアミノ等のアミノ
類を用いて開裂せしめること等により除去することがで
きる。かかるヒドロキシルアミノによる開裂除去反応は
、例えば０〜４０℃で、ｐＨ６〜１０の条件下、０．０
１〜１．０Ｍの濃度のヒドロキシルアミノ処理で行うこ
とができ、所要時間は１時間〜５日間である。なお、本
処理により、可逆性アミノ基修飾剤残基が抗体から１部
又は全部１１脱することがあるので、その様な場合には
、本処理を離脱工程と組み合わせて行なうのが好ましい
。

□以上のごとくにして生成した抗体複合体の精製は、低
分子物質を除くためには透析、ゲル口過。

硫安沈澱法、エタノール沈澱法、アセトン沈澱法等の通
常の方法を用いることができる。また、複合体が不溶性
物質の場合には、単なる濾過、洗浄等の方法を用いるこ
とができる。また、高分子物質の分離は、ゲルＯ過、イ
オン交換クロマトグラフィー、等電点沈澱法等９通常の
方法を用いて行うことができる。

次に本発明をより詳しく説明するために実施例を記載す
るが、本発明はもとよりこれらに限定されるものではな
い。

実施例１　抗体と制癌薬との複合体の製造１−１　　複
合体の製造 抗ヒトメラノーマモノクローナル抗体９６．５の１２、
Ｏ＃１５Ｆを溶解した７０−ＭホスＭ緩衝液（ＤＨ８，
８）の溶液１，７ｄに無水ジメチルマレイン酸の０．２
ＭＤＭＦ溶液２０μ旦を水冷下、撹拌下に加え、３０分
間反応させた。その間、０．ＩＭ　　ＮａＯＨを滴下し
て、反応液１）Ｈを８．５〜９．０に保った。次にメソ
トレキセート（以下ＭＴＸと省略する）のＮ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル（Ｐ。

Ｋｕｌｋａｒｎｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　４１゜２７００−２７０６　（
１９８１）に記載の方法に改良を加えた方法によって合
成した。）の３０．６１１１Ｍ　　ＤＭ　Ｆ溶液５２μ
文を添加して、４時間反応させた。

次に０．１Ｍホウ酸緩衝液（１１Ｈ８，５）に溶解した
０、４Ｍグリシン溶液１２０μ文を加え、反応液を４℃
１時間撹拌して反応を停止し、その後０．１Ｍホウ酸緩
衝波緩衝液中した　１．１Ｍヒト０キシアミノ（ＮＨ２
０８）溶液（ＤＨ９，０）　　１８０μすを加え、４℃
にて３日間静置した。かか−る反応液を０．０２　Ｍリ
ン酸緩衝液−０，１４Ｍ　　ＮａＣオ（ｐＨ７，２）に
対して４℃にて４０時間透析することにより、ジメチル
マレイル基および抗体分子の水酸基に結合したＭＴＸを
脱離せしめ、目的物である複合体の溶液２．２−を得た
。ざらに抗体と無水ジメチルマレイン酸およびＭＴＸ　
　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルとの反応比を
変化させることにより、２種の抗体−ＭＴＸ複合体を作
製した。

これらの反応における抗体と無水ジメチルマレイン酸お
よびＭＴＸ　　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
との反応モル比と得られた複合体の抗体１分子当たりの
ＭＴＸの平均結合分子数との関係を表１に示した。なお
、抗体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数（モル比
）は１−２に述べる方法により求めた。

表　　１ ５０　　　　　　　　　　２０　　　　　　　４．１１
００　　　　　　　　　　４０　　　　　　　５．８２
００　　　　　　　　　　５０　　　　　　　５．０＊
ＭＴＸ　　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル１−
２　　複合体の足間 １−１で得た複合体の溶液一部を用い、２８０ｎａ＋お
よび３７２ｎｍでの吸光（資）を測定して、それぞれの
値より複合体中の抗体蛋白質量およびＭＴＸｆｆｌを求
めた。なお、２８０ｎｍにおけるＭＴＸに由来する吸収
は、ＭＴＸの３７２ｎｍにおける吸収の２．５２倍であ
ることを実験的に求め、複合体の２８０ｎｍでの吸光度
をＭＴＸに由来する吸収で補正して抗体蛋白質量を求め
た。その結果は表１に記載した通りである。

１−３　　抗体のアミノ基の一部を可逆的に修飾剤で保
護することなく抗体とＭＴＸとの複合体を製造する比較
例 ９６．５抗体３．０１ｌＩ！Ｊを溶解した０、１Ｍホウ
酸緩衝液（ｐＨ８，５＞　（７）？ＩＦ液０．３４に：
ＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの３０
．６ｍＭ　　ＤＭＦ溶液（実施例１−１で使用したもの
と同じもの）５μ交を添加して４時間反応させた。次に
０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，５＞に溶解した０、４
Ｍグリシン溶液１２μ旦を加え、反応液を４℃、１時間
撹拌して反応を停止した。その後０．１Ｍホウ酸緩衝波
緩衝液中した１、１Ｍヒドロキシルアミノ溶液（ＤＨ９
，０）　３０μｍを加え、４℃にて３日間静置し、抗体
分子の水酸基に結合したＭＴＸを脱離せしめ、かかる溶
液を０．０２　Ｍリン酸！ｌｌｊ液−〇、１４　Ｍ　　
Ｎａ　Ｃ１（ｐＨ７，２）に対して４℃にて４０時間透
析することにより、目的物である複合体の溶液０．６５
−を得た。複合体の組成は１−２と同じ方法で求めた結
果、抗体１分子に平均ＭＴＸ４６５分子が結合している
ことが判明した。ざらにＭＴＸ　　Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミドエステルの９６．５抗体（３，０１Ｉｙ）へ
の添加口を５μ文から６．５μ文に変化させることによ
り、添加量５μ旦の場合と同様の操作を経て、抗体１分
子に平均ＭＴＸ６，２分子が結合した複合体２．６■を
得た。

１−４　　複合体の抗原への結合活性（抗体活性）の定
ｍ 先ずヒトメラノーマ細胞Ｍ　１４−　Ａ　Ｉ！濁液（１
×１０Ｇ細胞／ｄ）　　Ｏ，ニアｄに、種々の濃度の被
験サンプル０．１ａｉ！を加えて混合し、時々撹拌しな
がら室温で１時間反応させた。さらに、一定＋１ｆ１度
の″ｌ標識９６．５抗体（”’ｌ−９６．５）　　０．
ＩＭｌを添加して混合し、時々撹拌しながら室温で１時
間反応させた。

以上の細胞、試薬類の調整には、１０％正常ウマつ清面
０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食
塩水を用いた。

次に上記食塩水１ｄで３回、細胞を遠心洗浄した後、細
胞に結合した放射活性をγ−スペクトロメーターで測定
した。

ｘｔ こうして、　　■標識９６．５のＭ　１４−　Ａ細胞に
対する結合を複合体が５０％抑制する複合体サンプルの
濃度（ＩＣ５０）を求め、元の９６．５抗体のＩＣａと
の比較から、複合体の抗原結合活性を算出した。

その結果、アミノ基の無水ジメチルマレイン酸による保
護を行なわずに作製した複合体（１−３に記載）の抗原
結合活性は９６．５抗体１分子にＭＴＸを平均４８５分
子結合させた場合に元の抗体の２９％に、抗体１分子に
ＭＴＸを平均６．２分子結合させた場合には１２％に低
下したのに対し、本発明の方法によって抗体１分子にＭ
ＴＸを平均４．１〜５．８分子結合させた場合（１−１
に記載）は抗原結合活性は１００％であり、明らかに本
発明の方法によって製造した複合体の抗原結合活性は従
来法による複合体より高い。

実施例２ 実施例１における９６．５抗体のかわりに、抗ヒトメラ
ノーマモノクローナル抗体Ｚ　Ｍ　Ｅ　０１８を用い、
実施例１−１と同様の操作を施し、抗体−ＭＴＸ複合体
を製造した。すなわち、Ｚ　Ｍ　Ｅ　０１８抗体１２．
７ηを溶解した７０　ｍＭホウ酸緩衝液（＋）Ｈ８，８
）の溶液１．３ｍに無水ジメチルマレイン酸の０，２１
　ＭＤＭＦ溶液４０μ文を水冷下、撹拌下に加え、３０
分間反応させた後、かかる反応液を２本の試験管に等量
ずつ分注し、ＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエ
ステルの３０．６ｍＭ　　ＤＭＦ溶液（実施例１−１で
使用したものと同じもの）を一方の反応液に５５μ文、
他方の反応液に８３μ旦加え各々４時間反応させた。次
に０．１ＭホウＩＩＩ液（ｐＨ８，５）に溶解した０、
４Ｍグリシン溶液１５０μすを各々の反応液に加え、４
℃１時間撹拌して反応を停止し、その後０．１Ｍヒドロ
キシアミノ溶液（＋）Ｈ９，０）　７０μ夏を各々の反
応液に加え２５℃にて２４時間静置した。かかる反応液
を０．０２　Ｍリン酸緩衝液−０，１４Ｍ　　Ｎａ　Ｃ
１（１）ｔ−！　７．２）に対して４℃にて４０時間透
析することにより、ジメチルマレイル基および抗体分子
の水酸基に結合したＭＴＸを脱離せしめ、目的物である
複合体を２種得た。両複合体の抗体１分子当たりのＭＴ
Ｘの平均結合分子数を１−２記載の方法で求めると一方
は４．３個、他方は８．１個であった。これら複合体の
抗体活性は実施例１−４において　ＩＩｅＸ識９６．５
のかわりに″′■標識Ｚ　Ｍ　Ｅ　０１８を用いること
により測定が可能であり、抗体１分子当たりのＭＴＸの
平均結合分子数４．３個の場合には元の抗体の１００％
であり、抗体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数８
．１個の場合には６７％であった。以上より、Ｚ　Ｍ　
Ｅ　０１８抗体の場合にも９６．５抗体の場合と同様に
、本発明の方法によって抗原結合活性を保持した複合体
が製造された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ基を修飾することにより抗原結合活性が低下
   する抗体またはそのフラグメントのアミノ基の一部を蛋
   白質アミノ基の可逆的修飾剤で修飾した後、抗体または
   そのフラグメントにアミノ基反応性官能基を有する物質
   を反応させ、しかる後生成物より蛋白質アミノ基の可逆
   的修飾剤残基と、さらに、アミノ基以外の官能基にアミ
   ノ基反応性官能基を有する物質の残基が導入された場合
   には必要に応じてかかる残基を、除去することを特徴と
   する抗体複合体の製造方法。 ２、抗体がモノクローナル抗体である、特許請求の範囲
   第１項記載の抗体複合体の製造方法。 ３、蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤が無水マレイン酸類
   である、特許請求の範囲第１項または第２項記載の抗体
   複合体の製造方法。 ４、アミノ基反応性官能基を有する物質が生物活性物質
   である、特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記
   載の抗体複合体の製造方法。 ５、生物活性物質がそれ自体で殺細胞効果を示すか、他
   の物質により細胞内に導入された場合に殺細胞効果を示
   す物質である、特許請求の範囲第４項記載の抗体複合体
   の製造方法。 ６、殺細胞効果を示す物質が抗腫瘍性物質である、特許
   請求の範囲第５項記載の抗体複合体の製造方法。 ７、アミノ基反応性官能基を有する物質がキレート化剤
   である、特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記
   載の抗体複合体の製造方法。 ８、アミノ基反応性官能基を有する物質がカルボキシル
   基の活性化誘導基を有する化合物である、特許請求の範
   囲第１項、第２項または第３項記載の抗体複合体の製造
   方法。