JP4732331B2 - 安定な放射性ヨウ素複合体の精製方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、放射免疫検出および放射免疫治療に用いる試薬の精製、詳しくはイン・ビボにおける安定性が増強され、かつ、腫瘍部位における保持が増強された放射性ヨウ素標識複合体の精製に関する。
発明の背景
放射性ヨウ素化モノクローナル抗体は、Goldenberg がAmer. J. Med. 1993; 94: 297-312にまとめているように、癌の診断および治療に重要である。ここ３０年の間に、これらの用途のために、モノクローナルおよびポリクローナル抗体へ放射性ヨウ素を化学的に導入する方法がいくつか開発された。タンパク質の放射性ヨウ素化に用いられる化学反応は比較的容易なものであり、放射性ヨウ素は有用な物理的崩壊性を有し、さらに、ヨウ素の同位体は商業的に入手できることから、これらの適用の放射性標識としてはヨウ素が好ましい。ヨウ素と、癌細胞をターゲッティングする抗体とを結合させるために種々の化学法が開発されている。これらの化学法はWilbur, Bioconjugate Chemistry 1992; 3: 433-70に概説されている。最も一般的な結合法としては、in situで求電子性の放射性ヨウ素種を抗体上の官能基と反応するように意図されている。求電子性のヨウ素を生じさせるには、クロラミン−Ｔおよびヨードゲンなどの試薬が用いられている。通常、タンパク質上のチロシン基がヨウ素化の部位となる。
ＭＡｂの従来の放射性ヨウ素化にあっては、使用した酸化剤ならびに組み込まれなかった放射性ヨウ素を、なんらかの精製法を用いて除去する必要がある。クロラミン−Ｔなどのバッファーに可溶な酸化剤を用いた場合、酸化剤と放射性ヨウ素は慣例的に、市販のＰＤ１０（登録商標）カラムなどのサイズ排除カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより除去される。
直接放射性ヨウ素化法を用いる場合の主な欠点は、イン・ビボにおける脱ヨウ素現象である。抗体のインターナライゼーションとイン・ビボでのリソソーム処理の結果、標識タンパク質は小さなペプチドへと分解され、その放射性ヨウ素がヨードチロシンの形で、または低分子量のペプチド断片と結合したヨウ素として細胞から放出される。これらの知見は、Geissler et al., Cancer Research 1992; 52: 2907-2915およびShih et al., J. Nucl. Med. 1994; 35: 899-908により報告されている。このようなイン・ビボにおける標的細胞からの放射性ヨウ素の除去によって、放射線診断にとって重要な腫瘍と非腫瘍の識別が低下し、しかも、放射線療法の有効性に著しい影響を及ぼす、標的細胞での放射性ヨウ素の滞留時間も短くなる。
細胞内で保持されるヨウ素の放射性標識のデザインにより、イン・ビボでの脱ヨウ素化の現象を克服するためのいくつかのアプローチが考案されている。このような標識は「レシジュアライジングラベル(residualizing label)」と呼ばれている。一つの方法では、放射性ヨウ素を代謝できない炭水化物と結合し、まずこれを活性化し、その後、抗体と結合させる。このアプローチはラクチトリチラミン（ＬＴ）およびジラクチトリチラミン(Strobel et al., Arch. Biochem. Biophys 1985; 240: 635-45)ならびにチロシンセロビオース(Ali et al. , Cancer Research 1990; 50: 783s-88s)により例示される。別のアプローチでは、ピリジンに基づく部分「ＳＩＰＣ」が用いられている(Reist et al. , Cancer Research 1996; 56: 4970-4977)。総てのＤアミノ酸と複数の塩基性アミノ酸を含有するペンタペプチドも採用されている(Foulon et al. , Cancer Research 2000; 60: 4453-4460)。さらに別のアプローチでは、ＤＴＰＡを付加した、Ｄ−アミノ酸含有放射性ヨウ素化ペプチドがレシジュアライジンラベルとして首尾良く用いられている(Govindan et al., Bioconjugate Chemistry 1999; 10:231-240; Stein et al., Cancer Research 2003; 63: 111-118)。
放射性ヨウ素化した低分子量物質をＭＡｂと結合させた場合（以下、放射性ヨウ素化複合体）、前段の記載に例示したように、結合しなかった物質も同様に除去する必要があるという点で、さらなる必要性が生じる。これは必然的にさらなるカラム精製を必要とする。この炭水化物法は結果的に全体の収率および比活性が低くなり、最終工程でカラム精製法を必要とする。Reist et al（前掲）およびFoulon et al（前掲）の方法は２つのカラム精製工程を含み、一つは放射性ヨウ素化段階、もう一つは抗体結合段階である。Govindan et al（前掲；Stein et al（前掲）にもさらなる記載がある）の方法は最終工程に１回のカラム精製を含み、全体の収率および比活性はより高い。
カラム法は一般に煩雑であり、特に臨床規模の調製物として数百ｍＣｉのＩ−１３１を取り扱う場合に、職員への放射線暴露や取り返しのつかないカラム事故の更なる欠点がつきまとう。ヨードゲンに基づく放射性ヨウ素化では、酸化剤は水に不溶であり、放射性標識物質を単にシリンジで除去するか、または濾去することにより除去される。これらの場合には、除去する必要のある他の物質は組み込まれなかった放射性ヨウ素だけである。リン酸イオンまたは水酸化物イオンに対してヨウ化物イオンは強陰イオン交換樹脂との結合に比較的高い親和性を持っているので、組み込まれなかったヨウ化物イオンは陰イオン交換樹脂を用いることにより除去可能であることが示されている[Weadock et al. J Nuclear Medicine 1990; 31:508-511]; Behr TM et al. Nuklearmedizin 2002; 41: 71-79)。また、陰イオン交換樹脂と、市販の「ヨードビーズ」（登録商標）などの固定化クロラミン−Ｔ酸化剤を併用することも考えられる。このような併用により、直接放射性ヨウ素化抗体の精製においてはある程度の簡素化が達成されるものの、このような放射性ヨウ素化複合体の使用には依然として、結合していない低分子量部分を除去する必要がある。この精製の多くは、通常カラム法により達成されるが、これらの方法に付随する欠点は、臨床適用で数百ミリキュリーの放射性標識調製物の精製を行うのは実用上問題があるということである。
ジエチルアミノエチル−セルロース陰イオン交換体のカラムを通し、数回水で溶出することにより、放射性金属キレートＤＯＴＡ−ペプチドを非標識ＤＯＴＡ−ペプチドから精製するカラム法は、Li et al. (Bioconjugate Chemistry 1994; 5: 101-104)により記載されている。この場合、放射性金属キレートＤＯＴＡペプチドは中性の電荷を有するので、カラムから溶出されるが、キレーター部分に負電荷を有する非標識物質は陰イオン交換カラムに保持される。これには放射性金属でキレートし、その後、抗体と結合させた二官能性物質を精製することを必要とし、この生成物はサイズ排除カラム法により精製された。このように、Li et al.（前掲）の手順は多段階のアプローチ、そして２工程のカラムに基づく精製を含む。ここでも、このようなカラムに基づく方法は、低分子量部分を大規模に放射性ヨウ素化した後にターゲッティング因子と結合させるために適用する場合、実施不可能である。後者の場合、何百ミリキュリーという放射活性ヨウ素が関与するならば、より簡単な精製方法が必要である。
発明の概要
本発明は、放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドとターゲッティング因子とを共有結合させることによって製造された放射性ヨウ素化複合体の精製方法を提供することにより、上記の問題を解決するものである。
本発明は、種々の放射性ヨウ素化したアミノポリカルボキシレート付加部分とターゲッティング因子に由来する放射性ヨウ素化複合体のための精製系の必要性に取り組むものである。当技術分野で従来知られていた方法とは対照的に、抗体などのターゲッティング因子の直接の放射性ヨウ素化に関し、本発明はチロシン含有二官能性ペプチドなどの低分子量部分の放射性ヨウ素化と、その放射性ヨウ素化部分と抗体の結合を含む手法に関する。本発明はそれ自体、組み込まれなかった放射性ヨウ素および非結合放射性ヨウ素化部分の双方を精製により除去する必要性に取り組むものである。
本発明の方法は、レシジュアライジングヨウ素標識による、より効率的な抗体標識を提供する。これらの方法はまた、凝集塊が少なく、より品質が高く、安定な放射性ヨウ素複合体の製造法を提供する。ワンポット製造および精製法に伴う簡素化および取り扱いの安全性などの他の利点は以下の詳細な説明から明らかになろう。
定義
以下の記載においていくつかの専門用語が広く用いられている。本発明の理解を容易にするために、以下、定義を示す。
ターゲッティング因子 「ターゲッティング因子」とは、標的細胞と選択的に結合し得る分子部分である。ターゲッティング因子の例としては、腫瘍もしくは感染病変部により発現される抗原または受容体をターゲッティング可能なタンパク質分子、または腫瘍もしくは病変部上の特定の受容体をターゲッティング可能な低分子量部分、または腫瘍細胞もしくは病変部にターゲッティングされる合成ヌクレオチドが挙げられる。好ましいターゲッティング因子としては、抗体およびペプチドが挙げられる。
抗体 「抗体」とは、ネズミ、キメラ、ヒト化またはヒト抗体などのモノクローナル抗体、ならびに抗原結合フラグメントが含まれる。このようなフラグメントとしては、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠いたＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦ（ａｂ’）２が挙げられる。このようなフラグメントとしてはまた、軽鎖可変領域の単離されフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域の「Ｆｖ」フラグメント、（ｓＦｖ）２フラグメント（例えば、Tai et al., Cancer Research Supplement, 55:5983-5989, 1995参照）、および軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子も挙げられる。「多価」抗体とは、抗体が、同じ構造であっても異なる構造であってもよいが、１を超える抗原と同時に結合し得ることを意味する。「多重特異性抗体」とは、対象抗体が、構造の異なる少なくとも２つの抗原と同時に結合し得ることを意味する。
複合体 本明細書において「複合体」とは、モノクローナル抗体などのターゲッティング因子と共有結合された非標識または放射性標識アミノポリカルボキシレート付加ペプチド（「低分子量部分」とも呼ばれる）を含んでなる分子である。この複合体はターゲッティング因子の生物特異性を保持している。例えば、抗体ターゲッティング因子の免疫反応性（抗原結合能）は、その低分子量部分と結合させる前と比べて結合させた後はだいたい同じであるか、またはわずかに低下しているだけである。
アミノポリカルボキシレート付加ペプチド 「アミノポリカルボキシレート付加ペプチド」とは、アミノポリカルボン酸とペプチドとの共有結合により形成された化学部分をさす。この結合はペプチドのアミノ基を介したものであることが好ましい。いずれの好適なアミノポリカルボキシレートも本発明との併用が意図される。アミノポリカルボキシレートの例としては、容易に考えつく他のアミノポリカルボキシレートおよびそれらの誘導体の中でも、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン四酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＮ， Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸）、または例えば、イソチオシアナトベンジル−ＥＤＴＡ／ＤＴＰＡ／ＴＴＨＡ／ＤＯＴＡなどの、様々なその主鎖置換変種が挙げられる。ペプチドは以下に定義する。
ペプチド アミノポリカルボキシレート付加ペプチドという場合の「ペプチド」の使用は、ＬもしくはＤ−アミノ、またはＬおよびＤ−アミノ酸の組合せから構成された任意のペプチドをさす。このペプチドは好ましくは２〜４０個のアミノ酸、より好ましくは２〜５個のアミノ酸、最も好ましくは３〜４個のアミノ酸から構成されている。最適には、ペプチドは、ＬまたはＤ−リシンなどの塩基性アミノ酸に好まれるＤ−チロシンを少なくとも１つ有し、これがペプチドのカルボキシ末端を構成している。この塩基性アミノ酸はアミノポリカルボン酸と結合することができる。
溶液 本明細書において、溶液とは、抗体と放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレートの複合体、組み込まれていない放射性ヨウ化物、および組み込まれていない放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレートを含有する溶液をさす。好ましい溶液は緩衝水溶液である。
非結合放射性ヨウ素 本明細書において、非結合放射性ヨウ素とは、反応性ヨウ素種へと酸化されてない放射活性ヨウ素種をさし、ペプチドと結合していない非酸化放射性ヨウ化物を含む。
陰イオン交換樹脂 本明細書において、「陰イオン交換樹脂」とは、対イオン（陰イオン）を検体の陰イオンと交換可能な、プロトン化第三級アミンまたはテトラアルキルアンモニウム官能基のいずれかを含む市販の不溶性合成または天然ポリマーマトリックスをさす。
フィルター 本明細書において、「フィルター」とは、例えば、濾過サイズ０．１０μｍ〜０．３０μｍの間であり、粒子物質を保持することができる（約０．２２μｍの孔径のフィルターがより好ましい）任意の装置をさす。
酸化剤 本明細書において、「酸化剤」とは、Wilbur（前掲）が述べているように、放射性ヨウ素化反応の放射性ヨウ素化種である、活性放射性一塩化ヨウ素へと放射性ヨウ素を酸化するのに用いられる任意の酸化剤をさす。
ヨードゲン法 この用語は、酸化剤としてのヨードゲンの使用を含む放射性ヨウ素化法をさす。ヨードゲン（１，３，４，６−テトラクロロ−３●，６●−ジフェニルグリコールウリル）は、Wilbur（前掲）が述べているように、放射性ヨウ化物の溶液と接触させた際に活性な放射性ヨウ素化種を生成する水に不溶な物質である。
クロラミン−Ｔ法 この用語は、Wilbur（前掲）が述べているように、放射性ヨウ化物の溶液と混合した際に活性な放射性ヨウ素化種を生成する水溶性の酸化剤としてクロラミン−Ｔ（ナトリウムＮ−クロロトルエンスルホンアミド）を用いることをさす。
結合部分 結合部分はマレイミド、クロロアセトアミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アミデートエステル、イソシアネート、またはイソチオシアネートを含んでなる基から選択され、ターゲッティング因子と共有結合を形成し得る官能基をさす。結合部分は、同種二官能性または異種二官能性架橋分子を用いてアミノポリカルボキシレート付加ペプチドへと導入される。架橋剤としての同種二官能性および異種二官能性試薬の使用は当技術分野で周知のものである(Wong, S. S., 1991; Chemistry of protein conjugation and cross-linking; CRC Press, Boca Raton, FL; pp 1-48)。
発明の詳細な説明
驚くことに、本発明者らは、陰イオン交換樹脂とわずかの間接触させるだけで非結合低分子量部分を効率的に除去されることを見出した。精製生成物は濾過により陰イオン交換樹脂から単離される。複合体、ならびに樹脂により除去された非反応ヨウ化物およびヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドから樹脂を濾過するには、粒子物質を捕捉できるいずれの濾過装置も適用することができる。０．２２μｍの濾過装置が最も好ましい。陰イオン交換樹脂とともに攪拌することにより非結合低分子量物質を除去する方法は、ＤＴＰＡなど、本発明のアミノポリカルボキシレート部分の場合に特によく機能する。
予期しないことに、煩雑なカラム精製法を用いず、簡単なワンポット精製により非結合ポリカルボキシレート部分が効率的に除去できることが見出された。陰イオン交換樹脂の対イオン選択性に基づけば、陰イオン交換樹脂と短時間接触させただけで、ポリカルボキシレートなどの非結合低分子量部分が効率的に除去できるとは予想外のことである。例えば、水酸化物は陰イオン交換樹脂との結合力が弱いと考えられ、酢酸基は水酸化物よりも若干よく結合するに過ぎない。アミノポリカルボキシレートは窒素原子上に酢酸残基を含み、これらの酢酸残基はｐＨ＞６の緩衝溶液中で酢酸塩として十分にイオン化されることから、酢酸基は本アミノポリカルボキシレートに関連する。例えば、製造者の製品文献（ＡＧ（登録商標）１およびＡＧ２強陰イオン交換樹脂説明マニュアル，BioRad Corporation）に基づけば、陰イオン交換樹脂であるＡＧ１（登録商標）におけるヨウ化物の選択性は水酸化物（任意に１とする）の１７５倍であるが、酢酸塩では水酸化物の３．２倍である。さらに、この樹脂は、酢酸塩よりも若干高い、相対選択性が５（水酸化物の１に対して）のリン酸型で用いられる。ヨウ化物は陰イオン交換樹脂に対する結合選択性が比較的高いので、イオン交換法によるヨウ化物の除去がうまくいくと予測されるに過ぎない。しかし、陰イオン交換樹脂との結合に対する酢酸塩の選択性がリン酸イオンよりも低いにもかかわらず、本発明者は、このイオン交換法が、陰イオン交換樹脂の結合選択性に基づいては予測できない、アミノポリカルボキシレート含有非結合低分子物質の除去において効率的に機能することを見出した。特定の理論に何ら縛られるものではないが、本発明者は、この選択性の向上が、低分子量部分のアミノポリカルボキシレートの部分構造により予測されるように、同一分子中複数の酢酸基の存在によるものであると考えている。このように、低分子量物質中にアミノポリカルボキシレート部分を組み込むことにより、単に陰イオン交換樹脂の懸濁液とともに数分間攪拌し、生成物を濾別することで、非結合放射性ヨウ素化物質を効率的に除去することができることを発見した。本発明の簡略な方法は、カラム精製法が完全になくなるという点で、Li et al.（前掲）の方法とは実施上明らかに異なり、有利である。
陰イオン交換樹脂
これらの例として、スチレンジビニルベンゼンコポリマー格子に結合された第四級アンモニウム基を含有する、市販の強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた。この樹脂の架橋度は８％であり、排除限界分子量１０００Ｄａの孔径に相当し、媒体のメッシュサイズは１００〜２００（粒径１５０〜７５μｍ）である。
しかしながら、本発明は上述の特定の陰イオン交換樹脂特性に限定されるものではないが、上記の強塩基性陰イオン交換樹脂および市販のジエチルアミノエチルセルロースのような弱塩基性陰イオン交換樹脂の双方を含む。さらに、用いる樹脂の架橋度も限定されない。特定例の強塩基性陰イオン樹脂では、架橋度は２％（排除限界分子量２７００Ｄａの孔径）〜１２％（排除限界分子量４００Ｄａの孔径）まで様々であってよく、樹脂の粒径は２０メッシュ〜４００メッシュであってよく、これは粒径範囲８５０μｍ〜３８μｍに相当する。
複合体
本発明は、放射活性がイン・ビボで滞留するように標識化抗体として使用される代謝できない放射性ヨウ素化ペプチドに関する。これらの特別に設計されたペプチドは２〜４０個のアミノ酸、好ましくは２〜５個のアミノ酸を含み、好ましくはＤ−アミノ酸を含む。Ｄ−アミノ酸は、ペプチドの抗体への結合部位と、チロシンまたはチラミンと結合している放射活性ヨウ素との間のペプチドにおいて用いるのが好ましい。この領域内に、Ｌ−アミノ酸である２つの隣接するアミノ酸がないのが最も好ましい。これに関して、グリシンはＬ−アミノ酸である。このようにＤ−アミノ酸を用いることにより、放射活性ヨウ素を抗体と連結しているペプチド結合は、リソソーム中でも加水分解されない。さらに、１以上のアミノポリカルボキシレート部分がこのペプチドに付加され、Ｎ末端および／または側鎖アミノ基は、抗体への共有結合のための官能基を有する架橋剤に結合される。抗体共有結合基はアミノ残基（ＭＡｂの酸化されたＦｃ部分の炭水化物との位置特異的結合のため）、イミデートまたはイソチオシアネート（タンパク質のリシン基と結合可能）、マレイミド、ブロモ−またはヨードアセトアミド残基（ＭＡｂ上のチオールに特異的）などであり得る。最後のＤ−チロシン単位のすぐ後の、抗体結合架橋剤を導入するために用いられるアミノ酸は、天然Ｌ−アミノ酸であってもよい。アミノポリカルボキシレート単位は、容易に考えつく、他の多くのアミノポリカルボキシレートおよびそれらの誘導体の中でも、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン四酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＮ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、または例えば１−［（ｐ−イソチオシアナト）ベンジル］−ＥＤＴＡ（ベンジル−ＥＤＴＡ）、１−［（ｐイソチオシアナト）ベンジル］−ＤＴＰＡ（ベンジル−ＤＴＰＡ）、１−［（ｐ−イソチオシアナト）ベンジル］−ＴＴＨＡ（ベンジル−ＴＴＨＡ）、１−［（ｐ−イソチオシアナト）ベンジル］−ＤＯＴＡ（ベンジル−ＤＯＴＡ）、１−［（ｐ−イソチオシアナト）ベンジル］−ＮＯＴＡ（ベンジル−ＮＯＴＡ）などの種々の主鎖置換変種であり得る。
もう１つの実施形態では、ヨウ素化可能な二官能性アミノポリカルボキシレートは、アミノポリカルボキシレートにトリラミン基と抗体結合基を結合させることにより誘導される。これらの構造中にはプロテアーゼ感受性結合は含まれていない。あるいは、抗体結合単位で主鎖置換したアミノポリカルボキシレートを、対応する二無水物へ変換し、これを次にＤ−チロシンと反応させてＤ−チロシン残基２個を含む物質を得る。二官能性アミノポリカルボキシレートとＤ−チロシンの間のアミド結合は、プロテアーゼによって認識されないので、これらはまた違った種のレシジュアライジングヨウ素標識をなす。
ヨウ素化Ｄ−チロシン部分がデイオジナーゼに耐性があるということは、本発明とともに使用可能な有利な特性である。この可能性は、Dumas et al., Biochem. Biophys. Acta 1973; 293: 36-47によって記載されている。
抗体の放射性ヨウ素化に有用なアミノポリカルボキシレート付加ペプチドの例としては、Ｘ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；Ｘ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）；［Ｘ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（１／２ＤＴＰＡ）］２；Ｘ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；Ｘ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；Ｘ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；Ｘ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；Ｘ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；およびＸ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ（ここで、Ｘは、モノクローナル抗体、そのフラグメントおよび構築物などのタンパク質をはじめ、ターゲッティングベクターとの共有結合のための官能基を含有する架橋剤である）からなる群から選択される。
本発明の範囲内で好適な例としての放射性ヨウ素は、Ｉ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５またはＩ−１３１である。
抗体
本発明の好ましい実施形態では、ＭＡｂ、多価抗体および多重特異性抗体などの抗体は、標的細胞において高レベルで発現され、正常組織に対して罹患細胞において優先的にまたは罹患細胞でのみ発現されるマーカーまたは腫瘍関連抗原、ならびにある種の正常細胞、および骨髄細胞のように侵食される組織や、副甲状腺、脾臓および子宮内膜などの異所組織に関連する抗原を認識する、またはそれらと結合するもの、および速やかにインターナライズする抗体が用いられる。「多価」抗体とは、抗体が、構造が同じであっても異なっていてもよいが、１を超える抗原と同時に結合し得ることを意味する。「多重特異性」抗体とは、対象抗体が構造の異なる少なくとも２つの抗原と同時に結合し得ることを意味する。例えば、２つの異なる特異性を有する抗体は、構造の異なる２つの標的と同時に結合し得ることから、多価抗体であり、多重特異性抗体でもあるとみなされる。他方、同じ標的と結合する２以上の特定のアームを有するが、他の特異性は持たない抗体は多価ではあるが、多重特異性ではない。種々の多重特異性かつ／または多価抗体は分子工学を用いて作製することができる。例えば、二重特異性融合タンパク質は、例えば、ある抗原に対する単一の結合部位を有するｓｃＦｖと、別の抗原に対する単一の結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる一価のものであり得る。二重特異性抗体はまた、例えば、ある抗原に対する２つの結合部位を有するＩｇＧと、別の抗原に対する２つの結合部位を有するｓｃＦｖからなる二価のものであり得る。
本発明の範囲内で有用な抗体としては、上記のような特性を有するｍＡｂが含まれ、限定されるものではないが、以下のｍＡｂ：ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２（抗ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１））、ＰＡＭ−４（抗ＭＵＣ１）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、ＡＦＰ（抗α−フェトプロテイン）、抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（Ｊ５９１など）、およびＧ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ）の使用が意図される。これらの複合体を用いてターゲッティングされ得る他の有用な抗原としては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、アルカリホスファターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ、テネイシン、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、およびガングリオシドが挙げられる。
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、抗体は、速やかにインターナライズし、その後、再発現され、プロセシングされ、細胞表面で提示され、細胞による連続的取り込みおよび循環免疫複合体の付着が可能となるものが用いられる。最も好ましい抗体／抗原対の例としては、ＬＬ１と抗ＣＤ７４ ｍＡｂ（定常鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）がある。ＣＤ７４抗原はＢ細胞リンパ腫、ある種のＴ細胞リンパ腫、黒色腫およびある種の他の癌で発現が高い(Ong et al., Immunology 1999; 98:296-302)。
抗ＣＤ７４抗体で治療される疾患としては、例えば、限定されるものではないが、非ホジキンリンパ腫、黒色腫および多発性骨髄腫が挙げられる。標的細胞の表面で短期間ＣＤ７４抗原が連続発現した後、抗原がインターナライズされ、その抗原が再発現するので、ターゲッティングＬＬ１抗体を、それが「ミサイル弾頭」として運ぶ治療薬部分とともにインターナライズさせることが可能となる。これにより高い治療濃度のＬＬ１−治療薬免疫複合体をこのような細胞に蓄積させることができる。インターナライズされたＬＬ１免疫複合体はリソソームおよびエンドソームを介して循環され、このようにレシジュアライジング放射活性部分が標的細胞内で保持される。
好ましい実施形態では、ヒト疾患の治療に用いられる抗体は、ヒト型またはヒト化型（ｃｄｒグラフト）抗体であるが、ネズミ型およびキメラ型の抗体も使用できる。獣医学用途としては、同種ＩｇＧが最も有効なベクターである可能性があるが、交差種ＩｇＧもやはり有用である。送達薬剤としての同種ＩｇＧ分子は、免疫応答を最小限とするために通常好ましい。これは反復治療を考える場合に特に重要である。ヒトに対しては、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体が患者の抗ＩｇＧ免疫応答を起こしにくいと思われる。インターナライズしている抗原をターゲッティングすれば、ｈＬＬ１およびｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞と結合した後に速やかにインターナライズされるが、このことは運ばれている放射性ヨウ素化抗体複合体が速やかに細胞内にインターナライズされることを意味する。
ＭＡｂはネズミ、キメラ、ヒト化またはヒト抗体であり、完全な形であっても、そのフラグメントであっても操作された種々の形態であってもよい。特に好ましい実施形態では、ＭＡｂはチオール基を持つように誘導体化されているか、またはジスルフィド還元されている。
抗体標的
心血管病変部（例えば、血餅、塞栓、アテローム斑）、アミロイド沈着物（例えば、アミロイド症およびアルツハイマー病の場合）、感染性生物（例えば、細菌、真菌、リケッチア、ウイルス、寄生虫）、炎症（例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病または慢性特発性血小板減少性紫斑病などの免疫媒介性血小板減少症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ−シェンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、硬皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎および繊維性肺胞炎などのような第ＩＩＩ種自己免疫疾患）、変位または異所性の正常組織（例えば、副甲状腺、子宮内膜、脾臓、胸腺）、および癌（液性癌（例えば、白血病およびリンパ腫）および固形癌（例えば、癌腫、肉腫、神経膠腫、黒色腫）といった種々の罹患組織、細胞および器官に対する抗体が用いられる。
以下、本発明を、その範囲を限定するものではないが、実施例により説明する。
実施例１：放射性ヨウ素化ＩＭＰ−Ｒ４によるジスルフィド還元抗ＣＥＡ ＭＡｂ、ｈＭＮ−１４の標識化のための簡便なワンポット製造および精製法
以下、本手順を、放射性ヨウ素化し、ジスルフィド還元抗ＣＥＡ ＭＡｂであるｈＭＮ−１４と結合されている、低分子量物質としてのＩＭＰ−Ｒ４を用いて説明する。ＩＭＰ−Ｒ４はＭＣＣ−Ｌｙｓ（ＭＣＣ）−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ（ここで、ＭＣＣは４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボニルである）という構造を有する。ＩＭＰ−Ｒ４は２０００年１０月２６日に出願された米国特許出願第０９／６９６，７４０号の主題の一部である。
供給者から得たＩ−１３１ヨウ化ナトリウムを、７倍量０．５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４で緩衝させ、さらに１．４ｍＬの４０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４を用いて、ヨードゲンでコーティングし、攪拌子を入れ、ＩＭＰ−Ｒ４（０．１３μｍｏｌ／１００ｍＣｉのＩ−１３１）を含むバイアルに移した。この溶液を８〜１５分間攪拌し、組み込まれなかった放射性ヨウ素を過剰量の４−ヒドロキシフェニル酢酸で急冷した。この放射性ヨウ素化ＩＭＰ−Ｒ４を３０分間、ジスルフィド還元ｈＭＮ−１４と結合させ（１回の実験でのＩｇＧ−ＳＨ−対ＩＭＰ−Ｒ４比は０．６）、用いられなかったチオール基をナトリウムテトラチオネートでキャップした。最後に、リン酸型の陰イオン交換樹脂ＡＧ１×８（登録商標）（１００〜２００メッシュ）の２０％ｗ／ｖ懸濁液２〜３ｍＬを加え、５分間攪拌した。次に、この放射性標識物質を、Ｍｉｌｌｉ−Ｆｉｌ（登録商標）ＧＳ ０．２２μｍフィルターユニット(Millipore Corporation)を用いて滅菌密閉容器中へ濾過した。所望により、ヒト血清アルブミンを生成物に加えて、終濃度１％〜２．５％とした。
典型的な回収率は次の通りである。５７．４ｍＣｉのＩ−１３１から出発すると最終生成物に４０ｍＣｉ（６９．９％）が含まれており、１２３ｍＣｉのＩ−１３１で一度試したところ、最終生成物には６３ｍＣｉ（５１％）が含まれていた。４０ｍＣｉ〜１２３ｍＣｉのＩ−１３１を用いた放射性標識（ｎ＝９）では、ＨＰＬＣ分析によれば全体の組み込み率は６１％〜７５％であり、回収率は５０％〜７０％の範囲であった。ＣＥＡとの複合化およびＨＰＬＣ分析によって判断したところ、免疫反応性は＞９５％であった。ＨＰＬＣ分析によれば最終生成物は純度＞９５％であり、凝集率は＜５％であり、比活性は５ｍＣｉ／ｍｇ〜６ｍＣｉ／ｍｇの範囲であった。
実施例２：イン・ビボにおけるバッファー中および血清添加に対する安定性
実施例１の精製生成物（全放射活性６２．９ｍＣｉ）を、２．５％ＨＳＡを含有するリン酸バッファー中、０．９ｍＣｉ／ｍＬ濃度および抗体濃度０．２ｍｇ／ｍＬで２０時間室温で放置し、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。リン酸バッファーの例としては、０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液をｐＨ６．０〜７．５の間に調節したものである。これにより、この生成物は実質的に変化しないことが示された。２０倍モル過剰のＣＥＡ抗原と複合化したところ、免疫反応性が保存されていることが明らかになった。
第二の実験では、上記の生成物をヒト血清中で３３．３倍希釈し、３７℃で２０時間インキュベートした。この時点で分析したところ、標識の損失は無視できるもので、この材料はＣＥＡとなお複合化していることが示され、このことから免疫反応性が保存されていることが示唆された。
実施例３：低ｐＨでの標識および精製
Ｉ−１３１ヨウ化ナトリウムの緩衝をその７倍量の０．３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６で行い、その後、緩衝させたこのＩ−１３１を１．４ｍＬの０．０３Ｍリン酸ナトリウムｐＨ６を用いてヨードゲンバイアル中に移すという変更を行い、実施例１の手順に従った。５６．５ｍＣｉのＩ−１３１ヨウ化ナトリウムから出発し、放射性ヨウ素化、ジスルフィド還元ｈＭＮ−１４との結合、およびＡＧ（登録商標）１×８陰イオン交換樹脂とともに攪拌することによる精製の後、３９ｍＣｉ（６９％）の精製Ｉ−１３１−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＭＮ−１４が回収された。別の実験で、同じ手順を用い、１０９．８ｍＣｉのＩ−１３１ヨウ化ナトリウムから、６９．３ｍＣｉの精製生成物（６３．１％）が得られた。ここでも、これら２種の実験で、ＣＥＡとの複合化を用い、免疫反応性の完全な保存が示された。
実施例４：酸化剤として固定化クロラミン−Ｔを用いた放射性ヨウ素化、その後の結合および陰イオン交換精製
この実験では、ヨードゲンの代わりに市販の固定化クロラミン−Ｔ（ヨード−ビーズ（登録商標）を用いる。放射性ヨウ素化バイアル中で１以上のビーズを用いる。それ以外の操作は実施例１に記載したものと同じである。このように、陰イオン交換精製および簡単な濾過による生成物の単離の後、精製されたＩ−１３１−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＭＮ−１４が得られた。
本願に言及された特許、特許出願および刊行物文献を含むいずれの、また総ての参照文献の内容は引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
粗（未精製）生成物（Ｉ−１３１−ＩＭＰ−Ｒ４−ｈＭＮ−１４）のサイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣを示す。保持時間約１０分の主要ピークは標識ｈＭＮ−１４によるものであり、１４分と１８分付近のピークはそれぞれ非結合Ｉ−１３１−ＩＭＰＲ４とＩ−１３１を示す。 精製Ｉ−１３１−ＩＭＰＲ４−ｈＭＮ１４のＳＥＣ ＨＰＬＣを示し、非結合Ｉ−１３１−ＩＭＰＲ４とＩ−１３１は陰イオン交換により完全に除去されることを示している。 精製生成物と抗原癌胎児性抗原（ＣＥＡ）複合体の混合物のＳＥＣ−ＨＰＬＣを示し、このＨＰＬＣは、標識抗体により、より高分子量物質の抗体−抗原複合体への完全なピークシフトによって示されるように、この生成物の免疫反応性が完全に維持されていることを示している。

Claims (24)

  1. 放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドとターゲッティング因子との複合体を製造および精製する方法であって、
    （Ａ）（ｉ）非結合放射性ヨウ素、（ii）ターゲッティング因子と結合してない放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチド、および（iii）ターゲッティング因子と結合している放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドを含んでなる溶液を準備すること；
    （Ｂ）その溶液と陰イオン交換樹脂とを接触させること；および
    （Ｃ）その陰イオン交換樹脂と溶液とを供に、陰イオン交換樹脂粒子を捕捉し得るフイルターに通すこと；
    を含んでなり、
    それにより陰イオン交換樹脂が、非結合放射性ヨウ素および非結合放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドとは結合するが、ターゲット因子と結合している放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドとは結合しないことを特徴とするものであって、
    アミノポリカルボキシレート付加ペプチドが、
    Ｘ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；
    Ｘ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）；
    ［Ｘ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（１／２ＤＴＰＡ）］ ２ ；
    Ｘ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；
    Ｘ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；
    Ｘ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；
    Ｘ−Ｌｙｓ（ＭＣＣ）−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；
    Ｘ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ；および
    Ｘ−Ｌｙｓ（Ｘ）−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨ
    （ここで、Ｘはターゲッティング因子と共有結合を形成し得る結合部分を含む架橋剤である）
    からなる群から選択される、方法。
  2. （Ａ）の溶液が、放射活性ヨウ化ナトリウムと、酸化剤としてヨードゲンまたは固定化されたクロラミン‐Ｔのいずれかとを用いて、アミノポリカルボキシレート付加ペプチドを放射性ヨウ素化して放射性ヨウ素化ペプチドを形成すること；および
    放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドとターゲッティング因子とを結合させて放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチドの複合体を形成すること；
    により製造される、請求項１に記載の方法。
  3. 酸化剤がクロラミン−Ｔであり、放射性ヨウ素化が、固定化された不溶性ビーズ型のクロラミン−Ｔの存在下で行われる、請求項２に記載の方法。
  4. フィルターの孔径が０．１μｍ〜０．３μｍの間である、請求項１に記載の方法。
  5. 陰イオン交換樹脂がポリマー格子上にある第四級アンモニウム官能基からなり、ポリマーの架橋度が２％〜１２％であり、樹脂粒子の大きさが２０メッシュ〜４００メッシュ（粒径８５０μｍ〜３８μｍ）の間である、請求項１に記載の方法。
  6. 精製された複合体溶液が、陰イオン交換樹脂に曝す前の溶液中に既に存在していた非結合放射性ヨウ素および非結合放射性ヨウ素化ペプチドの合計を１０％に満たない量で含む、請求項１に記載の方法。
  7. 樹脂を溶液とともに攪拌することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  8. ターゲッティング因子が、マレイミド、クロロアセトアミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ビニルスルホン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、アミデートエステル、イソシアネート、またはイソチオシアネートを含んでなる結合部分により、アミノポリカルボキシレート付加ペプチドと結合されている、請求項１に記載の方法。
  9. マレイミド結合部分が４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル部分である、請求項８に記載の方法。
  10. マレイミド結合部分が２−（Ｎ−マレイミド）アセチル部分である、請求項８に記載の方法。
  11. アミノポリカルボキシレートがＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ベンジル−ＥＤＴＡ、ベンジル−ＤＴＰＡ、ベンジル−ＤＯＴＡ、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、ＮＯＴＡ、またはベンジル−ＮＯＴＡである、請求項１に記載の方法。
  12. ペプチドがＭＣＣ−Ｌｙｓ（ＭＣＣ）−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（（１−（ｐ−ＣＳＮＨ）ベンジル）ＤＴＰＡ）−ＯＨである（ここで、ＭＣＣは４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル部分である）ＩＭＰ−Ｒ４である、請求項１に記載の方法。
  13. ターゲッティング因子がモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である、請求項１に記載の方法。
  14. 前記モノクローナル抗体がインターナライズ型抗体である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記モノクローナル抗体が抗ＣＥＡ ＭＡｂ、ＭＮ−１４；抗ＥＧＰ−１ ＭＡｂ；抗ＣＤ２２ ＭＡｂ；抗ＣＤ２０ ＭＡｂ；抗結腸特異的抗原−ｐ ＭＡｂ；抗ＣＤ７４ ＭＡｂ；抗ＭＵＣ１ ＭＡｂ；抗ＡＦＰ ＭＡｂ；抗前立腺特異的膜抗原；または抗炭酸脱水酵素ＩＸ ＭＡｂである、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記モノクローナル抗体がネズミ、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体であり、完全型、そのフラグメントまたは種々の操作型であってよい、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記モノクローナル抗体がチオール基を有するように誘導体化されているか、またはジスルフィド還元されている、請求項１３に記載の方法。
  18. 放射性ヨウ素がＩ−１２３、Ｉ−１２４、Ｉ−１２５またはＩ−１３１である、請求項１に記載の方法。
  19. 前記モノクローナル抗体が心血管病変部、アミロイド沈着物、感染性生物、炎症、自己免疫疾患、変位または異所性の正常組織、および液性癌または固形癌をターゲッティングし得る、請求項１３に記載の方法。
  20. ターゲッティング因子が多価抗体または多価多重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
  21. 前記多価抗体または多価多重特異性抗体が感染性生物に関連している、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記多価抗体または多価多重特異性抗体がインターナライズ型抗体である、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記多価抗体または多価多重特異性抗体がチオール基を有するように誘導体化されているか、またはジスルフィド還元されている、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記モノクローナル抗体がＭＮ−１４、ＲＳ７、ＬＬ２、１Ｆ５、Ａ２０、Ｍｕ９、ＬＬ１、ＰＡＭ−４、Ｉｍｍｕ３１、Ｊ５９１およびＧ２５０からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
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