JPH064678B2 - 抗体複合体の製造方法 - Google Patents
抗体複合体の製造方法Info
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- JPH064678B2 JPH064678B2 JP62070429A JP7042987A JPH064678B2 JP H064678 B2 JPH064678 B2 JP H064678B2 JP 62070429 A JP62070429 A JP 62070429A JP 7042987 A JP7042987 A JP 7042987A JP H064678 B2 JPH064678 B2 JP H064678B2
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Description
【発明の詳細な説明】 抗原へ特異的に結合する機能をもつ抗体と、各種化合物
とを共有結合で結合した複合体は、多方面に用いられ
る。例えば、特定の抗体の不溶性支持体に結合した複合
体は、アフィニティクロマトグラフィーに使用され、混
合物から特定の物質を分離することを可能にする。又、
生体内の特定の組織，例えば悪性腫瘍に特異性をもつ抗
体に、γ線放出性の放射性同位元素を結合して得られる
複合体は、生体内に投与すると、腫瘍に放射活性を集積
させるので、癌の画像診断に用いることができる。さら
に、抗体に生物活性物質を結合した複合体は、選択性が
高い薬物となり得る。例えば、抗腫瘍抗体と制癌薬ある
いはその他の細胞毒とを結合した複合体は、腫瘍に選択
的に作用する癌治療薬となる。抗体に蛍光物質や酵素を
結合した複合体は、例えば、免役・生化学試薬や診断薬
として用いられる。また将来発生するニーズに対して、
さらに新しい複合体が考察されよう。
とを共有結合で結合した複合体は、多方面に用いられ
る。例えば、特定の抗体の不溶性支持体に結合した複合
体は、アフィニティクロマトグラフィーに使用され、混
合物から特定の物質を分離することを可能にする。又、
生体内の特定の組織，例えば悪性腫瘍に特異性をもつ抗
体に、γ線放出性の放射性同位元素を結合して得られる
複合体は、生体内に投与すると、腫瘍に放射活性を集積
させるので、癌の画像診断に用いることができる。さら
に、抗体に生物活性物質を結合した複合体は、選択性が
高い薬物となり得る。例えば、抗腫瘍抗体と制癌薬ある
いはその他の細胞毒とを結合した複合体は、腫瘍に選択
的に作用する癌治療薬となる。抗体に蛍光物質や酵素を
結合した複合体は、例えば、免役・生化学試薬や診断薬
として用いられる。また将来発生するニーズに対して、
さらに新しい複合体が考察されよう。
これらの複合体の製造方法に共通する要件は、必要とす
る物質を抗体に満足に結合できる製造方法であると同時
に、抗体が元来持っている機能である抗原に特異的に結
合する特性を損わない製造方法であることである。
る物質を抗体に満足に結合できる製造方法であると同時
に、抗体が元来持っている機能である抗原に特異的に結
合する特性を損わない製造方法であることである。
抗体に物質を結合させる場合に最も一般的に使われる方
法に、物質を抗体を構成するアミノ酸が含有するアミノ
基（リジンやＮ−末端アミノ酸が含有する）や、カルボ
キシル基（グルタミン酸やアスパラギン酸が含有する）
に結合する方法があり、なかでも、アミノ基に結合する
方法は、特に多用されている。例えば、アフィニティク
ロマトグラフィーによる特定物質の分離精製のために供
される抗体と不溶性支持体との複合体は、支持体にアミ
ノ基との反応性基、即ちエポキシ基，カルボン酸活性エ
ステル基，酸アジド基，ブロモアセチル基，臭化シアン
活性化基等の反応性基を導入し、次いで抗体をそのアミ
ノ基で反応させて、支持体に結合する方法によって製造
されている（山崎誠，石井信一，岩井浩一編，「アフィ
ニティクロマトグラフィー」講談社，1975年，第19頁〜
32頁参照）。また、抗体に放射性物質を結合させた複合
体は、放射性ヨード元素の導入試薬であるボルトン・ハ
ンター試薬と抗体との反応で例示されるように、カルボ
ン酸の活性エステルを含有した化合物と抗体のアミノ基
との反応で製造されたり（Ａ．Ｅ．Ｂolton and Ｗ．
Ｍ．Ｈunter，Ｂiochem.Ｊ．１３３，529-539(1973)参
照），またジエチレントリアミンペンタアセチック ア
シッド（ＤＴＰＡと省略する）で例示されるタイプのキ
レート化剤を、その含有するカルボキシル基で抗体のア
ミノ基に結合した上で、Ｉｎで例示される放射性金属
をキレート化剤に結合する方法で製造される（Ｂ．Ａ．
Ｋhaw,Ｊ．Ｔ．Ｆallon，Ｈ．Ｗ．Ｓtrauss，Ｅ．Ｈabe
r，Ｓcience，２０９，295参照）。また抗体と生物活性
物質の複合体の製造においても、例えば制癌薬メソトレ
キセートの結合方法（Ｐ．Ｎ．Ｋulkarni，Ａ．Ｈ．Ｂl
air，Ｔ．Ｉ．Ｇhose，Ｃancer Ｒesearch，４１，270
0〜2706(1981)参照）で例示されるごとく、生物活性物
質の含有するカルボキシル基で抗体のアミノ基に結合し
て製造され、また例えば細胞毒リシンのＡ鎖の結合方法
（Ｋ．Ａ．Ｋrolick，Ｃ．Ｖillemez，Ｐ．Ｉsakson，
Ｊ．Ｗ．Ｕhr.and Ｅ．Ｓ．Ｖitetta，Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ．，７７，5419-5423(1980)参照）
で例示されるごとく、先ず架橋剤、例えば活性ジスルフ
ィド基導入用の架橋剤Ｎ−サクシンイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート，を抗体のアミノ基に
反応させて導入し、かくして導入された活性ジスルフィ
ド基にリシンＡ鎖が含有するチオール基を反応させて、
新たなジスルフィド結合を形成させることにより、抗体
・リシンＡ鎖複合体が製造されている。
法に、物質を抗体を構成するアミノ酸が含有するアミノ
基（リジンやＮ−末端アミノ酸が含有する）や、カルボ
キシル基（グルタミン酸やアスパラギン酸が含有する）
に結合する方法があり、なかでも、アミノ基に結合する
方法は、特に多用されている。例えば、アフィニティク
ロマトグラフィーによる特定物質の分離精製のために供
される抗体と不溶性支持体との複合体は、支持体にアミ
ノ基との反応性基、即ちエポキシ基，カルボン酸活性エ
ステル基，酸アジド基，ブロモアセチル基，臭化シアン
活性化基等の反応性基を導入し、次いで抗体をそのアミ
ノ基で反応させて、支持体に結合する方法によって製造
されている（山崎誠，石井信一，岩井浩一編，「アフィ
ニティクロマトグラフィー」講談社，1975年，第19頁〜
32頁参照）。また、抗体に放射性物質を結合させた複合
体は、放射性ヨード元素の導入試薬であるボルトン・ハ
ンター試薬と抗体との反応で例示されるように、カルボ
ン酸の活性エステルを含有した化合物と抗体のアミノ基
との反応で製造されたり（Ａ．Ｅ．Ｂolton and Ｗ．
Ｍ．Ｈunter，Ｂiochem.Ｊ．１３３，529-539(1973)参
照），またジエチレントリアミンペンタアセチック ア
シッド（ＤＴＰＡと省略する）で例示されるタイプのキ
レート化剤を、その含有するカルボキシル基で抗体のア
ミノ基に結合した上で、Ｉｎで例示される放射性金属
をキレート化剤に結合する方法で製造される（Ｂ．Ａ．
Ｋhaw,Ｊ．Ｔ．Ｆallon，Ｈ．Ｗ．Ｓtrauss，Ｅ．Ｈabe
r，Ｓcience，２０９，295参照）。また抗体と生物活性
物質の複合体の製造においても、例えば制癌薬メソトレ
キセートの結合方法（Ｐ．Ｎ．Ｋulkarni，Ａ．Ｈ．Ｂl
air，Ｔ．Ｉ．Ｇhose，Ｃancer Ｒesearch，４１，270
0〜2706(1981)参照）で例示されるごとく、生物活性物
質の含有するカルボキシル基で抗体のアミノ基に結合し
て製造され、また例えば細胞毒リシンのＡ鎖の結合方法
（Ｋ．Ａ．Ｋrolick，Ｃ．Ｖillemez，Ｐ．Ｉsakson，
Ｊ．Ｗ．Ｕhr.and Ｅ．Ｓ．Ｖitetta，Ｐroc．Ｎatl．
Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ．，７７，5419-5423(1980)参照）
で例示されるごとく、先ず架橋剤、例えば活性ジスルフ
ィド基導入用の架橋剤Ｎ−サクシンイミジル３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート，を抗体のアミノ基に
反応させて導入し、かくして導入された活性ジスルフィ
ド基にリシンＡ鎖が含有するチオール基を反応させて、
新たなジスルフィド結合を形成させることにより、抗体
・リシンＡ鎖複合体が製造されている。
しかしながら、抗体のアミノ基への反応による、従来用
いられている各種複合体製造方法は、それらに共通する
欠点をもつ。それは、抗体蛋白質に存在する多数のアミ
ノ基の内１個〜数個に物質を結合する場合、それらのア
ミノ基は、それらが抗体の抗原への結合活性に関与して
いるといないとにかかわらず、無差別に物質の結合に供
される、という事実である。従って、抗原への結合に関
与するアミノ基が化学反応に供されやすい場合には特に
それらのアミノ基が修飾を受け、その結果、得られた複
合体の抗原結合活性が著しく低下する。例えば、メラノ
ーマの細胞膜が有する高分子抗原に対する単クローン抗
体225.28Ｓにキレート剤ＤＴＰＡの分子内酸無水物を当
モル反応させて得られた複合体の抗体活性は、元の抗体
の約1/2に低下した（Ｒ．Ａ．Ｆawwaz，Ｔ．Ｓ．Ｔ．Ｗ
ang，Ａ．Ｅstabrook，Ｊ．Ｍ．Ｒosen，Ｍ．Ａ．Ｈard
y，Ｐ．Ｏ．Ａlderson，Ｓ．Ｃ．Ｓrivastava，Ｐ．Ｒi
chards，and Ｓ．Ｆerrone，Ｊ．Ｎuclear Ｍedicin
e，２６，488-492(1985)）。
いられている各種複合体製造方法は、それらに共通する
欠点をもつ。それは、抗体蛋白質に存在する多数のアミ
ノ基の内１個〜数個に物質を結合する場合、それらのア
ミノ基は、それらが抗体の抗原への結合活性に関与して
いるといないとにかかわらず、無差別に物質の結合に供
される、という事実である。従って、抗原への結合に関
与するアミノ基が化学反応に供されやすい場合には特に
それらのアミノ基が修飾を受け、その結果、得られた複
合体の抗原結合活性が著しく低下する。例えば、メラノ
ーマの細胞膜が有する高分子抗原に対する単クローン抗
体225.28Ｓにキレート剤ＤＴＰＡの分子内酸無水物を当
モル反応させて得られた複合体の抗体活性は、元の抗体
の約1/2に低下した（Ｒ．Ａ．Ｆawwaz，Ｔ．Ｓ．Ｔ．Ｗ
ang，Ａ．Ｅstabrook，Ｊ．Ｍ．Ｒosen，Ｍ．Ａ．Ｈard
y，Ｐ．Ｏ．Ａlderson，Ｓ．Ｃ．Ｓrivastava，Ｐ．Ｒi
chards，and Ｓ．Ｆerrone，Ｊ．Ｎuclear Ｍedicin
e，２６，488-492(1985)）。
本発明者らは、従来の方法では避けがたいかかる不都合
をきたす事なく、物質をアミノ基に結合する目的で広く
一般的に用いることができる抗体−物質複合体製造方法
を開発すべく鋭意研究した結果、抗体またはそのフラグ
メントのアミノ基に所望の物質や置換基を導入するに際
し、抗体が抗原に結合する活性に関与するアミノ基を含
む１乃至複数のアミノ基を可逆的修飾剤を用いて保護す
ることを基本とする、抗体複合体の製造方法を考案し、
しかして得られた複合体は、従来法で製造する場合には
複合体の抗体活性が低下する場合、抗体活性を充分保持
していることを知見して、本発明に到った。
をきたす事なく、物質をアミノ基に結合する目的で広く
一般的に用いることができる抗体−物質複合体製造方法
を開発すべく鋭意研究した結果、抗体またはそのフラグ
メントのアミノ基に所望の物質や置換基を導入するに際
し、抗体が抗原に結合する活性に関与するアミノ基を含
む１乃至複数のアミノ基を可逆的修飾剤を用いて保護す
ることを基本とする、抗体複合体の製造方法を考案し、
しかして得られた複合体は、従来法で製造する場合には
複合体の抗体活性が低下する場合、抗体活性を充分保持
していることを知見して、本発明に到った。
すなわち本発明は、アミノ基を修飾することにより抗原
結合活性が低下する抗体またはそのフラグメントのアミ
ノ基の一部を蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤で修飾した
後、抗体またはそのフラグメントにアミノ基反応性官能
基を有す物質を反応させ、しかる後、生成物より蛋白質
アミノ基の可逆的修飾剤残基と、さらに、アミノ基以外
の官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の残基が
導入された場合には必要に応じてかかる残基を、除去す
ることを特徴とする抗体複合体の製造方法である。
結合活性が低下する抗体またはそのフラグメントのアミ
ノ基の一部を蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤で修飾した
後、抗体またはそのフラグメントにアミノ基反応性官能
基を有す物質を反応させ、しかる後、生成物より蛋白質
アミノ基の可逆的修飾剤残基と、さらに、アミノ基以外
の官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の残基が
導入された場合には必要に応じてかかる残基を、除去す
ることを特徴とする抗体複合体の製造方法である。
本発明において、アミノ基を修飾することにより抗原結
合活性が低下する抗体は、その特異性については、いか
なる抗原やハプテンに対する抗体でもよい。すなわち、
例えば、癌、細菌、ウィルス、カビ、マイコプラズマ、
寄生虫に対する抗体，病原性物質，腫瘍関連物質に対す
る抗体，腫瘍関連抗原，細胞の分化抗原，組織適合性抗
原，その他の細胞膜抗原に対する抗体，毒素，酵素，ア
レルゲン，ホルモン，薬物，その他の生物活性物質に対
する抗体等を用いることができる。また本発明におい
て、抗体は、例えば、動物を抗原やハプテンで免疫して
作るポリクローナル抗体でも、あるいは、細胞融合や、
ＥＢウィルスを用いる抗体産生細胞の形質転換法等によ
って作られるモノクローナル抗体でもよい。モノクロー
ナル抗体は、細胞融合法やウィルス形質転換法により、
さまざまな抗原に対し特異性の明確な高純度の抗体を多
量に得ることができるという利点を有する。
合活性が低下する抗体は、その特異性については、いか
なる抗原やハプテンに対する抗体でもよい。すなわち、
例えば、癌、細菌、ウィルス、カビ、マイコプラズマ、
寄生虫に対する抗体，病原性物質，腫瘍関連物質に対す
る抗体，腫瘍関連抗原，細胞の分化抗原，組織適合性抗
原，その他の細胞膜抗原に対する抗体，毒素，酵素，ア
レルゲン，ホルモン，薬物，その他の生物活性物質に対
する抗体等を用いることができる。また本発明におい
て、抗体は、例えば、動物を抗原やハプテンで免疫して
作るポリクローナル抗体でも、あるいは、細胞融合や、
ＥＢウィルスを用いる抗体産生細胞の形質転換法等によ
って作られるモノクローナル抗体でもよい。モノクロー
ナル抗体は、細胞融合法やウィルス形質転換法により、
さまざまな抗原に対し特異性の明確な高純度の抗体を多
量に得ることができるという利点を有する。
また、本発明方法はいかなるクラス，サブクラスの抗体
にも適用することができる。すなわち、抗体にはＩｇ
Ｇ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤおよびＩｇＥのクラスが知
られており、さらにＩｇＧにはＩｇＧ１，ＩｇＧ2a，Ｉ
ｇＧ2b，ＩｇＧ３のサブクラスが、ＩｇＡにはＩｇＡ
１，ＩｇＡ２のサブクラスが、ＩｇＭにはＩｇＭ１，Ｉ
ｇＭ２のサブクラスがあるが、これらのどのクラス，サ
ブクラスの抗体であっても本発明の抗体として用いるこ
とができる。抗体は分子全体を用いてもよいが、その抗
原結合部分を含むフラグメントを用いることができる。
かかるフラグメントとしては、例えばＩｇＭ抗体の単量
体ＩｇＭｓやＩｇＡの単量体，抗体分子をペプシンで分
解することによって得られる２価のフラグメントＦ（ａ
ｂ′）2，パパインで分解することによって得られる１
価のフラグメントＦab等を挙げることができる。
にも適用することができる。すなわち、抗体にはＩｇ
Ｇ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤおよびＩｇＥのクラスが知
られており、さらにＩｇＧにはＩｇＧ１，ＩｇＧ2a，Ｉ
ｇＧ2b，ＩｇＧ３のサブクラスが、ＩｇＡにはＩｇＡ
１，ＩｇＡ２のサブクラスが、ＩｇＭにはＩｇＭ１，Ｉ
ｇＭ２のサブクラスがあるが、これらのどのクラス，サ
ブクラスの抗体であっても本発明の抗体として用いるこ
とができる。抗体は分子全体を用いてもよいが、その抗
原結合部分を含むフラグメントを用いることができる。
かかるフラグメントとしては、例えばＩｇＭ抗体の単量
体ＩｇＭｓやＩｇＡの単量体，抗体分子をペプシンで分
解することによって得られる２価のフラグメントＦ（ａ
ｂ′）2，パパインで分解することによって得られる１
価のフラグメントＦab等を挙げることができる。
本発明において、蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤とは、
抗体またはそのフラグメントの抗原との結合に深くかか
わっているアミノ基を化学的に修飾し（可逆的修飾剤残
基の共有結合）、その後、抗体またはそのフラグメント
にアミノ基反応性官能基を有する物質を反応させ、しか
る後、生成物より直ちにか、あるいは生成物をさらに化
学反応に付した後にその生成物より、その（可逆的修飾
剤）残基を除去しアミノ基を再生し得る化合物であれば
いかなるものでもよい。かかる蛋白質アミノ基の可逆的
修飾剤としては、例えば、無水マレイ酸類，無水コハク
酸類，ポリハロゲン化カルボン酸の反応性誘導体、ジケ
テン，２−ヒドロキシアセトアルデヒドがあり、具体例
としては、例えば、無水マレイン酸類では、無水マレイ
ン酸 無水シトラコン酸 無水2,3−ジメチルマレイン酸 無水シスアコニチン酸 を，無水コハク酸類では、無水テトラフルオロコハク酸 無水エキソーシス−3,6−エンドキソ−△4−テトラヒド
ロフタール酸 無水エキソーシス−3,6−エンドキソヘキサヒドロフタ
ール酸 を，ポリハロゲン化カルボン酸の反応性誘導体として
は、無水トリフルオロ酢酸を挙げることができる。
抗体またはそのフラグメントの抗原との結合に深くかか
わっているアミノ基を化学的に修飾し（可逆的修飾剤残
基の共有結合）、その後、抗体またはそのフラグメント
にアミノ基反応性官能基を有する物質を反応させ、しか
る後、生成物より直ちにか、あるいは生成物をさらに化
学反応に付した後にその生成物より、その（可逆的修飾
剤）残基を除去しアミノ基を再生し得る化合物であれば
いかなるものでもよい。かかる蛋白質アミノ基の可逆的
修飾剤としては、例えば、無水マレイ酸類，無水コハク
酸類，ポリハロゲン化カルボン酸の反応性誘導体、ジケ
テン，２−ヒドロキシアセトアルデヒドがあり、具体例
としては、例えば、無水マレイン酸類では、無水マレイ
ン酸 無水シトラコン酸 無水2,3−ジメチルマレイン酸 無水シスアコニチン酸 を，無水コハク酸類では、無水テトラフルオロコハク酸 無水エキソーシス−3,6−エンドキソ−△4−テトラヒド
ロフタール酸 無水エキソーシス−3,6−エンドキソヘキサヒドロフタ
ール酸 を，ポリハロゲン化カルボン酸の反応性誘導体として
は、無水トリフルオロ酢酸を挙げることができる。
本発明方法において、アミノ基反応性官能基を有する物
質とは、抗体またはそのフラグメントに抗原結合活性を
損わずに導入することが必要であってしかもアミノ基反
応性官能基を有する物質であればいかなる物質でもよ
く、広範囲に及ぶが、その例として、架橋剤，生物活性
物質，キレート化剤，放射性物質，蛍光物質，不溶性支
持体等を挙げることができる。
質とは、抗体またはそのフラグメントに抗原結合活性を
損わずに導入することが必要であってしかもアミノ基反
応性官能基を有する物質であればいかなる物質でもよ
く、広範囲に及ぶが、その例として、架橋剤，生物活性
物質，キレート化剤，放射性物質，蛍光物質，不溶性支
持体等を挙げることができる。
本発明方法におけるアミノ基反応性官能基を有する物質
としての生物活性物質には、細胞毒性物質，抗腫瘍性物
質，抗菌性物質，抗ウィルス性物質，抗カビ性物質，抗
マイコプラズマ性物質，抗寄生虫性物質，ホルモン，酵
素等が含まれる。ここで、細胞毒性物質とは、それ自体
で殺細胞効果を示すか、他の物質により細胞内に導入さ
れた場合に殺細胞効果を示す物質を意味し、α線または
β線放出性放射性同位元素とキレート結合をしたキレー
ト化剤や、抗腫瘍性物質，毒素またはその酵素活性を有
するフラグメント等である。
としての生物活性物質には、細胞毒性物質，抗腫瘍性物
質，抗菌性物質，抗ウィルス性物質，抗カビ性物質，抗
マイコプラズマ性物質，抗寄生虫性物質，ホルモン，酵
素等が含まれる。ここで、細胞毒性物質とは、それ自体
で殺細胞効果を示すか、他の物質により細胞内に導入さ
れた場合に殺細胞効果を示す物質を意味し、α線または
β線放出性放射性同位元素とキレート結合をしたキレー
ト化剤や、抗腫瘍性物質，毒素またはその酵素活性を有
するフラグメント等である。
かかるアミノ基反応性官能基を有する物質としては、ア
ミノ基反応性官能基としてカルボキシル基の活性化誘導
基を有する物質が特に望ましく、その具体例としては、
例えば抗腫瘍性物質では、以下の化学式で表わされる化
合物のカルボキシル基の活性化誘導体を挙げることがで
きる。
ミノ基反応性官能基としてカルボキシル基の活性化誘導
基を有する物質が特に望ましく、その具体例としては、
例えば抗腫瘍性物質では、以下の化学式で表わされる化
合物のカルボキシル基の活性化誘導体を挙げることがで
きる。
ニトロソウレア誘導体 クロラムブシル メソトレキセート マイトマイシンＣ誘導体 アクチノマイシン−Ｄオキサジノン誘導体 ビンブラスチン誘導体 また、キレート化剤では、以下の化学式で表わされる化
合物のカルボキシル基の活性化誘導体を挙げることがで
きる。
合物のカルボキシル基の活性化誘導体を挙げることがで
きる。
ジエチレントリアミンペンタ酢酸 トリス（カルボキシメチル）アミン かかるカルボキシル基の活性化誘導基には、活性エステ
ル基，活性アミド基，酸アジド基，酸無水基等があり、
活性エステル基を形成するアルコール残基の具体例とし
ては、2,4−ジニトロフェノキシ基 Ｎ−サクシンイミジルオキシ基 Ｎ−５−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミジルオ
キシ基 等を、活性アミド基を形成するアミン残基の具体例とし
ては、Ｎ−イミダゾリル基 等を挙げることができる。酸無水物基は、別の酸との混
合酸無水物でもよく、また、分子内の適当な位置に２個
のカルボキシル基を有する化合物ではそれらのカルボキ
シル基が結合した分子内酸無水物基でもよい。これらの
酸無水物基を、以下にキレート化剤の酸無水物について
例示する。
ル基，活性アミド基，酸アジド基，酸無水基等があり、
活性エステル基を形成するアルコール残基の具体例とし
ては、2,4−ジニトロフェノキシ基 Ｎ−サクシンイミジルオキシ基 Ｎ−５−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミジルオ
キシ基 等を、活性アミド基を形成するアミン残基の具体例とし
ては、Ｎ−イミダゾリル基 等を挙げることができる。酸無水物基は、別の酸との混
合酸無水物でもよく、また、分子内の適当な位置に２個
のカルボキシル基を有する化合物ではそれらのカルボキ
シル基が結合した分子内酸無水物基でもよい。これらの
酸無水物基を、以下にキレート化剤の酸無水物について
例示する。
ジエチレントリアミンペンタ酢酸誘導体 2,6−ジオキソ−Ｎ−（カルボキシメチル）−モルホリ
ン なお、カルボキシル基は、例えばジシクロヘキシルカル
ボジイミド等の縮合剤を用いて、アミノ基と縮合しアミ
ド結合を形成し得るので、例えば上に例示したカルボキ
シル基を有する化合物はそれ自体で本発明のアミノ基反
応性官能基を有する物質であるが、カルボキシル基を有
する化合物が例えば縮合剤のジシクロヘキシルカルボジ
イミドと反応してできる反応性中間体（カルボキシル基
を有する化合物を で示せば、 で表わされる）等もまた、本発明で言うカルボキシル基
の活性化誘導基を有する化合物に含まれる。
ン なお、カルボキシル基は、例えばジシクロヘキシルカル
ボジイミド等の縮合剤を用いて、アミノ基と縮合しアミ
ド結合を形成し得るので、例えば上に例示したカルボキ
シル基を有する化合物はそれ自体で本発明のアミノ基反
応性官能基を有する物質であるが、カルボキシル基を有
する化合物が例えば縮合剤のジシクロヘキシルカルボジ
イミドと反応してできる反応性中間体（カルボキシル基
を有する化合物を で示せば、 で表わされる）等もまた、本発明で言うカルボキシル基
の活性化誘導基を有する化合物に含まれる。
本発明の方法において原料として用いられる蛋白質アミ
ノ基の可逆的修飾剤である、無水マレイン酸，無水シト
ラコン酸，無水2,3−ジメチルマレイン酸，無水シスア
コニチン酸等の無水マレイン酸類，無水テトラフルオロ
コハク酸，無水エキソ−シス−3,6−エンドキソ−△4−
テトラヒドロフタール酸，無水エキソ−シス−3,6−エ
ンドキソヘキサヒドロフタール酸等の無水コハク酸類，
無水トリフルオロ酢酸等のポリハロゲン化カルボン酸の
反応性誘導体類，ジケテン，２−ヒドロキシアセトアル
デヒド，等の物質は、いづれも工業製品として供給され
る。又、本発明の方法において原料として用いられる抗
体に結合されるべきアミノ基反応性官能基を有する化合
物は、架橋剤，生物活性物質，キレート化剤，放射性物
質，蛍光物質，不溶性支持体等広範囲に及ぶが、これら
は、すでに有用な物質として工業的に供給されている
か、或いは工業的に供給され得る物質を抗体のアミノ基
と反応して結合させる目的に好都合であるように加工し
て本発明の原料として使用し得るものである。
ノ基の可逆的修飾剤である、無水マレイン酸，無水シト
ラコン酸，無水2,3−ジメチルマレイン酸，無水シスア
コニチン酸等の無水マレイン酸類，無水テトラフルオロ
コハク酸，無水エキソ−シス−3,6−エンドキソ−△4−
テトラヒドロフタール酸，無水エキソ−シス−3,6−エ
ンドキソヘキサヒドロフタール酸等の無水コハク酸類，
無水トリフルオロ酢酸等のポリハロゲン化カルボン酸の
反応性誘導体類，ジケテン，２−ヒドロキシアセトアル
デヒド，等の物質は、いづれも工業製品として供給され
る。又、本発明の方法において原料として用いられる抗
体に結合されるべきアミノ基反応性官能基を有する化合
物は、架橋剤，生物活性物質，キレート化剤，放射性物
質，蛍光物質，不溶性支持体等広範囲に及ぶが、これら
は、すでに有用な物質として工業的に供給されている
か、或いは工業的に供給され得る物質を抗体のアミノ基
と反応して結合させる目的に好都合であるように加工し
て本発明の原料として使用し得るものである。
本発明の方法は、通常下記の３つの段階的反応の連続的
操作を経て実施される。すなわち、１）蛋白質アミノ基
の可逆的修飾剤による抗体またはそのフラグメントのア
ミノ基の保護反応，２）アミノ基反応性官能基を有する
化合物を一部のアミノ基が保護された抗体またはそのフ
ラグメントに結合し、必要ならば結合した化合物をさら
に加工する反応，３）生成物より可逆的修飾剤残基と、
さらに、アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性官能基
を有する物質が反応しその残基が導入された場合には必
要に応じてかかる残基を、除去する反応である。第１の
反応において用いる蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤の量
は、用いる抗体および／または修飾剤によって異なり、
好ましくは、抗体又はフラグメントに対して１〜500倍
モルである。反応は抗体活性並びに蛋白質としての特性
に障害をおよぼさない緩和な条件下すなわち、反応液の
pHは４〜10の範囲，反応温度は−４°〜35℃が好まし
い。反応条件としては、用いるアミノ基の可逆的修飾剤
が無水マレイン酸類ではpH８〜10の弱アルカリでの反応
が好ましく、ポリハロゲン化カルボン酸の反応性誘導体
である無水トリフルオロ酢酸ではpH７〜９が好ましい。
また、ジケテン，２−ヒドロキシアセトアルデヒド等は
pH４〜９での反応が好ましい。反応時間は、通常10分〜
24時間であるが、30分〜５時間で終了することが多い。
可逆的修飾剤でアミノ基を保護した抗体は、一度精製し
て次の工程で用いるか、またはその反応溶液のまま次の
工程の反応に供される。後者の操作は、可逆的修飾剤が
加水分解されて一定時間の後には反応系に存在しなくな
る場合に好ましく用いられ、無水マレイン酸類等の酸無
水物が一般に該当する。精製する場合は、例えばセファ
デックスＧ−25を用いる簡単なゲル濾過カラム操作や、
４℃下での透析等によってこれを成し得る。
操作を経て実施される。すなわち、１）蛋白質アミノ基
の可逆的修飾剤による抗体またはそのフラグメントのア
ミノ基の保護反応，２）アミノ基反応性官能基を有する
化合物を一部のアミノ基が保護された抗体またはそのフ
ラグメントに結合し、必要ならば結合した化合物をさら
に加工する反応，３）生成物より可逆的修飾剤残基と、
さらに、アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性官能基
を有する物質が反応しその残基が導入された場合には必
要に応じてかかる残基を、除去する反応である。第１の
反応において用いる蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤の量
は、用いる抗体および／または修飾剤によって異なり、
好ましくは、抗体又はフラグメントに対して１〜500倍
モルである。反応は抗体活性並びに蛋白質としての特性
に障害をおよぼさない緩和な条件下すなわち、反応液の
pHは４〜10の範囲，反応温度は−４°〜35℃が好まし
い。反応条件としては、用いるアミノ基の可逆的修飾剤
が無水マレイン酸類ではpH８〜10の弱アルカリでの反応
が好ましく、ポリハロゲン化カルボン酸の反応性誘導体
である無水トリフルオロ酢酸ではpH７〜９が好ましい。
また、ジケテン，２−ヒドロキシアセトアルデヒド等は
pH４〜９での反応が好ましい。反応時間は、通常10分〜
24時間であるが、30分〜５時間で終了することが多い。
可逆的修飾剤でアミノ基を保護した抗体は、一度精製し
て次の工程で用いるか、またはその反応溶液のまま次の
工程の反応に供される。後者の操作は、可逆的修飾剤が
加水分解されて一定時間の後には反応系に存在しなくな
る場合に好ましく用いられ、無水マレイン酸類等の酸無
水物が一般に該当する。精製する場合は、例えばセファ
デックスＧ−25を用いる簡単なゲル濾過カラム操作や、
４℃下での透析等によってこれを成し得る。
アミノ基反応性官能基を有する化合物を一部のアミノ基
が保護された抗体またはそのフラグメントに結合し、必
要ならば結合した化合物をさらに加工する反応について
は、先ずアミノ基反応性官能基を有する化合物の反応に
おいて、反応は抗体に障害を及ぼさない条件下、すなわ
ち、反応のpHは４〜10の範囲，反応温度は−４°〜35℃
でおこなうのが好ましい。さらに抗体のアミノ基に結合
している修飾剤残基の脱離を促すような条件は好ましく
ない、すなわち、無水マレイン酸類，無水エキソ−シス
−3,6−エンドキソ−△4−テトラヒドロフタール酸，無
水エキソ−シス−3,6−エンドキソヘキサヒドロフター
ル酸等で修飾した抗体への反応はpH７〜10の弱アルカリ
溶液中で行うのが好ましく、また、無水テトラフルオロ
コハク酸，無水トリフルオロ酢酸、ジケテン等で修飾し
た抗体への反応はpH４〜８で行うのが好ましい。
が保護された抗体またはそのフラグメントに結合し、必
要ならば結合した化合物をさらに加工する反応について
は、先ずアミノ基反応性官能基を有する化合物の反応に
おいて、反応は抗体に障害を及ぼさない条件下、すなわ
ち、反応のpHは４〜10の範囲，反応温度は−４°〜35℃
でおこなうのが好ましい。さらに抗体のアミノ基に結合
している修飾剤残基の脱離を促すような条件は好ましく
ない、すなわち、無水マレイン酸類，無水エキソ−シス
−3,6−エンドキソ−△4−テトラヒドロフタール酸，無
水エキソ−シス−3,6−エンドキソヘキサヒドロフター
ル酸等で修飾した抗体への反応はpH７〜10の弱アルカリ
溶液中で行うのが好ましく、また、無水テトラフルオロ
コハク酸，無水トリフルオロ酢酸、ジケテン等で修飾し
た抗体への反応はpH４〜８で行うのが好ましい。
抗体に結合した物質にさらに加工を加える場合の反応条
件もまた同様である。この場合、２−ヒドロキシアセト
アルデヒドで修飾した抗体への反応では、いまだアミノ
保護基をそのまま保持する必要がある場合には、過ヨー
ソ酸を用いてはならない。
件もまた同様である。この場合、２−ヒドロキシアセト
アルデヒドで修飾した抗体への反応では、いまだアミノ
保護基をそのまま保持する必要がある場合には、過ヨー
ソ酸を用いてはならない。
反応に用いるアミノ基反応性官能基を有する化合物の量
は、化合物の性質により異なるが、モル比で抗体または
そのフラグメントの１〜100倍が好ましい。化合物の水
溶性が小さい場合は、大量に抗体に結合することにより
抗体が不溶化する場合があり、その様な場合は、反応に
用いる物質量を限定して用いる。ただし、結合する物質
が、例えば不溶性のゲルの様な本来不溶性物質として用
いるべき物質の場合はこの限りでない。
は、化合物の性質により異なるが、モル比で抗体または
そのフラグメントの１〜100倍が好ましい。化合物の水
溶性が小さい場合は、大量に抗体に結合することにより
抗体が不溶化する場合があり、その様な場合は、反応に
用いる物質量を限定して用いる。ただし、結合する物質
が、例えば不溶性のゲルの様な本来不溶性物質として用
いるべき物質の場合はこの限りでない。
アミノ基反応性官能基を有する化合物が、架橋剤の場
合、それらを抗体またはそのフラグメントに結合した
後、かくして抗体またはそのフラグメントに導入された
架橋剤残基に架橋剤反応性官能基を有する化合物を反応
させて結合する等の加工反応を加えることができるが、
その場合の反応における好ましい反応条件もまた、上と
同様である。
合、それらを抗体またはそのフラグメントに結合した
後、かくして抗体またはそのフラグメントに導入された
架橋剤残基に架橋剤反応性官能基を有する化合物を反応
させて結合する等の加工反応を加えることができるが、
その場合の反応における好ましい反応条件もまた、上と
同様である。
アミノ基よりアミノ基の可逆的修飾剤残基と、さらに、
アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性官能基を有する
物質の残基が導入された場合に必要に応じてかかる残基
を除去する反応は、その前段階の反応後、一たん生成物
を精製した後行なってもよいが、多くの場合精製するこ
となく行うこともできる。精製を加える場合は、ゲル口
過，イオン交換等のカラムクロマトグラフィーや、透析
等を行う。
アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性官能基を有する
物質の残基が導入された場合に必要に応じてかかる残基
を除去する反応は、その前段階の反応後、一たん生成物
を精製した後行なってもよいが、多くの場合精製するこ
となく行うこともできる。精製を加える場合は、ゲル口
過，イオン交換等のカラムクロマトグラフィーや、透析
等を行う。
なお、アミノ基の可逆的修飾剤残基と、アミノ基以外の
官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の残基が導
入された場合であって必要に応じてかかる残基を除去す
る場合、除去の反応に先立って、アミノ基の可逆的修飾
剤が未反応のまま系に残存している場合には、必要に応
じてこれを、例えばリジン，２−アミノエタノール等の
アミノ基を有する化合物で処理して不活化してもよい。
官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の残基が導
入された場合であって必要に応じてかかる残基を除去す
る場合、除去の反応に先立って、アミノ基の可逆的修飾
剤が未反応のまま系に残存している場合には、必要に応
じてこれを、例えばリジン，２−アミノエタノール等の
アミノ基を有する化合物で処理して不活化してもよい。
アミノ基の可逆的修飾剤残基を除去する反応と、アミノ
基以外の官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の
残基が導入された場合であって必要に応じてかかる残基
を除去する反応は、どちらを先に行ってもよく、また、
同時に行っても差し支えない。反応によっては、一方を
除去する条件で他方もまたその一部が除去されることも
ある。
基以外の官能基にアミノ基反応性官能基を有する物質の
残基が導入された場合であって必要に応じてかかる残基
を除去する反応は、どちらを先に行ってもよく、また、
同時に行っても差し支えない。反応によっては、一方を
除去する条件で他方もまたその一部が除去されることも
ある。
次に、抗体のアミノ基より可逆的修飾剤残基を除去する
反応の好ましい条件について述べる。マレイル基，エキ
ソ−シス−3,6−エンドキソ−△4−テトラヒドロフタリ
ル基，エキソ−シス−3,6−エンドキソヘキサヒドロフ
タリル基，等はpH４〜８の弱酸性ないしは中性付近の条
件での処理によって除去するのが好ましい。反応温度は
−４°〜35℃が好ましく、反応時間は通常0.5時間〜96
時間である。また、テトラフルオロサクシニル基，トリ
フルオロアセチル基，アセトアセチル基は、pH８〜10の
弱アルカリ条件下で除去するのが好ましい。さらに、助
剤としてヒドロキシルアミン，モルホリン等の塩基性物
質を10mM〜100mMの濃度で加えて反応を促進させること
もできる。反応温度は−４°〜35℃が好ましく、反応時
間は通常0.5時間〜96時間である。また、２−ヒドロキ
シエチル基は１〜10mMの過ヨーソ酸を作用して除去する
ことができる。
反応の好ましい条件について述べる。マレイル基，エキ
ソ−シス−3,6−エンドキソ−△4−テトラヒドロフタリ
ル基，エキソ−シス−3,6−エンドキソヘキサヒドロフ
タリル基，等はpH４〜８の弱酸性ないしは中性付近の条
件での処理によって除去するのが好ましい。反応温度は
−４°〜35℃が好ましく、反応時間は通常0.5時間〜96
時間である。また、テトラフルオロサクシニル基，トリ
フルオロアセチル基，アセトアセチル基は、pH８〜10の
弱アルカリ条件下で除去するのが好ましい。さらに、助
剤としてヒドロキシルアミン，モルホリン等の塩基性物
質を10mM〜100mMの濃度で加えて反応を促進させること
もできる。反応温度は−４°〜35℃が好ましく、反応時
間は通常0.5時間〜96時間である。また、２−ヒドロキ
シエチル基は１〜10mMの過ヨーソ酸を作用して除去する
ことができる。
カルボキシル基の活性化誘導基はアミノ基との反応性が
高いが、セリン，スレオニン，糖鎖の水酸基等とも反応
性を有している。従ってアミノ基反応性官能基を有する
物質がカルボキシル基の活性化誘導基をもつ物質である
場合には、かかる物質を、アミノ基の一部を蛋白質アミ
ノ基の可逆的修飾剤で修飾した抗体またはそのフラグメ
ントと反応させた場合、アミノ基反応性官能基を有する
物質は抗体のセリン，スレオニン，糖鎖残基とも反応す
る。本発明の、アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性
官能基を有する物質の残基が導入された場合とは例えば
かかる場合である。アミノ基以外の官能基に導入された
アミノ基反応性官能基を有する物質の残基は、必要に応
じて除去されるが、上に例示した、カルボキシル基の活
性化誘導基が抗体のセリン，スレオニン残基，糖鎖と反
応してアミノ基反応性官能基を有する物質がエステル結
合によって抗体に導入された場合には、かかる残基は、
エステル結合を弱アルカリ性や弱酸性の条件で加水分解
するか、或いは、例えばヒドロキシルアミン等のアミン
類を用いて開裂せしめること等により除去することがで
きる。かかるヒドロキシルアミンによる開裂除去反応
は、例えば０〜40℃で、pH６〜10の条件下、0.01〜1.0
Ｍの濃度のヒドロキシルアミン処理で行うことができ、
所要時間は１時間〜５日間である。なお、本処理によ
り、可逆性アミノ基修飾剤残基が抗体から１部又は全部
離脱することがあるので、その様な場合には、本処理を
離脱工程と組み合わせて行なうので好ましい。
高いが、セリン，スレオニン，糖鎖の水酸基等とも反応
性を有している。従ってアミノ基反応性官能基を有する
物質がカルボキシル基の活性化誘導基をもつ物質である
場合には、かかる物質を、アミノ基の一部を蛋白質アミ
ノ基の可逆的修飾剤で修飾した抗体またはそのフラグメ
ントと反応させた場合、アミノ基反応性官能基を有する
物質は抗体のセリン，スレオニン，糖鎖残基とも反応す
る。本発明の、アミノ基以外の官能基にアミノ基反応性
官能基を有する物質の残基が導入された場合とは例えば
かかる場合である。アミノ基以外の官能基に導入された
アミノ基反応性官能基を有する物質の残基は、必要に応
じて除去されるが、上に例示した、カルボキシル基の活
性化誘導基が抗体のセリン，スレオニン残基，糖鎖と反
応してアミノ基反応性官能基を有する物質がエステル結
合によって抗体に導入された場合には、かかる残基は、
エステル結合を弱アルカリ性や弱酸性の条件で加水分解
するか、或いは、例えばヒドロキシルアミン等のアミン
類を用いて開裂せしめること等により除去することがで
きる。かかるヒドロキシルアミンによる開裂除去反応
は、例えば０〜40℃で、pH６〜10の条件下、0.01〜1.0
Ｍの濃度のヒドロキシルアミン処理で行うことができ、
所要時間は１時間〜５日間である。なお、本処理によ
り、可逆性アミノ基修飾剤残基が抗体から１部又は全部
離脱することがあるので、その様な場合には、本処理を
離脱工程と組み合わせて行なうので好ましい。
以上のごとくにして生成した抗体複合体の精製は、低分
子物質を除くためには透析，ゲルロ過，硫安沈澱法，エ
タノール沈澱法，アセトン沈澱法等の通常の方法を用い
ることができる。また、複合体が不溶性物質の場合に
は、単なる濾過，洗浄等の方法を用いることができる。
また、高分子物質の分離は、ゲルロ過，イオン交換クロ
マトグラフィー，等電点沈澱法等，通常の方法を用いて
行うことができる。
子物質を除くためには透析，ゲルロ過，硫安沈澱法，エ
タノール沈澱法，アセトン沈澱法等の通常の方法を用い
ることができる。また、複合体が不溶性物質の場合に
は、単なる濾過，洗浄等の方法を用いることができる。
また、高分子物質の分離は、ゲルロ過，イオン交換クロ
マトグラフィー，等電点沈澱法等，通常の方法を用いて
行うことができる。
次に本発明をより詳しく説明するために実施例を記載す
るが、本発明はもとよりこれらに限定されるものではな
い。
るが、本発明はもとよりこれらに限定されるものではな
い。
実施例１抗体と制癌薬との複合体の製造 １−１複合体の製造 抗ヒトメラノーマモノクローナル抗体96.5の12.0mgを溶
解した70mMホス酸緩衝液(pH8.8)の溶液1.7mlに無水ジメ
チルマレイン酸の0.2Ｍ ＤＭＦ溶液20μを氷冷下、
攪拌下に加え、30分間反応させた。その間、0.1Ｍ Ｎ
ａＯＨを滴下して、反応液pHを8.5〜9.0に保った。次に
メソトレキセート（以下ＭＴＸと省略する）のＮ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル（Ｐ．Ｋulkarni et a
l.，Cancer Research,41,2700-2706(1981)に記載の方法
に改良を加えた方法によって合成した。）の30.6mM Ｄ
ＭＦ溶液52μを添加して、４時間反応させた。
解した70mMホス酸緩衝液(pH8.8)の溶液1.7mlに無水ジメ
チルマレイン酸の0.2Ｍ ＤＭＦ溶液20μを氷冷下、
攪拌下に加え、30分間反応させた。その間、0.1Ｍ Ｎ
ａＯＨを滴下して、反応液pHを8.5〜9.0に保った。次に
メソトレキセート（以下ＭＴＸと省略する）のＮ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル（Ｐ．Ｋulkarni et a
l.，Cancer Research,41,2700-2706(1981)に記載の方法
に改良を加えた方法によって合成した。）の30.6mM Ｄ
ＭＦ溶液52μを添加して、４時間反応させた。
次に、0.1Ｍホウ酸緩衝液(pH8.5)に溶解した0.4Ｍグリ
シン溶液120μを加え、反応液を４℃１時間攪拌して
反応を停止し、その後0.1Ｍホウ酸緩衝液中に溶解した
1.1Ｍヒドロキシアミン（ＮＨ2ＯＨ）溶液（pH9.0）180
μを加え、４℃にて３日間静置した。かかる反応液を
0.02Ｍリン酸緩衝液−0.14Ｍ ＮａCl（pH7.2）に対し
て４℃にて40時間透析することにより、ジメチルマレイ
ル基および抗体分子の水酸基に結合したＭＴＸを脱離せ
しめ、目的物である複合体の溶液2.2mlを得た。さらに
抗体と無水ジメチルマレイン酸およびＭＴＸ Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステルとの反応比を変化させる
ことにより、２種の抗体−ＭＴＸ複合体を作製した。こ
れらの反応における抗体と無水ジメチルマレイン酸およ
びＭＴＸ Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルとの
反応モル比と得られた複合体の抗体１分子当たりのＭＴ
Ｘの平均結合分子数との関係を表１に示した。なお、抗
体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数（モル比）は
１−２に述べる方法により求めた。
シン溶液120μを加え、反応液を４℃１時間攪拌して
反応を停止し、その後0.1Ｍホウ酸緩衝液中に溶解した
1.1Ｍヒドロキシアミン（ＮＨ2ＯＨ）溶液（pH9.0）180
μを加え、４℃にて３日間静置した。かかる反応液を
0.02Ｍリン酸緩衝液−0.14Ｍ ＮａCl（pH7.2）に対し
て４℃にて40時間透析することにより、ジメチルマレイ
ル基および抗体分子の水酸基に結合したＭＴＸを脱離せ
しめ、目的物である複合体の溶液2.2mlを得た。さらに
抗体と無水ジメチルマレイン酸およびＭＴＸ Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステルとの反応比を変化させる
ことにより、２種の抗体−ＭＴＸ複合体を作製した。こ
れらの反応における抗体と無水ジメチルマレイン酸およ
びＭＴＸ Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルとの
反応モル比と得られた複合体の抗体１分子当たりのＭＴ
Ｘの平均結合分子数との関係を表１に示した。なお、抗
体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数（モル比）は
１−２に述べる方法により求めた。
１−２複合体の定量 １−１で得た複合体の溶液一部を用い、280nmおよび372
nmでの吸光度を測定して、それぞれの値より複合体中の
抗体蛋白質量およびＭＴＸ量を求めた。なお、280nmに
おけるＭＴＸに由来する吸収は、ＭＴＸの372nmにおけ
る吸収の2.52倍であることを実験的に求め、複合体の28
0nmでの吸光度をＭＴＸに由来する吸収で補正して抗体
蛋白質量を求めた。その結果は表１に記載した通りであ
る。
nmでの吸光度を測定して、それぞれの値より複合体中の
抗体蛋白質量およびＭＴＸ量を求めた。なお、280nmに
おけるＭＴＸに由来する吸収は、ＭＴＸの372nmにおけ
る吸収の2.52倍であることを実験的に求め、複合体の28
0nmでの吸光度をＭＴＸに由来する吸収で補正して抗体
蛋白質量を求めた。その結果は表１に記載した通りであ
る。
１−３抗体のアミノ基の一部を可逆的に修飾剤で保護す
ることなく抗体とＭＴＸとの 複合体を製造する比
較例 96.5抗体3.0mgを溶解した0.1Ｍホウ酸緩衝液（pH8.5）
の溶液0.3ｍにＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ドエステルの30.6mM ＤＭＦ溶液（実施例1-1で使用し
たものと同じもの）５μを添加して４時間反応させ
た。次に0.1Ｍホウ酸緩衝液（pH8.5）に溶解した0.4Ｍ
グリシン溶液12μを加え、反応液を４℃，１時間攪拌
して反応を停止した。その後0.1Ｍホウ酸緩衝液中に溶
解した1.1Ｍヒドロキシルアミン溶液（pH9.0）30μを
加え、４℃にて３日間静置し、抗体分子の水酸基に結合
したＭＴＸを脱離せしめ、かかる溶液を0.02Ｍリン酸緩
衝液−0.14Ｍ ＮａCl（pH7.2）に対して４℃にて40時
間透析することにより、目的物である複合体の溶液0.65
mlを得た。複合体の組成は1-2と同じ方法で求めた結
果、抗体１分子に平均ＭＴＸ4.5分子が結合しているこ
とが判明した。さらにＭＴＸ Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドエステルの96.5抗体（3.0mg）への添加量を５μ
から6.5μに変化させることにより、添加量５μ
の場合と同様の操作を経て、抗体１分子に平均ＭＴＸ
6.2分子が結合した複合体2.6mgを得た。
ることなく抗体とＭＴＸとの 複合体を製造する比
較例 96.5抗体3.0mgを溶解した0.1Ｍホウ酸緩衝液（pH8.5）
の溶液0.3ｍにＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイミ
ドエステルの30.6mM ＤＭＦ溶液（実施例1-1で使用し
たものと同じもの）５μを添加して４時間反応させ
た。次に0.1Ｍホウ酸緩衝液（pH8.5）に溶解した0.4Ｍ
グリシン溶液12μを加え、反応液を４℃，１時間攪拌
して反応を停止した。その後0.1Ｍホウ酸緩衝液中に溶
解した1.1Ｍヒドロキシルアミン溶液（pH9.0）30μを
加え、４℃にて３日間静置し、抗体分子の水酸基に結合
したＭＴＸを脱離せしめ、かかる溶液を0.02Ｍリン酸緩
衝液−0.14Ｍ ＮａCl（pH7.2）に対して４℃にて40時
間透析することにより、目的物である複合体の溶液0.65
mlを得た。複合体の組成は1-2と同じ方法で求めた結
果、抗体１分子に平均ＭＴＸ4.5分子が結合しているこ
とが判明した。さらにＭＴＸ Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドエステルの96.5抗体（3.0mg）への添加量を５μ
から6.5μに変化させることにより、添加量５μ
の場合と同様の操作を経て、抗体１分子に平均ＭＴＸ
6.2分子が結合した複合体2.6mgを得た。
1-4複合体の抗原への結合活性（抗体活性）の定量 先ずヒトメラノーマ細胞Ｍ14−Ａ懸濁液（１×106細胞
／ｍ）0.2ｍに、種々の濃度の被験サンプル0.1mlを
加えて混合し、時々攪拌しながら室温で１時間反応させ
た。さらに、一定濃度の125Ｉ標識96.5抗体（125Ｉ−9
6.5）0.1mlを添加して混合し、時々攪拌しながら室温で
１時間反応させた。以上の細胞，試薬類の調製には、10
％正常ウマ血清と、0.02％アジ化ナトリウムを含むリン
酸緩衝化生理食塩水を用いた。
／ｍ）0.2ｍに、種々の濃度の被験サンプル0.1mlを
加えて混合し、時々攪拌しながら室温で１時間反応させ
た。さらに、一定濃度の125Ｉ標識96.5抗体（125Ｉ−9
6.5）0.1mlを添加して混合し、時々攪拌しながら室温で
１時間反応させた。以上の細胞，試薬類の調製には、10
％正常ウマ血清と、0.02％アジ化ナトリウムを含むリン
酸緩衝化生理食塩水を用いた。
次に上記食塩水１mlで３回，細胞を遠心洗浄した後、細
胞に結合した放射活性をγ−スペクトロメーターで測定
した。
胞に結合した放射活性をγ−スペクトロメーターで測定
した。
こうして、125Ｉ標識96.5のＭ14−Ａ細胞に対する結合
を複合体が50％抑制する複合体サンプルの濃度（Ｉ
Ｃ50）を求め、元の96.5抗体のＩＣ50との比較から、複
合体の抗原結合活性を算出した。その結果、アミノ基の
無水ジメチルマレイン酸による保護を行なわずに作製し
た複合体（1-3に記載）の抗原結合活性は96.5抗体１分
子にＭＴＸを平均4.5分子結合させた場合に元の抗体の2
9％に、抗体１分子にＭＴＸを平均6.2分子結合させた場
合には12％に低下したのに対し、本発明の方法によって
抗体１分子にＭＴＸを平均4.1〜5.8分子結合させた場合
（1-1に記載）は抗原結合活性は100％であり、明らかに
本発明の方法によって製造した複合体の抗原結合活性は
従来法による複合体より高い。
を複合体が50％抑制する複合体サンプルの濃度（Ｉ
Ｃ50）を求め、元の96.5抗体のＩＣ50との比較から、複
合体の抗原結合活性を算出した。その結果、アミノ基の
無水ジメチルマレイン酸による保護を行なわずに作製し
た複合体（1-3に記載）の抗原結合活性は96.5抗体１分
子にＭＴＸを平均4.5分子結合させた場合に元の抗体の2
9％に、抗体１分子にＭＴＸを平均6.2分子結合させた場
合には12％に低下したのに対し、本発明の方法によって
抗体１分子にＭＴＸを平均4.1〜5.8分子結合させた場合
（1-1に記載）は抗原結合活性は100％であり、明らかに
本発明の方法によって製造した複合体の抗原結合活性は
従来法による複合体より高い。
実施例２ 実施例１における96.5抗体のかわりに、抗ヒトメラノー
マモノクローナル抗体ＺＭＥ018を用い、実施例1-1と同
様の操作を施し、抗体−ＭＴＸ複合体を製造した。すな
わち、ＺＭＥ018抗体12.7mgを溶解した70mMホウ酸緩衝
液（pH8.8）の溶液1.3mlに無水ジメチルマレイン酸の0.
21Ｍ ＤＭＦ溶液40μを氷冷下、攪拌下に加え、30分
間反応させた後、かかる反応液を２本の試験管に等量ず
つ分注し、ＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テルの30.6mM ＤＭＦ溶液（実施例1-1で使用したもの
と同じもの）を一方の反応液に55μ、他方の反応液に
83μ加え各々４時間反応させた。次に0.1Ｍホウ酸緩
衝液（pH8.5）に溶解した0.4Ｍグリシン溶液150μを
各々の反応液に加え、４℃１時間攪拌して反応を停止
し、その後0.1Ｍヒドロキシアミン溶液（pH9.0）70μ
を各々の反応液に加え25℃にて24時間静置した。かかる
反応液を0.02Ｍリン酸緩衝液−0.14Ｍ ＮａC（pH7.
2）に対して４℃にて40時間透析することにより、ジメ
チルマレイル基および抗体分子の水酸基に結合したＭＴ
Ｘを脱離せしめ、目的物である複合体を２種得た。両複
合体の抗体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数を1-
2記載の方法で求めると一方は4.3個、他方は8.1個であ
った。これら複合体の抗体活性は実施例1-4において125
Ｉ標識96.5のかわりに125Ｉ標識ＺＭＥ018を用いること
により測定が可能であり、抗体１分子当たりのＭＴＸの
平均結合分子数4.3個の場合には元の抗体の100％であ
り、抗体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数8.1個
の場合には67％であった。以上より、ＺＭＥ018抗体の
場合にも96.5抗体の場合と同様に、本発明の方法によっ
て抗原結合活性を保持した複合体が製造された。
マモノクローナル抗体ＺＭＥ018を用い、実施例1-1と同
様の操作を施し、抗体−ＭＴＸ複合体を製造した。すな
わち、ＺＭＥ018抗体12.7mgを溶解した70mMホウ酸緩衝
液（pH8.8）の溶液1.3mlに無水ジメチルマレイン酸の0.
21Ｍ ＤＭＦ溶液40μを氷冷下、攪拌下に加え、30分
間反応させた後、かかる反応液を２本の試験管に等量ず
つ分注し、ＭＴＸのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テルの30.6mM ＤＭＦ溶液（実施例1-1で使用したもの
と同じもの）を一方の反応液に55μ、他方の反応液に
83μ加え各々４時間反応させた。次に0.1Ｍホウ酸緩
衝液（pH8.5）に溶解した0.4Ｍグリシン溶液150μを
各々の反応液に加え、４℃１時間攪拌して反応を停止
し、その後0.1Ｍヒドロキシアミン溶液（pH9.0）70μ
を各々の反応液に加え25℃にて24時間静置した。かかる
反応液を0.02Ｍリン酸緩衝液−0.14Ｍ ＮａC（pH7.
2）に対して４℃にて40時間透析することにより、ジメ
チルマレイル基および抗体分子の水酸基に結合したＭＴ
Ｘを脱離せしめ、目的物である複合体を２種得た。両複
合体の抗体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数を1-
2記載の方法で求めると一方は4.3個、他方は8.1個であ
った。これら複合体の抗体活性は実施例1-4において125
Ｉ標識96.5のかわりに125Ｉ標識ＺＭＥ018を用いること
により測定が可能であり、抗体１分子当たりのＭＴＸの
平均結合分子数4.3個の場合には元の抗体の100％であ
り、抗体１分子当たりのＭＴＸの平均結合分子数8.1個
の場合には67％であった。以上より、ＺＭＥ018抗体の
場合にも96.5抗体の場合と同様に、本発明の方法によっ
て抗原結合活性を保持した複合体が製造された。
フロントページの続き (72)発明者 原 健 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物医学研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−228025（ＪＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】アミノ基を修飾することにより抗原結合活
性が低下する抗体またはそのフラグメントのアミノ基の
一部を蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤で修飾した後、抗
体またはそのフラグメントにアミノ基反応性官能基を有
する物質を反応させ、しかる後生成物より蛋白質アミノ
基の可逆的修飾剤残基と、さらに、アミノ基以外の官能
基にアミノ基反応性官能基を有する物質の残基が導入さ
れた場合には必要に応じてかかる残基を、除去すること
を特徴とする抗体複合体の製造方法。 - 【請求項２】抗体がモノクローナル抗体である、特許請
求の範囲第１項記載の抗体複合体の製造方法。 - 【請求項３】蛋白質アミノ基の可逆的修飾剤が無水マレ
イン酸類である、特許請求の範囲第１項または第２項記
載の抗体複合体の製造方法。 - 【請求項４】アミノ基反応性官能基を有する物質が生物
活性物質である、特許請求の範囲第１項，第２項または
第３項記載の抗体複合体の製造方法。 - 【請求項５】生物活性物質がそれ自体で殺細胞効果を示
すか、他の物質により細胞内に導入された場合に殺細胞
効果を示す物質である、特許請求の範囲第４項記載の抗
体複合体の製造方法。 - 【請求項６】殺細胞効果を示す物質が抗腫瘍性物質であ
る、特許請求の範囲第５項記載の抗体複合体の製造方
法。 - 【請求項７】アミノ基反応性官能基を有する物質がキレ
ート化剤である、特許請求の範囲第１項，第２項または
第３項記載の抗体複合体の製造方法。 - 【請求項８】アミノ基反応性官能基を有する物質がカル
ボキシル基の活性化誘導基を有する化合物である、特許
請求の範囲第１項，第２項または第３項記載の抗体複合
体の製造方法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| PCT/JP1988/000279 WO1988007553A1 (en) | 1987-03-26 | 1987-03-17 | Process for preparing antibody complex |
| JP62070429A JPH064678B2 (ja) | 1987-03-26 | 1987-03-26 | 抗体複合体の製造方法 |
| EP19880902561 EP0307480A4 (en) | 1987-03-26 | 1988-03-17 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF AN ANTIBODY COMPLEX. |
| US07/304,987 US5106955A (en) | 1987-03-26 | 1988-03-17 | Process for preparation of antibody conjugates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62070429A JPH064678B2 (ja) | 1987-03-26 | 1987-03-26 | 抗体複合体の製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63238100A JPS63238100A (ja) | 1988-10-04 |
| JPH064678B2 true JPH064678B2 (ja) | 1994-01-19 |
Family
ID=13431228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62070429A Expired - Lifetime JPH064678B2 (ja) | 1987-03-26 | 1987-03-26 | 抗体複合体の製造方法 |
Country Status (4)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0307480A4 (ja) |
| JP (1) | JPH064678B2 (ja) |
| WO (1) | WO1988007553A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| SE468238B (sv) * | 1990-02-28 | 1992-11-30 | Sten Ohlson | Laekemedel med svag affinitet |
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| US8420086B2 (en) | 2002-12-13 | 2013-04-16 | Immunomedics, Inc. | Camptothecin conjugates of anti-CD22 antibodies for treatment of B cell diseases |
| JP4912153B2 (ja) * | 2003-12-01 | 2012-04-11 | イミューノメディクス、インコーポレイテッド | タンパク質とキレート剤とのコンジュゲートを調製するための改良された方法 |
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- 1988-03-17 US US07/304,987 patent/US5106955A/en not_active Expired - Fee Related
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