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Die
Erfindung betrifft Anti-Petasin-Antikörper zum Nachweis von Petasin
oder Petasin-Protein-Konjugaten
in physiologischen Flüssigkeiten,
Verfahren zu ihrer Herstellung mittels Immunisierung durch Carrier-Molekül-gekoppelte
Petasin-Derivate sowie ihre Verwendung und einen Testkit.
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Petasin,
eine Komponente von Pestwurzextrakten, ist bekanntermaßen der
Ester aus Petasol und Angelikasäure,
der schon länger
als pflanzliches Spasmoanalgetikum zur Bekämpfung von Spasmen des Gastrointestinaltraktes,
insbesondere Harnleiterkoliken, spastischen Bronchitiden und Migräne, sowie
antiphlogistisch verwendet wird (B. Debrunner et al., Pharm. Acta
Helv. 72, 359-380 (1998)). Weiterhin schreibt man Petasindrogen
eine Antitumorwirkung zu (B. Meier et al., Hagers Handbuch der pharmazeutischen
Praxis, 5. Auflage, S. 81-105, Springer-Verlag (1994)). Inzwischen liegen auch
neuere Erkenntnisse zur Beeinflussung der Biosynthese von Leukotrienen
vor (D. Pichl et al., Planta Medica, 60, 318-322 (1994)).
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Nach
peroraler Applikation von Petasindrogen sind in Körperflüssigkeiten
gesunder Probanden lediglich Konzentrationen im Bereich von wenigen
ng/ml zu erwarten. Vor diesem Hintergrund sind biologische, physikalische
und chemische Nachweisverfahren, die zur Charakterisierung der Droge
selbst Anwendung finden, für
die Quantifizierung von Petasin in Körperflüssigkeiten nicht anwendbar.
Selbst moderne analytische Methoden, wie die üblicherweise angewendete HPLC,
sind nicht ausreichend empfindlich bzw. aufgrund ihres hohen Zeitaufwandes
für große Probenzahlen
nicht geeignet.
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Der
Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, Nachweismethoden für Petasin
bereitzustellen, insbesondere für
die gewünschten
pharmakokinetischen Untersuchungen geeignete Methoden mit hoher
Sensitivität
und Spezifität.
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Erfindungsgemäß erfüllen immunchemische
Detektionstechniken die gestellten Anforderungen an Sensitivität und Spezifität, wodurch
eine zusätzliche,
der eigentlichen Bestimmung vorangehende Extraktion bzw. Konzentrierung
der Probe, wie sie bei chromatographischen Verfahren erforderlich
ist, entfällt.
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Die
Lösung
der Aufgabe konnte durch Bereitstellung von Anti-Petasin-Antikörpern realisiert
werden.
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Die
erfindungsgemäßen Antikörper werden
mit an ein Carrier-Molekül-gekoppelten
Derivaten des Petasins hergestellt. Überraschend konnte durch die
Herstellung von Antikörpern
gegen die Kopplungsgruppe des Petasins eine möglicherweise eintretende Veränderung
des in der Nähe
der 8-Positon liegenden immundominanten Epitops vermieden werden.
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Die
polyklonalen oder monoklonalen Antikörper werden durch Immunisierung
von nichtmenschlichen Säugetieren
und/oder Vögeln
mit Derivaten des Petasins der allgemeinen Formel I
hergestellt und über Hybridomtechnik
oder rekombinant mit Hilfe von Antikörperbibliotheken gewonnen.
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Es
werden folgende Carrier-Molekül-gekoppelten
Derivate eingesetzt:
- – Derivate des Petasins der
allgemeinen Formel I, in denen die in 8-Stellung befindliche Ketogruppe
durch eine Carboxylgruppe, die durch Carboxymethylhydroxyamin unter
Oximbildung eingeführt
wurde, ersetzt und mittels EDAC an Rinderserumalbumin gekoppelt
ist.
- – Derivate
des Petasins der allgemeinen Formel I, in denen die in 8-Stellung
befindliche Ketogruppe durch eine Carboxylgruppe ersetzt und über aktiviertes
Hydrazid-Dextran an Rinderserumalbumin oder Fibrinogen gekoppelt
ist, wobei die Einführung
der Carboxylgruppe mit Carboxymethylhydroxyamin unter Oximbildung
erfolgt.
- – Derivate
des Petasins der allgemeinen Formel I, in denen die in 11, 12-Stellung befindliche
Doppelbindung bromiert und an mittels Trautschem Reagenz aktiviertes
Rinderserumalbumin gekoppelt ist.
- – Derivate
des Petasins der allgemeinen Formel I, in denen die Angelikasäure abgespalten
ist und das verbleibende Petasol über Chorameisensäureester
an einen Träger
gekoppelt ist.
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Die
so hergestellten Anti-Petasin-Antikörper werden zum Nachweis von
Petasin oder Petasin-Protein-Konjugaten in physiologischen Flüssigkeiten
eingesetzt, wobei entweder Petasin, Petasin-Protein-Konjugate oder
die Anti-Petasin-Antikörper
vorzugsweise mit einem Marker versehen sind. Bevorzugt liegen die
Reaktionspartner in homogener Lösung
vor.
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Als
Marker werden Enzyme, Fluoreszenzfarbstoffe, Radioisotope oder redoxaktive
Verbindungen verwendet.
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Das
antikörpergebundene
Petasin wird optisch, elektrochemisch, fluorimetrisch oder radiochemisch nachgewiesen,
bevorzugt optisch mittels Farbreagenzien oder chromatographisch.
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In
einer Ausführungsvariante
werden entweder die Anti-Petasin-Antikörper, das
zu bestimmende Petasin oder die Petasin-Protein-Konjugate an eine feste Phase
gebunden, wobei zwischen den Reaktionsschritten ein Waschprozeß erfolgt.
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Die
feste Phase ist ggf. chemisch aktiviert, wobei die Bindung der Anti-Petasin-Antikörper, des
zu bestimmenden Petasins oder der Petasin-Protein-Konjugate daran
adsorptiv oder kovalent erfolgt. Besonders bevorzugt wird als feste
Phase Polystyren verwendet.
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Darüber hinaus
kann die feste Phase eine unterschiedliche geometrische Form aufweisen,
so z.B. in Form einer Mikrotitrationsplatte, eines Röhrchens
oder in kugelförmiger
bzw. flächenförmiger Gestalt.
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Desweiteren
betrifft die Erfindung einen Testkit zur Bestimmung von Petasin
in physiologischen Flüssigkeiten,
der umfaßt
Anti-Petasin-Antikörper
eine
feste Phase, vzw. Polystyren
Waschlösung,
Verdünnungspuffer,
markiertes
Petasin oder einen markierten Anti-Species-Antikörper,
ein markerspezifisches
Nachweissystem, vorzugsweise ein Enzymsubstrat.
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Anschließend wird
die Erfindung an Ausführungsbeisspielen
näher erläutert.
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Ausführungsbeispiele
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A) Herstellung der Immunogene
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Petasinoxim:
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10
mg (3,3 × 10–5 mol)
Petasin in 5 ml Ethanol lösen,
mit 15 mg (6,8 × 10–5 mol)
Carboxymethoxylamin Hemihydrochlorid (Sigma- Aldrich) versetzen und tropfenweise
5 M Natronlauge bis zu einem pH von 12 zugeben. Der Ansatz wird
4 h am Rückfluß erhitzt,
auf dem Wasserbad zur Trockne eingeengt, mit 2 M Salzsäure gewaschen
und in einem Gemisch aus 1 ml Dioxan und 2 ml DMSO gelöst und bei –70°C gelagert.
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Dünnschichtchromatografie:
Rf-Wert (Kieselgel G60, Chloroform) = 0,42
(Petasin: 0,16).
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Das
Oxim entsteht als alleiniges Reaktionsprodukt.
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Petasinoxim-Rinderserumalbumin:
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32
mg (4,8 × 10–7 mol)
Rinderserumalbumin (RSA) in 4 ml PBS lösen (Lösung A).
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7
mg (1,8 × 10–5 mol)
Petasinoxim, gelöst
in 1 ml Dioxan/DMSO = 1:2 (v/v), mit 16 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
(EDAC) versetzen und unter Rühren
30 min bei Raumtemperatur inkubieren lassen (Lösung B). Lösung B tropfenweise zu Lösung A geben
und 6 h bei Raumtemperatur rühren,
anschließend
bei 4°C
gegen 3 × 0,5
l PBS (0,01 M Phosphat, 0,15 M MaCl, pH = 7,4) dialysieren und bei –70°C lagern.
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Petasin-Dextran-Proteine:
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7
mg (1,8 × 10–5 mol)
Petasinoxim, gelöst
in 1 ml Dioxan/DMSO = 1:2 (v/v) tropfenweise zu 32 mg Rinderserumalbumin
(4,8 × 10–7 mol)
bzw. Fibrinogen in 4 ml PBS geben und mit 0,5 mg (1,5 × 10–4 mol
Hydazidgruppen) aktiviertem Hydrazid-Dextran (Pierce, Code 20900)
versetzen. Danach werden 16 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC)
hinzugefügt
und das Gemisch 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird
bei 4°C
gegen 3 × 0,5l1
PBS (0,01 M Phosphat, 0,15 M NaCl, pH = 7,4) dialysiert. Die Lagerung
erfolgt bei –70°C.
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Brompetasin-Rinderserumalbumin:
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Bromierung von Petasin:
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10
mg (3,3 × 10–5 mol)
Petasin, gelöst
in 3 ml Dichlormethan, werden tropfenweise unter Schwenken mit 5
mg (3,1 × 10–5 mol)
Brom in 1 ml Dichlormethan versetzt. Der Ansatz wird danach im Wasserbad
zur Trockne eingeengt und in 1 ml DMSO aufgenommen. Dünnschichtchromatografie:
Rf-Wert (Kieselgel G60, Chloroform) = 0,51
(Petasin: 0,16).
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Thiolierung von Rinderserumalbumin:
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40
mg (6 × 10–7 mol)
Rinderserumalbumin in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH = 8,0 lösen und
mit 20 mg (1,4 × 10–4 mol)
2-Iminothiolan-Hydrochlorid
(Traut's Reagenz)
versetzen und 40 min bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Anschließend wird
mit Hilfe einer mit Sephadex G25 gefüllten Säule (1 × 10 cm) gegen 0,1 M Phosphatpuffer
pH = 7,2 umgesalzt. Zur Lösung
des thiolierten Proteins gibt man unter Rühren 4 mg (8,4 × 10–6 mol)
Brompetasin und läßt 3 h bei
Raumtemperatur inkubieren, worauf bei 4°C gegen 3 × 0,5 l PBS (0,01 M Phosphat,
0,15 M NaCl, pH = 7,4) dialysiert wird.
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Petasol-Rinderserumalbumin:
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0,7
mg (2,9 × 10–6 mol)
Petasol werden in 200 μl
getrocknetem Dioxan/DMF = 1:1 (v/v) gelöst, mit 2 mg (7,9 × 10–6 mol)
5-Norbornen-2,3-dicarboximidyl-chlorkohlensäureester
und 4 mg (3,3 × 10–5 mol)
4-Dimethylaminopyridin versetzt und unter Auschluß von Luftfeuchtigkeit
1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird diese Lösung tropfenweise
unter Rühren
zu 10 mg (1,5 × 10–7 mol)
Rinderserumalbumin, gelöst
in 0,5 ml PBS, gegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird
bei 4°C
gegen 3 × 0,5
l PBS (0,01 M Phosphat, 0,15 M NaCl, pH = 7,4) dialysiert und das
Proteinkonjugat bei –70°C gelagert.
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B) Herstellung des Antiserums
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Die
Immunisierung erfolgt in Kaninchen als Primärinjektion durch subkutane
und intramuskuläre
Injektion mit je 3 mg Petasin-RSA in komplettem Freund'schen Adjuvans. Die
Sekundärinjektion
erfolgt vier Wochen nach der Primärinjektion. Nach weiteren zwei
Wochen erfolgt die erste Boosterinjektion, eine zweite wird zwölf Wochen
nach Immunisierungsbeginn in inkomplettem Freund'schen Adjuvans durchgeführt. Ca.
acht Wochen nach Beginn der Immunisierung erfolgt die erste Probeblutentnahme,
die durch eine weitere nach vier Wochen ergänzt wird. Die Entblutung erfolgt
nach 16 Wochen.
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Die
erhaltenen Antiseren werden einer Titerbestimmung auf spezifische
anti-Petasin-Antikörper
mittels Enzymimmunoassay unterworfen, bei dem Petasin-Ovalbumin
an die Oberfläche
von Mikrotiterplatten gebunden wird. Die zu untersuchenden Antiseren
und Nullseren der Kaninchen werden nachfolgend in einer Verdünnungsreihe
mit dem immobilisierten Petasin inkubiert. Der Nachweis der gebundenen
Antikörper
erfolgt durch Inkubation mit einem Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin-Enzym-Konjugat (Peroxidase)
und anschließender
visuell auswertbarer Substratreaktion.
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C Enzymimmunoassay
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Petasin-Ovalbumin:
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0,3
mg (8 × 10–7 mol)
Petasinoxim, gelöst
in 100 μl
Dioxan/DMSO = 1:2 (v/v) werden mit 4 mg EDAC versetzt und 30 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird der Ansatz in eine
Lösung
von 5,5 mg (1,2 × 10–7 mol)
Ovalbumin in 3 ml PBS gegeben, 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren und
anschließend
16 h bei 4°C
inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird bei 4°C gegen 3 × 0,5 l Aqua bidest. dialysiert
und das Proteinkonjugat bei –70°C gelagert.
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Beschichtung:
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Petasin-Ovalbumin
wird in einer Konzentration von 5 mg/l in 0,1 M Karbonatpuffer pH
= 9,5 (100 μl/well)
adsorptiv für
16 h bei 4°C
an Polystyren-Mikrotiterplatten gebunden und danach abgesaugt. Nach
zweimaligem Waschen mit 300 μl/well
Waschpuffer (PBS, 0,1% Tween 20) wird 2 h bei Raumtemperatur mit
150 μl/well
Blockierungslösung
(0,06% Gelatine, 0,02% Natriumazid in PBS) geblockt und schließlich dreimal
mit Waschpuffer gewaschen.
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Testdurchführung:
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50 μl der zu
testenden Serumprobe bzw. des jeweiligen Standards (1:4-Verdünnung in
Probenpuffer (PBS, 1% RSA, 0,1% Tween 20, 0,01% Thiomersal)) und
50 μl einer
optimierten Antiserumverdünnung
in Probenpuffer werden simultan 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert.
Anschließend
wird die Mikrotiterplatte dreimal mit 300 μl/well Waschpuffer gewaschen
und mit 100 μl
anti-Kaninchen-Immunglobulin-Peroxidase-Konjugat,
verdünnt
in Probenpuffer, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und abermals
wie oben gewaschen. Danach wird 10 min mit 100 μl einer gebrauchsfertigen Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)
pro Vertiefung inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 100 μl/well 0,5
M Schwefelsäure
gestoppt. Die Auswertung erfolgt bei 450 nm in einem Mikrotiterplatten-Reader.
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D) Herstellung des Antiserums
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Die
Immunisierung erfolgt in Kaninchen als Primärinjektion durch subkutane
und intramuskuläre
Injektion mit je 3 mg Petasinoxim-Rinderserumalbumin in komplettem
Freund'schen Adjuvans.
Die Sekundärinjektion
erfolgt vier Wochen nach der Primärinjektion. Nach weiteren zwei
Wochen erfolgt die erste Boosterinjektion, eine zweite wird zwölf Wochen
nach Immunisierungsbeginn in inkomplettem Freund'schen Adjuvans durchgeführt. Ca.
acht Wochen nach Beginn der Immunisierung erfolgt die erste Probeblutentnahme,
die durch eine weitere nach vier Wochen ergänzt wird.
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Die
Entblutung erfolgt nach 16 Wochen.
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Das
erhaltene Antiserum K2E wird einer Titerbestimmung auf spezifische
anti-Petasin-Antikörper mittels
Enzymimmunoassay (nach Ausführungsbeispiel
E) unterworfen, bei dem Petasin-Ovalbumin (und zur Kontrolle Ovalbumin)
an die Oberfläche
von Mikrotiterplatten (MTP) gebunden wird: Das zu untersuchende
Antiserum K2E und das entsprechende Nullserum werden nachfolgend
in einer Verdünnungsreihe
(1:100 bis 1: 1,56·106) inkubiert. Der Nachweis der gebundenen
Antikörper
erfolgt durch Inkubation mit einem Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin-Enzym-Konjugat (Peroxidase)
und anschließender
Substratreaktion. Die Auswertung bei 450 nm erfolgt in einem Mikrotiterplatten-Reader.
Das Antiserum K2E zeigt einen spezifischen Antikörpertiter von 1: 3,1·105 im Vergleich zum Präimmunserum. Auf der Ovalbumin-MTP
erfolgt keine spezifische Bindung (s. 1).
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E) Enzymimmunoassay
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Petasin-Ovalbumin
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0,3
mg (8 × 10–7 mol)
Petasinoxim, gelöst
in 100 μl
Dioxan/DMSO = 1:2 (v/v) werden mit 4 mg EDAC versetzt und 30 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird der Ansatz in eine
Lösung
von 5,5 mg (1,2 × 10–7 mol)
Ovalbumin in 3 ml PBS gegeben, 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren und
anschließend
16 h bei 4°C
inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird bei 4°C gegen 3 × 0,5 l Aqua bidest. dialysiert
und das Proteinkonjugat bei –70°C gelagert.
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Beschichtung
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Petasin-Ovalbumin
wird in einer Konzentration von 5 mg/l in 0,1 M Karbonatpuffer pH
= 9,5 (100 μl/well)
adsorptiv für
16 h bei 4°C
an Polystyren-Mikrotiterplatten gebunden und danach abgesaugt. Nach
zweimaligem Waschen mit 300 μl/well
Waschpuffer (PBS, 0,1% Tween 20) wird 2 h bei Raumtemperatur mit
150 μl/well
Blockierungslösung
(0,06% Gelatine, 0,02% Natriumazid in PBS) geblockt und schließlich dreimal
mit Waschpuffer gewaschen.
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Testdurchführung
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50 μl der zu
testenden Probe bzw. 50 μl
des jeweiligen Petasin-Standards (8 Konzentrationen: 100,0; 33,3;
11,1; 3,7; 1,2; 0,41; 0,13 und 0 μg/ml)
in Probenpuffer (PBS, 1 % RSA, 0,1 % Tween 20, 0,01 % Thiomersal))
und 50 μl
einer optimierten Verdünnung
des Antiserums K2E (z.B. 1:2.500) in Probenpuffer werden simultan
1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln
inkubiert. Anschließend
wird die Mikrotiterplatte dreimal mit 300 μl/well Waschpuffer gewaschen
und mit 100 μl
anti-Kaninchen-Immunglobulin-Peroxidase-Konjugat,
verdünnt
in Probenpuffer, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und abermals
wie oben gewaschen. Danach wird 10 min mit 100 μl einer gebrauchsfertigen Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) pro Vertiefung
inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 100 μl/well 0,5 M Schwefelsäure gestoppt.
Die quantitative Auswertung erfolgt anhand der Standards bei 450
nm in einem Mikrotiterplatten-Reader (s. 2).
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Kreuzreaktivität des Antiserums
K2E
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Die
Spezifität
des Antiserums K2E konnte durch Inhibitionsexperimente mit strukturverwandten
Petasinderivaten nachgewiesen werden. Dazu wurden die Hemmkurven
dieser Derivate und von Petasin selbst im Enzymimmunoassay bestimmt
(s. Testdurchführung;
9 Konzentrationen: 400,0; 133,3; 44,4; 14,8; 4,9; 1,6; 0,5; 0,18
und 0 μg/ml)
und die Hemmkonzentrationen [Petasin] und [Derivat] der jeweiligen
50%-Inhibition (Extinktionen E/E0 = 0,5
bei 450 nm, E0: ohne Analyt) und daraus
die relative Kreuzreaktivität
rK berechnet (s. Tab.1):
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Unter
den Petasinderivaten und -metaboliten zeigt das Antiserum K2E für die drei
Schwefelderivate keine bzw. eine vernachlässigbar geringe Kreuzreaktivität. Ebenfalls
reagiert das Antiserum nicht mit den Vertretern der Furano-Chemovarietät. Die Isomere
Neo- und Isopetasin unterliegen zusammen mit Petasin in wäßriger Lösung einem
Isomerisierungsgleichgewicht und zeigen deshalb naturgemäß eine geringe
Kreuzreaktivität.
