CN117147826A - 一种抗体缀合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体缀合物及其应用,涉及抗体偶联技术领域。本发明提供了一种在抗体的二硫键进行定向修饰的技术,利用连接子高效偶联抗体和缀合伙伴,其制备获得的抗体缀合物均一性好,与常规工艺制备的抗体缀合物相比,具有检测灵敏度高、稳定性好等的明显优势,为诊断试剂的开发和应用提供了途径。
Description
交叉引用
本申请要求申请日2022-05-29的中国专利申请号202210595445.3,申请日2023-04-25的中国专利申请号202310471792.X的优先权,并援引其中的内容。
技术领域
本发明涉及抗体偶联技术领域,具体而言,一种抗体缀合物及其应用。
背景技术
诊断领域通常采用EDC、NHS或马来酰亚胺(MAL)偶联蛋白质的羧基、氨基或巯基,这种蛋白偶联技术存在两个问题,影响试剂的灵敏度和精密度。第一,偶联位点的随机性:以IgG1型抗体为例,其平均含有80个赖氨酸,其中20个处于溶剂可及部位,有些溶剂可及的赖氨酸处于Fab的抗原识别区。因此,以抗体的氨基为偶联位点时,由于氨基在抗体中的随机分布,导致抗体缀合物不均一和抗体失活。第二,偶联效率低:NHS与氨基的二级反应动力学为10-1~102M-1S-1,达到平衡时缀合物得率40%,产物得率低,造成原料的浪费,影响试剂的灵敏度。
马来酰亚胺与巯基的二级反应动力学达到102~103M-1S-1,缀合物得率为80%,但是抗体的半胱氨酸残基以二硫键形式存在,溶剂可及的游离巯基很少。另一种方法是用Traut's试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷)将抗体的氨基转变为巯基,但还是存在转化效率低和偶联位点随机性的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体缀合物及其应用。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了一种抗体缀合物,其适用于免疫诊断,其包括以下结构:
从左至右分别为缀合伙伴、放大载体、连接子(即)和抗体;
n、m均为整数且独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
其中,上述整体结构式中的不明确的符号结构(例如缀合伙伴、放大载体)与其它不明确的符号结构或明确的结构(例如连接子)之间可以直接连接,也可以通过中间连接基团连接,因此上述结构式中插入符号L,L表示不存在或L表示连接基团,当L是连接基团,其包含4至30个原子,不计算氢。
优选地,所述放大载体为同时具有二硫键和氨基的物质,优选地,所述放大载体选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵白蛋白。
优选地,所述放大载体为经重桥连改造的放大载体,所述经重桥连改造是指放大载体的二硫键被还原后经重桥连剂重桥连,因此经重桥连改造的放大载体的结构示意为此时,所述抗体缀合物包括以下结构:
其中所述结构选自如下的结构之一:
对于本发明所述抗体缀合物,并不限定结构中连接子的数量,可以具有一个或多个连接子。即抗体可以有多个二硫键,每个二硫键都可以独立地被还原成巯基然后与连接子重构成硫碳桥键如此一个抗体可以连接多个连接子,每个连接子又可以独立地连接缀合伙伴,即形成(缀合伙伴-连接子)x-抗体结构,x为大于等于1的整数。
第二方面,本发明实施例提供了如前述实施例所述的抗体缀合物在制备诊断试剂或试剂盒中的应用。
第三方面,本发明实施例提供了一种试剂盒,包含如前述实施例所述的抗体缀合物。
对于本发明所述的“连接子”,其存在未形成缀合物的形式即具有如下结构也存在形成缀合物的形式即具有如下结构
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种在抗体的二硫键进行定向修饰以进行偶联的技术,其包括用如下结构所示的具有本发明连接子的二硫键重构交联剂(即2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-(PEG)m-酰胺-(PEG)n),
如下所示与二硫键被还原的抗体反应偶联以高效偶联抗体和缀合伙伴,其制备获得的抗体缀合物均一性好,与常规工艺制备的抗体缀合物相比,具有检测灵敏度高、稳定性好等的明显优势,为诊断试剂的开发和应用提供了途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为抗体二硫键经还原剂还原后再次被重构示意图;
图2为基于凝胶电泳显示的抗体的二硫键还原数量RDAR(泳道1~3)和被TSMA重新连接后二硫键还原数量(泳道4~6)的结果;
图3为基于凝胶电泳显示的TCEP浓度对抗体二硫键还原数量的影响;
图4为2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-甲基四嗪的色谱图;
图5为2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-甲基四嗪的质谱图;
图6为2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-甲基四嗪的质谱峰分析图;
图7为2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-甲基四嗪的核磁共振碳谱图;
图8为2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-甲基四嗪的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
对于本发明所述的抗体缀合物,如无对结构的其它具体描述(例如明确说明缀合伙伴-放大载体-连接子结构),则认为“缀合伙伴-连接子”结构中的缀合伙伴与连接子之间可以没有放大载体,也可以有放大载体。由此,对于本发明所述“缀合伙伴-连接子”,并不限定结构中与同一个连接子连接的缀合伙伴的数量,同一个连接子可以连接一个缀合伙伴(无放大载体)或多个缀合伙伴(有放大载体)。即缀合伙伴可以通过放大载体与连接子间接连接,形成(缀合伙伴)y-放大载体-连接子-抗体结构,y为大于等于1的整数,一个放大载体可以连接多个缀合伙伴,这样同一个连接子就能连接多个缀合伙伴,起到放大缀合抗体对样本的检测信号的作用。如果此时抗体也连接多个连接子,则形成((缀合伙伴)y-放大载体-连接子)x-抗体结构,x和y为大于等于1的整数,并且x个(缀合伙伴)y-放大载体-连接子结构中的每一个(缀合伙伴)y-放大载体-连接子结构的y取值互相独立。
对于本发明所述的“重构交联剂”(或二硫键重构剂)和“重桥连剂”(或二硫键重桥连剂),它们的化学功能是一样的,都是将被还原打开的二硫键重新构成硫碳桥键。只是为了区分理解,将作用于抗体的试剂称为重构交联剂,将作用放大载体的试剂称为重桥连剂。本发明的发明点涉及作用于抗体的重构交联剂的结构,但发明点与作用于放大载体的重桥连剂的结构无关,因此本发明的重桥连剂的结构可以与本发明的重构交联剂的结构相同(即TSMA),也可以是现有技术中其它已知的重桥连剂(例如单/双砜类试剂、3,4-二取代马来酰亚胺、二溴哒嗪二酮、二乙烯基嘧啶等)。
对于本发明描绘的抗体缀合物的示意结构,结构中包括明确化学结构部分(例如连接子)和不明确化学结构部分(例如缀合物伙伴、放大载体、抗体),而示意结构是对发明点的简要表示,省略了在明确化学结构部分与不明确化学结构部分之间、不明确化学结构部分与不明确化学结构部分之间存在的“连接基团”。因此本发明的抗体缀合物的示意结构中的可能暗含“连接基团”。
本发明所述“连接基团”是指化学部分(moity),其可以包含约2至约50个原子或4至约30个原子(不计算氢),并且可以包含2至约30个原子、或3至约20个原子的链,所述原子各自独立地选自通常由碳、氧、硫、氮和磷组成的组。在一些实例中,部分或全部所述连接基团可以是连接的分子的一部分,诸如但不限于,例如聚(氨基酸)上的氨基酸残基。连接基团中的杂原子的数目可以是0至约20、或1至约15、或约2至约10。所述连接基团可以是脂族或芳族的。当存在杂原子时,氧通常作为键合至碳、硫、氮或磷的氧代或氧基存在,氮通常作为通常键合至碳、氧、硫或磷的硝基、亚硝基或氨基存在;硫与氧相似;而磷通常作为膦酸单或二酯和磷酸单或二酯键合至碳、硫、氧或氮。在连接基团和待缀合的分子之间形成共价键的常见官能团为烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮、硫醚和羧酸酯、磺酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。
在大多数情况下,连接基团具有连接官能团(用于与基团反应的官能团),包括氮和硫类似物的非氧代羰基基团、磷酸酯基团、氨基基团,烷基化剂诸如卤代或甲苯磺酰基烷基,氧基(羟基或硫类似物、巯基)氧代羰基(例如,醛或酮),或活性烯烃诸如乙烯基砜或α-、β-不饱和酯时,这些官能团可被连接至胺基团、羧基基团、活性烯烃、烷基化剂,例如溴乙酰基。当连接胺和羧酸或其氮衍生物或磷酸时,可形成酰胺、脒和磷酰胺。当连接硫醇和活化烯烃时,形成硫醚。当连接硫醇和烷基化剂时,形成硫醚。当在还原条件下连接醛和胺时,形成烷基胺。当连接酮或醛和羟胺(包括其衍生物,其中取代基取代羟基基团的氢)时,形成肟官能团(=N-O-)。当连接羧酸或磷酸和醇时,形成酯。当连接官能团为例如点击化学基团,包括甲基四嗪、反式环辛烯、叠氮、二苯并环辛炔、四嗪、炔烃、环丙烷环辛炔和环丙烯等时,其可与成对的正交点击化学基团连接。
本发明实施例提供了一种抗体缀合物,其包括以下结构:
从左至右分别为缀合伙伴、放大载体、连接子(即)和抗体;
n、m均为整数且独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
在一些实施例中,放大载体和连接子之间具有带有连接官能团的连接基团,所述连接官能团选自成对的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和氨基,或者成对的MAL(马来酰亚胺)和巯基,或者成对的正交点击化学基团。
在一些实施例中,放大载体和连接子之间存在成对的正交点击化学基团,此时所述抗体缀合物具有如下结构:
其中,所述R1为第一点击化学基团,所述R2为第二点击化学基团,所述第一点击化学基团和/或所述第二点击化学基团选自:甲基四嗪、反式环辛烯、叠氮、二苯并环辛炔、四嗪、炔烃、环丙烷环辛炔和环丙烯中的任意一种,m和n的定义同上;
在一些实施例中,所述第一点击化学基团和所述第二点击化学基团均互斥地选自甲基四嗪和反式环辛烯中的任意一种。
在一些实施例中,放大载体为经重桥连改造的放大载体,所述经重桥连改造是指放大载体的二硫键被还原后经重桥连剂重桥连,因此经重桥连改造的放大载体的结构示意为此时,所述抗体缀合物包括以下结构:
重桥连剂可以是本发明的用于偶联二硫键被还原的抗体的重构交联剂TSMA,也可以是现有技术已知的任意二硫键重桥连剂,例如a:单/双砜类试剂,b:3,4-二取代马来酰亚胺,c:二溴哒嗪二酮和d:二乙烯基嘧啶;取决于所用的上述四种重桥连剂的种类,所述分别对应地包括选自如下的结构之一:/>
在一些实施例中,提供了一种连接子化合物(TSMA),其结构为2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-(PEG)m-酰胺-(PEG)n-R1;
其中,m和n均为整数且独立选自0~24,优选地m+n=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24;优选地m+n=4,优选地m不为零,优选地n不为零,优选地m和n都不为零;
R1的定义同上;而2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺结构是重构交联剂能够将抗体上游离的巯基重新桥连在一起,形成S-C-S的碳硫键,可参照图1。连接子中PEG的数量,即m+n的值为0~24为宜,连接子中PEG的数量能调整缀合伙伴与抗体的间隔距离,间隔太近会影响抗体的空间结构,间隔太远会影响抗体缀合物的稳定。
常用的重构交联剂和点击化学基团都是疏水性强的有机化合物,很难进入水溶性抗体的二硫键位置。例如CN107400072B公布的作为重构交联剂的双乙烯磺酰胺水溶性不好,影响二硫键重构的效率。本发明在重构交联剂中通过设计引入PEG分子,提升了水溶性,增加了二硫键重构的效率,也使得最终缀合产物的检测信号强度大幅提升。
在一些实施例中,所述抗体缀合物的结构式中的硫碳桥键位于抗体铰链区之间、抗体轻重链之间或抗体重链之间。所述抗体重链之间包括CH1之间和Fc区之间。
在一些实施例中,缀合伙伴与连接子通过放大载体间接连接,放大载体选自选自聚糖、多聚赖氨酸、蛋白载体、PEG(聚乙二醇)、聚乙烯亚胺和树枝状聚合物中的至少一种。具体地,聚糖包括交联聚蔗糖、葡聚糖;蛋白载体包括牛血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白中的至少一种;树枝状聚合物包括聚乙二醇和/或聚丙烯亚胺。在一些实施例中,放大载体包括牛血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白中的至少一种。
本文所述抗体以最广义解释,其可以包括全长单克隆抗体,双特异性或多特异性抗体,以及嵌合抗体和抗体的抗原结合片段,只要它们展示所需的生物学活性,并且具有二硫键能在被还原后与2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺结构交联形成硫碳桥键。
点击化学是一种正交的连接反应,常用的有两类:第一种是铜催化的叠氮-炔基环加成反应(CuAAC)或无铜催化的叠氮-二苯并环辛炔应变促进环加成反应(SPAAC);第二种是四嗪类-反式环辛烯反转电子需求加成反应,是目前发现的速率最快的正交反应,二级反应动力学可到30000M-1S-1。具有较强吸电子基团的四嗪的稳定性低于氢取代四嗪,低于甲基取代四嗪。氢取代四嗪表现出异常快的动力学(10000M-1S-1),通常比甲基取代的四嗪类快至少10倍。因此,在四嗪类基团的选择上需要在反应速率和稳定性上取得平衡。发明人发现,1mg/mL甲基四嗪修饰的IgG抗体与TCO修饰的AP(碱性磷酸酶)在90min内可以完全转变为IgG-AP缀合物,且甲基四嗪修饰的IgG抗体在4℃条件下放置一个月活性只降低10~20%。根据这些结果并结合IVD领域的应用场景,本发明中优选甲基四嗪(MTz)和反式环辛烯(TCO)作为点击化学正交对,其它点击化学正交对也能达到类似的效果。
TCO与MTz加成反应过程如下:
在一些实施例中,所述缀合伙伴是标记物,标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物中的至少一种;优选地,所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物中的至少一种;优选地,所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶中的任意一种;优选地,所述放射性同位素选自212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F中的至少一种;优选地,所述化学发光试剂选自鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物中的至少一种;优选地,所述纳米颗粒类标记物选自胶体、有机纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒中的任意一种;优选地,所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶中的至少一种;优选地,所述胶体金属选自胶体金、胶体银和胶体硒中的至少一种。
在一些实施例中,将连接子试剂与二硫键经还原被打开的抗体偶联过程如下:
为了演示方便,后文所述“抗体-具体点击化学基团”用来表示本发明的带有具体点击化学基团的抗体-连接子结构。
本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的抗体缀合物在制备诊断试剂或试剂盒中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
本发明研发思路是锚定抗体的二硫键,先将二硫键还原打开得到两个游离巯基,再用重桥连试剂连接巯基形成硫碳桥键。本发明设计了一种烯丙基砜类化合物接头,发现将其用于偶联抗体制备标记抗体,所得标记抗体在免疫检测中有出乎意料的灵敏度效果。
实施例1
2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-(PEG)m-酰胺(TSMA)及2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-(PEG)m-酰胺-(PEG)n-R1(带点击化学基团的TSMA)的制备。
合成中所用化学试剂如无特殊说明,皆购买自麦克林试剂网。
本实施例以m=4为例说明标题化合物的制备方法,而实际上在制备方法中通过改变使用的化合物A中的PEG单元数量来相应获得其它m取值(包括零的正整数)的标题化合物(其它不同m取值的化合物A也可以从麦克林试剂网买到)。
以下示例性描述了2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-甲基四嗪的制备过程。
(1)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-(PEG)4-酰胺(TSMA)的制备
①
a.将叔丁氧羰基-亚氨基-四聚乙二醇-胺(化合物A,200mg,0.65mmol)溶于10mLDMF(N,N-二甲基甲酰胺)中,加入甲基丙烯酸(化合物B,67mg,0.78mmol),DCC(二环己基碳二亚胺,193mg,0.94mmol)以及NHS(N-羟基丁二酰亚胺,119mg,1.03mmol),25℃磁力搅拌12小时。
b.旋蒸除去溶剂,将粗产物溶于10mL去离子水中,过滤除去沉淀,旋蒸除去溶剂后,使用柱色谱(丙烯酸乙酯:正己烷=1:1)提纯,得到叔丁氧羰基-亚氨基-四聚乙二醇-甲基丙烯酰胺(化合物C),产率约90%。
上述步骤中,甲基丙烯酸可由但不限于如甲基丙烯酰卤(如甲基丙烯酰氯、甲基丙烯酰溴、甲基丙烯酰氟等)或甲基丙烯酸酐替换。当使用甲基丙烯酰卤或甲基丙烯酸酐时,合成步骤如下:
a.将叔丁氧羰基-亚氨基-四聚乙二醇-胺(化合物A,200mg,0.65mmol)溶于10mL二氯甲烷中,在0℃下加入三乙胺(78.8mg,108μL,0.78mmol),甲基丙烯酰卤或甲基丙烯酸酐(0.78mmol),磁力搅拌12小时。
b.旋蒸除去溶剂,将粗产物溶于30mL二氯甲烷中,使用1M HCl和饱和氯化钠溶液洗涤,有机层使用无水硫酸钠干燥后,旋蒸除去溶剂。使用柱色谱(丙烯酸乙酯:正己烷=1:1)提纯,得到叔丁氧羰基-亚氨基-四聚乙二醇-甲基丙烯酰胺(化合物C),产率约90%。
②
a.将化合物C(200mg,0.53mmol)溶于5mL二氯甲烷中,加入4-甲苯磺酰氯(化合物D,152mg,0.80mmol),25℃磁力搅拌24小时。
b.之后加入三乙胺(162mg,223μL,1.60mmol)搅拌12小时。将粗产物用1M HCl,饱和碳酸氢钠溶液,饱和氯化钠溶液洗涤后,使用无水硫酸镁干燥,旋蒸除去溶剂。
c.将粗产物溶于10mL乙酸乙酯中,在0℃下加入三乙胺(162mg,223μL,1.60mmol)回流12小时。旋蒸除去溶剂后,使用柱色谱(丙烯酸乙酯:正己烷=3:1)提纯,得到叔丁氧羰基-2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酸酯(化合物E),产率约70%。
上述步骤中,4-甲苯磺酰氯可由但不限于如4-甲苯亚磺酸钠替换。当使用4-甲苯亚磺酸钠时,上述合成步骤中的a和b步骤如下:
a.将化合物C(200mg,0.53mmol)溶于5mL二氯甲烷中,加入4-甲苯亚磺酸钠(143mg,0.80mmol)和碘(204mg,0.80mmol),25℃磁力搅拌72小时。
b.之后加入三乙胺(162mg,223μL,1.60mmol)搅拌12小时。将粗产物用1M HCl,饱和碳酸氢钠溶液,饱和硫代硫酸钠溶液,饱和氯化钠溶液洗涤后,使用无水硫酸镁干燥,旋蒸除去溶剂。
c步骤相同。
③将化合物E(26.7mg,0.05mmol)溶于5mL二氯甲烷中,加入三氟乙酸(278mg,2.50mmol),25℃磁力搅拌12小时,旋蒸除去溶剂得到TSMA,产率约98%。
(2)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-甲基四嗪(TSMA-MTz)的制备
①将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL二氯甲烷中,加入DIEA(N,N-二异丙基乙基胺,7.5mg,0.06mmol)或三乙胺(6.1mg,8.4μL,0.06mmol),搅拌溶匀。将甲基四嗪-PEG4-NHS酯(化合物F,购买自西安康福诺生物科技有限公司,16.7mg,0.03mmol)溶于1mL二氯甲烷中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。
②混合物在25℃下磁力搅拌12小时,旋蒸除去溶剂,将粗产物溶于20mL二氯甲烷中,用饱和氯化钠溶液洗涤后,使用无水硫酸镁干燥,旋蒸除去溶剂后,使用柱色谱(二氯甲烷:甲醇=20:1)提纯,得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-甲基四嗪(化合物G,TSMA-MTz),产率约50%。
对产物进行液相色谱-质谱联用检测和核磁共振检测,检测结果见附图4-8,证明该方法确实成功制备得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-甲基四嗪。
上述是以n=4为例说明标题化合物的制备方法,实际上可使用含有不同PEG单元数量的甲基四嗪-PEGn-NHS酯来合成具有不同n取值(包括零的正整数)的标题化合物。而且此处的甲基四嗪也可由其它的四嗪类基团替代,如四嗪(如无其它说明,本文所用的各种点击化学基团-PEGn-NHS化合物都可从西安康福诺生物科技有限公司定制)。比如制备时,参照前面的操作步骤,其他合成步骤不变,仅需将甲基四嗪-PEG4-NHS酯分别更换为等摩尔量的甲基四嗪-NHS酯、四嗪-PEG4-NHS酯以及四嗪-NHS酯,可以分别合成得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-甲基四嗪、2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-四嗪以及2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-四嗪。
本实施例的化合物也可在水相中的合成,在水相合成时示例性步骤如下:
将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL去离子水中,调节pH为7.0-8.0,搅拌溶匀。将甲基四嗪-PEG4-NHS酯(化合物F,购买自西安康福诺生物科技有限公司,16.7mg,0.03mmol)或等摩尔量的四嗪-PEG4-NHS酯溶于1mL去离子水中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。混合物在25℃下磁力搅拌12小时,即制得2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-甲基四嗪或2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-四嗪的水溶液。
(3)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-(4E)-反式环辛烯(TSMA-TCO)的制备。
①将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL二氯甲烷中,加入DIEA(N,N-二异丙基乙基胺,7.5mg,0.06mmol)或三乙胺(6.1mg,8.4μL,0.06mmol),搅拌溶匀。将(4E)-反式环辛烯-PEG4-NHS酯(购买自西安康福诺生物科技有限公司,15.4mg,0.03mmol)溶于1mL二氯甲烷中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。
②混合物在25℃下磁力搅拌12小时,旋蒸除去溶剂,将粗产物溶于20mL二氯甲烷中,用饱和氯化钠溶液洗涤后,使用无水硫酸镁干燥,旋蒸除去溶剂后,使用使用柱色谱(二氯甲烷:甲醇=20:1)提纯,得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-(4E)-反式环辛烯(TSMA-TCO)。
上述是以n=4为例说明标题化合物的制备方法,可使用含有不同PEG单元数量的(4E)-反式环辛烯-PEGn-NHS酯来合成具有不同n取值的2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-(4E)-反式环辛烯,而(4E)-反式环辛烯也可替换为(2E)-反式环辛烯。比如制备时,参照前面的步骤,其他合成步骤不变,仅需将(4E)-反式环辛烯-PEG4-NHS酯分别更换为等摩尔量的(4E)-反式环辛烯-NHS酯,以及(2E)-反式环辛烯-PEG4-NHS酯,可分别合成得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-(4E)-反式环辛烯,以及2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-(2E)-反式环辛烯。
本实施例的化合物也可在水相中的合成。在水相合成时示例性步骤如下:
将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL去离子水中,调节pH为7.0-8.0,搅拌溶匀。将(4E)-反式环辛烯-PEG4-NHS酯(购买自西安康福诺生物科技有限公司,15.4mg,0.03mmol)或等摩尔量的(2E)-反式环辛烯-PEG4-NHS酯溶于1mL去离子水中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。混合物在25℃下磁力搅拌12小时,即制得2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-(4E)-反式环辛烯或2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-(2E)-反式环辛烯的水溶液。
(4)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-叠氮(TSMA-N3)的制备
①将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL二氯甲烷中,加入DIEA(N,N-二异丙基乙基胺,7.5mg,0.06mmol)或三乙胺(6.1mg,8.4μL,0.06mmol),搅拌溶匀。将叠氮-PEG4-NHS酯(0.03mmol)溶于1mL二氯甲烷中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。
②混合物在25℃下磁力搅拌12小时,旋蒸除去溶剂,将粗产物溶于20mL二氯甲烷中,用饱和氯化钠溶液洗涤后,使用无水硫酸镁干燥,旋蒸除去溶剂后,使用使用柱色谱(二氯甲烷:甲醇=20:1)提纯,得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-叠氮(TSMA-N3)。
上述是以n=4为例说明本实施例标题化合物的制备方法,实际上可使用含有不同PEG单元数量的叠氮-PEGn-NHS酯(此处的叠氮-PEGn-NHS酯可从上海芃硕生物科技公司定制)来合成具有不同n取值的2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEGn-叠氮。比如制备时,参照前面的步骤,其他合成步骤不变,仅需将叠氮-PEG4-NHS酯分别更换为等摩尔量的叠氮-PEG2-NHS酯,以及叠氮-PEG8-NHS酯,可分别合成得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG2-叠氮以及2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG8-叠氮。
本实施例的化合物也可在水相中的合成。在水相合成时示例性步骤如下:
将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL去离子水中,调节pH为7.0-8.0,搅拌溶匀。将叠氮-PEG4-NHS酯(0.03mmol)溶于1mL去离子水中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。混合物在25℃下磁力搅拌12小时,即制得2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-叠氮的水溶液。
(5)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-DBCO(TSMA-DBCO)的制备
①将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL二氯甲烷中,加入DIEA(N,N-二异丙基乙基胺,7.5mg,0.06mmol)或三乙胺(6.1mg,8.4μL,0.06mmol),搅拌溶匀。将DBCO-PEG4-NHS酯(购买自西安康福诺生物科技有限公司,0.03mmol)溶于1mL二氯甲烷中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。
②混合物在25℃下磁力搅拌12小时,旋蒸除去溶剂,将粗产物溶于20mL二氯甲烷中,用饱和氯化钠溶液洗涤后,使用无水硫酸镁干燥,旋蒸除去溶剂后,使用使用柱色谱(二氯甲烷:甲醇=20:1)提纯,得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-DBCO(TSMA-DBCO)。
上述是以n=4为例说明本实施例标题化合物的制备方法,实际上可使用含有不同PEG单元数量的DBCO-PEGn-NHS酯来合成具有不同n取值的2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEGn-DBCO。比如制备时,参照前面的步骤,其他合成步骤不变,仅需将DBCO-PEGn-NHS酯分别更换为等摩尔量的DBCO-NHS酯,以及DBCO-PEG2-NHS酯,可分别合成得到2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-DBCO,以及2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG2-DBCO上述原料均可以购买自西安康福诺生物科技有限公司。
本实施例的化合物也可在水相中的合成。在水相合成时示例性步骤如下:将TSMA(13mg,0.03mmol)溶于2mL去离子水中,调节pH为7.0-8.0,搅拌溶匀。将DBCO-PEG4-NHS酯(购买自西安康福诺生物科技有限公司,0.03mmol)溶于1mL去离子水中,溶匀后加入TSMA的上述溶液中。混合物在25℃下磁力搅拌12小时,即制得2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-PEG4-DBCO的水溶液。
实施例2
点击化学基团修饰的缀合伙伴的制备。
对于本实施例示例性制备的点击化学基团修饰的碱性磷酸酶,在点击化学基团和碱性磷酸酶之间存在着PEG4间隔臂,但实际上点击化学基团和碱性磷酸酶可以直接连接也可以通过一些间隔臂连接,后文有试验数据证明点击化学基团和碱性磷酸酶之间是否存在间隔臂对最终抗体缀合物的检测信号强度没有实质影响。
(1)碱性磷酸酶-反式环辛烯(AP-TCO)的制备
碱性磷酸酶(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到100mM pH7.4的PBS缓冲液中。10mM的TCO-PEG4-NHS(10eq,DMSO溶解),添加到40uM的碱性磷酸酶溶液中,25℃条件下反应1个小时。然后,多余的TCO-PEG4-NHS用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)进行脱盐处理,置换到PB(50mM,pH7.4)缓冲液中。制备得到AP-TCO,用PB(50mM,pH7.4)缓冲液稀释至4mg/mL,置于4℃保存备用。
(2)碱性磷酸酶-甲基四嗪(AP-MTz)的制备
碱性磷酸酶(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到100mM pH7.4的PBS缓冲液中。10mM的甲基四嗪-PEG4-NHS(10eq,DMSO溶解),添加到40uM的碱性磷酸酶溶液中,25℃条件下反应1个小时。然后,多余的甲基四嗪-PEG4-NHS用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)进行脱盐处理,置换到PB(50mM,pH7.4)缓冲液中。制备得到AP-MTz,用PB(50mM,pH7.4)缓冲液稀释至4mg/mL,置于4℃保存备用。
(3)碱性磷酸酶-二苯并环辛炔(AP-DBCO)的制备
碱性磷酸酶(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到100mM pH7.4的PBS缓冲液中。10mM的DBCO-PEG4-NHS(10eq,DMSO溶解),添加到40uM的碱性磷酸酶溶液中,25℃条件下反应1个小时。然后,多余的DBCO-PEG4-NHS用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)进行脱盐处理,置换到PB(50mM,pH7.4)缓冲液中。制备得到AP-DBCO,用PB(50mM,pH7.4)缓冲液稀释至4mg/mL,置于4℃保存备用。
(4)吖啶酯-(未改造)牛血清白蛋白-反式环辛烯(AE-BSA-TCO)的制备
本实施例在作为放大载体的牛血清白蛋白上同时修饰连接吖啶酯和反式环辛烯,一个放大载体分子会连接有多个吖啶酯分子,后续抗体与该放大载体偶联,则一个抗体分子可以间接连接有多个吖啶酯分子。
牛血清白蛋白(5mg/mL)用100mM pH7.4的PBS缓冲液溶解,加入10mM的TCO-PEG4-NHS(10eq,DMSO溶解),25℃条件下反应1个小时。多余的TCO-PEG4-NHS用ZebaTM脱盐柱(10KMWCO)进行脱盐处理,置换到100mM pH7.4的PBS缓冲液中。然后加入10mM的吖啶酯-NHS(20eq,DMSO溶解),25℃条件下反应1个小时。多余的吖啶酯-NHS用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)进行脱盐处理,置换到PB(50mM,pH7.4)缓冲液中。制备得到AE-BSA-TCO-,用PB(50mM,pH7.4)缓冲液稀释至4mg/mL,置于4℃保存备用。
(5)吖啶酯-重桥连改造的牛血清白蛋白-反式环辛烯(AE-rebridged BSA-TCO)的制备
在将吖啶酯分子和抗体分子偶联于牛血清白蛋白分子时,通常锚定牛血清白蛋白的氨基作为连接官能团位点,如上述实施例2.(4)的记载,其中吖啶酯-NHS分子连接于牛血清白蛋白的氨基,而TCO-PEG4-NHS分子也连接于牛血清白蛋白的氨基,则后续工艺(实施例5)偶联得到的抗体缀合物中,吖啶酯分子和抗体分子实际都是锚定牛血清白蛋白的氨基作为连接官能团位点。然而牛血清白蛋白表面可用的氨基数目不超过30个,吖啶酯分子和抗体分子竞争有限的氨基位点,最终抗体缀合物中的吖啶酯分子-抗体分子比例也会受到限制。
鉴于此,本实施例提供一个更优选的方案,即锚定牛血清白蛋白的二硫键,将牛血清白蛋白的二硫键还原打开,然后加入重桥连剂重构形成硫碳桥键,从而引入重桥连剂作为提供给抗体分子的连接官能团位点,而吖啶酯依然定牛血清白蛋白的氨基作为连接官能团位点。因而,最终抗体缀合物中的吖啶酯分子-抗体分子比例得到提高,实验操作如下:
①将牛血清白蛋白(4mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(7K MWCO)置换到PBS(10mM,pH7.4,150mM NaCl)缓冲液中。取TCEP(Sigma)用PBS缓冲液配置成100mM溶液。在牛血清白蛋白溶液中加入20eq的TCEP,25℃下温和振荡(400rpm)反应2个小时后置换到PB(50mM,pH7.8)缓冲液中。
②将TSMA-TCO在干燥条件下用DMSO配置成60mM溶液。在步骤①所得BSA溶液中加入20eq的TSMA-TCO,在4℃条件下反应16个小时。BSA溶液中多余的化学试剂用ZebaTM脱盐柱(7K MWCO)置换到PBS缓冲液中。制备得到重桥连改造的牛血清白蛋白-反式环辛烯(rebridged BSA-TCO),置于4℃下保存备用。
③将吖啶酯-NHS(AE-NHS)在干燥条件下用DMSO配置成8mM溶液。在步骤②得到的rebridged BSA-TCO溶液中加入20eq的吖啶酯-NHS,在25℃条件下反应60分钟,加入200eq甘氨酸溶液(100mM),继续反应30分钟,用ZebaTM脱盐柱(7K MWCO)置换到PBS缓冲液中。制备得到吖啶酯-重桥连改造的牛血清白蛋白-反式环辛烯(AE-rebridged BSA-TCO),置于4℃下保存备用。
实施例3
抗体二硫键的还原。
本发明的实施例选取IgG1、IgG2a、IgG2b鼠单克隆抗体进行研究,其中IgG1型抗体包括AFP抗体、CA153抗体、CA724抗体、CA199抗体和HIV P24抗体;IgG2a型抗体为CA125抗体;IgG2b抗体为cTnI抗体。
可以在抗体二硫键处还原得到两个游离巯基,然后加入带有2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺结构的接头分子,通过2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺与两个游离巯基的连接反应,重新连接成硫碳桥键。上述抗体在铰链区有2~4个二硫键,在轻重链之前也有二硫键,可以调整还原工艺使得更倾向于在抗体的铰链区还原二硫键或更倾向于在抗体的轻重链之间还原二硫键。
(1)抗体铰链区二硫键的还原
抗体(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到PBS(100mM PB,50mM氯化钠,pH7.4,1mM EDTA)缓冲液中。2-MEA(2-巯基乙胺盐酸盐)用PBS(100mM,50mM氯化钠,pH7.4,1mM EDTA)配置成10mM溶液。在抗体溶液中加入10eq的2-MEA,25℃下温和振荡(400rpm)反应1个小时。还原处理的抗体置于4℃下保存备用。
(2)轻重链间二硫键的还原
抗体(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到PB(50mM,pH7.4,1mM EDTA)缓冲液中。TCEP(Sigma)用PB(50mM,pH7.4,1mM EDTA)配置成10mM溶液。在抗体溶液中加入2eq的TCEP,37℃下温和振荡(400rpm)反应2个小时。还原处理的抗体置于4℃下保存备用。
实施例4
抗体二硫键的重构。
(1)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-甲基四嗪(TSMA-MTz)接头分子的引入
TSMA-MTz在干燥条件下用DMSO配置成10mM溶液。在还原的抗体溶液中加入20eq的TSMA-MTz,在4℃条件下反应16个小时。抗体溶液中多余的化学试剂用ZebaTM脱盐柱(10KMWCO)置换到PB(50mM,pH7.4)的缓冲液中。制备得到抗体-连接子-甲基四嗪(抗体-MTz),用PB(50mM,pH7.4)稀释至4mg/mL,置于4℃下保存备用。
(2)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-反式环辛烯(TSMA-TCO)接头分子的引入
TSMA-TCO在干燥条件下用DMSO配置成10mM溶液。在还原的抗体溶液中加入20eq的TSMA-TCO,在4℃条件下反应16个小时。抗体溶液中多余的化学试剂用ZebaTM脱盐柱(10KMWCO)置换到PB(50mM,pH7.4)的缓冲液中。制备得到抗体-连接子-反式环辛烯(抗体-TCO),用PB(50mM,pH7.4)稀释至4mg/mL,置于4℃下保存备用。
(3)2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-PEG4-酰胺-叠氮(TSMA-N3)接头分子的引入
TSMA-N3在干燥条件下用DMSO配置成10mM溶液。在还原的抗体溶液中加入20eq的TSMA-N3,在4℃条件下反应16个小时。抗体溶液中多余的化学试剂用ZebaTM脱盐柱(10KMWCO)置换到PB(50mM,pH7.4)的缓冲液中。制备得到抗体-连接子-叠氮(抗体-N3),用PB(50mM,pH7.4)稀释至4mg/mL,置于4℃下保存备用。
实施例5
缀合伙伴定向交联的抗体缀合物的制备。
(1)取前述实施例的抗体-MTz(4mg/mL)与AP-TCO(4mg/mL),按摩尔比是1:1进行交联,25℃下反应一个小时,得到本发明的碱性磷酸酶标记的抗体缀合物。反应完后,置于4℃下保存备用。
(2)取前述实施例的抗体-TCO(4mg/mL)与AP-MTz(4mg/mL),按摩尔比是1:1进行交联,25℃下反应一个小时,得到本发明的碱性磷酸酶标记的抗体缀合物。反应完后,置于4℃下保存备用。
(3)取前述实施例的抗体-N3(4mg/mL)与AP-DBCO(4mg/mL),按摩尔比是1:1进行交联,25℃下反应一个小时,得到本发明的碱性磷酸酶标记的抗体缀合物。反应完后,置于4℃下保存备用。
(4)取前述实施例的抗体-MTz(4mg/mL)与AE-BSA-TCO(4mg/mL),按摩尔比是1:1进行交联,25℃下反应一个小时,得到本发明的通过(未改造)牛血清白蛋白作放大载体的吖啶酯标记的抗体缀合物。反应完后,置于4℃下保存备用。
(5)取前述实施例的抗体-MTz与AE-rebridged BSA-TCO,按摩尔比1.5:1进行交联25℃下反应一个小时,得到本发明的通过(重桥连改造)牛血清白蛋白作放大载体的吖啶酯标记的抗体缀合物,置于4℃下保存备用。
对比例1
提供了一种常规工艺抗体缀合物的制备方法,具体如下。
常规的IVD领域抗体缀合物的制备原理是利用蛋白质氨基酸侧链的氨基或巯基作偶联位点。
常规工艺制备碱性磷酸酶抗体缀合物的方法如下:
(1)抗体的巯基化修饰(IgG-SH):
抗体(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到PBS(100mM PB,50mM氯化钠,pH8.0,5mM EDTA)。Traut’s reagent(Pierce)用PBS(100mM PB,50mM氯化钠,pH7.4,1mMEDTA)配置成10mM溶液。在抗体溶液中加入10eq的Traut’s reagent,25℃下温和振荡(400rpm)反应2个小时。脱盐除去多余的试剂,巯基化修饰的抗体置于4℃下保存备用。
(2)碱性磷酸酶的马来酰亚胺修饰(AP-MAL):
碱性磷酸酶(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到PBS(10mM PB,50mM氯化钠,pH7.4,5mM EDTA)缓冲液中。10mM的SMCC(10eq,DMSO溶解),添加到40uM的碱性磷酸酶溶液中,25℃条件下反应1个小时。脱盐除去多余的试剂,马来酰亚胺修饰的AP置于4℃保存备用。
(3)IgG-SH和AP-MAL交联:
巯基修饰的抗体(4mg/mL)和马来酰亚胺修饰的AP(4mg/mL)在PBS(10mM PB,50mM氯化钠,pH7.4)缓冲液中25℃反应1个小时。反应完后,置于4℃下保存备用。
常规工艺制备吖啶酯抗体缀合物的方法如下:
抗体(5mg/mL)用ZebaTM脱盐柱(10K MWCO)置换到PBS(10mM PB,50mM氯化钠,pH7.4,5mM EDTA)缓冲液中。10mM的NHS-AE(10eq,DMSO溶解),添加到30uM的抗体溶液中,25℃条件下反应1个小时。反应完后,脱盐除去多余的试剂,置于4℃下保存备用。
验证例1
验证抗体铰链区的还原和修饰。
2-巯基乙胺盐酸盐(2-Mercaptoethylamine·HCl)简称2-MEA,是一种温和还原剂,可以特异性地倾向还原抗体铰链区的二硫键,而不还原抗体其它位点的二硫键。
选用10eq、5eq、3eq三个浓度的2-MEA对AFP单克隆抗体(鼠IgG1型)进行还原(过程参照实施例3)。发现3eq的2-MEA的还原特异性最优,只打开一个铰链区二硫键,抗体的二硫键还原数量RDAR为1.1(图2和表1)。
表1抗体的二硫键还原数量RDAR
序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
厂家 | 10eq | 5eq | 3eq | 10eq | 5eq | 3eq |
RDAR | 3.4 | 2.5 | 1.1 | 0.02 | 0.02 | 0.01 |
在10eq和5eq的2-MEA还原下,AFP抗体轻重链间二硫键被不同程度的打开,抗体的二硫键还原数量RDAR为3.4和2.5(序号1~2)。
三种还原的AFP抗体在TSMA-MTz接头分子的作用下,被打开的二硫键又重新连接形成硫碳桥键(过程参照实施例4),再次形成一个完整的抗体,抗体二硫键还原数量为0.01~0.02(序号4~6),说明大部分抗体的断开的二硫键再次形成硫碳桥键。
验证例2
将验证例1中的带MTz标签的三个抗体分别与碱性磷酸酶交联(过程参照实施例5),配置成AFP检测试剂,进行灵敏度测试。检测结果显示,3eq的2-MEA制备的抗体缀合物与5eq和10eq的2-MEA的相比,低值样本(CL)的灵敏度分别高23.2%和26.7%(表2)。
表2 AFP项目灵敏度测试
这个结果说明,抗体铰链区二硫键是比抗体轻重链间二硫键更优的偶联位点。在抗体铰链区二硫键位置偶联缀合伙伴后对抗体的结构和功能影响更小。
应用本发明实施例制备的抗体缀合物与常规工艺相比,低值样本(CL)灵敏度分别高127%、120%、179%,具有明显的优势。
验证例3
二硫键还原位点的控制。
鼠IgG有三种亚型,IgG1,IgG2a和IgG2b,不同亚型在链间二硫键的数量上有差异。IgG2a和IgG2b链间二硫键数量均为6个,而IgG1为4个。选取CA153(IgG1)和cTnI(IgG2b)两种亚型的鼠IgG抗体进行研究。
将浓度为1mg/mL的CA153和cTnI抗体,分别均分成7等份。TCEP用PB(50mM,pH7.4,1mM EDTA)配置成10mM溶液。在7份抗体溶液中分别加入0eq,5eq,10eq,15eq,20eq,30eq和50eq的TCEP溶液,37℃下温和振荡(400rpm)反应2小时。反应结束后,取蛋白样品进行SDS-PAGE和抗体二硫键还原数量分析。结果见图3。
结果表明,TCEP浓度和抗体二硫键还原数量(RDAR)呈正相关,TCEP浓度越高,抗体二硫键还原数量越多。通过调节TCEP的浓度,可以控制抗体链间二硫键的还原数量。TCEP浓度10eq时,IgG1抗体的二硫键打开数量是3.1,IgG2b抗体链间二硫键打开数量1.6个。
进一步的,用10eq TECP还原的CA153抗体和cTnI抗体与碱性磷酸酶进行交联(采用实施例1的TSMA-MTz)。得到的抗体缀合物进行灵敏度测试,结果见表3。
表3不同项目灵敏度
表3显示,使用本发明技术制备的cTnI抗体缀合物和CA153抗体缀合物和常规工艺制备的抗体缀物相比,低值样本(CL)的灵敏度分别高96%和220%。同时,两种抗体灵敏度提升的差异暗示灵敏度和抗体二硫键还原数量(RDAR)呈正相关。即二硫键还原数量越多,灵敏度越高。
验证例4
点击化学反应正交性评估。
AFP单克隆抗体(IgG1)、10eq TCEP还原的AFP单克隆抗体、10eq TCEP还原后20eqTSMA-MTz(实施例1)重构AFP单克隆抗体分别与AP-TCO交联,摩尔比1:1,25℃反应一个小时后,4℃保持备用。
同时,10eq TCEP还原后20eq TSMA-MTz重构的AFP单克隆抗体与AP交联,摩尔比1:1,25℃反应一个小时后,4℃保持备用。
按照常规工艺制备IgG-SH和AP-MAL,按照摩尔比1:1进行交联,25℃反应一个小时后,4℃保持备用。
制备得到5种AFP单克隆抗体缀合物,按一定比例稀释成缀合物工作液,与磁珠工作液搭配组成检测试剂,进行灵敏度测试。从灵敏度测试结果看(表4)。
表4点击化学反应正交性评估
AP-TCO与IgG、TCEP还原的IgG交联得到的抗体缀合物没有活性,AP与抗体-MTz制备得到抗体缀合物也没有信号,只有AP-TCO与抗体-MTz制备得到的抗体缀合物有活性,这一结果说明了点击化学基团的正交性。同时也说明,点击化学基团不与蛋白的氨基、巯基或羧基等生物活性基团反应,具有良好的生物相容性。
验证例5
二硫键重构定向交联剂技术通用性评估。
对2个IgG1型抗体和1个IgG2a项目进行测试,评估本发明实施例提供的技术在免疫诊断领域的通用性。
IgG1型选取CA724和HIV P24两个项目的单克隆抗体,IgG2a型选取CA125项目的单克隆抗体,用本发明的技术制备碱性磷酸酶抗体缀合物(采用连接子TSMA-MTz),与各自的磁珠包被物搭配组成检测试剂,进行灵敏度测试。从灵敏度测试结果看(表5)。
表5二硫键重构定向交联技术通用性评估
表6二硫键重构定向交联技术通用性评估
IgG2a型抗体CA125项目应用本发明的技术,低值样本(CL)的灵敏度能提高108.1%。IgG1型抗体CA724项目应用本发明的技术,低值样本(CL)的灵敏度能提高63.9%。HIV四代检测试剂P24抗原的检测灵敏度能够提高检测的窗口期,对HIV的临床诊断具有重要的意义。从表6可以看出,应用本发明的技术检测1.25IU/mL的国际标准品(NIBSC,英国国家生物制品检定所),P/N比达到30.3,灵敏度相对于常规工艺可以提高105.3%。
验证例6
二硫键还原位点与灵敏度和相关性的关系。
根据前述验证的结果可知,铰链区二硫键是比轻重链间二硫键更优的偶联位点。分别用10eq浓度TCEP和2-MEA还原CA153抗体,然后用20eq TSMA-MTz(实施例1)重构二硫键后,加入AP-TCO进行交联,抗体-MTz与AP-TCO的摩尔比是1:1。制备得到2个定向交联的缀合物与常规工艺制备得到的缀合物一起进行SEC-HPLC分析,灵敏度和相关性测试。
表7CA153项目灵敏度
TCEP和2-MEA两种还原方式,即轻重链二硫键和铰链区二硫键重构制备得到的缀合物,低值样本(CL)的灵敏度比常规工艺分别高189%和200%(表7)。铰链区二硫键重构比轻重链二硫键重构在在灵敏度上优势不明显。
用上述三种不同工艺制备得到抗体缀合物组成检测试剂,分别对57例浓度范围为4.22~367.4U/mL的罗氏临床样本进行测试,每个浓度的样本检测1次,测试数据见补充材料1。以菲鹏仪器测试得到RLU为y轴变量,以罗氏临床样本的浓度值为x轴变量,进行线性回归分析和数据拟合。常规工艺,TCEP还原抗体和2-MEA还原抗体得到的缀合物,相关系数分别为0.9524、0.9257、0.9789(表7)。铰链区二硫键重构比轻重链二硫键重构在相关性上具有明显优势。
SEC-HPLC分析显示,常规工艺,TCEP还原工艺和2-MEA还原工艺的得率分别为43.78%、87.67%、91.16%。抗体缀合物得率与其灵敏度结果一致。常规工艺得到的抗体缀合物是二聚体,三聚体和四聚体的混合物,本发明技术得到的抗体缀合物是以三聚体为主的均一物。
验证例7
2-(甲苯磺酰)甲基丙烯酰胺-(PEG)m-酰胺-(PEG)n-MTz连接子具有不同PEG数量对检测灵敏度的影响。
合成m+n=0、2、3、4、8、16六种取值的标题化合物连接子与CA153抗体偶联得到CA153抗体-MTz,再与反式环辛烯-AP偶联得到CA153抗体-AP缀合物(参照实施例5),然后进行对CA153样本的检测灵敏度测试。测试结果显示,m+n=0、2、3、4、8、16六种CA153抗体-AP缀合物在测试CA153低值样本(CL)的P/N比分别为1.4、1.9、3.6、3.1、2.1(表8),表中C0表示背景值样本,CL表示低值样本,CH表示高值样本,下同。
表8连接子不同PEG数量的灵敏度(CA153)
在没有PEG分子的情况下,连接子的溶剂可及性低,二硫键重构效率低,灵敏度显著降低。PEG分子数量太多,影响抗体缀合物的结构和稳定,不利于免疫反应的进行,灵敏度降低。连接子最合适的PEG分子数量在4~8之间,其中4个最优。
验证例8缀合伙伴与点击化学基团之间存在间隔臂对检测灵敏度无影响。
分别用TCO-NHS和TCO-PEG4-NHS对碱性磷酸酶进行TCO修饰,得到AP-PEG4-TCO和AP-TCO,再分别与验证例7的CA153抗体-MTz进行交联,摩尔比1:1。制备得到缀合伙伴与点击化学基团之间的PEG分子数量分别为0和4的两种抗体-AP缀合物,并对CA153样本进行灵敏度测试。表9测试结果显示,缀合伙伴与点击化学基团之间的PEG分子数量分别为0和4的抗体-AP缀合物在测试不同含量的CA153样本时的灵敏度基本一致,说明缀合伙伴与点击化学基团之间是否有间隔臂对抗体缀合物的检测灵敏度影响不大。
表9缀合伙伴与点击化学基团之间有无间隔臂对灵敏度的影响(CA153)
验证例9
二硫键重构技术所得抗体缀合物热稳定性评估。
用10eq的2-MEA和10eq的TCEP分别还原CA242抗体,然后用20eq的TSMA-MTz(同实施例4)进行二硫键重构得到抗体-MTz,然后与AP-TCO按摩尔比1:1进行交联,得到抗体-AP缀合物。取本发明制备的两种抗体-AP缀合物和常规工艺的抗体-AP缀合物分别用缀合伙伴稀释液进行稀释,制备得到酶标工作液。三种不同的酶标工作液分别均分为三等分,一份置于2~8℃保存,作为对照样品。另外两份置于37℃恒温箱中,作为试验样品,第3天和第7天,取出试验样品放置于2~8℃保存。最后一天,所有样品与磁珠工作液组成检测试剂,对CA242的三个不同浓度的样本进行测试,每个样品测试2次,得到相对发光值(RLU),并计算相对发光值均值。计算试验组和对照组的相对偏差。
表10二硫键重构技术所得抗体缀合物热稳定性评估(CA242)
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从实验结果可以看出(表10),常规工艺抗体缀合物加速3天和7天,低值样本(CL)发光值偏差分别为-12%和16%。2-MEA和TCEP两种还原剂制备得到的定向交联抗体缀合物,加速3天和7天的发光值偏差均小于10%。本发明技术得到的抗体缀合物热加速稳定性好于常规工艺。
验证例10
吖啶酯标记的抗体缀合物检测灵敏度评估。
对本发明制备得到的吖啶酯标记的抗体缀合物(实施例5.(4),使用未改造的放大载体;实施例5.(5),使用重桥连改造的放大载体),和常规工艺制备得到的吖啶酯标记的抗体缀合物(对比例1)进行灵敏度测试,低值样本(CL)的灵敏度分别为7.4、17.1、26.8。用本发明的(未改造)放大载体-吖啶酯标记的抗体缀合物和(重桥连改造)放大载体-吖啶酯标记的抗体缀合物和常规工艺相比,灵敏度分别高130%和262%。而本发明(未改造)放大载体-吖啶酯标记的抗体缀合物和(重桥连改造)放大载体-吖啶酯标记的抗体缀合物之间的对于检测低值样本的57%的灵敏度差异说明,在本发明的主要技术方案之上,再加入重桥连改造的放大载体这一次要方案,能进一步显著提升本发明最终的抗体缀合物的性能。
表11吖啶酯标记物的灵敏度(CA153)
性能测试
用酶标稀释液对本发明的抗体缀合物和常规工艺的抗体缀合物进行稀释,配置成酶标工作液,分别与磁珠工作液搭配组成检测试剂,在菲鹏ishine系列全自动化学发光免疫分析仪上进行测试,评估检测试剂的灵敏度,相关性和稳定性。
(1)灵敏度
对不同项目的内部参考品C0,CL,CH进行测试,每个样品测试两次,得到相对发光值(RLU),并计算RLU均值。通过CL和CH的RLU均值与CO的RLU均值的比值,计算灵敏度(P/N)。
(2)相关性
罗氏cobas e 411和菲鹏shine分析仪分别用自己的校准品进行校准,然后对至少40例的相关性样本进行检测,每个样本检测一次,得到相对发光值(RLU)。以菲鹏系统的结果为Y轴变量,以Roche系统的结果为X轴变量。用线性回归分析对数据进行拟合,得到方程Y=KX+B,相关系数r。
理化性质分析
(1)SDS-PAGE
蛋白样品中加入5X Loading Buffer(2.5mM pH7.8 Tris-HCl,0.1%SDS,0.005%溴酚蓝)制备蛋白电泳样品。使用SurePAGETM蛋白预制胶(金斯瑞)和Tris-MOPS-SDSRunning Buffer Powder(金斯瑞)对蛋白电泳样品进行SDS-PAGE。
(2)SEC-HPLC
采用Waters高效液相色谱平台对蛋白样品进行分子排阻分析。按厂家仪器使用说明进行操作,蛋白样品浓度不低于0.1mg/mL,蛋白总量不低于50ug。
(3)抗体二硫键还原数量的测定
采用Ellman试剂(DTNB,Pierce)定量测定抗体游离巯基的摩尔浓度,通过与抗体摩尔浓度的比值,可以确定抗体二硫键还原数量RDAR(Reduced disulfide bondsantibody ratio)。在412nm波长下测定OD值,巯基的摩尔消光系数ε412为10mM-1cm-1。在280nm波长下测定0D值,抗体的摩尔消光系数ε280为210mM-1cm-1。根据朗伯比尔定律(Lambert-Beer law):Aλ=ελbC,Aλ为样品在λ波长下的紫外吸收值,ελ为样品在λ波长下的摩尔消光系数,b为光程,C为样品摩尔浓度。因此抗体二硫键还原数量RDAR可以通过下公式进行计算:
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗体缀合物,包括抗体、连接子、放大载体和缀合物伙伴,其包括以下结构:
其中n、m均为整数且独立地选自0~24。
2.根据权利要求1所述的抗体缀合物,其中m+n=0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。
3.根据权利要求1所述的抗体缀合物,m不为零;优选地,m和n都不为零;优选地,m+n≧4。
4.根据权利要求1所述的抗体缀合物,其中所述放大载体选自聚糖、多聚赖氨酸、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、树枝状聚合物、和蛋白载体中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的抗体缀合物,其中所述缀合伙伴选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂、纳米颗粒类标记物中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的抗体缀合物,其特征在于,其中硫碳桥键位于抗体铰链区之间、抗体轻重链之间、抗体重链之间、抗体轻链内或抗体重链内。
7.根据权利要求1所述的抗体缀合物,其中所述放大载体是经重桥连改造的载体,经重桥连改造的放大载体的结构示意为所述抗体缀合物包括以下结构:
其中结构部分包括选自如下的结构之一:/>
8.据权利要求7所述的抗体缀合物,其中,所述放大载体选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵白蛋白。
9.权利要求1-8中任一项所述的抗体缀合物在制备诊断试剂或试剂盒中的应用。
10.一种试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1-8中任一项所述的抗体缀合物。
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