CZ307368B6 - Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab, jeho komplex s radionuklidy, způsoby jejich přípravy a jejich použití - Google Patents
Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab, jeho komplex s radionuklidy, způsoby jejich přípravy a jejich použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ307368B6 CZ307368B6 CZ2016-742A CZ2016742A CZ307368B6 CZ 307368 B6 CZ307368 B6 CZ 307368B6 CZ 2016742 A CZ2016742 A CZ 2016742A CZ 307368 B6 CZ307368 B6 CZ 307368B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- chelator
- formula
- nimotuzumab
- conjugate
- monoclonal antibody
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Předkládané řešení se týká konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I, přičemž chelátor vzorce I je kovalentně navázán přes isothiokyanát na aminoskupinu aminokyseliny lysinu, přítomnou v monoklonální protilátce nimotuzumabu, thiomočovinovým můstkem. Řešení se dále týká komplexu výše uvedeného konjugátu s radionuklidy, způsobů přípravy konjugátu i komplexu s radionuklidy a jejich použití při léčbě nádorových onemocnění.
Description
Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab, jeho komplex s radionuklidy, způsoby jejich přípravy a jejich použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab s tetrazamakrocyklickým ligandem, jeho komplexu s radionuklidy, způsobů jejich přípravy a jejich použití při léčbě nádorových onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Monoklonální protilátky jsou imunoglobuliny (Afy cca 150 kDa), které produkuje imunitní systém jako odpověď na přítomnost látek (antigenů), které jsou organismu cizí. Protilátky jsou vytvářeny také proti nádorovým buňkám, protože rakovinné buňky na svém povrchu často exprimují antigeny, které tělo pokládá za cizí, nebojsou na jejich povrchu receptory tělu vlastní, ale vyskytují se v podstatně větším počtu. Protilátky lze tedy použít při léčbě nádorových onemocnění, a to buď samostatně, nebo mohou sloužit jako cílící skupina (targeting group) pro dopravu jiných léčiv do nádoru, například radioizotopů sloužících k vnitřnímu ozařování, tj. těch izotopů, jejichž radioaktivní rozpad je spojen s emisí β nebo a částic, které jsou schopny zabíjet buňky v pouze blízkém okolí radioizotopu. Tento koncept je např. používán v komerčním přípravku Zevalin®, který slouží k terapii non-Hodgkinovu lymfomu (NHL). Účinnou složkou Zevalinu® je protilátka rituximab rozpoznávající antigen CD-20 na povrchu B-buněk, která je konjugována s derivátem DTPA (DTPA = diethylentriaminpentaoctová kyselina) jako chelátorem pro terapeutický radioizotop 90Y (β zářič).
Je známo, že makrocyklické ligandy odvozené od DOTA (DOTA = 1,4,7,10tetraazacyklododekan-l,4,7,10-tetraoctová kyselina; Schéma 1) jsou vhodnější pro použití in vivo než deriváty DTPA. Důvodem je větší stabilita DOTA komplexu s kovem za podmínek in vivo, přestože komplexy s DOTA vznikají méně snadno než s DTPA. Protože však stabilita in vivo je důležitější parametr než snadnost komplexace, většina v současné době klinicky testovaných radioaktivně značených protilátek je založena na konjugátech s deriváty DOTA.
Jedním z nejčastěji používaných a technicky nejjednodušších způsobů konjugace ligandu a protilátek je reakce mezi isothiokyanátem na ligandu a ε-aminoskupinami lysinu na protilátce. Tímto způsobem je možné na molekulu protilátky navázat až cca dvacet molekul ligandu, přičemž vyšší počet ligandových skupin zlepšuje značení radioizotopy, ale současně také snižuje imunoreaktivitu celého konjugátu. Optimálním počtem jsou 3 až 5 molekul ligandu na jednu molekulu protilátky. Velikost ligandu, jeho hydrofílicita, náboj atd. ovlivňují imunoreaktivitu modifikované protilátky, a proto konjugáty s různými chelátory mohou vykazovat velmi různou biologickou aktivitu díky velkým rozdílům v immunoreaktivitě.
Nimotuzumab (hR3, Theraloc, CIMAher) je humanizovaná protilátka s afinitou k extracelulámí doméně receptorů pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor, EGFR), který je ve vysoké míře přítomen na povrchu mnoha typů nádorových buněk. Tato protilátka je sama o sobě terapeuticky účinná a ve světě probíhá její klinické testování (fáze I. - III.) pro různé protinádorové indikace. Může být také použita jako cílící molekula pro dopravu jiných terapeutik jako jsou kovové radioizotopy. Pro tyto účely byl nimotuzumab konjugován s deriváty DOTA a značen I77Lu nebo 90Y (Comparison of [177Lu-DOTAO,Tyr3]octreotate and [177LuDOTA0,Tyr3]octreotide: which peptide is preferable for PRRT?, J. P. Esser, E. P. Krenning,
J. J. M. Teunissen, P. P. M. Kooij, A. L. H. van Gameren, W. H. Bakker, D. J. Kwekkeboom, Eur. J. Nud. Med. Mol. Imaging (2006) 33:1346-1351; Preparation and preclinical evaluation of 177Lu-Nimotuzumab targeting epidermal growth factor receptor overexpressing tumors, Denis R. Beckford Věra, Sebastian Eigner, Kateřina Eigner Henke, Ondřej Lebeda, František Melichar,
- 1 CZ 307368 B6
Miloš Beran, Nud. Med. Biol, 2012, 39(1 ):3-13; Preclinical Evaluation of 177Lu-Nimotuzumab: a Potential Tool for Radioimmunotherapy of EGFR Overexpressing Tumors, Beckford Věra, DR, Eigner S., Beran M., Eigner Henke K., Laznickova A., Laznicek M., Melichar F and Chinol M, Cancer Biother. Radiopharm., 2011, 26(3): 287-297).
Nejčastěji použitým ligandem byl komerční ligand DOTA-NCS (Schéma 1). Publikované podmínky pro konjugaci však vedou ke ztrátám cenného ligandu a často ke špatně reprodukovatelným výsledkům, zejména pokud jde o počet molekul ligandu vázaných v konjugátu. V případě protilátek tak dochází k nepravidelným změnám afinity k danému receptoru a tedy k nejednoznačným výsledkům testů in vivo.
HOOC
HOOC
COOH
DOTA
Schéma 1
Ve stavu techniky chybí konjugáty protilátky nimatuzumab s deriváty DOTA, jejichž konjugace by byla snadná, reprodukovatelná a s daným počtem molekul ligandu na jednu molekulu protilátky. Tyto konjugáty by vedly k vyšší a reprodukovatelnější biologické aktivitě in vitro a in vivo. Dosavadní postupy konjugace využívají vysoké pH a mnohonásobné přebytky ligandu pro navázání optimálního počtu molekul ligandu na protilátku. Tyto podmínky ale vedou ke znečištění reakční směsi produkty hydrolýzy skupiny -NCS ligandu a tím i k vyšší spotřebě ligandu při přípravě konjugátu. Vedle vysoké spotřeby ligandu je další nevýhodou ligandu typu DOTA rovněž široké rozmezí počtu konjugovaných komplexotvomých jednotek na molekulu protilátky, vedoucí k nepravidelným změnám afinity konjugátu k receptoru.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález, který se týká nového konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumabu se skupinou -NCS vázanou na tetraazamakrocyklický ligand, zjednodušuje a zefektivňuje konjugační reakci, která vede k danému počtu molekul ligandu navázaných na jednu molekulu protilátky a tím k reprodukovatelně vyšší a reprodukovatelné bioaktivitě in vitro a in vivo komplexů tohoto konjugátu s radionuklidy, které mají uplatnění při léčbě nádorových onemocnění. Předkládaný vynález rovněž vede k neočekávaně vysoké afinitě výsledného konjugátu k receptorům, což vede k potenciálně lepším léčebným výsledkům při aplikacích in vivo.
Předmětem předkládaného vynálezu je konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab a alespoň jednoho chelátoru vzorce I
-2CZ 307368 B6
NCS
přičemž alespoň jeden chelátor vzorce I je kovalentně navázán thiomočovinovým můstkem NHC(=S)-NH- vzniklým reakcí isothiokyanátové skupiny chelátoru vzorce I a aminoskupiny aminokyseliny lysinu, přítomné v monoklonální protilátce nimotuzumabu. Monoklonální protilátkou se rozumí celá molekula nimotuzumabu nebo její fragmenty Fab, sloužící k vazbě na nádorové antigeny.
Ve výhodném provedení obsahuje konjugát podle předkládaného vynálezu do 10 molekul chelátoru vzorce kovalentně navázaných thiomočovinovým můstkem vzniklým reakcí isothiokyanátové skupiny chelátoru vzorce I a aminoskupiny aminokyseliny lysinu, přítomné v monoklonální protilátce nimotuzumabu, výhodněji 2 až 7 navázaných molekul chelátoru vzorce I, nejvýhodněji 2 až 4 navázané molekuly chelátoru vzorce I na jednu molekulu monoklonální protilátky nimotuzumabu.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce 1 podle předkládaného vynálezu, kdy se roztok protilátky nimotuzumab o pH v rozmezí od 8,0 do 9,2 smíchá s roztokem chelátoru vzorce I o pH v rozmezí od 8,0 do 9,2, přičemž molární poměr monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I je v rozmezí od 1:10 do 1:100, s výhodou v rozmezí od 1:20 do 1:75, výhodněji v rozmezí od 1:45 do 1:55;
výsledná reakční směs reaguje po dobu alespoň 10 minut, s výhodou po dobu 10 až 600 min, výhodněji po dobu 50 až 250 min, nejvýhodněji po dobu 100 až 120 minut, při teplotě v rozmezí od 4 do 40 °C, s výhodou v rozmezí od 15 do 30 °C, výhodněji v rozmezí od 18 do 22 °C, za vzniku konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle předkládaného vynálezu.
S výhodou je pH reakční směsi udržováno po celou dobu reakce konstantní, v rozmezí od 8,0 do 9,2, výhodněji v rozmezí od 8,3 do 8,7, nejvýhodněji v rozmezí od 8,5 do 8,6.
Koncentrace protilátky se s výhodou pohybuje v rozmezí od 2,5 do 7 mg/ml výsledné reakční směsi, výhodněji v rozmezí od 4,5 do 5 mg/ml výsledné reakční směsi. Použitá rozpouštědla nesmí, při jakémkoliv kroku, kdy je použit chelátor vzorce I a/nebo konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle předkládaného vynálezu, obsahovat ionty těžkých kovů. Postup konjugační reakce může být s výhodou sledován pomocí metody HPLC.
Chelátor vzorce I a jeho příprava byla popsána v práci Rudovský J., Botta M., Hermann P., Koridze A., Aime S., Dalton Trans., 2006, 2323-2333. Příprava jeho aminového prekurzoru (1,4,7,10-tetraazacyklododekan^4,7,10-triacetato-l -{methyl [(4aminofenyl)methyl]fosfinová}kyselina) je popsána v Rudovský J., Kotek J., Hermann P., Lukeš
I., Mainero V., Aime S., Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 112-117. Konjugace chelátoru vzorce I na jednoduché aminy, cyklodextriny a PAMAM dendrimery jsou popsané v Rudovský J., Botta M., Hermann P., Hardcastle K. I., Lukeš I., Aime S., Bioconjugate Chem., 2006, 17, 975-987; Kotková Z., Helm L., Kotek J., Hermann P., Lukeš I., Dalton Trans., 2012, 41, 13509-13519. Publikované podmínky pro konjugaci však vedou ke ztrátám cenného ligandu a často ke špatně
-3 CZ 307368 B6 reprodukovatelným výsledkům, zejména pokud jde o počet molekul ligandu vázaných v konjugátu. V případě protilátek tak dochází k nepravidelným změnám afinity k danému receptoru a tedy k nejednoznačným výsledkům testů in vivo.
V jednom provedení způsobu přípravy konjugátu podle monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle předkládaného vynálezu je rozpouštědlem reakční směsi voda, popřípadě voda obsahující do 20 obj. % DMSO. S výhodou voda obsahuje do 5 obj. % DMSO, výhodněji do 1 obj. % DMSO.
V jednom provedení způsobu přípravy konjugátu podle monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle předkládaného vynálezu reakční směs dále obsahuje pufr pro udržení konstantní hodnoty pH, který je vybraný ze skupiny zahrnující fosfátový pufr, acetátový pufr, TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethan) pufr, HEPES (AL-(2-hydroxyethyl)piperazin-7V'-(2ethansulfonová kyselina)) pufr a EPPS (<V-(2-hydroxyethyl)piperazin-V'-(3-propansulfonová kyselina)) pufr. S výhodou se použije pufr o koncentraci v rozmezí od 0,1 do 1,0 M. Výhodněji se použije EPPS pufr o koncentraci v rozmezí od 0,2 do 0,3 M.
V jednom provedení způsobu přípravy konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle předkládaného vynálezu následuje dále krok přečištění reakční směsi, s výhodou filtrací přes membránu. Čištění reakční směsi po konjugaci ligandu a protilátky se s výhodou provádí pomocí membrány pro separaci látek na základě jejich velikosti. Tímto způsobem se oddělí vysokomolekulámí konjugát (cca 150 kDa) od nízkomolekulámích látek, jako např. nezreagovaný chelátor vzorce I, a solí. Separace probíhá s výhodou na membránách s cut-off 20 až 100 kDa, výhodněji s cut-off 30 až 40 kDa. Ve výhodném provedení se výsledná reakční směs po konjugaci naředí na cca dvojnásobný objem pufrem použitým při reakci a roztok se nanese na kolonu s příslušnou membránou. Kolona se následně eluuje vodným roztokem octanu amonného (NH4OAc, 0,05 M).
Roztok přečištěného konjugátu se s výhodou lyofilizuje. Lyofílizovaný preparát lze skladovat po dobu několika měsíců při teplotě 2 až 8 °C bez změny kvality připraveného konjugátu.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále komplex konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce 1 s radionuklidem, který obsahuje konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle předkládaného vynálezu, kde alespoň jeden chelátor vzorce I tvoří koordinační sloučeninu s radionuklidem vybraným ze skupiny zahrnující 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 90Y, ’ln, 186Re, l88Re, radioizotopy lanthanoidů, 212Pb a 2l3Bi, s výhodou je radionuklid vybraný ze skupiny obsahující radioizotopy lanthanoidů, 47Sc, 67Cu, inIn a 90Y, nejvýhodněji je radionuklidem l53Sm, 166Ho, 'in a l77Lu. Díky přítomnosti kyselé fosforové skupiny je chelátor vzorce I a jeho komplexy hydrofilnější než analogické komplexy s DOTA či DOTA—NCS, a komplexace probíhá za mírnějších podmínek, rychleji a s vyššími výtěžky.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy komplexu konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I s radionuklidem podle předkládaného vynálezu, kdy se vodný roztok soli radionuklidu smíchá s vodným roztokem konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce 1 podle předkládaného vynálezu, a výsledná reakční směs reaguje při teplotě do 50 °C po dobu alespoň 5 minut. S výhodou je teplota reakce v rozmezí od 10 do 50 °C, výhodněji v rozmezí od 20 do 45 °C, nejvýhodněji v rozmezí od 35 do 40 °C. Doba reakce závisí na druhu radionuklidu a je s výhodou v rozmezí od 30 minut do 4 hodin, výhodněji v rozmezí od 1 do 2,5 h. V jednom provedení je radionuklidem 177Lu a reakční doba je v rozmezí od 60 do 90 min. V jiném provedení je radionuklidem 166Ho a reakční doba je v rozmezí od 90 do 120 min. V jiném provedení je radionuklidem 90Y a reakční doba je v rozmezí od 60 do 90 min. V jiném provedení je radionuklidem 153Sm a reakční doba je v rozmezí od 90 do 120 min. V jiném provedení je radionuklidem ’ln a reakční doba je v rozmezí od 120 do 150 min. S výhodou se, zejména u α-zářičů, po ukončení reakce do reakční
-4CZ 307368 B6 směsi přidá askorbát sodný / kyselina askorbová v množství 5 až 10 % hmotn. výsledného roztoku. Askorbát / kyselina askorbová slouží jako stabilizátor proti radiolýze.
Solí radionuklidu se rozumí ve vodě rozpustná sůl anorganické kyseliny a kationtu radionuklidu, s výhodou se solí radionuklidu rozumí chlorid radionuklidu.
Ve výhodném provedení způsobu přípravy komplexu konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I s radionuklidem podle předkládaného vynálezu probíhá reakce při pH v rozmezí od 5 do 8, s výhodou při pH v rozmezí od 6 do 7. S výhodou se pro reakci použije acetátový pufr nebo HEPES pufr.
Předmětem předkládaného vynálezu je také konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce 1 podle předkládaného vynálezu a/nebo komplex tohoto konjugátu s radionuklidem podle předkládaného vynálezu pro použití při léčení nádorových onemocnění, zejména pro cílenou léčbu nádorů s overexpresí EGFR (receptor epidermálního růstového faktoru), jako jsou například kolorektální karcinomy, epidermální nádory hlavy a krku, karcinom prostaty, karcinomy pankreatu, karcinomy jícnu, nemalobuněčné typy karcinomu plic, karcinom prsu, karcinom vaječníku a nádory neepiteliálního původu, jako jsou např. gliomy.
Objasnění výkresů
Obr. 1: Identifikace imunokonjugátů metodou SDS-PAGE; hR3 značí nativní protilátku nimotuzumab, Kl značí konjugát protilátky s chelátorem v molámím poměru 1:200 a K2 značí konjugát protilátky s chelátorem v molárním poměru 1:50.
Obr. 2: HPLC chromatogram konjugátu nimotuzumabu, typický retenční čas činí 9 až 10 min. Na chromatogramu nejsou patrny žádné nečistoty s retenčními časy 11 až 12 min.
Obr. 3A: Radiochromatogram 177Lu-DOTA-nimotuzumab.
Obr. 3B: Radiochromatogram 177Lu-chelátor vzorce (I)-nimotuzumab.
Obr. 4: Radio-TLC chromatogram komplexu konjugátu i77Lu-chelátor vzorce (I)-nimotuzumab.
Příklady uskutečnění vynálezu
Sloučenina DOTA-NCS byla zakoupena od firmy Macrocyclics (USA). Chelátor vzorce I byl syntetizován podle dříve publikovaných dat (Rudovský J., Botta M., Hermann P., Koridze A., Aime S., Dalton Trans., 2006, 2323 - 2333). Monoklonální protilátka nimotuzumab byla zakoupena od firmy Oncoscience AG (GER) a byla přechovávána podle pokynů dodavatele. V experimentech byla použita demineralizovaná voda, která byla dále zbavená stop iontů těžkých kovů pomocí pryskyřice Chelex, nebo vysoce čistá voda čistoty TraceSelect®. Roztoky pufrů byly zbaveny stop těžkých kovů pomocí pryskyřice Chelex. S chelatační pryskyřicí Chelex se zachází podle pokynů výrobce (Sigma Aldrich). Všechny použité chemikálie měly čistotu vyhovující stopové analýze. Používané laboratorní nádobí bylo před použitím omyto 5 M vodnou HC1, poté opláchnuto vysoce čistou vodou (TraceSelect®) a dále sušeno bez přístupu prachu.
Příklad: 1 Konjugace monoklonálníprotilátky nimotuzumab s DOTA-NCS
Konjugace monoklonální protilátky nimotuzumab s DOTA-NCS byla provedena při molámím poměru protilátka : ligand = 1 : 50. Roztok obsahující 2,5 mg protilátky byl smíchán s vodným roztokem pufru (0,2 M EPPS, pH 8,5 až 8,6) a s příslušným objemem vodného roztoku ligandu
-5CZ 307368 B6 v 0,2 M EPPS (koncentrace 10 mg/ml, pH 8,5 až 8,6). Množství přidaného pufru je voleno tak, aby celkový objem reakční směsi po smíchaní komponent činil 500 μΐ. Směs je třepána na Vortexu (mírné třepání, cca 450 kmitů/min) po dobu 2 h při laboratorní teplotě. Ihned po uplynutí reakčního časuje provedeno čištění vzniklého konjugátu na chromatografických kolonkách PD10. Kolonka je nejprve promyta vodným roztokem NH4OAc (2 x 10 ml a pak 1 x 5 ml, 0,05 M, pH 7,0). Následně je kolonka nasycena 1 ml roztoku (5 mg/ml) nativní protilátky. Přebytek protilátky je vypláchnut vodným roztokem NH4OAc (2 x 10 ml a 1 x 5 ml, 0,05 M, pH 7,0). Nyní je kolonka připravena k čištění konjugátu. Jednotlivé frakce jsou jímány do sady osmi čistých a sterilních plastových mikrozkumavek Eppendorf (1,5 ml). Reakční směs je naředěna pufrem EPPS (0,2 M, pH 8,5 až 8,6) na celkový objem 1 ml a roztok konjugátu je nanesen na kolonku. Po najímání 1. frakce je na kolonku postupně nanášeno po 1 ml vodného roztoku NH4OAc (0,05 M, pH 7,0) a jsou eluovány jednotlivé frakce. Po eluci 8. frakce je kolonka promyta vodným roztokem NH4OAc (2x10 ml, 0,05 M, pH 7,0). Frakce 3, 4 a 5 jsou převedeny do nádobky Vivaspin 6. Objem v nádobce je doplněn vodným roztokem NH4OAc (0,05 M, pH 7,0) na 6 ml a roztok konjugátu je centrifugován 30 min při 4000 rpm. Objem zbývající ve vrchní části nádobky Vivaspin by měl být menší než 400 μΐ. Do vrchní části nádobky je přidán vodný 0,05 M NH4OAc (1 ml, pH 7,0) a roztok je třepán 5 min na Vortexu při 1000 kmitech/min. Následně je roztok převeden do čisté a sterilní plastové mikrozkumavky Eppendorf (velikost 1,5 ml). Takto získaný roztok čistého konjugátu je použit ke značení, nebo je uchováván ve formě lyofilizátu nebo ve formě roztoku skladovaných v lednici při teplotách 2 až 8 °C.
Příklad 2: Konjugace monoklonálníprotilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce I
Konjugace monoklonální protilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce I je prováděna při molámím poměru protilátka : ligand = 1 : 50. Roztok obsahující 2,5 mg protilátky byl smíchán s vodným roztokem pufru (0,2 M EPPS, pH 8,5 až 8,6) a s příslušným objemem vodného roztoku ligandu v 0,2 M EPPS (koncentrace 10 mg/ml, pH 8,5 až 8,6). Množství přidaného pufru je voleno tak, aby celkový objem reakční směsi po smíchání komponent činil 500 μΙ. Směs je třepána na Vortexu (mírném třepání, cca 450 kmitů/min) po dobu 2 h při laboratorní teplotě. Ihned po uplynutí reakčního časuje provedeno čištění vzniklého konjugátu na kolonkách PD-10. Kolonka je nejprve promyta vodným roztokem NH4OAc (2 x 10 ml a pak 1 x 5 ml, 0,05 M, pH 7,0). Následně je kolonka nasycena 1 ml roztoku (5 mg/ml) nativní protilátky. Přebytek protilátky je vypláchnut vodným roztokem NH4OAc (2 x 10 ml a 1 x 5 ml, 0,05 M, pH 7,0). Nyní je kolonka připravena k čištění konjugátu. Jednotlivé frakce jsou jímány do sady osmi čistých a sterilních plastových mikrozkumavek Eppendorf (1,5 ml). Reakční směs je naředěna pufrem EPPS (0,2 M, pH 8,5 až 8,6) na celkový objem 1 ml a roztok konjugátu je nanesen na kolonku. Po najímání 1. frakce je na kolonku postupně nanášeno po 1 ml vodného roztoku NH4OAc (0,05 M, pH 7,0) a jsou eluovány jednotlivé frakce. Po eluci 8. frakce je kolonka promyta vodným roztokem NH4OAc (2x10 ml, 0,05 M, pH 7,0). Frakce 3, 4 a 5 jsou převedeny do nádobky Vivaspin 6. Objem v nádobce je doplněn vodným roztokem NH4OAc (0,05 M, pH 7,0) na 6 ml a roztok konjugátu je centrifugován 30 min při 4000 rpm. Objem zbývající ve vrchní části nádobky Vivaspin by měl být menší než 400 μΐ. Do vrchní části nádobky je přidán vodný 0,05 M NH4OAc (1 ml, pH 7,0) a roztok je třepán 5 min na Vortexu při 1000 kmitech/min. Následně je roztok převeden do čisté a sterilní plastové mikrozkumavky Eppendorf (velikost 1,5 ml). Takto získaný roztok čistého konjugátu je použit ke značení, nebo je uchováván ve formě lyofilizátu nebo ve formě roztoku skladovaných v lednici při teplotách 2 až 8 °C.
Příklad 3: Lyofilizace konjugátu monoklonálníprotilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I
Roztok konjugátu ihned po přečištění, podle postupu popsaného v příkladu 2, je lyofilizován: K roztoku konjugátu je přidána trehalosa v množství 200 mmol na každý mg konjugátu a vyčká se do úplného rozpuštění. Poté se lahvička se vzorkem umístěna do lázně s kapalným dusíkem a po vymražení je lahvička ihned vložena do připraveného lyofilizátoru a spustí se lyofilizační
-6CZ 307368 B6 proces. Po skončení lyofilizace je lahvička uzavřena pryžovým uzávěrem a uskladněna v lednici při teplotách 2 až 8 °C do dalšího zpracování.
Příklad 4: Konjugace monoklonálníprotilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce I za přítomnosti DMSO
Konjugace protilátky s chelátorem vzorce I je prováděna při molárním poměru protilátka : ligand = 1:50. Roztok obsahující 2,5 mg protilátky je smíchán s vodným roztokem pufru (0,2 M EPPS, pH 8,5 až 8,6) a s příslušným objemem roztoku ligandu v bezvodém DMSO (koncentrace 50 až 60 mg/ml). Množství přidaného pufru je voleno tak, aby celkový objem reakční směsi po smíchání komponent činil 500 μΐ. Směs je třepána na Vortexu (mírné třepání, cca 450 kmitů/min) po dobu 2 h při laboratorní teplotě. Po uplynutí reakčního času je provedeno čištění vzniklého konjugátu na kolonkách PD-10. Kolonka je nejprve promyta vodným roztokem NH4OAc (2 x 10 ml a pak 1 x 5 ml, 0,05 M, pH 7,0). Následně je kolonka nasycena 1 ml roztoku (5 mg/ml) nativní protilátky. Přebytek protilátky je vypláchnut vodným roztokem NH4OAc (2 x 10 ml a 1 x 5 ml, 0,05 M, pH 7,0). Nyní je kolonka připravena k čištění konjugátu. Jednotlivé frakce jsou jímány do sady osmi čistých a sterilních plastových mikrozkumavek Eppendorf (1,5 ml). Reakční směs je naředěna pufrem EPPS (0,2 M, pH 8,5 až 8,6) na celkový objem 1 ml a roztok konjugátu je nanesen na kolonku. Po najímání 1. frakce je na kolonku postupně nanášeno po 1 ml vodného roztoku NH4OAc (0,05 M, pH 7,0) a jsou eluovány jednotlivé frakce. Po eluci 8. frakce je kolonka promyta vodným roztokem NH4OAc (2x10 ml, 0,05 M, pH 7,0). Frakce 3, 4 a 5 jsou převedeny do nádobky Vivaspin 6. Objem v nádobce je doplněn pufrem 0,05 M NH4OAc na 6 ml a roztok konjugátu je centrifugován 30 min při 4000 rpm. Objem zbývající ve vrchní části nádobky Vivaspin by měl být menší než 400 μΐ. Do vrchní části nádobky je přidán vodný 0,05 M NH4OAc (1 ml, pH 7,0) a roztok je třepán 5 min na Vortexu při 1000 kmitech/min. Následně je roztok převeden do čisté a sterilní plastové zkumavky typu Eppendorf (velikost 1,5 ml). Takto získaný roztok čistého konjugátu je ihned dále zpracováván, skladován při teplotách 2 až 8 °C po dobu max. 2 dnů nebo okamžitě lyofilizován.
Příklad 5: Příprava komplexu konjugátu DOTA-NCS-nimotuzumab s radionuklidem 177Lu
Přečištěný konjugát DOTA-NCS-nimotuzumab připravený v příkladu 1 je v množství 0,5 až 0,7 ml převeden do plastové mikrozkumavky Eppendorf (objem 1,5 ml) a doplněn vodným roztokem NH4OAc (0,5 M, pH 7,0) tak, aby výsledný objem roztoku (včetně radionuklidu, který bude přidán) činil 1 ml. K tomuto roztoku je přidán vodný roztok radioaktivního chloridu lutecitého v 0,04 M vodné FICI, v množství odpovídajícím poměru 100 MBq 177Lu na 1 mg konjugátu. Je zkontrolováno pH, jehož hodnota by se měla bez dalších úprav pohybovat v rozmezí 6,0 až 7,0. Reakční směs je následně inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1 h. Po ukončení inkubace je přidáno 5 mg askorbátu sodného a přípravek je sterilizován filtrací přes filtr Millex-GV a rozdělen do jednotlivých sterilních vialek pro další použití. Následně je provedena kontrola kvality přípravku.
Příklad 6: Příprava komplexu konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce I s radionuklidem 177Lu
Přečištěný konjugát v množství 0,5 až 0,7 ml je převeden do plastové mikrozkumavky Eppendorf (objem 1,5 ml) a doplněn vodným roztokem NH4OAc (0,5 M, pH 7,0) tak, aby výsledný objem roztoku (včetně radionuklidu, který bude přidán) činil 1 ml. K tomuto roztoku je přidán vodný roztok radioaktivního chloridu lutecitého v 0,04 M HCI, v množství odpovídajícím poměru 100 MBq l77Lu na 1 mg konjugátu. Je zkontrolováno pH, jehož hodnota by se měla bez dalších úprav pohybovat v rozmezí 6,0 až 7,0. Reakční směs je následně inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1 h. Po ukončení inkubace je přidáno 5 mg askorbátu sodného a přípravek je sterilizován
-7CZ 307368 B6 filtrací přes filtr Millex-GV (filtr určený pro sterilizaci roztoků proteinů) a rozplněn do jednotlivých sterilních vialek pro další použití. Následně je provedena kontrola kvality přípravku, která je dále popsána v příkladech 11 a 12.
Příklad 7: Stanovení počtu molekul chelátu vzorce Iv molekule konjugátu
Pro stanovení počtu navázaných molekul chelátu vzorce I na molekulu monoklonální protilátky nimotuzumab je použit roztok nosičového 177Lu, (tzn., že k roztoku Lu3+ o požadované koncentraci v 0,05 M vodné HC1 je přidáno stopové množství l77Lu tak, aby k 10 7 mol Lu3+bylo přidáno cca 10 MBq l77Lu). Tento roztok je pak přidáván k roztoku konjugátu tak, aby molární poměry protilátka : Lu3+ odpovídaly 1:3 až 1:20. pH reakčního roztoku je upraveno přídavkem 0,5 M vodného octanu amonného na pH 5. Reakční roztok je následně inkubován při teplotě 42 °C po dobu 2 h. Po této době je k reakční směsi přidán 0,01 M vodný roztok DTPA (pH 6) a směs se nechá reagovat dalších 15 min při laboratorní teplotě. Navázáním volného l77Lu na DTPA je ukončeno značení konjugátu. Poté jsou 2 μΐ směsi aplikovány na desku TLC (chromatografický papír se skleněnými vlákny impregnovaný silikagelem (iTLC-SG)). Deska je vyvinuta vzestupně směsí 1 M (77 g dm ’) octanu amonného a methanolu v poměru 1:1 (v/v). Pomocí TLC skeneru je stanovena distribuce aktivity na TLC. V dané chromatografické soustavě zůstává konjugát značený l77Lu na startu chromatografické dráhy (7?f = 0) a komplex 177LuDTPA se pohybuje s čelem mobilní fáze (Rf ~ 1). Výtěžek značení se uvádí jako procenta aktivity na startu chromatogramu vůči součtu aktivity na celém chromatogramu.
Ze zjištěných výtěžků značení stanovených pomocí TLC a ze známého použitého poměru proti látka: kov byl vypočítán počet skupin chelátoru vzorce I na molekule protilátky podle vztahu:
Mchelátor vzorce I = radiochemický výtěžek (%) x (poměr kov:konjugát) x 100.
Příklad 8: Potvrzení identity připraveného konjugátu metodou elektroforézy
Imunokonjugáty jsou analyzovány pomocí SDS elektroforézy v polyakrylamidovém gelu za neredukujících i redukujících podmínek. SDS-PAGE je zvolena jako analytická metoda pro ověření integrity použité monoklonální protilátky nimotuzumab před i po vazbě s ligandem. Za neredukujících podmínek lze pomocí SDS-PAGE detekovat celou molekulu IgG s molekulovou hmotností -150 kDa. Za redukujících podmínek dochází ke štěpení interi intramolekulových disulfidových můstků pomocí β-merkaptoethanolu, čímž dojde k rozštěpení molekuly IgG na podjednotky, 2 lehké (-25 kDa) a 2 těžké (-50 kDa) řetězce. Tato analýza umožňuje účinnou kontrolu molekuly protilátky před i po vazbě s ligandem před značením radioaktivním kovem (l77Lu). Pomocí SDS-PAGE dochází k ověření, že molekula mAb nebyla degradována během procesu vazby s ligandem a několika následujícími přečišťovacími kroky pomocí centrifugace ve Vivaspin.
Proteiny jsou před vlastní SDS-PAGE denaturovány 5 min při 100 °C ve vzorkovém pufru s obsahem SDS. Redukující podmínky jsou zajištěny přítomností β-merkaptoethanolu. Do každé jamky gelu je naneseno 2 pg proteinů (dle hodnot koncentrace proteinů stanovených metodou podle Bradfordové). Proteiny jsou následně separovány s použitím NuPAGE 4 až 12% gradientového gelu v zařízení Cleaver Scientifíc Ltd. s použitím komerčního elektrodového pufru NuPAGE MES nebo NuPAGE MOPS. Barvení separovaných proteinů v gelu je provedeno pomocí Coomassie Blue R-250.
Za neredukujících podmínek je v gelu očekávána detekce jednoho hlavního bandu o velikosti -150 kDa, odpovídající celé molekule IgG. Za redukujících podmínek pak detekce 2 dominantních bandů o velikostech okolo 50 kDa a 25 kDa. Obr. 1 demonstruje příklad provedení
-8CZ 307368 B6
SDS-PAGE dvou připravených imunokonjugátů (ΚΙ, K2). K1 značí konjugát protilátky s chelátorem v molámím poměru 1:200 a K2 značí konjugát protilátky s chelátorem v molámím poměru 1:50. Díky konjugaci protilátky s ligandem dochází také k viditelnému zpomalení (posunu) bandu těchto imunokonjugátů oproti původní, nekonjugované, molekule protilátky.
Příklad 9: Potvrzení identity připraveného konjugátu metodou HPLC
Z roztoku konjugátu je odebrán vzorek na HPLC v objemu 50 až 100 μΐ do 0,5ml plastové mikrozkumavky Eppendorf. Cca 30 μΐ roztoku bylo aplikováno na jednu analýzu. Měření je prováděno na HPLC sestavě Agilent 1200 s UV a radiometrickou detekcí. Stacionární fázi tvoří gelová kolona TSK-Gel 3000 (7,5 x300 mm, 10 μιη) a mobilní fázi 0,01 M PBS s 0,05 % DTPA. Detekce je uskutečněna detektorem VWD (UV, 280 nm) a rovněž radiometricky detektorem Gábi Raytest. Měření probíhá isokraticky po dobu 20 min.
V tomto uspořádání má konjugát retenční čas 9 až 10 min. Případné zbytky volného ligandu nebo jiné nečistoty s nižší molekulovou hmotností vykazují typické retenční časy 11 až 12 min (obr. 2).
Příklad 10: Stanovení imunoreaktivity konjugátu
Ke sledování imunoreaktivity protilátky nimotuzumab je použita nepřímá nekompetitivní metoda ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Na povrch jamek mikrotitračních destiček určených pro imunometody je jako antigen imobilizován lidský rekombinantní EGFR (Sino Biological lne., Čína) v konstantní koncentraci (100 ng/jamka v 0,01 M PBS, pH 7,4; PBS = phosphate buffered šalině). Po saturaci volných vazebných míst na povrchu jamek 3% roztokem BSA (BSA = Bovine Sérum Albumin) v 0,01 M PBS, pH 7,4 následuje inkubace s primární protilátkou (nimotuzumab/DOTA-NCS-nimotuzumab/chelátor vzorce Inimotuzumab) ředěnou v 1,5 % BSA v 0,01 M PBS, pH 7,4. Vzniklý imunokomplex je vizualizován pomocí enzymově značené sekundární protilátky specifické proti Fc fragmentu lidského IgG (ředění 1:20 000 v 1,5 % BSA v 0,01 M PBS, pH 7,4). Produkt enzymové reakce chromogenního substrátu OPD (OPD = o-fenylendiamin) s křenovou peroxidázou (HRP, horseradish peroxidase) je následně detekován spektrofotometricky s maximem absorbance při 492 nm na přístroji Tecan Sunrise.
Pro kvantifikaci imunoreaktivity bylo využito vlastností lineární části závislosti získané při stanovení ELISA. V této oblasti probíhá vazba protilátky na antigen kinetikou pseudopravního řádu. Z experimentálně získaných dat lze získat aproximací rovnice přímek a poměrem jejich směrnic získat imunoreaktivitu konjugátu oproti nemodifikované formě nimotuzumab. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.
-9CZ 307368 B6
Tabulka 1: Srovnání imunoreaktivity neaktivních konjugátů nimotuzumab s chelátorem vzorce I a DOTA-NCS k lidskému rekombinantnímu EGFR stanovených metodou ELISA a jejich srovnání s výsledky počtu molekul ligandu na molekule imunokonjugátu.
Ligand v konjugátu | Počet molekul ligandu na molekulu protilátky | Imunoreaktivita in vitro (%)a |
chelátor vzorce I | 1,8 | 60 |
DOTA-NCS | 2,3 | 36 |
DOTA-NCS | 2,6 | 44 |
DOTA-NCS | 3,9 | 36 |
chelátor vzorce I | 3,9 | 56 |
chelátor vzorce I | 6,9 | 41 |
DOTA-NCS | 7,6 | 18 |
chelátor vzorce I | 7,9 | 30 |
DOTA-NCS | 8,3 | 26 |
“Imunoreaktivita byla stanovena metodou ELISA, vztaženo k nativnímu nimotuzumabu (= 100%).
Příklad 11: Stanovení radiochemické čistoty komplexu konjugátu s radionuklidem metodou HPLC
Z roztoku komplexu konjugátu s radionuklidem je odebrán vzorek na HPLC v objemu 50 až 15 100 μΐ do 0,5 ml plastové mikrozkumavky Eppendorf. Cca 30 μΐ roztoku je aplikováno na jednu analýzu. Měření je prováděno na HPLC sestavě Agilent 1200 s UV a radiometrickou detekcí. Stacionární fázi tvoří gelová kolona TSK-Gel 3000 (7,5 x 300 mm, 10 μτη) a mobilní fázi 0,01 M PBS s 0,05 % vodné DTPA. Detekce je uskutečněna detektorem VWD (UV, 280 nm) a rovněž radiometricky detektorem Gábi Raytest. Měření probíhá isokraticky po dobu 20 min. 20 HPLC chromatogramy konjugátu nimotuzumabu značených l77Lu jsou uvedeny na obr. 3A a 3B.
V tomto uspořádání má značený konjugát typický retenční čas 9 až 10 min, volný kov, popř. jiné značené nečistoty 11 až 12 min. 25
Příklad 12: Stanovení radiochemické čistoty komplexu konjugátu s radionuklidem metodou TLC
Radiochemická čistota komplexu radionuklidu s konjugátem, připraveného podle postupu uvedeného v příkladu 6, je stanovena metodou tenkovrstvé chromatografie (TLC). Ze značící směsi je po ukončení inkubace a před přídavkem kyseliny askorbové odebrán alikvot, ke kterému 30 je přidán 0,01 M roztok DTPA (pH 6) a směs se nechá reagovat dalších 15 min při laboratorní teplotě. Po této době jsou 2 μΐ reakční směsi naneseny na chromatografický papír se skleněnými vlákny impregnovaný silikagelem (iTLC-SG), který je vzestupně vyvinut mobilní fází (směs 1 M (77 g dm 3) octanu amonného a methanolu v poměru 1:1 (v/v)). Rozložení aktivity na vyvinuté TLC desce je detekováno TLC skenerem aktivity. V dané chromatografické soustavě zůstává 35 radionuklidem značený konjugát na startu chromatografické dráhy (J?f = 0) a komplex se pohybuje s čelem mobilní fáze (Rf ~ 1) (l77Lu-DTPA viz obr. 4). Radiochemická čistota odpovídá procentům aktivity na startu chromatogramu vůči součtu aktivity na celém chromatogramu.
- 10CZ 307368 B6
Příklad 13: Příprava komplexu konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce (I) s radionuklidem ,ň6Ho
Přečištěný konjugát připravený v příkladu 4 v množství 0,5 až 0,7 ml je převeden do plastové mikrozkumavky Eppendorf (objem 1,5 ml) a doplněn vodným roztokem NH4OAc (0,5 M, pH 5,5) tak, aby výsledný objem roztoku (včetně radionuklidu, který bude přidán) činil 1 ml.
K. tomuto roztoku je přidán vodný roztok radioaktivního chloridu holmitého v 0,2 M HC1, v množství odpovídajícím poměru 100 až 2500 MBq 166Ho na 1 mg konjugátu. Je zkontrolováno pH, jehož hodnota by se měla bez dalších úprav pohybovat v rozmezí 5,0 až 6,0. Reakční směs je následně inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1,5 h. Po ukončení inkubace je přidáno 5 mg askorbátu sodného a přípravek je sterilizován filtrací přes filtr Millex-GV (filtr určený pro sterilizaci roztoků proteinů) a rozplněn do jednotlivých sterilních vialek pro další použití. Následně je provedena kontrola kvality přípravku, která je dále popsána v příkladech 11 a 12.
Příklad 14: Příprava komplexu konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce (I) s radionuklidem
Přečištěný konjugát připravený v příkladu 2 v množství 0,5 až 0,7 ml je převeden do plastové mikrozkumavky Eppendorf (objem 1,5 ml) a doplněn vodným roztokem NH4OAc (0,5 M, pH 7,0) tak, aby výsledný objem roztoku (včetně radionuklidu, který bude přidán) činil 1 ml. K tomuto roztoku je přidán vodný roztok radioaktivního chloridu yttritého v 0,04 M HC1, v množství odpovídajícím poměru 100 až 1000 MBq 90Y na 1 mg konjugátu. Je zkontrolováno pH, jehož hodnota by se měla bez dalších úprav pohybovat v rozmezí 6,5 až 7,5. Reakční směs je následně inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1 h. Po ukončení inkubace je přidáno 5 mg askorbátu sodného a přípravek je sterilizován filtrací přes filtr Millex-GV (filtr určený pro sterilizaci roztoků proteinů) a rozplněn do jednotlivých sterilních vialek pro další použití. Následně je provedena kontrola kvality přípravku, která je dále popsána v příkladech 11 a 12.
Příklad 15: Příprava komplexu konjugátu monoklonálníprotilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce (I) s radionuklidem 1:3Sm
Přečištěný konjugát připravený v příkladu 2 v množství 0,5 až 0,7 ml je převeden do plastové mikrozkumavky Eppendorf (objem 1,5 ml) a doplněn vodným roztokem NH4OAC (0,5 M, pH 4,8) tak, aby výsledný objem roztoku (včetně radionuklidu, který bude přidán) činil 1 ml.
K. tomuto roztoku je přidán vodný roztok radioaktivního chloridu samaritého v 0,2 M HC1, v množství odpovídajícím poměru 100 až 1000 MBq 153Sm na 1 mg konjugátu. Je zkontrolováno pH, jehož hodnota by se měla bez dalších úprav pohybovat v rozmezí 4,5 až 5,5. Reakční směs je následně inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1,5 h. Po ukončení inkubace je přidáno 5 mg askorbátu sodného a přípravek je sterilizován filtrací přes filtr Millex-GV (filtr určený pro sterilizaci roztoků proteinů) a rozplněn do jednotlivých sterilních vialek pro další použití. Následně je provedena kontrola kvality přípravku, která je dále popsána v příkladech 11 a 12.
Příklad 16: Příprava komplexu konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab s chelátorem vzorce (1) s radionuklidem IHIn
Přečištěný konjugát připravený v příkladu 2 v množství 0,5 až 0,7 ml je převeden do plastové mikrozkumavky Eppendorf (objem 1,5 ml) a doplněn vodným roztokem NH4OAc (0,5 M, pH 5,5) tak, aby výsledný objem roztoku (včetně radionuklidu, který bude přidán) činil 1 ml. K tomuto roztoku je přidán vodný roztok radioaktivního ” ’lnCl3 v 0,2 M HC1, v množství odpovídajícím poměru 100 až 1000 MBq ’ln na 1 mg konjugátu. Je zkontrolováno pH, jehož
- 11 CZ 307368 B6 hodnota by se měla bez dalších úprav pohybovat v rozmezí 5,0 až 6,0. Reakční směs je následně inkubována při teplotě 37 °C po dobu 2 h. Po ukončení inkubace je přidáno 5 mg askorbátu sodného a přípravek je sterilizován filtrací přes filtr Millex-GV (filtr určený pro sterilizaci roztoků proteinů) a rozplněn do jednotlivých sterilních vialek pro další použití. Následně je provedena kontrola kvality přípravku, která je dále popsána v příkladech 11 a 12.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab nebo jejího fragmentu Fab a alespoň jednoho chelátoru vzorce IHOOCNOSN NHOOC\__/ \^COOH (I), přičemž alespoň jeden chelátor vzorce I je kovalentně navázán thiomočovinovým můstkem vzniklým reakcí isothiokyanátové skupiny chelátoru vzorce I a aminoskupiny aminokyseliny lysinu, přítomné v monoklonální protilátce nimotuzumabu.
- 2. Konjugát podle nároku 1, který obsahuje do 10 molekul chelátoru vzorce I kovalentně navázaných thiomočovinovým můstkem vzniklým reakcí isothiokyanátové skupiny chelátoru vzorce I a aminoskupiny aminokyseliny lysinu, přítomné v monoklonální protilátce nimotuzumabu.
- 3. Způsob přípravy konjugátu podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že se roztok protilátky nimotuzumab o pH v rozmezí od 8,0 do 9,2 smíchá s roztokem chelátoru vzorce I o pH v rozmezí od 8,0 do 9,2, přičemž molámí poměr monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce 1 je v rozmezí od 1:10 do 1:100;výsledná reakční směs reaguje po dobu alespoň 10 minut při teplotě v rozmezí od 4 do 40 °C za vzniku konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce 1 podle kteréhokoli z předchozích nároků.
- 4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že rozpouštědlem reakční směsi je voda, popřípadě voda obsahující do 20 obj. % DMSO.
- 5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačený tím, že reakční směs dále obsahuje pufr pro udržení konstantní hodnoty pH, který je vybraný ze skupiny zahrnující fosfátový pufr, acetátový pufr, TRIS pufr, HEPES pufr a EPPS pufr.
- 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 3 až 5, vyznačený tím, že následně dále obsahuje krok přečištění reakční směsi, s výhodou filtrací přes membránu.- 12CZ 307368 B6
- 7. Komplex konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I s radionuklidem, který obsahuje konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, kde alespoň jeden chelátor vzorce I tvoří koordinační sloučeninu s radionuklidem vybraným ze skupiny zahrnující 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 90Y, 1HIn, 186Re, 188Re, radioizotopy lanthanoidů, 2I2Pb a 2l3Bi, s výhodou je radionuklid vybraný ze skupiny obsahující radioizotopy lanthanoidů, 47Sc, 67Cu, 1HIn a 90Y, nejvýhodněji je radionuklidem 153Sm, 166tt 111r 177iHo, ln a Lu.
- 8. Způsob přípravy komplexu podle nároku 7 konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I s radionuklidem, vyznačený tím, že se vodný roztok soli radionuklidu smíchá s vodným roztokem konjugátu monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce 1 a výsledná reakční směs reaguje při teplotě do 50 °C po dobu alespoň 5 minut.
- 9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že reakce probíhá při pH v rozmezí od 5 do 8.
- 10. Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab a chelátoru vzorce I podle nároku 1 nebo 2 a/nebo komplex tohoto konjugátu s radionuklidem podle nároku 7 pro použití při léčení nádorových onemocnění.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2016-742A CZ2016742A3 (cs) | 2016-11-28 | 2016-11-28 | Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab, jeho komplex s radionuklidy, způsoby jejich přípravy a jejich použití |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ2016-742A CZ2016742A3 (cs) | 2016-11-28 | 2016-11-28 | Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab, jeho komplex s radionuklidy, způsoby jejich přípravy a jejich použití |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ307368B6 true CZ307368B6 (cs) | 2018-07-04 |
CZ2016742A3 CZ2016742A3 (cs) | 2018-07-04 |
Family
ID=62783866
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2016-742A CZ2016742A3 (cs) | 2016-11-28 | 2016-11-28 | Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab, jeho komplex s radionuklidy, způsoby jejich přípravy a jejich použití |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ2016742A3 (cs) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003008394A1 (en) * | 2001-07-17 | 2003-01-30 | Therapharm Gmbh | Novel chelating agents and conjugates thereof, their synthesis and use as diagnostic and therapeutic agents |
-
2016
- 2016-11-28 CZ CZ2016-742A patent/CZ2016742A3/cs unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003008394A1 (en) * | 2001-07-17 | 2003-01-30 | Therapharm Gmbh | Novel chelating agents and conjugates thereof, their synthesis and use as diagnostic and therapeutic agents |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MARTÍNEZ, Luis M. Alonso, et al. Development of 90Y-DOTA-nimotuzumab Fab fragment for radioimmunotherapy. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 2014, 302.1: 49-56. ISSN 0236-5731 (print) ISSN 1588-2780 (electronic) * |
RUDOVSKÝ, Jakub, et al. Relaxometric and solution NMR structural studies on ditopic lanthanide (III) complexes of a phosphinate analogue of DOTA with a fast rate of water exchange. Dalton Transactions, 2006, 19: 2323-2333. ISSN 1477-0520 * |
VERA, Denis R. Beckford, et al. Preparation and preclinical evaluation of 177 Lu-nimotuzumab targeting epidermal growth factor receptor overexpressing tumors. Nuclear medicine and biology, 2012, 39.1: 3-13. ISSN 0969-8051 (print) ISSN 1872-9614 (electronic) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ2016742A3 (cs) | 2018-07-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI837077B (zh) | 藉由IgG結合肽之部位特異性RI標識抗體 | |
Sun et al. | Reduction− alkylation strategies for the modification of specific monoclonal antibody disulfides | |
JP6219372B2 (ja) | 放射性医薬錯体 | |
TW202128230A (zh) | 具有經ri標定之人類化抗體的複合體、放射性醫藥 | |
JP2021130675A (ja) | 放射性核種錯体を調製するための方法およびキット | |
WO2009036885A1 (en) | Ed-b fibronectin as stratification marker for anti-tumor drugs | |
Grote Gansey et al. | Conjugation, immunoreactivity, and immunogenicity of calix [4] arenes; model study to potential calix [4] arene-based Ac3+ chelators | |
TW202140432A (zh) | 巨環螯合物及其用途 | |
Postupalenko et al. | Template directed synthesis of antibody Fc conjugates with concomitant ligand release | |
CA3222172A1 (en) | Methods and materials for combining biologics with multiple chelators | |
JP2010502585A (ja) | 68Ga標識ペプチド系放射性医薬品 | |
US20090010839A1 (en) | Avidin dimers effective in increasing the concentration of radioactive biotin in pretargeted radioimmunotherapy | |
CZ307368B6 (cs) | Konjugát monoklonální protilátky nimotuzumab, jeho komplex s radionuklidy, způsoby jejich přípravy a jejich použití | |
Bejot et al. | Aminooxy‐functionalized DOTA for radiolabeling of oxidized antibodies: evaluation of site‐specific 111In‐labeled trastuzumab | |
EP4230637A1 (en) | Radioactive complexes of anti-her2 antibody, and radiopharmaceutical | |
Luo et al. | An efficient method for the site-specific 99mTc labeling of nanobody | |
JP2024519031A (ja) | コンジュゲート療法エンハンサーを含む組成物 | |
WO2024090489A1 (ja) | 放射性医薬組成物の製造方法 | |
KR20230163487A (ko) | 항egfr 항체의 방사성 복합체 및 방사성 의약 | |
CN116456992A (zh) | 抗her2抗体的放射性复合物和放射性药物 | |
KR20230174238A (ko) | 방사성 항종양제 | |
KR20150042097A (ko) | 방사면역접합체 또는 방사표지펩티드 제조용 링커 화합물 및 그 제조방법 | |
PL199384B1 (pl) | Sposób wytwarzania preparatu radiodiagnostycznego na bazie gammaglobuliny |